CN102272145A - 亲和色谱基质 - Google Patents

亲和色谱基质 Download PDF

Info

Publication number
CN102272145A
CN102272145A CN201080004708.4A CN201080004708A CN102272145A CN 102272145 A CN102272145 A CN 102272145A CN 201080004708 A CN201080004708 A CN 201080004708A CN 102272145 A CN102272145 A CN 102272145A
Authority
CN
China
Prior art keywords
albumen
immunoglobulin
proteic
mab
matrix
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201080004708.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102272145B (zh
Inventor
H·J·约翰逊
A·伦格勒夫
R·帕尔姆格伦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cytiva Bioprocess R&D AB
Original Assignee
GE Healthcare Bio Sciences AB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GE Healthcare Bio Sciences AB filed Critical GE Healthcare Bio Sciences AB
Publication of CN102272145A publication Critical patent/CN102272145A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102272145B publication Critical patent/CN102272145B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B01D15/3809—Affinity chromatography of the antigen-antibody type, e.g. protein A, G, L chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
    • B01J20/3246—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure
    • B01J20/3248—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3268—Macromolecular compounds
    • B01J20/3272—Polymers obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B01J20/3274—Proteins, nucleic acids, polysaccharides, antibodies or antigens

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及从液体中分离一种或多种含免疫球蛋白的蛋白的方法。所述方法包括：首先使所述液体与分离基质接触，所述基质包含固定到支持体的配体；使所述含免疫球蛋白的蛋白通过与所述配体的相互作用而吸附到所述基质上；接着是洗涤所述被吸附的含免疫球蛋白的蛋白的任选步骤；和通过使所述基质与释放所述蛋白的洗脱液接触，来回收所述含免疫球蛋白的蛋白。本方法较先前分离方法的改善之处在于，每一种所述配体基本由单体或二聚体SpA或Z蛋白或其功能性变体组成。

