JP2002527149A - 無ストロマヘモグロビンの産生のための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明の方法は、市販の血球分離器を使用する。この分離器は、コンピュータ制御の遠心分離器（２）（これは、ロータ（２４）を有する）を備え、この中に、ドナー血液を含む血液処理バッグ（６）が配置される。一旦血液が収集されると、この処理は、囲まれた遠心分離ボウル内で、好ましくはそのドナー収集部位にてインサイチュでその全体が行われる。第一の工程において、血液が遠心分離されて血漿を細胞成分から分離する。赤血球を他の血液成分から単離した後、赤血球を通常の生理食塩水または他の溶液を用いて洗浄する。次いで、赤血球を、低張ショックによって溶解し、赤血球膜（ストロマ）を分離し、そして溶解物を滅菌容器（４４）に収集して、ストロマのみを、遠心分離ボウルに残す。最終産物は、現在赤血球代替物として開発されている、ヘモグロビンベースの任意の酸素キャリアについての原料として使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （関連出願） 本願は、１９９８年１０月１５日に出願された、仮出願番号６０／１０４，３
１９および１９９９年３月１日に出願された仮出願番号６０／１２２，１８０の
両方の仮出願に対して優先権を主張する。上記仮出願の開示は、その全体が参考
として援用される。

【０００２】 （発明の分野） 本発明は、自動血球分離器を使用して、高品質のヘモグロビン溶液を、ヘモグ
ロビンベースの治療用酸素キャリア（「血液代替物」）の製造のための原料とし
て生成するためのシステムおよび方法に関する。

【０００３】 （発明の背景） 保存されたヒト血液の輸血は、医療の実践における古来よりの備蓄物である。
しかし、その効力は、厳密には決して示されておらず、そしてその手順はかなり
欠陥を有する。例えば、最良の医療センターにおいてでさえ、輸血の必要性が示
される場合、処置は、その患者の血液の血液型および交叉適合性に対する必要性
のために遅延し、次いで、その血液が患者の病床または手術室もしくは救急室に
送達される。さらに、いくつかの証拠によって、輸血が免疫抑制性であり得、そ
して自己系ドナーリンパ球がそのレシピエントにおいてキメラを確立し得ること
が示唆されている。輸血によるウイルス疾患の伝染の危険性は、広く認識されて
いる。

【０００４】 これらの問題にもかかわらず、医療の実践がより複雑になり、そして人々が高
齢化するに連れ、輸血に対する世界的な必要性が増加している。米国における輸
血の比率が世界の人口６０億に対して上昇する場合、年間合計およそ３億ユニッ
トの赤血球の需要が予測され得る。実際に輸血される数の確固たる見積もりは利
用可能ではないが、その数は、９０００万ユニット程度の少なさであり得る。こ
の見積もりが正確であると仮定すると、世界で１年あたり２億ユニットを超える
潜在的な不足が存在する。発展途上国が先進国において利用可能な洗練された血
液銀行手順を支援し得るようではなく、ほとんどの発展途上国は、公衆衛生の一
般的に貧弱な状況のために、需要を満たすに充分なドナー血液を生成し得ない。

【０００５】 血液供給における潜在的な不足に取り込む努力において、治療用酸素キャリア
（すなわち、「血液代替物」）が、商用研究室および学術研究室の両方によって
、１９８０年代半ばから広汎に開発されており、そして研究所の実験室ではそれ
よりもっと長く開発されてきている。原料として使用するヘモグロビンの精製、
その溶液の特徴付け、およびヘモグロビン改変化学を含む、顕著な問題は克服さ
れている。

【０００６】 市場における血液代替物が成功するか否かは、いくつかの重要な因子に依存す
る。第一に、それは、有効でなければならない。しかし、効力についての明解な
試験は、確立されていない。１つの可能な試験は、その生成物が同種異系血液に
対する患者の曝露を有効に減少させ得るか否かである。第二に、その生成物は安
全でなければならない。これまでに発生した安全に関する問題は、血液収縮性で
あるヘモグロビンの公知の特性の周辺に集中している。この特性は少なくとも部
分的にヘムリガンドとしておよびスルフヒドリル部位への、ヘモグロビンに対す
る一酸化窒素（ＮＯ）の非常に強力な結合である。第三に、赤血球代替物は、臨
床用途のための血液と、首尾よく競合しなければならない。現在開発中の血液代
替物製品は、１２〜５８時間の範囲の血漿保持時間（半減期）を有する。従って
、血液代替物製品は、一過的な状況においてのみ使用されるか、または反復した
用量が投与され得る状況で使用されるかのいずれかである。

【０００７】 ヒト血液は、ＨＩＶが血液製品の輸血によって伝染し得るという発見の後に、
血液銀行産業の強力な精査の結果として非常に安全となった。価値有る製品とな
るために、赤血球代替物は、安全かつ比較的安価でなければならない。血液の価
格よりも高い価格は、安全性、効力、使用の簡便性、または患者の受容性に明ら
かな利点がある場合にのみ支持される。従って、これらの血液代替物が臨床での
使用に近づくにつれ、原料の供給源、価格および供給は、より重要になってくる
。臨床試験における製品について、生のヘモグロビンは、期限切れのヒトの預け
られた血液、ウシまたは組換え（Ｅ．ｃｏｌｉ）の供給源のいずれかから得られ
る。保存された血液のうち１％以下が期限切れになるという見積もりがあること
から、１年間の血液代替物製造に利用可能な血液は、およそ１２０，０００ユニ
ットのみとなる。従って、この期限切れの血液についての競合および価格は高い
。ウシ血液は、大量に得られ得るという利点を有する。しかし、この目的のため
にウシを維持することは、その動物について厳密な保健基準および獣医学的なケ
ア、頻繁な試験ならびにそれらを支持するために莫大な量の土地および飼料を必
要とする。さらに、ウシの血液は、その目的のために設計された特殊な装置を用
いて収集されなければならない。組換え供給源は、理想的な解決策である。なぜ
なら、ヒト病原体の混入の危険性が減じているからである。しかし、組換えヘモ
グロビンは、醗酵の他の成分からそのタンパク質を分離するために徹底的に精製
することが必要とされ、大量の水が利用され、そして廃棄産物の処理において重
大な問題に遭遇する。そのような処理の必要性のために、組換えヘモグロビンを
用いて生産された血液代替物産物は、従来の預けられた血液の価格よりも数倍高
い価格である結果になっている。

