MXPA05001766A - Uso de proteina quinasa n beta. - Google Patents

Uso de proteina quinasa n beta.

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MXPA05001766A
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kinase
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Anke Klippel-Giese
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Abstract

La presente invencion se refiere al uso de la proteina quinasa N beta o un fragmento o derivado de la misma como un objetivo corriente debajo de la trayectoria de Pl 3-quinasa, preferentemente como un objetivo de droga corriente debajo de la trayectoria de PI 3-quinasa.

Description

USO DE PROTEÍNA Q UI NASA N BETA" CAMPO DE LA I NVENCI ÓN La presente invención se refiere al uso de la proteína quinasa N beta.
ANTECEDENTES D E LA I NVE N CIÓ N El desarrollo de drogas modernas ya no se basa en un planteamiento más o menos heurístico sino que típicamente implica la elucidación del mecanismo molecular subyacente a una enfermedad o condición, la identificación de moléculas objetivo candidatas y la evaluación de dichas moléculas objetivo. Una vez que tal molécula objetivo candidata, la cual también es referida en la presente como objetivo, se encuentra disponible, pueden probarse las candidatas de droga relacionadas con la misma. En muchos casos tales candidatas de droga son miembros de una biblioteca compuesta la cual puede consistir en compuestos sintéticos o naturales. También es común el uso de bibliotecas combinacionales. Tales bibliotecas de compuesto son referidas en la presente como bibliotecas de compuestos candidatos. Aunque este planteamiento ha probado ser exitoso en el pasado, aún requiere mucho tiempo y dinero. Actualmente se aplican diferentes tecnolog ías para la identificación de objetivo y la validación de objetivo. Aún, numerosos tumores y cánceres son una gran amenaza a la salud humana. Con objeto de crear drogas más seguras y más poderosas que tengan menos efectos secundarios, es necesario saber acerca de las moléculas objetivo las cuales, después de abordarse por los compuestos apropiados, pueden influenciarse específicamente y selectivamente en su actividad o presencia. Debido a la interacción preferentemente selectiva y específica entre el compuesto, el cual puede ser una droga potencial o candidata, y el objetivo, la función del objetivo en -una enfermedad o condición de enfermedad tal como, por ejemplo, cáncer, tumorigénesis y metástasis, puede influenciarse y consecuentemente la enfermedad puede tratarse o evitarse y mejorarse la condición de enfermedad.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Por ende, el problema subyacente a la presente invención fue proporcionar un objetivo el cual es adecuado para planteamientos terapéuticos en el tratamiento de la tumorigénesis y el cáncer. Fue además un problema subyacente a la presente invención proporcionar un objetivo el cual se encuentra implicado en la tumorigénesis y la metástasis. El problema subyacente a la presente invención se soluciona en un primer aspecto por el uso de la proteína quinasa N beta o un fragmento o derivado de la misma como un objetivo corriente debajo de la trayectoria de Pl 3-quinasa, preferentemente como un objetivo de droga corriente debajo de la trayectoria de Pl 3-quinasa. €1 problema subyacente a la presente invención se soluciona en un segundo aspecto por el uso de la proteína quinasa N beta o un fragmento o derivado de la misma para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad y/o para la elaboración de un agente de diagnóstico para el diagnóstico de la enfermedad, donde la enfermedad se selecciona a partir del grupo que comprende cánceres, cánceres metastáticos y cualquier condición patológica que implique la trayectoria de Pl 3-quinasa. En una modalidad del uso de acuerdo con el aspecto primero y segundo de la presente invención , la proteína quinasa N beta tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el NO DE ID DE SEC. 1 o de acuerdo con el ingreso di banco de datos PID g7019489 o el acceso del banco de datos gi 7019489, o una parte o derivado del mismo. El problema subyacente a la presente invención se soluciona en un tercer aspecto por el uso de una codificación de ácido nucléico para la proteína de quinasa N beta, o un fragmento o derivado de la misma para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad y/o para la elaboración de un agente de diagnóstico para el diagnóstico de una enfermedad, donde la enfermedad se selecciona a partir del grupo que comprende cánceres, cánceres metastáticos y cualquier condición patológica que implique la trayectoria de Pl 3-quinasa. En una modalidad del uso de acuerdo con un tercer aspecto de la presente invención , la proteína de quinasa N beta tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el NO DE I D DE SEC. 1 o de acuerdo con el ingreso del banco de datos PID g701 9489 o el acceso del banco de datos gi 701 9489, o una parte o derivado del mismo.
En otra modalidad del uso de acuerdo con el tercer aspecto de la presente invención, el ácido nucléico es un ácido nucléico de acuerdo con el NO DE ID DE SEC. 2 o de acuerdo con los accesos del banco de datos gi 7019488 o NM_01345, preferentemente NM_01335.1 . En otra modalidad del uso de acuerdo con cualquiera de los aspectos de la presente invención la proteína de quinasa N beta se codifica por un ácido nucléico de acuerdo con el NO DE I D DE SEC. 2 o de acuerdo con los accesos del banco de datos gi 7019488 o NM_01335, preferentemente NM_01 335.1 . En una modalidad del uso de acuerdo con el tercer aspecto de la presente invención, la secuencia de ácidos nucleicos, pero para la degeneración del código genético hibridizaría al ácido nucléico inventivo sujeto al tercer aspecto de la presente invención. En una modalidad adicional del uso de acuerdo con cualquiera de los aspectos de la presente invención, la secuencia de ácidos nucléicos es una secuencia de ácidos nucléicos la cual se hibridiza bajo condiciones astringentes para la secuencia de ácidos nucléicos o parte de la misma, de acuerdo con el NO DE I D DE SEC. 2 o de acuerdo con los accesos del banco de datos gi 7019488 o NM_01335, preferentemente NM_01 335.1 . En una modalidad preferida del uso de acuerdo con cualquier aspecto de la presente invención, la enfermedad se caracteriza de tal manera que las células que están involucradas en dicha enfermedad , carecen de actividad PTEN , muestran un creciente comportamiento agresivo, o son células de un tumor de etapa tardía.
En una modalidad más preferida del uso de acuerdo con el tercer aspecto de la presente invención la enfermedad es un tumor de etapa tardía. El problema subyacente a la presente invención se soluciona en un cuarto aspecto por un método para la filtración de un agente para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad y/o para la elaboración de un agente de diagnóstico para el diagnóstico de una enfermedad, por la cual la enfermedad se selecciona a partir del grupo que comprende cánceres, cánceres metastáticos y cualquier condición patológica que implique la trayectoria de Pl 3-quinasa que comprende los pasos: a) proporcionar un compuesto candidato, b) proporcionar un sistema de expresión para la proteína de quinasa N beta y/o un sistema que detecta la actividad de proteína de quinasa N beta; c) contactar el compuesto candidato con el sistema de expresión para la proteína de quinasa N beta y/o el sistema que detecta la actividad de la proteína de quinasa N beta; d) determinar si la expresión y/o la actividad de la proteína de quinasa N beta se cambia bajo la influencia del compuesto candidato. En una modalidad del método de acuerdo con el cuarto aspecto de la presente invención, el compuesto candidato se encuentra contenido en una biblioteca de compuestos. En otra modalidad del método de acuerdo con el cuarto aspecto de la presente invención, el compuesto candidato se selecciona a partir del grupo de clases de compuestos que comprende péptidos, proteínas, anticuerpos, anticalinas, ácidos nucléicos funcionales, compuestos naturales y moléculas pequeñas. En una modalidad preferida del método de acuerdo con el cuarto aspecto de la presente invención, los ácidos nucléicos funcionales se seleccionan a partir del grupo que comprende aptámeros, aptazimas, ribozimas, spiegelmero, oliglonucleótidos de antidetección y siARN. En una modalidad preferida adicional del método de acuerdo con el cuarto aspecto de la presente invención la proteína de quinasa N beta o la codificación de ácido nucléico para la proteína de quinasa N beta se describen en conexión con cualquier otro aspecto de la presente invención. El problema subyacente a la presente invención se soluciona en un quinto aspecto por el uso de la proteína de quinasa N beta o una parte o derivado de la misma y/o ácido nucléico o una parte o derivado del mismo para codificar la proteína de quinasa N beta como molécula objetivo para el desarrollo y/o elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad y/o para la elaboración de un agente de diagnóstico para el diagnóstico de una enfermedad, donde la enfermedad se selecciona a partir del grupo que comprende cánceres, cánceres metastáticos y cualquier condición patológica que implique la trayectoria de Pl 3-quinasa. En una modalidad del uso de acuerdo con el quinto aspecto de la presente invención, el medicamento y/o el agente de diagnóstico comprende un agente, el cual se selecciona a partir del grupo que comprende anticuerpos, péptidos, anticalinas, pequeñas moléculas, moléculas de antidetección, aptámeros, spiegelmeros y moléculas de iARN. En una modalidad preferida del uso de acuerdo con el quinto aspecto de la presente invención, el agente ¡nteractúa con la proteína de quinasa N beta o una parte o derivado de la misma. En una modalidad alterna del uso de acuerdo con el quinto aspecto de la presente invención, el agente interactúa con la codificación de ácido nucleico para la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, en particular con mARN, ácido nucléico genómico o cADN para la proteína quinasa N beta. El problema subyacente a la presente invención se soluciona en un sexto aspecto por el uso de un polipéptido el cual interactúa con la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, para el desarrollo o elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad y/o para la elaboración de un agente de diagnóstico para el diagnóstico de una enfermedad, por la cual la enfermedad se selecciona a partir del grupo que comprende cánceres, cánceres metastáticos y cualquier condición patológica que implique la trayectoria de Pl 3-quinasa. En una modalidad del uso de acuerdo con el sexto aspecto de la presente invención, el polipéptido se selecciona a partir del grupo, el cual comprende anticuerpos contra la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma y polipéptidos que unen la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma. El problema subyacente a la presente invención se soluciona en un séptimo aspecto por el uso de un ácido nucléico el cual interactúa con la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, para el desarrollo o elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad y/o para la elaboración, de un agente de diagnóstico para el diagnóstico de una enfermedad, por la cual la enfermedad se selecciona a partir del grupo que comprende cánceres, cánceres metastáticos y cualquier condición patológica que implique la trayectoria de Pl 3-quinasa. En una modalidad del uso de acuerdo con el séptimo aspecto de la presente invención, el ácido nucléico se selecciona a partir del grupo que comprende aptámeros y spiegelmeros. El problema subyacente a la presente invención se soluciona en un octavo aspecto por el uso de un ácido nucléico el cual interactúa con una codificación de ácido nucléico para la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, para el desarrollo o elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad y/o para la elaboración de un agente de diagnóstico para el diagnóstico de una enfermedad, donde la enfermedad se selecciona a partir del grupo que comprende cánceres, cánceres metastáticos y cualquier condición patológica que implique la trayectoria de Pl 3-quinasa. En una modalidad del uso de acuerdo con el octavo aspecto de la presente invención, el ácido nucléico de interacción es un oligonucleótido de antidetección, una ribozima y/o siARN . En una modalidad adicional del uso de acuerdo con el octavo aspecto de la presente invención, la codificación de ácido nucléico para la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma es el cADN, mARN o hnARN. En una modalidad del uso de acuerdo con el octavo aspecto de la presente invención, la proteína quinasa N beta y/o la codificación de ácido nucléico para la proteína quinasa N beta es la descrita en conexión con cualquier aspecto de la presente invención. El problema subyacente a la presente invención se soluciona en un noveno aspecto por el uso de una composición farmacéutica que comprende al menos un agente seleccionado a partir del grupo que comprende a la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, pequeñas moléculas que interactúan con la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma o con una codificación de ácido nucléico para la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, anticuerpos específicos para la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, polipéptidos que interactúan con la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, una codificación de ácido nucléico para la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, ácidos nucléicos que interactúan con la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma o ácidos nucléicos que interactúan con una codificación de ácido nucléico para la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, y al menos un portador farmacéuticamente aceptable, preferentemente para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad por la cual la enfermedad se selecciona a partir del grupo que comprende cánceres, cánceres metastáticos y cualquier condición patológica que implique la trayectoria de Pl 3-quinasa. El problema subyacente a la presente invención se soluciona en un décimo aspecto por el juego para la caracterización de una enfermedad o una condición la cual se selecciona a partir del grupo que 'comprende cánceres, cánceres metastáticos y cualquier condición patológica que implique la trayectoria de Pl 3-quinasa, comprendiendo al menos un agente el cual se selecciona a partir del grupo que comprende la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, anticuerpos específicos para la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, polipéptidos que interactúan con la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, polipéptidos que interactúan con una codificación de ácido nucleico para la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, ácidos nucléicos que interactúan con la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, ácidos nucléicos que interactúan con una codificación de ácido nucleico para la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, y opcionalmente al menos otro compuesto. Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que la proteína quinasa N beta, también referida en la presente como PKN beta, es un objetivo valioso en conexión con cáncer y tumores. Más particularmente, los presentes inventores han descubierto que la proteína quinasa N beta es un objetivo corriente debajo de la trayectoria de PI-3 quinasa/PTEN . Aún más sorprendentemente los presentes inventores han descubierto que la proteína quinasa N beta se encuentra unida a la tumorigénesis y metástasis. Particularmente, el último efecto parece estar fuertemente relacionado con la pérdida de la función supresora, más particularmente la función supresora del tumor PTEN. Como se mostrará en los ejemplos, la proteína quinasa N beta se sobre-regulará bajo condiciones donde la PTEN que es una inhibidora de la trayectoria de PI-3 quinasa/PTEN, no se encuentra activa. Debido a la sobre-regulación de la proteína quinasa N beta, las células donde ocurre tal sobre-regulación, mostrarán un incremento en el comportamiento metastático y el comportamiento de migración. Esto se refiere a que un inhibidor de la proteína quinasa N beta es un medio adecuado para controlar el comportamiento metastático y de migración de células y que es un medio adecuado para el tratamiento de tumores y cánceres, más particularmente aquellos tumores y cánceres los cuales son metastáticos y las células que muestran un com portamiento metastático y/o de migración las cuales son referidas generalmente en la presente como "la enfermedad como se describe en la presente" o como "condición de enfermedad como se describe en la presente". La enfermedad como se describe en la presente así como también la condición de enfermedad como se describe en la presente comprenden también tumorigénesis y metástasis. Esto aplica particularmente a aquellas enfermedades como se describe en la presente y aquellas condiciones de enfermedad como se describe en la presente, donde las células involucradas en tales enfermedades o condiciones de enfermedad son negativas a PTEN lo cual significa que la PTEN supresora de tumores no se encuentra activa o tiene un nivel reducido de actividad. Las enfermedades comprenden también aquellas enfermedades en las cuales generalmente se encuentra involucrada la trayectoria de PI-3 quinasa. Además, los tumores metastáticos en particular, la diabetes pertenece a esta clase de enfermedades y condiciones de enfermedad, respectivamente. Por lo tanto, las células, particularmente aquellas que se encuentran involucradas en la enfermedad o condición de enfermedad como se describe en la presente y las cuales son negativas a PTEN, son susceptibles al tratamiento por una droga, el modo de acción es tal que se reduce o elimina la actividad de la proteína quinasa N beta en las células respectivas involucradas. De acuerdo con lo anterior, los pacientes cuyos tumores se caracterizan por una trayectoria de PI-3 quinasa preferentemente hiperactivada, que incluye pero que no se limita a, sea por amplificación o por mutación de componentes de codificación genética de la trayectoria de PI-3 quinasa (p1 1 0, Akt) o son negativos a PTEN o que tienen células las cuales son negativas a PTEN , particularmente si estas células se encuentran involucradas en la enfermedad como se describe en la presente o en la condición de enfermedad como se describe en la presente, pueden tratarse ventajosamente utilizando dichas drogas. Tal reducción en la actividad puede resultar de una reducción en el nivel de transcripción o en el nivel de la traducción, es decir, la actividad enzimática de la proteína quinasa N beta. Sin desear limitarse a teoría alguna, el último aspecto, es decir, modificar la actividad de la proteína quinasa N beta también es resultado de una comprensión de los inventores con relación a las características de PKNbeta, a saber que la actividad enzimática de PKNbeta también puede sobre- y sub-regularse, más preferentemente sub-regularse. Un grupo adicional de pacientes que pueden tratarse ventajosamente utilizando dicha drogas son aquellos que padecen de cánceres los cuales tienen una alta incidencia para la pérdida de la función de PTEN, especialmente en los tumores de etapa tardía (Cantley, L. C. y Neel, B. G . (1999)). N uevas comprensiones en la supresión de tumores: PTEN suprime la formación de tumores al restringir la trayectoria de fosfoinositida 3-quinasa/AKT. Proc Nati Acad Sci U S A 96, 4240-4245; Ali, I . U. (2000). Portero para endometrio: el gen supresor de tumores de PTEN. J Nati Cáncer Inst 92, 861 -863). La pérdida de PTEN se correlaciona con un creciente comportamiento agresivo e invasivo de las respectivas células tumorosas. Debido a esto, en las modalidades preferidas de la presente invención aquellos agentes diagnósticos que también pueden utilizarse como herramientas o medios analíticos en conexión con los diversos aspectos de la presente invención, y agentes terapéuticos, respectivamente, dirigidos a la proteína quinasa N beta o codificación de ácidos nucléicos pueden, por ende, utilizarse para cualquier tumor siempre y cuando se cumpla el prerrequisito anteriormente mencionado, a saber, que la PTEN se correlaciona con un creciente comportamiento agresivo e invasivo. Esta clase de droga puede diseñarse, filtrarse o elaborarse sobre la base de la descripción determinada en la presente, a saber, que la proteína quinasa N beta es un objetivo de droga corriente abajo y que la proteína quinasa N beta es un objetivo para la tumorigénesis y metástasis y enfermedades relacionadas con la misma o que surgen de ella. Debido a la implicación de la proteína quinasa N beta en los mecanismos como se describió anteriormente, puede utilizarse también como un marcador para diagnosticar el estado de una célula o paciente que tiene en su cuerpo tal clase de células si experimenta metástasis y tumorigénesis, respectivamente. Como ejemplo de que esta clase de planteamiento funciona y es aplicable para ese propósito es, por ejemplo, ICA -1. ICAM-1 se utiliza en el pronóstico de cánceres gástricos para experimentar la metástasis ( aruo Y, Gochi A, aihara A, Shimamura H, Yamada T, Tanaka N, OritaK., Int. J Cáncer. 