CN1674929B - 蛋白激酶Nβ的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白激酶Nβ或其片段或衍生物作为PI3-激酶途径的下游靶、优选作为PI3-激酶途径的下游药靶的应用。

Description

蛋白激酶Nβ的应用
本发明涉及蛋白激酶Nβ的应用。 
现代药物开发不再依赖于或多或少试探的方法，而典型地包含阐明构成疾病或症状基础的分子机制，鉴定候选靶分子和评估所述靶分子。一旦可获得这样证实的靶分子(在本文中也称作靶)，可以检验针对其的候选药物。在很多情形中，这些候选药物是可以由合成或天然化合物组成的化合物文库的成员。组合文库的使用也很常见。这些化合物文库在本文中还称为候选化合物文库。尽管过去该方法已经证明是成功的，它仍然耗时费钱。当前将不同技术用于靶鉴定和靶证实。 
仍然有许多肿瘤和癌是人类健康的大威胁。为了产生更安全和更有效的具有更小副作用的药物，必须了解经适当化合物处理后可特异性地或选择性地影响它们的活性或存在的靶分子。因为可以是潜在或候选药物的化合物与靶之间的优选地选择性和特异性相互作用，靶在疾病或疾病症状如例如癌、肿瘤发生和转移中的功能可能被影响，因此疾病被治疗或预防和疾病症状被改善。 
因此构成本发明基础的问题是提供适于用于肿瘤发生和癌的治疗中治疗方法的靶。构成本发明基础的另一问题是提供涉及肿瘤发生和转移的靶。 
构成本发明基础的问题在第一方面通过将蛋白激酶Nβ或其片段或衍生物用作PI 3-激酶途径的下游靶、优选作为PI 3-激酶途径的下游药靶来解决。 
构成本发明基础的问题在第二方面通过将蛋白激酶Nβ或其片段或衍生物用于制备治疗和/或预防疾病的药物和/或制备用于诊断疾病的诊断剂来解决，其中疾病选自包含癌、转移癌和与PI 3-激酶途径有关的任何病理症状的组。 
在按照本发明第一和第二方面的应用的实施方案中，蛋白激酶Nβ具有按照SEQ ID NO.1或按照数据库登记号PID g7019489或数据库登记号 gi 7019489的氨基酸序列，或其部分或衍生物。 
构成本发明基础的问题在第三方面通过将编码蛋白激酶Nβ或其片段或衍生物的核酸用于治疗和/或预防疾病和/或制备用于诊断疾病的诊断剂来解决，其中疾病选自包含癌、转移癌和与PI 3-激酶途径有关的任何病理症状的组。 
在按照本发明第三方面的应用的实施方案中，蛋白激酶Nβ具有按照SEQ ID NO.1或按照数据库登记号PID g7019489或数据库登记号gi7019489的氨基酸序列，或其部分或衍生物。 
在按照本发明第三方面的应用的实施方案中，核酸是按照SEQ ID NO.2或按照数据库登记号gi 7019488或NM_01335、优选NM_01335.1的核酸。 
在按照本发明任一方面的应用的另一个实施方案中，蛋白激酶Nβ由按照SEQ ID NO.2或按照数据库登记号gi 7019488或NM_01335、优选NM_01335.1的核酸编码。 
在按照本发明第三方面的应用的优选实施方案中，由于遗传密码的简并性核酸序列将与按照本发明第三方面的本发明的核酸杂交。 
在按照本发明任一方面的应用的另一个实施方案中，核酸序列是在严谨条件下与按照SEQ ID NO.2或按照数据库登记号gi 7019488或NM_01335、优选NM_01335.1的核酸序列或其部分杂交的核酸序列。 
在按照本发明任一方面的应用的优选实施方案中，疾病的特征在于与所述疾病有关的细胞缺少PTEN活性，显示增加的攻击行为，或是晚期肿瘤细胞。 
在按照本发明第三方面的应用的更优选的实施方案中，疾病是晚期肿瘤。 
构成本发明基础的问题在第四方面通过筛选治疗和/或预防疾病和/或制备用于诊断疾病的诊断剂的试剂的方法来解决，其中疾病选自包含癌、转移癌和与PI 3-激酶途径有关的任何病理症状的组，其包含以下步骤： 
a)提供候选化合物， 
b)提供蛋白激酶Nβ的表达系统和/或检测蛋白激酶Nβ活性的系统； 
c)将候选化合物与蛋白激酶Nβ的表达系统和/或检测蛋白激酶Nβ 活性的系统接触； 
d)确定蛋白激酶Nβ的表达和/或活性是否在候选化合物的影响下改变。 
在按照本发明第四方面的方法的实施方案中，候选化合物包含在化合物文库中。 
在按照本发明第四方面的方法的另一个实施方案中，候选化合物选自包含肽，蛋白质，抗体，抗促成素(anticaline)，功能核酸，天然化合物和小分子的各类化合物的组。 
在按照本发明第四方面的方法的优选实施方案中，功能核酸选自包含适体(aptamer)，适配酶(aptazyme)，核酶，spiegelmer，反义寡核苷酸和siRNA的组。 
在按照本发明第四方面的方法的另一优选实施方案中，蛋白激酶Nβ或编码蛋白激酶Nβ的核酸是与本发明其它任何方面有关描述的那些。 
构成本发明基础的问题在第五方面通过将蛋白激酶Nβ或其片段或衍生物和/或编码蛋白激酶Nβ的核酸或其部分或衍生物用作开发和/或制备治疗和/或预防疾病的药物和/或制备用于诊断疾病的诊断剂的靶分子来解决，其中疾病选自包含癌、转移癌和与PI 3-激酶途径有关的任何病理症状的组。 
在按照本发明第五方面的应用的实施方案中，药物和/或诊断剂包含试剂，其选自由包含抗体，肽，抗促成素，小分子，反义分子，适体，spiegelmer和RNAi分子的组。 
在按照本发明第五方面的应用的优选实施方案中，试剂与蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用。 
在按照本发明第五方面的应用的备选实施方案中，试剂与编码蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸，特别是与蛋白激酶Nβ的mRNA、基因组核酸或cDNA相互作用。 
构成本发明基础的问题在第六方面通过将与蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用的多肽用于开发或制备治疗和/或预防疾病的药物和/或制备用于诊断疾病的诊断剂来解决，其中疾病选自包含癌、转移癌和与PI 3-激酶途径有关的任何病理症状的组。 
在按照本发明第六方面的应用的实施方案中，多肽选自由以下各项组成的组：针对蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的抗体和结合蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的多肽。 
构成本发明基础的问题在第七方面通过将与蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用的核酸用于开发或制备治疗和/或预防疾病的药物和/或制备用于诊断疾病的诊断剂来解决，其中疾病选自包含癌、转移癌和与PI 3-激酶途径有关的任何病理症状的组。 
在按照本发明第七方面的应用的实施方案中，核酸选自包含适体和spiegelmer的组。 
构成本发明基础的问题在第八方面通过将与编码蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸相互作用的核酸用于开发或制备治疗和/或预防疾病的药物和/或制备用于诊断疾病的诊断剂来解决，其中疾病选自包含癌、转移癌和与PI 3-激酶途径有关的任何病理症状的组。 
在按照本发明第八方面的应用的实施方案中，相互作用的核酸是反义寡核苷酸，核酶和/或siRNA。 
在按照本发明第八方面的应用的另一实施方案中，编码蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸是cDNA，mRNA或hnRNA。 
在按照本发明第八方面的应用的实施方案中，蛋白激酶Nβ和/或编码蛋白激酶Nβ的核酸是与本发明任一方面相关描述的一种。 
构成本发明基础的问题在第九方面通过优选用于预防和/或治疗疾病的药物组合物来解决，该药物组合物包含至少一种试剂和至少一种药用载体，所述试剂选自包含蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物，与蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物或与编码蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸相互作用的小分子，蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的特异性抗体，与蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用的多肽，编码蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸，与蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用的核酸或与编码蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸相互作用的核酸的组，其中疾病选自包含癌、转移癌和与PI 3-激酶途径有关的任何病理症状的组。 
构成本发明基础的问题在第十方面通过用于表征疾病或症状的试剂盒来解决，所述疾病或症状选自包含癌、转移癌和与PI 3-激酶途径有关的任 何病理症状的组，所述试剂盒包含至少一种试剂和任选地至少一种其它化合物，所述试剂选自包含蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物，蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的特异性抗体，与蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用的多肽，与编码蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸相互作用的多肽，与蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用的核酸，与编码蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸相互作用的核酸的组。 
本发明人已经意外地发现蛋白激酶Nβ，在本文也称为PKNβ，是与癌和肿瘤有关的有价值的靶。更具体地，本发明人已经发现蛋白激酶Nβ是PI-3激酶/PTEN途径的下游靶。更意外地本发明人发现蛋白激酶Nβ与肿瘤发生和转移关联。特别是后者作用似乎与抑制功能、更具体地PTEN肿瘤抑制功能的丧失强烈相关。如将在实施例中显示，在作为PI-3激酶途径抑制剂的PTEN无活性的症状中蛋白激酶Nβ将被上调。由于蛋白激酶Nβ的上调，发生该上调的细胞将显示转移行为和迁移行为的增加。这意味着蛋白激酶Nβ的抑制剂是控制细胞转移和迁移行为的适当方法，这是治疗肿瘤和癌的适当方法，该肿瘤和癌更具体地是转移性的和其细胞显示转移和/或迁移行为的那些肿瘤和癌，在本文中通常称为“本文所述疾病”或“本文所述症状”。本文所述疾病以及本文所述症状还包含肿瘤发生和转移。这特别适用于本文所述的那些疾病和本文所述的那些症状，其中与这些疾病或疾病症状有关的细胞是PTEN阴性，这意味着肿瘤抑制剂PTEN无活性或具有降低水平的活性。该疾病还包含其中通常涉及PI 3-激酶途径的那些疾病。除了转移瘤以外，特别是糖尿病分别属于这种类型的疾病和疾病症状。因此，细胞，特别是与本文所述疾病或疾病症状有关的和为PTEN阴性的那些，对于其作用模式是降低或消除各个有关细胞中蛋白激酶Nβ活性的药物治疗敏感。因此，使用所述药物可以有利地治疗患者，该患者肿瘤特征在于优选过度激活的PI 3-激酶途径，包括但不限于通过扩增或诱变编码PI 3-激酶途径组分的基因(p110，Akt)或是PTEN阴性的或具有PTEN阴性的细胞，特别是如果这些细胞涉及本文所述疾病或本文所述疾病症状。该活性的降低可来源于转录水平或翻译水平，即蛋白激酶Nβ的酶促活性的降低。不希望局促于任何理论，后一方面，即改变蛋白激酶Nβ的活性也是来自本发明人关于PKNβ特性的理解的结果，即 PKNβ的酶促活性也可以上调和下调，更优选下调。 