【０００８】 ヘモグロビン溶液をヒト血液から調製するための現在の手順は、生理食塩水、
沈降もしくはダイアフィルトレーションによるプールされた赤血球の洗浄、低張
性緩衝液を用いた緩やかな溶解、および赤血球膜の厳密な除去という、徹底的な
処理を包含する。これらの手順は、大きな滅菌溶液および高価なフィルターを必
要とし、そして完了するのにかなり長い時間を必要とする。この処理において使
用される成分及び溶液の多くは、令室および／またはクリーンルームに収容され
粘らない。１週間あたりの、無ストロマの赤血球溶液５リットルの容量での１つ
の報告されたパイロット処理プラントは、およそ１０００平方フィートの実験室
空間をカバーする４つの、別個であるが、接続された部屋を必要とした。生産コ
ストは、およそ１０００ドル／リットルであった（ＷｉｎｓｌｏｗおよびＣｈａ
ｐｍａｎ、「Ｐｉｌｏｔ−ｓｃａｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｍ
ｏｇｌｏｂｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２３１
：３−１６、１９９４を参照のこと。この開示は、本明細書において参考として
援用される。）。高コストな生産の顕著な不利益に加えて、このパイロット設定
の大規模さおよび複雑さは、何人かのサポート要員を必要とし、そして混入のた
めの多くの機会をもたらした。

【０００９】 世界の血液供給において予測される欠乏に適切に取り組むために必要な量で利
用可能な血液代替物を製造するために、血液代替物を調製するために必要とされ
る原料を処理するための既存の方法は、改善されねばならない。その産物のコス
ト、複雑性および混入の危険性を減じた血液代替物を製造する際に使用するため
の無ストロマヘモグロビンを調製するための方法に対する必要性が残存している
。

【００１０】 （発明の要旨） 内蔵式の自動化装置における無ストロマヘモグロビンの調製のための方法を提
供することが本発明の利点である。

【００１１】 本発明の別の利点は、ドナーから直接的に、収集の時点で得られた血液を使用
した血液代替物の製造のための原料として高品質のヘモグロビン溶液を調製し、
従って、血液の血液型決定および保存、ならびに混入の危険性を減ずるための必
要性を除去するための方法を提供することである。

【００１２】 代表的な実施形態において、この方法は、市販の血球分離器を使用する。この
血液分離器は、ドナー血液を含む血液処理バッグが配置されるローターを有する
、コンピュータ制御される遠心分離器を備える。一旦血液が収集されると、この
プロセスは、その全体が、密封された遠心分離ボウル内で、好ましくは、インサ
イチュでドナー収集部位において、実施される。この遠心分離ローターは、処理
バッグを受けるための１つ以上の処理チャンバを備える。第一の工程において、
この血液を遠心分離して、細胞成分から血漿を分離する。上清（すなわち、白血
球、血小板、および血漿）を、血液処理バッグにおける可撓性ダイアフラムおよ
びソレノイド制御されたピンチバルブを介して作動液圧力を用いて除去し、そし
て充填された細胞を残す。ピンチバルブは、溶液を含むチューブを挟むことによ
って機能し、直接の接触を回避して、その流体経路を滅菌性に維持する。回転シ
ールによって、遠心分離器が回転している間、血液処理バッグ内へおよびそこか
ら外への流体の通過が可能となる。赤血球を他の血液成分から単離した後、赤血
球を、通常の生理食塩水もしくは溶液を用いて洗浄する。洗浄溶液を流体圧力に
よって除き、そしてチューブを通して上清収集容器へと移動させる。光センサー
を配置して、上清収集容器へとのびるチューブをモニターして、赤血球の存在を
検出する。赤血球が検出された場合、停止または中止の機能が、システムコント
ローラによって開始される。次いで、赤血球を、低張ショックによって溶解し、
そして遠心力を用いて、赤血球膜（ストロマ）を、溶解物から分離し、これを滅
菌容器に収集して、ストロマのみを、遠心分離ボウルに残す。最終産物は、ヘモ
グロビンベースの任意の酸素キャリアについての原料として使用され得る。これ
は、現在、赤血球代替物として開発中である。これらの工程の全てを、細胞分離
器のボウルまたは細胞セーバ内で行って、滅菌性を維持する。

【００１３】 ドナー行為の部位において血液を処理する能力によって、血液代替物を製造す
るための、より迅速かつ、低廉なコストの赤血球の収集が提供される。特に、こ
の手順は、収集された血液のユニットを血液型決定し、そして保存する必要性を
除去し、そしてこの目的のために収集されたユニットをプールして、ＨＩＶまた
はＣ型肝炎のような感染性因子についての試験のコストを減少させ得る。

【００１４】 （好ましい実施形態の詳細な説明） 無ストロマヘモグロビン（「ＳＦＨ」）の産生のための方法は、図１に図式的
に例証される、慣用的な市販の血球処理装置を使用する。このような系は、患者
またはドナー由来の全血の分離物を成分に処理するために使用される。赤血球が
収集され、そして残りの成分はドナーに戻され得るか、または廃棄され得る。そ
の装置は、血液バッグ６を保持するための遠心分離機２、処理溶液を含む複数の
リザーバ８および１０、上清１４を受け取るためのリザーバ、複数のバルブ、お
よび種々のリザーバを血液バッグ６に接続する滅菌チューブハーネス、ならびに
、遠心分離機およびバルブを制御するためのコントローラ２０を備える。使い捨
ての回転シール３４を、チューブハーネス内に含めて、遠心分離ローターが回転
している間、血液処理バッグ中への液体の通過およびそのバッグの外への液体の
通過を可能にする。シールは、液体が液体経路の外に漏出すること、および空気
が液体中に漏出することを防ぐ。血液は、ドナー（腕２２を示す）から、チュー
ブ３０およびバルブ３２を通して、血液バッグ６に直接に、好ましくは直接処理
のために収集される。好ましい実施形態において、血液バッグ６およびチューブ
ハーネスは、あらかじめ滅菌された、使い捨ての処理セットの部分である。バル
ブは、チューブを締め付けることによって、作用し、その結果、チューブ中で液
体と直接的な接触はない。

