JPH11512753A - 濃縮抗体製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、濃縮された抗体製剤、そのような製剤を含有する医薬処方物、ヒト治療におけるその使用、およびその製造法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 濃縮抗体製剤 本発明は、濃縮された抗体製剤、そのような製剤を含有する医薬処方物、ヒト の治療におけるその使用、およびその製造法に関する。 高濃度で製造された市販の免疫グロブリンの多くは、ヒト血清から得られ、血 液製剤製造業によって製造されている。臨床的に使用された精製ヒト免疫グロブ リンＧ（IgG）の最初の製剤は、1940年代に調製された免疫血清グロブリンであ った（Cohn，E.J．et al“Preparation and properties of serum and plasma p roteins.”J．Am．Chem．Soc．68：459−475(1946)およびOncley，J.L．et al“ The separation of antibodies，isoagglutinins，prothrombin，plasminogen a nd β-lipoproteins into sub-fractions of human plasma.”J．Am．Chem．Soc ．71：541−550(1949)）。 次世代の精製IgGが1960年代に開発されたが、それらは静脈内投与に適する製 剤が中心であった（Barandun，S．et al“Intravenous administration of huma n γ-globulin.”Vox．Sang．７：157−174(1962)）。これらの最初のIgGの静脈 内用製剤（Gamimune（商標名）、Cutter Biological）は、0.2Ｍグリシン、10％ マルトース、pH 6.8における５％（50mg/ml）IgG溶液として処方されていた。こ の溶液は、５℃で少なくとも２年半は安定であった。静脈内用IgG（IVIG）製剤 の承認に関する重要な基準は、IgGの断片化がほとんど生じないこと、そして高 分子量の凝集物が存在しないことであった。 今日、ヒトの治療用免疫グロブリン製剤が、筋肉内（IMIG）または静脈内（IV IM）のいずれかで投与するために用いられている。IMIGは、Ａ型肝炎の予防のた めに主に使用され、そして無ガンマグロブリン血症患者の処置のために時々使用 されている。IVIGは、続発性免疫不全症、種々の感染、血液学的疾患および他の 自己免疫疾患のためだけでなく、原発性免疫不全症および突発性血小板減少症の 処置において使用されている。一般に、IMIG製剤は16％（w/v）（160mg/ml）溶 液として、IVIG製剤は５％（w/v）（50mg/ml）溶液として市販されている。 製造業者のIVIGに関する経験によって、これらの製剤は、（10％（w/v）未満 の）比較的薄い溶液では不安定であることが示されている。この不安定性は、材 料を室温で貯蔵しているときの「シェディング（shedding）」として知られてい る過程によって、不溶性粒子が形成されるためであることが明らかにされている （Fernandes，P.M．and Lundband，J.L.“Preparation of a stable intravenou s gamma-globulin：process design and scale up.”Vox．Sang．39：101−112( 1980)）。市販の16.5％γ−グロブリンは、通常、緩衝化されたグリシン−生理 食塩水溶液中で安定化されている。安定化剤としてのマルトースを５〜10％で使 用することによって、５％IVIGの微粒子形成からの保護に有効であることが明ら かにされている（Femandes et al 前出）。 シェディングに加えて、濃縮された（16.5％）IVIG溶液は、長期間の貯蔵の間 に凝集しやすい。10〜30％（w/w）もあるIVIG溶液は、凝集物から構成されるこ とがある（Gronski，P．et al“On the nature of IgG dimers．I．Dimers in h uman polyclonal IgG preparations：kinetics studies.”Behring Inst．