KR20050059069A - 단백질 키나아제 ｎ 베타의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 PI 3-키나아제 경로의 하류 표적, 바람직하게는 PI 3-키나아제 경로의하류 약물 표적으로서 단백질 키나아제 N 베타 또는 단편 또는 그 유도체의 용도에 관한 것이다.

Description

단백질 키나아제 Ｎ 베타의 용도{USE OF PROTEIN KINASE Ｎ BETA}
본 발명은 단백질 키나아제 N 베타의 용도에 관한 것이다.
현대 의약의 개발은 더이상 발견적인 방법에 의존하지 않지만, 일반적으로 기본적인 질병 또는 질환의 분자 작용기전, 후보 표적 분자의 확인 및 상기 표적 분자의 평가를 포함한다. 본원에서 표적으로도 불리는 그러한 표적 분자를 일단 확인하면, 그로부터 유도된 후보 약물을 실험할 수 있다. 많은 경우에서 그러한 후보 약물은 합성 또는 천연 화합물로 구성된 조합 라이브러리의 구성요소이다. 조합 라이브러리의 사용은 일반적이다. 그러한 화합물 라이브러리는 본원에서 후보 화합물 라이브러리로 불린다. 과거에는 이러한 방법이 성공적이었으나, 여전히 시간 및 비용 소모적이다. 표적 확인에 대해 다양한 기술들이 현재 적용되고 있다.
여전히 수많은 종양 및 암은 사람의 건강에 있어서 큰 위협이다. 부작용이 적은 안전하고 더 강력한 약물을 개발하기 위해서는 표적 분자에 대해 알아야 하는 바, 이들의 활성 또는 존재에 있어서 특이적으로 또는 선택적으로 영향을 받을 수 있는 적절한 화합물에 의해 해결된다. 잠재적 또는 후보 약물이 될 수 있는 화합물 및 표적간의 선택적 및 특이적 상호작용 때문에, 암, 종양형성 및 전이와 같은 질환 또는 질환상태에서 표적의 기능은 영향을 받을 수 있으므로 치료 또는 예방될 질환 및 질환상태는 호전되었다.
따라서, 본 발명은 종양형성 및 암의 치료에 있어서 치료방법에 적절한 표적을 제공한다. 본 발명은 또한 종양형성 및 변이에 관련된 표적을 제공한다.
도 1은 PI 3-키나아제 경로의 성장인자 유도된 활성의 개략도를 도시;
도 2는 라파마이신으로 치료한 후 동소(orthotopic) PC-3 마우스에서 림프절 전이의 측정을 도시;
도 3은 PI 3-키나아제 경로의 하류 약물 표적으로서 PKN 베타를 확인하기 위한 실험방법을 도시;
도 4는 PKN 베타에 대한 일차 GeneBloc 검사를 도시;
도 5는 마트리겔상의 PKN 베타 특이적 GB에 의해 형질감염된 PC3 세포의 성장을 도시;
도 6은 HeLaB 세포내의 siRNA의 일시적 발현에 의한 RNA 간섭을 도시;
도 7은 탐침으로서 단백질 키나아제 N 베타 안티센스 및 센스 서열을 사용한 교잡반응시 사람 전립선 세포 및 사람 전립선 암의 사진을 도시;
도 8은 두개의 상이한 siRNA 작제물을 사용한 동소 전립선 종양 모델에서 일차 종양의 체적을 도시하는 개략도(도 8a), 두개의 상이한 siRNA 작제물을 사용한 동소 전립선 종양 모델에서 림프절 전이의 체적을 도시하는 개략도(도 8b) 및 대조용 siRNA를 사용한 동소 전립선 종양 모델에서 전립선 및 림프절의 사진(도 8c1) 및 단백질 키나아제 N 베타 특이적 siRNA 작제물의 사진(도 8c2)을 도시;
도 9는 키나아제 유도체의 상대적 발현 정도를 검출하기 위해 HeLa 세포 및 항-단백질 키나아제 N 베타 항체(항-PK)에서 일시적 과잉발현 시 표준 인산화 기질로서 MPB를 사용한 상이한 단백질 키나아제 N 베타 유도체 및 이들 활성에 대한 웨스턴-블럿 분석(도 9a), 단백질 키나아제 N 베타의 인산화 형태에 대해 특이적인 항체를 사용한 상이한 단백질 키나아제 N 베타 유도체에 대한 다른 웨스턴-블럿 분석(도 9b) 및 사용된 다양한 단백질 키나아제 N 베타 유도체의 개략도를 도시;
도 10은 은 HeLa 세포에서 단백질 키나아제 N 베타 유도체의 발현 정도를 모니터하기 위한 다양한 단백질 키나아제 N 베타 유도체의 웨스턴 블럿(도 10a) 및 단백질 키나아제 N 베타 유도체의 인산화에 대한 겔 분석(도 10b)을 도시;
도 11은 웨스턴 블럿팅(도 11a) 또는 오디오그라피에 의한 32P-라벨 인산염의 통합(도 11b)에 의해 단백질 키나아제 N 베타의 인산화된 형태를 검출하는 단백질 키나아제 N 베타에 대한 단백질 기질의 인산화를 검출하기 위한 면역침강 에세이의 결과를 도시한다. 각각의 면역 침강내에 존재하는 PKN 베타의 유사한 양을 확인하기 위해 도 11a에 도시된 여과기는 항-PKN 베타 항체(“키나아제”, 도 11c)를 사용하여 재탐침하였다.
도 12는 HeLa 및 PC-3 세포에서 각각 다른 시간에 LY294002로 처리된 샘플내의 내인성 단백질 키나아제 N 베타의 발현을 비교하는 웨스턴 블럿 분석을 도시한다. 인산화된 AKT의 정도는 PI 3-키나아제 억제제의 효능을 확인하기 위해 유사하게 모니터하였다.
도 13은 단백질 및 면역-복합체에 존재하는 다양한 재조합 PKN 베타 유도체의 키나아제 활성을 도시한다. 각각의 재조합 단백질을 발현하는 세포는 표시된 시간에 대한 용해이전에 PI 3-키나아제 억제제 LY294002로 처리하였다.
도 14는 PKN 베타 및 PKN 베타 야생형(도 14a), PKN 베타 유도체 TA(도 14b), PKN 베타 유도체 KE(도 14c) 및 PKN 베타 델타N(도 14d)와 같은 그 유도체의 세포 분포를 공초점 형광현미경에 의해 조사한 일련의 사진을 도시한다. PKN 베타의 HA-표시된 재조합 유도체는 HeLa 세포에서 48시간동안 일시적으로 발현된다. 고정 및 투과 후, 재조합 단백질의 발현은 항체-HA 항체 후 FITC-결합된 항-마우스 항체를 사용하여 검출하였다. 상기 세포는 세포골격 액틴을 로다민-팔로이딘으로 라벨을 붙임으로써 대비염색제로 착색하였다.
도 1은 PI 3-키나아제 경로의 성장인자 유도된 활성의 개략도를 나타낸다. 세포의 성장인자 자극은 세포막에서 이들과 같은 종류의 수용체의 활성화를 초래하고, 차례로 PI 3-키나아제와 같은 세포내의 신호 분자와 결합하거나 이를 활성화시킨다. 종양 억제제 PTEN은 PI 3-키나아제 매개 하류 반응을 방해하며 일시적인 방식으로 발생하는 경로의 활성화를 보호한다. LY294002는 PI 3-키나아제의 소분자 억제제이다. PI 3-K의 공지된 하류 유전자중 하나는 임상적으로 승인된 의약 라파마이신(Rapamune)에 의해 억제될 수 있는 mTOR(라파마이신의 포유류 표적)이다. PI 3-K은 세포증식, 세포생존, 포도당 운반, 번역, 전이 및 이동의 조절에 관여한다. X는 암세포의 전이성 행동을 촉진시키는데 관여하는 것으로 예상되는 잠재적인 약물 표적을 나타내는 하류 작동체를 나타낸다. 경로에서 다른 하류에 작용하는 이러한 유형의 작동체 분자는 다면발현 효과가 더 적기 때문에 mTOR과 같은“상류”표적보다 더 나은 약물 표적을 나타낼 것이다.
도 2 내지 도 5의 내용은 하기 실시예와 관련하여 더 상세하게 논의될 것이다.
도 6은 HeLaB 세포에서 siRNA의 일시적인 발현에 의한 간섭을 나타낸다.
(a) siRNA 분자는 표적 특이적 서열의 발현을 유도하는 프로모터(U6+2)에 의해 생성되었다( 21-mer 센스를 함유하는 유전자로부터 유도된 주형 및 12-mer 폴리 A 스트레치에 의해 연결된 역 상보적 서열). 전사시에 RNA는 이증가닥 siRNA 분자를 형성할 것이다.
(b) siRNA 발현에 대한 표적 유전자의 주형 서열. 대응하는 서열은 U6+2 프로모터 카세트를 윤반하는 발현벡터내로 도입되었다.