【００１５】 遠心分離ローター２４は、血漿から赤血球を分離するために作動される。遠心
力は、上清リザーバ１４への血漿の圧搾のための揚水を提供する（または所望の
場合、患者またはドナーに戻される）。具体的には、置換チャンバーは、水力操
作仕切り板４を備える遠心分離ローター２４に含まれる。可撓性仕切り板４の下
の領域への水力液体の流れまたは可撓性仕切り板４の下の領域からの水力液体の
流れは、遠心分離ドライブ３６の回転および可逆性水力ポンプ３８の方向を制御
することによって、システムコントローラ２０によって制御される。コントロー
ラ２０は、チューブ１８を通して血漿が血液バッグに流出することを可能にする
ためにバルブ１６を開口させることを引き起こし、次いで、血漿が取り除かれた
後でバルブを閉鎖することを引き起こす。血漿の完全な除去は、光学的検出器２
８の使用によって決定され得、これは、清浄なチュービングにおいて赤血球の存
在を検出する。リザーバ８からの生理食塩水溶液は、開口バルブ１２によって、
チューブ２６を通して、血液バッグ中に放出される。あるいは、抗細菌薬剤、界
面活性剤、または他の適切な洗浄溶液を洗浄溶液として使用して、あるいは生理
食塩水溶液に加えて、血液中に存在し得る任意の細菌夾雑物を除去し得る。遠心
分離ローターは、比較的低速で回転し、赤血球を洗浄するための攪拌を提供する
。洗浄後、回転速度は増大し、そしてコントローラ２０はバルブ１６を開き、遠
心力および可撓性仕切り板が洗浄溶液を上清リザーバ１４に圧搾することを可能
にする。

【００１６】 一旦洗浄溶液が血液バッグ６から除去されたならば、ヘモグロビンからストロ
マを分離するために、低張性ショックを誘導するために蒸留水を導入することに
よって赤血球は溶解される。リザーバ１０に蓄えられる蒸留水は、開口バルブ１
３によってチューブ１１を通して輸送される。赤血球が最初に蒸留水と接触し始
めると、それらのいくつかは溶解し、ヘモグロビンを溶液中に遊離する。無細胞
成分がこの時点で収集され得、そして蒸留水注入を継続し、懸濁培地のイオン強
度が減少するにつれて、よりいっそうのヘモグロビンを遊離させる。ヘモグロビ
ンに対する損害を最小化するために低速で回転する遠心分離ローターを用いて、
無ストロマヘモグロビンがボウル全体に分布されるが、一方赤血球および膜は、
ボールの外縁に圧縮される。大量の蒸留水が必要とされ得るので、大部分のヘモ
グロビンを遊離させるためには数回の反復が必要である。ヘモグロビンの除去は
、滅菌容器４４中へのチューブ４２を通しての血液バッグ６中の、滅菌ポート４
０を介して達成される。持続する痕跡量の膜粒子を除去するために、輸送経路（
チューブ）中でのフィルター４６を含むことが所望され得る。十分な水および時
間が与えられる場合、すべてのヘモグロビンが除去されるはずであるが、意図さ
れる用途に依存して、後でヘモグロビン溶液を濃縮することが必要であり得る。
ヘモグロビン抽出物の完全性の決定は、ヘモグロビン溶液中のイオン濃度の測定
によってなされ得る。伝導率メーターをシステムコントローラー２０に接続する
ことによって、イオン濃度が所定のレベルよりも下に下がった場合には、このプ
ロセスは停止され得る。所定のレベルの選択は、時間対ヘモグロビン抽出の効率
（すなわち、費用便益分析）のバランスに基づく。

【００１７】 赤血球を溶解するために低張性ショックを誘導するための他の方法は公知であ
り、そして蒸留水リンスに取って代わり得るか、または蒸留水リンスと組み合わ
せて使用され得る。代替的な溶解方法は、以下により詳細に記載される。

【００１８】 ヘモグロビン溶液が移される滅菌容器は、血液代替物の調製物についてあらか
じめ測定された試薬（例えば、緩衝剤塩、Ｔｒａｕｔ試薬、および活性化ポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）を含む）を含み得る。血液代替物の調製のための代
表的な方法は、特許第５，８１４，６０１号および同第５，２９６，４６５号に
詳述され、これらの開示は本明細書中に参考として援用される。

【００１９】 処理の方法は、使い捨ての、あらかじめ滅菌された処理セット（これは、好ま
しくは、すべてのチュービング、リザーバ、遠心分離ボウル、およびインライン
フィルターを含む）中で完全に行われる。この閉じた系は、夾雑の危険を除去す
る。

【００２０】 以下の実施例は、例示としてのみ提供され、そして本発明の範囲を制限するこ
とが意図されない。

【００２１】 （実施例１） 血液からの無ストロマヘモグロビンの産生のための実験的な装置を構築した。
この装置は、古い血液のバッグを空にするためのマニホルド；洗浄、溶解、およ
び精製のための交差流（ｃｒｏｓｓ−ｆｌｏｗ）濾過デバイス；架橋ヘモグロビ
ンのためのバイオリアクター；調製スケールＨＰＬＣ装置；および滅菌バッグへ
の製品の最終的な充填のためのフードを備える。ＰＦＷ分配ループを含むフロー
ループを閉鎖した。すべての連結部は、衛生的３クランプ型（ｓａｎｉｔａｒｙ ｔｒｉｃｌａｍｐ ｔｙｐｅ）のものであり、そしてラミナーフロー環境にお
いて作製された。全体のプロセスは、事務所を除いて、実験室空間のおよそ１０
００ｆｔ²を必要とした。このパイロットプラントの容量は、一週間あたり約５
リットルであり、そして生産のためのコストは、約１０００ドル／リットルであ
った。

【００２２】 交差流濾過システムは、３つのポンプ、４つのタンク、および４つの別個のフ
ィルターパッケージからなった。すべての構成材料は、１８０グリッドの内部仕
上げを有する３１６Ｌステンレス鋼から作製された。チュービングは可撓性であ
り、そして強化シリコンから作製された。ホローファイバー濾過カートリッジは
、非溶血性、非発熱性（ｎｏｐｙｒｏｇｅｎｉｃ）ポリスルホンメンブレンであ
った。

【００２３】 すべての溶液を、被覆付きステンレス鋼５００リットルタンク中で調製後、冷
却した。赤血球洗浄および熔解タンクを、温度制御のためにグリコール被覆した
。５００ｋＤａおよび１０ｋＤａ超遠心分離ループは、二重チューブ熱交換体を
使用した。ＰＦＷを、濃縮したヘモグロビンのダイアフィルトレーションの前に
冷却した。ロータリーローブポンプ（ｒｏｔａｒｙ ｌｏｂｅ ｐｕｍｐ）は、
低い剪断条件を保証した。圧力プロフィールは、このシステム全体を通してモニ
ターされ、そして２０ｐｓｉ未満に制御された。すべての溶液のｐＨを、生理学
的範囲に維持した。