另一组可以使用所述药物有利地治疗的患者是患有癌症的那些，其丧失PTEN功能的发生率高，特别是在晚期肿瘤中(Cantley，L.C.和Neel，B.G(1999).New insights into tumor suppression：PTEN suppresses tumorformation by restraining the phosphoinositide 3-kinase/AKT pathway.ProcNatl Acad Sci U S A 96，4240-4245；Ali，I.U.(2000).Gatekeeper forendometrium：the PTEN tumor suppressor gene.J Natl Cancer Inst 92，861-863)。PTEN的丧失与各种肿瘤细胞增加的攻击和入侵行为相关。因此，在本发明的优选实施方案中，可以将也可以用作与本发明各个方面相关的分析工具或手段的、分别针对蛋白激酶Nβ或编码其的核酸的那些诊断剂和治疗剂用于任何肿瘤，条件是符合上述前提，即PTEN与增加的攻击和入侵行为相关。 
基于本文提供的公开内容，即蛋白激酶Nβ是下游药靶和蛋白激酶Nβ是肿瘤发生和转移和与其相关或由其导致的疾病的靶，可以设计，筛选或制备这种药物。 
由于蛋白激酶Nβ涉及以上概述的机制，它还可以用作诊断细胞或其体内具有该类细胞的患者的状态，其是否将分别进行转移和肿瘤发生的标记。作为这种方法起作用和适用于该目的的实例是例如ICAM-1。ICAM-1用于胃癌进行转移的预后(Maruo Y，Gochi A，Kaihara A，ShimamuraH，YamadaT，TanakaN，OritaK.Int J Cancer.2002Aug 1；100(4)：486-490)，其中发现s-ICAM-1水平在肝转移的患者中升高。在另一个实施例中，将骨桥蛋白用作乳腺癌的预后标记(Rudland PS，Platt-Higgins A，El-TananiM，De Silva Rudland S，Barraclough R，Winstanley JH，Howitt R，WestCR.Cancer Res.2002Jun 15；62(12)：3417-3427)。在这个范围内蛋白激酶Nβ的存在或存在水平(蛋白质或mRNA)或活性水平可以用作标记，与蛋白激酶Nβ或多或少特异性相互作用的任何化合物因此将是适当的诊断剂。 
下面将公开在任何情形下与蛋白激酶Nβ特异性和/或选择性相互作用的药物和诊断剂的方法和设计原理。 
根据这些发现激酶Nβ证明是允许选择性调节仅一些典型地涉及PI-3 激酶途径的方面，即转移和迁移的适当下游药靶，和选择性和特异性的诊断方法，即检测典型地涉及PI 3-激酶途径的过程，更具体地转移和迁移。 
PI 3-激酶途径其特征在于经生长因子诱导后的PI 3-激酶活性和平行的信号途径。细胞的生长因子刺激导致细胞膜上它们相关受体的激活，其又与胞内信号分子如PI 3-激酶相关并将PI 3-激酶激活。PI 3-激酶(由调节p85和催化p110亚基组成)的激活通过磷酸化导致Akt的激活，由此支持细胞应答如扩增，存活或向下游迁移。PTEN因此是涉及磷脂酰肌醇(PI)3-激酶途径的肿瘤抑制剂，过去已经广泛研究其在调节细胞生长和转化中的作用(关于综述参见Stein，R.C.和Waterfield，M.D.(2000).PI3-kinase inhibition：a target for drug development？Mol Med Today 6，347-357；Vazquez，F.和Sellers，W.R.(2000).The PTEN tumor suppressorprotein：an antagonist of phosphoinositide 3-kinase signaling.BiochimBiophys Acta 1470，M21-35；Roymans，D.和Slegers，H.(2001).Phosphatidylinositol 3-kinases in tumor progression.Eur J Biochem 268，487-498)。肿瘤抑制剂PTEN通过逆转PI 3-激酶-催化反应起PI 3-激酶负调节物的作用和由此确保途径的激活以瞬时和可控方式发生。PTEN的功能失活导致PI 3-激酶信号的慢性超活化。通过加入小分子抑制剂LY294002可以阻断PI 3-激酶活性。以平行途径作用的信号激酶MEK的活性和下游响应可以例如被小分子抑制剂PD98059抑制。 
PI 3-激酶途径通过PTEN功能丧失的慢性激活是肿瘤发生和转移的主要贡献者，显示该肿瘤抑制剂代表控制细胞增殖的重要关卡。PTEN剔除(knock out)细胞显示与其中PT 3-激酶途径已经通过PI 3-激酶的激活形式被慢性诱导的细胞类似的特性(Di Cristofano，A.，Pesce，B.，Cordon-Cardo，C.和Pandolfi，P.P.(1998).PTEN is essential for embryonic development andtumour suppression.Nat Genet 19，348-355.Klippel，A.，Escobedo，M.A.，Wachowicz，M.S.，Apell，G.，Brown，T.W.，Giedlin，M.A.，Kavanaugh，W.M.和Williams，L.T.(1998).Activation of phosphatidylinositol 3-kinase issufficient for cell cycle entry and promotes cellular changes characteristic ofoncogenic transformation.Mol Cell Biol 18，5699-5711.Kobayashi，M.，Nagata，S.，Iwasaki，T.，Yanagihara，K.，Saitoh，I.，Karo山i，Y，Ihara，S.和 Fukui，Y.(1999).Dedifferentiation of adenocarcinomas by activation ofphosphatidylinositol 3-kinase.Proc Natl Acad Sci U S A 96，4874-4879). 
PTEN涉及也称为PTEN相关途径的几个途径如PI3K/PTEN途径，Akt途径，EGF-相关自分泌回路(loop)和mTOR途径。PI 3-激酶途径实际上是直接或间接涉及PI 3-激酶的任何途径。PI 3-激酶在该途径中可以用作抑制剂或激活剂，或者它可以被途径的其它元件调节。 
存在丰富的现有技术描述涉及PI 3-激酶途径的疾病和症状。这些症状和疾病中的任何一种可以因此通过本文教导设计、筛选或制备的本发明方法和药物和诊断剂处理。为了不限制性地举例说明的原因，它是指下列各项：子宫内膜癌，结肠直肠癌，神经胶质瘤，子宫内膜癌，腺癌，子宫内膜增生，考登综合征，遗传性非息肉病结肠直肠癌，Li-Fraumene’s综合征，乳腺-卵巢癌，前列腺癌(Ali，I.U.，Journal of the National Cancer Institute，Vol.92，no.11，June 07，2000，第861-863页)，班-佐综合征，LDD(Lhermitte-Duklos’综合征)(Macleod，K.，上文)错构瘤-巨头病，包括Cow病(CD)和Bannayan-Ruvalcaba-Rily综合征(BRR)，粘膜皮肤损伤(例如毛膜瘤(trichilemmonmas))，巨头，智力低下，胃肠harmatomas，脂瘤，甲状腺腺瘤，乳腺纤维囊性病，小脑发育不良性神经节细胞瘤和乳腺和甲状腺恶性肿瘤(Vazquez，F.，Sellers，W.R.，上文)。 
鉴于此，蛋白激酶Nβ是PI 3-激酶途径有价值的下游药靶，其可以用副作用比针对蛋白激酶Nβ下游的靶的其它药物小的药物处理。因此本发明提供适合设计、筛选、开发和制备药物活性化合物的药靶，这些化合物比本领域已知的那些如例如LY 294002更有选择性。通过对效应分子该特定部分即蛋白激酶N β和途径中涉及的任何另外的下游分子的控制，仅极有限量的其平行分支或信号级联放大中另外的上游靶可能导致不期望的作用。因此，与细胞周期、DNA修复、细胞调亡、葡萄糖转运、翻译有关的PI-3激酶/PTEN途径的其它活性将不受影响。此外，不诱导胰岛素信号，这意味着实际上避免了与LY294002的使用相关的观察到的糖尿病响应或其它副作用。LY294002(2-(4-吗啉基)8-苯基色酮)是Lilly研究实验室(Indianapolis)开发的作为PI-3K抑制剂的几种色酮衍生物小分子抑制剂之一(Vlahos等，1994，JBC，269，5241-5248)。它靶向PI-3K分子它们的催 化亚基，p110并且通过与ADP竞争结合催化中心来发挥作用。然而，LY294002不能辨别不同的p110同工型(α，β，γ，δ)，这些同工型提示具有不同细胞功能。 
蛋白激酶Nβ也是雷帕霉素处理的mTOR的另一下游。mTOR(雷帕霉素的哺乳动物靶)，也称为Raft或FRAP，作用于PI 3-激酶的下游来调节诸如pp70S6激酶依赖性进入细胞周期的过程。mTOR用作生长因子和营养可用性的传感物以通过激活pp70S6激酶和起始因子4E来控制翻译。mTOR的功能受细菌大环内酯雷帕霉素抑制，雷帕霉素抑制T-细胞和某些肿瘤细胞的生长(Kuruvilla和Schreiber 1999，Chemistry & Biology 6，R129-R136)。 
雷帕霉素及其衍生物是当前用于临床的适当药物的事实证明药靶更有益和具有更小副作用，更具体地它是关于例如Yu等(Yu，K.等(2001)Endrocrine-RelatCanc 8，249)证明的特定分子机制。 
蛋白激酶Nβ是蛋白激酶C家族的成员，该家族据说是蛋白质-丝氨酸/苏氨酸激酶。典型地，这种类型的蛋白激酶包含一个调节和一个催化亚基，使用钙离子和磷脂作为辅因子。二酰甘油用作这种类型的蛋白激酶家族的激活剂。蛋白激酶C家族的成员涉及与激素或神经递质有关的几个信号途径。这些蛋白激酶通过磷酸化调节它们的靶蛋白的活性。本领域已知非生理性的持续激活蛋白激酶C导致转化的细胞表型，其可导致癌症产生。 