(c) 세포성장 및 증식에 대한 siRNA 발현의 효과. 작제물(상기 참조)은 RNAi 간섭 실험을 위한 HeLaB 세포에서 형질감염에 의해 일시적으로 발현되었다 세포는 형질감염 48시간 후 채취하였으며 그 후 “마트리겔”겔상에 살포되었다(웰당 8000 세포). 대응하는 유전자의 발현에 대한 RNA 간섭의 효과는 마트리겔상의 성장/증식에 대한 형질감염된 세포를 조사함으로써 분석하였다. PTEN에 대한 siRNA 표적의 발현은 마트리겔(오른쪽 패널)상의 HeLaB 세포성장에 대해 아무런 영향을 미치지 않는 반면, p110베타 및 PKN 베타에 대해 siRNA 특이적 발현은 마트리겔(중간 및 오른쪽 패널)상의 HeLaB 성장의 행동을 심하게 방해하였다.
제 1요지에서 본 발명이 해결하고자 하는 문제는 PI 3-키나아제 경로의 하류 표적으로서, 바람직하게는 PI 3-키나아제 경로의 하류 약제 표적으로서 단백질 키나아제 N 베타 또는 단편 또는 그 유도체의 사용에 의해 해결가능하다.
제 2요지에서 본 발명이 해결하고자 하는 문제는 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 제조용 및/또는 질환의 진단을 위한 진단 물질의 제조용 단백질 키나아제 N 베타 또는 단편 또는 그 유도체의 사용에 의해 해결가능하며, 상기 질환은 암, 전이성 암 및 PI 3-키나아제 경로를 포함하는 임의의 병리적 상태로 구성된 그룹으로부터 선택된 질환이다.
본 발명의 제 1 및 제 2요지에 따른 사용의 구체예로서, 단백질 키나아제 N 베타는 서열번호 1 또는 데이터뱅크 진입 PID g7019489 또는 데이터뱅크 진입 gi 7019489에 따른 아미노산 서열 또는 일부 또는 그 유도체를 갖는다.
제 3요지에서 본 발명이 해결하고자 하는 문제는 질환의 치료 및/또는 예방용 및/또는 질환의 진단을 위한 진단 물질의 제조용 단백질 키나아제 N 베타 또는 단편 또는 그 유도체에 대한 핵산 코딩의 사용에 의해 해결가능하며, 상기 질환은 암, 전이성 암 및 PI 3-키나아제 경로를 포함하는 임의의 병리적 상태로 구성된 그룹으로부터 선택된 질환이다.
본 발명의 제 3요지에 따른 사용의 구체예로서, 단백질 키나아제 N 베타는 서열번호 1 또는 데이터뱅크 진입 PID g7019489 또는 데이터뱅크 진입 gi 7019489에 따른 아미노산 서열 또는 일부 또는 그 유도체를 갖는다.
본 발명의 제 3요지에 따른 사용의 다른 구체예로서, 상기 핵산은 서열번호 1 또는 데이터뱅크 진입 gi 7019488 또는 NM_01335, 바람직하게는 NM_01335.1에 따른 핵산이다.
본 발명의 임의의 요지에 따른 사용의 다른 구체예로서, 단백질 키나아제 N 베타는 서열번호 2에 따른 또는 데이터뱅크 진입 gi 7019488 또는 NM_01335, 바람직하게는 NM_01335.1에 따른 핵산에 의해 암호화된다.
본 발명의 제 3요지에 따른 사용의 바람직한 구체예로서, 상기 핵산 서열은 유전자 코드의 퇴화가 없다면 본 발명의 제 3요지에 따른 핵산과 교잡반응할 것이다.
본 발명의 임의의 요지에 따른 사용의 다른 구체예로서, 상기 핵산 서열은 엄격한 조건하에서 서열번호 2 또는 데이터뱅크 진입 gi 7019488 또는 NM_01335, 바람직하게는 NM_01335.1에 따른 핵산 서열 또는 그 일부와 교잡반응하는 핵 서열이다.
본 발명의 임의의 요지에 따른 사용의 바람직한 구체예로서, 상기 질병은 상기 질병에 관련된 세포가 PTEN 활성이 부족하고, 증가된 공격성 행동을 나타내며, 또는 말기 단계 종양의 세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제 3요지에 따른 사용의 더 바람직한 구체예로서, 상기 질병은 말기 단계 종양이다.
제 4요지에서 본 발명이 해결하고자 하는 문제는 질환의 치료 및/또는 예방용 및/또는 질환의 진단을 위한 진단 물질의 제조용 물질의 스크리닝 방법에 의해 해결가능하며, 상기 질환은 암, 전이성 암 및 하기 단계로 구성된 PI 3-키나아제 경로를 포함하는 임의의 병리적 상태로 구성된 그룹으로부터 선택된 질환이다:
a) 후보 화합물을 제공하는 단계;
b) 단백질 키나아제 N 베타에 대한 발현 시스템 및/또는 단백질 키나아제 N 베타의 활성 검출 시스템을 제공하는 단계;
c) 상기 후보 화합물을 단백질 키나아제 N 베타에 대한 발현 시스템 및/또는 단백질 키나아제 N 베타의 활성 검출 시스템과 접촉시키는 단계;
d) 단백질 키나아제 N 베타의 발현 및/또는 활성이 후보 화합물의 영향하에서 변하는지 여부를 측정하는 단계.
본 발명의 제 4요지에 따른 방법의 구체예로서, 상기 후보 화합물은 화합물의 라이브러리내에 함유되어 있다.
본 발명의 제 4요지에 따른 방법의 다른 구체예로서, 상기 후보 화합물은 펩티드, 단백질, 항체, 안티칼린, 기능적 핵산, 천연 화합물 및 소 분자로 구성되는 종류의 화합물 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 제 4요지에 따른 방법의 바람직한 구체예로서, 상기 기능적인 핵산은 아프타머, 아프타짐, 리보자임, 스피에겔머, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 siRNA로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 제 4요지에 따른 방법의 다른 바람직한 구체예로서, 단백질 키나아제 N 베타 또는 단백질 키나아제 N 베타에 대한 핵산 코딩은 본 발명의 임의의 다른 면과 관련하여 개시되어 있다.
제 5요지에서 본 발명이 해결하고자 하는 문제는 질환의 치료 및/또는 예방하기 위한 의약 개발 및 제조용 및/또는 질환의 진단을 위한 진단 물질의 제조용 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체 및/또는 표적분자로서 단백질 키나아제 N 베타에 대한 핵산 또는 일부분 또는 그 유도체 코딩의 사용에 의해 해결가능하며, 상기 질환은 암, 전이성 암 및 하기 PI 3-키나아제 경로를 포함하는 임의의 병리적 상태로 구성된 그룹으로부터 선택된 질환이다.
본 발명의 제 5요지에 따른 사용의 다른 바람직한 구체예로서, 상기 의약 및/또는 진단 물질은 항체, 펩티드, 안티칼린, 소 입자, 안티센스 분자, 아프타머, 스피에겔머 및 RNAi 분자로 구성된 그룹으로부터 선택된 물질을 포함한다.
본 발명의 제 5요지에 따른 사용의 바람직한 구체예로서, 상기 물질은 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체와 상호작용한다.
본 발명의 제 5요지에 따른 사용의 다른 구체예로서, 상기 물질은 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체에 대한 핵산 코딩, 특히 단백질 키나아제 N 베타에 대한 mRNA, 게놈 핵산 또는 cDNA와 상호작용한다.
제 6요지에서 본 발명이 해결하고자 하는 문제는 질환의 치료 및/또는 예방하기 위한 의약 개발 또는 제조용 및/또는 질환의 진단을 위한 진단 물질의 제조용 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체와 상호작용하는 폴리펩티드의 사용에 의해 해결가능하며, 상기 질환은 암, 전이성 암 및 PI 3-키나아제 경로를 포함하는 임의의 병리적 상태로 구성된 그룹으로부터 선택된 질환이다.
본 발명의 제 6요지에 따른 사용의 구체예로서, 상기 폴리펩티드는 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체에 대한 항체 및 폴리펩티드 결합 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
제 7요지에서 본 발명이 해결하고자 하는 문제는 질환의 치료 및/또는 예방하기 위한 의약 개발 또는 제조용 및/또는 질환의 진단을 위한 진단 물질의 제조용 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체와 상호작용하는 핵산의 사용에 의해 해결가능하며, 상기 질환은 암, 전이성 암 및 PI 3-키나아제 경로를 포함하는 임의의 병리적 상태로 구성된 그룹으로부터 선택된 질환이다.
본 발명의 제 7요지에 따른 사용의 구체예로서, 상기 핵산은 아프타머 및 스피에겔머로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
제 8요지에서 본 발명이 해결하고자 하는 문제는 질환의 치료 및/또는 예방하기 위한 의약 개발 또는 제조용 및/또는 질환의 진단을 위한 진단 물질의 제조용 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체에 대한 핵산 코딩과 상호작용하는 핵산의 사용에 의해 해결가능하며, 상기 질환은 암, 전이성 암 및 PI 3-키나아제 경로를 포함하는 임의의 병리적 상태로 구성된 그룹으로부터 선택된 질환이다.