2002 Ago 1; 100(4):486-490) donde se encontraron niveles elevados de s-ICAM-1 en pacientes con metástasis de hígado. En otro ejemplo, se utiliza osteopontína como un marcador de pronóstico para el cáncer de pecho (Rudland PS, Platt-Higgins A, El-Tanami M, De Silva Rudland S, Barraclough R, Winstanley JH, Howítt R, West CR. Cáncer Res. 2002 Jun 15; 62(12):3417-3427). En cuanto a la presencia o el nivel de presencia (proteína o mARN) o el nivel de actividad de la proteína quinasa N beta puede utilizarse como marcador y puede acompañarse más o menos interactuar específicamente con proteína quinasa N beta serán, por ende, un agente de diagnóstico apropiado. Los métodos y principios de diseño para drogas y agentes de diagnóstico los cuales en cualquier caso específicamente y/o selectivamente interactúan con la proteína quinasa N beta serán descritos a continuación. A la luz de estos descubrimientos, la proteína quinasa N beta comprueba ser un objetivo de droga corriente abajo adecuado el cual permite la modulación selectiva de solamente algunos aspectos los cuales se encuentran relacionados típicamente con la trayectoria de PI-3 quinasa, a saber metástasis y migración, y un planteamiento de diagnóstico selectivo y específico, es decir, detección, de procesos relacionados típicamente con la trayectoria de PI-3 quinasa, más particularmente metástasis y migración. La trayectoria de PI-3 quinasa se caracteriza por una actividad de PI-3 quinasa después de la inducción del factor de desarrollo y una trayectoria de señalización paralela. La estimulación del factor de desarrollo de las células conduce a la activación de sus receptores congéneres en la membrana celular lo cual a su vez se asocia con y activa las moléculas de señalización intracelular tales como la PI 3-quinasa. La activación de Pl 3-quinasa (que consiste en un p85 regulador y una subunidad p1 1 0 catalítica) da como resultado la activación de Akt por fosforilación, apoyando así respuestas celulares tales como proliferación, sobrevivencia o migración adicional corriente abajo. PTEN es consecuentemente una supresora de tumores que se encuentra implicada en la trayectoria de fosfatidilinositol (Pl) 3-quinasa y la cual se ha estudiado extensamente en el pasado por su papel para regular el desarrollo y transformación celulares (para revistas, ver, Stein, R. C. y Waterfield, . D. (2000). Inhibición de Pl 3-quinasa: ¿un objetivo para desarrollo de droga? Mol Med Today 6, 347-357; Vázquez, F. y Sellers, W. R. (2000) . La proteína supresora de tumores de PTEN: un antagonista de señalización de fosfoinositida 3-quinasa. Biochim Biophys Acta 1470, M21 -35; Roymans, D. y Slegers, H . (2001 ) . Las fosfatidilinositol 3-quinasas en la progresión de tumores. Eur J Biochem 268, 487-498). La PTEN supresora de tumores funciona como un regulador negativo de Pl 3-quinasa al invertir la reacción catalizada de Pl 3-quinasa y asegura así que la activación de la trayectoria ocurre de manera transitoria y controlada. La hiperactivación crónica de señalización de Pl 3-quinasa es ocasionada por la inactivación funcional de PTEN . La actividad de Pl 3-quinasa puede bloquearse por la adición del inhibidor LY294002 de molécula pequeña. La actividad y respuestas corriente debajo de la EK de quinasa de señalización la cual actúa en una trayectoria paralela, puede por ejemplo, inhibirse por el inhibidor PD98059 de molécula pequeña. Una activación crónica de la trayectoria de Pl 3-quinasa mediante la pérdida de función de PTEN es un contribuyente principal a la tumorigénesis y metástasis que índica que este supresor de tumores representa un punto de verificación importante para una proliferación celular controlada. Las células de desactivación de PTEN muestran características similares como las células en las cuales se ha inducido químicamente la trayectoria de Pl 3-quinasa mediante formas activadas de Pl 3-quinasa (Di Cristofano, A., Pesce, B ., Cordon-Cardo, C , y Pandolfi, P. P. ( 1 998). La PTEN es esencial para el desarrollo embriónico y supresión de tumores. Nat Genet 1 9, 348-355. Klippel, A. , Escobedo, M. A. , Wachowicz, , M. S. , Apell, G. , Brown, T. W. , Giedlin, . A. , Kavanaugh, W. . y Williams, L. T. (1998). La activación de fosfatidilinositol 3-quinasa es suficiente para la entrada de ciclo celular y mejora los cambios celulares característicos de la transformación oncogénica. Mol Cell Biol 18, 5699-571 1 . Kobayashi, . , Nagata, S. , Iwasaki, T. , Yanagihara, K. , Sayito, L. , arouji, Y. , I hara, S. y Fukui, Y. (1 999). Desdiferenciación de adenocarcinomas por activación de fosfatidilinositol 3-quinasa. Proc Nati Acad Sci USA 96, 4874-4879). La PTEN se encuentra involucrada en varias trayectorias las cuales son referidas también como trayectorias relacionadas con PTEN tales como la trayectoria PI3K/PTEN, la trayectoria Akt, el circuito autocrine relacionado con EGF y la trayectoria mTOR. Una trayectoria de Pl 3-quinasa es actualmente cualquier trayectoria la cual implica Pl 3-quinasa, sea directamente o indirectamente. La Pl 3-quinasa puede actuar como un inhibidor o como un activador en tal trayectoria, o puede regularse como tal por otros elementos de la trayectoria. Existe una muestra de las enfermedades y condiciones que describen la técnica anterior que involucran la trayectoria de PI 3-quinasa. Cualquiera de estas condiciones y enfermedades puede abordarse consecuentemente por los métodos inventivos y las drogas y agentes de diagnóstico, el diseño, la filtración o elaboración de las mismas se enseña en la presente. Por razones de ilustración mas no de limitación, se refiere a lo siguiente: cáncer endometrial, carcinomas coloréeteles, gliomas, cánceres endometriales, adenocarcinomas, hiperplasias endometriales, síndrome de Cowden, carcinoma colorectal de no poliposis hereditario, síndrome de Li-Fraumene, cáncer de pecho-ovarios, cáncer de próstata (Ali, I . U . , Journal of the Nacional Cáncer Institute, Vol. 92, no. 1 1 , 7 de Junio de 2000, página 861 -863) , síndrome de Bannayan-Zonana, LDD (síndrome de Lhermitte-Duklos) (Macleod, K. , supra) enfermedades de harmatoma-macrocefalia que incluyen enfermedad de Cow (CD) y síndrome de Bannayan-Ruvalcaba-Rily (BRR) , lesiones mucocutáneas (por ejemplo, triquilemonas), macrocefalia, retardo mental, harmatomas gastrointestinales, lipomas, adenomas tiroides, enfermedad fibrocística del pecho, gangliocitoma displástica cerebelar, y malignidades de pecho y tiroides (Vázquez, F. , Sellers, W. R. , supra) En vista de esto, la proteína quinasa N beta es un valioso objetivo de droga corriente debajo de la trayectoria de pi 3-quinasa N beta la cual puede abordarse por drogas las cuales tienen menos efectos colaterales que otras drogas dirigidas a los objetivos corriente arriba de la proteína quinasa N beta. A tal grado la presente invención proporciona un objetivo de droga el cual es adecuado para el diseño, filtración , desarrollo y elaboración de compuestos farmacéuticamente activos que sean más selectivos que aquellos conocidos en la materia, tal como, por ejemplo, LY 29402. Al tener control sobre esta fracción o moléculas ejecutoras, es decir, la proteína quinasa N beta y cualquier molécula corriente abajo adicional implicada en la trayectoria, solamente un número muy limitado de ramas paralelas de la misma u objetivos corriente arriba adicionales en la cascada de señalización son propensos a ocasionar efectos indeseables. Por lo tanto, las demás actividades de trayectoria de Pl-3 quinasa/PTEN se refieren al ciclo celular, reparación de ADN, apoptosis, transporte de glucosa, no influirá la traducción. También, no se induce la señalización de insulina lo cual significa que las respuestas diabéticas u otros efectos colaterales observados en conexión con el uso de LY294002 se evitan actualmente. LY294002 (2-(4-morfolinil)8-fenilcromona) es uno de varios inhibidores de molécula pequeña de derivados de cromona desarrollado por Lilly Research Laboratorios (Indianápolis) como inhibidor para PI-3K (Vlahos et al. 1 994, JBC 269, 5241 -5248). Selecciona como objetivo su subunidad catalítica de la molécula de Pl-3K, p1 10 y funciona compitiendo con la unión de ADP en el centro catalítico. Sin embargo, LY294002 no puede distinguir entre diferentes isoformas de p 1 1 0 (alfa, beta, delta) las cuales sugieren tener diferentes funciones celulares. La proteína quinasa N beta se encuentra también corriente debajo de mTOR la cual se aborda por la rapamicina. mTOR (Objetivo De Rapamicina mamífera), también conocida como Raft o FRAP, actúa corriente debajo de Pl 3-quinasa para regular procesos tales como el acceso dependiente de la quinasa pp70 S6 en el ciclo celular. mTOR actúa como un detector para el factor de desarrollo y la disponibilidad de nutrientes a fin de controlar la traducción mediante la activación de pp70 S6 quinasa y el factor de iniciación 4E. La función mTOR se inhibe por la rapamicina de macrólidos bacteriana la cual bloquea el desarrollo de células T y algunas células tumorosas (Kuruvilla y Schreiber 1999, Chemistry & Biology 6, R 129-R136). El hecho de que la rapamicina y sus derivados sean drogas adecuadas actualmente utilizadas en la clínica comprueba que un objetivo de droga es lo más útil y tiene los menores efectos secundarios, lo más específico es para un mecanismo molecular particular como, por ejemplo, se demuestra por Yu et al. (Yu, K. et al (2001 ) Endocrine-RelatCanc 8, 249) . La proteína quinasa N beta es un miembro de la familia de la proteína quinasa C las cuales todas se dice son quinasas de proteína-serina/treonina. Típicamente, esta clase de quinasa de proteína com prende una subunidad reguladora y una catalítica y utiliza iones de calcio y fosfolípidos como co-factores. Los gliceroles de diacilo actúan como un activador de esta clase de la familia de la proteína quinasa. Los miembros de la familia de la proteína quinasa C se encuentran involucrados en varias trayectorias de señalización unidas a hormonas o neurotransmisores. Estas proteínas quinasas regulan la actividad de sus proteínas objetivo por fosforilación. Se sabe en la materia que la activación continuada no fisiológica de la proteína quinasa C da como resultado el fenotipo celular transformado que puede conducir a la generación del cáncer. La secuencia completa de proteína quinasa N beta como mARN se encuentra disponible en bancos de datos, por ejemplo, bajo los números de acceso gi 7019488 o N _01 3355. Utilizando el código genético, la secuencia de aminoácidos particular puede deducirse a partir de este mARN . También, la secuencia de aminoácidos de la proteína quinasa N beta se encuentra disponible en los bancos de datos bajo el número de acceso gi 7019489 o NP_037487.1 . Se encuentra dentro de la presente invención que los derivados o versiones truncadas de los mismos pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención siempre y cuando puedan realizarse los efectos secundarios. El grado de derivación y truncamiento pueden determinase consecuentemente por aquellos expertos en la materia por análisis rutinario . Cuando vuelve a secuencias de ácidos nucléicos aquellas secuencias de ácidos nucléicos también se encuentran comprendidas por el término de las secuencias de ácidos nucléicos que codifican la proteína quinasa N beta los cuales hibridizan al ácido nucléico especificado por los números de acceso anteriormente mencionados o cualquier secuencia de aminoácidos que puede derivarse a partir de las secuencias de aminoácidos anteriormente mencionados. Tal hibridización es conocida por aquellos expertos en la materia. Las particularidades de tal hibridización pueden tomarse de Sambrook, J . Fritsch, E. F. Y Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. , Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory. En una modalidad preferida, la hibridización es una hibridización bajo condiciones astringentes. Además, una codificación de ácido nucléico para una proteína quinasa N beta es una secuencia de ácidos nucléicos la cual es homologa a cualquiera de las secuencias de ácidos nucléicos anteriormente mencionadas, por las cuales el grado de homología preferentemente es 75, 80, 85, 90 o 95%. Las referencias adicionales relacionadas con la proteína quinasa N beta son, entre otras, Shibata H . et al. J . Biochem. (Tokio) 2001 Jul; 1 30 (1 ) :23-31 ; Dong, LQ, Proc Nati Akad Scie USA, 2000, Mayo 09; 97 (10): 5089-5094; y Oishi, K., Biochem Biophys Res Commun. 1 999, Ago. 1 1 ; 261 (3): 808-814. Los homólogos a la proteína quinasa N beta pueden encontrarse, entre otros, en M. musculus, R. norvegicus, A. thaliana, C. elegans, D. melanogaster y S. cerevisiae. El porcentaje de identidad y el largo de la región alineada es de 67% y 279 aminoácidos, 51 % y 866 aminoácidos, 38% y 305 aminoácidos, 36% y 861 aminoácidos, 63% y 296 aminoácidos y 44% y 362 aminoácidos, respectivamente, para las diversas especies mencionadas con anterioridad. Aquellos expertos en la materia reconocerán que cualquiera de estos u otros homólogos serán adecuados en principio para la práctica de la presente invención a menos que la droga o el agente de diagnóstico generados utilizando tal homólogo puedan interactuar aún con la proteína quinasa N beta humana o cualquier proteína quinasa N beta pretendida. La secuencia de aminoácidos humanos puede tomarse también a partir de ProtEST, número de acceso pir: JC7083 donde la proteína quinasa N beta respectiva es referida como la proteína quinasa JC7083. El gen para la proteína quinasa N beta humana se encuentra ubicado en el cromosoma humano número 9. Las fuentes de cADN para la proteína quinasa N beta son en general un cierto número de cánceres y diversos tejidos fetales o embriónicos, más particularmente, entre otros, estómago, adenocarcinoma, cerebro, pecho, linfoma de Burkitt, linfoma, cuello del útero, condrosarcoma, colon, ojos fetales, cristalino fetal, segmento anterior de ojo fetal, nervio óptico fetal , retina fetal, mácula lútea de retina fetal, mácula lútea de retina fetal, coroides fetal, macular fetal, fibroteoma, línea germinal, cuello, corazón, riñon, carcinoma de células grandes, leiomiosarcoma metastático condrosarcoma, ovarios, paratiroides, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de células pequeñas, carcinoma de células escamosas, testículos, y útero. De esta lista es obvio que la droga la cual es referida también en la presente como medicamento, y el agente de diagnóstico, incluyendo un agente de etapas, es decir, un agente el cual pueden utilizarse para diferenciar el estado de un paciente con respecto a la etapa de una enfermedad que puede estar padeciendo, así como también para monitorear la efectividad de un tratamiento aplicado a un paciente, respectivamente, a diseñarse, filtrarse o elaborarse de acuerdo con la enseñanza técnica dada en la presente puede además de cualquier otra enfermedad como se describe en la presente y las condiciones de enfermedad como se describen en la presente utilizarse también para el tratamiento, prevención, diagnóstico, pronóstico y monitoreo de estas enfermedades o de cualquier enfermedad que involucre las células específicas, tejidos u órganos. Estas enfermedades y condiciones de enfermedad deben estar' comprendidas todas por el término "como se describe en la presente". En vista de los sorprendentes descubrimientos en la presente, la proteína quinasa N beta como tal puede utilizarse como un medicamento para la prevención y/o tratamiento de las diversas enfermedades y condiciones de enfermedad como se describe en la presente, y para la elaboración de un medicamento para tal propósito y para la elaboración de un agente de diagnóstico. En caso de que la proteína quinasa N beta o un fragmento o derivado de la misma como se define con anterioridad sea utilizada como un medicamento mismo, se utiliza preferentemente como competidor a la proteína quinasa N beta de generación natural y evitando consecuentemente la función biológica normal de la misma. Particularmente se prefiere que la proteína quinasa N beta utilizada para ese propósito sea catalíticamente defectuosa. Esta clase de proteína quinasa N beta puede aplicarse al organismo y célula, respectivamente, o puede introducirse al organismo y células respectivas por medio de terapia genética. Aparte de ser una droga potencial por si misma, la proteína quinasa N beta puede utilizarse como el compuesto contra el cual se dirigen los compuestos químicos que pueden utilizarse como drogas o candidatos de droga o como agentes de diagnóstico. Estos compuestos químicos pertenecen a diferentes clases de compuestos tales como anticuerpos, péptidos, anticalinas, aptámeros, spiegelmeros, ribozimas, oligonucleótidos de antidetección y siARN así como también moléculas pequeñas. Los compuestos se diseñan, seleccionan, filtran, generan y/o elaboran sea utilizando la proteína quinasa N beta misma como un entidad física o química, o información relacionada con la proteína quinasa N beta. En el proceso de diseño, selección, filtración, generación y/o elaboración de dichas clases de compuestos de proteína quinasa N beta también serán referidos como el objetivo el cual es utilizado en el proceso en lugar de la aplicación final del compuesto respectivo para un paciente en necesidad del mismo. En los procesos los cuales proporcionan las diversas clases de compuestos, puede utilizarse sea la proteína quinasa N beta, también referida en la presente como proteína quinasa N beta o codificación de ácido nucleico para la proteína quinasa N beta. El término proteína quinasa N beta como se utiliza en la presente comprende cualquier fragmento o derivado de la proteína quinasa N beta la cual permite el diseño, selección, filtración, generación y/o elaboración de dichas clases de compuestos de la(s) clase(s) respectiva(s) de compuestos los cuales a su vez tras su aplicación como medicamento o como un agente de diagnóstico activo como tal. El término codificación de ácido nucléico para la proteína quinasa N beta como se utiliza en la presente comprenderá cualquier ácido nucléico el cual contenga un ácido nucléico que codifique la proteína quinasa N beta como se definió con anterioridad, o una parte de la misma. Una parte de una codificación de ácido nucléico para la proteína quinasa N beta es estimada como tal siempre y cuando sea aún adecuada para el diseño, selección, filtración, generación y/o elaboración de dicha clases de compuestos lo cual a su vez después de su aplicación como medicamento o como un agente de diagnóstico activo como tal. La codificación de ácido nucléico para la proteína quinasa N beta puede ser ácido nucléico genómico, hnARN, mARN, cADN, o parte de cada uno de ellos. Como se bosquejó con anterioridad, dentro de la presente invención aparte de la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma o una secuencia de ácido nucléico, como se describe en la presente, también pueden utilizarse otros medios o compuestos con objeto de crear o suprimir los efectos que surgen de la proteína quinasa N beta o la proteína quinasa N beta de codificación de ácido nucléico. Tales medios pueden determinase o seleccionarse en un método de filtración. En tal método de filtración se proporciona un primer paso para proporcionar uno o varios de los llamados compuestos candidatos. Los compuestos candidatos como se utilizan en la presente son compuestos cuya aplicabilidad va a probarse en un sistema de prueba para tratar o aliviar las diversas enfermedades como se describe en la presente y condiciones de enfermedad como se describe en la presente o para utilizarse como un medio o agente de diagnóstico para esta clase de enfermedades y condiciones de enfermedad. Si un compuesto candidato muestra un efecto respectivo en un sistema de prueba dicho compuesto candidato es un medio o agente adecuado para el tratamiento de dichas enfermedades y condiciones de enfermedad y, en principio, también un agente de diagnóstico adecuado para dichas enfermedades y condiciones de enfermedad. En un segundo paso, el compuesto candidato se contacta con un sistema de expresión de proteína quinasa N beta o un producto genético de proteína quinasa N beta, preferentemente un producto de expresión genética respectivo, tal como un hnARN o mARN, o un sistema de actividad de proteína quinasa N beta o una proteína quinasa N beta. El sistema de actividad de proteína quinasa N beta también es referido en la presente como y/o también se encuentra preferentemente activo en el significado de un sistema que detecta la actividad de la proteína quinasa N beta. Un sistema de expresión de proteína quinasa N beta es básicamente un sistema de expresión el cual muestra o despliega la expresión de proteína quinasa N beta, por lo que el grado o nivel de expresión puede cambiarse básicamente. Preferentemente, un sistema de actividad de proteína quinasa N beta es esencialmente un sistema de expresión por el cual la actividad o condición de actividad es medida en lugar de la expresión de proteína quinasa N beta. Alternativamente, un sistema de actividad de quinasa de proteína es una proteína quinasa N beta cuya actividad puede medirse o un sistema que proporciona o que comprende proteína quinasa N beta. En cualquiera de estos sistemas se prueba si bajo la influencia de un compuesto candidato la actividad de proteína quinasa N beta o de la proteína quinasa N beta de codificación de ácido nucléico es diferente de la situación sin el compuesto candidato. Independientemente de que el sistema particular sea un sistema de expresión o un sistema de actividad, se encuentra dentro del alcance de la presente invención que un incremento o decremento de la actividad y expresión, respectivamente, pueda ocurrir y pueda medirse. Típicamente, el sistema de expresión y/o el sistema de actividad es una reacción in vitro, tal como un extracto celular o un fragmento del extracto celular tal como un extracto de núcleo. Un sistema de expresión de proteína quinasa N beta como se utiliza en la presente puede ser también una célula, preferentemente una célula de un tejido u órgano involucrado en las enfermedades como se describe en la presente y las condiciones de enfermedad como se describe en la presente. Si existe un incremento o decremento en el sistema de actividad o sistema de expresión puede determinarse en cada nivel de la expresión, por ejemplo al medir el incremento decremento de la cantidad de codificación de ácido nucléico para la proteína quinasa N beta, más particularmente mARN o el incremento o decremento de la proteína quinasa N beta expresada bajo la influencia del compuesto candidato. Las técnicas requeridas para la medición, más particularmente la medición cuantitativa de esta clase de cambios, tales como para el mARN o la proteína son conocidas por aquellos expertos en la materia. También son conocidos por aquellos expertos en la materia los métodos para determinar la cantidad de o contenido de proteína quinasa N beta, por ejemplo, por el uso de anticuerpos apropiados. Los anticuerpos pueden generarse como conocen aquellos expertos en la materia y se describe, por ejemplo, por Harlow, E., y Lañe, D. , "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1 988).