【００２４】 無菌性を、処理の全体に渡って維持した。交差流濾過システムを、クラス１０
０環境において収容した。すべての処理タンク、配管、およびフィルターを、純
粋な蒸気中に置いて蒸気処理するか、または０．１Ｎ ＮａＯＨで化学的に衛生
化した。このシステムからの衛生化溶液をＰＦＷでリンスした。このシステムの
無菌性を、処理の前に、そして処理の全体を通して、Ｌｉｍｕｌｕｓ ａｍｅｂ
ｏｃｙｅ溶解（ＬＡＬ）試験を使用して発熱物質についてサンプリングすること
によって確認した。

【００２５】 ＳＦＨの産生のための代表的な実行についての流れ図を図２に示す。充填され
たヒトの古い赤血球（ＰＲＢＣ）を、古くなってから４週間までに使い果たした
。すべての試験したユニットは、ＨＩＶおよびＢ型肝炎抗原に陰性であった。代
表的なバッチにおいて、約２０リットルのＰＲＢＣを、１００リットルの被覆付
きステンレス鋼タンク中の通常の生理食塩水の８０リットルを加えた血液収集物
のセットを使用してプールした。ＲＢＣを、７倍量の冷却した通常の生理食塩水
を用いて、一定の容量（８０リットル）で、３つの０．６５μｍ中空繊維メンブ
レンカートリッジ（総表面積６９ｆｔ²）を通して、ダイアフィルトレーション
によって洗浄した。血漿が除去されたことを確認するために、濾過物を、血漿タ
ンパク質についてのマーカーとして、アルブミンについてアッセイした。代表的
な洗浄の間、アルブミン濃度は、一貫して、２ｍｇ／ｍｌより高くから検出不可
能なレベル（＜２μｇ／ｍｌ）に減少した。ＲＢＣはゆっくりと溶解され、そし
てストロマを、５倍量の冷却した１０ｍＭ ＮａＨＰＯ４、ｐＨ ７．６を用い
、一定の容量（８０リットル）で、０．１μｍ中空繊維メンブレンカートリッジ
を通して、ダイアフィルトレーションによって除去した。０．１μｍカートリッ
ジの濾過物は、１００リットルステンレス鋼タンクに向けられた。次いで、これ
を、一定量（８０リットル）で、５００ｋＤａメンブレンカートリッジを通して
ダイアフィルトレーションを行い、あらゆるストロマ粒子を除去した。次いで、
５００ｋＤａカートリッジからの濾過物（ＳＦＨ）を、３つの１０ｋＤａ中空繊
維メンブレンカートリッジを通して循環によって１０ｇ／ｄｌまで濃縮した。

【００２６】 得られたＳＦＨ溶液を、６倍量のリンガー酢酸、ｐＨ ７．４を用いてダイア
フィルトレーションを行い、次いで、ステンレス鋼濃縮タンクから、０．２μｍ
、１０インチフィルターを通して、４０リットルステンレス鋼保持タンクに移し
た。最後に、ＳＦＨ生成物を、滅菌条件下で、プラスチックバッグに移し、そし
て−８０℃で凍結させた。あるいは、ＳＦＨを、架橋のために７０リットルバイ
オリアクターに移した。

【００２７】 上記の装置および手順を使用して産生される無ストロマヘモグロビン溶液は、
水中またはリン酸緩衝液中のいずれかで処方され得る。メトヘモグロビン濃度は
、慣用的に１％未満であり、そしてその溶液は、−８０℃で無限に保存され得る
。ウサギ発熱物質試験はネガティブであり、そしてその溶液は、細菌が夾雑して
いなかった。純度をＨＰＬＣ分析によって評価し、そしてその溶液が実質的に非
ヘモグロビンタンパク質を含まないことを示した。他の品質管理試験には、酸素
結合（Ｐ５０、Ｈｉｌｌパラメーター、ｎ）、ｐＨ、内毒素（ＬＡＬ試験）、お
よびＳＤＳゲル電気泳動が含んだ。産生されたＳＦＮの代表的なバッチにおける
これらの試験の結果を表１に示す。

【００２８】

【表１】 無ストロマヘモグロビンを産生する際の最も大きな関心は、夾雑に加えて、お
そらく、膜リン脂質成分の厳密な除去である。リン脂質は、慣用的な基礎で測定
することは極度に困難であるので、より単純な全リン酸アッセイを使用した。非
常に感受性が高いので、それは、リン酸の供給源を区別しない。細胞内酵素は、
赤血球夾雑物の第２のグループを構成し、そして最終産物からすべての赤血球酵
素の除去が所望され得るかさえ、抗酸化物活性の観点から、明確ではない。

【００２９】 この方法で収集されたＳＦＨの「ユニット」は、無制限に凍結保存され得、そ
して中央処理施設（いくつかの場所において血漿処理が実行される）に出荷され
るか、または品質管理試験のために局所的にプールされる。提案されたシステム
の別の利点は、コストを劇的に減少させ得ることである。現時点において、すべ
ての収集された血液は、高価なウイルス試験に供されており、これは、血液収集
の最大の単一のコストである。新規なシステムを使用すると、ユニットは、試験
前に収集され得る。これは、全体のコストを非常に減少する。Ｈａｅｍｏｎｅｔ
ｉｃｓは、血液のユニットの収集のコストは、１８ドルであり、そのうちの１５
ドルがウイルス試験であると見積もっている。このコストは、例えば、１０ユニ
ットプール上で行った試験について、１０分の１に減少され得る。

【００３０】 この方法において収集された血液は、特許番号第５，８１４，６０１号に開示
されるような「血液代替物」を再製造のために受容可能であり得る。しかし、こ
れは、ドナー血液のための現在のＦＤＡ標準には合致しないかもしれない。例え
ば、ヘモクロマトーシス（ｈｅｍａｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ）を有する患者は、
現在、輸血のための血液の提供をＦＤＡから禁止されている。このことは、これ
らの患者に、患者に対するかなりのコストで静脈切開を実行する開業医を捜すこ
とを促してきた。鉄負荷疾患協会（Ｉｒｏｎ Ｏｖｅｒｌｏａｄ Ｄｉｓｅａｓ
ｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ）は、米国のみで顕著な鉄負荷を有する１５０万人もの多く
の個体が存在し得ると見積もっている。この協会は、定期的な静脈切開プログラ
ムにあるおよそ５，０００の患者の記録を有しており、これは、約６ユニット／
年、または３０，０００ユニットを除去する。赤血球代替物は、用量等量を確立
し、その結果、１ｇ／ｄｌの血漿ヘモグロビンが、７ｇ／ｄｌの赤血球ヘモグロ
ビンとして出血モデルにおいて有効である。従って、この患者の群だけで、１年
あたり、１５０，０００ユニットもの多くの人工血液のための生の材料を提供し
得る。