본 발명의 제 8요지에 따른 사용의 구체예로서, 상호작용하는 상기 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임 및/또는 siRNA이다.
본 발명의 제 8요지에 따른 사용의 다른 구체예로서, 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체에 대한 상기 핵산 코딩은 cDNA, mRNA 또는 hnRNA이다.
본 발명의 제 8요지에 따른 사용의 다른 구체예로서, 상기 단백질 키나아제 N 베타 및/또는 단백질 키나아제 N 베타에 대한 핵산 코딩은 본 발명의 임의의 면과 관련하여 개시되어 있다.
제 9요지에서 본 발명이 해결하고자 하는 문제는 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체, 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체 또는 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체에 대한 핵산 코딩과 상호작용하는 소 분자, 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체에 대해 특이적인 항체, 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체와 상호작용하는 폴리펩티드, 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체에 대한 핵산 코딩, 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체와 상호작용하는 핵산, 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체에 대한 핵산 코딩과 상호작용하는 핵산으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 물질 및 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 의해 해결가능하며, 상기 질환은 암, 전이성 암 및 PI 3-키나아제 경로를 포함하는 임의의 병리적 상태로 구성된 그룹으로부터 선택된 질환이다.
제 10요지에서 본 발명이 해결하고자 하는 문제는 암, 전이성 암 및 PI 3-키나아제 경로를 포함하는 임의의 병리적 상태로 구성된 그룹으로부터 선택된 질환 또는 질병에 대한 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체, 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체에 대해 특이적인 항체, 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체와 상호작용하는 폴리펩티드, 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체 또는 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체에 대한 핵산 코딩과 상호작용하는 폴리펩티드, 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체와 상호작용하는 핵산, 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체에 대한 핵산 코딩과 상호작용하는 핵산으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 물질 및 경우에 따라 하나 이상의 다른 화합물을 포함하는 키트에 의해 해결가능하다.
본원에서 PKN 베타로 불리는 단백질 키나아제 N 베타가 암 및 종양과 관련하여 중요한 표적이라는 것을 본 발명자들은 놀랍게도 발견하였다. 더 구체적으로, 단백질 키나아제 N 베타가 PI 3-키나아제/PTEN 경로의 하류 표적인 것을 본 발명자들은 발견하였다. 단백질 키나아제 N 베타가 종양형성 및 전이와 관련되어 있음을 본 발명자들은 놀랍게도 발견하였다. 특히 후자 효과는 억제 기능, 특히 PTEN 종양 억제 기능의 손실과 상당히 관련된 듯하다. 실시예에서 보여지는 바와 같이, PTEN이 PI 3-키나아제 경로의 억제자이며 활성이 아닌 조건하에서 단백질 키나아제 N 베타는 상향 조절될 것이다. 단백질 키나아제 N 베타의 상향 조절때문에 그러한 상향 조절이 발생하는 세포는 전이성 행동 및 이동성 행동의 증가를 나타낼 것이다. 이는 단백질 키나아제 N 베타의 억제자가 세포의 전이성 및 이동성 행동을 조절하는 적절한 수단임을 의미하며 이는 종양 및 암, 특히 세포가 전이성 및/또는 이동성 행동을 나타내는 전이성 종양 및 암의 치료에 적절한 수단이다. 상기 질환은 종양형성 및 전이를 포함한다. 이는 특히 본원에 개시된 질환에 적용되며, 세포는 상기 질환이 종양 억제유전자 PTEN이 활성이지 않거나 활성이 감소된 것을 의미하는 PTEN 음성인 질환과 관련된다. 상기 질환은 PI 3-키나아제 경로가 일반적으로 관련된 질환을 또한 포함한다. 전이성 종양외에 특히 당뇨가 이러한 유형의 질환 및 질환 상태에 속한다. 따라서, 본원에 개시된 질환 또는 질환상태에 관련되며 PTEN 음성인 세포는 관련된 각 세포에서 단백질 키나아제 N 베타의 활성을 감소 또는 제거하기 위해 약제의 작용방식에 의한 처리가 가능하다. 따라서, PI 3-키나아제 경로(p110, Akt)의 구성요소를 암호화하는 유전자의 증식 또는 변이를 통해 과도하게 활성화된 PI 3-키나아제 경로를 특징으로 하는 종양환자 또는 PTEN 음성이거나 또는 PTEN 음성인 세포를 갖는, 특히 세포가 본원에 개시된 질환에 관련된 경우의 환자는 상기 약제를 사용하여 유리하게 치료될 수 있다. 활성도의 감소는 전사 정도 또는 번역 정도에서 즉, 단백질 키나아제 N 베타의 효소 활성화의 감소로부터 발생할 수 있다. 어떤 이론에 제한됨없이, 단백질 키나아제 N 베타의 활성도를 변형하는 것은 PKNbeta의 특징 즉, PKNbeta의 효소 활성화가 상향 및 하향 조절, 더 바람직하게는 하향 조절될 수 있다는 것과 관련하여 본 발명자들의 통찰력으로부터 나온 결과이다.
상기 약제를 사용하여 유리하게 치료될 수 있는 다른 환자 그룹은 PTEN 기능 손실의 발생률이 높은 암, 특히 말기 종양으로 고통받는 환자들이다(Cantley, L. C. 및 Neel, B. G (1999). 종양 억제에 대한 새로운 통찰력: 포스포이노시티드 3-키나아제/AKT 경로를 억제함으로써 PTEN 억제 종양 형성. Proc Natl Acad Sci USA 96, 4240-4245; Ali, I. U.(2000). 자궁내막에 대한 게이트키퍼(gatekeeper): PTEN 종양 억제 유전자. J Natl Cancer Inst 92, 861-863). 이 때문에 본 발명의 바람직한 구체예로서, 분석 기구로 또는 본 발명의 다양한 면과 관련한 수단으로 사용될 수 있는 진단 물질 및 단백질 키나아제 N 베타 또는 핵산 코딩에 대해 지시된 치료 물질은 상술한 전제조건이 충족된다면 즉, PTEN이 증가된 공격성 및 침윤성 행동과 서로 관련된다면 임의의 종양에 대해 사용될 수 있을 것이다.
이 유형의 약제는 본원의 명세서를 토대로 고안, 연구 또는 제조될 수 있는 바, 즉 단백질 키나아제 N 베타는 하류 약물 표적이며 단백질 키나아제 N 베타는 종양형성 및 전이 및 이와 관련되거나 이로부터 생기는 질환에 있어서 표적이다.
상술한 바와 같이, 단백질 키나아제 N 베타의 작용기전에의 관여때문에, 세포 또는 전이 및 종양형성이 나타나는 그러한 유형의 세포를 갖는 환자의 상태를 진단하기 위한 표지로서 사용될 수 있다. 일 예로서, 이러한 유형의 방법은 효과적이며 그러한 목적에 즉, ICAM-1에 적용가능하다. ICAM-1은 전이를 경험하는 위암의 예후에 사용(Maruo Y, Gochi A, Kaihara A, Shimamura H, YamadaT,TanakaN, OritaK. Int J Cancer. 2002 Aug 1; 100(4): 486-490)되며, 간에 전이된 환자에 있어서 s-ICAM-1 양은 상승된 것으로 나타났다. 다른 예로서, 오스테오폰틴은 유방암에 대한 진단 표지로서 사용된다(Rudland PS, Platt-Higgins A, EL-Tanani M, De Silva Rudland S, Barraclough R, Winstanley JH, Howitt R, West CR. Cancer Res. 2002 Jun 15; 62(12): 3417-3427). 지금까지 단백질 또는 mRNA의 존재 또는 존재의 정도 또는 단백질 키나아제 N 베타 활성도의 정도는 표지로서 사용될 수 있으므로,단백질 키나아제 N 베타와 다소 특이적으로 상호작용하는 화합물은 적절한 진단 물질일 것이다.
단백질 키나아제 N 베타와 특이적 및/또는 선택적으로 상호작용하는 경우에서 약제 및 진단 물질의 고안방법 및 고안원칙이 하기에 개시될 것이다.
이러한 발견에 비추어 보면, 키나아제 N 베타는 PI-3 키나아제 경로 즉, 전이 및 이동 및 선택적 및 특이적 진단방법 즉, PI-3 키나아제 경로에 일반적으로 관련된 방법, 특히 전이 및 이동의 검출에 일반적으로 관련된 일부 요지에만 선택적 변형을 허용하는 적절한 하류 약물 표적인 것으로 입증되었다.