蛋白激酶Nβ作为mRNA的完整序列可在数据库中获得，例如登记号为gi 7019488或NM_013355。使用遗传密码，从该mRNA中可推断出具体的氨基酸序列。而且，蛋白激酶Nβ的氨基酸序列可在数据库中以登记号gi 7019489或NP_037487.1获得。属于本发明范围内的是可以按照本发明使用其衍生物或截短形式(version)，只要可以实现期望效果。衍生化和截短的程度因此可以由本领域技术人员通过常规分析测定。就核酸序列而言那些核酸序列也被术语编码蛋白激酶Nβ的核酸序列包含，这些核酸序列可以与上述登记号指定的核酸或可以衍生于上述氨基酸序列的任何核酸序列杂交。该杂交为本领域技术人员已知。这种杂交的细节可以获自Sambrook，J.Fritsch，E.F.和Maniats，T.(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2nd ed.Cold Spring Harbor：Cold Spring Harbor Laboratory。在一个优选实施方案中，杂交是严谨条件下的杂交。另外，编码蛋白激酶Nβ的核酸也是与任何上述核酸序列同源的核酸序列，其中同源程度优选为75，80，85，90或95％。另外的与蛋白激酶Nβ有关的参考文献尤其有Shibata H.等，J.Biochem.(Tokyo)2001 Jul；130(1)：23-31；Dong，LQ，Proc Natl Akad Scie USA，2000，May 09；97(10)：5089-5094；和Oishi，K.，Biochem Biophys Res Commun.1999，Aug.11；261(3)：808-814。 
尤其在M.musculus，R norvegicus，A.thaliana，C.elegans，D.melanogaster和S.cerevisiae中可以发现人蛋白激酶Nβ的同源物。对于上述各种物种，对比区域的百分同一性和长度分别为67％和279个氨基酸，51％和866个氨基酸，38％和305个氨基酸，36％和861个氨基酸，63％和296个氨基酸和44％和362个氨基酸。本领域技术人员公认这些或其它同源物中的任何一种原则上适合于实施本发明，除非使用该同源物产生的药物或诊断剂可以仍与人蛋白激酶Nβ或其它任何预定蛋白激酶Nβ相互作用。 
人氨基酸序列还可以获自ProtEST，登记号pir：JC7083，其中各种蛋白激酶N β称为JC7083蛋白激酶。人蛋白激酶Nβ的基因位于第9条人染色体上。蛋白激酶Nβ的cDNA来源通常是多种癌和各种胎儿或胚胎组织，更具体地，尤其是胃，腺癌，脑，乳腺，burkitt，淋巴瘤，子宫颈，软骨肉瘤，结肠，胎儿眼，胎儿晶状体，胎儿眼前段，胎儿视神经，胎儿视网膜，胎儿视网膜中央窝(foveal)，胎斑肽脉络膜，fibrotheoma，种系，nead颈，心脏，肾，大细胞癌，平滑肌肉瘤，转移性软骨肉瘤，卵巢，甲状旁腺，成视网膜细胞瘤，横纹肌肉瘤，小细胞癌，鳞状细胞癌，睾丸，和子宫。从该表中明显的是在本文中也称为药剂(medicament)的药物和诊断剂，包括肿瘤分类(staging)剂，即分别可以用于区分患者关于他可能遭受的疾病阶段的状态以及用于监视施用于患者的治疗功效的试剂，其按照本文提供的技术教导设计、筛选或制备，除了本文公开的其它任何疾病和本文公开的疾病症状以外，其可以用于治疗、预防、诊断、预后和监视这些疾病或涉及特定细胞、组织或器官的任何疾病。这些疾病和疾病症状也应当包含在术语“本文所述疾病”中。 
鉴于本文公开的意外发现，蛋白激酶Nβ因而可以用作预防和/或治疗本文所述的各种疾病和疾病症状的药物，和用于为此目的制备药物和用于制备诊断剂。 
在将以上定义的蛋白激酶Nβ或其片段或衍生物本身用作药物的情况下，将它优选用作天然存在的蛋白激酶Nβ的竞争剂和由此抑制其正常生物学功能。特别优选用于该目的的蛋白激酶Nβ是催化缺陷型的。这种蛋白激酶Nβ可分别施用于生物和细胞，或可以通过基因治疗的方式导入生物或各个细胞。 
除了其本身是潜在药物以外，蛋白激酶Nβ可以用作针对可以用作药物或候选药物或用作诊断剂的化学化合物的化合物。这些化学化合物属于不同类别的化合物如抗体，肽，抗促成素，适体，spiegelmer，核酶，反义寡核苷酸和siRNA以及小分子。使用蛋白激酶Nβ其本身作为物理或化学实体或与蛋白激酶Nβ有关的信息，设计、选择、筛选产生和/或制备化合物。在所述类别的化合物的设计、选择、筛选、产生和/或制备方法中，蛋白激酶Nβ也将称为靶，其用于该方法中而不是将各种化合物向需要其的患者的最终施用中。在提供各种类别的化合物的方法中，可以使用蛋白质蛋白激酶Nβ，在本文中也称为蛋白激酶Nβ或编码蛋白激酶Nβ的核酸。本文所用的术语蛋白激酶Nβ包含蛋白激酶Nβ的任何片段或衍生物，其允许设计、选择、筛选、产生和/或制备各类化合物中所述类别的化合物，其在应用时又由于有活性而作为药物或作为诊断剂。本文所用的编码蛋白激酶Nβ的术语核酸应当包含任何核酸，其包含编码如上定义的蛋白激酶Nβ的核酸或其部分。同样考虑编码蛋白激酶Nβ的核酸的一部分，只要它仍适合设计、选择、筛选、产生和/或制备所述类别的化合物，其在应用时又由于有活性而作为药物或作为诊断剂。编码蛋白激酶Nβ的核酸可以是基因组核酸，hnRNA，mRNA，cDNA或其中每个的一部分。 
如以上概述，属于本发明范围内的是除了本文所述的蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物或为此的核酸序列，还可以使用其它工具或化合物以便产生或抑制产生于蛋白激酶Nβ或编码蛋白激酶Nβ的核酸的作用。这些工具可以在筛选方法中确定或选择。在该筛选方法中，第一步是提供一种或多种所谓的候选化合物。本文所用的候选化合物是在测试系统中检测其适 合性的化合物，该适合性是关于治疗或减轻本文所述各种疾病和本文所述疾病症状或被用于这种疾病和疾病症状的诊断工具或试剂的适合性。如果候选化合物在测试系统中显示各种作用，所述候选化合物是治疗所述疾病和疾病症状的适当工具或试剂，和原则上，以及所述疾病和疾病症状的适当诊断剂。在第二步中将候选化合物与蛋白激酶Nβ表达系统或蛋白激酶Nβ的基因产物、优选各种基因表达产物如hnRNA或mRNA，或蛋白激酶Nβ活性系统或蛋白激酶Nβ接触。蛋白激酶Nβ活性系统在本文中也称为检测蛋白激酶Nβ活性的系统和/或优选在该系统的含义中也是有活性的。 
蛋白激酶Nβ表达系统基本上是显示或展示蛋白激酶Nβ表达的表达系统，其中表达的程度或水平基本上可以改变。优选地，蛋白激酶Nβ活性系统基本上是其中测量活性或活性状态而不是蛋白激酶Nβ表达的表达系统。备选地，蛋白激酶活性系统是其活性可以测量的蛋白激酶Nβ或者提供或包含蛋白激酶Nβ的系统。在这些系统的任何一个中，检验在候选化合物的影响下蛋白激酶Nβ或编码蛋白激酶Nβ的核酸的活性是否不同于没有候选化合物的情形。不管具体系统是否是表达系统或活性系统，属于本发明范围内的是可以出现活性和表达分别增加或降低并且可以测量。典型地，表达系统和/或活性系统是体外反应，如细胞提取物或细胞提取物的级分如核提取物。本文所用的蛋白激酶Nβ表达系统也可以是细胞，优选与本文所述疾病和本文所述疾病病症有关的组织或器官的细胞。 
例如通过测量在候选化合物的影响下编码蛋白激酶Nβ的核酸量、更具体地mRNA的增加或减少或表达的蛋白激酶Nβ的增加或减少，可以在每个表达水平上确定活性系统或表达系统中是否有增加或降低。测量所需技术，更具体地诸如对于mRNA或蛋白质的这类变化的定量测量，是本领域技术人员公知的。本领域技术人员还公知的是例如通过使用适当抗体测定蛋白激酶Nβ的量或含量的方法。可以如本领域技术人员所知和例如Harlow，E.，和Lane，D.，″Antibodies：A Laboratory Manual，″Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，(1988)所述产生抗体。 
在蛋白激酶Nβ表达系统的情形中，优选可以在功能测定中测定蛋白激酶Nβ活性的增加或降低。 
通常通过将候选化合物的水溶液加入各自反应系统中进行将候选化合物分别与表达系统和活性系统接触，该反应系统在本文中通常称为测试系统。除了水溶液以外，可以使用候选化合物在有机溶剂中的混悬液或溶液。水溶液优选为缓冲液。 
优选地，在每轮分别使用表达系统和活性系统中，仅使用单一候选化合物。然而，还属于本发明范围内的是几个该类测试在高通量系统中平行进行。 
按照本发明的方法的另一步骤在于测定在候选化合物的影响下，表达系统和活性系统的表达或活性是否分别相对于蛋白激酶Nβ或编码其的核酸变化。典型地，这通过将加入候选化合物后的系统反应与未加入候选化合物的系统反应比较完成。优选地，候选化合物是化合物文库的成员。基本上任何化合物文库适合于本发明目的，而与化合物类别无关。适当的化合物文库尤其有由小分子组成的文库，由肽、蛋白质、抗体、抗促成素和功能核酸组成的文库。如本领域技术人员公知可以产生后者化合物并在本文中概述。 
蛋白激酶Nβ蛋白质的特异性抗体或编码蛋白激酶Nβ的核酸的制备为本领域技术人员已知，并且例如在Harlow，E.，和Lane，D.，″Antibodies：ALaboratory Manual，″Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，(1988)中描述。优选地，单克隆抗体可以与本发明结合使用，其可以按照Cesar和Milstein的方案和基于其的进一步发展来制备。本文所用抗体包括但不限于，完全抗体，抗体片段或衍生物如Fab片段，Fc片段和单链抗体，只要它们适合于和能够与蛋白激酶Nβ结合。除了单克隆抗体以外，还可以使用和/或产生多克隆抗体。多克隆抗体的产生也为本领域技术人员已知，例如在Harlow，E.，和Lane，D.，″Antibodies：A Laboratory Manual，″Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，(1988)中描述。优选地，用于治疗目的的抗体是以上定义的人源化的或人的抗体。 
按照本发明可以使用的抗体可以具有一个或几个标记或标签。这些标记或标签可以在其诊断应用或其治疗应用中用于检测抗体。优选地，标记和标签选自包含抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、生物素、金和荧光素的组，并例如在ELISA方法中使用。这些和另外的标记以及方法在例如 Harlow，E.，和Lane，D.，″Antibodies：A Laboratory Manual，″Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，(1988)中描述。 
还属于本发明范围内的是，标签或标记显示除了检测以外的额外功能，如与其它分子相互作用。该相互作用可以例如是与其它化合物的特异相互作用。这些其它化合物可以是其中使用抗体的系统如人或动物体固有的那些或通过使用各自抗体分析的样品。适当的标记可以例如是生物素或荧光素，其特异相互作用的配偶体如抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白等存在于各种化合物或结构上以与如此标记或带标签的抗体相互作用。 
使用蛋白激酶Nβ蛋白质或编码蛋白激酶Nβ的核酸可以产生的另一类药物以及诊断剂是与其结合的肽。这些肽可以通过使用按照现有技术的方法如噬菌体展示产生。基本上，产生诸如噬菌体形式的肽文库，这种文库与靶分子接触，在本情形中靶分子是例如蛋白激酶Nβ。随后从各自反应中优选作为与靶分子的复合体去除与靶分子结合的那些肽。本领域技术人员已知结合特性至少在一定程度上依赖于具体实现的实验设定如盐浓度等。在从未结合的文库成员中分离以较高亲和力或较大力与靶分子结合的那些肽以后，和任选地还在从靶分子和肽的复合体中去除靶分子以后，可以随后表征各个肽。在表征前，任选地如例如通过增殖编码肽的噬菌体来实现扩增步骤。表征优选包含将靶结合肽测序。基本上，肽不受它们的长度限制，然而在各种方法中优选获得优选长度约为8-20个氨基酸的肽。文库的大小可以为约102至1018，优选108至1015种不同的肽，然而不限于此。 
一种具体形式的靶结合多肽是所谓的“抗促成素”，其尤其在德国专利申请DE 197 42 706中描述。 