En caso de un sistema de expresión de proteína quinasa N beta puede determinarse un incremento o decremento de la actividad de proteína quinasa N beta, preferentemente en una prueba funcional. Contactar el compuesto candidato y el sistema de expresión y sistema de actividad, respectivamente, normalmente se realiza agregando una solución acuosa del compuesto candidato a un sistema de reacción respectivo el cual generalmente es referido en la presente como sistema de prueba. Además de las soluciones acuosas también pueden utilizarse suspensiones o soluciones del compuesto candidato en solventes orgánicos. La solución acuosa preferentemente es una solución reguladora. Preferentemente, en cada prueba que utiliza el sistema de expresión y el sistema de actividad, respectivamente, solamente se utiliza un solo compuesto candidato. Sin embargo, también se encuentra dentro de la presente invención que varias pruebas de esta clase se realizan en paralelo en un sistema de alto rendimiento. Un paso adicional en el método de acuerdo con la presente invención reside en determinar si bajo la influencia del compuesto candidato la expresión o actividad del sistema de expresión y el sistema de actividad, respectivamente, con relación a la proteína quinasa N beta o una codificación de ácido nucléico se cambia. Típicamente esto se realiza comparando la reacción del sistema tras la adición del compuesto candidato con relación a la que no tiene la adición del compuesto candidato. Preferentemente, el compuesto candidato es un miembro de una biblioteca de compuestos. Básicamente cualquier biblioteca de compuestos es adecuado para propósitos de esta invención independientemente de la clase de compuestos. Las bibliotecas adecuadas de compuestos, entre otras cosas, son bibliotecas compuestas de pequeñas moléculas, de péptidos, proteínas, anticuerpos y ácidos nuciéicos funcionales. Estos últimos compuestos pueden generarse como saben aquellos expertos en la materia y como se bosqueja en la presente. La elaboración de un anticuerpo específico para la proteína quinasa N beta o para la codificación de ácido nucléico para proteína quinasa N beta, es conocida por aquellos expertos en la materia y, por ejemplo, se describe en Harlow, E. , y Lañe, D. , "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988). Preferentemente, los anticuerpos monoclonales pueden utilizarse en conexión con la presente invención los cuales pueden elaborarse de acuerdo con el protocolo de Cesar y Milstein y desarrollos adicionales basados en los mismos. Los anticuerpos como se utilizan en la presente, incluyen , pero no se limitan a, anticuerpos completos, fragmentos de anticuerpos o derivados tales como fragmentos de Fab, fragmentos de Fe, y anticuerpos de cepa individual, siempre y cuando sean adecuados y capaces para unirse a la proteína quinasa N beta. Aparte de los anticuerpos monoclonales también pueden utilizarse y/o generarse anticuerpos monoclonales. La generación de anticuerpos monoclonales es conocida también por los expertos en la materia y, por ejemplo, se describe en Harlow, E. , y lañe, D. , "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988). Preferentemente, los anticuerpos utilizados para propósitos terapéuticos son anticuerpos humanizados o humanos como se definió con anterioridad. Los anticuerpos que pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención pueden tener uno o varios marcadores o etiquetas. Tales marcadores o etiquetas pueden ser útiles para detectar el anticuerpo sea en su aplicación de diagnóstico o su aplicación terapéutica. Preferentemente, los marcadores y etiquetas se seleccionan a partir del grupo que comprende avidina, estreptavidina, biotina, oro y fluoresceína y se utiliza, por ejemplo, en los métodos de ELISA. Estos marcadores y otros adicionales así como también los métodos, por ejemplo, se describen en Harlow, E., y Lañe, D. , "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988). También se encuentra dentro de la presente invención que la etiqueta o marcador exhibe una función adicional aparte de la detección, tal como la interacción con otras moléculas. Tal interacción puede ser, por ejemplo, interacción específica con otros compuestos. Estos otros compuestos pueden ser sea aquellos inherentes al sistema donde el anticuerpo se utiliza tal como el cuerpo humano o de animal o la muestra que se analiza utilizando el anticuerpo respectivo. Los marcadores apropiados, por ejemplo, pueden ser biotina o fluoresceína con los S OC I S de interacción específica de la misma tal como avidina y estreptavidina y lo similar, estando presente en el compuesto o estructura respectiva par interactuar con el anticuerpo así marcado o etiquetado. Una clase adicional de medicamentos así como también los agentes de diagnóstico que pueden generarse utilizando la proteína de la proteína quinasa N beta o la codificación de ácido nucléico para la proteína quinasa beta, son los péptidos que se unen a la misma. Tales péptidos pueden generarse utilizando métodos de acuerdo con el estado en la materia tal como despliegue de fagos. Básicamente, se genera una biblioteca de péptidos, tal como en forma de fagos, y esta clase de bibliotecas se contacta con la molécula objetivo, en el presente caso, por ejemplo,- la proteína quinasa N beta. Aquellos péptidos que se unen a la molécula de objetivo se eliminan subsecuentemente, preferentemente como un complejo con la molécula de objetivo, de la reacción respectiva. El experto en la materia sabe que las características de unión, al menos hasta un cierto grado, dependen de la configuración experimental realizada particularmente tal como la concentración de la sal y lo similar. Después de separar aquellos péptidos que se unen a la molécula objetivo con una mayor afinidad o con una mayor fuerza, a partir de los miembros de no unión de la biblioteca, y opcionalmente también después de la eliminación de la molécula objetivo del complejo de molécula y péptido de objetivo, puede(n) caracterizarse subsecuentemente el(los) péptido(s) respectivo(s). Antes de la caracterización se lleva a cabo opcionalmente un paso de amplificación tal como, por ejemplo, propagar los fagos de codificación de péptidos. La caracterización comprende preferentemente la secuencia de los péptidos de unión de objetivo.
Básicamente, los péptidos no se limitan en sus largos, sin embargo, los péptidos que preferentemente tienen un largo desde aproximadamente 8 hasta 20 aminoácidos se obtienen preferentemente en los métodos respectivos. El tamaño de las bibliotecas puede ser aproximadamente 102 a 1 08, preferentemente 1 08 a 1015 diferentes péptidos, sin embargo, no se limita a los mismos. Una forma particular de polipéptidos de unión de objetivo son las llamadas "anticalinas" las cuales, entre otras, se describen en la solicitud de patente Alemana DE 197 42 706. De acuerdo con la presente invención la proteína quinasa N beta así como también la codificación de ácido nucléico para la proteína quinasa N beta puede utilizarse como el objetivo para la elaboración o desarrollo de un medicamento para el tratamiento de las enfermedades descritas en la presente y de las condiciones de enfermedad descritas en la presente, así como también para la elaboración y/o desarrollo de medios para el diagnóstico de dichas enfermedades y dichas condiciones, en un proceso de filtración, por el que en el proceso de filtración se utilizan moléculas pequeñas o bibliotecas de moléculas pequeñas. Esta filtración comprende el paso para contactar la molécula de objetivo con una sola molécula pequeña o una variedad de moléculas pequeñas al mismo tiempo o subsecuentemente, preferentemente aquellas derivadas de la biblioteca como se especificó con anterioridad, e identificar aquellas moléculas pequeñas o miembros de la biblioteca que se unen a las moléculas de objetivo las cuales, si se examinan en conexión con otras moléculas pequeñas puede separarse de las moléculas pequeñas de no unión o de no interacción. Se reconocerá que la unión y la no unión pueden influenciarse fuertemente por la configuración experimental particular. Al modificar la severidad de los parámetros de reacción es posible variar el grado de unión y no unión que permite una sintonización fina de este proceso de filtración. Preferentemente, después de la identificación de una o varias moléculas pequeñas que interactúan específicamente con la molécula de objetivo, esta molécula pequeña puede caracterizarse adicionalmente. Esta caracterización adicional puede, por ejemplo, residir en la identificación de la molécula pequeña y la determinación de su estructura molecular y características físicas, químicas, biológicas y/o médicas adicionales. Preferentemente, los compuestos naturales tienen un peso molecular de aproximadamente 10 a 1 000 Da. También, preferentemente, las moléculas pequeñas son aquellas las cuales cumplen con las reglas de Lepinsky de cinco conocidas por aquellos expertos en la materia. Alternativamente, las moléculas pequeñas pueden definirse también de manera tal que son moléculas pequeñas sintéticas, que surgen preferentemente de la química combinacional, en contraste con productos naturales que preferentemente son no sintéticos. Sin embargo, debe observarse que estas definiciones solamente son subsidiarias para la comprensión general de los términos respectivos en la materia. También se encuentra dentro de la presente invención para utilizar la proteína quinasa N beta y/o una codificación de ácido nucléico para la proteína quinasa N beta como una molécula de objetivo para la elaboración o selección de aptámeros y spiegelmeros los cuales después pueden utilizarse directamente o indirectamente sea como medicamento o como agentes de diagnóstico. Los aptámeros son ácidos nucléicos D los cuales son de cepa individual o de cepa doble y los cuales interactúan específicamente con una molécula de objetivo. La elaboración o selección de aptámeros, por ejemplo, se describe en la patente Europea EP 0 533 838. Básicamente se realizan los siguientes pasos. Primeramente, se proporciona una mezcla de ácidos nucléicos, es decir, los aptámeros potenciales por los que cada ácido nucleico comprende típicamente un segmento de varios nucleótidos aleatorizados subsecuentes, preferentemente al menos ocho. Esta mezcla se contacta subsecuentemente con la molécula de objetivo por la cual el(los) ácido(s) nucléico(s) se une(n) a la molécula de objetivo, tal como se basa en una afinidad incrementada hacia el objetivo o con una mayor fuerza a la misma, en comparación con la mezcla candidata. El(los) ácido(s) nucléico(s) de unión se separa(n) subsecuentemente del resto de la mezcla. Opcionalmente, el(los) ácido(s) nucléico(s) así obtenido(s) se amplifican utilizando, por ejemplo, reacción de cadena de polimerasa. Estos pasos pueden repetirse varias veces brindando al final una mezcla que tiene una relación creciente de ácidos nucléicos que se unen específicamente al objetivo del cual se selecciona después opcionalmente el ácido nucléico de unión final. Este(os) ácido(s) nucléico(s) de unión específica son referidos como aptámeros. Es obvio que en cualquier etapa del método para la generación o identificación de las muestras de aptámeros de la mezcla de ácidos nucléicos individuales pueden tomarse para determinar la secuencia de las mismas que utilizan técnicas convencionales. Se encuentra dentro de la presente invención que los aptámeros pueden estabilizarse, tal como introduciendo grupos químicos definidos que son conocidos por aquellos expertos en la materia de generar aptámeros. Tal modificación puede por ejemplo residir en la introducción de un grupo amino en la posición 2' del residuo de azúcar de los nucleótidos. Los aptámeros se utilizan actualmente, como agentes terapéuticos. Sin embargo, también se encuentran dentro de la presente invención que los aptámeros así seleccionados o generados pueden utilizarse para la validación de objetivos y/o como una substancia principal para el desarrollo de medicamentos, preferentemente de medicamentos basados en moléculas pequeñas. Esto se realiza actualmente por una prueba de competencia por la que la interacción específica entre la molécula de objetivo y el aptámero se inhibe por una droga candidata por lo que después del reemplazo del aptámero derivado del complejo de objetivo y aptámero puede suponerse que el candidato de droga respectiva permite una inhibición específica de la interacción entre el objetivo y el aptámero, y si la interacción es específica, dicha droga candidata, al menos en principio, será adecuada para bloquear el objetivo y consecuentemente disminuirá su disponibilidad o actividad biológica en un sistema respectivo que comprende tal objetivo. La molécula pequeña así obtenida puede entonces ser sujeto de una derivación y modificación adicionales para optimizar sus características físicas, químicas, biológicas y/o médicas tales como toxicidad, especificidad, biodegradabilidad y biodisponibilidad. La generación de spiegelmeros que pueden utilizarse o generar de acuerdo con la presente invención que utilizan ia proteína quinasa N beta o una codificación de ácido nucleico para la proteína quinasa N beta, se basa en un principio similar. La elaboración de spiegelmeros se describe en la solicitud de patente internacional WO 98/08856. Los spiegelmeros son ácidos nucléicos L, lo cual significa que se encuentran compuestos de nucleótidos L en lugar de aptámeros que se encuentran compuestos de nucleótidos D como lo son aptámeros. Los spiegelmeros se caracterizan por el hecho de que tienen una estabilidad muy alta en sistemas biológicos y, son comparables con los aptámeros, interactúan específicamente con la molécula de objetivo contra la cual se dirigen. Con el propósito de generar spiegelmeros, se crea una población heterógona de ácidos nucléicos D y esta población se contacta con la antípoda de la molécula de objetivo, en el presente caso para el ejemplo con el enantiómero D del enantiómero L de generación natural de la proteína quinasa N beta. Subsecuentemente, se separan aquellos ácidos nucléicos D que no interactúan con la antípoda óptica de la molécula de objetivo. Sin embargo, se separan aquellos ácidos nucléicos D que interactúan con la antípoda óptica de la molécula de' objetivo, se determinan opcionalmente y/o se secuencian y subsecuentemente se sintetizan los ácidos nucléicos L con base en la información de secuencia de ácido nucléico obtenida de los ácidos nucléicos D. Estos ácidos nucléicos L que son idénticos en términos de secuencia con los ácidos nucléicos D anteriormente mencionados que interactuan con la antípoda óptica de la molécula de objetivo, interactuarán específicamente con la molécula de objetivo de generación natural en lugar de con la antípoda óptica de la m isma. Similar al método para la generación de aptámeros también es posible repetir los diversos aspectos varias veces y consecuentemente enriquecer aquellos ácidos nucléicos que interactuan específicamente con la antípoda óptica de la molécula de objetivo. Una clase adicional de los compuestos que pueden elaborarse o generarse con base en la proteína quinasa N beta o una codificación de ácido nucléico para la proteína quinasa beta, como la molécula de objetivo como se describe en la presente, son los ribozimas, oligonucleótidos de antidetección y siARN . Una característica común de todos los ácidos nucléicos anteriormente mencionados es que no interactúan con la molécula de objetivo en el nivel del producto de trad ucción el cual es en el presente caso la proteína q u inasa N beta, pero en cam bio interactúan con el producto de transcripción , es decir, la codificación de ácido nucléico para la proteína quinasa beta tal como el ácido nucléico genómico o cualquier ácido nucléico derivado del mismo tal como los correspondientes hnARN , cADN y mARN , respectivamente. A tal grado, la molécula de objetivo de la clase anteriormente mencionada de compuestos es preferentemente el mARN de la proteína quinasa N beta. Los ribozimas son ácidos nucléicos catal íticamente activos los cuales consisten preferentemente de ARN el cual com prende básicamente dos residuos. El primer residuo muestra una actividad catalítica mientras que el segundo residuo es responsable de la interacción específica con el ácido nucléico de objetivo, en el presente caso la codificación de ácido nucléico para la proteína quinasa N beta. Después de la interacción entre el ácido nucléico de objetivo y el segundo residuo de la ribozima, típicamente por hibridización y el emparejamiento base de Watson-Crick de tramos esencialmente complementarios de bases en las dos cepas hibridizantes, el residuo catalíticamente activo puede volverse activo lo cual significa que se cataliza, sea intramolecularmente o intermolecularmente, el ácido nucléico de objetivo en caso de actividad catalítica del ribozima es una actividad de fosfodiesterasa. Subsecuentemente, puede haber una degradación adicional del ácido nucléico de objetivo el cual al final da como resultado la degradación del ácido nucléico de objetivo así como también la proteína derivada de dicho ácido nucléico de objetivo que en el presente caso es la proteína quinasa N beta debido a una falta de proteína quinasa N beta recientemente sintetizada y una inversión de la proteína quinasa N beta existente anterior. Los ribozimas, su uso y los principios de diseño son conocidos por aquellos expertos en la materia, y, por ejemplo se describen en Doherty y Doudna (Ribozym structures and mechanism . Annu ref. Biophys. Biomolstruct. 2001 ; 30: 457-75) y Lewin y Hauswirth (Ribozyme Gene Therapy: Applications for molecular medicine. 