Mitt. 82:127−143(1988)）。 これらの凝集物の大部分は、イディオタイプ抗体および抗イディオタイプ抗体 の複合体によって生成したダイマーである。組織培養上清から調製されるモノク ローナル抗体は抗イディオタイプ抗体を含有しないため、このようなダイマーは 存在しない。しかし、これらの製剤では、部分的に変性したモノマー状の抗体分 子間の複合体形成によって、ダイマーが形成されることがある。抗体製剤を濃縮 するために使用されるタンジェント流限外ろ過の間にかかるような物理的な力に よっても、凝集物生成を増大させることがある（Wang，Y.-C.J．and Hanson，M. A.“Parenteral formulations of proteins and peptides：stability and stab ilisers.”J．Parenteral Sci．Technol．42(Suppl)：S3−S26(1988)）。 従って、免疫グロブリンの（100mg/mlよりも高い）濃縮製剤が用いられている が、現在までのところ、これらは、血液処理業から得られるポリクローナル抗体 製剤であり、グリシンおよびマルトースなどの種々の添加剤の添加によって安定 化されている。 従って、モノクローナル抗体製剤が、凝集物の増大を伴うことなく、添加剤の 非存在下で100mg/mlよりも高い濃度で得られることは驚くべきことである。 日本国特許公報JP01268646A（AN89-359879）のDerwent要約は、当該出願に、0 .1μg/ml〜100mg/mlの濃度を有するIgG₃モノクローナル抗体の注射用製剤が記載 されていることを報告している。これらの刊行物において開示されている事項は 、本発明の範囲外である。 従って、本発明は、ヒトに投与されるモノクローナル抗体製剤であって、該製 剤中の抗体が、100mg/mlまたはそれよりも高い濃度、好ましくは100mg/mlよりも 高い濃度であることを特徴とするモノクローナル抗体製剤を提供する。350mg/ml よりも高い濃度では、製剤は非常に粘度が高くなることがあり、そして回収率は 受容できないほど低くなる。理想的な濃度は、100mg/ml〜300mg/mlである。 本発明による製剤は、実質的に凝集物を含まない。凝集した不純物の許容レベ ルは、５％未満であり、理想的には２％未満である。より日常的には約１％では あるが、0.2％ほどの低いレベルが達成されることがある。製剤はまた、好まし くは、ポリクローナル処方物の安定化のために従来から使用されている添加剤（ 例えば、グリシンおよび／またはマルトース）を含まない。 従って、本発明は、ヒトに投与されるモノクローナル抗体製剤であって、その モノクローナル抗体製剤中の抗体は、100mg/mlまたはそれよりも高い濃度、好ま しくは100mg/mlよりも高い濃度であり、製剤は、実質的に凝集物を含まないこと によって特徴づけられるモノクローナル抗体製剤を提供する。 組換え抗体が、まさにそれらの性質によって、合成かつ非天然の細胞培養環境 で得られる。商業化のために十分な量のタンパク質を生成させるために使用され ている発現システムは、日常的には、骨髄腫またはチャイニーズハムスターの卵 巣（CHO）の宿主細胞に基づいている。 そのような細胞を培養するために、動物性タンパク質を全く含有しない複雑な 合成培地が考案され、その結果、自然界で生じているとは考えられないタンパク 質のグリコシル化パターンが得られている。従って、そのような合成条件下で生 成される複雑な糖タンパク質が、そのすべての緩衝化能力とともに、正常なヒト 血清中に存在するよりも数倍高い濃度で調製され得ることは、実に、さらに驚く べきことである。 従って、本発明は、ヒトに投与されるモノクローナル抗体製剤であって、その モノクローナル抗体製剤中の抗体は、組換え抗体であり、100mg/mlまたはそれよ りも高い濃度、好ましくは100mg/mlよりも高い濃度であることによって特徴づけ られるモノクローナル抗体製剤を提供する。製剤は、好ましくは、実質的に凝集 物を含まない。 治療または診断のために使用されるとしても、精製抗体を作製する間、抗体は 貯蔵時に十分に安定であることが重要である。種々の化学種は、抗体の安定性に 悪作用を有することがある。