PI-3 키나아제 경로는 성장인자 유도에 대한 PI-3 키나아제 활성도 및 유사한 신호 경로를 특징으로 한다. 세포에 대한 성장인자의 자극은 PI-3 키나아제와 같은 세포내 신호 분자와 차례로 결합하여 활성화시키는 세포막에서 이들과 같은 종류의 수용체의 활성화를 유도한다. PI-3 키나아제(조절 p85 및 촉매 p110 서브유닛으로 구성된)의 활성화는 인산화에 의한 Akt의 활성화를 초래함으로써 증식, 생존 또는 다른 하류로 이동과 같은 세포 반응을 지지한다. 따라서, PTEN은 포스파티딜이노시톨(PI) 3-키나아제 경로에 관여하는 종양 억제제이며 세포 성장 및 변형을 조절하는 역할때문에 과거에 광범위하게 연구되었다(Stein, R. C. 및 Waterfield, M. D. (2000). PI3-키나아제 억제: 의약 개발에 대한 표적? Mol Med Today 6, 347-357; Vazquez, F 및 Sellers, W. R. (2000). PTEN 종양 억제 단백질: 포스포이노시티드 3-키나아제 신호의 길항제. Biochem Biophys Acta 1470, M21-35; Roymans, D 및 Slegers, H. (2001). 종양 진행에서의 포스파티딜이노시톨 3-키나아제. Eur J Biochem 268, 487-498). 상기 종양 억제 PTEN은 PI-3 키나아제 촉매 반응을 역전시킴으로써 PI-3 키나아제의 음성 조절자로서 기능하여 일시적 및 통제된 방식으로 발생하는 경로의 활성화를 확보한다. PI-3 키나아제 신호의 만성적인 과도한 활성화는 PTEN의 기능적인 비활성화에 의해 생긴다. PI-3 키나아제 활성화는 소 분자 억제제 LY294002의 부가에 의해 막을 수 있다. 유사한 경로에서 작용하는 신호 키나아제 MEK의 활성도 및 하류 반응은 소 분자 억제제 PD98059에 의해 억제될 수 있다.
PTEN 기능의 손실을 통한 PI-3 키나아제 경로의 만성적인 활성화는 이 종양 억제제가 통제된 세포 증식에 대해 중요한 체크포인트를 나타내는 것을 표시하는 종양형성 및 전이에 주요한 공헌자이다. PTEN 녹아웃 세포는 PI-3 키나아제 경로가 활성화된 형태의 PI-3 키나아제를 통해 만성적으로 유도되는 세포와 유사한 특징을 나타낸다(Di Cristofano, A., Pesce, B., Cordon-Cardo, C 및 Pandolfi, P. P.(1998). PTEN은 배아 발달 및 종양 억제에 있어서 필수적이다. Nat Gener 19, 348-355. Klippel, A., Escobedo, M. A., Wachowicz, M. S., Apell, G., Brown, T. W., Giedlin, M. A., Kavanaugh, W. M. 및 Williams, L. T.(1998). 포스파티딜이노시톨 3-키나아제의 활성화는 세포 주기 진입에 충분하며 세포 변화 특징적인 종양 유전자 변형을 촉진한다. Mol Cell Biol 18, 5699-5711. Kobayashi, M., Nagata, S., Iwasaki, T., Yanagihara, K., Saitoh, I., Karouji, Y., Ihara, S 및 Fukui, Y. (1999). 포스파티딜이노시톨 3-키나아제의 활성화에 의한 선암의 분화. Proc Narl Acad Sci USA 96, 4874-4879).
PTEN은 PI3K/PTEN 경로, Akt 경로, EGF-관련 옥토크린 루프 및 mTOR 경로와 같은 PTEN 관련 경로로 불리는 몇몇의 경로에 관련되어 있다. PI3-키나아제 경로는 그러한 경로에서 억제제 또는 활성제로서 작용하거나 또는 경로의 다른 요소에 의해 조절될 수 있다.
PI 3-키나아제 경로를 포함하는 질환 및 질병을 개시하는 많은 선행기술이 있다. 이들 질병 및 질환은 본 방법에 의해 해결되며 약제 및 진단 물질의 고안, 스크리닝 또는 제조는 본원에 개시되어 있다. 그러한 질환 및 질병의 예는 다음과 같으나 이에 한정되지 않는다: 자궁내막암, 직장암종, 신경교종, 선종, 자궁내막 비후, 코우덴(Cowden) 증후군, 유전적 비-폴립 직장암종, 리-프라우멘(Li-Fraumene) 증후군, 유방-난소 암, 전립선암(Ali, I. U., Journal of the National Cancer Institute, Vol. 92, no. 11, June 07, 2000, page 861-863), 바나얀-조아나나(Bannayan-Zonana)증후군,LDD(Lhermitte-Duklos’syndrome)(Macelod, K., supra), 카우(Cow) 질환(CD) 및 바나얀-루발카바-릴리(Bannayan-Ruvalcaba-rily) 증후군(BRR)을 포함한 과오종-대두증 질환, 점막피부 병변(예를들면, 트리칠렘몬마스), 대두증, 정신지체, 위장관 과오종, 지방종, 갑상선 선종, 유방의 섬유낭성 질환, 소뇌 형성장애 신경절 세포종 및 유방 및 갑상선 악성종양(Vazquez, F., Sellers, W. R., supra).
단백질 키나아제 N 베타는 단백질 키나아제 N 베타의 표적 상류에 대해 유도된 다른 약물보다 부작용이 적은 약물에 의해 해결될 수 있는 PI 3-키나아제 경로의 유용한 하류 약제 표적이다. 본 발명은 LY 294002와 같이 공지된 기술보다 더 선택적인 약제학적으로 활성인 화합물의 고안, 스크리닝, 개발 및 제조에 적절한 약제 표적을 제공한다. 작동체 분자, 즉 경로에 포함된 단백질 키나아제 N 베타 및 임의의 다른 하류 분자의 이 특정 단편에 대한 조절을 가짐으로써, 그 유사한 분자의 제한된 수 또는 신호 연속단계내의 다른 상류 표적만이 원하지 않은 효과를 유발하는 것 같다. 따라서, 세포주기, DNA 회복, 세포괴사, 포도당 운반, 번역에 관련된 PI 3-키나아제/PTEN 경로는 영향을 받지 않을 것이다. 또한, 인슐린 신호가 유도되지 않는 바 이는 LY294002의 사용과 관련하여 관찰된 당뇨반응 또는 다른 부작용을 실질직으로 피하는 것을 의미한다. LY294002 (2-(4-모르폴리닐)8-페닐크로몬)은 PI-3K에 대한 억제제로서 Lilly Research Laboratories(Indianapolis)에 의해 개발된 몇몇의 크로몬 유조체 소분자 억제제중 하나이다(Vlahos 등. 1997, JBC 269, 5241-5248). 이는 촉매 중심에서 ADP 결합과 경쟁함으로써 PI-3K 분자, p110 및 기능에 대한 이들의 촉매 서브유닛을 표적으로 한다. 그러나, LY294002는 다른 세포 기능을 갖고 있음을 시사하는 p110(알파, 베타, 감마, 델타)의 상이한 이소폼(isoform)을 구별할 수 없다.
단백질 키나아제 N 베타는 라파마이신에 의해 해결되는 mTOR의 다른 하류이다. Raft 또는 FRAP로도 공지된 mTOR(라파마이신의 포유류 표적)은 세포주기내로 pp70 S6 키나아제 의존성 진입과 같은 과정을 조절하기 위해 PI 3-키나아제의 하류에 작용한다. mTOR은 pp70 S6 키나아제 및 개시 인자 4E 활성화를 통해 번역을 조절하기 위해 성장인자 및 영양소 유효성에 대한 센서로서 작용한다. mTOR 기능은 T-세포 및 특정 종양 세포의 성장을 방해하는 세균성 마크로리드 라파마이신에 의해 억제된다(Kuruvilla 및 Schreiber 1999, Chemistry & Biology 6, R129-R136).
임상에서 현재 사용되고 있는 적절한 약제인 라파마이신 및 그 유도체는 약물 표적이 더욱 유익하고 부작용이 더 작으며, Yu 등(Yu, K. 등 (2001) Endrocrine-RelatCanc 8, 249)에 의해 입증된 것처럼 특정한 분자 작용기전에 대해 더 특이적이라는 것이 증명되었다.물
단백질 키나아제 N 베타는 단백질-세린/트레오닌 키나아제로 불리는 단백질 키나아제 C 패밀리의 구성요소이다. 일반적으로, 이 유형의 단백질 키나아제는 한개의 조절 서브유닛 및 한개의 촉매 서브유닛을 포함하며 공동-인자로서 칼슘이온과 인지질을 사용한다. 디아실 글리세롤은 이러한 유형의 단백질 키나아제 패밀리의 활성제로서 작용한다. 단백질 키나아제 C 패밀리의 구성요소는 호르몬 또는 신경전달물질과 결합된 몇몇의 신호 경로에 관여한다. 이들 단백질 키나아제는 인산화에 의해 이들 표적 단백질의 활성을 조절한다. 단백질 키나아제 C의 비생리적 연속적인 활성화는 암의 발생을 유도할 수 있는 변형된 세포 표현형을 초래한다.