2001 7:221 -8). El uso de oligonucleótidos de antidetección para la elaboración de un medicamento y como un agente de diagnóstico, respectivamente, se basa en un modo similar de acción. Básicamente, los oligonucleótidos de antidetección se hibridizan con base en complementariedad base, con un ARN objetivo, preferentemente con un mARN, activan consecuentemente la RNasa H. La RNasa H se activa tanto por fosfodiéster y ADN acoplado con fosforotioato. Sin embargo, el ADN acoplado con fosforotioato se degrada rápidamente por nucleasas celulares con excepción de ADN acoplado con fosforotioato. Estos derivados resistentes de ADN de generación no natural no inhiben la RNasa H después de la hibridización con ARN. En otras palabras, los polinucleótidos de antidetección son solamente eficaces como complejos híbridos de ARN ADN. Los ejemplos para esta clase de oligonucleótidos de antidetección se describen, entre otros, en la Patente de E. U. No. 5,849,902 y 5,989,912. En otras palabras, con base en la secuencia de ácido nucleico de la molécula de objetivo el cual en el presente caso es la codificación de ácido nucléico para la proteína quinasa N beta, sea de la proteína de objetivo de la cual puede deducirse en principio una secuencia d"e ácido nucléico respectiva, o conociendo la secuencia de ácido nucléico tal como, particularmente el mARN, los oligonucleótidos de antidetección adecuados pueden diseñarse con base en el principio de complementariedad de base. Los oligonucleótidos de antidetección particularmente preferidos que tienen un tramo corto de ADN de fosforotioato (3 a 9 bases) . Un mínimo de 3 bases de ADN es requerido para la activación de RNasa H bacteriana y un mínimo de 5 bases es requerido para la activación de RNasa H mamífera. En estos oligonucleótidos quiméricos existe una región central que forma un substrato para la RNasa H que se distingue por "brazos" hibridizantes comprendidos de nucleótidos modificados que no forman substratos para la RNasa H. Los brazos hibridizantes de los oligonucleótidos quiméricos pueden modificarse tal como por 2'-0-metil o 2'-fluoro. Los planteamientos alternativos utilizaron enlaces de metilfosfonato o fosforamidato en dichos brazos. Las modalidades adicionales del oligonucleótido de antidetección útil en la práctica de la presente invención son los P-metoxioligonucleótidos, P-metoxioligodeoxiribonucleótidos parciales o P-metoxioligonucleótidos. De particular relevancia y utilidad para la presente invención son aquellos oligonucleótidos de antidetección como se describe más particularmente en las dos patentes de E. U. anteriormente mencionadas. Estos oligonucleótidos no contienen nucleótidos enlazados 5'?3' de generación natural. En cambio, los oligonucleótidos tienen dos tipos de nucleótidos: 2'-deoxifosforotioato, que activan la RNasa H, y nucleótidos modificados en 2' que no la activan. Los enlaces entre los nucleótidos modificados en 2' pueden ser fosfodiésteres, fosforotioato o P-etoxifosfodiéster. La activación de la RNasa H se realiza por una región de activación de RNasa H contigua, la cual contiene entre 3 y 5 nucleótidos de 2'-deoxifosforotioato para activar RNasa H bacteriana y entre 5 y 10· nucleótidos de 2'-deoxifosforotioato para activar la RNasa H eucariótica y, particularmente, mamífera. La protección de la degradación se realiza elaborando las bases terminales 5' y 3' altamente resistentes a la nucleasa y, opcionalmente, colocando un grupo de bloqueo terminal en 3'. ás particularmente, el oligonucleótido de antidetección comprende un término de 5' y un término de 3'; y de 1 1 a 59 nucleótidos enlazados 5'?3' de seleccionados independientemente a partir del grupo que consiste en nucleótidos de fosfodiéster modificado en 2' y nucleótidos de P-alquiloxifosfotriéster modificado en 2'; y donde la nucleosidad terminal en 5' se anexa en una región de activación de RNasa H de entre tres y diez desoxirribonucleótidos enlazados al fosforotioató contiguos, y donde el término 3' de dicho oligonucleótido se selecciona a partir del grupo que consiste en un desoxirribonucleótido invertido, un tramo contiguo de uno a tres ribonucleótidos modificados en 2' de fosforotiato, un grupo de biotina y un nucleótido de P-alquiloxifosfotriéster. También puede utilizarse un oligonucleótido de antidetección donde la nucleosidad terminal en 5' no se une a la región de activación de RNasa H sino a la nucleosidad terminal en 3' como se especificó con anterioridad. También, el término 5' se selecciona a partir del grupo particular en lugar del término 3' de dicho oligonucleótido. Los oligonucleótidos de antidetección adecuados y útiles son también aquellos que comprenden una región de activación de RNasa H terminal en 5' y que tienen entre 5 y 1 0 nucleótidos de desoxifosforotioato; entre 1 1 a 59 2'-metoxiribonucleót¡dos contiguos enlazados en 5'?3'; y un grupo de bloqueo de exonucleasa presente en el extremo 3' del oligonucleótido que se extrae del grupo que consiste en un nucleótido enlazado de no-5'-3'-fosfodiéster, derivado de uno a tres nucleótidos modificados contiguos enlazados de 5'-3' y un grupo bloqueo químico de no nucleótidos. Dos clases de oligonucleótidos de antidetección particularmente preferidos pueden caracterizarse como se explica a continuación. La primera clase de oligonucleótidos de antidetección, referida también en la presente como la segunda generación de oligonucleótidos de antidetección, comprende un total de 23 nucleótidos que comprenden en la dirección de 5'?3' un tramo de siete 2'-0-metilribonucleótidos, un tramo de nueve 2'-deoxiribonucléotidos, un tramo de seis 2'-0-metilribonucleótidos y un 2'-deoxiribonucléotido terminal en '3'. Del primer grupo de siete 2'-0-metilribonucleótidos los primeros cuatro son enlazados con fosforotioato, mientras que los subsecuentes cuatro 2'-0-metilribonucleótidos son enlazados por fosfodiéster. También, existe un enlace de fosfodiéster entre el último, es decir, el extremo más terminal en 3' de los 2'-0-metilribonucleótidos y el primer nucleótido del tramo que consiste en nueve 2'-deoxiribonucleótidos. Todos los 2'-deoxiribonucleótidos son enlazados por fosforotioato. También' se encuentra presente un enlace de fosforotioato entre el último, es decir, el 2'-deoxinucleótido más terminal en 3', y el primer 2'-0-metilribonucleótido del tramo subsecuente consistente en seis 2'-0-metilribonucleótidos. De este grupo de seis 2'-O-metilribonucleótidos los primeros cuatro de ellos, nuevamente en la dirección 5'—»3', se enlazan por fosfodiéster, mientras que los últimos tres de ellos, correspondientes a las posiciones 20 a 22 se enlazan por fosforotioato. El último, es decir, el 2'-deoxinucleótido terminal en 3' se enlaza al último, es decir, al 2'-0-metilribonucleótido más terminal en 3' mediante un enlace de fosforotioato. La primera clase puede describirse también para referencia a la siguiente estructura esquemática": R Rnnnn NNNNN NNNNnnnRRRN. En la presente, R indica ribonucleótidos de 2'-0-metilo enlazados con fosforotioato (A, G, U, C); n simboliza ribonucleótidos de 2'-0-metilo (A, G, U, C); N representa desoxirribonucleótidos enlazados con fosforotioato (A, G, T, C). La segunda clase de oligonucleótidos de antidetección particularmente preferidos, también referida en la presente como tercera generación (de) oligonucleótidos de antidetección o GeneBlocs, comprende también un total de 17 a 23 nucleotidos con la siguiente estructura básica (en la dirección 5'?3'). En el extremo terminal en 5' se encuentra un nucleótido abásico invertido el cual es una estructura adecuada para conferirle resistencia contra la actividad de exonucleasa y, se describe, por ejemplo en WO 99/54459. Este abásico invertido se enlaza a un tramo de cinco a siete 2'-0-metilribonucleótidos los cuales se enlazan por fosfodiéster. Después de este tramo de cinco a siete 2'-0-metilribonucleótidos se encuentra un tramo de siete a nueve 2'-0-deoxiribonucleótidos los cuales son enlazados todos por fosforotioato. El enlace entre el último, es decir, el 2'-0-metilribonucleótido más terminal en 3' y el primer 2'-0-deoxinucleótido del 2'-deoxinucleótido que comprende el tramo ocurre mediante un enlace de fosfodiéster.
Adyacente al tramo de siete a nueve 2'-deoxinucleótidos se conecta un tramo consistente de cinco a siete 2'-0-metilribonucleótidos. El último 2'-0-deoxinücleótido se enlaza al primer 2'-0-metilribonucleótido del último tramo mencionado consistente en cinco a siete 2'-0-metilribonucleótidos ocurre mediante un enlace de fosforotioato. El tramo de cinco a siete 2'-0-metilribonucleótidos se enlazan por fosfodiéster. En el extremo terminal en 3' del segundo tramo de cinco a siete 2'-0-metilr¡bonucleótidos se anexa otro abásico invertido. Esta segunda clase puede describirse también por referencia a la siguiente estructura esquemática: (GeneBlocs que representan la 3a generación de oligonucleótidos de antidetección tienen también la siguiente estructura esquemática:) cap-(np)x(Ns)y(np)z-cap o cap-nnnnnnnNNNNNNNNNnnnnnnn-cap. En la presente, cap representa abásicos de desoxi invertidos o modificaciones similares en ambos extremos; n simboliza ribonucleótidos de 2'-0-metilo (A, G, U, C); N representa desoxirribonucleótidos enlazados por fosforotioato (A, G, T, C); x representa un entero de 5 a 7; y representa un entero desde 7 hasta 9; y z representa un entero desde 5 hasta 7. Debe observarse que los enteros x, y y z pueden seleccionarse independientemente uno del otro aunque se prefiere que x y z sean iguales en un determinado oligonucleótido de antidetección. De acuerdo con lo anterior, las siguientes estructuras o diseños básicos de los oligonucleótidos de antidetección de la tercera generación pueden ser como se explica a continuación: cap-(np)5(Ns)7(np)5-cap, cap-(np)6(Ns)7(np)5-cap, cap-(np)7(Ns)7(np)5-cap, cap- (np)5 ( s)8(np)5-cap, cap-(np)6(Ns)8(np)5-cap, cap-(np)7(Ns)8(np)5-cap, cap-(np)5(Ns)9(np)5-cap, cap-(np)6(Ns)9(np)5-cap, cap-(np)7(Ns)9(np)5-cap, cap-(nP) s(Ns)7(np)6-cap, cap-(np)6(Ns)7(np)6-cap, cap-(np)7(Ns)7(np)6-cap, cap-(np)5(Ns)8(np)6-cap, cap-(np)6(Ns)8(np)6-cap, cap-(np)7(Ns)8(np)6-cap, cap-(np)5(Ns)9(np)6-cap, cap-(np)6(Ns)9(np)6-cap, cap-(np)7(Ns)9(np)6-cap, cap-(np)5(Ns)7(np)7-cap, cap-(np)6(Ns)7(np)7-cap, cap-(np)7(Ns)7(np)7-cap, cap-(np)5(Ns)8(np)7-cap, cap-(np) 6( N s)3(np)7-cap, cap-(np)7(Ns)3(np)7-cap, cap-(np)5(Ns)9(np)7-cap, cap-(np)6(Ns)9(np)7-cap, y cap-(np)7(Ns)9(np)7-cap. Una clase adicional de compuestos que puede generarse con base en las enseñanzas técnicas determinadas en la presente y que puede utilizarse como medicamentos y/o agentes de diagnóstico es ARN de interferencia pequeña (siARN) dirigido al ácido nucléico, preferentemente mARN, que codifica para la proteína quinasa N beta. El siARN es un ATN de doble cepa que tiene típicamente un largo de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleótidos. La secuencia de una de las dos cepas de ARN corresponde a la secuencia el ácido nucléico objetivo tal como la codificación de ácido nucléico para la proteína quinasa N beta, a degradarse. En otras palabras, conociendo la secuencia de ácido nucléico de la molécula de objetivo, en el presente caso la proteína quinasa N beta, puede diseñarse preferentemente la secuencia de mARN , un ARN de doble cepa con una de las dos cepas que es complementaria, por ejemplo, a dicho mARN de proteína quinasa N beta y, después de la aplicación de dicho siARN a un sistema que contiene el gen, ADN genómico, hnARN, mARN, o codificación de mARN para la proteína quinasa N beta, el ácido nucléico de objetivo respectivo se degradará y consecuentemente se reducirá el nivel de proteína respectiva. Los principios básicos para diseñar, construir, y utilizar dicho siARN como medicamento y agente de diagnóstico, respectivamente, entre otras cosas, se describe en las solicitudes de patente internacional WO 00/44895 y WO 01 /75164. Con base en los principios de diseño anteriormente mencionados, es posible generar tal siARN , oligonucleótidos de antidetección y ribozimas, respectivamente, una vez que se conoce la codificación de secuencia de ácido nucléico para la proteína quinasa N beta. También es cierto para las moléculas precursoras de ácidos nucléicos tales como hnARN, cADN y lo similar, incluyendo ácido nucléico genómico. Por supuesto, conociendo también la cepa de antidetección respectiva puede permitirse el diseño de tales compuestos basados en ácido nucléico dado el principio básico de complementariedad de par base, preferentemente con base en el emparejamiento base de Watson-Crick. De acuerdo con lo anterior, un aspecto adicional de la presente invención se refiere a siARNs específicos, ribozimas y nucleótidos de antidetección los cuales se dirigen contra o son específicos para la proteína quinasa N-beta. En lo siguiente, esto se ilustra adicionalmente por el siARN , sin embargo, esto aplica para oligonucleótidos y ribozimas de antidetección también, como reconocerá aquellos expertos en la materia. Tal siARN comprende preferentemente un largo de 15 a 5 nucleótidos, por lo que esto se refiere actualmente a cualquier largo que comprende 15, 16, 1 7, 1 8, 20,21 , 22, 23, 24 o 25 nucleótidos. En modalidades adicionales , el siARN puede exh ibir incluso más nucleótidos . De acuerdo con los princi pios de diseño conocidos en la materia, puede generarse el siARN respectivo . De acuerdo con lo anterior, el siARN reivindicado en la presente comprende un tramo de preferentemente cualq u ier largo nucleótido desde 1 5 hasta 25 nucleótidos consecutivos que sea al menos parcialmente complementario a la PKN-beta de codificación cepa de detección o de antidetección , y una segunda cepa de ribonucleótidos la cual es al menos parcialmente complementaria a la primera y consecuentemente a la cepa de antidetección y la cepa de detección respectivamente, codificando la proteína quinasa N-beta. Puede aplicarse cualquier principio de diseño conocido en la materia de generación o elaboración de siARN a esta clase de estructura doble. El espacio de siARN descrito en la presente comprende moléculas de siARN cuya cepa de antidetección com ienza con un nucleótido el cual corresponde al nucleótido no. 1 de una secuencia de codificación de PKN-beta como se especifica con anterioridad. Además, tales moléculas de siARN com ienzan con un nucleótido el cual corresponde al nucleótido no. 2 de una secuencia de cod ificación de PKN-beta como se especificó con anterioridad, etcétera . Esta clase de filtración sobre la secuencia de codificación de PKN-beta se repite a fin de proporcionar todas las moléculas posibles de siARN las cuales pueden dirigirse contra P KN-beta . El largo de cualesq uier moléculas de siARN así generadas puede ser cualq u ier largo adecuado para el siARN , más particularmente cualquier largo como se especifica con anterioridad. Preferentemente, las diversas moléculas de siARN del espacio de molécula de siARN descrito en. la presente, se sobreponen excepto el nucleótido más terminal en 5' de la cepa de antidetección o la cepa de detección. Es obvio que las secuencias de antidetección así obtenidas tienen que complementarse mediante el emparejamiento base a fin de formar al menos parcialmente la estructura de doble cepa requerida para un siARN funcionalmente activo. Con base en el modo de acción de las clases anteriormente mencionadas de compuestos, tales como anticuerpos, péptidos, anticalinas, aptámeros, spiegelmeros, ribozimas, oligonucleótidos de antidetecció'n, así como también si ARN, se encuentra consecuentemente dentro de la presente invención para utilizar cualquiera de estos compuestos que seleccionan como objetivo la proteína quinasa N beta y la codificación de ácido nucléico por ende, respectivamente, para la elaboración de un medicamento o un agente de diagnóstico para cualquiera de las enfermedades como se describen en la presente y cualquiera de las condiciones de enfermedad descritas en la presente. Además, estos genes pueden utilizarse para monitorear el progreso de dichas enfermedades y condiciones de enfermedad y el éxito de cualquier terapia aplicada, respectivamente. Las diversas clases de compuestos diseños de acuerdo con la presente invención tal como anticuerpos, péptidos, anticalinas, moléculas pequeñas, aptámeros, spiegelmeros, ribozimas, oligonucleótidos de antidetección y siARN pueden contenerse también en una composición farmacéutica. Preferentemente tal composición farmacéutica se utiliza para el tratamiento de las enfermedades como se describe en la presente o las condiciones de enfermedad descritas en la presente. La composición farmacéutica puede comprender en una modalidad una o varias de las clases de compuestos anteriormente mencionadas y/o uno o más miembros de una sola clase, y opcionalmente un compuesto activo farmacéutico adicional, y un portador farmacéuticamente aceptable. Tal portador puede ser o líquido o sólido, por ejemplo, una solución, un regulador, una solución alcohólica o lo similar. Los portadores sólidos adecuados, entre otros, son almidón y lo similar. El experto en la materia sabe proporcionar las formulaciones respectivas para los diversos compuestos de acuerdo con las clases de compuestos anteriormente mencionadas con objeto de llevar a cabo la ruta particular de administraciones tales como oral, parenteral , subcutánea, intravenosa, intramuscular y lo similar. Los diversos compuestos de las diferentes clases de compuestos como se mencionó anteriormente, pueden ser también, solos o en combinación, sujeto a o contenerse en un juego. Tal juego comprende aparte del(los) compuesto(s) respectivo(s) adicionalmente uno o varios elementos o compuestos adicionales por los cuales ios elementos se seleccionan a partir del grupo que comprende reguladores, controles negativos, controles positivos e instrucciones sobre el uso de los diversos compuestos. Preferentemente, los diversos compuestos se encuentran presentes sea en forma seca o líquida, preferentemente como una dosis unitaria para la administración individual a cada uno. El juego puede utilizarse particularmente para la terapia , d iag nóstico o monitoreo del progreso de la enfermedad o terapias aplicadas con relación a las enfermedades y condiciones de enfermedad como se describe en la presente.