例えば、微量の銅（Cu⁺⁺）は、現在、貯蔵時の免疫 グロブリン分子に対して不安定化作用を有すること（WO93/08837）、そしてこの 作用は、銅イオンの適切なキレーター（例えば、EDTAまたはクエン酸イオン）と ともに免疫グロブリン分子を処方することによって排除され得ることが知られて いる。 本発明は、すべてのクラスの免疫グロブリン（すなわち、IgM、IgG、IgA、IgE およびIgD）の製剤に適用でき、そしてFabフラグメントおよび二重特異性抗体の 製剤にも拡大される。本発明は、好ましくは、IgG₁、IgG₂、IgG₃およびIgG₄のサ ブクラスを含むIgGクラスの免疫グロブリン製剤に適用される。本発明は、より 好ましくはIgG₄およびIgG₁のクラス、最も好ましくはIgG₁クラスの免疫グロブリ ン製剤に適用される。 本発明は、組換え抗体、最も詳しくはキメラ抗体またはヒト化（CDR融合）抗 体の調製において特に適用される。これらの具体的な例として、CD2、CD3、CD4 、CD5、CD7、CD8、CD11a、CD11b、CD18、CD19、CD23、CD25、CD33、CD54およびC Dw52の各抗原に対するキメラ抗体またはヒト化抗体が挙げられる。さらなる例と して、種々の腫瘍細胞マーカー（例えば、40kd［J．Cell．Mol．125(2)：437−4 46(1994)］）あるいはＢ型肝炎またはヒトサイトメガロウイルスなどの感染因子 の抗原に対するキメラ抗体またはヒト化抗体が挙げられる。特に好ましい例とし て、CDw52、CD4およびCD23の各抗原に対するキメラ抗体またはヒト化抗体が挙げ られる。 治療的使用を目的とする免疫グロブリンは、一般に、医薬用処方物の形態で患 者に投与される。そのような処方物は、好ましくは、免疫グロブリンに加えて、 他の免疫グロブリンまたは薬物（例えば、抗生物質）などの他の薬剤の１つ以上 と混合されるかもしないが、生理学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む 。適切なキャリアとして、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない： 生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、グルコースおよび緩衝化生理食塩水、ク エン酸緩衝化生理食塩水、クエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝液、マレイン酸緩 衝液（例えば、マレイン酸／水酸化ナトリウム緩衝液）、コハク酸緩衝液（例え ば、コハク酸／水酸化ナトリウム緩衝液）、酢酸緩衝液（例えば、酢酸ナトリウ ム／酢酸緩衝液）、またはリン酸緩衝液（例えば、オルトリン酸二水素カリウム ／オルトリン酸水素二ナトリウム緩衝液）。必要に応じて、処方物は、抗体安定 化の ためにポリソルベートを含有する。あるいは、免疫グロブリンは凍結乾燥（冷凍 乾燥）され、水および／または上記の水性緩衝化溶液を添加することによって必 要時に使用するために再構成され得る。 本発明のよる医薬用処方物の好ましいpHは、個々の投与経路に依存する。しか し、濃縮溶液中での抗体の溶解度を最大にするために、溶液のpHは、抗体の等電 点のpHと異なっていなければならない。 従って、本発明のさらなる面によれば、本発明は、ヒトに投与されるモノクロ ーナル抗体製剤であって、そのモノクローナル抗体製剤中の抗体は、100mg/mlま たはそれよりも高い濃度であり、製剤のpHが抗体の等電点のpHと異なっているこ とによって特徴づけられるモノクローナル抗体製剤を提供する。 投与経路は、日常的には非経口的であり、静脈内、筋肉内および腹腔内への注 入または送達を含む。しかし、製剤は、例えば、１用量あたりの容量が約１mlで あるように、容量が少なくなければならない皮下用処方物を得るために特に有用 である。そのような処方物において治療的な投薬を確実に達成し得るために、濃 縮された製剤が常に必要である。皮下用製剤に好ましい濃度は、例えば、100mg/ ml〜200mg/ml（例えば、150mg/ml〜200mg/ml）の範囲内である。皮下用製剤は自 分で投与することができ、従って静脈内投与のために病院に行かなければならな いことが避けられるという利点を有する。 