mRNA로서 단백질 키나아제 N 베타의 완전한 서열은 데이터뱅크 예를들면, 입수번호 gi 7019488 또는 NM_013355에서 이용가능하다. 유전자 코드를 사용하여, 이 mRNA로부터 특정 아미노산 서열이 유래될 수 있다. 또한, 단백질 키나아제 N 베타의 아미노산 서열은 데이터뱅크 입수번호 gi 7019489 또는 NP_037487.1에서 이용가능하다. 유도체 또는 유도체의 절단된 부분은 소망하는 효과가 생기는 한 본 발명에 따라 사용될 수 있다는 것은 본 발명의 범위에 속한다. 유도체화 및 절단의 정도는 당업자에 의한 일반적인 분석에 의해 측정가능하다. 핵산 서열에 있어서, 이들 핵산 서열은 상술한 입수번호 또는 상술한 아미노산 서열로부터 유래될 수 있는 임의의 핵산 서열에 의해 특이화된 핵산과 교잡반응하는 단백질 키나아제 N 베타를 암호화하는 핵산서열로 구성된다. 그러한 교잡반응는 당업자에게 공지되어 있다. 그러한 교잡반응의 특이성은 Sambrook, J. Fritsch, E.F. 및 Maniats, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbo Laboratory로부터 취할 수 있다. 바람직한 구체예로서, 상기 교잡반응는 엄격한 조건하에서의 교잡반응이다. 또한, 단백질 키나아제 N 베타에 대한 핵산 코딩은 상술한 임의의 핵산 서열과 상동인 핵산서열인 반면, 상동성의 정도는 바람직하게는 75, 80, 85, 90 또는 95%이다. 단백질 키나아제 N 베타에 대한 다른 참고문헌은 Shibata H. 등., J. Biochem. (Tokyo) 2001 Jul; 130(1): 23-31; Dong, LQ, Proc Natl Akas Scie USA, 2000, May 09; 97(10): 5089-5094; 및 Oishi, K., Biochem Biophys Res Commun. 1999, Aug. 11 ; 261(3): 808-814이다.
사람 단백질 키나아제 N 베타에 대한 상동관계는 M. musculus, R norvegicus, A. thaliana, C. elegans, D. melanogaster 및 S. cerevisiae에서 발견할 수 있다. 일치성 퍼센트 및 정렬된 영역의 길이는 상술한 다양한 종에 대해 각각 67% 및 279개 아미노산, 51% 및 866개 아미노산, 38% 및 305개 아미노산, 36% 및 861개 아미노산, 63% 및 296개 아미노산 및 44% 및 362개 아미노산이다. 임의의 이들 또는 다른 상동관계는 그러한 상동관계를 이용하여 생성된 약제 또는 진단 물질이 사람 단백질 키나아제 N 베타 또는 임의의 다른 의도된 단백질 키나아제 N 베타와 상호작용하지 않는 한, 본 발명의 실시에 있어서 적절한 원칙임을 당업자는 알게 될 것이다.
사람 아미노산 서열은 입수번호 pir인 ProtEST로부터 또한 얻을 수 있을 것이다; 각각의 단백질 키나아제 N 베타가 JC7083 단백질 키나아제로 불리는 JC7083. 사람 단백질 키나아제 N 베타에 대한 유전자는 사람 염색체 번호 9상에 위치해 있다. 단백질 키나아제 N 베타에 대한 cDNA 공급원은 일반적으로 다수의 암 및 다양한 태아 또는 배아 조직, 특히 위, 선암, 대뇌, 유방, 버킷, 임파종, 자궁경부, 연골육종. 대장, 태아 눈, 태아 렌즈, 태아 눈 전방 부분, 태아 광 신경, 태아 망막, 태아 망막 와, 태아 반점, 태아 맥락막, 피브로테오마(fibrotheoma), 배선, 네아드 넥(nead neck), 심장, 신장, 큰 세포 암종, 평활근육종, 전이성 연골육종, 난소, 부갑상선, 망막아종, 횡문근육종, 작은 세포 암종, 편평상피세포 암종, 고환 및 자궁이다. 상기 리스트로부터 환자에게 적용된 치료의 효과를 모니터링하는 것뿐만 아니라 질환의 단계에 있어서 상이한 환자의 상태에 사용될 수 있는 스테이징(staging) 물질을 포함한 의약 및 진단 물질은 이들 질환 또는 특이적 세포, 조직 또는 기관을 포함하는 임의의 질환의 치료, 예방, 진단, 예후 및 모니터링하는데 사용될 수 있음이 명백하다. 이들 질환 및 질환 상태는 본원에 개시된 질환에 포함된다.
본원에 개시된 놀라운 발견을 고려하여, 단백질 키나아제 N 베타는 본원에 개시된 다양한 질환의 예방 및/또는 치료를 위해 및 그러한 목적을 위한 의약의 제조를 위해 및 진단 물질의 제조를 위한 의약으로서 사용될 수 있다.
단백질 키나아제 N 베타 또는 단편 또는 그 유도체가 의약 자체로서 사용될 경우, 천연적으로 발생하는 단백질 키나아제 N 베타에 대해 경쟁제로서 사용되어 그 정상적인 생물학적 기능을 막는것이 바람직하다. 그러한 목적을 위해, 사용된 단백질 키나아제 N 베타가 촉매작용 결함이 있는 것이 특히 바람직하다. 이러한 유형의 단백질 키나아제 N 베타는 각각 유기체 및 세포에 적용될 수 있으며 유전자 치료에 의해 유기체 및 세포내로 도입될 수 있다.
단백질 의약 자체와는 별도로, 단백질 키나아제 N 베타는 약물 또는 약물후보 또는 진단물질로서 사용될 수 있는 화학적 화합물에 대해 화합물로서 사용될 수 있다. 이들 화학적 화합물은 소 분자뿐만 아니라 항체, 펩티드, 안티칼린, 아프타머, 스피에겔머, 리보자임, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 siRNA와 같은 상이한 종류의 화합물에 속한다. 상기 화합물은 생리적 또는 화학적 구성요소로서 단백질 키나아제 N 베타 자체 또는 단백질 키나아제 N 베타에 관련된 정보를 사용하여 고안, 선별, 검사 및/또는 제조된다. 상기 종류 화합물의 고안, 선별, 검사, 생성 및/또는 제조 과정에 있어서, 단백질 키나아제 N 베타는 환자에게 각 화합물의 최종 적용보다 그 과정에서 사용되는 표적으로서 또한 언급될 것이다. 다양한 종류의 화합물을 제공하는 과정에서, 단백질 키나아제 N 베타 또는 단백질 키나아제 N 베타에 대한 핵산 코딩이 사용될 수 있다. 본원에 사용된 용어 단백질 키나아제 N 베타는 의약 또는 진단물질 활성으로서 적용되는 화합물의 고안, 선별, 스크리닝, 생성 및/또는 제조를 허용하는 단백질 키나아제 N 베타의 임의의 단편 또는 유도체를 포함한다. 단백질 키나아제 N 베타에 대한 핵산코딩 용어는 단백질 키나아제 N 베타를 암호화하는 핵산을 함유하는 임의의 핵산 또는 그 일부분을 포함할 것이다. 단백질 키나아제 N 베타에 대한 핵산코딩의 일부분은 의약 또는 진단물질 활성으로서 적용되는 상기 화합물의 고안, 선별, 스크리닝, 생성 및/또는 제조에 적절한 것으로 간주된다. 단백질 키나아제 N 베타에 대한 핵산코딩은 게놈 핵산, hnRNA, mRNA, cDNA 또는 각각의 그 일부분일 수 있다.
본원에 개시된 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체 또는 핵산서열외에, 단백질 키나아제 N 베타 또는 단백질 키나아제 N 베타에 대한 핵산코딩으로부터 발생하는 효과를 만들어내기 위해 또는 효과를 억제하기 위해 다른 수단 또는 화합물이 사용될 수 있으며 이는 본 발명의 범위에 속한다. 그러한 수단은 검사방법에서 측정 또는 선별될 수 있다. 그러한 검사방법에 있어서, 첫번째 단계는 하나 또는 몇몇의 후보 화합물로 불리는 화합물을 제공하는 것이다. 본원에서 사용된 후보 화합물은 본원에 개시된 다양한 질환 및 질환상태를 치료 또는 경감시키는 실험 시스템에서 실험되기에 적합한 화합물 또는 그러한 질환 및 질환상태에 대한 진단 수단 또는 물질로 사용되는 화합물이다. 후보 화합물이 실험 시스템에서 각각의 효과를 나타낸다면, 상기 후보 화합물은 상기 질환 및 질환상태를 치료하기 위한 적절한 수단 또는 물질일뿐 아니라 적절한 진단 물질이다. 두번째 단계는, 상기 후보 화합물을 단백질 키나아제 N 베타 발현 시스템 또는 단백질 키나아제 N 베타 유전자 산물, 바람직하게는 hnRNA 또는 mRNA 또는 단백질 키나아제 N 베타 활성 시스템 또는 단백질 키나아제 N 베타와 같은 각각의 유전자 발현 산물과 접촉시키는 것이다. 상기 단백질 키나아제 N 베타 활성 시스템은 단백질 키나아제 N 베타의 활성을 검출하는 시스템의 의미에 잇어서 또한 활성이다.