按照本发明，蛋白激酶Nβ蛋白质以及编码蛋白激酶N β的核酸可以在筛选方法中用作制备或开发治疗本文所述疾病和本文所述疾病症状的药物的靶，以及制备和/或开发用于诊断所述疾病和所述症状的工具，其中在筛选方法中使用小分子或小分子文库。该筛选包含同时或顺序将靶分子与优选来自上面指定文库的那些的单个小分子或多种小分子接触的步骤，和鉴定与靶分子结合的那些小分子或文库成员，其如果连同其它小分子筛选，可以从未结合或未相互作用的小分子中分离。应当认识到结合和未结 合可强烈受具体的实验设定影响。在改变反应参数的严谨度方面可以改变结合和未结合的程度，这允许微调该筛选方法。优选地，在鉴定一种或几种与靶分子特异相互作用的小分子以后，可以进一步表征该小分子。这种进一步表征可以例如在于鉴定小分子和确定其分子结构和另外的物理、化学、生物和/或医学特性。优选地，天然化合物具有约100-1000Da的分子量。还优选地，小分子是遵守本领域技术人员已知的Lepinsky五项法则的那些。备选地，与优选非合成的天然产物相反，还可以限定小分子以使它们是优选产生于组合化学的合成小分子。然而，应当注意这些定义是仅帮助对本领域各个术语的一般理解。 
还属于本发明范围内的是将蛋白激酶Nβ和/或编码蛋白激酶Nβ的核酸用作制备或选择适体和spiegelmer的靶分子，其然后可以直接或间接用作药物或诊断剂。 
适体是单链或双链的并且与靶分子特异性相互作用的D-核酸。适体的制备或选择例如在欧洲专利EP 0 533 838中描述。基本上实现下列步骤。首先，提供核酸即潜在适体的混合物，其中每个核酸典型地包含几个、优选至少8个顺序随机化的核苷酸的片段。该混合物随后与靶分子接触，其中如基于与候选混合物相比，对靶增加的亲和力或与其的更大力，核酸与靶分子结合。结合核酸随后从混合物的剩余部分中分离。任选地，使用例如聚合酶链式反应扩增如此获得的核酸。这些步骤可以重复数次最终提供与靶特异性结合的核酸比率提高的混合物，然后从中任选地选择最终结合核酸。这些特异性结合的核酸称为适体。明显的是在产生或鉴定适体的方法的任何阶段，可以取单个核酸混合物样品来使用标准技术测定其序列。在本发明范围内的是可以例如通过引入产生适体的本领域技术人员已知的限定化学基团来稳定适体。该修饰可以例如在于在核苷酸糖部分的2’-位引入氨基。适体当前用作治疗剂。然而，还属于本发明范围内的是如此选择或产生的适体可以用于靶验证和/或作为先导物质用于开发药物，优选基于小分子的药物。这实际上通过竞争测定完成，其中靶分子和适体之间的特异相互作用受候选药物的抑制，候选药物从靶和适体的复合体中替代适体，可以假定各个候选药物允许特异性抑制靶和适体之间的相互作用，和如果相互作用是特异性的，所述候选药物至少在原则上将适合于阻断靶 和因此在各种包含该靶的系统中降低其生物有效性或活性。如此获得的小分子可以然后进行进一步的衍生化和修饰以优化其物理、化学、生物和/或医学特性如毒性、特异性、生物可降解性和生物利用度。 
基于类似原理产生或制备spiegelmer，其可以按照使用蛋白激酶Nβ或编码蛋白激酶Nβ的核酸的本发明使用或产生。Spiegelmer的制备在国际专利申请WO 98/08856中描述。Spiegelmer是L-核酸，这意味着它们由L-核苷酸组成，不同于如适体由D-核苷酸组成的适体。Spiegelmer其特征在于它们在生物系统中具有极高稳定性和与适体相比与它们针对的靶分子特异性相互作用的事实。为了产生spiegelmer，产生D-核酸异质群体并将该群体与靶分子的旋光对映体接触，在本情形中例如与天然存在的蛋白激酶Nβ的L-对映异构体的D-对映异构体接触。随后，分离不与靶分子的旋光对映体相互作用的那些D-核酸。然而，分离与靶分子的旋光对映体相互作用的那些D-核酸，任选地测定和/或测序和随后基于获自D-核酸的核酸序列信息合成相应的L-核酸。序列和与靶分子的旋光对映体相互作用的上述D-核酸相同的这些L-核酸，将特异性地与天然存在的靶分子而不是与其旋光对映体相互作用。类似于产生适体的方法，还可以重复各个步骤数次和由此富集与靶分子的旋光对映体特异性相互作用的那些核酸。 
基于本文公开的作为靶分子的蛋白激酶Nβ或编码蛋白激酶Nβ的核酸可以制备或产生的另一类化合物是核酶，反义寡核苷酸和siRNA。 
所有上述核酸的共同特征是它们不与靶分子在翻译产物水平上(在本情形中蛋白激酶Nβ)相互作用，而是与转录产物(即编码蛋白激酶Nβ的核酸如基因组核酸或其衍生的任何核酸如分别地相应的hnRNA，cDNA和mRNA)相互作用。因此，上述类别的化合物的靶分子优选为蛋白激酶Nβ的mRNA。 
核酶是有催化活性的核酸，优选由基本上包含两部分的RNA组成。第一部分显示催化活性而第二部分负责与靶核酸(在本情形中编码蛋白激酶Nβ的核酸)的特异相互作用。当靶核酸和核酶的第二部分之间典型地通过两条杂交链上基本上互补的碱基序列杂交和沃森-克里克碱基配对相互作用时，催化活性部分可变得有活性，这意味着它在分子内或分子间催化靶核酸，假定核酶的催化活性是磷酸二酯酶活性。随后，可以进一步降 解靶核酸，由于缺乏新合成的蛋白激酶Nβ和在先存在的蛋白激酶Nβ的更新，最终导致靶核酸以及衍生于所述靶核酸的蛋白质(在本情形中为蛋白激酶Nβ)的降解。核酶，它们的应用和设计原理为本领域技术人员已知，例如在Doherty和Doudna(Ribozym structures and mechanism.Annu ref.Biophys.Biomolstruct.2001；30：457-75)和Lewin & Hauswirth(RibozymeGene Therapy：Applications for molecular medicine.2001 7：221-8)中描述。 
反义寡核苷酸分别在制备药物和作为诊断剂中的应用是基于类似的作用方式。基本上，基于碱基互补性反义寡核苷酸与靶RNA、优选与mRNA杂交，由此激活RNase H。RNase H被磷酸二酯和硫代磷酸酯偶联的DNA激活。然而，除了硫代磷酸酯偶联的DNA以外，磷酸二酯偶联的DNA被细胞核酸酶迅速降解。这些抗性的非天然存在的DNA衍生物与RNA杂交后不抑制RNase H。换句话说，反义多核苷酸仅作为DNA RNA杂交复合体有效。这类反义寡核苷酸的实例尤其在美国专利US 5,849,902和US5,989,912中描述。换句话说，基于靶分子(在本情形中为编码蛋白激酶Nβ的核酸)的核酸序列，其来自从中原则上可以推断各自核酸序列的靶蛋白质，或通过知道如特别是mRNA的核酸序列，基于碱基互补的原理可以设计适当的反义寡核苷酸。 
特别优选的是含有短序列的硫代磷酸酯DNA(3-9个碱基)的反义-寡核苷酸。激活细菌RNase H需要最少3个DNA碱基，哺乳动物RNase H激活需要至少5个碱基。在这些嵌合寡核苷酸中，存在形成RNase H的底物的中央区域，侧邻由不形成RNase H的底物的修饰核苷酸组成的杂交“臂”。例如通过2’-O-甲基或2’-氟可以修饰嵌合寡核苷酸的杂交臂。备选方法在所述臂中使用膦酸甲酯或氨基磷酸酯键。用于实施本发明的反义寡核苷酸的另外实施方案是对甲氧基寡核苷酸，部分对甲氧基寡脱氧核糖核苷酸或对甲氧基寡核苷酸。 
对于本发明特别相关和有用的是在上述两个US专利中更具体描述的那些反义寡核苷酸。这些寡核苷酸不含有天然存在的5′→3′-连接的核苷酸。然而寡核苷酸具有两类核苷酸：激活RNase H的2’-脱氧硫代磷酸酯和不激活RNase H的2’-修饰核苷酸。2’-修饰核苷酸之间的键可以是磷酸二酯，硫代磷酸酯或对乙氧基磷酸二酯。通过连续的RNase H-激活区域完 成RNase H的激活，该区域在3和5之间含有激活细菌RNase H的2’-脱氧硫代磷酸酯核苷酸和在5和10之间含有激活真核的、特别是哺乳动物RNase H的2’-脱氧硫代磷酸酯核苷酸。防止降解的保护是通过使5’和3’末端碱基高度抗核酸酶和任选地通过放置3’末端保护基团来完成。 
更具体地，反义寡核苷酸包含5’末端和3’末端；11-595′→3′-连接的核苷酸独立地选自由2’-修饰磷酸二酯核苷酸和2’-修饰的对烷氧基磷酸三酯核苷酸组成的组；和其中5’-末端核苷酸与3个和10个连续硫代磷酸酯连接的脱氧核糖核苷酸之间的RNase H激活区域连接，和其中所述寡核苷酸的3’-末端选自由反向脱氧核糖核苷酸、1-3个硫代磷酸酯2’-修饰核糖核苷酸的连续序列、生物素基团和对烷氧基磷酸三酯核苷酸组成的组。 
还可以使用反义寡核苷酸，其中不是5’末端核苷酸而是上述3’末端核苷酸与RNase H-激活区域连接。而且，5’末端选自特定组而不是所述寡核苷酸的3’末端。 
适当的和有用的反义寡核苷酸还有以下那些：包含5’末端RNase H激活区域和在5个和10个连续脱氧硫代磷酸酯核苷酸之间；在11-59个连续5′→3′-连接的2’-甲氧基核糖核苷酸之间含有RNase H激活区域；和核酸外切酶封闭基存在于寡核苷酸的3’末端，其来源于由非-5′-3′-磷酸二酯-连接的核苷酸，1-3个连续的5′-3′-连接的修饰核苷酸和非核苷酸化学封闭基组成的组。 
如下可以表征两类特别优选的反义寡核苷酸： 
第一类反义寡核苷酸，在本文中也称为第二代反义寡核苷酸，包含总共23个核苷酸，其包含5′→3′方向的7个2’-O-甲基核糖核苷酸的一段序列，9个2’-脱氧核糖核苷酸的一段序列，6个2’-O-甲基核糖核苷酸的一段序列和3’-末端2’-脱氧核糖核苷酸。从7个2’-O-甲基核糖核苷酸的第1个基团开始，首先4个是硫代磷酸酯连接，而随后4个2’-O-甲基核糖核苷酸是磷酸二酯连接。此外，在最后一个即2’-O-甲基核糖核苷酸的最3’-末端和由9个2’-脱氧核糖核苷酸组成的序列的第一个核苷酸之间存在磷酸二酯键。所有2’-脱氧核糖核苷酸是硫代磷酸酯连接。硫代磷酸酯还存在最后一个即最3’-末端的2’-脱氧核苷酸和随后由6个2’-O-甲基核糖核苷酸组成的序列的第一个2’-O-甲基核糖核苷酸之间。从6个2’-O-甲基核糖 核苷酸的该基团开始，它们中的首先4个，再次以5′→3′方向，是磷酸二酯键连接的，而它们中的最后3个，对应于位置20-22，是硫代磷酸酯连接的。最后一个，即末端3’-末端2’-脱氧核苷酸通过硫代磷酸酯键与最后一个即最3’-末端2’-O-甲基核糖核苷酸连接。 
该第一类也可以通过参考下列示意性结构描述：RRRnnnnNNNNNNNNnnnRRRN。因此，R表示硫代磷酸酯连接的2’-O-甲基核糖核苷酸(A，G，U，C)；n表示2’-O-甲基核糖核苷酸(A，G，U，C)；N表示硫代磷酸酯连接的脱氧核糖核苷酸(A，G，T，C)。 
第二类特别优选的反义寡核苷酸，在本文中也称为第三代反义寡核苷酸或GeneBlocs，也包含具有下列碱基结构(5′→3′方向)的总共17-23个核苷酸。 
在5’-末端存在反向无碱基核苷酸，其是适合于赋予对外切核酸酶活性的抗性的结构和例如在WO 99/54459中描述。该反向无碱基与磷酸二酯连接的5-7个2’-O-甲基核糖核苷酸的序列连接。在该5-7个2’-O-甲基核糖核苷酸的序列之后有7-9个2’-脱氧核糖核苷酸的序列，其全部都是硫代磷酸酯连接的。最后一个即最3’-末端的2’-O-甲基核糖核苷酸和包含2’-脱氧核苷酸的序列的第一个2’-脱氧核苷酸之间的连接是通过磷酸二酯键发生。与7-9个2’-脱氧核苷酸的序列邻近，连接由5-7个2’-O-甲基核糖核苷酸组成的序列。最后一个2’-脱氧核苷酸与稍后提及的由5-7个2’-O-甲基核糖核苷酸组成的序列的第一个2’-O-甲基核糖核苷酸的连接是通过硫代磷酸酯键发生。5-7个2’-O-甲基核糖核苷酸的序列是磷酸二酯连接的。在第二个5-7个2’-O-甲基核糖核苷酸序列的3’-末端连接另一个反向无碱基。 