好ましくは、本発明による皮下用処方物は等張であり、特定のpHに緩衝化され ている。皮下用処方物に好ましいpH範囲は、一般に、pH４〜pH９の範囲である。 好ましいpH、従って緩衝液は、上記のように抗体の等電点に依存する。従って、 抗CD4抗体を含有する皮下用製剤の場合、pHは、好ましくは、pH４〜pH 5.5、例 えばpH 5.0〜pH 5.5の範囲、例えばpH 5.5である。抗CD23抗体の場合は、pH４〜 pH 6.5の範囲内である。従って、抗CD4抗体を含有する皮下用製剤における使用 に好ましい緩衝液は、マレイン酸、コハク酸、酢酸、あるいはより好ましくはリ ン酸の緩衝液である。緩衝液は、好ましくは、50mM〜100mMの濃度で使用される 。 本発明による皮下用製剤はまた、必要に応じて、溶液の張度を調節するために 塩化ナトリウムを含有させることができる。 従って、本発明のさらなる面によれば、本発明は、ヒトに皮下投与されるモノ クローナル抗体製剤であって、該製剤中の抗体が、100mg/mlまたはそれよりも高 い濃度であり、該製剤のpHが抗体の等電点のpHと異なっていることを特徴とする モノクローナル抗体製剤を提供する。 本発明のさらなる面において、モノクローナル製剤は、ヒトの治療において使 用することが考えられる。以下のような種々のヒトの障害を処置することができ る：例えば、ガンまたは感染性疾患（例えば、上記の疾患）、ならびにＴ細胞媒 介性障害などの免疫不全症であって、重篤な血管炎、慢性関節リウマチ、全身性 狼瘡、さらに自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、対宿主性移植片病、乾癬、 若年発症糖尿病、シェーグレン病、甲状腺疾患、重症筋無力症、移植拒絶反応、 炎症性腸疾患および喘息）を含む免疫不全症。 従って、本発明は、上記障害のいずれかの処置に必要な医薬品の製造において 、本明細書に記載される濃縮モノクローナル抗体製剤の使用を提供する。さらに 、何らかのそのような障害を有するヒトの処置方法も提供される。この方法は、 そのような個人に本発明による治療的有効量の製剤を投与することを含む。 そのような抗体製剤の投薬量は、処置される状態および処置の受け手により変 化するが、成人患者については、50mg〜約2000mg、好ましくは100mg〜1000mgの 範囲で、１〜30日の期間にわたり毎日または毎週投与され、必要に応じて繰り返 される。投薬は、単回または複数回の用量として行うことができる。 抗体製剤は、交叉流（タンジェンシャル）限外ろ過または攪拌限外ろ過などの 種々の方法によって濃縮することができる。好ましい方法は、タンジェント流限 外ろ過による。低い回収率および沈澱物形成は、抗体濃縮時に問題となることが ある。本発明は、大きな循環速度（500ml／分）における交叉流限外ろ過の剪断 力を低下させることを伴う濃縮方法によって、特にこの問題を解決する。循環を 、例えば、250ml／分に低下させると、問題なく抗体濃度は150mg／mlよりも高く なり、そして材料の高い回収率が得られる。 従って、本発明は、本明細書中に記載されるような、濃縮抗体製剤の調製方法 を提供する。濃縮製剤における抗体の回収は、好ましくは70％よりも大きく、日 常的には90％よりも大きい。 上記の方法に従って調製される濃縮抗体製剤は、緩衝液、塩、ポリソルベート および／またはEDTAなどの添加物をさらに含有させることができる。これらのさ らなる薬剤は、当該分野で公知で慣用的な方法による透析を用いて、それらを除 去または交換することができる場合、最終的な医薬用処方物においては必要とさ れ得ない。例えば、クエン酸緩衝液およびEDTAを含有する濃縮抗体製剤は、この 方法を使用してリン酸緩衝液またはマレイン酸緩衝液を含有する濃縮抗体製剤に 変えることができる。 本発明はまた、そのような方法によって得られる新規な濃縮抗体製剤をも提供 する。 以下の実施例は、本発明の非限定的な実施例である。