Description

亲和色谱基质
发明领域
本发明涉及亲和色谱领域，更具体地涉及含配体单体或二聚体的分离基质。本发明还涉及用上述基质分离目标蛋白的方法，其优势在于增加的能力和洗脱pH。
发明背景
免疫球蛋白代表全球各公司在制造或开发方面的最普遍性生物制药产品。高商业需求和由此的这种特殊治疗市场价值已导致制药公司需重视最大限度提高其相应mAb制造过程的生产率同时控制相关费用。
在多数情况下，将亲和色谱法用作纯化这些免疫球蛋白分子(如单克隆或多克隆抗体)的关键步骤之一。亲和试剂中特别受关注的种类是能够特异性结合免疫球蛋白分子不变部分的蛋白，这种相互作用独立于抗体对抗原的结合特异性。这类试剂可广泛用在亲和色谱中从不同的样品回收免疫球蛋白，所述样品为例如但不限于血清或血浆制品或细胞培养源性原料。这类蛋白的实例是葡萄球菌A蛋白，其含有能够与来自不同物种的IgG免疫球蛋白的Fc和Fab部分结合的结构域。
基于葡萄球菌A蛋白(SpA)的试剂，由于其高亲和力和选择性，在生物技术领域具有广泛应用，例如在亲和色谱中用于捕获和纯化抗体以及用于检测。目前，基于SpA的亲和介质可能是使用最广泛的亲和介质，用于从不同的样品(包括来自细胞培养物的工业原料)中分离单克隆抗体及其片段。因此，各种包含A蛋白-配体的基质有市售，例如，以天然A蛋白的形式(例如Protein A SEPHAROSETM，GEHealthcare，Uppsala，Sweden)，也包括重组A蛋白的形式(例如rProtein A-SEPHAROSETM，GE Healthcare)。更具体而言，在商业重组A蛋白产品中进行的遗传操作旨在促进其附着于支持体。
这些应用，如其它的亲和色谱应用一样，需要综合考虑对污染物的明确去除。这些污染物可以是例如在色谱过程中吸附到固定相或基质的非洗脱分子，例如非所需的生物分子或微生物，包括例如蛋白、碳水化合物、脂质、细菌和病毒。通常在第一次洗脱所需产品后进行从基质中对这些污染物的去除，以在后续使用前再生所述基质。这种去除通常涉及称为原地清洗(CIP)的程序，其中使用能够从固定相洗脱污染物的物质。这类物质中经常被使用的一种是流经所述固定相的碱性溶液。目前最广泛使用的清洗和消毒剂是氢氧化钠，其浓度范围可以从0.1M至高达例如1M，视污染的程度和性质而定。该策略与将基质暴露于高于13的pH值相关。对于许多含有蛋白类亲和配体的亲和色谱基质，这类碱性环境是非常苛刻的条件，从而因配体对所处高pH条件的不稳定而导致能力下降。
广泛的研究因此集中于工程蛋白配体的开发，该配体表现出耐受碱性pH值的改善能力。例如，Gülich等(Susanne Gülich，MartinLinhult，
Figure BPA00001406079700021
Nygren，Mathias Uhlén，Sophia Hober，Journal ofBiotechnology，80(2000)，169-178)建议将蛋白工程化以提高链球菌白蛋白结合域(ABD)在碱性环境中的稳定性能。Gülich等创建了ABD突变体，其中所有四个天冬酰胺残基都分别被亮氨酸(一个残基)、天冬氨酸(两个残基)和赖氨酸(一个残基)置换。此外，Gülich等报告说，他们的突变体呈现出与天然蛋白相似的结合目标蛋白行为，而且经过反复暴露在碱性条件下后，含有该工程配体的亲和柱比用亲本非工程配体制备的柱表现出更高的结合能力。由此得到的结论是，可以置换所有四个天冬酰胺残基而对其结构和功能没有任何显著影响。
最近的工作表明，也可以对A蛋白(SpA)进行改造以实现类似性质。US专利申请公布书2005/0143566中公开，当有至少一个天冬酰胺残基被突变为除谷氨酰胺或天冬氨酸外的氨基酸时，在pH值高达约13-14下，与亲本SpA(例如SpA的B结构域)或Z蛋白(源自SpAB结构域的合成构建体(US 5,143,844))相比，该突变体具有更强的化学稳定性。作者表明，当将这些突变蛋白用作亲和配体时，分离介质可如预期地更耐受使用碱剂的清洁程序。US 2006/0194955显示，所述突变配体可以更耐受蛋白酶从而减少在分离过程中配体的漏失。另一份公布书，US 2006/0194950表明，所述碱稳定SpA域可以进一步被修饰，使配体缺乏对Fab的亲和力但保留对Fc的亲和力，例如G29A突变体。
过去所有A蛋白亲和介质都用含有5个IgG结合域的天然A蛋白来生产。利用重组技术，已生产了大量A蛋白构建体，其所有都含有4个或5个IgG结合域。
因此，本领域需要获得含下述蛋白配体的分离基质，该蛋白配体具有较低重复数目但具有与四聚体相似或增强的结合能力。
发明简述
本发明的目的之一是提供亲和分离基质，其包含能够结合免疫球蛋白(例如IgG、IgA和/或IgM)的蛋白配体，优选通过它们的Fc片段结合。这些配体以单体或二聚体呈现，并且与有较高重复数目的配体多聚体(例如五聚体配体)相比，具有更高的相对结合能力。
本发明的另一目的是提供方法，该方法利用现有亲和基质去分离一种或多种含免疫球蛋白的蛋白。通过使用单体或二聚体亲和配体，该方法出乎意料地实现了对目标分子的相对结合能力增强。此外，采用单体配体，洗脱pH值提高。
因此，本发明提供了方法，该方法用于生产纯化产品，例如纯的免疫球蛋白组分或液体(免疫球蛋白已被从其中除去)，或者用于检测样品中免疫球蛋白的存在情况。本发明的配体呈现出增强的能力，这使这些配体成为对具成本效益的大规模经营有吸引力的候选物。
一个或多个以上定义的目的可如所附权利要求所述而实现。
附图简述
图1图示，对Z1(虚线)、Z2(点线)和Z4(实线)在6分钟停留时间记录的穿透曲线。
图2：在Superdex 200 5/150GL上的分析性尺寸排阻色谱。Fc融合蛋白(实线)和MAb 3(虚线)。
图3：不同MAb和Fc融合蛋白的洗脱pH值，低上样量，加样于不同的z-原型上。
发明详述
定义
术语“蛋白”在本文中用于描述蛋白及其片段。因此，任何呈现出三维结构的氨基酸链都被包括在术语“蛋白”中，并相应地包括蛋白片段。
术语蛋白的“功能变体”本文中意指变体蛋白，其中，基本保留了与本发明相关的定义为亲和力和稳定性的功能。因此，那些与所述功能不相关的一个或多个氨基酸可以被替换。
术语“亲本分子””本文中用于指呈引人本发明突变之前的形式的相应蛋白。
术语“结构稳定性”是指分子三维形式的完整性，而“化学稳定性”是指耐受化学降解的能力。
术语“结合Fc片段的”蛋白意指能够结合免疫球蛋白Fc片段的蛋白。但是，不排除结合Fc片段的蛋白还可以结合其他区，例如免疫球蛋白的Fab区。
在本说明书中，如果不提及它们的全名，氨基酸用常规单字母符号来表示。
在本文，突变用被替换位置处的编号来定义，该编号前面是野生型或非突变氨基酸而后面是突变氨基酸。因此，举例来说，在23位的天冬酰胺向苏氨酸的突变表示为N23T。
本发明的一方面涉及从液体分离一种或多种含免疫球蛋白的蛋白的方法，该方法包括：(a)使所述液体与分离基质接触，所述基质包含固定到支持体的配体；(b)使所述含免疫球蛋白的蛋白通过与所述配体的相互作用而吸附到所述基质上；(c)洗涤所述被吸附的含免疫球蛋白的蛋白的任选步骤；和(d)通过使所述基质与释放所述蛋白的洗脱液接触，来回收所述含免疫球蛋白的蛋白。该方法通过使用单体配体，提供所述配体对免疫球蛋白分子增强的结合能力，所述单体配体为例如葡萄球菌A蛋白(SpA)的结构域B或Z蛋白。
本发明的另一方面涉及从液体分离一种或多种含免疫球蛋白的蛋白方法，该方法包括：(a)使所述液体与分离基质接触，所述基质包含固定到支持体的配体；(b)使含免疫球蛋白的蛋白通过与所述配体的相互作用而吸附到所述基质上；(c)洗涤所述被吸附的含免疫球蛋白的蛋白的任选步骤；和(d)通过使所述基质与释放所述蛋白的洗脱液接触，来回收所述含免疫球蛋白的蛋白。该方法通过使用二聚体配体，提供所述配体对免疫球蛋白分子增强的结合能力，所述二聚体配体为例如葡萄球菌A蛋白(SpA)的结构域B或Z蛋白。
所述结合免疫球蛋白的蛋白(即配体)可以是具有天然免疫球蛋白结合能力的任意蛋白，例如葡萄球菌A蛋白(SpA)或链球菌G蛋白(SpG)。有关其它此类蛋白的述评，参见例如Kronvall，G.，Jonsson，K.Receptins：新术语，用于不断扩展范围的具有结合哺乳动物蛋白特性的天然和改造的微生物蛋白(a novel term for anexpanding spectrum of natural and engineered microbial proteins withbinding properties for mammalian proteins)，J.Mol.Recognit.1999 Jan-Feb；12(1)：38-44。所述单体或二聚体配体可以包括一个或多个SpA的E、D、A、B和C结构域。更优选地，所述配体包括A蛋白的结构域B或工程Z蛋白。
在一实施方案中，所述配体被赋予碱稳定性，例如通过突变SpA结构域B或Z蛋白中的至少一个天冬酰胺残基为除谷氨酰胺外的氨基酸。如前面所讨论，US专利申请公布书2005/0143566公开，当有至少一个天冬酰胺残基被突变为除谷氨酰胺或天冬氨酸外的氨基酸时，该突变获得了在高pH值条件下增强的化学稳定性。此外，含有这些配体的亲和介质可以更耐受使用碱剂的清洗程序。US2006/0194955表明，所述突变配体还可更耐受蛋白酶从而减少在分离过程中配体的漏失。这些申请的公开内容通过引用以其整体结合于本文中。
在另一实施方案中，如此制备的配体缺失对抗体Fab部分的任何基本亲和力，但具有对Fc部分的亲和力。在某些实施方案中，所述配体的至少一个甘氨酸被丙氨酸置换。US 2006/0194950表明，碱稳定性结构域可进一步被修饰，使得配体缺失对Fab的亲和力但保留Fc亲和力，例如通过G29A突变。该申请的公开内容通过引用以其整体结合于本文中。本文中使用的氨基酸编号是在本领域常规使用的，本领域技术人员可容易地识别被突变的位置。