【００３１】 （実施例２） 本発明の実施形態において、ベッドサイドでドナー／患者の血液を収集するた
めに設計された内蔵式のポータブルユニットが使用される。この適用のための適
切なシステムには、Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ ＭＣＳ＋８１５０血液収集システ
ム（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ，
ＭＡ）およびＣＯＢＥ ２９９１細胞プロセッサ（ＣＯＢＥ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＣＯ）が含まれる。血液は、ＣＰ２Ｄ
／ＡＳ−３抗凝集剤／添加物システムにおいて、抗凝集剤と抗凝集化血液が１：
１６の比で収集される。この装置は、約２５分間で単一のドナーからの赤血球の
１ユニットまたは２ユニットのいずれかを収集するように構成される。収集され
た各ユニットは、およそ１８０ｍｌの充填された赤血球（「ＲＢＣ」）および４
００ｍｌの血漿を産生する。以下の関係が、分離の効率を決定するために使用さ
れ得る： ［（処理後重量ＲＢＣ計数×処理後重量）／（処理前ＲＢＣ計数×処理前重量）
］×１００＝ＲＢＣ回収％ 充填された赤血球内に残存する白血球の数は、５×１０⁸未満であるべきである
。絶対的な白血球（「ＷＢＣ」）計数は： （１ミリリットルに転換したＷＢＣ計数）×（１ミリリットル中の産物容積）で
あり、 一方、その残存する割合は： ［（処理後重量ＷＢＣ計数×処理後重量）／（処理前ＷＢＣ計数×処理前重量）
］×１００＝ＷＢＣ残存％ である。

【００３２】 基本的な市販の血球処理システムの例は、Ｌａｔｈａｍ，Ｊｒ．の特許番号第
４，３０３，１９３号およびＴｏａｖｓらの特許番号第５，９２１，９５０号に
提供される。これらの特許の開示は、本明細書中で参考として援用される。一般
的に、市販の血球処理システムは、ヒトドナーからの血液を、２つの成分（１つ
は、血漿に富み、他方は細胞成分に富む）に分離するために自己バランス（ｓｅ
ｌｆ−ｂａｌａｎｃｉｎｇ）遠心分離を使用する。この装置は、血液ドナー／患
者とじかに隣接して使用されることを意図する。血液の流れの経路は、完全に使
い捨ての処理セット（静脈切開用針および、約６３０ｍｌの容量を有する可撓性
の血液処理バッグに静脈切開用針を接続する、血液適合性チュービングを含む）
である。この処理セットには、チューブハーネス、回転シールおよび上清収集容
器もまた含まれる。回転シールは、血液処理バッグの中への、またはその外への
液体の通過を可能にするが遠心分離ローターは回転している。このシールは、液
体が液体経路の外に漏出すること、および空気が液体中に漏出することを防ぐ。
チューブハーネスは、赤血球への洗浄溶液の導入のための滅菌した液体経路を提
供する。３つのバルブが血液処理バッグへの血液または洗浄溶液の流れを制御す
る。各々のバルブは、ソレノイド制御されるピンチバルブであり、システムコン
ピュータの制御下にあり、そしてチュービングにおける液体との直接的な接触を
有さない。処理バッグの外縁の滅菌出力ポートは、バッグから滅菌容器への処理
された細胞の輸血を直接的に可能にする。

【００３３】 このバッグは、遠心分離ローター中の輪郭化された（ｃｏｎｔｏｕｒｅｄ）処
理チャンバ内に支持されるように構成され、それにより第２の血液成分はバッグ
内の短い次元にそって進み、分離が達成される。水圧操作される仕切り板（ｄｉ
ａｐｈｒａｇｍ）を備える交換チャンバがまた、遠心分離ローターの血液処理チ
ャンバ内に配置される。可撓性の仕切り板下の領域への、およびその領域からの
動水性液体の流れは、遠心分離ドライブの回転およびピンチバルブソレノイドに
より制御される。水圧システムは、配管およびリザーバー（プラスチックバッグ
）の流量ネットワークを伴って、能動的置換ピストン型ポンプアセンブリ、流速
制御およびスイッチから構成される。このポンプは、可変速度の逆転可能モータ
ーにより駆動される。このポンプの最大容積は、約６００ｍｌに調節される。ポ
ンプモーター制御は、設定速度で前に駆動され、血液処理バッグ上に圧力を働か
せることにより上清を急送する。これにより、上清を、１つの開口バルブを通し
てバッグから上清収集容器へ出させる。これは、赤血球が光センサーを通して検
知されるか、上清外容積が達するかもしくは停止するか、またはホールド機能が
開始されるまで続く。このポンプは、逆向きに駆動され、遠心分離水圧液体チャ
ンバから、およびリザーバーから液体をくみ出す。次いで、この遠心分離ロータ
ーは、停止され、ドナーへの第２の血液成分の戻りを可能にし得る。全ての機能
がコンピューター制御下であるので、オペレーターによる介在は最小限であり、
従ってオペレーターの間違いの確率はわずかである。

【００３４】 遠心分離ボウルの容積は、約２５０ｍｌであり、遠心分離速度は約４，０００
ｒｐｍである。血液をいれた遠心分離の領域を、滅菌生理食塩水で希釈する。そ
して、非赤血球成分および血漿の連続除去により赤血球を濃縮する。この目的は
、血清アルブミンの量をできるだけ低いレベル（好ましくは検出不能まで）に減
らすことである。非赤血球成分は、廃棄されるかまたは他の目的に用いられ得る
。

【００３５】 ＲＢＣ洗浄工程後の血清タンパク質除去の評価を、血球プロセッサーの製造業
者により指示された手順を用いて実行する。例えば、ＣＯＢＥ ２９９１ Ｃｅ
ｌｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒにおいて、赤血球洗浄後、１ｍｌのサンプルを、血液
バッグ中の滅菌ポートを通じて取り出し、実験室の遠心分離機中で遠心分離し、
そしてその上清を収集する。市販のタンパク質化学のディップスティックウエッ
トパッド（ｄｉｐｓｔｉｃｋ ｗｅｔ ｐａｄ）を、上清を試験するために用い
得、ここで色調変化がタンパク質レベルの指標である。タンパク質レベルは、痕
跡量である（１５〜３０ｍｇ／ｄｌ）か、またはそれより少ないべきであり、こ
のことは、９６％以上の血漿減少を示す。