実施例１ Campath-1H の濃縮 Minitan限外ろ過装置（Minitan XX42 ASY MT限外ろ過システム、Millipore） を、２枚のポリスルホン製30K NMWCOフィルタープレート（Minitan PTTK 30K NM WCO、Millipore）を用いて組み立て、配管およびプレートを製造者の指示に従っ て0.1M NaOHで30分間消毒した（Minitan Ultrafiltration System：Assembly，O peration，Maintenance Instructions、Millipore Corporation、P15076）。１ 〜２リットルのリン酸緩衝化生理食塩水（PBS：pH 7.2）で軽く洗浄してを消 毒剤を除去した。 Campath-1H（CDw52抗原に対するヒト化抗体：Reichmann et al Nature 332：3 23−327(1988)）（50mMクエン酸ナトリウム（pH 6.0）中に16.4mg/mlで2200ml） を、600ml／分の流速で、２〜2.5barの背圧でメンブランの保持側を循環させた 。実験中、背圧をこの値で維持し、透過液の流速を種々の時間間隔で測定した。 抗体試料を種々の時点で保持容器から取り出し、抗体濃度、濁度、％凝集物およ び粘度についてアッセイした。 この実験ではろ過速度が非常に低かったため、３日間にわたってろ過を行うこ とが必要であった。システムをPBSで洗い流し、濃縮物を４℃で一晩貯蔵した。 第２日目の後、微生物汚染を防止するために、0.01％（w/v）のチオメルサール を濃縮物に添加し、その後一晩貯蔵した。濃縮終了時、システムを500mlのPBSで 洗い流し、次いでさらに500mlのPBS洗浄により、メンブランの保持側を30分間再 循環させた。これらの洗浄中の抗体濃度を、280nmでの吸光度測定によって求め た。 Minitanシステムにおいてわずか２枚のプレートを使用して、Campath-1Hを16. 4mg/mlから257mg/mlに濃縮するのに要した全時間は、17.25時間であった。表1(a )は、この間の時間におけるCampath-1Hの濃度変化を示す。 濃度は、17時間後の300mg/mlの最大値まで指数関数的に増加した。最終濃度は、 この最大値よりもわずかに低かった；この相違は、おそらくは、非常に粘度の高 い液体から代表し得る試料を得ることが困難であったためである。表1(b)は、 Campath-1Hの濃度が、透過液の流速の低下に反比例していることを示す。この表 はまた、残留している濃縮物の粘度が189mg/mlよりも高い濃度で劇的に増大した ことを示している。 表1(c)は、190mg/mlまでの濃度では高い回収であったが、この濃度よりも高く なると著しく低下し始めたことを示している。粘度の増大により、材料がガラス 器具および配管に付着し、一晩貯蔵する前の洗浄の間に失われるためである。25 7mg/ml材料の最終的な回収（サンプリング中に取り出された材料および洗浄中に 失われた材料を除く）は、63.4％であった。さらに、14.6％がシステムの最初の PBS洗浄で回収され、そして0.5％が二番目に再循環させたPBS洗浄で回収された 。従って、合計すれば、最初の材料の78.5％が実験終了時に回収された（サンプ リング中に取り出された材料および洗浄中に失われた材料を除く）。21.5％の喪 失は、主に、ガラス器具および配管に付着している粘性の高い材料によるためで ある。 濃縮中のCampath-1H溶液の濁度を計算によって求めた。濁度の値として、適切 に希釈した抗体試料の1.0mlの650nmでの吸光度を使用した。表1(d)は、増加しな かったことを示している。 凝集物の測定に必要な試料は、PBSを使用してタンパク質濃度を１mg/mlに希釈 し、その50μlまたは100μlをTSK-GEL G3000SW_XLサイズ排除HPLCカラムに注入し た。カラムを、0.05％ NaN₃および0.1Ｍ Na₂SO₄を含む0.1Ｍリン酸緩衝液（pH 6 .7）を用いて1.0ml／分の流速で溶出した。凝集物の量は、280nmでの吸光度のピ ークを積分することによって求め、全期間を通して約１％で残留していることを 見出した。実施例２ 抗CD4抗体の濃縮−方法A Minitan限外ろ過装置を組立て、2の代わりに8ポリスルホン30K NMWCOフィルタ ープレートを用いることを除いて、実施例1と同様に消毒した。全装置を無菌ド ラフト内に設置した。抗CD4抗体（50mMクエン酸ナトリウム、pH 6.0中2142ml、1 3.9mg/ml）を流出速度190ml/min、後方圧２〜2.5バールで膜の残留側にて循環さ せた。