该第二类还可以通过参考下列示意性结构描述：(GeneBlocs代表第三代反义寡核苷酸，也具有下列示意性结构：)帽-(np)x(Ns)y(np)z-帽或帽-nnnnnnnNNNNNNNNNnnnnnnn-帽。因此，帽代表两个末端处的反向脱氧无碱基或类似修饰；n代表2’-O-甲基核糖核苷酸(A，G，U，C)；N表示硫代磷酸酯连接的脱氧核糖核苷酸(A，G，T，C)；x表示5-7的整数；y表示7-9的整数；和z表示5-7的整数。 
应当注意整数x，y和z可以彼此独立地选择，尽管优选x和z在给定反义寡核苷酸中相同。因此，下列第三代反义寡核苷酸的碱基设计或结构 可以如下：帽-(np)5(Ns)7(np)5-帽，帽-(np)6(Ns)7(np)5-帽，帽-(np)7(Ns)7(np)5-帽，帽-(np)5(Ns)8(np)5-帽，帽-(np)6(Ns)8(np)5-帽，帽-(np)7(Ns)8(np)5-帽，帽-(np)5(Ns)9(np)5-帽，帽-(np)6(Ns)9(np)5-帽，帽-(np)7(Ns)9(np)5-帽，帽-(np)5(Ns)7(np)6-帽，帽-(np)6(Ns)7(np)6-帽，帽-(np)7(Ns)7(np)6-帽，帽-(np)5(Ns)8(np)6-帽，帽-(np)6(Ns)8(np)6-帽，帽-(np)7(Ns)8(np)6-帽，帽-(np)5(Ns)9(np)6-帽，帽-(np)6(Ns)9(np)6-帽，帽-(np)7(Ns)9(np)6-帽，帽-(np)5(Ns)7(np)7-帽，帽-(np)6(Ns)7(np)7-帽，帽-(np)7(Ns)7(np)7帽，帽-(np)5(Ns)8(np)7-帽，帽-(np)6(Ns)8(np)7-帽，帽-(np)7(Ns)8(np)7-帽，帽-(np)5(Ns)9(np)7-帽，帽-(np)6(Ns)9(np)7-帽和帽-(np)7(Ns)9(np)7-帽。 
基于本文提供的技术教导可以产生的和可以用作药物和/或诊断剂的另一类化合物是针对编码蛋白激酶Nβ的核酸、优选mRNA的小干扰RNA(siRNA)。siRNA是典型长度为约21至约23个核苷酸的双链RNA。两条RNA链之一的序列对应于待降解的靶核酸如编码蛋白激酶Nβ的核酸的序列。换句话说，知道靶分子(在本情形中蛋白激酶Nβ)的核酸序列，优选mRNA序列，可以设计双链RNA，两条链之一与所述例如蛋白激酶Nβ的mRNa互补，当将所述siRNA应用于含有编码蛋白激酶Nβ的基因、基因组DNA、hnRNA或mRNA的系统时，各自的靶核酸将被降解和因此降低各个蛋白质的水平。设计、构建和使用所述siRNA分别作为药物和诊断剂的基本原理尤其在国际专利申请WO 00/44895和WO 01/75164中描述。 
基于上述设计原理，一旦已知编码蛋白激酶Nβ的核酸序列，可以分别产生这些siRNA，反义寡核苷酸和核酶。这对于核酸的前体分子如hnRNA、cDNA等包括基因组核酸也是正确的。当然，考虑到碱基对互补的基本原理，优选基于沃森-克里克碱基配对，还知道各自的反义链可以允许设计基于这些核酸的化合物。因此，本发明的另一方面涉及针对蛋白激酶Nβ的或蛋白激酶Nβ特异性的特定siRNA，核酶和反义核苷酸。下面，这通过siRNA进一步举例说明，然而这同样适用于反义寡核苷酸和核酶，如本领域技术人员所公认的。 
该siRNA包含优选15-25个核苷酸的长度，其中这实际上意味着包含15，16，17，18，20，21，22，23，24或25个核苷酸的任何长度。在另 一实施方案中，siRNA甚至可以显示更多的核苷酸。按照本领域公知的设计原理，可以产生各自的siRNA。因此，本文要求的siRNA包含优选15-25个连续核苷酸的任何核苷酸长度的一段序列，其至少部分与编码PKN-β的有意义或反义链互补，第二条核糖核苷酸链，其分别与第一条链和因此编码蛋白激酶N-β的反义链和有意义链至少部分互补。本领域已知的产生或制备siRNA的任何设计原理可以应用于该类双链结构。本文公开的siRNA空间(space)包含siRNA分子，其反义链以对应于上述PKN-β编码序列的第1个核苷酸的核苷酸开始。另外的这种siRNA分子以对应于上述PKN-β编码序列的第2个核苷酸的核苷酸开始，等等。重复这种类型的对PKN-β编码序列的扫描以便提供所有可能的可以针对PKN-β的siRNA分子。如此产生的任何siRNA分子的长度可以是适合于siRNA的任何长度，更具体地上述任何长度。优选地，除了反义链或有意义链最5’末端的核苷酸以外，本文公开的siRNA分子空间中的各种siRNA分子重叠。明显的是如此获得的反义序列必须通过碱基配对互补以便形成功能活性siRNA所需的至少部分双链的结构。 
基于上述类别的化合物如抗体、肽、抗促成素、适体、spiegelmer、核酶、反义寡核苷酸以及siRNA的作用方式，因此还属于本发明范围内的是使用分别靶向蛋白激酶N-β和编码其的核酸的这些化合物中任何一种，以制备针对本文所述任何疾病和本文所述任何疾病症状的药物或诊断剂。另外，这些试剂可以用于分别监视所述疾病和疾病症状的进展和施用的任何治疗的成功。 
按照本发明设计的各类化合物如抗体、肽、抗促成素、小分子、适体、spiegelmer、核酶、反义寡核苷酸和siRNA也可以包含在药物组合物中。优选该药物组合物用于治疗本文所述疾病或本文所述疾病症状。在一个实施方案中药物组合物还可以包含一种或几种上述类别的化合物和/或单一类别的一个或多个成员，和任选地另外的药物活性化合物，和药用载体。该载体可以是液体或固体，例如溶液，缓冲液，醇溶液等。适当的固体载体尤其是淀粉等。本领域技术人员已知的是提供按照上述类别的化合物的不同化合物的各种制剂，以便实现特定给药途径如口服、肠胃外、皮下、静脉内、肌内等。 
上述不同类别的化合物的各种化合物也可以单独或组合附属于或包含在试剂盒中。除了各种化合物以外该试剂盒另外包含一种或多种附加成分(element)或化合物，其中该成分选自包含缓冲液、阴性对照、阳性对照和各种化合物的使用说明的组。优选地，各种化合物以干燥或液体形式存在，优选作为每次单一给药的单位剂量存在。试剂盒可以特别用于治疗、诊断或监视疾病或对本文所述疾病和疾病症状施加的治疗的进展。 
现在通过下列附图和实施例进一步举例说明本发明，其不意欲限制保护范围。从所述附图和实施例中，可以理解实施方案和优势，其中 
图1显示生长因子诱导的PI 3-激酶途径激活的图示； 
图2显示同位PC-3小鼠模型中在用雷帕霉素处理后淋巴结转移的测量； 
图3显示鉴定PKN β为PI 3-激酶途径下游药靶的实验方法； 
图4显示对PKN β的初级GeneBloc筛选； 
图5显示用PKN β特异的GB转染的PC3细胞在matrigel上的生长； 
图6显示通过在HeLaB细胞中瞬时表达siRNA的RNA干扰； 
图7显示在使用蛋白激酶Nβ反义和有意义序列作为探针杂交后人前列腺细胞和人前列腺癌细胞的照片； 
图8显示描述使用两种不同siRNA构建体的同位前列腺肿瘤模型中原发性肿瘤体积的图表(图8A)，描述使用两种不同siRNA构建体的同位前列腺肿瘤模型中淋巴结体积转移的图表(图8B)，和在使用对照siRNA(图8C1)和蛋白激酶Nβ特异性siRNA构建体(图8C2)的同位前列腺肿瘤模型中前列腺和淋巴结的照片； 
图9显示不同蛋白激酶Nβ衍生物和它们的活性的蛋白质印迹分析，使用MPB作为标准磷酸化底物，在HeLa细胞中瞬时过量表达，抗-蛋白激酶Nβ抗体(抗-PK)用于检测激酶衍生物的相对表达水平(图9A)，另外的不同蛋白激酶Nβ衍生物的蛋白质印迹分析，使用磷酸化形式的蛋白激酶Nβ的特异性抗体(图9B)，和所用各种蛋白激酶Nβ衍生物的图示(图9C)； 
图10显示各种蛋白激酶Nβ衍生物的蛋白质印迹(图10A)，监视其在HeLa细胞中的表达水平，和蛋白激酶Nβ衍生物的磷酸化的凝胶分析 (图10B)； 
图11显示检测蛋白激酶Nβ的蛋白质底物磷酸化的免疫沉淀测定结果，通过蛋白质印迹法(图11A)或通过放射自显影检测掺入32P-标记的磷酸盐(图11B)来检测其磷酸化形式。为了确保在各个免疫沉淀物中存在可比较量的PKNβ，使用抗-PKNβ抗体重探测图11A所示的滤液(“激酶”，图11C)。 
图12显示比较用LY294002处理不同时间的样品中HeLa和PC-3细胞中内源蛋白激酶Nβ的表达的蛋白质印迹分析。平行监视磷酸化AKT的水平以证实PI 3-激酶抑制剂的功效。 
图13显示免疫-复合体中存在的各种重组PKNβ衍生物的相对蛋白质量和激酶活性。在裂解指定时间之前已经用PI 3-激酶抑制剂LY294002处理表达各种重组蛋白质的细胞。 
图14显示一组照片，其中通过聚焦荧光显微镜研究PKNβ及其衍生物如PKNβ野生型(图14A)、PKNβ衍生物TA(图14B)、PKNβ衍生物KE(图14C)和PKNβδN(图14D)的细胞分布。HA-标记的PKNβ重组衍生物在HeLa细胞中瞬时表达48小时。在固定和透化处理以后，通过使用抗-HA抗体接着FITC-偶联的抗小鼠抗体检测重组蛋白质的表达。通过用罗丹明-鬼笔毒环肽标记细胞骨架肌动蛋白来复染细胞。 
图1显示生长因子诱导的PI 3-激酶途径激活的图示。生长因子刺激细胞导致细胞膜上它们相关受体的激活，其又与胞内信号分子如PI 3-激酶相关并将其激活。肿瘤抑制剂PTEN干扰PI 3-激酶介导的下游应答和确保途径的激活以瞬时方式发生。LY294002是PI 3-激酶的小分子抑制剂。PI 3-K的一个已知下游基因是mTOR(雷帕霉素的哺乳动物靶)，其可以通过临床批准的药物雷帕霉素(Rapamune)抑制。PI 3-K涉及细胞增殖、细胞存活、葡萄糖转运、翻译、转移和迁移的调节。X表示下游效应物，其表示预计涉及促进癌细胞转移行为的潜在药物靶。在途径中作用于更下游的该类效应物分子可能代表比更“上游”的靶如mTOR更好的药靶，因为它们具有较小的多效作用。 
结合下列实施例更详细地讨论图2至图5的主题。 
图6显示通过在HeLaB细胞中瞬时表达siRNA干扰。 
(A)通过启动子(U6+2)驱动表达靶特异序列(来源于目的基因的模板，含有21-链节的有意义和反向互补序列，连接12-链节的聚A序列)来产生siRNA分子。经转录后RNA可能形成双链siRNA分子。 
(B)siRNA表达的靶基因的模板序列。将相应的序列引入携带U6+2启动子盒的表达载体。 
(C)siRNA表达对细胞生长和增殖的影响。通过在用于RNAi干扰实验的HeLaB细胞中转染瞬时表达构建体(见上文)。在转染后48小时收获细胞，随后接种(80000个细胞/孔)在“matrigel”凝胶上。通过在matrigel上测定转染细胞的生长/增殖来分析RNA干扰对相应基因的表达的影响。靶向PTEN的siRNA的表达对matrigel上HeLaB细胞生长无影响(右图)，而p110β和PKNβ特异的siRNA的表达严重干扰HeLaB在matrigel上的生长行为(中图和右图)。 
实施例1：材料和方法 
细胞培养 
人前列腺癌PC-3细胞获自美国典型培养物中心(ATCC)。细胞在F12K营养混合物(Kaighn’s改进)中培养，该营养混合物含有10％胎小牛血清(CS)，庆大霉素(50μg/ml)，和两性霉素(50ng/ml)。按照制造商的使用说明，通过使用各种阳离子型脂质如Oligofectamine，Lipofectamine(LifeTechnologies)，Argfectin50或Profectin50(Atugen/GOT Berlin，Germany)，或FuGene 6(Roche)，在96孔或10-cm板中进行转染(30％-50％汇合)。通过将预形成的无血清培养基中的5x浓缩的GeneBloc和脂质复合物加入完全培养基中的细胞来转染GeneBlocs。对于平铺在96孔中的细胞总转染体积为100μl，对于10cm平板中的细胞为10ml。取决于细胞密度，最终脂质浓度为0.8-1.2μg/ml；GeneBloc浓度在每个实验中显示。将培养的细胞胰蛋白酶消化，在通过培养基终止胰蛋白酶作用后收获。加入洗涤步骤(PBS；离心5分钟/1000rpm)，最后，考虑接种的细胞数和体积重悬浮沉淀。 