【００３６】 初回の洗浄期間後、生理食塩水を滅菌水に交換する。図３を参照すれば、赤血
球が滅菌水と最初に接触するとき、それらのいくらかは溶解し、溶液中にヘモグ
ロビンを遊離することが理解され得る。溶解のための条件は以下に考察されてい
る。無細胞成分は、この時収集され得、そして蒸留水注入が続き、懸濁培地のイ
オン強度が減るにつれ、ヘモグロビンをますます遊離する。十分な時間を考慮す
れば、遠心分離ボウルに赤血球のゴーストを残すのみで、全てのヘモグロビンを
取り出すことが可能である。

【００３７】 溶血血液の容積は、所望のレベルの溶解を達成するのに必要な蒸留水の量に依
存する。しかし、ヘモグロビン溶液は、意図される用途によっては、さらに濃縮
されることが必要であり得る。ＮａＣｌが、ヘモグロビン溶液に伴い得るので、
引き続く精製が必要であり得る。最終溶液のイオン強度の迅速で鋭敏な測定は、
伝導率測定によって達成され得る。

【００３８】 （ヒト赤血球の溶解の条件） 循環している赤血球での長い生存期間にもかかわらず、ヘモグロビンは、脆弱
なタンパク質である。これは、４つのポリペプチドサブユニットである、２αお
よび２βから構成される。α鎖およびβ鎖は、強固に連結されてαβサブユニッ
トとなり、そしてαβサブユニットは、安定性の弱いデトラマー（完全に形成さ
れたヘモグロビン分子）を形成する。４つのサブユニットのそれぞれは、鉄補欠
分子基であるヘムを含む。鉄原子は、酸素に結合するために還元されたＦｅ⁺⁺状
態で維持される。この還元状態の維持は、赤血球内の多数の酵素系の存在による
。ヘモグロビンが細胞から遊離されれば、この防御はもはや存在せず、そして最
終的に分子の分解を導く一連の事象が生じる。これらの事象は、ヘム−グロビン
結合を失わせる鉄の酸化、ヘムの遊離、テトラマーからダイマーへの分離、グロ
ビンの変性、および最終的には沈降である。従って、赤血球代替物の生成におい
ては、これらの分解工程の１つ以上を妨げるために非常に穏やかにこのタンパク
質を取り扱うことが非常に重要である。そのようにしなければ、生の材料および
濾過されなければならない沈殿の形成の損失を導く。さらに、部分的に変性され
たまたは分解されたヘモグロビン分子でさえ、可逆的に酸素に結合せず、従って
酸素キャリアとして実用でない。

【００３９】 概して、ヒト赤血球を溶解するためには３つの方法が存在する。第１には、ヒ
ト赤血球は繰り返し、凍結され融解され得る。細胞内のおよび細胞の周りの氷の
形成は、膜を破壊し、そしてヘモグロビンが遊離される。しかし、この方法を用
いる溶解は、周知のことだが不完全であり、そしてヘモグロビン変性が生じ得る
。第２の方法において、ＣＣｌ₄またはトルエンのような有機溶媒が用いられ得
る。この方法はより有効であるが、この溶媒はまた、タンパク質の安定性に有害
に影響し得る。

【００４０】 第３の方法は、上記のような浸透圧性溶解である。浸透圧性溶解に対する赤血
球の感受性は周知である。

【００４１】 （評価されたプロセス有効性） ＣＯＢＥ ２９９１ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒについてのプロトコール
に従う収率は、８２％の平均ＲＢＣ回収と報告されている。これは、血漿の９９
％および白血球の９３．４％までの除去を伴う。赤血球を遠心分離的に洗浄しそ
して溶解するための本発明の方法を用いて、５０ｇの開始量から約４０ｇの無ス
トロマヘモグロビン（「ＳＦＨ」）を得る。これは８０％の収率と評価される。
従って、最終収率は、開始材料から処理したＳＦＨで約６６％質量になると見積
もられる。

【００４２】 ヘモグロビン産生における問題は、タンパク質変性である。ヘモグロビンは、
希釈、圧力、せん断、温度およびｐＨの変化の効果に対して感受性である。これ
らの因子は、酸化、沈降、ヘム損失、およびサブユニット解離を含む問題を導き
得る。従って、全ての処理工程は一定のかつ低い温度で実行されることが重要で
ある。例えば、ＣＯＢＥ ２９９１ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒは、冷蔵さ
れ４℃に維持される。さらに撹拌は激しすぎてはならず、ｐＨ変化は急激ではな
らず、そして圧力は高いレベルに達してはいけない。

【００４３】 （特徴付けおよび品質管理） ストロマの混入の測定を、総リン酸塩アッセイを用いることにより実行し得る
。ヘモグロビン溶液からのリン脂質の抽出は、困難であり得、そのため総リン酸
塩アッセイがより簡易で、かつ費用の少ない手順である。このアッセイは、かな
り敏感ではあるが、リン酸塩の供給源を識別し得ない。

【００４４】 細胞内酵素は、赤血球混入の第２の可能性のある群を構成する。しかし、この
型のいくつかの混入は、血液代替物において受容され得る可能性がある。分析的
ＦＰＬＣは、無ストロマヘモグロビン産物の均質性を評価するために用いられ得
る。これには、非ヘモグロビンタンパク質からのＳＦＨを分離するために２８０
ｎｍのフィルターを用いる。

【００４５】 内毒素測定を、Ｌｉｍｕｌｕｓ ａｍｅｂｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ
）凝集カスケードの限界に基づく動態学的比濁アッセイを用いて実施し得る。こ
のようなアッセイは、当該分野で周知である。（例えば、Ｃｏｈｅｎら、Ｂｉｏ
ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｏｒｓｅｓｈｏｅ Ｃｒａ
ｂ（Ｌｉｍｕｌｉｄａｅ）、１９７９、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ．，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。

【００４６】 無ストロマヘモグロビン溶液のｐＨおよび伝導率を、従来のｐＨメーターおよ
び導電率計（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．，Ｐｉｔｔ
ｓｂｕｒｇｈ，ＰＡのＡｃｃｕｍｅｔ ｌｉｎｅにおけるｐＨメーターおよび導
電率計）を用いて測定し得る。スペクトル分析は、溶液中のヘモグロビン濃度お
よびメトヘモグロビンの量の評価を提供し得る。このような分析は、ソレー（Ｓ
ｏｒｅｔ）領域および可視領域において、ＶａｎｄｅｇｒｉｆｆおよびＳｈｒａ
ｇｅｒ（「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｘｙｇｅｎ ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕ
ｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｂｙ ｒａｐｉｄ ｓｃａ
ｎｎｉｎｇ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｓｉｎｇｕｌａｒ
ｖａｌｕｅ ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ」、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２
３２：４６０〜４８５、１９９４）（本明細書において参考として援用される）
により記載される多成分性の分計技術によって実行される評価を備える、Ｍｉｌ
ｔｏｎ Ｒｏｙ ３０００などの急速走査ダイオードアレー分光光度計（ｒａｐ
ｉｄ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏ
ｍｅｔｅｒ）を用いて実行し得る。