단백질 키나아제 N 베타 발현 시스템은 단백질 키나아제 N 베타의 발현을 나타내는 발현 시스템이며, 발현의 정도 또는 수준은 변할 수 있다. 바람직하게는, 단백질 키나아제 N 베타 활성 시스템은 본질적으로 단백질 키나아제 N 베타의 발현보다 활성 또는 활성 상태가 측정되는 발현 시스템이다. 다르게는, 단백질 키나아제 활성 시스템은 활성도가 측정될 수 있는 단백질 키나아제 N 베타이거나 또는 단백질 키나아제 N 베타를 제공하거나 포함하는 시스템이다. 임의의 이들 시스템에서, 후보 화합물의 영향하에서 단백질 키나아제 N 베타의 활성 또는 단백질 키나아제 N 베타에 대한 핵산 코딩의 활성이 후보 화합물이 없는 상황과 다른지 여부를 실험하였다. 상기 특정 시스템이 발현 시스템 또는 활성 시스템인지 여부에 관계없이 활성 및 발현의 증가 또는 감소는 발생 및 측정할 수 있다는 것은 본 발명의 범위에 속한다. 일반적으로, 상기 발현 시스템 및/또는 활성 시스템은 세포 추출물 또는 핵 추출물과 같은 세포 추출물의 단편과 같은 시험관내 반응이다. 본원에 사용된 단백질 키나아제 N 베타 발현 시스템은 세포, 바람직하게는 본원에 개시된 질환 및 질환 상태에 관여하는 조직 또는 기관의 세포일 수 있다.
활성 시스템 및 발현 시스템의 증가 또는 감소가 있는지 여부는 각각의 발현의 수준에서 측정될 수 있는데, 예를들면 단백질 키나아제 N 베타, 특히 mRNA에 대한 핵산 코딩 양의 증가 또는 감소를 측정함으로써 또는 후보 화합물의 영향하에서 발현된 단백질 키나아제 N 베타의 증가 또는 감소를 측정함으로써 측정가능하다. 측정 특히, mRNA 또는 단백질과 같은 이러한 유형의 변화에 대한 양적 측정에 필요한 기법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를들면, 적절한 항체의 사용에 의해 단백질 키나아제 N 베타의 양 또는 함량을 측정하는 방법은 당업자에게 또한 공지되어 있다. 항체는 당업자에게 공지되거나 Harlow, E., 및 Lane, D., “Antibodies: A Laboratory Manual,” Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY,(1988)에 개시된 바에 의해 생성될 수 있다.
단백질 키나아제 N 베타 발현 시스템의 경우, 단백질 키나아제 N 베타 활성의 증가 또는 감소는 바람직하게는 기능적 에세이에서 측정될 수 있다.
후보 화합물을 각각의 발현 시스템 및 활성 시스템과 접촉시키는 것은 일반적으로 후보 화합물의 수용액을 본원에서 실험 시스템으로 불리는 각각의 반응 시스템에 부가함으로써 실시된다. 수용액외에 현탁액 또는 유기용매내의 후보 화합물의 용액도 사용될 수 있다. 상기 수용액은 바람직하게는 완충액 용액이다.
바람직하게는, 발현 시스템 및 활성 시스템의 각각의 실시에 있어서 단일 후보 화합물만이 사용된다. 그러나, 몇몇의 이러한 유형의 실험은 높은 유출량 시스템과 병행하여 실시되는 것은 본 발명의 범위에 속한다.
본 발명에 따른 방법에 있어서 다른 단계는 후보 화합물의 영향하에서 발현 시스템 및 활성 시스템의 발현 또는 활성이 단백질 키나아제 N 베타 또는 단백질 키나아제 N 베타에 대한 핵산 코딩을 변하게 하는지 여부를 측정하는데 있다. 일반적으로, 이는 후보 화합물의 부가없이 관련된 후보 화합물을 시스템에 부가할 때의 시스템의 반응을 비교함으로써 실시된다. 바람직하게는, 상기 후보 화합물은 화합물 라이브러리의 구성요소이다. 기본적으로 임의의 화합물 라이브러리는 화합물의 종류에 관계없이 본 발명의 목적에 적합하다. 적절한 화합물의 라이브러리는 소 분자, 펩티드, 단백질, 항체, 안티칼린 및 기능적 핵산으로 구성된 라이브러리이다. 후자 화합물은 당업자에게 공지된 바에 의해 및 본원에 개시된 바에 의해 생성될 것이다.
단백질 키나아제 N 베타 또는 단백질 키나아제 N 베타에 대한 핵산 코딩에 특이적인 항체의 제조는 당업자에게 공지되어 있으며, Harlow, E., 및 Lane, D., “Antibodies: A Laboratory Manual,” Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY,(1988)에 개시되어 있다. 바람직하게는, 본 발명과 관련되어 사용될 수 있는 단일클론성 항체는 Cesar 및 Milstein의 방법에 따라 제조될 수 있으며 이를 기초로 더 개발될 수 있다. 본원에 사용된 항체는 이들 항체가 적절하며 단백질 키나아제 N 베타에 결합할 수 있는 한, 완전한 항체, 항체 단편 또는 Fab 단편, Fc 단편 및 단일 가닥 항체와 같은 유도체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 단일성클론 항체외에, 다클론성 항체 또한 사용 및/또는 생성될 수 있다. 다클론성 항체의 생성은 당업자에게 또한 공지되어 있으며, Harlow, E., 및 Lane, D., “Antibodies: A Laboratory Manual,” Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY,(1988)에 개시되어 있다. 바람직하게는, 치료 목적으로 사용된 항체는 인체에 적용시키거나 또는 상술한 바와 같이 사람 항체이다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 항체는 하나 또는 몇몇의 표지 또는 라벨을 갖을 수 있다. 그러나 표지 또는 라벨은 진단적 적용 또는 치료적 적용에 있어서 항체를 검출하는데 유용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 표지 및 라벨은 아비딘, 스트렙타비딘, 비오틴, 골드 및 플루오레세인으로 구성된 그룹으로부터 선택되며 사용된다면 ELISA 방법에서 사용된다. 이들 및 다른 표지뿐만 아니라 방법은 Harlow, E., 및 Lane, D., “Antibodies: A Laboratory Manual,” Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY,(1988)에 개시되어 있다.
상기 라벨 또는 표지가 다른 분자와의 상호작용과 같은 검출외에 추가 기능을 나타내는 것은 본 발명의 범위에 속한다. 그러한 상호작용은 예를들면, 다른 화합물과의 특이적 상호작용이다. 이들 다른 화합물은 상기 항체가 사람 또는 동물신체와 같이 사용되는 시스템에 대해 고유의 화합물이거나 또는 각각의 항체의 사용에 의해 분석되는 샘플일 수 있다. 적절한 표지는 아비딘 및 스트렙타비딘과 같은 특이적 상호작용 파트너를 갖는 비오틴 또는 플루오레세인 및 표지 또는 라벨의 항체와 상호작용하는 각각의 화합물 또는 구조상에 존재하는 표지일 수 있다.
단백질 키나아제 N 베타 또는 단백질 키나아제 N 베타에 대한 핵산 코딩을 사용하여 생성될 수 있는 진단 물질뿐만 아니라 다른 종류의 약물은 그에 결합된 펩티드이다. 그러한 펩티드는 파지 디스플에이와 같은 기술상태에 따른 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 기본적으로, 펩티드 라이브러리는 파지의 형태와 같이 생성되며 이러한 종류의 라이브러리는 표적 분자, 본원의 경우에서는 단백질 키나아제 N 베타와 접촉한다. 표적 분자에 결합된 이들 펩티드는 바람직하게는, 표적분자와 함께 복합체로서 각각의 반응으로부터 그 후에 제거된다. 상기 결합 특징은 적어도 어느 정도는 염 농축 등과 같은 특정하게 실시된 실험적 준비에 따라 다르다는 것은 당업자에게 공지되어 있다. 높은 유사성 또는 더 큰 힘을 갖는 표적 분자에 결합한 이들 펩티드를 리이브러리의 비결합 구성요소로부터 분리한 후 및 경우에 따라 표적 분자 및 펩티드의 복합체로부터 표적분자를 또한 제거한 후, 상기 각각의 펩티드는 그 후에 특징화될 것이다. 특징화 이전에 경우에 따라 펩티드 코딩 파지를 증식하는 것과 같이 증폭 단계가 실시된다. 상기 특징화는 바람직하게는 표적 결합 펩티드의 서열을 포함한다. 기본적으로, 상기 펩티드는 그들의 길이에 있어서 제한되지 않으나, 바람직하게는 약 8 내지 20개 아미노산 길이를 갖는 펩티드가 각 방법에서 바람직하게 수득된다. 라이브러리의 크기는 상이한 펩티드의 약 102 내지 105, 바람직하게는 108 내지 1015이나 이에 한정되지 않는다.
표적 결합 폴리펩티드의 특정 형태는“안티칼린”이며 독일특허 출원 DE 197 42 706에 개시되어 있다.