以降の実験を通し後方圧をこの値で維持し、透過流出速度を様々な時間間 隔で測定した。様々な時点で抗体サンプルを未透過液の容器から取り出し、抗体 濃度、CD4結合、濁度、凝集率および粘度を定量した。 実験の最後に未透過液をMinitan装置からポンプで吸引し、膜の残留側を50mM クエン酸ナトリウム0.05mM EDTA、pH6.0溶液500mlで洗浄した。そして洗浄液の5 0ml分画を回収した。最後に、再循環している500mlの50mMクエン酸ナトリウム0. 05mM EDTA、pH6.0溶液で、残留側の膜周辺を30分間洗浄した。洗浄分画の抗体濃 度を吸光度280nmで測定することで確定した。 結果を表2（a）〜（d）に示した。濃縮に用いるプレートの枚数が増えると、2 50mg/mlの濃度へ達するために要する時間が減少した。250mg/mlまでにCampath-1 Hでの濃縮は17.25時間かかるのに対し、本実験は6時間であった（表2（a）参照 ）。また表2（a）は、113mg/mlの濃度に達するまで抗CD4抗体の粘度がはっきり と上昇しないことを示している。この濃度を超えると粘度は劇的に上昇した。 83 mg/mlを超える濃度で、濃縮材料に顕著な蛋白石濁が認められた。蛋白石濁 は、濃度がこの値を超えて上昇するにつれて沈殿を生ずる原因となった。このこ とは、表2（b）に示す透過流出速度の減少を、また表２（c）に示す濁度の上昇 をもたらした。凝集率は全ての濃度において非常に低いままで、全体を通して0. 2％未満であった（表2（c）参照）。表2（b）は粘度が上昇し、沈殿が発生する までは回収率が高い一方、装置からはずした後の未透過液の最終回収までに50％ と劇的に低下していることを示している。 この不十分な回収率は、濃縮抗CD4抗体の粘度が高いために、抗体が限外ろ過 システムのチューブや膜に付着することによるものである。本方法で失われた抗 CD4抗体はすべて、後に緩衝液でシステムを洗い流すことで回収できた。表2（d ）は、実験の最後にMinitan装置を洗い流している間の、連続した50mlの洗浄分 画における抗CD4抗体の回収を示している。最初の分画は235mg/mlの濃度で11.7g の抗CD4抗体を含んでいたため、これを252mg/mlで装置から最初に回収した濃縮 液12.6gと共に回収した。この際、全体の濃度が著しく希釈されることはなかっ た。残りの洗浄分画は全部で5.1 gの抗CD4抗体を含んでいたが、57mg/ml未満の 濃度であったため、濃縮材料と共に回収できなかった。濃縮液および最初の洗浄 分画における全回収率は90％であった。最終の濃縮抗CD4抗体を４℃で一夜保存 すると、一部の沈殿は再溶解することが認められた。 従って、沈殿した抗CD4抗体が完全に可溶化する濃度を測定するための実験を 設定した。250mg/mlの抗CD4抗体のアリコート10mlに、50mMクエン酸ナトリウム0 .05mM EDTA、pH6.0溶液を加えて徐々に希釈した。適度に希釈した抗体サンプル のアリコートの1.0mlにおける650nmでの吸光度を、濁度の測定に使用した。結果 を表３に示した。 沈殿は再溶解したが、濁度および蛋白石濁は抗CD4抗体が約80mg/mlの濃度に達 するまで完全には消えなかった。濃縮中に最初に蛋白石濁が認められた濃度はこ の濃度を上回っているため、沈殿は可逆性で濃度依存性であると思われた。実施例３ 抗CD４抗体の濃縮−方法Ｂ 抗CD４抗体の緩衝液の調整 抗CD４抗体（1460 ml；24ｇ）を50 mMクエン酸ナトリウム、0.05 mM EDTA、pH 6.0中で調製した。抗体製剤に固体のクエン酸を添加し、次いでNaOHでpHを6.0 に調整することによって、この緩衝液を約100 mMクエン酸ナトリウム、0.05 mM EDTA、pH 6.0とした。得られた製剤を0.22μmフィルターを介して滅菌ろ過し、 約12gの2アリコートとして保存した。 Filtron Ultrasetteにおける抗CD４抗体の濃縮 Filtron Mini-UltrasetteおよびWatson-Marlowポンプを低温室に配置した。 Mini-Ultrasette（カットオフ値30Ｋの流限外ろ過フィルタ−Filtron）に水で軽 く洗浄し、次いで製造者の指示に従って0.1 M NaOHで30分間消毒した（Mini Ult rasette Tangenital Flow Device Operating Instructions．