通过Taqman分析测定RNA水平的相对量 
使用Invisorb RNA HTS 96试剂盒(InVitek GmbH，Berlin)分离和纯化在96-孔中转染的细胞的RNA。使用300nM PKN β5’引物，300nM PKN β3’引物和100nM标记的PKN βTaqman探针Fam-Tamra，通过实时RT-PCR(Taqman)分析检测PKN βmRNA表达的抑制。按照制造商的使用说明在下列条件下在50μl中进行反应并在ABI PRISM 7700测序仪(Applied Biosystems)上分析：48℃30分钟，95℃10分钟，接着95℃15秒和60℃1分钟40个循环。 
在matrigel基质上的体外生长 
当接种在Matrigel上时用5μM LY294002或DMSO处理PC3细胞。如果在接种前转染细胞，用GeneBloc转染细胞和在转染后48小时胰蛋白酶消化。在培养基中洗涤细胞，接种到用250l matrigel基底膜基质(BectonDickinson)预包被的双份24-孔(每孔100.000个细胞)中。在温育24-72小时后用与Axiovert S100显微镜(Zeiss)连接的Axiocam照相机以5x放大率照相。 
Affymetrix 
根据制造商的方案，使用总RNA试剂盒(AMBION)制备来自Matrigel上生长的细胞的总RNA。在最后步骤中将沉淀的总RNA重悬浮在Invisorb裂解缓冲液中并使用Invisorb spin细胞-RNA试剂盒(INVITEK)纯化。根据Affymetrix的方案制备生物素标记的cRNA，将15μg cRNA杂交到Affymetrix GeneChip组HG-U95上。 
数据分析 
使用Affymetrix GeneChip软件Microarray Suite v4.0分析原始数据。作为一组对应于一个转录物的16-20个探针对的平均的与错配寡核苷酸相比完全匹配寡核苷酸的杂交信号的差异，计算每个探针组的强度。探针组的平均差异与转录物的丰度成比例。在比较前将不同测定的总信号强度换算成相同值。通过成对比较来自实验和基线测定的相应探针对的强度，使用Affymetrix软件计算倍数变化。使用Affymetrix描述的抉择矩阵，软件 还产生绝对调用(call)(在实验中转录物缺乏，临界或存在)和差异调用(与另一个实验相比一个实验中转录物的丰度：增加，临界增加，无变化，临界降低，降低)。结果输出到Microsoft Excel(绝对调用，差异调用，倍数变化)中并过滤。丢弃具有缺少调用或无变化调用的所有探针组并通过倍数变化将表分类。 
动物研究 
按照食品与药物管理局的非临床实验室研究的良好实验室规范(GLP条例)和根据作为立法基础的德国动物保护法进行体内实验。 
雄性shoe：NMRI-nu/nu小鼠(Tierzucht 
Figure G03819435X19960327D000261
GmbH)，在SPF条件下保养(层流气流设备，Scantainer，Scanbur)，用作人前列腺癌细胞的受体。将2×106/0,03ml肿瘤细胞接种到年龄为6-8周和重28-30g的动物的前列腺的左背侧叶(iprost；同位的)或肝脏的左侧叶的顶部(ihep；异位的)。为此，小鼠接受全身麻醉，使用Ketanest(Parke-Davis GmbH)和Rompun(Bayer Vital GmbH)80∶1的混合物，剂量分别为100mg/kg和5mg/kg。在腹部身体表面彻底消毒后，通过腹部皮肤和腹膜壁进行切割，从包皮腺边缘附近开始和测量约1cm。借助一对镊子和棉拭，显现前列腺。同位细胞攻击，接着借助放大镜和通过使用携带30G 0,30×13的微型手术针(Becton Dickinson)的1ml注射器(Henke Sass Wolf GmbH)。施用是成功的，在接种位点观察到显著疱疹。关于腹膜壁和腹部皮肤的Michel钳11×2mm(Heiland)，通过缝合材料(PGA Resorba，Franz Hiltner GmbH)闭合伤口。伤口喷雾(Hansaplast Sprühpflaster，BeiersdorfAG)覆盖损伤。在手术后阶段期间将动物保养在温暖环境中直至完全醒来。按照每组由5-10只动物组成的治疗组的数量随机化动物。依次检查它们，包括记录发现。施用Ssniff NM-Z，10mm，可高压灭菌(ssniff 
Figure G03819435X19960327D000262
GmbH)，作为强化食物和通过HCl酸化饮用水，两者都任意。 
评估 
为了收到实际剂量水平，在治疗日登记体重。同时，从体重发展可以获得以认识治疗方式对整个生物体的影响。 
在第0(基线)；14；28；和35天(牺牲)进行血穿刺。从短期麻醉的动物(二乙醚，Otto Fischar GmbH)的眼眶静脉中吸血。为治疗的相容性和副作用提供数据的评估参数如下：白细胞数；血小板数；酶。另外的血载参数是胆红素；肌酸酐；蛋白质；脲；尿酸。 
将所有牺牲的动物完全解剖并照相记录。通过一对测径器二维测量肿瘤(前列腺)和转移瘤(尾部，腰部，肾淋巴结转移瘤)。按照V(mm3)＝ab2/2计算体积，b＜a。通常，实施治疗方法的细胞数导致关于前列腺100％的肿瘤吸收。登记一些器官(肝脏；脾；肾)的重量以便发现另外的关于了解次级副作用的数据。 
对于组织学分析，将肿瘤组织，即前列腺肿瘤和淋巴结转移瘤的样品固定在5％甲醛中并包埋石蜡。常规地，将切片HE染色，如果需要制备特异染色(Azan，PAS)。 
为了检测肿瘤和转移细胞的人源，将充分的组织样品冷冻在液氮中。当使用PCR和用huHPRT特异扩增子的Taqman分析时，我们可以在5mg组织中检测到50个人细胞。 
通过Mann和Whitney u-检验统计学证实治疗结果。 
实施例2：对下游药靶适合性概念的实验证据 
如在结合于此作为参考的本说明书介绍部分中概述，与信号途径下游连接的靶对于设计或开发药物和诊断剂都有价值。明显的是，如果特定靶与其它不同途径连接或者由于它在信号途径中的位置与许多生物学现象连接如转移和迁移、生长翻译细胞调亡、细胞周期、DNA修复等，如在PI-3激酶的情形中，处理该靶的任何化合物可能具有多种副作用，其可能对系统有害和从医学观点来看是不希望有的。因此，进一步作用下游的靶应当是治疗干预的第一选择。 
本发明人已经发现在PI 3-激酶途径的控制下涉及除了mTOR以外的另外可能的药靶，其特异性用于控制转移和迁移的现象和因此肿瘤发生。在制药工业中已经发现以Rapamune的商品名出售的雷帕霉素适合于抑制转移和迁移。这证实了处理下游药靶的策略的适合性。 
如从图2中可以知道，雷帕霉素适于减小淋巴结转移瘤的体积和因此 其效果比得上公知的PI 3-激酶抑制剂LY294002。如在图2A中描述，使用肿瘤获得模型，在第1天开始使用雷帕霉素的处理。使用的两个浓度，即0.4mg/kg/剂量-2mg/kg/剂量导致淋巴结转移程度的巨大降低，表示为与磷酸盐缓冲盐水阴性对照相比测量的转移瘤体积(mm3)。 
对于组织学分析，将肿瘤组织，即前列腺肿瘤和淋巴结转移瘤的样品固定在5％甲醛中并包埋石蜡。常规地，将切片HE染色，如果需要制备特异染色(Azan，PAS)。 
在从第28天开始处理的Rapamune处理确立(established)肿瘤模型的情形中也基本上获得相同结果。 
测量在用雷帕霉素(Rapamune)处理以后在同位PC-3小鼠模型中的淋巴结转移。在图2(A)中显示(A)肿瘤获得模型的结果。用0.03ml前列腺内2×106PC3细胞注射裸shoe：NMRI-nu/nu小鼠(每组8只)，每日腹膜内使用Rapamune进行处理，共28天，剂量为2mg/kg和0.4mg/kg。PBS用作对照。 
为了处理确立的肿瘤(B)，允许细胞ipros生长28天，在移植后第29天至第50天口服使用Rapamune进行处理。如A中概述选择剂量。分别在第29天和第51天牺牲动物，测定总淋巴结转移。 
实施例3：鉴定PKNβ作为PI 3-激酶途径中的下游药靶 
基本实验方法在图3中显示。用DMSO或PI 3-K抑制剂LY294002处理在Matrigel上培养的PC3细胞，从每个样品中分离总RNA。进行差异Affymetrix基因表达作图，使用实时RT-PCR Taqman测定证实表达。将p110用作无差异的标准。PC3细胞是PTEN-/-的，这意味着肿瘤抑制剂PTEN确实在这些细胞中缺乏，以致PI 3-激酶途径被永久激活，导致细胞增加的转移活性或行为，其表现为它们在matrigel测定中的生长模式。具有侵入生长潜力的细胞在基底膜如matrigel基质上显示增强生长。(Petersen，O.W.，Ronnov-Jessen，L.，Howlett，A.R.和Bissell，M.J.(1992)Interaction withbasement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiationpattern of normal and malignant human breast epithelial cells.Proc Natl AcadSci USA，89，9064-9068.(Auch：Sternberger et al.，2002Antisense & Nucleicacid drug development 12：131-143)。 
与其相关应当注意PC3细胞在matrigel上生长并将这当作接近体内环境的模型系统，从中分离的RNA假定比获自生长在非-matrigel环境如常规细胞培养板中的细胞的任何制剂更接近原位情形或结果。 
实施例4：筛选针对蛋白激酶Nβ的最优反义寡核苷酸 
如所述用不同的GeneBloc浓度转染PC3细胞，使用Taqman测定在转染后24小时测定mRNA水平，该测定使用300nM PKNβ特异的正向和反向引物和100nM探针和人-肌动蛋白的40nM正向和反向引物和100nM探针。将mRNA水平对内部肌动蛋白水平标准化，显示相对于GBC(用GeneBloc Control转染的细胞)的量。 
其结果在图4中显示。从图4中，作为特别有利的反义寡核苷酸，选择GeneBlocs 70210和70211用于进一步研究。 
关于在各种实施例中本文使用的GeneBloc，应当注意它们都是本文指定的第三代反义寡核苷酸，这意味着，从表1中也是明显的，大写字母代表脱氧核苷核苷酸，其通过硫代磷酸酯而不是磷酸二酯键连接。 
表1：所用各种GeneBlocs、它们的别名、相对于靶核酸的错配和它们的序列和结构特性的综述 
 GeneBloc No   Alias   MM   Sequence
  70669   PKNbeta：706L21   0   ggagguCCAGTTTCTgagagg
  70670   PKNbeta：377L21   0   uguuucACCTTCAGCuccaca
  24536   PKNbeta：2021L23   0   aggacaaCACAAGCCAcgtagaa
  24537   PKNbeta：2665L23   0   gctctgaCACAAAGTCgaagtcc