在一个有利的实施方案中，结构域B的碱稳定性，通过使至少一个天冬酰胺残基突变为除谷氨酰胺外的氨基酸来实现；并包括在碱稳定性结构域B的29位处氨基酸残基的突变，例如G29A突变。
在另一实施方案中，所述配体是Z蛋白，其中通过使至少一个天冬酰胺残基突变为除谷氨酰胺外的氨基酸，来实现碱稳定性。在一个有利的实施方案中，通过使至少在23位处的天冬酰胺残基突变为除谷氨酰胺外的氨基酸，来实现碱稳定性。在另一实施方案中，碱稳定蛋白是在碱性条件下基本稳定的天然蛋白。
本领域技术人员容易理解，可使用常规分子生物学技术以任何次序来进行提供碱稳定性的突变和由G向A的突变。此外，可以通过具有编码突变蛋白配体的核酸序列的载体来表达所述配体。或者，它们也可以通过蛋白合成技术来制备。用于合成预定序列的肽和蛋白的方法在本领域是众所周知和一般可获得的。
因此，在本发明中，术语“葡萄球菌A蛋白的碱稳定性结构域B”意指基于SpA结构域B的碱稳定性蛋白，例如在US专利申请公布书2005/0143566和US2006/0194950中描述的突变蛋白；以及其他来源但具有功能性等同氨基酸序列的其他碱稳定蛋白。
技术人员理解的是，在被固定到支持体前，表达蛋白应被纯化到适当程度。这种纯化方法在本领域是众所周知的，并且容易使用标准方法将基于蛋白的配体固定到支持体。适宜的方法和支持体将在下面更详细讨论。
因此，在一个实施方案中，本发明的突变蛋白包含至少约75％，例如至少约80％或优选至少约95％的SEQ ID NO：1或SEQID NO：2中定义的序列，前提是天冬酰胺突变不发生在21位处。
在本说明书中，SEQ ID NO：1定义SpA的B结构域的氨基酸序列：
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys。
SEQ ID NO：2定义称为Z蛋白的蛋白：
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys。
Z蛋白是衍生于SpA B结构域的合成构建体，其中29位的甘氨酸已被替换为丙氨酸，参见例如
Figure BPA00001406079700071
等，1999年：生物技术中的亲和融合体：聚焦A蛋白和G蛋白(Affinity fusions in biotechnology：focus on protein A and protein G)，载于《生物过程技术百科全书：发酵、生物催化和生物分离(The Encyclopedia of Bioprocess Technology：Fermentation，Biocatalysis and Bioseparation)》，M.C.Fleckinger和S.W.Drew编辑，John Wiley和Sons Inc.，New York，8-22。
在一个实施方案中，以上描述的突变蛋白由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中定义的氨基酸序列组成，或为其功能性变体。本文所用术语“功能性变体”包括任何类似的序列，其包含在以下氨基酸位置的一个或多个其它变化，所述位置不影响突变蛋白对免疫球蛋白的亲和力或其在提高的pH值环境中改进的化学稳定性。
在一个有利的实施方案中，本发明突变选自：N23T；N23T和N43E；N28A；N6A；N11S；N11S和N23T；以及N6A和N23T；其中，亲本分子包含SEQ ID NO：2定义的序列。如上所述，为了获得可用作在长时间的碱性条件下具有高结合能力的配体的突变体蛋白，避免21位天冬酰胺残基的突变。在一个实施方案中，3位的天冬酰胺残基不被突变。
在最有利的实施方案中，位于亮氨酸残基和谷氨酰胺残基之间的天冬酰胺残基已被突变，例如徒变为苏氨酸残基。因此，在一个实施方案中，SEQ ID NO：2定义序列的23位天冬酰胺已被突变，例如突变为苏氨酸残基。在具体的实施方案中，SEQ ID NO：2定义序列的43位天冬酰胺已被突变，例如突变为谷氨酸。在其中第43位氨基酸已被突变的实施方案中，似乎最有利的是与至少一个进一步的突变(例如N23T)相结合。
SpA结构域B和Z蛋白中的不同天冬酰胺残基可对突变蛋白的亲和力和稳定性有不同的贡献，这是相当意外的发现，特别是鉴于Gülich等人的上述教导，其中推论ABD的所有天冬酰胺残基都可被突变而没有任何内部区别。
因此，本发明包括上述讨论的单体突变体蛋白。然而，这种蛋白单体可结合为多聚体蛋白，例如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体等。因此，本发明的另一方面是多聚体，其由至少一个本发明的突变蛋白和一个或多个其他单元(优选也是本发明的突变蛋白)组成。因此，本发明为例如由两个重复单元组成的二聚体。
在一个实施方案中，本发明的多聚体包含由氨基酸段连接的单体单元，该氨基酸段优选从0到15个氨基酸范围，例如5-10个。而这种连接的性质应该优选不使所述蛋白单元的空间构象不稳定。此外，所述连接应该优选在碱性环境中也足够稳定以不影响突变蛋白单元的性质。
在一个实施方案中，本发明单体配体包含SEQ ID NO：3的序列：
AlaGlnGlyThrValAspAlaLysPheAspLysGluGlnGlnAsnAlaPheTyr
GluIleLeuHisLeuProAsnLeuThrGluGluGlnArgAsnAlaPheIleGlnSer
LeuLysAspAspProSerGlnSerAlaAsnLeuLeuAlaGluAlaLysLysLeu
AsnAspAlaGlnAlaProLysCys。
在另一实施方案中，本发明二聚体配体包含SEQ ID NO：4的序列：
AlaGlnGlyThrValAspAlaLysPheAspLysGluGlnGlnAsnAlaPheTyr
GluIleLeuHisLeuProAsnLeuThrGluGluGlnArgAsnAlaPheIleGlnSer
LeuLysAspAspProSerGlnSerAlaAsnLeuLeuAlaGluAlaLysLysLeu
AsnAspAlaGlnAlaProLysValAspAlaLysPheAspLysGluGlnGlnAsn
AlaPheTyrGluIleLeuHisLeuProAsnLeuThrGluGluGlnArgAsnAlaPhe
IleGlnSerLeuLysAspAspProSerGlnSerAlaAsnLeuLeuAlaGluAlaLys
LysLeuAsnAspAlaGlnAlaProLysCys。
本发明意想不到的发现是，当比较配体的能力时，尽管对四聚体和二聚体获得相当的高动态结合能力，但单体具有最高的相对能力(mg Mab/mg配体)。概括地说，发现对具较少z-单元的配体得到较高的相对能力。我们的数据还证实，洗脱pH依赖于配体密度。此外，与其他原型相比，在单体配体原型上纯化的样品用较高的pH洗脱，对易于在低pH时聚集的免疫球蛋白而言是优势。在此同时，单体、二聚体和四聚体对宿主细胞蛋白的清除率几乎相等。
本发明还意外发现，对于更大的蛋白(例如含免疫球蛋白结构域的融合蛋白)，与四聚体相比，单体和二聚体的动态结合能力更高。此外，单体具有最高相对能力(即，表示为mg蛋白/mg配体的能力)。我们的研究表明，单体和二聚体中的动态结合能力增加并非主要是配体密度的效应，但可能是由于因位阻(对于相对体积大的融合蛋白)的减少而引起的可利用结合位置的更高利用率和/或更快的动力学。
理解的是，术语“含免疫球蛋白的蛋白”包括抗体、含抗体部分以及抗体片段的融合蛋白和突变抗体，只要它们基本保留了抗体的结合特性即可。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。优选抗体为来自哺乳动物物种(例如人类)的IgG、IgA和/或IgM。
在一个实施方案中，本发明涉及亲和分离基质，所述基质包含单体或二聚体配体，其含偶联到固相支持体的结合免疫球蛋白的蛋白。优选的是，蛋白的至少一个天冬酰胺残基已被突变为除谷氨酰胺外的氨基酸。与由四聚体配体组成的基质相比，本发明基质呈现增强的结合能力。所述突变蛋白配体优选是FC片段结合蛋白，可用于选择性结合IgG、IgA和/或IgM，优选IgG。
本发明的基质可以包含如以上所述在其任一实施方案中的突变体蛋白作为配体。在最优选实施方案中，在固相支持体上存在的配体包括如上所述的单体。
本发明基质的固相支持体可以是任一合适的熟知种类。常规的亲和分离基质往往具有有机性质，并且基于以下聚合物，其将亲水表面暴露于所用水性介质，即在其外部表面以及内部表面(如果存在的化)暴露羟基(-OH)、羧基(-COOH)、酰胺基(-CONH2，可能以N-取代形式)、氨基(-NH2，可能以取代形式)、低聚或聚乙烯氧基(polyethylenoxy group)。在一个实施方案中，所述多聚物可例如基于多糖，例如葡聚糖、淀粉、纤维素、普鲁兰、琼脂糖等，其已有利地交联，例如用双环氧化物、表卤代醇、1，2，3-三卤代取代的低级烃，以提供合适的孔隙度和刚性。在最优选实施方案中，固相支持体是多孔琼脂糖珠粒。可容易地按标准方法制备在本发明中使用的支持体，例如反相悬浮凝胶法(S Hjertén：Biochim Biophys Acta，79(2)，393-398(1964))。或者，基底基质是市售产品，例如SEPHAROSETM FF(GE Healthcare)。在对大规模分离特别有优势的实施方案中，支持体被改造以增强其刚性，从而使所述基质更适于高流速。