BREVE DESCRIPCI ÓN DE LAS FIGURAS La presente invención se ilustra ahora adicionalmente por las sig uientes figuras y ejemplos los cuales pretenden l im itar el alcance de la protección . A partir de d ichas fig uras y ejem plos pueden tom arse características, modalidades y ventajas adicionales, en las que La Figura 1 muestra una representación esquemática de activación de la trayectoria de Pl 3-quinasa inducida por el factor de desarrollo; La Fig ura 2 muestra la medición de la metástasis del nodo linfático en un m odelo de ratón PC-3 ortotópico después del tratamiento con rapam ici na ; La Figura 3 m uestra el planteamiento experimental para identificar una PKN beta como un objetivo de droga corriente debajo de la trayectoria de Pl 3-Quinasa; La Figura 4 muestra una pantalla de GeneBIoc primaria en PKN beta; La Figura 5 muestra el desarrollo de células de PC3 transfectadas con GB específico de PKNbeta en matrigel; La Fig ura 6 m uestra la i nterferencia de ARN por la expresión transitoria de siARN en las cél u las HeLaB; La Figura 7 muestra fotografías de células de próstata humana y de células cancerosas de próstata humana después de la hibridización utilizando secuencias de antidetección y de detección de proteína quinasa N beta como sondas; La Figura 8 muestra un diagrama que representa gráficamente el volumen de tumores primarios en un modelo de tumor de próstata ortotópica que utiliza dos diferentes construcciones de siARN (Figura 8A); un diagrama que representa gráficamente el volumen de metástasis de nodo linfático en un modelo ortotopico de tumor de próstata que utiliza dos construcciones diferentes de siARN (Figura 8B), y fotografías de próstata y nodos linfáticos en un modelo ortotopico de tumor de próstata que utiliza siARN de control (Figura 8C1 ) y una construcción de siARN específica a la proteína quinasa N beta (Figura 8C2); La Figura 9 muestra un análisis sanguíneo Western de diferentes derivados de proteína quinasa N beta y sus actividades utilizando la MPB como un substrato de fosforilación convencional después de la sobreexpresión transitoria en células de HeLa y el anticuerpo de anti-proteína quinasa N beta (anti-PK) para detectar los niveles de expresión relativos de los derivados de quinasa (Figura 9A) , un análisis sanguíneo Western adicional de diferentes derivados de anti-proteína quinasa N beta utilizando un anticuerpo específico para la forma fosfoTilada de la proteína quinasa N beta (Figura 9B), y una representación esquemática de los diversos derivados de proteína quinasa N beta utilizados (Figura 9C) ; La Figura 10 muestra un análisis sangu íneo Western de diversos derivados de proteína quinasa N beta (Figura 1 0A) para monitorear los niveles de expresión de los mismos en células HeLa y un análisis de gel de la fosforilación de los derivados de proteína quinasa N beta (Figura 1 0B); La Figura 1 1 muestra los resultados de pruebas de inmunoprecipitación para detectar la fosforilación de los substratos de proteína para la detección de la proteína quinasa N beta de la forma fosforilada de la misma por el análisis sanguíneo Western (Figura 1 1 A) o la incorporación de fosfato etiquetado con 32P por autoradiografía (Figura 1 1 B) . A fin de asegurar que estuvieron presentes cantidades comparables de PKNbeta en los precipitados inmunes respectivos, se volvió a reprobar el filtro mostrado en la Figura 1 1 utilizando un anticuerpo de anti-PKNbeta ("quinasa", Figura 1 1 C) . La Figura 12 muestra un análisis sanguíneo Western que copara la expresión de la proteína quinasa N beta endógena en muestras que fueron tratadas con LY294002 para diferentes momentos en células de HeLa y PC-3. El nivel de AKT fosforilado se monitoreó en paralelo para confirmar la eficacia del inhibidor de Pl 3-quinasa. La Figura 13 muestra las cantidades de proteína relativa y las actividades de quinasa de diversos derivados de PKNbeta recombinante presentes en inmuno-complejos. Las células que expresan las proteínas recombinantes respectivas se habían tratado con el inhibidor LY294002 de Pl 3-quinasa antes de la lisis para los momentos indicados.
La Figura 14 muestra un penal de imágenes, mediante las cuales se investigó la distribución celular de PKN beta y derivados de la misma tales como PKN beta de tipo silvestre (Figura 14A), derivado TA de PKN beta (Figura 14B), derivado KE de PKN beta (Figura 14C) y PKN beta deltaN (Figura 14D) por microscopía de fluorescencia confocal. Los derivados recombinantes etiquetados con HA de PKNbeta se expresaron temporalmente en células de HeLa durante 48 horas. Después de la fijación y de la permeabilización, se detectó la expresión de las proteínas recombinantes utilizando un anticuerpo anti-HA seguido por un anticuerpo de anti-ratón conjugado con FITC. Las células se contratiñeron al etiquetar la actina citoesquelética con rodamina-paloidina.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La Figura 1 muestra una representación esquemática de la activación de la trayectoria de Pl 3-quinasa inducida con el factor de desarrollo. La estimulación del factor de desarrollo de las células conduce a una activación de sus receptores congéneres en la membrana celular, con los cuales se asocian a su vez y activan moléculas de señalización intracelular tales como Pl 3-quinasa. La supresora de tumores PTEN interfiere con las respuestas corriente abajo mediadas con Pl 3-quinasa y asegura que la activación de a trayectoria ocurre de manera transitoria. LY294002 es un inhibidor de moléculas pequeñas de la Pl 3-quinasa. Uno de los genes corriente abajo conocidos de Pl 3-K es mTOR (objetivo de mamífero de apamicina) los cuales pueden inhibirse por la droga rapamicina (Rapamune) aprobada clínicamente. La Pl 3-K se encuentra involucrada en la regulación de la proliferación celular, sobrevivencia celular, transporte de glucosa, traducción , metástasis y migración. X indica los ejecutores corriente abajo los cuales representan objetivos de droga potenciales que son pronosticados para estar involucrados en mejoras del comportamiento metastático de células cancerosas. Esta clase de moléculas ejecutoras que actúan adicionalmente corriente abajo en la trayectoria son propensas a representar mejores objetivos de droga que los objetivos más "corriente arriba" tales como mTOR, dado que tienen menos efectos pleiotrópicos. La materia en cuestión de la Figura 2 a la Figura 5 se describe más detalladamente en conexión con los siguientes ejemplos. La Figura 6 muestra la interferencia por la expresión transitoria de siARN en células de HeLaB. (A) Las moléculas de siARN se generaron por la expresión accionada por el mejorador (U6+2) de secuencias específicas de objetivo (plantilla derivada del gen de interés con contenido de las secuencias complementarias de detección 21 -mero e inversas enlazadas por el tramo 12-mero poli A. Después de la transcripción los ARNs son propensos a formar moléculas de siARN de doble cepa. (B) Las secuencias de plantilla de genes seleccionados como objetivo para la expresión de siARN. Las secuencias correspondientes se introdujeron en los vectores de expresión que llevan el casette del mejorador U6+2.
(C) Efecto de la expresión de siARN en el desarrollo y la proliferación celular. Las construcciones (ver con anterioridad) se expresaron temporalmente por transfeccion en células HeLaB para los experimentos de interferencia de ARNi. Las células se cosecharon 48 horas después de transfectadas y se sembraron subsecuentemente (80000 células por cavidad) en gel "matrigel". El efecto de la interferencia de ARN en la expresión de los genes correspondientes fue analizado al probar las células transfectadas para desarrollo/proliferación en matrigel. La expresión de siARN seleccionado como objetivo a PTEN no tuvo efecto sobre el desarrollo de células de HeLaB en el matrigel (panel derecho), mientras que la expresión de siARN específico a pH Obeta y PKNbeta desestabilizaron severamente el comportamiento del desarrollo de HeLaB en matrigel (paneles intermedio y derecho).
Ejemplo 1 : Materiales y Métodos Cultivo celular Las células PC-3 de carcinoma de próstata humana se obtuvieron de la Colección de Cultivos de Tipo Americano (ATCC). Las células se cultivaron en una Mezcla N utriente F12K (modificación de aighn) con contenido de suero bovino fetal (CS) al 1 0% , gentamicina (50 µg/ml) y anfotericina (50 ng/ml). Las transfecciones se realizaron en placas de 96 cavidades o de 10 cm (a una confluencia de 30% a 50%) utilizando diversos lípidos catiónicos tales como Oligofectamine, Lipofectamine (Life Technologies), Argfectin50 o Profectin50 (Atugen/GOT Berlín, Alemania), o FuGene 6 (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los GeneBlocs se transfectaron agregando un complejo concentrado 5x pre-formado de GeneBloc y lípido en un medio sin suero a células en un medio completo. El volumen de transfección total fue de 100 µ? para las células colocadas en placas en 96 cavidades y 10 mi para células en placas de 10 cm. La concentración final de lípidos fue de 0.8 a 1 .2 pg/ml dependiendo de la densidad celular; la concentración de GeneBloc se indica en cada experimento. Las células cultivadas se tripsinaron y cosecharon después de detener el efecto de tripsina por el medio. Se agregan procedimientos de enjuague (PBS; Centrifugation 5 min/1 000 rpm) y, finalmente, el comprimido se vuelve a suspender considerando el número y el volumen celular a inocularse.
Determ inación de las cantidades relativas de n iveles de ARN por anál isis de Taqman . ¦El ARN de las células transfectadas en 96 cavidades se aisló y purificó utilizando el juego Invisorb RNA HTS 96 (I nVitek GMBH, Berlín). La inhibición de la expresión de mARN de PKN beta se detectó por análisis de RT-PCR (Taqman) en tiempo real utilizando 300 nM del imprimador 5' de PKNbeta, 300 nM del imprimador 3' de PKNbeta y 1 00 nM de la sonda Taqman PKNbeta etiquetada con Fam-Tamra. La reacción se realizó en 50 µ? y se probó en el detector de Secuencias ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante bajo las siguientes condiciones: 48°C durante 30 minutos, 95°C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de 15 segundos a 95°C y 1 minuto a 60°C.
Desarrollo in vitro en matriz de matrigel. Las células de PC3 se trataron con 5 µ? de LY294002 o DMSO cuando se sembraron en Matrigel. Si las células se transfectaron antes de la siembra, las células se transfectaron con GeneBloc y se tripsinaron 48 horas después de la transfección. Las células se enjuagaron en medio y se sembraron en 24 cavidades duplicadas (100,000 células por cavidad) pre-cubiertas con 250 1 matriz de membrana de basamento de matrigel (Becton Dickinson). Después de la incubación durante 24 a 72 horas se tomaron fotografías a una magnificación de 5x con una cámara Axiocam anexa a un microscopio Axiovert S100 (Zeiss).
Affymetrix El ARN total de las células desarrolladas en Matrigel se preparó utilizando el juego de ARN totalmente (AMBION) siguiendo el protocolo del fabricante. En el paso final se volvió a suspender el ARN total precipitado en el regulador de lisis Invisorb y se purificó utilizando el juego de ARN celular de giro Invisorb (INVITEK). Se preparó el cARN etiquetado con biotina siguiendo los protocolos de Affymetrix y se hibridizaron 15 pg de cARN sobre el juego HG-U95 de Affymetrix GeneChip.
Anál isis de ciatos Se analizaron los datos crudos utilizando el software Microarray Suite v4.0 de Affymetrix GeneChip. La intensidad de cada juego de sonda se calcula como la diferencia de la señal de hibridización de los oligonucleótidos de acoplamiento perfecto en comparación con los oligonucleótidos sin acoplamiento promediado sobre el conjunto de 16 a 20 pares de sondas correspondientes a una transcripción. La diferencia promedio de un conjunto de sondas es proporcional a la abundancia de una transcripción . Las intensidades totales de señal de los diferentes arreglos se escalaron al mismo valor antes de la comparación. Los cambios de veces se calcularon utilizando el software Affymetrix por comparación a manera de pares de las intensidades de los pares de sonda correspondientes derivados del experimento y los arreglos base. Utilizando las matrices de decisión descritas por Affymetrix el software genera también llamadas absolutas (la transcripción está ausente, marginal o presente en un experimento) y las llamadas de diferencia (abundancia de una transcripción en un experimento en comparación con otro: incremento, incremento marginal, sin cambios, decremento marginal, decremento). Los resultados se exportaron a Microsoft Excel (llamada absoluta, llamada de diferencia, cambio de veces) y se filtraron. Se descartaron todos los conjuntos de sonda con llamadas ausentes o una llamada sin cambio y se clasificó la tabla por el cambio de veces.
Estud ios an imales Se realizaron los experimentos in vivo correspondientes a las Buenas Prácticas de Laboratorio para Estudios No clínicos de Laboratorio (GLP Regulations) de la Administración de Drogas y Alimentos y de acuerdo con la ley Alemana de protección a animales como base legal. Zapato Macho: ratones NMRI-nu/nu (Tierzucht Schónwalde GmbH) mantenidos bajo condiciones de SPF (equipo de flujo de aire laminar, Scantainer, Scanbur) servidos como recipientes para células de carcinoma de próstata humana. Los animales, con edades de 6-8 semanas y con pesos de 28-30 g, fueron inoculados con 2*1 06/0.03 mi de células tumorosas tanto en el lóbulo dorsolateral izquierdo de la glándula prostética (iprost; Orthotopic) o la punta del lóbulo lateral izquierdo del hígado (ihep; Ectopic). Para este propósito, los ratones recibieron una anestesia corporal general utilizando una mezcla de Ketanest (Parke-Davis GmbH) y Rompun (Bayer Vital GmbH) 80: 1 con dosis de 100 mg/kg y 5 mg/kg, respectivamente. Siguiendo la esterilización a conciencia de la superficie corporal ventral se llevó a cabo una incisión por la piel abdominal y la pared peritoneal comenzando cerca del límite de la glándula prepucial y midiendo aproximadamente 1 cm . Mediante un par de tenazas y un estropajo de algodón se ' visualizó la glándula prostática. Siguieron los estímulos con células ortotópicas con ayuda de una lupa y por el uso de una jeringa de 1 mi (Henke Sass Wolf GmbH) soportando agujas 30G 0.30 * 13 microlanza (Becton Dickinson). Fue exitosa una administración observando una am polla marcada en el sitio de inoculación . La herida se cerró por material de sutura (PGA Resorba, Franz Hiltner GmbH) referente a la pared peritoneal y a las abrazaderas de Michel de 1 1 *2 mm (Heiland) para la piel abdominal. Un atomizador de heridas (Hansaplast Sprühpflaster, Beiersdorf AG) cubrió la lesión. Durante la fase posq uirúrgica los animales fueron mantenidos en un ambiente calentado hasta que fueron despertados completamente. Los animales fueron seleccionados aleatoriamente de acuerdo con el número de grupos de tfatamiento consistente en 5-10 animales por grupo cada uno de ellos. Fueron inspeccionados exitosamente inclusive al protocolar los hallazgos. Se administra ssniff NM-Z, 1 0 mm , con capacidad de someterse al autoclave (ssniff Spezialdiáten GmbH) como dieta fortificada y se acidifica el agua potable por HCI, ambas ad libitum.
Evaluaciones Para recibir el nivel de dosis actual se registraron los pesos corporales los días de tratamiento. Al mismo tiempo, puede derivarse del desarrollo de peso corporal a fin de reconocer las influencias de modalidades de tratamiento en todo el organismo . Se realizaron perforaciones de sangre el día 0 (base); 14; 28; y 35 (sacrificio) . Se extrajo sangre de la vena orbital del animal anestesiado a corto plazo (Dietiléter, Otto Fischar GmbH). Los parámetros de evaluación que brindan datos a la compatibilidad y efectos secundarios de los tratamientos son los siguientes: números de leucocitos; números de trombocitos; enzimas. Los parámetros adicionales transmitidos por la sangre fueron la bilirrubina; creatinina; proteína; urea; ácido úrico. Todos los animales sacrificados se disecaron completamente y se documentaron fotográficamente. Se midieron los tumores (glándula prostática) y las metástasis (metástasis de nodo linfática caudal, lumbar, renal) en dos dimensiones por medio de un par de calibradores. El volumen se calculó de acuerdo con V (mm3)= ab2/2 con b<a. En general, el número de células ejecutado para el planteamiento de terapia ocasiona una toma de tumor al 100% referente a la glándula prostática. Los pesos de algunos órganos (Hígado; Bazo; Riñon) fueron registrados con objeto de encontrar datos adicionales referentes al conocimiento de efectos secundarios. Para análisis histológicos, las muestras de tejidos tumorosos, es decir, metástasis de tumores prostéticos y de nodo linfático, se fijaron en formaldehído al 5% y parafina incorporada.
Rutinariamente, las secciones se tiñeron con HE, si fue necesario se realizaron teñidos específicos (Azan, PAS). Para detectar el origen humano de las células tumorosas y metastáticas se congelaron muestras de tejido adecuado en nitrógeno líquido. Cuando se utilizaba análisis de PCR y Taqman con amplicon específico de huHPRT pudimos detectar 50 células humanas en 5 mg de tejido. Los resultados terapéuticos se verificaron estadísticamente por la prueba-u de ann y Whitney.
Ejemplo 2 : Prueba de concepto experimental sobre la apl icabi lidad de objetivos de droga corriente abajo. Como se bosqueja en la parte introductoria de esta especificación la cual se incorpora en la presente para referencia, los objetivos enlazados corriente abajo a una trayectoria de señalización son valiosos para el diseño o desarrollo tanto de medicamentos como de agentes de diagnóstico. Es obvio que, si el objetivo particular se encuentra vinculado con otras trayectorias diferentes o debido a que su posición dentro de la trayectoria de señalización se encuentra vinculada a un cierto número de fenómenos biológicos tales como, por ejemplo, la metástasis y la migración, apoptosis de traducción de desarrollo, ciclo celular, reparación de ADN y lo similar como en el caso de la PI 3-quinasa, cualquier compuesto que aborde este objetivo es propenso a tener un cierto número de efectos secundarios los cuales pueden ser perjudiciales al sistema e indeseables desde el punto de vista médico. De acuerdo con lo anterior, los objetivos que actúan adic'ionalmente corriente abajo deben ser la primera elección para la invención terapéutica. Los presentes inventores han encontrado que bajo el control de la trayectoria de PI 3-quinasa se encuentran involucrados posibles objetivos de droga adicionales aparte de mTOR, los cuales son específicos para controlar los fenómenos de metástasis y migración y consecuentemente tumorigénesis. En la industria farmacéutica se ha descubierto que la rapamicina vendida bajo el nombre comercial de Rapamune es adecuada para inhibir la metástasis y la migración. Esto confirma la aplicabilidad de la estrategia para abordar objetivos de droga corriente abajo. Como puede observarse a partir de la Figura 2, la rapamicina es adecuada para reducir el volumen de metástasis de nodo linfático y es a tal grado comparable en su efecto con el inhibidor LY294002 de Pl 3-quinasa conocido. Como se representa gráficamente en la Figura 2A, se utilizó el modelo de toma de tumor y el tratamiento con Rapamune comenzó el día 1. Ambas concentraciones utilizaron, es decir, 0.4 mg/kg/dosis - 2 mg/kg/día condujeron a un decremento tremendo del grado de metástasis de nodo linfático, expresadas como un volumen medido de metástasis (mm3) en comparación con el control negativo el cual fue salmuera regulada con fosfato. Para análisis histológicos, se fijaron las muestras de tejidos tumorosos, es decir, metástasis de tumor prostático y de nodo linfático, en formaldehído al 5% y parafina incorporada.
Rutinariamente, los cortes se tiñeron con HE, si fue necesario se realizaron teñidos específicos (Azan, PAS). Básicamente se obtuvieron los mismos resultados en el caso del tratamiento de Rapamune de un modelo de tumor establecido con el tratamiento comenzando el día 28. Se midió la metástasis de nodo linfático en un modelo de ratón PC-3 ortotópico después del tratamiento con rapamicina (Rapamune). En la Figura 2(A) se muestran los resultados del modelo de toma de tumor (A). Zapato Desnudo: se inyectaron ratones NMRI -nu/nu (8 por grupo) con 2*10e células de PC3 en 0.03 mi de intraprostático y se llevó a cabo el tratamiento utilizando Rapamune intraperitonealmente diario durante 28 días en dosis de 2 mg/kg y 0.4 mg/kg de PBS servido como control. Para el tratamiento de los tumores (B) establecidos, se dejó desarrollar las células ¡pros durante 28 días y el tratamiento se llevó a cabo oralmente utilizando Rapamune los días 29 a 50 después del implante. Las dosis fueron seleccionadas como se delinea en A. Los animales se sacrificaron el día 29 y 51 , respectivamente y se determinaron las metástasis totales de nodo linfático.