본 발명에 따른 단백질 키나아제 N 베타의 단백질뿐만 아니라 단백질 키나아제 N 베타에 대한 핵산 코딩은 본원에 개시된 질환 및 질환상태의 치료용 의약의 제조 또는 개발을 위해서뿐만 아니라 소 분자 또는 표적 분자가 사용되는 검사과정에서 상기 질환 및 질환상태의 진단용 수단을 제조 및/또는 개발하기 위한 표적으로서 사용될 수 있다. 이 검사는 바람직하게는 상술된 라이브러리로부터 동시에 또는 그 후에 단일 소 분자 또는 다양한 소 분자와 표적분자를 접촉시키고 표적분자에 결합한 소 분자 또는 라이브러리 구성요소를 확인하는 단계를 포함하며, 다른 소 분자와 관련하여 검사된다면 비-결합 또는 비-상호작용 소 분자로부터 분리될 것이다. 상기 결합 및 비결합은 특정 실험 준비단계에 의해 강하게 영향을 받는다는 것을 알게 될 것이다. 반응 매개변수 긴축의 변형에 있어서, 이 검사방법에 대해 훌륭한 조율을 허용하는 결합 및 비결합의 정도를 변경하는 것이 가능하다. 바람직하게는, 표적 분자와 특이적으로 상호작용하는 하나 또는 몇몇의 소 분자를 확인한 후, 이 소 분자는 더 특징화될 것이다. 이 추가의 특징화는 상기 소 분자의 확인 및 그 분자 구조 및 다른 물리적, 화학적, 생물학적 및/또는 의학적 특징의 측정일 것이다. 바람직하게는, 천연 화합물은 약 100 내지 1000Da의 분자량을 갖는다. 또한 바람직하게는, 소 분자는 당업자에게 공지된 Lepinsky의 5가지 규칙에 따르는 분자이다. 다르게는, 소 분자는 비-합성인 천연 생성물과는 대조적으로 바람직하게는, 결합 화학으로부터 발생하는 합성 소 분자일 것이다. 그러나, 이들 정의는 당해 기술의 각각의 용어에 대한 일반적인 이해에 대해 단지 보조적이라는 것을 알아야 한다.
단백질 키나아제 N 베타의 단백질뿐만 아니라 단백질 키나아제 N 베타에 대한 핵산 코딩을 의약 또는 진단 물질로서 직접적 또는 간접적으로 사용될 수 있는 아프타머 및 스피에겔머의 재조 또는 선별을 위한 표적으로서 사용하는 것 또한 본 발명의 범위내이다.
아프타머는 단일 가닥 또는 이중가닥이며 특이적으로 표적 분자와 상호작용하는 D-핵산이다. 아프타머의 제조 또는 선별은 유럽특허 EP 0 533 838에 개시되어 있다. 기본적으로 하기 단계가 실시된다. 첫째, 핵산의 혼합물 즉, 잠재적인 아프타머를 제공하는 것으로 각 핵산은 일반적으로 몇몇의, 바람직하게는 8개 이상의 후속의 무작위로 추출된 뉴클레오티드의 부분을 포함한다. 이 혼합물은 그 후에 표적 분자와 접촉하며, 핵산은 후보 화합물과 비교할 때 표적에 대한 증가된 유사성 또는 그에 대한 더 큰 힘을 토대로 표적 분자에 결합한다. 결합된 핵산은 그 후에 혼합물의 나머지로부터 분리된다. 경우에 따라, 이렇게 수득한 핵산은 폴리머라아제 연쇄 반응에 의해 증폭된다. 이들 단계는 수회 반복될 수 있어 최종 결합 핵산으로부터 선택된 표적에 특이적으로 결합한 핵산의 증가된 비율을 갖는 혼합물을 마침내 생성한다. 특이적으로 결합된 핵산은 아프타머로 불린다. 개별적인 핵산 혼합물의 아프타머 샘플의 생성 또는 확인을 위한 방법의 임의 단계에서 표준 기법을 사용하여 그 서열을 측정할 수 있음이 명백하다. 상기 아프타머는 당업자에게 공지된 아프타머 생성 기술에 있어서 한정된 화학기를 도입함으로써 안정화될 수 있다. 그러한 변형은 뉴클레오티드의 당 잔기의 2’-위치에서 아미노기의 도입에 의해 가능하다. 아프타머는 현재 치료 물질로서 사용되어 지고 있다. 그러나, 이렇게 선별 또는 생성된 아프타머가 표적 확인 및/또는 의약 바람직하게는, 소 분자를 토대로 하는 의약 개발을 위한 유도 물질로서 사용될 수 있다는 것 또한 본 발명의 범위에 속한다. 이는 표적분자와 아프타머간의 특이적 상호작용이 후보 약물에 의해 억제되는 경쟁 에세이에 의해 실제로 행해지며, 표적 및 아프타머의 복합체로부터 아프타머가 교체되면 각각의 후보 약물은 표적과 아프타머간의 상호작용의 특이적 억제를 허용하며, 상기 상호작용이 특이적일 경우 상기 후보 약물은 적어도 원칙적으로 표적을 막는데 적절할 것이어서 그러한 표적을 포함하는 각각의 시스템에서 생물학적 유용성 또는 활성을 감소시킨다. 이렇게 수득한 소 분자는 독성, 특이성, 생물분해성 및 생물유용성과 같은 생리적, 화학적, 생물학적 및/또는 의학적 특성을 최적화하기 위해 추가로 유도체화 및 변형될 것이다.
단백질 키나아제 N 베타 또는 단백질 키나아제 N 베타에 대한 핵산 코딩을 사용하여 본 발명에 따라 사용 또는 생성될 수 있는 스피에겔머의 생성 또는 제조는 유사한 윈칙을 토대로 한다. 스피에겔머의 제조는 국제 특허 출원 WO 98/08856에 개시되어 있다. 스피에겔머는 L-핵산이며, 이는 스피에겔머가 D-뉴클레오티드로 구성되는 아프타머보다 오히려 L-뉴클레오티드로 구성되는 것을 의미한다. 스피에겔머는 생물학적 계에서 매우 높은 안정성을 가지며 아프타머에 비해 표적분자와 특이적으로 상호작용한다. 스피에겔머를 생성하기 위해, D-핵산의 이종 부분이 생성되며 이 부분은 표적분자의 광학 이성질체와, 본 발명의 경우 단백질 키나아제 N 베타의 천연적으로 발생하는 L-에난티오머의 D-에난티오머와 접촉한다. 그 결과, 이들 D-핵산은 분리되며 표적분자의 광학 이성질체와 상호작용하지 않는다. 그러나, 표적분자의 광학 이성질체와 상호작용하는 이들 D-핵산은 분리되며 경우에 따라 측정 및/또는 정렬되며 및 그 결과 대응하는 L-핵산은 D-핵산으로부터 수득한 핵산 서열 정보를 토대로 합성된다. 표적분자의 광학 이성질체와 상호작용하는 상술한 D-핵산과 서열에 있어서 일치하는 이들 L-핵산은 표적분자의 광학 이성질체보다는 오히려 천연적으로 발생하는 표적분자와 특이적으로 상호작용할 것이다. 아프타머의 생성 방법과 유사하게 다양한 단계를 수회 반복하는 것이 가능하므로 표적분자의 광학 이성질체와 특이적으로 상호작용하는 이들 핵산을 농축시킨다.
본원에 개시된 바와 같이 표적분자로서 단백질 키나아제 N 베타 또는 단백질 키나아제 N 베타에 대한 핵산 코딩을 토대로 제조 또는 생성될 수 있는 다른 종류의 화합물은 리보자임, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 siRNA이다.
핵산이 번역 생성물의 수준에서 표적분자, 분원의 경우 단백질 키나아제 N 베타와 상호작용하지 않고 오히려 전사 생성물 즉, 게놈 핵산 또는 대응하는 hnRNA, cDNA 및 mRNA와 같이 그로부터 유도된 임의의 핵산과 같은 단백질 키나아제 N 베타에 대한 핵산 코딩과 상호작용한다는 것은 상술한 모든 핵산의 공통된 특징이다.
리보자임은 두개의 잔기를 기본적으로 포함하는, 바람직하게는 RNA로 구성된 촉매 활성 핵산이다. 첫번째 잔기는 촉매 활성을 나타내는 반면 두번째 잔기는 표적 핵산, 본원의 경우 단백질 키나아제 N 베타에 대한 핵산 코딩과의 특이적 상호작용에 관여한다. 표적 핵산과 리보자임의 두번째 잔기간에 상호작용을 할 때, 일반적으로 교잡반응 및 두개의 교잡반응하는 가닥상의 본질적으로 상보적인 스트레치 염기에 대한 Watson-Crick 염기 쌍에 의해 상기 촉매 활성 잔기는 활성화되는데, 이는 리보자임의 촉매 활성이 포스포디에스테라아제 활성인 경우에서 상기 잔기가 분자내적으로 또는 분자사이에서 상기 표적분자를 촉진하는 것을 의미한다. 그 결과, 표적 핵산뿐만 아니라 상기 핵산으로부터 유래된 단백질, 본원의 경우 단백질 키나아제 N 베타의 퇴화를 초래하는 표적 핵산의 추가 퇴화가 있을 수 있는 바, 이는 새로이 합성된 단백질 키나아제 N 베타의 결핍 및 이전에 존재하는 단백질 키나아제 N 베타의 전복때문이다. 리보자임, 이들의 용도 및 고안 원칙은 당업자에게 공지되어 있으며 Doherty 및 Doudna(리보자임 구조 및 작용기전. Annu reg. Biophys. Biomolstruct. 2001; 30: 457-75) 및 Lewin 및 Hauswirth(리보자임 유전자 치료: application for molecular medicine. 2001 7: 221-8)에 개시되어 있다.