& Mini Ultrasettt e Care and Use Manual.，Filtron Teclmology Corporation）。滅菌水で軽く洗 浄し、続いて滅菌PBS、pH 7.2を溶出物のpHが7.2になるまで１〜２リットルで洗 浄して消毒剤を除去した。抗CD４抗体を、全期間を通して250 ml／分の流速で膜 の残留側に循環させた。 抗CD４抗体を約150 mg/mlに濃縮した後、残留物をMini-Ultrasetteからポンプ で吸引し、膜の残留物側に20 mlの50 mMクエン酸ナトリウム、0.05 mM EDTA、pH 6.0を3回軽く洗浄し、20 mlの洗浄画分のそれぞれを回収した。実施例１に記載 のように280 nmでの吸光度を測定することによって、洗浄画分の抗体濃度を決定 した。 結果は、残留流速を減少すると、交叉流限外ろ過により抗CD４抗体を約150 mg /mlにまで濃縮し、沈殿を回避する方法を提供し得ることを示唆した。これを、F iltron Mini-Ultrasetteおよび250 ml／分の残留物循環速度を用いて試験した。 本操作のための適切な等張緩衝液は、100 mMクエン酸ナトリウム、0.05 mM ED TA、pH 6.0であった。従って、16.8ｇのクエン酸を添加することによって50 mM クエン酸ナトリウム、0.05 mM EDTA、pH 6.0中抗CD４抗体の残りの1460 mlを再 処方し、最終溶液のpHをNaOHで調整した。この材料を滅菌ろ過し、２つの等量の アリコートに分割し、次いで250 ml／分の再循環流を用いてこのアリコートをFi ltron限外ろ過装置において個別に濃縮した。結果を表４に示す。 ^*サイズ排除HPLC PBSを用いて凝集測定用サンプルを１mg/mlのタンパク質濃度に希釈し、50μl または100μlのアリコートをTSK-GEL G3000SW_XLサイズ排除HPLCカラムに注入し た。カラムを0.1 Mリン酸緩衝液、pH 6.7中の0.05％NaN₃および0.1 M Na₂SO₄で 、1.0 ml/分の流速で展開した。280 nmでの吸光度のピークを積分することによ って凝集物の量を決定した。 両方の濃縮とも、抗体の溶解度に悪影響を及ぼすことなく限外ろ過装置におい て150 mg/mlを超える最大濃度を達成した。濃縮には９〜11時間を要した。約100 mg/mlの最終濃度は、限外ろ過装置からの回収率を最大にするのに必要な洗浄液 で希釈した結果生じる。全体的な回収率は90〜95％であり、肉眼では沈殿も凝集 物のレベルの増加も認められなかった。濃縮後650nmでの吸光度で測定した濁度 がわずかに増加して最終濃縮物がわずかに不透明になったが、このことはPolyso rbate 80による処方時に除去され、滅菌ろ過は重要とは思われなかった。 濃縮１のCD4結合活性は、予想通りほぼ100 mg/mlであったが、濃縮２について はかなり低い値しか得られなかった。濃縮１および２から回収した材料の最終オ スモル濃度は約297 mOs/kgであり、回収物は滅菌0.2μmフィルターを容易に通過 し得る透明かつ澄明かつ透明な溶液であった。 攪拌器付セルにおける抗CD4抗体の濃縮 窒素ガスを用いて1.5バールの圧力を適用することにより、Amicon攪拌器付限 外ろ過セル（YM30膜Amiconを装着した）中５℃で抗CD4抗体（上記）の330 mlの アリコートを170 mg/mlの最終濃度に濃縮した。限外ろ過セル内の抗CD4抗体を所 定の間隔でサンプリングし、280 nmでの吸光度を測定することによって濃度を、 そして650 nmでの吸光度を測定することによって濁度を決定した。実験の最後に 、濃縮した材料を限外ろ過セルから取り出し、0.22μmフィルターを介して滅菌 ろ過した。 Filtron交叉流限外ろ過装置上で発生する高い剪断力を克服するために、緩衝 液として50 mMクエン酸ナトリウム、0.05 mM EDTA、pH 6.0を用い、攪拌器付限 外ろ過セル内で濃縮を行った。表５は本実験の結果を示す。 ^*280 nmで吸光度を測定することによって決定した実際の濃度 全体で、濃縮には約2.5日を要し、濃縮された抗体の粘度が上昇すると流速が 急速に低下した。