Ejemplo 3: Identificación de PKN beta como objetivo de droga corriente abajo dentro de la trayectoria de Pl 3-quinasa El planteamiento experimental básico se muestra en la Figura 3. Las células de PC3 desarrolladas en Matrigel se trataron con DMSO o con el inhibidor LY294002 de Pl 3-K y se aisló el ARN total de cada muestra. Se realizó el perfil de expresión genética Affymetrix y se confirmó la expresión utilizando la prueba Taqman RT-PCR en tiempo real. Se utilizó p 1 0 como una norma no diferencial. Las células PC3 son PTEN -/- lo cual significa que la supresora de tumores PTEN realmente carece de estas células de manera que la trayectoria de Pl 3-quinasa se activa permanentemente lo cual conduce a una actividad o comportamiento metastático de las células lo cual se expresa por su patrón de desarrollo en la prueba de matrigel. Las células con un potencial de desarrollo invasivo exhiben un desarrollo mejorado sobre la membrana de base tal como una matriz de matrigel.
(Petersen, O.W., Ronnov-Jessen, L, Howlett, A.R. y Bissell, M.J. (1992). La interacción con membranas de basamento sirve para distinguir rápidamente el desarrollo y el patrón de diferenciación de las células epiteliales de pecho humano normales y malignas. Proc Nati Acad Sci U S A , 89, 9064-9068. (También: Sternberger et al., 2002 Antisense & Nucleic acid drug development 12:131-143). En conexión con la misma debe observarse que las células de PC3 se desarrollaron en matrigel y tomaron este como un sistema modelo el cual está próximo al ambiente in vivo el ARN aislado del mismo se supone que está más próximo a la situación o resultados in situ que cualquier preparación obtenida a partir de células desarrolladas en un ambiente de no matrigel tal como una placa de cultivo celular convencional.
Ejemplo 4: Filtración de oligonucleótidos de antidetección óptima dirigidos a la proteína quinasa N beta. Las células PC3 se transfectaron con diferentes concentraciones de GeneBloc como se describe y los niveles de mARN se determinaron 24 horas después de la transfección utilizando pruebas de Taqman con 300 nM de imprimadores directo e inverso específico de PKNbeta y 100 n y 40 nM de imprimador directo e inverso y 100 nM de sonda para la actina humana. Los niveles de mARN se estandarizaron a niveles de actina internos y las cantidades se muestran con relación a GBC (células transfectadas con un Control Gene Bloc).
El resultado del mismo se muestra en la Figura 4. De la Figura 4 se seleccionaron los oligonucleótidos de antidetección particularmente ventajosos GeneBlocs 7021 0 y 7021 1 para estudios adicionales. En conexión con el GeneBloc como se utiliza en la presente en los diversos ejemplos debe observarse que todos son oligonucleótidos de antidetección de tercera generación como se especifica en la presente lo cual significa, como también es obvio a partir de la Tabla 1 , que las letras mayúsculas superiores representan los desoxirribonucleótidos que estuvieron vinculados mediante un fosforotioato en lugar de un enlace de fosforodiéster.
Tabla 1: Resumen de los diversos GeneBlocs utilizados, sus alias, no correspondencias relativas con el ácido nucléico de objetivo y sus características estructuradas y de secuencia.
Los diversos GeneBlocs corresponden a los siguientes NOs DE ID DE SEC: .70669: NO DE ID DE SEC:3 70670: NO DE ID DE SEC:4 24536: NO DE ID DE SEC:5 24537: NO DE ID DE SEC:6 24538: NO DE ID DE SEC:7 70210: NO DE ID DE SEC:8 7021 1 : NO DE ID DE SEC:9 70671 : NO DE ID DE SEC: 10 70676: NO DE ID DE SEC: 1 1 70677: NO DE ID DE SEC: 12 Además debe observarse que cualquiera de las "t" anteriores son actualmente "u" dado el hecho de que los oligonucleótidos de antidetección anteriormente mencionados son GeneBlocs, es decir, oligonucleótidos de antidetección de tercera generación .
Ejemplo 5: Desactivación selectiva de proteína quinasa N beta Con objeto de comprobar que la proteína quinasa N beta es un objetivo de droga corriente abajo adecuado de la trayectoria de Pl 3-quinasa, los dos GeneBlocs particularmente ventajosos como se obtienen a partir del ejemplo 4 se utilizaron en un material basado en el experimento de desarrollo. El experimento de desarrollo de matrigel se toma como un modelo subrogado el cual muestra la metástasis y el comportamiento de migración de la célula respectiva. Un desarrollo más confluente de las células se toma como indicación de que se incrementan sus metástasis y comportamiento de migración lo cual le permite a las células dispersarse por la estructura tri-dimensional proporcionada por el matrigel. Las células de PC3 se transfectaron y sembraron en matrigel como se describe y se monitoreó el desarrollo. Se aisló mARN a partir de un alícuota de las células sembradas en matrigel y se analizaron utilizando la prueba Taqman (panel izquierdo) . El mARN específico de PKNbeta se estandarizó a los niveles de mARN de p1 10a endógeno. Se utiliza un GeneBloc específico de PTEN como control negativo en las células de PC-3 PTEN"7" y se utiliza un GeneBloc específico de p1 10a como control positivo para el desarrollo en la matriz extracelular. La inhibición de desarrollo específico se muestra comparando el desarrollo de células tratadas con el GeneBloc 70210 o 7021 1 específico de PKN beta contra sus oligonucleótidos no igualados correspondientes, respectivamente. Los resultados respectivos se ilustran también en la Figura 5. A partir, de esto puede tomarse que el bloque genético 7021 1 y 70210 pueden ser compuestos adecuados para la elaboración de un medicamento o agente de diagnóstico para el tratamiento de enfermedades y condiciones de enfermedad como se describe en la presente.
Ejemplo 6 : Interferencia de ARN por la expresió n trans itoria de siARN en células de HeLaB Este experimento es un ejemplo del diseño exitoso de siARN el cual permite que se aborde específicamente la proteína quinasa N beta de objetivo de droga corriente abajo. Como se ilustra en la Figura 6(A) las moléculas se generaron por la expresión accionada por el mejorador (U6+2) de las secuencias n de objetivo (plantilla derivada del gen de interés que contiene las secuencias complementarias inversa y de detección de 21 -mero enlazadas por el tramo poli A 12-mero. Después de la transcripción, los ARNs son propensos a formar moléculas de siARN de doble cepa. Las diversas construcciones tales como p1 1 0beta y PTEN fueron utilizadas como control positivo y negativo, respectivamente en la misma construcción vectorial que el siARN diseñado contra la secuencia de mARN de PKNbeta. El diseño respectivo se m uestra en la Figura 6(B) donde las secuencias de plantilla de los genes seleccionados como objetivo para la expresión de siARN fueron introducidos en vectores de expresión que llevan el casette del mejorador U6+2. Las construcciones se expresaron temporalmente por la transfección en células de HeLaB para experimentos de interfase de ARNi. Las células se cosecharon 48 horas después de transfectadas y subsecuentemente se sembraron (80000 células por cavidad) en matrigel. E-l efecto de interferencia de ARN en la expresión de genes correspondientes se analizó al probar células transfectadas para el desarrollo/proliferación en matrigel. La expresión de siARN seleccionado como objetivo a PTEN no tuvo efecto sobre el desarrollo de células de HeLaB en matrigel (panel derecho) , mientras que la expresión de siARN específica a p1 1 0beta y PKNbeta desestabilizó severamente el comportamiento de desarrollo de HeLaB en matrigel (paneles intermedio y derecho). En vista de esto, la secuencia de siARN particular comprueba ser un medio eficaz para el tratamiento de la enfermedad y condiciones de enfermedad como se describe en la presente.
Ejemplo 7: Detección de proteína quinasa N beta en tumores de próstata humana Con objeto de brindar evidencia adicional de que la proteína quinasa N beta es un objetivo adecuado en el tratamiento de tumores de próstata, se sometió tejido de próstata humana respectivo a hibridización in situ. Para la hibridización in situ se prepararon cepas de detección y de antidetección a partir de las posiciones de nucleótidos 1672 a 2667 de la secuencia NM 013355 en el vector pCR4 Topo, con lo cual se utilizó la polimerasa T7 y T3 para propósitos de amplificación. Las células tumorosas (PC-3) de próstata humana se desarrollaron en ratones. Después de la disección, el tejido se congeló a -20°C en solución de isopentano, se cortaron rebanadas a -15°C y se almacenaron a -80°C. Antes de la hibridización, las rebanadas se fijaron en paraformaldehído. Los especímenes tumorosos humanos se fijaron en paraformaldehído y se incorporaron con parafina. Los especímenes tumorosos fueron tratados con proteinaza K y se acetilaron. Las sondas de ácido nucléico se etiquetaron doblemente con 35S-ATP y 35S-UTP y se incubaron con tejidos a 58°C en un regulador de hibridización (0.4 M de NaCI, formamida al 50%, 1* Denhardt's, 10 mM de Tris, 1 mM de EDTa, sulfato de dextrano al 10%, 10 ¡g/m\ de cada tARN y ADN de esperma de salmón, 10 mM de DTT) con contenido de formamida al 50%. El resultado de la hibridización in situ se representa gráficamente en la Figura 7. Utilizando la sonda de antidetección de proteína quinasa N beta para la hibridización in situ de tumores de próstata, las glándulas se tiñen intensivamente (Figura 7A). En contraste con esto, el tejido de próstata saludable se tiñe menos y se proporciona para una señal de fondo solamente, utilizando n uevamente la sonda de antidetección (Figura 7C). En contraste con esto, el uso de la sonda de detección en conexión con ambos tejidos, no proporcionó señal alguna.
Ejemplo 8: Reducción in vivo de tumores primarios y metástasis de nodo linfático por siARN. Este ejemplo se encuentra relacionada con la validación genética de objetivo in vivo utilizando un modelo de tumor de próstata ortotópica en el cual puede mostrarse que al utilizar el siARN dirigido a la proteína quinasa N beta puede realizarse una reducción tanto de la metástasis del tumor primario como del nodo linfático. Los resultados se representan gráficamente en las Figuras 8A a 8C. En el diagrama de la Figura 8A, el volumen de tumores primarios, determinados como se describe en el ejemplo 1 , en un modelo de tumor de próstata ortotópica podría producirse significativamente utilizando cualquiera de las dos siguientes construcciones de siARN : 5'actgagcaagaggctttggag o 5'aaattccagtggttcattcca. Como control negativo, se utilizó el siARN contra la subunidad de p1 1 0-a y como control positivo, el siARN contra la subunidad de ?1 10-ß. Consecuentemente, el control positivo aborda el regulador corriente arriba de PTEN de proteína quinasa N beta. Un conjunto adicional de dos moléculas de siARN independientes fue utilizado para degradar la codificación de mARN para la proteína quinasa N beta en metástasis de nodo linfático. Las metástasis de nodo linfático son tumores secundarios encontrados en los siguientes nodos linfáticos: -Nodos linfáticos Caudales, Lumbares, Renales y mediastinales por los cuales los nodos linfáticos caudales se encuentran más próximos a los nodos linfáticos de próstata y mediastinales se encuentran más distantes al tumor de implante. Como en el caso del tumor primario, las construcciones de siARN obviamente fueron reduciendo exitosamente la codificación de mARN para la proteína quinasa N beta y consecuentemente reducir el volumen del tumor (Figura 8B) . Los controles positivo y negativo fueron como se describió en conexión con la reducción del tumor primario. En ambos casos, es decir, para metástasis de tumor y de nodo linfático, las células tumorosas de próstata humana se diseñaron genéticamente para expresar las moléculas de siARN respectivas a partir de un mejorador U6 de polimerasa I I I. Aparte de estos resultados, un análisis fenotípico claro como se representa gráficamente en la Figura 8C 1 y la Figura 8C2 muestras que después de la activación de la transcripción de la construcción de siARN en las células tumorosas de próstata humana, las metástasis de nodo linfático podrían reducirse significativamente y el nodo linfático hinchado representado gráficamente en la Figura 8C1 no se encuentra presente en el tejido tratado con siARN como se representa gráficamente en la Figura 8C2.
Ejemplo 9 : Caracterización funcional de la proteína qu i nasa N beta Este ejemplo se encuentra relacionado con la caracterización funcional de la proteína quinasa N beta y más particularmente con el impacto de la derivación, es decir, el truncamiento o mutación de residuos de aminoácido funcionales, de proteína quinasa N beta en su actividad de quinasa y en la regulación de su actividad de quinasa por fosforilación . Los siguientes derivados de proteína quinasa N beta se generaron como al menos parcialmente también se representa gráficamente en la Figura 9C con los residuos de aminoácidos referentes a la secuencia de tipo silvestre como se describe en la presente: a) dominio de quinasa que comprende los aminoácidos 535- 889; b) ?? que comprende los aminoácidos 288-889; c) dominio de quinasa que tiene una mutación en la posición 588 de Usina a arginina; d) dominio de quinasa que tiene una mutación en la posición 588 de lisina a ácido glutámico; e) derivados del dominio de quinasa que tienen mutaciones en el sitio de fosforilación (consenso de circuito de activación de AGC) con el residuo de treonina en la posición 718 de aminoácido sea cambiada a alanina (TA718) o a un ácido aspártico o ácido glutámico (TD71 8 o Te71 8); y f) molécula de PKNbeta de tipo silvestre de tamaño natural (889 aminoácidos). Los fragmentos respectivos se expresaron temporalmente en células de HeLa. Su expresión relativa se determinó por análisis sanguíneo Western de los extractos de células de HeLa utilizando un anticuerpo anti-PKNbeta. El antisuero de anti-PKNbeta policlonal se generó después de sobreexpresar los aminoácidos terminales en C (609-889) de PKNbeta en E.coli. El fragmento de proteína respectiva se purificó con gel a partir de cuerpos de inclusión, se recuperaron y concentraron de acuerdo con procedimientos convencionales. La proteína quinasa N beta tiene homologías a las moléculas de quinasa de tipo AGC en su dominio catalítico en el término C. La familia de quinasas se caracteriza por un residuo de treonina conservada en el circuito de activación del dominio catalítico que necesita fosforilarse para la actividad enzimática. Debido a la alta conservación de esta treonina y el contexto de aminoácidos circundantes en el circuito de activación, los anticuerpos anti-fosfo contra este sitio se encuentran disponibles por fuentes comerciales. Los anticuerpos respectivos son referidos como anti-P*-PRK en la Figura 9 y como anti-P*AGC quinasa en la Figura 10. MPB es la proteína básica de mileina la cual es un substrato de fosforilación in vitro convencional. Se obtuvieron los siguientes resultados: + :activo -: inactivo ¡= no se observó ninguna "hiperactivación" como uno pudiese esperar de mutaciones comparables en otras quinasas (Morgan y Debond, 1 994) Los resultados se representan gráficamente en la Figura 9. La Figura 9A muestra un análisis de gel de diferentes derivados de proteína quinasa N beta y sus actividades utilizando la MPB como un substrato de fosforilación convencional después de la sobreexpresión temporal en células de HeLa. Como puede apreciarse de la Figura 9A aparte de la proteína quinasa N beta de tamaño natural solamente el dominio de quinasa en su forma silvestre se encuentra activo en MPB de fosforilación. Utilizando los mismos derivados de proteína quinasa N beta puede observarse que excepto el derivado que comprende el dominio de quinasa que tiene la mutación T/A en la posición 718, los demás derivados desplegados se fosforilaron también independientemente de sus actividades intrínsecas adicionales. Los datos indican que la presencia de un dominio de quinasa funcional y fosforilación en la posición 71 8 son pre-requisitos para la actividad de quinasa de PKNbeta. Sin embargo, como puede concluirse de la incapacidad de la versión de ?? para actuar como quinasa, no son suficientes. Los datos indican también que la PKNbeta no se autofosforila en el aminoácido 71 8, sino que requiere fosforilación por otra molécula de quinasa, dado que la proteína muíante KR588 defectuosa de quinasa mantiene la fosforilación en la posición 71 8.
Ejem plo 1 0 : Caracterización de PKN beta de tamaño natural Con objeto de analizar las mutaciones de residuos de aminoácidos funcionales de la proteína quinasa N beta en el contexto de la molécula de tamaño natural, se llevaron a cabo los siguientes experimentos como se muestra en las Figuras 10 y 1 1 : Para medir la actividad de quinasa de la PKNbeta in vitro, los derivados de PKNbeta recombinante etiq uetada con HA- o Myc- se expresaron temporalmente en células de HeLa o COS-7. El derivado de dominio de equinasa más pequeña sirvió como control. Los extractos celulares con contenido de las versiones recombinantes de proteína quinasa N beta fueron analizados en paralelo con el anticuerpo de anti-proteína quinasa N beta (Figura 10A) como se describe en el Ejemplo 9 para demostrar niveles de expresión comparables, y un anticuerpo de sitio AGC anti-fosfo (referido también como anti-P*-AGC-quinasa)(Figura 10B) para mostrar el grado diferente de fosforilación de los derivados de proteína quinasa N beta in vivo.