或者，固相支持体基于合成的多聚物，例如聚乙烯醇、聚羟烷基丙烯酸酯、聚羟烷基甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺等。在疏水性聚合物例如基于二乙烯基和单乙烯基取代苯的基质的情况下，基质表面往往经亲水化以将上述定义的亲水基团暴露于周围的水性液体。这些聚合物容易按标准方法生产，参见例如“通过悬浮聚合开发的基于苯乙烯的聚合物支持体(Styrene based polymersupports developed by suspension polymerization)”(R Arshady：Chimicae L′Industria，70(9)，70-75(1988))。或者，使用市售产品，例如SourceTM(GE Healthcare)。
在另一备选中，本发明的固相支持体包括无机性质的支持体，例如二氧化硅、氧化锆等。
在又一实施方案中，固相支持体呈另一种形式，例如表面、芯片、毛细管或过滤器等。
至于本发明基质的形状，在一个实施方案中，基质呈多孔整料形式。在一个备选实施方案中，基质呈珠状或颗粒形式，可多孔或无孔。珠状或颗粒形式的基质，可用作填充床或呈悬浮形式。悬浮形式包括那些被称为膨胀床和纯悬浮液的形式，其中颗粒或珠粒可以自由移动。在整料、填充床和膨胀床的情况下，分离过程通常遵循常规色谱法用浓度梯度。在纯悬浮液的情况下，可使用间歇式的模式。
配体可通过常规偶联技术利用例如存在于配体中的氨基和/或羧基连接到支持体。双环氧化物、环氧氯丙烷、CNBr、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)等都是著名的偶联试剂。在支持体和配体之间，可以引入称作间隔物的分子，这将提高配体的可用性并有利于配体向支持体的化学偶联。或者，配体可通过非共价键合例如物理吸附或生物特异性吸附连接到支持体。
在一个有利的实施方案中，本发明的配体通过硫醚键偶联到支持体。进行这种偶联的方法在本领域是众所周知的，并且本领域技术人员容易使用标准的技术和设备来进行。在一个有利的实施方案中，配体首先被提供了末端半胱氨酸残基以随后用于偶联。本领域技术人员也容易进行合适的纯化步骤。
在本发明的一些实施方案中，吸附步骤的条件可以是任何常规使用的，依照目标抗体的性质例如其pI作适当调整。任选的洗涤步骤可以用常用的缓冲液如PBS缓冲液来进行。
可通过使用任何常用的缓冲液进行洗脱。在一个有利的实施方案中，在单体配体系统中，通过加入pH值在4.0-4.4(优选4.2-4.4)范围的洗脱液，实现抗体的回收。在一个类似的实施方案中，在二聚体配体系统中，通过加入pH值在3.8-4.2(优选3.9-4.0)范围的洗脱液，实现抗体的回收。因此，这些实施方案的优势是，在洗脱过程中将目标抗体暴露在以下pH值，其通常高于常规与基于A蛋白的配体一起使用的pH值，这对于大多数抗体，会导致由于pH值降低引起的变性风险较低，较少的聚集物和目标物的收率上升。
本发明的方法可用于捕获目标抗体，例如在例如用于治疗或诊断用途的抗体的纯化方案中的第一步。在一个实施方案中，至少有75％抗体被回收。在一个有利的实施方案中，在二聚体配体系统中使用pH为3.8-4.2范围的洗脱液而在单体配体系统中使用pH为4.0-4.4范围的洗脱液，回收至少80％、例如至少90％、优选至少95％的抗体。本发明方法可后续一步或多步其他步骤，例如其他色谱步骤。因此，在具体实施方案中，超过约98％的抗体被回收。
如前所讨论，对于SpA配体或者Z蛋白配体，当有至少一个天冬酰胺残基突变为除谷氨酰胺或天冬氨酸外的氨基酸时，包含这些突变配体的亲和介质可以更耐受使用碱剂的清洁程序(US2005/0143566)。稳定性增加意指突变蛋白对免疫球蛋白的初始亲和力基本被保留延长的时间。因此，在碱性环境，其结合能力比亲本分子下降得更慢。环境可被定义为碱性，意味着提高的pH值，例如超过约10，如高达约13或14，即从10-13或10-14，一般被称为碱性条件。或者，条件可由NaOH浓度来定义，NaOH的浓度可高达约1.0M，如0.7M或特定地约0.5M，相应地在0.7-1.0M范围内。
因此，对免疫球蛋白的亲和力即本发明配体的结合特性，和由此的基质的能力，在用碱剂处理的时间内基本不变。按照惯例，对于亲和分离基质的原地清洗处理，所用碱剂是NaOH，其浓度高达0.75M，如0.5M。因此，在用0.5M NaOH处理7.5小时后，其结合能力将降至少于约70％，优选少于约50％，更优选少于约30％，例如约28％。
本发明突变蛋白增强的化学稳定性可由本领域技术人员容易地证实，例如通过用0.5M浓度的NaOH常规处理。在本文中，要了解的是，与上面所述的类似，“增加的”稳定性意指保持初始稳定性的时间比亲本分子更长。
在另一方面，本发明涉及分离免疫球蛋白(例如IgG、IgA和/或IgM)的方法，其中使用本发明的配体单体、二聚体或基质。因此，本发明包括色谱方法，其中通过吸附到上述配体单体、二聚体或基质，从液体中分离至少一种目标化合物。所需产品可以是经分离的化合物或液体。因此，本发明的这一方面与亲和色谱相关，亲和色谱是广泛使用和众所周知的分离技术。简而言之，在第一个步骤，使包含目标化合物(优选是上述抗体)的溶液在以下条件下流经分离基质，所述条件允许目标化合物吸附到所述基质上存在的配体。例如通过溶液中的pH值和/或盐浓度(即离子强度)来控制这种条件。应注意不要超过所述基质的能力，即流速应足够慢以允许满意的吸附。在这一步，溶液中的其他组分大体上将畅通地流过。任选的是，然后洗涤基质，例如用水溶液，以除去残留和/或松散结合的物质。本发明基质最有利的是与使用添加剂(例如溶剂、盐类或去垢剂或它们的混合物)的中间洗涤步骤一起使用。在下一步，使被称为洗脱液的第二种溶液在提供解吸(即释放目标化合物)的条件下流经基质。通常由pH、盐浓度(即离子强度)、疏水性等的变化来提供这种条件。已知有多种洗脱方案，例如梯度洗脱和分步洗脱。也可以用包含竞争物质的第二种溶液来进行洗脱，该竞争物质将置换基质上的所需抗体。关于亲和色谱原理的全面评述，参见例如Wilchek，M.和Chaiken，I.，2000，亲和色谱概述(An overview of affinitychromatography)，Methods Mol.Biol.，147：1-6。
实施例
下面，将通过实施例描述本发明，提供该实施例仅用于说明目的，因此不应理解为限制所附权利要求书所定义的本发明范围。本申请下文和其他地方给出的所有参考文献都在此通过引用包含于本文中。
实施例1
本研究的目的是比较基于琼脂糖的介质原型的性能，所述琼脂糖与碱稳定性A蛋白(即SuRe配体结构域)的单体、二聚体和四聚体固定化(以下分别称为z1、z2和z4)，所述比较通过如下进行：
-测定CHO细胞培养物中表达的两种不同单克隆抗体的动态结合能力。
-比较用各种配体获得的洗脱pH
-测量在10％穿透、样品上样量为动态结合能力的70％时对宿主细胞蛋白的清除率。
1.实验
1.1.介质原型
MabSelect SuRe：批次312257    (配体密度5.6mg/ml)
HFA35 Z1：U1975095            (配体密度1.64mg/ml)
HFA35 Z2：U1975098            (配体密度3.46mg/ml)
1.2.化学试剂和样品
PBS缓冲液，SIGMA，P4417-100Tab
NaOH，Merck，1.06649.1000
脱水柠檬酸三钠，Merck，1.06448.1000
MAb 1，宿主细胞澄清饲养层(host cell clarified feed，HCCF)，1.1mgMAb/ml
MAb 2，宿主细胞澄清饲养层，1.8mg MAb/ml
1.3.系统
Explorer 100，AL E100.
Figure BPA00001406079700152
Explorer 10，HH E10S.
分光光度计，UltroSpec 3000pro.
2.方法
2.1迎头法
用含MAb(MAb 1和MAb 2)的两种不同宿主细胞澄清饲养层进行迎头法。
采用预编程Unicorn方法，由6个模块组成：
1.用PBS缓冲液平衡，持续5CV。
2.将饲养层上样，直到MAb的穿透为大约80％。
3.用PBS缓冲液洗出未结合材料，持续10CV。
4.在从60mM柠檬酸盐pH 6.0至60mM柠檬酸盐pH 3.0的20CV梯度内进行洗，。
5.用0.1M NaOH以0.3ml/分钟进行CIP 15分钟。
6.用PBS重新平衡。
用295nm处的紫外吸光度确定穿透。在迎头法之前，将饲养层注射经旁路流过色谱柱，以获得与饲养层的MAb、宿主细胞蛋白(HCP)和其他组分相对应的最大吸光值。从紫外曲线中减去在早期样品上样期间的“坪流过”值(对应于饲养层中不与柱结合的组分)，由此得到的吸光值用于依据等式1计算在5％、10％和80％穿透时的动态结合能力。
等式1：QBX％＝(Vx％-V0)C0/Vc
其中Vx％＝在x％穿透时的样品上样体积，C0＝样品浓度(mg/ml)，VC＝几何总体积和V0＝外水体积。
2.2HCP清除率
将样品上样至最终上样量为QB10％值的70％。在洗出未结合材料后，用60mM柠檬酸盐pH 3.5进行洗脱。合并洗脱流分，按1比10的量用0.2M磷酸钠、1％BSA、0.5％tween pH 8.0稀释。然后用Gyros方法分析样品中的HCP含量。在280纳米处测定上清液的吸光度。用朗伯-比尔定律(等式2)计算MAb浓度。然后通过用HCP浓度(ng/ml)除以MAb浓度(mg/ml)获得HCP浓度(以ppm计)。
等式2：A＝C*l*ε