171 mg/mlの最終濃度が首尾よく達成され、沈殿は認められな かった。この材料を限外ろ過セルから取り出し、膜を十分な50 mMクエン酸ナト リウム、0.05 mM EDTA、pH 6.0で洗浄し、濃縮物回収時に100 mg/mlの最終濃度 を得た。 この材料は容易に0.2μmの滅菌フィルターを通過する。この回収された材料の 実際に測定された濃度は、94.3 mg/mlで容積は46 mlであった。このことは、限 外ろ過工程を介する回収率が79％であることに相当する。 従って、本実験は、50 mMクエン酸ナトリウム、0.05 mM EDTA、pH6.0が抗CD4 を少なくとも171 mg/mgに濃縮するのに適切な緩衝液であり、上記のMinitanおよ びFiltron Mini-Ultrasetteの両方における、本来の交叉流限外ろ過実験で沈殿 を生じるのはおそらく高い剪断力であることを証明した。実施例４ 抗CD4および抗CD23抗体のための皮下用処方 ａ）抗CD4または抗CD23抗体 0.15ｇ オルトリン酸二水素カリウム、KH₂PO₄（無水） 0.0656ｇ オルトリン酸水素二ナトリウム、NaHPO₄・12Ｈ₂Ｏ 0.0673ｇ NaCl 0.6263ｇ Polysorbate 80（総処方物重量中の％） 0.01 水 100ｇまで ｂ）抗CD4または抗CD23抗体 0.15ｇ 酢酸Na 3.674ｇ 氷酢酸、10%溶液 0.315ｇ NaCl 0.630ｇ Polysorbate 80（総処方物重量中の％） 0.01 水 100ｇまで ｃ）抗CD4または抗CD23抗体 0.15ｇ マレイン酸 0.227ｇ 0.5 M NaOH 0.09ｇ NaCl 0.777ｇ Polysorbate 80（総処方物重量中の％） 0.01 水 100ｇまで ｄ）抗CD4または抗CD23抗体 0.15ｇ コハク酸 0.203ｇ 0.5 M NaOH 6.54ｇ NaCl 0.779ｇ Polysorbate 80（総処方物重量中の％） 0.01 水 100ｇまで 注意：処方ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）は任意に0.05mM EDTAを含有してもよい 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ヒトに投与するためのモノクローナル抗体製剤であって、前記製剤中の 抗体の濃度が１００ｍｇ／ｍｌ以上であることを特徴とする、抗体製剤。 ２． ヒトに投与するためのモノクローナル抗体製剤であって、１００ｍｇ／ ｍｌ以上の濃度で抗体を含み、ここで、前記製剤は実質的に凝集物を含まない、 抗体製剤。 ３． 前記抗体が１００ｍｇ／ｍｌを超える濃度で存在する、請求項１または ２に記載の抗体製剤。 ４． 前記抗体が１００〜３５０ｍｇ／ｍｌの間の濃度で存在する、請求項１ 〜３のいずれか１項に記載の抗体製剤。 ５． 前記抗体がイソタイプＩｇＧの抗体である、請求項１〜４のいずれか１ 項に記載の抗体製剤。 ６． 前記抗体が組換え抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗 体製剤。 ７． 前記抗体が改変された抗体である、請求項６に記載の抗体製剤。 ８． 前記抗体がキメラまたはＣＤＲ融合した抗体である、請求項７に記載の 抗体製剤。 ９． Ｔ細胞またはガン抗原に結合する、請求項１〜８のいずれか１項に記載 の抗体製剤。 １０． 前記製剤のｐＨが前記抗体の等電点のｐＨとは異なる、請求項１〜９ のいずれか１項に記載の抗体製剤。 １１． １００ｍｇ／ｍｌ以上の濃度のモノクローナル抗体および薬学的に受 容可能な賦形剤を含む医薬処方物。 １２． 皮下投与に適応される請求項１１に記載の医薬処方物。 １３． ヒトの治療に使用するための請求項１〜１０のいずれか１項に記載の モノクローナル抗体製剤。 １４． Ｔ細胞介在性障害の治療用薬剤の製造において製剤中の抗体の濃度が １００ｍｇ／ｍｌ以上である、モノクローナル抗体製剤の使用。 １５． タンジェント流限外ろ過により製剤中の抗体の濃度が１００ｍｇ／ｍ ｌ以上である、モノクローナル抗体製剤の製造法。 １６． タンジェント流限外ろ過により得られる１００ｍｇ／ｍｌ以上の濃度 の抗体を含む、モノクローナル抗体製剤。