Ejemplo 11: Requisitos de fosforilación para la actividad de la proteína quinasa N beta de tamaño natural y desarrollo de una prueba no radioactiva de quinasa in vitro - aplicabilidad de la proteina quinasa N beta para las pruebas de HTS. -Las moléculas derivadas de P Nbeta se inmuno-precipitaron de los extractos celulares mostrados en la Figura 10 utilizando los anticuerpos de anti-etiqueta. Los precipitados inmunes se enjuagaron como se describe (Klippei et al., 1996) y se dividieron en dos mitades. Una mitad se incubó con 5 g de MBP (UBI) como un substrato de fosforilación, 4 mM de MgCI2 y gamma 32P-TP en una solución regulada durante 10 minutos a temperatura ambiente. Además, los inhibidores de fosfatasa y los inhibidores contra quinasas que actúan no específicamente fueron agregadas como en Klippei et al., 1998. La incorporación de fosfato radioactivo se detectó por autoradiografía después de separar los productos de reacción por SDS-PAGE al 6% (Figura 11B). La segunda mitad de los precipitados inmunes se incubó con 1 pg de proteína de fusión GST-GSK3 (Cell Signaling Technology) como un substrato de fosforilación en presencia de 200 µ de rATP. La mezcla de reacción se analizó subsecuentemente por un gradiente de SDS-PAGE al 8-16% y análisis sanguíneo Western utilizando el anticuerpo GSK3alfa anti-fosfo (Cell Signaling Technology)(Figura 1 1 A) . El filtro se despojó después y se volvió a probar con un antisuero de anti-PKNbeta para confirmar la presencia de cantidades comparables de proteínas de PKNbeta en los precipitados inmunes respectivos (Figura 1 C). La especificidad de las reacciones de fosforilación in vitro se controló analizando las variantes defectuosas de quinasa (por ejemplo, con contenido de mutaciones en el sitio de unión de ATP, ver arriba) en paralelo a la proteína activa. La falta de señal en el caso de la variante de mutación de TA en el aminoácido 718 de la proteína quinasa N beta es de otra manera la proteína quinasa N beta de tipo silvestre de tamaño natural indica que este residuo de aminoácido se encuentra de hecho en la posición de fosforilación detectada por el anticuerpo (Figura 1 0B). El hecho de que las variantes deficientes en quinasa (mutación de KE o KR como se observa en la Figura 1 0 y la Figura 9, respectivamente) se fosforilan en este sitio indica que la treonina 71 8 no es un substrato para la autofosforilación. En cambio, otra quinasa en las células debe ser responsable de la fosforilación de este sitio; por lo que la PDK1 es una candidata posible. También, de este experimento en com binación con el de) ejemplo 9 se revela que la fosforilación de la proteína quinasa N beta en la posición 71 8 es un pre-requisito para la actividad de proteína quinasa N beta; todas las mutaciones probadas en este sitio evitaron la fosforilación y dieron como resultado un molécula de quinasa activa. A tal grado que una proteína quinasa N beta particularmente preferida que puede utilizarse en conexión con cualesquier aspectos de la invención como se describe en la presente es una proteína quinasa N beta que se fosforila en la posición 718 o un derivado de la misma, incluyendo el derivado que comprende el dominio de quinasa solamente como se describe en la presente. Los datos indican también que la PKNbeta de tamaño natural no se autofosforila en el aminoácido 718, sino que requiere la fosforilación por otra molécula de quinasa, dado que la proteína mutante de KE588 defectuosa de quinasa mantiene la fosforilación en la posición 71 8. Como puede observarse de la Figura 1 1 , probar la actividad de la proteína quinasa N beta puede adaptarse en un formato que permite la filtración de los inhibidores de proteína quinasa N beta en un sistema de alto rendimiento. En un primer paso, se determinó la aplicabilidad de un formato de filtración no radioactivo, por lo que los diversos derivados de proteína' quinasa N beta como ya se describió con anterioridad en conexión con el ejemplo 1 0, se utilizaron para fosforilar un substrato adecuado. Tal substrato puede, por ejemplo, ser la MBP o un péptido de GSK3 el cual se inmoviliza típicamente en un portador adecuado tal como cuentas de agarosa o sefarosa o en superficies plásticas. En el presente caso y como se representa gráficamente en la Figura 1 1 A, el substrato es un péptido derivado de GSK3 fusionado para la paramiosina. La primera hilera indica que todas las diversas pruebas que utilizan diferentes derivados de proteína quinasa N beta actualmente contuvieron dichos derivados. Solamente la proteína quinasa N beta de tipo silvestre de tamaño natural o el dominio de quinasa como se define en el ejemplo 9 fueron adecuados para fosforilar el substrato. El substrato fosforilado en el presente caso se detectó por el anticuerpo GSK alfa de antl-fosfo (anteriormente mencionado) Para asegurarse de que el planteamiento no radioactivo como se representa gráficamente en la Figura 1 1 A es suficientemente sensible se llevó a cabo el planteamiento radioactivo en paralelo con la mitad de precipitados inmunes utilizando la MBP como un substrato de fosforilación. La eficacia de la actividad de quinasa puede tomarse a partir de la .cantidad del substrato fosforilado generado como se indica por la autoradlografía después de la incorporación de [32P]. Como puede observarse a partir de las Figuras 1 1 A y 1 1 B, la proteína quinasa N beta de tipo silvestre de tamaño natural así como también el dominio de quinasa muestra actividad, mientras que no se detectó actividad alguna (Figura 1 1 A) ni actividad de fondo de las quinasas no específicas (Figura 1 1 B) con las proteínas mutantes KE de tamaño natural y TA de tamaño natural , respectivamente. Para resumir, el uso tanto de proteína quinasa N beta de tipo silvestre de tamaño natural así como también el dominio de quinasa como se describe en la presente, son objetivos adecuados o medios para el diseño de un procedimiento de filtración en formato HTS. Los pasos respectivos comprenderán consecuentemente a) generar proteína quinasa N beta recombinante purificada por expresión en un sistema de expresión no bacteriano tal como el sistema de células de insecto (ejemplo para una quinasa diferente en Klippel e al. , 1 997) en vista del hecho de que la proteína necesita fosforilarse para exhibir la actividad de quinasa, la cual no puede realizarse fácilmente por la expresión en un sistema bacteriano; b) inmovilización del substrato derivado de GSK-3 o substrato similar, e incubar el substrato con proteína quinasa N beta purificada en presencia de rATP, MgCI2 e inhibidores en una solución regulada; c) detectar la fosforilación del substrato por un medio de detección apropiado tal como un anticuerpo similar al anticuerpo anti-fosfo-GSK3 opcionalmente después de enjuagues seriales y opcionalmente después de desarrollar secuencialmente en los sistemas de pruebas Delfia o Lance (Perkin Elmer), por lo que el sitio de fosforilación se encuentra limitado por un anticuerpo etiquetado con Europio. La cantidad de Europio limitado se cuantifica después por el análisis de fluorescencia de resolución temporal.
Ejemplo 12: Determinación del nivel de expresión de PKN-beta endógena. En este ejemplo se brinda evidencia experimental de que la PKN-beta se expresa de manera dependiente a la Pl 3-quinasa. La expresión dependiente de la Pl 3-quinasa del ARN de PKNbeta mostrada en la Figura 3 se confirma aquí adicionalmente a nivel de proteína. Las células de PC-3 se cultivaron como se describe en el ejemplo 1 citado en la presente. Dichas células de PC-3 son PTEN -/-. Las células de HeLa se obtuvieron de la Colección de Cultivos Tipo Americano (ATCC) y se desarrollaron como se describe en Sternberger et al. (2002) . Las transfecciones se realizaron en placas de 1 0 cm (a una confluencia de 30% al 50%) utilizando Fugene 6 (Roche, Nutley, NJ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células cultivadas se tripsinaron y se cosecharon deteniendo el efecto de la tripsina por el medio. Ambos tipos de células, es decir, las células de PC-3 y las células de HeLa se trataron para los momentos indicados con 10µ? de LY294002 o DMSO, por lo que se utilizó DMSO como solvente para LY294002 y, debido a esto, como control negativo. Los extractos resultantes se fragmentaron por SDS-PAGE y se analizaron subsecuentemente por el análisis sanguíneo Western. Se detectaron los niveles de las proteínas indicadas tales como p1 1 0, las cuales sirvieron como control de carga, PKN-beta endógena y Akt fosforilada utilizando los anticuerpos respectivos. La Akt fosforilada (P*-Akt) sirve como control para la eficacia del tratamiento mediado con LY294002. Los resultados se representan gráficamente en la Figura 12. En las células de PC-3, la inhibición de Pl 3-quinasa ocasionó una reducción visible de la expresión de PKNbeta endógena después de 24 horas, los niveles de proteína se redujeron adicionalmente después de 48 horas de tratamiento. En las células de HeLa, que expresan cantidades mayores de proteína PKNbeta, este efecto es menos dramático, pero pueden detectarse cantidades reducidas después del tratamiento de 48 horas con LY 294002. De esto puede concluirse que la Pl 3-quinasa controla la expresión de PKN-beta.
Ejemplo 13: La actividad de PKN-beta requiere PI3-quinasa La PKN-beta de tipo silvestre recombinante o los derivados de PKN-beta (como se describe en las Figuras 10-11) se expresaron temporalmente en las células de HeLa. Dichos derivados fueron TA derivada y KE derivada de PKN-beta como se describe en el ejemplo 10 en la presente. La PKN-beta se modificó en cada caso por etiquetas con myc como se describió con anterioridad lo cual permitió la precipitación de PKN-beta y sus derivados utilizando un anticuerpo anti-Myc.
Para la evaluación de la actividad de PKN-beta se llevó a cabo una actividad de quinasa in vitro utilizando los precipitados inmunes como se describió con anterioridad. La mitad de los precipitados se sometió a la reacción de quinasa in vitro, la segunda mitad se analizó por el análisis sanguíneo Western utilizando anticuerpos anti-fosfo-PRK. El filtró se despojó y se volvió a probar utilizando el antisuero anti-PKN-beta. Los niveles de Quinasa p70 S6 se analizaron a partir de los alícuotas de Iisatos celulares, que se retiraron inicialmente, para confirmar la eficacia del tratamiento LY294002 incluso solamente después de un tratamiento de 3 horas. El anticuerpo anti-fosfo p70 se obtuvo de Cell Signaling. Como puede observarse a partir de la Figura 1 2, el tratamiento LY294002 conduce a una fuerte inhibición de la actividad de quinasa de PKN beta, medido aquí nuevamente por fosforilación de MBP. Este efecto fue visible solamente después de 3 horas de tratamiento, a una actividad de PKNbeta de 24 horas casi se inhibieron completamente. La fosforilación de PKNbeta en la posición 718 se comprometió también después de la inhibición de Pl 3-quinasa por LY294002, sin embargo, este efecto fue menos pronunciado que el efecto de la actividad de quinasa. El derivado de TA de la PKN-beta sirve como un control inactivo como se muestra con anterioridad , y como control para la especificidad del anticuerpo PRK anti-fosfo para la fosfo-treonina en la posición 71 8 (P*-PK). La KE derivada de PKN-beta sirve como control deficiente de quinasa como se describió con anterioridad . Su estado de fosforilación apareció también afectado en cierto grado por el tratamiento por LY294002. Esto indica que la quinasa, la cual es responsable de la fosforilación de la PKNbeta en la posición 718, lo hace de manera dependiente de la Pl 3-quinasa. Muy importantemente, este experimento muestra que PKNbeta no se regula solamente por la Pl 3-quinasa mediante su nivel de expresión (ver las Figuras 3 y 12), se regula también en su nivel de activación. Estos hallazgos indican que PKNbeta representa un objetivo corriente abajo "perfecto" para la interferencia con una trayectoria de Pl 3-quinasa hiperactiva para intervención terapéutica, dado que es necesariamente dependiente de la Pl 3-quinasa que se regula a diversos niveles. Esto permite la generación de compuestos los cuales exhiben un efecto distinto tanto en la proteína PKN-beta como en la codificación de ácido nucléico para la misma. Aún más importante, esta clase de modulación de actividad de PKN-beta en la traducción en lugar del nivel de transcripción, es decir, a nivel de la proteína expresada, parece ser más prominente y duradero que el impacto a nivel de transcripción. El método de filtración adicional de acuerdo con la presente invención se basa en esta búsqueda particular y utiliza preferentemente la prueba de quinasa in vitro radioactiva o no radioactiva como leída.
Ejemplo 14: Señales de localización de PKN-beta En este experimento la localización de diversos derivados de PKN-beta se comparó con la localización de PKN-beta de tipo silvestre. La Figura 14 muestra imágenes, mediante las cuales la distribución celular de PKNbeta y los derivados de la misma tales como PKNbeta de tipo silvestre (Figura 14A), TA derivada de PKN beta (Figura 14B) , KE derivada de PKN beta (Figura 14C) y deltaN de PKN beta (Figura 14D) se investigó por microscopía de fluorescencia confocoal. Los derivados recombinantes etiquetados con HA de PKNbeta se expresaron temporalmente en células de HeLa durante 48 horas. Después de la fijación y la permeabilización, la expresión de las proteínas recombinantes se detectó utilizando un anticuerpo anti-HA seguido de un anticuerpo de anti-ratón conjugado con FITC . Las células se contratiñeron al etiquetar la actina citoesquelética con rodamina-faloidina. Los resultados se representan gráficamente en las Figuras 14A a 14D, por lo que la imagen respectiva en cada costado izquierdo del doble de imágenes se encuentra relacionada con una imagen de células después de la excitación específica de FITC y la imagen derecha ilustra las mismas células después de la excitación utilizando una longitud de onda específica para la rodamina-faloidina. El teñido de FITC indica las células transfectadas con la proteína recombinante respectiva. . El teñido de Rodamina-faloidina muestra células transfectadas y no transfectadas. Como puede observarse a partir de la Figura 14A, la PKN- beta de tipo silvestre se ubica predominantemente en el núcleo de las células. El muíante de sitio de fosforilación de TA de PKN-beta y el muíante de KE, ambos son deficieníes de quinasa, no se encuentran concentrados más al interior del núcleo en comparación con la PKN-beta de tipo silvestre, sino que se encuentran dispersos en toda la célula. Finalmente, como se representa gráficamente en la Figura 14D, el derivado de PKN-beta ??, que carece de la íercera ferminal en N de la molécula y también de quinasa defectuosa (ver la Figura 9), se excluye esencialmente del núcleo. Estos datos indican que la localización nuclear apropiada de PKNbeta al núcleo es dependiente de su capacidad para acíuar como una molécula de quinasa activa e implica la presencia de su dominio terminal en N. Esto implica que la Pl 3-quinasa puede regular también su ubicación celular. Las caracterísíicas de la presente invención descritas en la especificación , el listado de secuencias, las reivindicaciones y/o los dibujos pueden separadamente y en cualquier combinación de los mismos ser material para realizar la invención en diversas formas de los mismos.'

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1 . Uso in vitro de la proteína quinasa N beta o un fragmento o derivado de la misma, por el que tal fragmento o derivado realiza los efectos de la proteína quinasa N beta, como un objetivo corriente debajo de la trayectoria de Pl 3-quinasa, preferentemente como un objetivo de droga corriente debajo de la trayectoria de Pl 3-quinasa. 2. Uso de una proteína quinasa N beta o un fragmento o derivado de la misma, por el que tal fragmento o derivado de la misma realiza los efectos de una proteína quinasa N beta, como un objetivo corriente debajo de la trayectoria de Pl 3-quinasa en un proceso de filtración. 3. Uso de la proteína quinasa N beta o un fragmento o derivado de la misma, por el que tal fragmento o derivado de la misma realiza los efectos de la proteína quinasa N beta para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad, donde la enfermedad se selecciona a partir del grupo que comprende cánceres metastáticos y cualquier condición patológica que implique la trayectoria de Pl 3-quinasa, donde tai condición patológica comprende cáncer endometrial, carcinomas colorectales, gliomas, adenocarcinomas, hiperplasias endometriales, s índrome de Cowden, carcinoma colorectal de no poliposis hereditario, síndrome de Li-Fraumene, cáncer de pecho-ovarios, cáncer de próstata, síndrome de Bannayan-Zonana, LDD (síndrome de Lhermitte-Duklos) enfermedades de harmatoma-macrocefalia que incluyen la enfermedad de Cow (CD) y síndrome de Bannayan-Ruvalcaba-Rily (BRR), lesiones mucocutáneas tales como triquilemonas, macrocefalia, retardo mental, harmatomas gastrointestinales, lipomas, adenomas tiroides, enfermedad fibrocística del pecho, gangliocitoma displástica cerebelar, y malignidades de pecho y tiroides. 4. Uso de proteína quinasa N beta o un fragmento o derivado de la misma, por el que tal fragmento o derivado de la misma realiza los efectos de la proteína quinasa N beta, para la elaboración de un agente de diagnóstico para el diagnóstico de una enfermedad, donde la enfermedad se selecciona a partir del grupo que comprende cánceres metastáticos y condiciones patológicas que involucran la trayectoria de Pl 3-quinasa, donde tal condición patológica comprende cáncer endometrial, carcinomas coforectales, gliomas, adenocarcinomas, hiperplasias endometriales, s índrome de Cowden, carcinoma colorectal de no poliposis hereditario, s índrome de Li-Fraumene, cáncer de pecho-ovarios, cáncer de próstata, síndrome de Bannayan-Z-onana, LDD (síndrome de Lhermitte-Duklos) enfermedades de harmatoma-macrocefalia que incluyen la enfermedad de Cow (CD) y síndrome de Bannayan-Ruvalcaba-Rily (BRR), lesiones mucocutáneas tales como triquilemonas, macrocefalia, retardo mental, harmatomas gastrointestinales, lipomas, adenomas tiroides, enfermedad fibrocística del pecho, gangliocitoma displástica cerebelar, y malignidades de pecho y tiroides. 5. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la proteína quinasa N beta tiene una secuencia de aminoácido de acuerdo con el NO DE I D DE SEC: 1 o de acuerdo con el acceso al banco de datos PID g7019489 o acceso de banco de datos gi701 9489, o una parte o derivado del mismo. 6. Uso de codificación de ácido nucléico para la proteína quinasa N beta, o un fragmento o derivado de la misma, por el que tal fragmento o derivado realiza los efectos de la proteína quinasa N beta, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad, donde la enfermedad se selecciona a partir del grupo que comprende cánceres metastáticos y cualesquier condiciones patológicas que involucran la trayectoria de Pl 3-quinasa, donde tal condición patológica comprende cáncer endometrial, carcinomas colorectales, gliomas, adenocarcinomas, hiperplasias endometriales, síndrome de Cowden , carcinoma colorectal de no poliposis hereditario, síndrome de Li-Fraumene, cáncer de pecho-ovarios, cáncer de próstata, síndrome de Bannayan-Zonana, LDD (síndrome de Lhermitte-Duklos) enfermedades de harmatoma-macrocefalia que incluyen la enfermedad de Cow (CD) y síndrome de Bannayan-Ruvalcaba-Rily (BRR), lesiones mucocutáneas tales como triquilemonas, macrocefalia, retardo mental, harmatomas gastrointestinales, lipomas, adenomas tiroides, enfermedad fibrocística del pecho, - gangliocitoma displástica cerebelar, y malignidades de pecho y tiroides. 7. Uso de codificación de ácido nucléico para la proteína quinasa N beta, o un fragmento o derivado de la misma, por el que tal fragmento o derivado realiza los efectos de la proteína quinasa N beta, para la elaboración de un agente de diagnóstico para el diagnóstico de una enfermedad, donde la enfermedad se selecciona a partir del grupo que comprende cánceres metastáticos y cualesquier condiciones patológicas que involucran la trayectoria de Pl 3-quinasa, donde tal condición patológica comprende cáncer endometrial, carcinomas coloréeteles, gliomas, adenocarcinomas, iperplasias endometriales, síndrome de Cowden , carcinoma colorectal de no poliposis hereditario, síndrome de Li-Fraumene, cáncer de pechóovarios, cáncer de próstata, síndrome de Bannayan-Zonana, LDD (síndrome de Lhermitte-Duklos) enfermedades de harmatoma-macrocefalia que incluyen la enfermedad de Cow (CD) y síndrome de Bannayan-Ruvaicaba-Rily (BRR), lesiones mucocutáneas tales como triquilemonas, macrocefalia, retardo mental , harmatomas gastrointestinales, lipomas, adenomas tiroides, enfermedad fibrocística del pecho, gangliocitoma displástica cerebelar, y malignidades de pecho y tiroides. 8. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la proteína quinasa N beta tiene una secuencia de aminoácido de acuerdo con el NO DE ID DE SEC: 1 o de acuerdo con el acceso de banco de datos PI D g7019489 o el acceso de banco de datos gi 7019489, o una parte o derivado de la misma. 9. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, donde el ácido nucleico es un ácido nucléico de acuerdo con el NO DE ID DE SEC: 2 o de acuerdo con los accesos del banco de datos gi 7019488 o N _01335, preferentemente M_01 335.1 . 