  24538   PKNbeta：2322L23   0   gcagtcaAACACCTCTtcctctg
  70210   PKNbeta：1034L21   0   caacacGGTTGTCCAccttta
  70211   PKNbeta：1784L21   0   tcagtgCTTTGATGGcgtagt
  70671   PKNbeta：183L21   0   cuucucGCAGTACAGgcucuc
  70676   PKNbeta：1034L21   4   caagacGCTTGTGCAcgttta
  70677   PKNbeta：1784L21   4   tcagagCTTAGTTGGcgttgt
[0156] 各种GeneBlocs对应于下列SEQ.ID.Nos： 
70669：SEQ.ID.No.3 
70670：SEQ.ID.No.4 
24536：SEQ.ID.No.5 
24537：SEQ.ID.No.6 
24538：SEQ.ID.No.7 
70210：SEQ.ID.No.8 
70211：SEQ.ID.No.9 
70671：SEQ.ID.No.10 
70676：SEQ.ID.No.11 
70677：SEQ.ID.No.12 
另外应当注意，考虑到以上反义寡核苷酸是GeneBlocs即第三代反义寡核苷酸的事实，以上的任何“t”实际上是“u”。 
实施例5：选择性剔除蛋白激酶Nβ 
为了证明蛋白激酶Nβ是PI 3-激酶途径适合的下游药靶，将获自实施例4的两个特别有利的GeneBlocs用于基于matrigel的生长实验。将Matrigel生长实验当作显示各个细胞转移和迁移行为的替代模型。将更汇合的细胞生长当作它们的转移和迁移行为增加的指示，这允许细胞扩展到matrigel提供的三维结构上。 
如所述转染PC3细胞并接种在matrigel上，监视生长。从接种在matrigel上的等份细胞中分离mRNA，并使用Taqman测定分析(作图)。将PKNβ特异的mRNA对内源p110αmRNA水平标准化。将PTEN特异的GeneBloc用作PTEN-/-PC-3细胞中的阴性对照，将p110α特异的GeneBloc用作胞外基质中生长的阳性对照。通过分别比较PKNβ特异的GeneBloc 70210或70211和它们对应的错配寡核苷酸70676和70677处理的细胞的生长，显示特异的生长抑制。 
各自的结果也在图5中举例说明。从这可以知道基因块70211和70210 可能是制备治疗本文所述疾病和疾病症状的药物或诊断剂的适当化合物。 
实施例6：通过在HeLaB细胞中瞬时表达siRNA的RNA干扰 
本实验是成功设计允许特异性处理下游药靶蛋白激酶Nβ的siRNA的实例。如图6(A)所示，通过启动子(U6+2)驱动表达靶特异序列(来源于目的基因的模板，含有21-链节的有意义和反向互补序列，连接12-链节的聚A序列)来产生siRNA分子。经转录后RNA可能形成双链siRNA分子。 
在与针对PKNβ的mRNA序列设计的siRNA相同的载体构建体中，将各种构建体如p110β和PTEN分别用作阳性和阴性对照。各自的设计在图6中显示。(B)是siRNA表达的靶基因的模板序列，将其导入携带U6+2启动子盒的表达载体。 
通过转染到用于RNAi干扰实验的HeLaB细胞中瞬时表达构建体。在转染后48小时收获细胞，随后接种(80000个细胞/孔)在“matrigel”上。通过测定在matrigel上转染细胞的生长/增殖来分析RNA干扰对相应基因的表达的影响。靶向PTEN的siRNA的表达对matrigel上HeLaB细胞生长无影响(右图)，而p110β和PKNβ特异的siRNA的表达严重干扰HeLaB在matrigel上的生长行为(中图和右图)。 
鉴于此，特定siRNA序列证明是治疗本文公开的疾病和疾病症状的有效方式。 
实施例7：在人前列腺肿瘤中检测蛋白激酶Nβ 
为了提供进一步的证据证明蛋白激酶Nβ是治疗前列腺肿瘤的适合的靶，将各种人前列腺组织进行原位杂交。 
对于原位杂交从pCR4Topo载体中序列NM 013355的核苷酸位置1672-2667制备有意义和反义链，因此将T7和T3聚合酶用于扩增目的。人前列腺肿瘤细胞(PC-3)在小鼠中生长。在解剖后，将组织冷冻在-20℃异戊烷溶液中，在-15℃切片并保存在-80℃。在杂交前将切片在多聚甲醛中固定。将人肿瘤标本在多聚甲醛中固定并石蜡包埋。将肿瘤标本用蛋白酶K处理并乙酰化。用35S-ATP和35S-UTP双链标记核酸探针，并与组织在58℃在含有50％甲酰胺的杂交缓冲液(0.4M NaCl，50％甲酰胺，1x Denhardt’s，10mM Tris，1mM_EDTA，10％葡聚糖硫酸酯，10μg/ml每种tRNA和鲑精DNA，10mM DTT)中温育。 
原位杂交的结果在图7中描述。使用前列腺肿瘤原位杂交的蛋白激酶Nβ反义探针，腺被强烈染色(图7A)。与其相反，健康的前列腺组织染色较少并且仅提供背景信号，再次使用反义探针(图7C)。与其相反，关于两种组织有意义探针的使用不提供任何信号。 
实施例8：通过siRNa体内减少原发性肿瘤和淋巴结转移瘤 
本实施例涉及靶基因的体内证实，使用同位前列腺肿瘤模型，其中通过使用针对蛋白激酶Nβ的siRNA可以显示原发性肿瘤和淋巴结转移瘤的减少都可以实现。结果在图8A-8C中描述。 
在图8A的图表中，使用下列两个siRNA构建体中任何一种可以显著减小如实施例1中所述测定的同位前列腺肿瘤模型中的原发性肿瘤的体积： 
5’actgagcaagaggctttggag或 
5’aaattccagtggttcattcca。 
作为阴性对照使用针对p110-α亚基的siRNA，作为阳性对照使用针对p110-β亚基的siRNA。阳性对照因此作用于蛋白激酶NβPTEN的上游调节物。 
另一组两个独立的siRNA分子被用于降解淋巴节转移瘤中编码蛋白激酶Nβ的mRNA。淋巴结转移瘤是在下列淋巴结中发现的继发性肿瘤：尾部，腰部，肾和纵隔淋巴结，其中尾淋巴结与前列腺最近，纵隔淋巴结与移植肿瘤最远。如在原发性肿瘤的情形中，siRNA构建体明显成功地减少了编码蛋白激酶Nβ的mRNA和由此减小了肿瘤体积(图8B)。阳性和阴性对照如关于原发性肿瘤减小所讨论的。在两种情形(即原发性肿瘤和淋巴结转移瘤)中，将人前列腺肿瘤细胞遗传改造以从聚合酶III U6启动子表达各自的siRNA分子。 
除了这些结果以外，如图8C1和图8C2所描述的清楚的表型分析显示经激活人前列腺肿瘤细胞中的siRNA构建体转录后，可以显著减少淋巴结转移瘤，在图8C1中描述的肿胀的淋巴结在如图8C2描述的siRNA处理 的组织中不存在。 
实施例9：蛋白激酶Nβ的功能表征 
本实施例涉及蛋白激酶Nβ的功能表征，更具体地涉及衍生化，即截短或突变蛋白激酶Nβ的功能氨基酸残基对其激酶活性和对其激酶活性受磷酸化调节的影响。 
如也在图9C中至少部分用示意图描述，产生下列蛋白激酶Nβ的衍生物，氨基酸残基是指本文公开的野生型序列： 
a)包含氨基酸535-889的激酶结构域； 
b)包含氨基酸288-889的ΔN； 
c)在位置588处具有赖氨酸至精氨酸的突变的激酶结构域； 
d)在位置588处具有赖氨酸至谷氨酸的突变的激酶结构域； 
e)激酶结构域的衍生物，其在磷酸化位点(AGC激活环共有序列)具有突变，氨基酸位置718的苏氨酸残基被改变为丙氨酸(TA718)或天冬氨酸或谷氨酸(TD718或TE718)；和 
f)全长野生型PKNβ分子(889个氨基酸)。 
将各自片段在HeLa细胞中瞬时表达。它们的相对表达通过Hela细胞提取物使用抗-PKNβ抗体的蛋白质印迹分析测定。 
在大肠杆菌中过量表达PKNβ的C-末端氨基酸(609-889)以后产生多克隆抗-PKNβ抗血清。按照标准方法从包函体中凝胶纯化各种蛋白质片段，回收并浓缩。 
蛋白激酶Nβ在其C-末端的催化结构域与AGC-类型的激酶分子具有同源性。该激酶家族其特征在于催化结构域的激活环中保守的苏氨酸残基，为了酶促活性需要将其磷酸化。由于该苏氨酸和激活环周围氨基酸的高保守性，针对该位点的抗-磷酸抗体可从商业来源中获得。在图9中将这些各种抗体称为抗-P*-PRK，在图10中称为抗-P*-AGC激酶。 
MPB是髓鞘碱性蛋白，其是标准体外磷酸化底物。 
获得下列结果： 
 蛋白激酶Nβ衍生物   活性
 全长野生型 包含氨基酸535-889的激酶结构域   ++*   +*
 包含氨基酸288-889的ΔN   -*
 在位置588处具有赖氨酸至精氨酸的突变的激酶结构域 (KR 588)   -*
 在位置588处具有赖氨酸至谷氨酸的突变的激酶结构域 (KE 588)   -*
 TA718   -*
 TD718或TE718   -*！
*+：有活性 
-：无活性 
！：没有观察到如可以从其它激酶可比较的突变中期望的“超活化”(Morgan和Debond，1994)。 
结果在图9中描述。 
图9A显示不同蛋白激酶Nβ衍生物和它们的活性的凝胶分析，使用MPB作为标准磷酸化底物，在HeLa细胞中瞬时过量表达。如可以从图9A中获知，除了全长蛋白激酶Nβ以外，仅其野生型形式的激酶结构域在磷酸化MPB中有活性。 
使用相同的蛋白激酶Nβ衍生物，可以观察到除了包含在位置718处具有突变T/A的激酶结构域的衍生物以外，无论它们另外的内在活性，所有展示的其它衍生物也被磷酸化。 
数据显示功能激酶结构域的存在和位置718处的磷酸化是PKN β激酶活性的前提条件。然而，如从ΔN形式不能用作激酶可以得出结论，它们是不足够的。数据还显示PKNβ在氨基酸718处不自磷酸化，而是需要通过另外的激酶分子磷酸化，因为激酶缺陷型KR588突变体蛋白质在位置718处保持磷酸化。 
实施例10：全长PKNβ的表征 
为了分析全长分子中蛋白激酶Nβ的功能氨基酸残基的突变，如图10 和11所示进行下列实验： 
为了测量PKNβ的体外激酶活性，重组HA-或Myc-标记的PKNβ衍生物在HeLa或COS-7细胞中瞬时表达。较小的激酶结构域衍生物用作对照。平行用如实施例9所述抗-蛋白激酶Nβ抗体(图10A)探测含有重组形式的蛋白激酶Nβ的细胞提取物，以证明可比较的表达水平，和用抗-磷酸AGC位点抗体(也称为抗-P*-AGC-激酶)(图10B)检测以显示蛋白激酶Nβ衍生物体内不同磷酸化程度。 
实施例11：全长蛋白激酶Nβ的活性的磷酸化要求和开发非放射性体外激酶测定-蛋白激酶Nβ对HTS测定的适合性 
通过使用抗-标记抗体从图10所示细胞提取物中免疫沉淀PKNβ-衍生的分子。如所述(Klippel等，1996)洗涤免疫沉淀并分成两半。一半与缓冲液中作为磷酸化底物的5μg MBP(UBI)，4mM MgCl2和γ-32P-ATP在室温下温育10分钟。另外，如Klippel等，1998加入磷酸酶抑制剂和非特异性作用的激酶的抑制剂。在通过16％SDS-PAGE分离反应产物以后通过放射自显影检测放射性磷酸盐的掺入(图11B)。 
将免疫沉淀的第二半份与作为磷酸化底物的1μg GST-GSK3融合蛋白(Cell Signaling Technology)在200μM rATP的存在下温育。随后通过8-16％梯度SDS-PAGE和使用抗-磷酸GSK3α抗体(Cell SignalingTechnology)的蛋白质印迹法分析反应混合物(图11A)。任何提取滤液和用抗-PKNβ抗血清重探测以证实各自免疫沉淀中可比较量的PKNβ蛋白质的存在(图11C)。 
通过与活性蛋白平行分析激酶缺陷型变体(例如在ATP结合位点含有突变，参见以上)控制体外磷酸化反应的特异性。 