【００４７】 ヘモグロビン溶液の機能的状態を決定するための最も鋭敏な試験は、その酸素
結合曲線を測定することである。このような方法の１つは、新規な酵素系による
、閉鎖した光学キュベット中の酸素の直線的な消費を必要とする。その酸素が枯
渇すれば、反復する可視化スペクトルが得られ、一方、ＰＯ₂がＣｌａｒｋｅ型
電極を用いて同時に測定される。ヘモグロビンを、０．１Ｍのビス−Ｔｒｉｓプ
ロパンまたはリン酸塩緩衝液中で、約６０μｍ（ヘム濃度で）の濃度まで希釈す
る。反応は約１５分行われる。この反応は、基質として、プロトカテク酸（ＰＣ
Ａ，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を用い、そし
て酵素プロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼ（ＰＣＤ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）により、生成物に転換された各１モル
のＰＣＡについて１モルのＯ₂を消費する。この実験後、ＰＯ₂値はスペクトルに
適合している。このスペクトルは、多成分分析およびカーブフィッティング手順
に供され、酸素結合曲線のパラメーター（Ｐ５０、Ｈｉｌｌ’ｓ パラメーター
、ｎ）を決定する。これらのスペクトルを分析する過程において、メトヘモグロ
ビンの相対的な比を、脱酸素における各工程について算出する。さらに、この方
法およびおよび分析は、変性および分解の産物のような、なんらかのさらなるヘ
モグロビン成分の存在を示す。

【００４８】 本発明を用いて生成されたヘモグロビン溶液はまた、ｐＨ範囲８．５〜５．５
におけるアガロースおよびポリアクリルアミド上の等電点電気泳動（ＩＥＦ）に
より特徴付けられる。サブユニット構造は、硫酸ドデシルアクリルアミドゲル電
気泳動によって評価される。スペクトル分析は、溶液中のヘモグロビン濃度なら
びにメトヘモグロビンおよびカルボキシヘモグロビンの量の評価を提供する。ス
ペクトルを、ソレー領域および可視領域において、急速スキャンニングダイオー
ドアレー分光光度計で収集する。スペクトルを、多成分分析により評価する。他
の品質管理手段は、ヘモグロビンの濃度、ｐＨおよび伝導率の測定を含む。さら
なる品質管理手段を、必要な場合、実施する。

【００４９】 （実施例３：記載された本発明を用いる改変ヘモグロビンの調製） 本発明を、さらに用いて、図４に示される、記載された改変セルセパレーター
デバイスにおいて調製した無ストロマヘモグロビン（ＳＦＨ）溶液を用いる、改
変ヘモグロビン溶液（「本製品」）を調製し得る。

【００５０】 赤血球は、任意の供給源（動物もしくはヒト、貯蔵もしくは新鮮、または血液
バンクから得た古いヒトユニットでさえ、を含む）から得られ得る。改変手順は
また、任意の手段（本発明を含む）または他の方法（組換えヘモグロビンを含む
）により調製されたヘモグロビン溶液を用いる。ドナー血液を用いる場合、それ
はまず抗凝血剤５０と混合され、遠心分離ボウル５２中で通常の生理食塩水を用
いて洗浄され、そして蒸留水５６を用いて溶解される。血漿、血小板および白血
球画分を除去し、そして分離容器５８に保存する。このヘモグロビン溶液（ＳＦ
Ｈ）６０を、分離リザーバー６２、または遠心分離ボウル５２のいずれかに入れ
、ここで化学修飾を行う。濾過後、最終製品を滅菌容器６４に収集し、これを以
後の使用のために貯蔵し得る。

【００５１】 記載した装置中で調製したＳＦＨがさらに製品に処理されるべき場合は、ＳＦ
Ｈは、化学修飾のための事前測定した試薬を含むリザーバー中に収集される。好
ましい方法において、この試薬は緩衝化塩、イミノチオラン（ｉｍｉｎｏｔｈｉ
ｏｌａｎｅ）および活性化ポリエチレングルコールである。反応時間の終わりに
、改変ヘモグロビン（ＰＥＧ−Ｈｂ）を、プラスチックバッグまたは他の貯蔵容
器に収集しそして貯蔵する。

【００５２】 ＰＥＧでの反応は、好ましいヘモグロビン改変であるが、任意の記載された改
変が本発明の記載された装置によって実行され得、そしてこれらの手順は血液代
替物調製の分野で周知である。このような改変としては、例えば、ヘモグロビン
の内部架橋剤、重合化反応、または表面改変（デキストラン、デンプン、または
他の合成ポリマーもしくは天然ポリマーによる）を含み得る。

【００５３】 この製品は、これをフィルター６６およびフィルター６８を通して通過させる
ことによりさらに精製し得る（図４）。このようなフィルターおよび超遠心分離
デバイスは、例えば、サイズ排除フィルター、イオン交換フィルター、混合ベッ
ドイオンエクスチェンジャー、活性炭フィルター、または他のインラインフィル
ター（タンパク質精製または透析手順において用いられる）であり得る。

【００５４】 この製品の滅菌は、多くの手順により同じ装置において実行され得る。この手
順としては、溶媒−界面活性剤処理、γ線照射、ナノ濾過、メチレンブルーもし
くは類似の誘導体、または細菌およびウイルスのような生物を不活性化するかも
しくは除去するための任意の他の手段が挙げられる。

【００５５】 本発明の方法は、輸液に利用可能な血液の重大な世界的不足に取り組み得る血
液代替物を生成するために必要な赤血球のより迅速かつ低コストの収集のための
手段を提供する。本発明の方法は、古い血液の処理のために用いられ得るが、イ
ンサイチュでドナー／患者のベッドサイドで用いた場合に最も有利である。この
処理はコンピューター制御の完全内臓式装置で実行されるので、取り扱いは最小
限であり、そして汚染の危険性は限られている。この手順はまた、収集された血
液の型および貯蔵ユニットの必要性を排除する。そしてこの目的のために集めら
れたユニットは、感染性因子の試験のコストを減らすためにプールされ得る。

【００５６】 発明の詳細な説明に特に含まれていなくても、本発明の範囲および精神に含ま
れる、さらなる実施形態および適用が存在することが証明される。本明細書は、
限定を意図せず、そして本発明の範囲は、前述の特許請求の範囲によってのみ限
定される。