1 0. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 6, 7 u 8, donde la proteína quinasa N beta se codifica por un ácido nuciéico de acuerdo con el NO DE ID DE SEC: 2 o de acuerdo con los accesos del banco de datos gi 7019488 o NM_01335, preferentemente NM_01335.1 . 1 1 . El uso según la reivindicación 6 a 7, donde la secuencia de ácido nuciéico, pero para la degeneración del código genético hibridizarían al ácido nuciéico como se especifica en la reivindicación 6 o 7. 1 2. El uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la secuencia de ácido nuciéico es una secuencia nucléica que se hibridiza bajo condiciones astringentes a la secuencia de ácido nuciéico o parte de la misma, de acuerdo con el NO DE ID DE SEC: 2 o de acuerdo con los accesos de banco de datos gi 701 9488 o NM_01 335, preferentemente N _01 335.1 . 13. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 12; donde la enfermedad se caracteriza porque las células se encuentran involucradas en dicha enfermedad carecen de actividad de PTEN , muestran un creciente comportamiento agresivo, o son células de un tumor de etapa tardía. 14. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 13, donde la enfermedad es un tumor de etapa tardía. 15. Un método para la filtración de un agente para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad y/o para la elaboración de un agente de diagnóstico para el diagnóstico de una enfermedad, por lo que la enfermedad se selecciona a partir del grupo que comprende cánceres metastáticos y cualesquier condiciones patológicas que implica la trayectoria de Pl 3-quinasa que comprende los pasos: a) proporcionar un compuesto candidato, b) proporcionar un sistema de expresión para la proteína de quinasa N beta y/o un sistema que detecta la actividad de proteína de quinasa N beta; c) contactar el compuesto candidato con el sistema de expresión para la proteína de quinasa N beta y/o el sistema que detecta la actividad de la proteína de quinasa N beta; d) determinar si la expresión y/o la actividad de la proteína de quinasa N beta se cambia bajo la influencia del compuesto candidato. 16. Método según la reivindicación 1 5, caracterizado porque el ' compuesto candidato se encuentra contenido en una biblioteca de los compuestos. 17. El método según la reivindicación 15 o 16, caracterizado porque el compuesto candidato se selecciona a partir del grupo de clases de compuestos que comprende péptidos, proteínas, anticuerpos, anticalinas, ácidos nucléicos funcionales, compuestos naturales y pequeñas moléculas. 18. El método según la reivindicación 17, caracterizado porque los ácidos nucléicos funcionales se seleccionan a partir del grupo que comprende aptámeros, aptazimas, ribozimas, spiegelmeros, oligonucleótidos de antidetección y s i'ARN. 1 9. Uso de proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, por el que tal fragmento o derivado de la misma realiza los efectos de la proteína quinasa N beta, y/o el ácido nucléico o una parte o derivado del mismo que codifica para la proteína quinasa N beta como molécula de objetivo para el desarrollo de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad y/o para el desarrollo de un agente de diagnóstico para el diagnóstico de una enfermedad, por lo que la enfermedad se selecciona a partir del grupo que comprende cánceres metastáticos y cualesquier condiciones patológicas .que involucran la trayectoria de Pl 3-quinasa. 20. El uso según la reivindicación 1 9, caracterizado porque el medicamento y/o el agente de diagnóstico comprende un agente, el cual se selecciona a partir del grupo que comprende anticuerpos, péptidos, anticalinas, moléculas pequeñas, moléculas de antidetección, aptámeros, spiegelmeros y moléculas de ARNi. 21 . El uso según la reivindicación 20, caracterizado porque el agente interactúa con la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma. 22. El uso según la reivindicación 20, caracterizado porque el agente interactúa con la codificación de ácido nucléico para la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, en particular con mARN, ácido nucléico genómico o cADN para la proteína quinasa N beta. 23. Uso de un polipéptido el cual interactúa con la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, para el desarrollo de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad, donde la enfermedad se selecciona a partir del grupo que comprende cánceres metastáticos y cualesquier condiciones patológicas que involucran la trayectoria de Pl 3-quinasa, donde tal condición patológica comprende cáncer endometrial, carcinomas colorectales, gliomas, adenocarcinomas, hiperplasias endometriales, síndrome de Cowden, carcinoma colorectal de no poliposis hereditario, síndrome de Li-Fraumene, cáncer de pecho-ovarios, cáncer de próstata, síndrome de Bannayan-Zonana, LDD (s índrome de Lhermitte-Duklos) enfermedades de harmatoma-macrocefalia que incluyen la enfermedad de Cow (CD) y síndrome de Bannayan-Ruvalcaba-Rily (BRR) , lesiones mucocutáneas tales como triquilemonas, macrocefalia, retardo mental, harmatomas gastrointestinales, lipomas, adenomas tiroides, enfermedad fibrocística del pecho, gangliocitoma displástica cerebelar, y malignidades de pecho y tiroides, y donde el polipéptido se selecciona a partir del grupo, el cual comprende anticuerpos contra la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma y los polipéptidos que unen la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma 24. Uso de polipéptido el cual interactúa con la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, para el desarrollo de un agente de diagnóstico para el diagnóstico de una enfermedad, donde la enfermedad se selecciona a partir del grupo que comprende cánceres metastáticos y cualesquier condiciones patológicas que involucran la trayectoria de Pl 3-quinasa, donde tal condición patológica comprende cáncer endometrial, carcinomas colorectales, gliomas, adenocarcinomas, hiperplasias endometriales, síndrome de Cowden, carcinoma colorectal de no pollposis hereditario, síndrome de U-Fraumene, cáncer de pecho-ovarios, cáncer de próstata, síndrome de Bannayan-Zonana, LDD (síndrome de Lhermitte-Duklos) enfermedades de harmatoma-macrocefalia que incluyen la enfermedad de Cow (CD) y síndrome de Bannayan-Ruvalcaba-Rily (BRR), lesiones mucocutáneas tales como triquilemonas, macrocefalia, retardo mental, harmatomas gastrointestinales, lipomas, adenomas tiroides, enfermedad fibrocística del pecho, gangliocitoma displástica cerebelar, y malignidades de pecho y tiroides, y donde el polipéptido se selecciona a partir del grupo, el cual comprende anticuerpos contra la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma y polipéptidos de unión de la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma. 25. Uso de un polipéptido el cual interactúa con ' la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, para la elaboración- de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad , donde la enfermedad se selecciona a partir del grupo que comprende cánceres metastáticos y cualesquier condiciones patológicas que involucran la trayectoria de Pl 3-quinasa, donde tal condición patológica comprende cáncer endometrial, carcinomas colorectales, gliomas, adenocarcinomas, hiperplasias endometriales, síndrome de Cowden, carcinoma colorectal de no poliposis hereditario, síndrome de Li-Fraumene, cáncer de pecho-ovarios, cáncer de próstata, síndrome de Bannayan-Zonana, LDD (síndrome de Lhermitte-Duklos) enfermedades de harmatoma-macrocefalia que incluyen la enfermedad de Cow (CD) y síndrome de Bannayan-Ruvalcaba-Rily (BRR) , lesiones mucocutáneas tales como triquilemonas, macrocefalia, retardo mental, harmatomas gastrointestinales, lipomas, adenomas tiroides, enfermedad fibrocística del pecho, gangliocitoma displástica cerebelar, y malignidades de pecho y tiroides, y donde el polipéptido se selecciona a partir del grupo, el cual comprende anticuerpos contra la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma y polipéptidos de unión de la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma. 26. Uso de un polipéptido el cual interactúa con la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, para la elaboración de un agente de diagnóstico para el diagnóstico de una enfermedad, donde la enfermedad se selecciona a partir del grupo que comprende cánceres metastáticos y cualesquier condiciones patológicas que involucran la trayectoria de Pl 3-quinasa, donde tal condición patológica comprende cáncer endometrial, carcinomas colorectales, gliomas, adenocarcinomas, hiperplasias endometriales, síndrome de Cowden, carcinoma colorectal de no poliposis hereditario, síndrome de Li-Fraumene, cáncer de pecho-ovarios, cáncer de próstata, síndrome de Bannayan-Zonana, LDD (síndrome de Lhermitte-Duklos) enfermedades de harmatoma-macrocefalia que incluyen la enfermedad de Cow (CD) y síndrome de Bannayan-Ruvalcaba-Rily (BRR) , lesiones mucocutáneas tales como triquilemonas, macrocefalia, retardo mental, harmatomas gastrointestinales, lipomas, adenomas tiroides, enfermedad fibrocística del pecho, gangliocitoma displástica cerebelar, y malignidades de pecho y tiroides, y donde el polipéptido se selecciona a partir del grupo, el cual comprende anticuerpos contra la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma y polipéptidos de unión de la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma. 27. Uso de un ácido nucléico el cual interactúa con la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, para el desarrollo de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad y/o para la elaboración de un agente de diagnóstico para el diagnóstico de una enfermedad, donde la enfermedad se selecciona a partir del grupo que comprende cánceres metastáticos y cualesquier condiciones patológicas que involucran la trayectoria de Pl 3-quinasa, donde tal condición patológica comprende cáncer endometrial, carcinomas coloréeteles, gliomas, adenocarcinomas, hiperplasias- endometriales, síndrome de Cowden, carcinoma colorectal de no pollposis hereditario, síndrome de Li-Fraumene, cáncer de pecho-ovarios, cáncer de próstata, síndrome de Bannayan-Zonana, LDD (síndrome de Lhermitte-Duklos) enfermedades de harmatoma-macrocefalia que incluyen la enfermedad de Cow (CD) y síndrome de Bannayan-Ruvalcaba-Rily (BRR), lesiones mucocutáneas tales como triquilemonas, macrocefalia, retardo mental, harmatomas gastrointestinales, lipomas, adenomas tiroides, enfermedad fibrocística del pecho, gangliocitoma displástica cerebelar, y malignidades de pecho y tiroides, y donde el ácido nucléico se selecciona a partir del grupo, el cual comprende aptámeros y spiegelmeros. 28. Uso de un ácido nucléico el cual interactúa con la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, para el desarrollo de un agente de diagnóstico para el diagnóstico de una enfermedad, donde la enfermedad se selecciona a partir del grupo que comprende cánceres metastáticos y cualesquier condiciones patológicas que involucran la trayectoria de Pl 3-quinasa, donde tal condición patológica comprende cáncer endometrial, carcinomas colorectales, gliomas, adenocarcinomas, hiperplasias endometriales, síndrome de Cowden, carcinoma colorectal de no poliposis hereditario, síndrome de Lí-Fraumene, cáncer de pecho-ovarios, cáncer de próstata, síndrome de Bannayan-Zonana, LDD (síndrome de Lhermitte-Duklos) enfermedades de harmatoma-macrocefalia que incluyen la enfermedad de Cow (CD) y síndrome de Bannayan-Ruvalcaba-Rily (BRR), lesiones mucocutáneas tales como triquilemonas, macrocefalia, retardo mental, harmatomas gastrointestinales, lipomas, adenomas tiroides, enfermedad fibrocística del pecho, gangliocitoma displástica cerebelar, y malignidades de pecho y tiroides, y donde el ácido nucléico se selecciona a partir del grupo que comprende aptámeros y spiegelmeros. 29. Uso de un ácido nucléico el cual interactúa con la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad y/o para la elaboración de un agente de diagnóstico para el diagnóstico de una enfermedad, donde la enfermedad se selecciona a partir del grupo que comprende cánceres metastáticos y cualesquier condiciones patológicas que involucran la trayectoria de Pl 3-quinasa, donde tal condición patológica comprende cáncer endometrial , carcinomas colorectales, gliomas, adenocarcinomas, hiperplasias endometriales, síndrome de Cowden , carcinoma colorectal de no poliposis hereditario, síndrome de Li-Fraumene, cáncer de pecho-ovarios, cáncer de próstata, síndrome de Bannayan-Zonana, LDD (síndrome de Lhermitte-Duklos) enfermedades de harmatoma-macrocefalia que incluyen la enfermedad de Cow (CD) y síndrome de Bannayan-Ruvalcaba-Rily (BRR), lesiones mucocutáneas tales como triquilemonas, macrocefalia, retardo mental, harmatomas gastrointestinales, lipomas, adenomas tiroides, enfermedad fibrocística del pecho, gangliocitoma displástica cerebelar, y malignidades de pecho y tiroides, y donde el ácido nucléico se selecciona a partir del grupo que comprende aptámeros y spiegelmeros. 30. Uso de un ácido nucléico el cual interactúa con la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, para la elaboración de un agente de diagnóstico para el diagnóstico de una enfermedad, donde la enfermedad se selecciona a partir del grupo que comprende cánceres metastáticos y cualesquier condiciones patológicas que involucran la trayectoria de Pl 3-quinasa, donde tal condición patológica comprende cáncer endometrial, carcinomas colorectales, gliomas, adenocarcinomas, hiperplasias endometriales, síndrome de Cowden , carcinoma colorectal de no poliposis hereditario, síndrome de Li-Fraumene, cáncer de pecho-ovarios, cáncer de próstata, síndrome de Bannayan-Zonana, LDD (síndrome de Lhermitte-Duklos) enfermedades de harmatoma-macrocefalia que incluyen la enfermedad" de Cow (CD) y síndrome de Bannayan-Ruvalcaba-Rily (BRR), lesiones mucocutáneas tales como triquilemonas, macrocefalia, retardo mental, harmatomas gastrointestinales, lipomas, adenomas tiroides, enfermedad fibrocística del pecho, gangliocitoma displástica cerebelar, y malignidades de pecho y tiroides, y donde el ácido nucléico se selecciona a partir del grupo que comprende aptámeros y spiegelmeros. 31 . Uso de un ácido nucléico el cual interactúa con una codificación de ácido nucléico para la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, para el desarrollo de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad, donde la enfermedad se selecciona a partir del grupo que comprende cánceres metastáticos y cualesquier condiciones patológicas que involucran la trayectoria de Pl 3-quinasa, donde tal condición patológica comprende cáncer endometrial, carcinomas coloréeteles, gliomas, adenocarcinomas, hiperplasias endometriales, síndrome de Cowden, carcinoma colorectal de no poliposis hereditario, síndrome de Li-Fraumene, cáncer de pecho-ovarios, cáncer de próstata, síndrome de Bannayan-Zonana, LDD (síndrome de Lhermitte-Duklos) enfermedades de harmatoma-macrocefalia que incluyen la enfermedad de Cow (CD) y síndrome de Bannayan-Ruvalcaba-Rily (BRR) , lesiones mucocutáneas tales como triquilemonas, macrocefalia, retardo mental, harmatomas gastrointestinales, lipomas, adenomas tiroides, enfermedad fibrocística del pecho, gangliocitoma displástica cerebelar, y malignidades de pecho y tiroides, y donde el ácido nucléico de interacción es un oligonucleótido de antidetección, una ribozima y/o siARN. 32. Uso de un ácido nucléico el cual interactúa con una codificación de ácido nucléico para la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, para el desarrollo de un agente de diagnóstico , para el diagnóstico de una enfermedad, donde la enfermedad se selecciona a partir del grupo que comprende cánceres metastáticos y cualesquier condiciones patológicas que involucran la trayectoria de Pl 3-quinasa, donde tal condición patológica comprende cáncer endometrial, carcinomas colorectales, gliomas, adenocarcinomas, hiperplasias endometriales, síndrome de Cowden, carcinoma colorectal de no políposis hereditario, síndrome de Li-Fraumene, cáncer de pecho-ovarios, cáncer de próstata, síndrome de Bannayan-Zonana, LDD (síndrome de Lhermitte-Duklos) enfermedades de harmatoma-macrocefalia que incluyen la enfermedad de Cow (CD) y síndrome de Bannayan-Ruvalcaba-Rily (BRR) , lesiones mucocutáneas tales como triquilemonas, macrocefalia, retardo mental, harmatomas gastrointestinales, lipomas, adenomas tiroides, enfermedad fibrocística del pecho, gangliocitoma displástica cerebelar, y malignidades de pecho y tiroides, y donde el ácido nucléico de interacción es un oligonucleótido de antidetección, una ribozima y/o siARN . 33. Uso de un ácido nucléico el cual interactúa con una codificación de ácido nucléico para la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad, donde la enfermedad se selecciona a partir del grupo que comprende cánceres metastáticos y cualesquier condiciones patológicas que involucran la trayectoria de Pl 3-quinasa, donde tal condición patológica comprende cáncer endometrial, carcinomas colorectales, gliomas, adenocarcinomas, hiperplasias endometrtales, síndrome de Cowden, carcinoma colorectal de no poliposis hereditario, síndrome de Li-Fraumene, cáncer de pecho-ovarios, cáncer de próstata, síndrome de Bannayan-Zonana, LDD (síndrome de Lhermitte-Duklos) enfermedades de harmatoma-macrocefalia que incluyen la enfermedad de Cow (CD) y síndrome de Bannayan-Ruvalcaba-Rily (BRR), lesiones mucocutáneas tales como triquilemonas, macrocefalia, retardo mental, harmatomas gastrointestinales, lipomas, adenomas tiroides, enfermedad fibrocística del pecho, gangliocitoma displástica cerebelar, y malignidades de pecho y tiroides, y donde el ácido nucléico de interacción es un oligonucleótido de antidetección, una ribozima y/o siARN. 34. Uso de un ácido nucléico el cual interactúa con una codificación de ácido nucléico para la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, para la elaboración de un agente de diagnóstico para el diagnóstico de una enfermedad, donde la enfermedad se selecciona a partir del grupo que comprende cánceres metastáticos y cualesquier condiciones patológicas que involucran la trayectoria de Pl 3-quinasa, donde tal condición patológica comprende cáncer .endometrial, carcinomas colorectales, gliomas, adenocarcinomas, hiperplasias endometriales, síndrome de Cowden, carcinoma colorectal de no poliposis hereditario, síndrome de Li-Fraumene, cáncer de pecho-ovarios, cáncer de próstata, síndrome de Bannayan-Zonana, LDD (síndrome de Lhermitte-Duklos) enfermedades de harmatoma-macrocefalia que incluyen la enfermedad de Cow (CD) y síndrome de Bannayan-Ruvalcaba-Rily (BRR) , lesiones mucocutáneas tales como triquilemonas, macrocefalia, retardo mental, harmatomas gastrointestinales, lipomas, adenomas tiroides , enfermedad fibrocística del pecho, gangliocitoma displástica cerebelar, y malignidades de pecho y tiroides, y donde el ácido nucléico de interacción es un oligonucleótido de antidetección, una ribozima y/o siARN. 35. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 34, caracterizado porque la codificación de ácido nucléico para la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma es el cADN, mARN o hnARN. 36. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 9 a 35, donde la proteína quinasa N beta y/o la codificación de ácido nucléico para la proteína quinasa N beta es la descrita en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14. 37. El método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 1 8, donde la proteína quinasa N beta y/o la codificación de ácido nucléico para la proteína quinasa N beta es la descrita en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14. 38. Uso de un juego para la caracterización de una enfermedad o una condición que se selecciona a partir del grupo que comprende cánceres metastáticos y cualesquier condiciones patológicas que involucran la trayectoria de Pl 3-quinasa, donde tal juego comprende al menos un agente el cual se selecciona a partir del grupo que comprende proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, donde tal fragmento o derivado realiza los efectos de la proteína quinasa N beta, los anticuerpos específicos para la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, donde tal fragmento o derivado realiza los efectos de la proteína quinasa N beta, los polipéptidos interactúan con la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, donde tal fragmento o derivado realiza los efectos de la proteína quinasa N beta, los polipéptidos interactúan con una codificación de ácido nucléico para la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, donde tal fragmento o derivado realiza los efectos de la proteína quinasa N beta, los ácidos nucléicos que interactúan con la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, donde tal fragmento o derivado realiza los efectos de la proteína quinasa N beta, los ácidos nucléicos interactúan con una codificación de ácido nucléico para la proteína quinasa N beta o una parte o derivado de la misma, donde tal fragmento o derivado realiza los efectos de la proteína quinasa N beta, y opcionalmente al menos otro compuesto.
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