其中C＝蛋白浓度(mg/ml)，A＝280nm处的吸光度，L＝路径长度(cm)＝1，ε＝消光系数(mg ml-1cm-1)＝1.7。
依据等式3计算收率：
等式3：收率(％)＝100*(V合并物*C合并物)/(V上样*C0)
其中V合并物＝合并流分的体积，C合并物＝在合并物中的MAb浓度，V上样＝上样到柱上的样品体积和C0＝样品浓度(mg/ml)。
2.3利用分析性尺寸排阻色谱法测定纯度
在SUPERDEX 200 5/150GL上，按照手册用标准方法进行分析性尺寸排阻色谱法。洗脱缓冲液是PBS pH 7.4(SIGMA)，样品体积为25μL。通过对色谱图进行积分来测定MAb纯度。
3.结果和讨论
3.1迎头法
3.1.1MAb 1
计算了5％、10％和80％穿透时的动态结合能力(DBC)。结果见表1a。MabSelect SuRe(z4)和z2在5％和10％穿透的DBC是相等的，而z1的值较低。然而，如表1b所示，含较少z单元的配体获得了最高相对能力(即，表示为mg MAb/mg配体的能力)，即z1＞z2＞z4。
QB10％/QB80％的比较被用作动力学的衡量(较高的值表示更快的动力学)。结果表明，与z1或z2相比，z4得到稍微较慢的动力学。
在pH梯度中的洗脱，对z4和z2得到大致相同的洗脱pH(pH3.6-3.7)，而MAb自z1中在稍微较高的pH洗脱(pH 4.0)。
还测定了在1至2.4分钟之间的不同停留时间的DBC。正如预期，在较低停留时间(即较高流速)时DBC下降。然而，z2 DBC的降低少于z4的，用z1得到进一步改善(表1a)。因此，为了最低的DBC下降，单体配体是优选的。
表1a.MAb 1的迎头法结果总结
Figure BPA00001406079700171
Figure BPA00001406079700181
*Z4＝MabSelect SuRe
表1b.MAb 1的迎头法结果，表示为相对能力。(停留时间：2.4分钟)
Figure BPA00001406079700182
3.1.2MAb 2
在2.4分钟停留时间进行迎头法，计算了5％、10％和80％穿透的动态结合能力(DBC)。结果见表2a。对于MAb 1，MabSelectSuRe(z4)和z2在5％和10％穿透的DBC几乎相等，而z1得到的值较低。如上所述，含较少z单元的配体获得了最高相对能力，即z1＞z2＞z4。比较QB10％/QB80％显示，含较少z单元的配体获得了较快的动力学，即z4＜z2＜z1。
与z2相比，在pH梯度中的洗脱，得到z1的洗脱pH略微较高(由于实验误差，未获得z4的值)。
表2a.MAb 2的迎头法结果总结。
*Z4＝MabSelect SuRe
表2b.MAb 2的迎头法结果，表示为相对能力。(停留时间：2.4分钟)
Figure BPA00001406079700191
3.2HCP清除率
将样品上样至最终上样量为QB10％值的70％，分析洗脱合并物的HCP含量，并通过在Superdex 5/150GL上的分析性尺寸排阻色谱法来分析。对MAb 1和MAb 2的纯化得到的结果见表3。对于z1、z2和z4，HCP清除率几乎相同。然而，在HCP的相对减少(即C起始物质/C合并物)及百分比收率方面，MAb 1高于MAb 2。
经分析性尺寸排阻色谱法测定，两种MAb洗脱合并物都含有4.4％-6.8％二聚体/聚集物。对不同的配体，没有观察到明显的趋势。自z2介质中在较高pH(即，以3.75取代3.5)洗脱MAb 2，导致收率较低、HCP和二聚体/聚集物稍微较高的减少。
表3.MAb 1和MAb 2的纯化结果总结
  MAb 1   收率(％)   mg Mab/ml   ng HCP/ml   ppm HCP   D/A％2   纯度％3
  起始物质   1.1   36500   36869
  Z41   95   7.5   1090   161   4.4   95
  Z2   97   7.6   1100   161   5.7   94
  Z1   98   6.1   1130   206   5.5   92
  MAb 2   收率(％)   mg Mab/ml   ng HCP/ml   ppm HCP4   D/A％2   纯度％3
  起始物质   1.8   19000   11728
  Z41   83   8.8   2350   297   4.7   94
  Z2   92   10.7   4450   462   6.8   93
  Z2(洗脱pH 3.75)   85   7.95   2050   287   3.2   96
  Z1   78   8   1900   264   4.4   95
1Z4＝MabSelect SuRe.
2D/A＝经分析性尺寸排阻色谱法测定的聚集物和二聚体
3纯度＝(单体MAb的峰面积)/(总峰面积)，通过对分析性尺寸排阻色谱法的色谱图积分而确定
4.结论
对Z4和Z2获得最高的动态结合能力。对Z1得到最低能力，Z1也具最低的配体密度(1.64mg/ml)。然而，对含较少z单元的配体获得了最高相对能力(mg MAb/mg配体)。
对与含较少z-单元的配体偶联的基于琼脂糖的介质原型，获得了更快的动力学和在停留时间减少时动态结合能力降低得更少。因此，z1在较短停留时间的能力下降是最低的。
两种MAb的洗脱pH在z1上都稍微较高。较高的洗脱pH对容易在低pH发生聚集的MAb可为优势。
z1、z2和z4的HCP清除率几乎相等。
实施例2
本研究的目的是比较基于琼脂糖型介质的介质原型的性能，该介质原型与碱稳定性A蛋白的不同形式，即Z结构域的单体、二聚体和四聚体(以下命名为Z1、Z2和Z4)偶联，该比较通过如下进行：
-测定“MAb 3”的动态结合能力
-测定在10％穿透、样品上样量为动态结合能力的70％时对宿主细胞蛋白的清除率。
1.实验
1.1色谱介质和过滤器
HFA35 Z4：MabSelect SuRe批次10007589(配体密度5.9mg/ml)
HFA35 Z1：U1975095                  (配体密度1.64mg/ml)
HFA35 Z2：U1975098                  (配体密度3.46mg/ml)
Superdex 200 5/150GL，GE Healthcare，28-9065-63
1.2化学试剂
PBS缓冲液，SIGMA，P4417-100Tab
NaCl，MERCK，1.06404.1000
NaOH，MERCK，1.06649.1000
柠檬酸，MERCK，1.00244.0500
丙酮，MERCK，1.00014.2511
粗葡聚糖，GE Healthcare(无批号)
用于稀释ELISA样品的保存液：
0.2M磷酸钠，1％BSA，0.5％tween pH 8.
在宿主细胞澄清饲养层(HCCF)中的MAb 3[VH3]，3mg/ml(消光系数1.4)
1.3系统
参见实施例1.
2.方法
2.1迎头法
用MAb 3进行迎头法。采用预编程Unicorn方法，由6个模块组成：
1.用PBS缓冲液平衡，持续5CV。
2.将饲养层上样，直到MAb的穿透大于10％。
3.用平衡缓冲液洗出未结合材料，持续10CV。
4.用60mM柠檬酸盐pH 3.5进行洗脱，持续6CV。
5.用0.1M氢氧化钠以0.3ml/分钟进行CIP15分钟。
6.用平衡缓冲液重新平衡。
用295nm处的紫外吸光度确定穿透，基本如实施例1中描述。依据等式1，计算在10％穿透时的动态结合能力。
2.2HCP清除率
将样品上样至最终上样量为QB10％值的70％。在洗出未结合材料后，用0.1M柠檬酸盐pH 3.3进行洗脱。合并洗脱流分，按1/10用保存液稀释。然后分析样品中的HCP含量，并按照2.3通过分析性尺寸排阻色谱法分析聚集物含量。在280nm处测定上清液的吸光度。用朗伯-比尔定律(等式2)计算MAb浓度(ε＝消光系数(mg ml-1cm- 1)＝1.4)。然后通过用HCP浓度(ng/ml)除以MAb浓度(mg/ml)获得HCP浓度(以ppm计)。
依据等式3计算抗体收率。
2.3通过分析性尺寸排阻色谱法测定纯度
参见实施例1
3.结果与讨论
3.1迎头法
计算了在10％穿透时不同的停留时间(1、2.4和6分钟)的动态结合能力(DBC)。结果见表4和图1。对Z4(即MabSelect SuRe)得到的DBC最高，Z2次之。对Z1得到的DBC最低。然而，如表5所示，含较少Z单元的配体获得了最高相对能力(即，mg MAb/ml配体)，即Z1＞Z2＞Z4。该结果与先前在实施例1中获得的结果一致。
表4.迎头法结果总结。
Figure BPA00001406079700221
表5.迎头法结果，表示为相对能力。
Figure BPA00001406079700222
Figure BPA00001406079700231
1由于在样品上样期间MAb的渗漏，在1分钟停留时间的DBC难以测定。
3.2HCP清除率、收率和纯度
在2.4分钟的停留时间，将样品上样至最终上样量为10％穿透时DBC的70％，对洗脱合并物分析HCP含量，并在Superdex 2005/150GL上通过分析性尺寸排阻色谱法进行分析。结果见表6。在HCP清除率、收率以及高分子量和低分子量物质的水平方面，Z1、Z2和Z4几乎等同。
作为对照实验，通过在Superdex 200 5/150GL上的分析性尺寸排阻色谱法，分析起始物质和来自HFA35 Z1的流过流分。在流过合并物中几乎无法检测到MAb。
表6MAb 3纯化结果的总结
Figure BPA00001406079700232
2通过Superdex 200 5/150GL上的分析性尺寸排阻色谱法确定MAb的纯度