【図面の簡単な説明】

本発明の理解は、添付の図面を一緒に考慮して、以下の本発明の好ましい実施
形態の詳細な記載を考慮することによって容易にされる。この図面では、同様の
数字は、同様の部分を示す。ここで、図面は以下のとおりである。

【図１】 図１は、無ストロマヘモグロビンの調製において使用するための赤血球プロセ
ッサの図である。

【図２】 図２は、充填された赤血球からの無ストロマヘモグロビンの生産のためのフロ
ー図である。

【図３】 図３は、本発明に従った処理フローのブロック図である。

【図４】 図４は、「血液代替物」を生産するための本発明の１つの可能な構成の模式図
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｂ０４Ｂ 5/00 Ｂ０４Ｂ 5/00 Ｚ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4C058 AA22 BB07 CC06 JJ06 JJ26 4C077 AA12 BB02 BB04 DD13 JJ03 JJ12 KK09 KK11 KK25 NN03 PP29 4C087 AA04 BB34 DA06 DA08 DA17 MA66 NA01 ZA52 4D057 AA03 AB01 AC01 AE11

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヘモグロビン溶液を、遠心分離器を備える自動化血液分離器
   内で赤血球を含む溶液から生産するための方法であって、該方法は、以下の工程
   ： （ａ）該溶液中の該赤血球を単離する工程； （ｂ）該単離工程の間に産生される上清を除去する工程； 洗浄溶液中で該赤血球を洗浄する工程； （ｃ）該赤血球を溶解して溶血産物を作製する工程；および （ｄ）該溶血産物から該赤血球のストロマを分離する工程、 を包含する、方法。
2. 【請求項２】 前記洗浄溶液が、通常の生理食塩水溶液を含む、請求項１に
   記載の方法。
3. 【請求項３】 前記洗浄溶液が、細菌を殺傷するための因子を含む、請求項
   １に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記洗浄溶液が、ウイルスを不活化するための因子を含む、
   請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記工程（ａ）〜（ｄ）が、前記遠心分離器の中に配置され
   た単一の処理容器内において実施される、請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 さらに、前記溶血産物のイオン濃度を測定する工程を包含し
   、ここで、前記工程（ｃ）および（ｄ）が該イオン濃度が所定レベルにまで減少
   するまで反復される、請求項１に記載の方法。
7. 【請求項７】 細胞処理装置内において実施される、赤血球および血漿を含
   む溶液からヘモグロビンを産生するための方法であって、該方法は、以下の工程
   ： 処理バッグおよびチューブハーネスを備える滅菌処理セットにおいて該溶液を
   収集する工程であって、該処理バッグは、該細胞処理装置における遠心分離器内
   に配置される、工程； 該遠心分離器内の該処理バッグを回転させることによって、該赤血球を該血漿
   から分離する工程； 該処理バッグから該血漿を圧搾する工程； 該処理バッグへ洗浄溶液を導入して、該赤血球を洗浄する工程； 洗浄後に上清を圧搾する工程； 該赤血球を、蒸留水を該処理バッグへ導入することによって溶解して、ヘモグ
   ロビンを溶液中に遊離させる工程； 該遠心分離器において該処理バッグを回転させることによって、該ヘモグロビ
   ン溶液から赤血球膜を分離する工程；ならびに 該処理バッグにおける滅菌ポートを通じて該ヘモグロビン溶液を取り出す工程
   、 を包含する、方法。
8. 【請求項８】 前記赤血球膜をヘモグロビンから分離する工程が、以下： 前記蒸留水が、前記赤血球に最初に接触するときに生成される最初に生成され
   たヘモグロビンを取り出すこと；および 該溶液のイオン濃度が減少するにつれて生成されるさらなるヘモグロビンを連
   続的に取り出すこと、 を包含する、請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 さらに、 前記溶液から前記ヘモグロビンを取り出す工程によって生成されるヘモグロビ
   ン溶液のイオン強度を測定する工程； さらなる蒸留水を添加する工程；および 前記さらなるヘモグロビンを取り出す工程および前記さらなる蒸留水を添加す
   る工程を、該イオン強度が所定の閾値に達するまで反復する工程、 を包含する、請求項８に記載の方法。
10. 【請求項１０】 細胞処理装置において処理容器内の充填された赤血球から
    ヘモグロビンを分離する方法であって、該方法は、該装置内で実施される以下の
    工程： 生理食塩水溶液を用いて、該処理容器における該赤血球を洗浄する工程； 該処理容器内の該赤血球を溶解する工程； 該処理容器内のヘモグロビンから、赤血球膜および溶解されていない赤血球を
    分離する工程；ならびに 該処理容器から溶液中に該ヘモグロビンを抽出する工程、 を包含する、方法。
11. 【請求項１１】 前記分離する工程が、前記装置内で前記処理容器を遠心分
    離して、前記赤血球膜および溶解していない赤血球を充填することを包含する、
    請求項１０に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記洗浄する工程が、前記生理食塩水溶液に、界面活性剤
    、抗菌因子または抗ウイルス因子を添加することを包含する、請求項１０に記載
    の方法。
13. 【請求項１３】 さらに、前記ヘモグロビン溶液のイオン強度を測定する工
    程を包含し、ここで、前記溶解する工程、分離する工程および抽出する工程が、
    該イオン強度が、所定のレベルにまで減少するまで反復して実施される、請求項
    １０に記載の方法。
14. 【請求項１４】 改変されたヘモグロビン溶液を調製するための方法であっ
    て、該方法は以下の工程： 通常の生理食塩水溶液に、充填された赤血球を混合する工程； 該赤血球を生理食塩水溶液を用いて洗浄する工程； 該赤血球を溶解する工程； 該赤血球をダイアフィルトレートしてストロマを取り出す工程； 該ダイアフィルトレートされた赤血球をダイアフィルトレートする工程； 得られたヘモグロビン溶液を容器中に収集する工程であって、該容器は、該ヘ
    モグロビン溶液の化学的改変のために適合された予め測定された試薬を含む、工
    程； 該試薬と、該ヘモグロビン溶液とを反応させる工程；ならびに 該反応させた溶液を保存容器中に保存する工程、 を包含する、方法。
15. 【請求項１５】 前記予め測定された試薬が緩衝塩を含む、請求項１４に記
    載の方法。
16. 【請求項１６】 前記緩衝塩がイミノチオレーンおよび活性化ポリエチレン
    グリコールである、請求項１５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 さらに、前記反応させた溶液を濾過する工程を包含する、
    請求項１４に記載の方法。
18. 【請求項１８】 さらに、前記反応させた溶液を滅菌して、生物を除去する
    かまたは不活化する工程を包含する、請求項１４に記載の方法。