其它为全长野生型蛋白激酶Nβ，在蛋白激酶Nβ的氨基酸718处TA突变变体的情形中缺乏信号显示该氨基酸残基确实是抗体检测的磷酸化位置(图10B)。激酶缺陷型变体(如图10和图9分别显示的KE或KR突变)在该位点被磷酸化的事实显示苏氨酸718不是自磷酸化的底物。而细胞中的另一种激酶必须负责该位点的磷酸化，其中PDK1是可能的候选物。 
此外，从该实验结合实施例9的实验，显示位置718处的蛋白激酶Nβ的磷酸化是蛋白激酶Nβ活性的前提条件；所有在该位点检测的突变抑制磷酸化和导致无活性的激酶分子。因此特别优选的可以结合本文公开的本发明任何方面使用的蛋白激酶Nβ是在位置718处磷酸化的蛋白激酶Nβ或其衍生物，包括如本文所述仅包含激酶结构域的衍生物。数据进一步显示全长PKNβ也不在氨基酸718处自磷酸化，而是需要通过另一激酶分子磷酸化，因为激酶缺陷型KE588突变蛋白质在位置718处保持磷酸化。 
如可以从图11中看出，可以将测定蛋白激酶Nβ的活性修改为允许筛选蛋白激酶Nβ抑制剂至高通量系统中的形式。 
第一步，确定非放射性筛选形式的适合性，其中将如已经结合实施例10讨论的各种蛋白激酶Nβ衍生物用于磷酸化适当底物。该底物可以例如是MBP或GSK3肽，其典型地固定在适当载体如琼脂糖或sepharose珠或在塑料表面上。在本情形中和如图11A所描述，底物是与副肌球蛋白融合的GSK3-衍生的肽。第一行显示所有使用不同蛋白激酶Nβ衍生物的各种测定实际上含有所述衍生物。仅全长野生型蛋白激酶Nβ或如实施例9所定义的激酶结构域适合于磷酸化底物。通过抗-磷酸GSK3α抗体(以上所述)检测本情形中的磷酸化底物。 
为了确认在图11A中描述的非放射性方法足够敏感，用一半免疫沉淀物使用MBP作为磷酸化底物平行进行放射性方法。激酶活性的效力可以从产生的磷酸化的底物的量获得，如掺入[32P]后放射自显影所示。如从图11A和11B中可以看出，全长野生型蛋白激酶Nβ以及激酶结构域显示活性，而使用全长KE和全长TA突变蛋白质分别未检测到(图11A)或检测到非特异性激酶的背景活性(图11B)。 
总之，全长野生型蛋白激酶Nβ以及本文公开的激酶结构域的使用是设计HTS形式的筛选方法的适当靶或工具。各种步骤将因此包含 
a)鉴于蛋白质需要被磷酸化以显示激酶活性而这不容易通过在细菌系统中表达完成的事实，通过在非细菌表达系统如昆虫细胞系统中(关于Klippel等，1997中不同激酶的实例)表达产生纯化的重组蛋白激酶Nβ蛋白质； 
b)固定化GSK3-衍生的底物或类似底物，和将底物与纯化的蛋白激 酶Nβ在rATP，MgCl2和抑制剂的存在下在缓冲液中温育； 
c)任选地在连续洗涤和进一步任选地随后在Delfia或Lance测定系统(Perkin Elmer)中显影后，通过适当检测工具如抗体如抗-磷酸-GSK3抗体检测底物磷酸化，其中磷酸化位点被Europium-标记的抗体结合。结合的Europium的量然后通过时间分辨荧光分析来定量。 
实施例12：内源性PKN-β的表达水平测定 
在本实施例中提供实验证据证明PKN-β以PI3-激酶依赖型方式表达。图3中显示的PKN-βRNA的PI 3-激酶-依赖型表达在此进一步在蛋白质水平上证实。 
如本文实施例1所述培养PC-3细胞。所述PC-3细胞是PTEN-/-。HeLa细胞获自美国典型培养物中心(ATCC)并如Sternberger等(2002)所述培养。转染在10-m板中进行(30％-50％的汇合)，按照制造商的使用说明使用Fugene 6(Roche，Nutley，NJ)。将培养的细胞胰蛋白酶消化，在通过培养基终止胰蛋白酶作用以后收获。 
用10μM LY294002或DMSO处理两种细胞类型，即PC-3细胞和HeLa细胞指定时间，其中将DMSO用作LY294002的溶剂和因此作为阴性对照。 
通过SDS-PAGE分级获得的提取物，随后通过蛋白质印迹法分析。使用各种抗体检测所示蛋白质如用作加样对照的p110、内源性PKN-β和磷酸化Akt的水平。磷酸化Akt(P*-Akt)用作LY294002-介导的处理的功效的对照。 
结果在图12中描述。 
在PC-3细胞中PI-3-激酶的抑制导致内源性PKN-β表达在24小时后可见的降低，在48小时处理后蛋白质水平进一步降低。在表达较高量的PKN-β蛋白质的HeLa细胞中，该作用较不显著，但是在用LY294002处理48小时后可以检测到减少的量。 
从这可以得出结论，PI3-激酶控制PKN-β的表达。 
实施例13：PKN-β活性需要PI3-激酶 
在HeLa细胞中瞬时表达重组野生型PKN-β或PKN-β的衍生物(如图 10-11中描述)。所述衍生物是如本文实施例10所述的PKN-β衍生物TA和衍生物KE。在每种情形中如上所述通过myc-标记修饰PKN-β，其允许使用抗-Myc抗体沉淀PKN-β及其衍生物。 
为了评估PKN-β的活性，如上所述进行使用免疫沉淀的体外激酶活性。一半沉淀进行体外激酶反应，第二半份通过使用抗-磷酸-PRK抗体的蛋白质印迹法分析。提取滤液并使用抗-PKN-β抗血清重探测。从较早提取的细胞裂解液等分部分中分析磷酸-p70 S6激酶水平，以证实甚至仅在3小时处理后LY294002处理的功效。抗-磷酸p70抗体获自Cell signaling。 
如从图13可以看出，LY294002处理导致PKN-β激酶活性的强烈抑制，该活性在此再次通过MBP的磷酸化来测量。在仅3小时的处理后，该效果是明显的，在24小时PKN-β活性几乎完全被抑制。在LY294002抑制PI 3-激酶后也损害PKN-β在位置718处的磷酸化，然而该影响没有对激酶活性的影响明显。 
PKN-β的TA衍生物用作如上所述的无活性对照，和作为抗-磷酸PRK抗体对位置718(P*-PK)处的磷酸-苏氨酸的特异性的对照。 
PKN-β衍生物KE用作如上所述的激酶缺陷型对照。它的磷酸化状态似乎在某种程度上还受LY294002处理的影响。这显示负责在位置718上磷酸化PKN-β的激酶以PI 3-激酶依赖型方式完成。 
更重要地，本实验显示PKN-β不仅受PI 3-激酶通过它的表达水平调节(参见图3和12)，它还在它激活水平上受调节。这些发现显示PKN-β代表用于干扰超活性的PI 3-激酶途径以治疗干预的“完美的”下游靶，因为它完全依赖于在各种水平上由它调节的PI 3-激酶。这允许产生对蛋白质PKN-β和编码其的核酸显示不同效果的化合物。甚至更重要的，这种PKN-β在翻译而不是转录水平上、即在表达的蛋白质水平上的活性调节，似乎比转录水平上的影响更显著和更持久。 
按照本发明另外的筛选方法是基于这种特别的理解和在体外激酶测定中优选使用放射性或非放射性作为读出。 
实施例14：PKN-β的定位信号 
在本实验中将各种PKN-β衍生物的定位与野生型PKN-β的定位比较。 
图14显示照片，其中通过聚焦荧光显微镜研究PKN-β及其衍生物如PKN-β野生型(图14A)、PKN-β衍生物TA(图14B)、PKN-β衍生物KE(图14C)和PKN-βΔN(图14D)的细胞分布。HA-标记的PKN-β重组衍生物在HeLa细胞中瞬时表达48小时。在固定和透化后，通过使用抗-HA抗体接着FITC-偶联的抗-小鼠抗体来检测重组蛋白质的表达。通过用罗丹明-鬼笔毒环肽标记细胞骨架肌动蛋白来复染细胞。 
结果在图14A-14D中描述，其中在每对照片的左侧涉及经FITC-特异激发的细胞照片，右方照片显示经使用罗丹明-鬼笔毒环肽特异的波长激发后的相同细胞。FITC-染色显示用各种重组蛋白质转染的细胞。罗丹明-鬼笔毒环肽染色显示转染和未转染的细胞。 
如可以从图14A中获得，野生型PKN-β主要定位于细胞核。PKN-βTA的磷酸化位点突变体和KE突变体都是激酶缺陷型，与野生型PKN-β相比不再浓缩在核内，而是扩散在整个细胞中。最后，如图14D中所描述，PKN-β衍生物ΔN，缺少分子N-末端的三个和也是激酶缺陷型(参见图9)，基本上排除在核以外。 
这些数据显示PKN-β对核的适当核定位取决于它作为活性激酶分子的能力和涉及它N-末端结构域的存在。这暗示PI-3激酶可能也调节它的细胞定位。 
在说明书、序列表、权利要求和/或附图中公开的本发明特征可以单独地或以任何组合作为实现本发明各种形式的材料。 
Figure IYZ000004142063800011
Figure IYZ000004142063800021
Figure IYZ000004142063800031
Figure IYZ000004142063800041
Figure IYZ000004142063800061
Figure IYZ000004142063800081
Figure IYZ000004142063800091
Figure IYZ000004142063800111

Claims (16)

1.蛋白激酶Nβ抑制剂在制备治疗和/或预防疾病的药物中的应用，其中所述疾病选自前列腺瘤和淋巴节转移瘤，所述抑制剂选自各自针对蛋白激酶Nβ的反义寡核苷酸和siRNA。
2.按照权利要求1的应用，其特征在于蛋白激酶Nβ的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或数据库登记号PID g7019489或数据库登记号gi7019489所示。
3.编码蛋白激酶Nβ抑制剂的核酸在制备治疗和/或预防疾病的药物中的应用，其中所述疾病选自前列腺瘤和淋巴节转移瘤，所述抑制剂选自各自针对蛋白激酶Nβ的反义寡核苷酸和siRNA。
4.按照权利要求1和3中任何一项的应用，其特征在于蛋白激酶Nβ的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或按照数据库登记号PID g7019489或数据库登记号gi7019489所示。
5.按照权利要求3的应用，其特征在于所述核酸是按照SEQ ID NO.2或按照数据库登记号gi7019488或NM_01335所示。
6.按照权利要求5的应用，其中所述核酸是按照NM_01335.1的核酸。
7.按照权利要求3的应用，其中蛋白激酶Nβ被按照SEQ ID NO.2或按照数据库登记号gi7019488或NM_01335的核酸编码。
8.按照权利要求7的应用，其中所述蛋白激酶Nβ被按照NM_01335.1的核酸编码。
9.按照权利要求1和3中任何一项的应用，其特征在于所述疾病的特征在于与所述疾病有关的细胞缺少PTEN活性，显示增加的攻击行为，或是晚期肿瘤细胞。
10.按照权利要求1和3中任何一项的应用，其中所述疾病是晚期肿瘤。
11.蛋白激酶Nβ和/或编码蛋白激酶Nβ的核酸作为筛选用于治疗和/或预防疾病的药物的靶分子的应用，其中所述疾病选自前列腺瘤和淋巴节转移瘤，其中所述药物包含试剂，所述试剂选自各自针对蛋白激酶Nβ的反义寡核苷酸和siRNA。
12.按照权利要求11的应用，其特征在于所述试剂与编码蛋白激酶Nβ的核酸相互作用。
13.按照权利要求12的应用，其特征在于所述试剂与蛋白激酶Nβ的mRNA、基因组核酸或cDNA相互作用。
14.与编码蛋白激酶Nβ的核酸相互作用的核酸在筛选治疗和/或预防疾病的药物中的应用，其中所述疾病选自前列腺瘤和淋巴节转移瘤，并且其中所述相互作用的核酸是各自针对蛋白激酶Nβ的反义寡核苷酸和/或siRNA。
15.按照权利要求14的应用，其特征在于编码蛋白激酶Nβ的核酸是cDNA，mRNA或hnRNA。
16.按照权利要求11-14中任何一项的应用，其中所述蛋白激酶Nβ和/或编码蛋白激酶Nβ的核酸是权利要求1-10中任何一项描述的一种。
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