实施例3
Fc结合蛋白是通过结合两种蛋白(融合蛋白)制成的重组DNA药物。它将人可溶性TNFα受体连接至人免疫球蛋白G1(IgG1)的Fc组分。它是一个大分子，分子量为150kDa，其结合TNFα并降低其在涉及人类和其他动物的过度炎症的病症中的作用，所述病症包括自身免疫性疾病例如强直性脊柱炎、幼年型类风湿关节炎、银屑病、银屑病关节炎、类风湿关节炎和潜在的由过量TNFα介导的其他各种病症。这种治疗潜力基于以下事实：TNF-α是许多器官系统中炎症反应的“主调节物”。
本研究的目标是通过测定对在澄清CHO细胞培养上清液中表达的Fc融合蛋白的动态结合能力，来比较基于HFA 35的介质原型的性能，所述介质原型与碱稳定性A蛋白的不同形式即Z结构域的单体、二聚体和四聚体(以下命名为Z1、Z2和Z4)偶联。
1.实验
1.1.色谱介质和过滤器
HiTrap MabSelect SuRe，GE Healthcare，批次10021346
预-过滤器：5μm聚丙烯过滤器，Millipore，AN5004700
其它介质参见实施例2
1.2.化学试剂
TRIS，MERCK，1.08382.0500
PBS缓冲液，SIGMA，P4417-100Tab
NaCl，MERCK，1.06404.1000
NaOH，MERCK，1.06649.1000
NaN3，MERCK，K2806788
HCl，MERCK，1.09973.001
醋酸，MERCK，1.00063.2511
丙酮，MERCK，1.00014.2511
粗葡聚糖，GE Healthcare(无批号)
来自CHO细胞培养上清液的含融合蛋白Fc融合蛋白的饲养层。所述饲养层含0.48mg Fc融合蛋白l/ml
纯化的Fc融合蛋白
MAb 3
1.3.仪器
Figure BPA00001406079700241
Explorer 100，AL E100.
Explorer100，AL L100.
Figure BPA00001406079700243
Explorer 10.LK-E 10XT
2.方法
2.1.样品制备
用5μm预过滤器过滤CHO细胞培养上清液。加入NaN3至终浓度为0.05％(重量/体积)。样品被存放在约6℃的冰箱中。
2.2.迎头法
用Fc融合蛋白饲养层进行迎头法。采用预编程Unicorn方法，由6个模块组成：
1.用25mM TRIS-HCl，0.15M NaCl pH 7.4平衡，持续5CV。
2.将饲养层上样，直到融合蛋白的穿透大于10％(注意，由于饲养层浓度低(0.48mg T2/ml)，所述穿透不能用紫外信号监测到。收集1.3ml流分，并按下文说明分析)。
3.用平衡缓冲液洗出未结合材料，持续10CV。
4.用0.1M醋酸pH 3.6进行洗脱，持续6CV。
5.用0.5M氢氧化钠以0.4ml/分钟进行CIP 15分钟。
在HiTrap MabSelect SuRe柱上，用与上述同样的缓冲液分析上样期间的所选流分。对洗脱峰进行积分，将mAUxml的峰面积与起始物质峰面积进行比较。根据具有10％峰面积在起始物质中的流分定义出10％穿透(V10％)时的上样体积。然后根据等式1计算动态结合能力(QB10％)。
2.3尺寸排阻色谱法
分析性尺寸排阻色谱法如实施例1进行。
在峰顶确定每个样品的保留体积(VR)。用约5％粗葡聚糖确定外水体积(V0)，用含5％丙酮的PBS缓冲液确定总液体体积(Vt)。
分配系数KD代表固定相的比例，其可用于既定溶质种类的扩散[凝胶过滤原理与方法(Gel filtration Principles and Methods)，Pharmacia LKB Biotechnology 1991；Lars Hagel，凝胶过滤在蛋白纯化中的原理、高分辨率方法和应用(Gel Filtration，in ProteinPurification，Priciples，High Resolutiom Methods and Applications)，J-CJansson和L Ryde′n编辑，VHS Publishers，New York，1989.，第3章]。根据等式4计算KD：
KD＝(VR-V0)/Vp＝(VR-V0)/(Vt-V0)
其中VP＝孔体积(＝Vt-V0)。
3.结果与讨论
测定了在两个不同的停留时间(即2.4分钟和6分钟)在10％穿透时对Fc融合蛋白的动态结合能力(DBC)。结果见表7。与先前MAb的结果相比，Z1和Z2对Fc融合蛋白的DBC高于Z4。
表7FC-融合蛋白的迎头法结果总结
Figure BPA00001406079700261
虽然Z1的配体密度低于Z4(分别为1.65mg/ml和5.9mg/ml)，但Z1的DBC较高，特别是在较短的停留时间时。Z2(配体密度3.46mg/ml)的DBC也高于Z4，特别是在较长的停留时间时。对Z1获得最高的相对能力(即，表示为mg Fc融合蛋白/mg配体的能力)(表8)。
表8迎头法结果，表示为相对能力
Figure BPA00001406079700262
在Superdex 200 5/150GL上的分析性尺寸排阻色谱表明，Fc融合蛋白的洗脱早于MAb 3(图2)。Fc融合蛋白和MAb 3的分配系数(KD)分别被计算为0.28和0.43。因此，即使分子量的差别小，但与MAb相比，FC融合蛋白的行为就像更大的分子(即较高的溶质半径(radious))。
实施例4
本研究的目的是探讨几种单克隆抗体的洗脱pH，所述单克隆抗体在基于琼脂糖的基质上的不同z-配体上纯化而得。以线性pH梯度进行洗脱。测定最大峰值处的洗脱pH。与其他原型相比，单体配体原型上纯化的样品用稍微较高的pH洗脱。结果还表明，洗脱pH依赖于配体密度。用多克隆IgG调查了较高的样品上样量。没有迹象表明，较高的样品上样量会影响洗脱pH。
洗脱条件可对每一种MAb的进一步优化有益。在中性pH捕获MAb，并在酸性pH洗脱。如果可用提高的pH洗脱MAb，则这可对易于在低pH时发生聚集的单MAb来说是优势。较高的洗脱pH可以防止聚集和得到更高的回收率。
在本实施例中，我们调查了在MabSelect SuRe配体结构域的不同碱稳定性z-配体上七种不同免疫球蛋白分子的洗脱pH。我们还调查了多克隆IgG的高上样量对不同z-配体的影响。
1.实验
1.1.材料/调查单元
1.1.1.柱
具有不同Z配体的基于琼脂糖的介质：
基于琼脂糖的介质 Z1：U1975077    (1.98mg/ml)
基于琼脂糖的介质 Z2：U1975098    (3.46mg/ml)
MabSelect SuRe(Z4)批次：312257   (5.6mg/ml)
MabSelect SuRe(Z4)批次：306928   (5.6mg/ml)
结合能力：
表9：多克隆IgG(gammanorm)的QB10数据
Figure BPA00001406079700271
Figure BPA00001406079700281
1.1.2.缓冲液
10mM磷酸盐缓冲液(PBS，SIGMA，P4417-100Tab)
60mM柠檬酸钠pH 6(柠檬酸钠M.294.1g/mol)用HCl调节pH
60mM柠檬酸钠pH 3(柠檬酸钠M.294.1g/mol)用HCl调节pH
0.3M NaOH
1.1.3.样品
所有样品均为纯组分。PD-10柱用于缓冲液交换。
多克隆人IgG(Octapharma，gammanorm)
MAb 1
MAb 2
Fc融合蛋白，批次：1510
含IgG的CHO细胞上清液
MAb 4(在HiTrap MabSelect SuRe上纯化)
MAb 3
上样0.5-1.5mg样品/ml介质。
1.2.方法
UNICORN方法
平衡：5CV
样品体积：1ml(低上样量)
洗出非结合样品：5CV
洗脱：梯度pH 6至pH3，20CV
重新平衡：5CV
停留时间：2.4分钟
以线性pH梯度进行洗脱。测定最大峰值处的洗脱pH。
1.3.仪器
Figure BPA00001406079700291
10 TF_E10
分光光度计  Molecular Devices Spextramax PLUS
Mettler Toledo Seven Easy
2.结果
在具不同配体密度的不同z-配体原型(即单体(Z1)、二聚体(Z2)和SuRe(Z4))上纯化了七种MAb和Fc结合蛋白。在原型SuRe(1,37mg/ml)上洗脱的FC融合蛋白和MAb 1的pH与该柱上的其他样品不同。可能的解释是，这两个样品在加样前已被冻结/融化。
MAB 3和Mab 4样品是在MabSelect介质(重组A蛋白)上纯化。如预期，MAB 3的洗脱pH在MabSelect上低于其他z原型。MAB 3包含了VH3部分，Fc部分和VH3部分两者都结合到MabSelect介质，需要较低的pH用于洗脱。
结果显示，洗脱pH与配体密度有依赖性。与其他的原型相比，当样品在单体配体原型上纯化时，它们的洗脱pH稍微较高(图3)。
图3显示了不同的MAb和Fc融合蛋白的洗脱pH值，低上样量，加样于不同的z原型上。结果证实，洗脱pH依赖于配体密度。在单体配体原型上纯化的样品的洗脱pH略高于其他原型。用多克隆IgG调查了较高的样品上样量。没有迹象表明，较高的样品上样量会影响洗脱pH。
由于从单体配体原型洗脱MAb需要较高的洗脱pH，所以这提供了避免在洗脱步骤期间形成聚集物的好处。此特性和其他特性使单体成为亲和色谱的良好配体。
上述实施例说明了本发明的具体方面，而不是意图限制其在任何方面的范围，并且也不应如此理解。受益于上文陈述的本发明教导的本领域技术人员，可对本发明实施大量的修改。这些修改应视为包括在所附权利要求所陈述的本发明范围内。

Claims (15)

1.一种从液体中分离一种或多种含免疫球蛋白的蛋白的方法，所述方法包括：
(a)使所述液体与分离基质接触，所述基质包含固定到支持体的配体；
(b)使所述含免疫球蛋白的蛋白通过与所述配体的相互作用而吸附到所述基质上；
(c)洗涤所述被吸附的含免疫球蛋白的蛋白的任选步骤；
(d)通过使所述基质与释放所述蛋白的洗脱液接触，来回收所述含免疫球蛋白的蛋白；
改善之处在于，每一种所述配体基本由葡萄球菌A蛋白(SpA)的结构域B或Z蛋白或其功能性变体的单体组成。
2.一种从液体中分离一种或多种含免疫球蛋白的蛋白的方法，所述方法包括：
(a)使所述液体与分离基质接触，所述基质包含固定到支持体的配体；
(b)使所述含免疫球蛋白的蛋白通过与所述配体的相互作用而吸附到所述基质上；
(c)洗涤所述被吸附的含免疫球蛋白的蛋白的任选步骤；
(d)通过使所述基质与释放所述蛋白的洗脱液接触，来回收所述含免疫球蛋白的蛋白；
改善之处在于，每一种所述配体基本由葡萄球菌A蛋白(SpA)的结构域B或Z蛋白或其功能性变体的二聚体组成。
3.权利要求1或2的方法，其中所述配体通过将至少一个天冬酰胺残基突变为除谷氨酰胺外的氨基酸而对碱稳定的。
4.权利要求3的方法，其中所述配体具有对免疫球蛋白Fc部分的亲和力，但缺乏对免疫球蛋白Fab部分的亲和力。
5.权利要求4的方法，其中所述配体的至少一个甘氨酸已被丙氨酸置换。
6.权利要求4的方法，其中在29位的甘氨酸残基已被改变为丙氨酸。
7.权利要求1或2的方法，其中所述配体是Z蛋白，其中已通过将至少一个天冬酰胺残基突变为除谷氨酰胺外的氨基酸实现碱稳定性。
8.权利要求7的方法，其中已通过将至少23位的天冬酰胺残基突变为除谷氨酰胺外的氨基酸实现Z蛋白的碱稳定性。
9.权利要求2的方法，其中通过加入pH为3.8-4.2的洗脱液实现对含免疫球蛋白的蛋白的回收。
10.权利要求2的方法，其中使用pH为3.8-4.2的洗脱液，回收至少80％、例如至少90％、优选至少95％的所述含免疫球蛋白的蛋白。
11.权利要求1的方法，其中通过加入pH为4.0-4.4的洗脱液实现对含免疫球蛋白的蛋白的回收。
12.权利要求1的方法，其中使用pH为4.0-4.4的洗脱液，回收至少80％、例如至少90％、优选至少95％的所述含免疫球蛋白的蛋白。
13.权利要求1或2的方法，其中所述含免疫球蛋白的蛋白是单克隆抗体。
14.权利要求1或2的方法，其中所述含免疫球蛋白的蛋白是多克隆抗体。
15.权利要求1或2的方法，其中所述含免疫球蛋白的蛋白是融合蛋白，所述融合蛋白包含与另一种蛋白融合的免疫球蛋白。
CN201080004708.4A 2009-01-12 2010-01-11 亲和色谱基质 Active CN102272145B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE0900029 2009-01-12
SE0900029-0 2009-01-12
PCT/SE2010/050016 WO2010080065A1 (en) 2009-01-12 2010-01-11 Affinity chromatography matrix

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102272145A true CN102272145A (zh) 2011-12-07
CN102272145B CN102272145B (zh) 2014-07-30

Family

ID=42316657

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201080004708.4A Active CN102272145B (zh) 2009-01-12 2010-01-11 亲和色谱基质

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20120149875A1 (zh)
EP (1) EP2389386A4 (zh)
JP (1) JP2012515160A (zh)
CN (1) CN102272145B (zh)
WO (1) WO2010080065A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106543274A (zh) * 2016-10-18 2017-03-29 天津大学 一种对抗体具有特异性结合作用的a蛋白结构域z的衍生物及其应用
CN109311949A (zh) * 2016-05-11 2019-02-05 通用电气医疗集团生物工艺研发股份公司 储存分离基质的方法
CN110325274A (zh) * 2017-02-27 2019-10-11 通用电气医疗集团生物工艺研发股份公司 分离抗体的分离基质和方法

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE0200943D0 (sv) * 2002-03-25 2002-03-25 Amersham Biosciences Ab Mutant protein
EP1870459B1 (en) 2005-03-31 2016-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
CN106519025B (zh) 2007-09-26 2021-04-23 中外制药株式会社 利用cdr的氨基酸取代来改变抗体等电点的方法
MY180713A (en) 2007-09-26 2020-12-07 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Modified antibody constant region
US8592555B2 (en) 2008-08-11 2013-11-26 Emd Millipore Corporation Immunoglobulin-binding proteins with improved specificity
WO2010054401A1 (en) * 2008-11-10 2010-05-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Novel lipids and compositions for the delivery of therapeutics
SG162687A1 (en) 2008-12-24 2010-07-29 Millipore Corp Caustic stable chromatography ligands
TR201811076T4 (tr) * 2009-06-10 2018-08-27 Arbutus Biopharma Corp Geliştirilmiş lipit formulasyonu.
WO2011107518A1 (de) * 2010-03-05 2011-09-09 Boehringer Ingelheim International Gmbh Selektive anreicherung von antikörpern
US8859726B2 (en) 2010-11-29 2014-10-14 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Affinity chromatography matrix
EP4279511A3 (en) 2010-11-30 2024-01-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
US9683013B2 (en) 2010-12-20 2017-06-20 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Affinity chromatography matrix
EP2654914B1 (en) * 2010-12-20 2018-05-30 GE Healthcare BioProcess R&D AB Affinity chromatography matrix
SG10201604559TA (en) 2011-06-08 2016-07-28 Emd Millipore Corp Chromatography matrices including novel staphylococcus aureus protein a based ligands
JPWO2013018880A1 (ja) * 2011-08-04 2015-03-05 独立行政法人産業技術総合研究所 プロテインｇの細胞膜外ドメイン変異体のタンデム型多量体から成る新規な改変型タンパク質
EP2831096B1 (en) * 2012-03-28 2020-04-29 GE Healthcare BioProcess R&D AB Affinity chromatography matrix
US8921113B2 (en) 2012-12-21 2014-12-30 Dionex Corporation Buffer kit and method of generating a linear pH gradient
US20160215026A1 (en) 2013-09-06 2016-07-28 Kaneka Corporation Dissociation capacity-boosted ligand for affinity dissociation matrix
JP7082484B2 (ja) 2015-04-01 2022-06-08 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
SG11201803989WA (en) 2015-12-28 2018-06-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for promoting efficiency of purification of fc region-containing polypeptide
US10703774B2 (en) 2016-09-30 2020-07-07 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
ES2874974T3 (es) 2016-05-11 2021-11-05 Cytiva Bioprocess R & D Ab Matriz de separación
ES2909833T3 (es) 2016-05-11 2022-05-10 Cytiva Bioprocess R & D Ab Método de limpieza y/o desinfección de una matriz de separación
US10730908B2 (en) 2016-05-11 2020-08-04 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
US10654887B2 (en) 2016-05-11 2020-05-19 Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab Separation matrix
WO2020040307A1 (ja) * 2018-08-24 2020-02-27 Jsr株式会社 イムノグロブリン結合タンパク質、及びそれを用いたアフィニティー担体
CN109182364A (zh) * 2018-08-30 2019-01-11 武汉百意欣生物技术有限公司 一种特异性识别蛋白a的多克隆抗体及其制备方法和应用
US11022585B2 (en) 2019-06-09 2021-06-01 Dionex Corporation Methods and systems for optimizing buffer conditions with liquid chromatography

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1404428B1 (en) * 2001-06-05 2006-07-19 Genetics Institute, LLC Methods for purifying highly anionic proteins
SE0200943D0 (sv) * 2002-03-25 2002-03-25 Amersham Biosciences Ab Mutant protein
US7709209B2 (en) * 2002-03-25 2010-05-04 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Protein ligands
US8592555B2 (en) * 2008-08-11 2013-11-26 Emd Millipore Corporation Immunoglobulin-binding proteins with improved specificity
SG162687A1 (en) * 2008-12-24 2010-07-29 Millipore Corp Caustic stable chromatography ligands

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109311949A (zh) * 2016-05-11 2019-02-05 通用电气医疗集团生物工艺研发股份公司 储存分离基质的方法
CN109311949B (zh) * 2016-05-11 2022-09-16 思拓凡生物工艺研发有限公司 储存分离基质的方法
CN106543274A (zh) * 2016-10-18 2017-03-29 天津大学 一种对抗体具有特异性结合作用的a蛋白结构域z的衍生物及其应用
CN106543274B (zh) * 2016-10-18 2020-10-27 天津大学 一种对抗体具有特异性结合作用的a蛋白结构域z的衍生物及其应用
CN110325274A (zh) * 2017-02-27 2019-10-11 通用电气医疗集团生物工艺研发股份公司 分离抗体的分离基质和方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP2389386A1 (en) 2011-11-30
WO2010080065A1 (en) 2010-07-15
CN102272145B (zh) 2014-07-30
EP2389386A4 (en) 2013-11-06
JP2012515160A (ja) 2012-07-05
US20120149875A1 (en) 2012-06-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102272145B (zh) 亲和色谱基质
US10751645B2 (en) Chromatography ligand
US9187555B2 (en) Affinity chromatography matrix
US9683013B2 (en) Affinity chromatography matrix
AU2005317279B2 (en) Purification of immunoglobulins
JP4776615B2 (ja) 抗体精製
US8859726B2 (en) Affinity chromatography matrix
Narayanan Preparative affinity chromatography of proteins
CN107001432A (zh) 突变的免疫球蛋白结合多肽
CN105377880A (zh) 突变的免疫球蛋白结合多肽
CN101060931B (zh) 色谱配体
CN118201957A (zh) Fc结合多肽
Majeed et al. Efficiency of purification techniques of human IgG–a review
WO2008121042A1 (en) Purification of immunoglobulins

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20160816

Address after: uppsala

Patentee after: GE HEALTHCARE BIO-SCIENCES AB

Address before: uppsala

Patentee before: GE Health Bio-science Co., Ltd.

CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: uppsala

Patentee after: Situofan Biotechnology R & D Co., Ltd

Address before: uppsala

Patentee before: GE HEALTHCARE BIOPROCESS R&D AB

CP01 Change in the name or title of a patent holder