의약 제조를 위한 및 진단 물질로서의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 용도는 유사한 작용방식을 토대로 한다. 기본적으로, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 상보성을 토대로 표적 RNA, 바람직하게는 mRNA와 교잡반응하여 RNase H를 활성화시킨다. RNase H는 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트-결합 DNA에 의해 활성화된다. 그러나, 포스포디에스테르-결합 DNA는 포스포로티오에이트-결합 DNA를 제외하고는 세포 뉴클레아제에 의해 빠르게 퇴화된다. 이들 내성, 비-천연적으로 발생하는 DNA 유도체는 RNA와 교잡반응할 때 RNase H를 억제하지 않는다. 즉, 안티센스 폴리뉴클레오티드는 DNA RNA 교잡반응 복합체로서 효과적일 뿐이다. 이러한 유형의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 미국 특허 US 5, 849, 902 및 US 5, 989, 912에 개시되어 있다. 즉, 표적 분자, 본원의 경우 단백질 키나아제 N 베타에 대한 핵산 코딩의 핵산 서열을 토대로 각각의 핵산 서열이 원칙적으로 유도될 수 있는 표적 단백질로부터 또는 mRNA와 같은 핵산 서열의 공지에 의해 적절한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 염기 상보성의 원칙을 토대로 고안될 수 있다.
특히 바람직한 것은 포스포로티오에이트 DNA(3 내지 9개 염기)의 짧은 스트레치를 갖는 안티센스-올리고뉴클레오티드이다. 최소한 3개 DNA 염기가 박테리아 RNase H의 활성화에 필요하며 최대 5개 염기가 포유류 RNase H의 활성화에 필요하다. 이들 가상의 올리고뉴클레오티드에 있어서 RNase H에 대한 기질을 형성하지 않는 변형된 뉴클레오티드로 구성된 암스(arms)를 교잡반응함으로써 측면위치한 RNase H에 대한 기질을 형성하는 중심영역이 있다. 가상의 올리고뉴클레오티드의 교잡반응 암스는 2’-O-메틸 또는 2’-플루오로에 의해 변형될 수 있다. 상기 암스내의 메틸포스포네이트 또는 포스포라미데이트 연결에 다른 방법이 사용되었다. 본 발명의 실시에 유용한 안티센스 뉴클레오티드의 다른 구체예는 P-메톡시올리고뉴클레오티드, 일부 P-메톡시올리고데옥시리보뉴클레오티드 또는 P-메톡시올리고뉴클레오티드이다.
본 발명의 유용성은 상술한 두개의 미국특허에 개시된 바와 같은 안티센스 뉴클레오티드이다. 이들 뉴클레오티드는 천연발생 5’→3’-연결된 뉴클레오티드를 함유하지 않는다. 오히려, 상기 뉴클레오티드는 두가지 형태의 뉴클레오티드를 갖는다: RNase H를 활성화하는 2’-데옥시포스포로티오에이트 및 RNase H를 활성화하지 않는 2’-변형된 뉴클레오티드이다. 상기 2’-변형된 뉴클레오티드간의 연결은 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 또는 P-에톡시포스포로디에스테르일 수 있다. RNase H의 활성화는 박테리아 RNase H를 활성화하기 위한 3개 및 5개 2’-데옥시포스포로티오에이트 뉴클레오티드 및 진핵세포 특히, 포유류 RNase H를 활성화하기 위한 5개 및 10개 2’-데옥시포스포로티오에이트 뉴클레오티드를 함유하는 인접하는 RNase H-활성화 영역에 의해 이루어 진다. 퇴화로부터의 보호는 5’및 3’말단 염기가 뉴클레아제 내성을 높게 하거나 및 경우에 따라서는 3’말단 차단(blocking) 기를 놓음으로써 이루어 진다.
특히, 안티센스 뉴클레오티드는 5’말단 및 3’말단을 포함한다; 2’-변형된 포스포디에스테르 뉴클레오티드로 구성된 그룹으로부터 개별적으로 선택된 11 내지 59개 5’→3’-연결된 뉴클레오티드 및 2’-변형된 P-알킬옥시포스포트리에스테르 뉴클레오티드; 상기에서, 5’말단 뉴클레오티드는 3개 및 10개의 인접하는 포스포로티오에이트-연결된 데옥시리보뉴클레오티드간의 RNase H-활성화 영역에 부착되어 있으며, 상기 뉴클레오티드의 3’말단은 전화된 데옥시리보뉴클레오티드, 1 내지 3개 포스포로티오에이트 2’-변형된 리보뉴클레오티드의 인접하는 스트레치, 비오틴 기 및 P-알킬옥시포스포트리에스테르 뉴클레오티드로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
5’말단 뉴클레오티드가 RNase H-활성화 영역에 부착되지 않고 상술한 바와 같은 3’말단 뉴클레오티드의 안티센스 뉴클레오티드가 또한 사용될 수 있다. 5’말단은 상기 뉴클레오티드의 3’말단보다는 오히려 특정한 그룹으로부터 선택된다.
적절하고 유용한 안티센스 뉴클레오티드는 5’말단 RNase H-활성화 영역을 포함하며 5개 내지 10개의 인접하는 데옥시포스포로티오에이트 뉴클레오티드를 갖는 뉴클레오티드이다; 11 내지 59개의 인접하는 5’→3’-연결된 2’-메톡시리보뉴클레오티드; 및 비-5’-3’-포스포디에스테르-연결된 뉴클레오티드로 구성된 그룹, 1개 내지 3개의 인접하는 5’-3’-연결된 변형된 뉴클레오티드 및 비-뉴클레오티드 화학적 차단 기로부터 유도된 뉴클레오티드의 3’말단에 존재하는 엑소뉴클레아제 차단 기.
특히 바람직한 안티센스 뉴클레오티드의 두가지 유형은 하기와 같은 특징을 갖는다:
본원에서 두번째 생성의 안티센스 뉴클레오티드로도 불리는 첫번째 유형의 안티센스 뉴클레오티드는 5’→3’방향으로 7개의 2’-O-메틸리보뉴클레오티드의 스트레치로 구성된 총 23개 뉴클레오티드, 9개의 2’-데옥시리보뉴클레오티드의 스트레치, 5개의 2’-O-메틸리보뉴클레오티드의 스트레치 및 3’-말단 2’-데옥시리보뉴클레오티드를 포함한다. 7개의 2’-O-메틸리보뉴클레오티드의 첫번째 그룹으로부터 첫번째 4개는 포스포로티오에이트 연결되어 있는 반면, 그 다음의 4개의 2’-O-메틸리보뉴클레오티드는 포스포디에스테르 연결되어 있다. 또한, 2’-O-메틸리보뉴클레오티드의 가장 3’-말단 및 9개의 2’-데옥시리보뉴클레오티드로 구성된 스트레치의 첫번째 뉴클레오티드사이에 포스포디에스테르 연결이 있다. 모든 2’-데옥시리보뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 연결되어 있다. 포스포로티오에이트 연결은 2’-데옥시리보뉴클레오티드의 가장 3’-말단 및 6개의 2’-O-메틸리보뉴클레오티드로 구성된 그 다음 스트레치의 첫번째 2’-O-메틸리보뉴클레오티드사이에 존재한다. 6개의 2’-O-메틸리보뉴클레오티드의 이 그룹으로부터 첫번째 4개는 5’→3’방향으로 포스포디에스테르 연결되어 있으며, 위치 20 내지 22에 대응하는 그 마지막 3개는 포스포로티오에이트 연결되어 있다. 3’-말단 2’-데옥시뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 연결을 통해 3’-말단 2’-O-메틸리보뉴클레오티드에 연결되어 있다.
첫번째 유형은 하기의 개략적인 구조로 개시될 수 있다: RRRnnnnNNNNNNNNNnnnRRRN. 상기에서, R은 포스포로티오에이트 연결된 2’-O-메틸리보뉴클레오티드(A, G, U, C)이며; n은 2’-O-메틸 리보뉴클레오티드(A, G, U, C)이며; N은 포스포로티오에이트 연결된 데옥시리보뉴클레오티드(A, G, T, C)를 나타낸다.
본원에서 세번째 생성의 안티센스 뉴클레오티드 또는 GeneBloc로도 불리는 두번째 유형의 특히 바람직한 안티센스 뉴클레오티드는 다음의 염기 구조(5’→3’방향으로)를 갖는 총 17 내지 23개 뉴클레오티드를 포함한다.
5’-말단에는 엑소뉴클레아제 활성에 대해 내성에 적절한 구조인 전화된 염기 뉴클레오티드가 있으며 WO 99/54459에 개시되어 있다. 이 전화된 염기는 포스포디에스테르 연결된 5개 내지 7개의 2’-O-메틸리보뉴클레오티드의 스트레치에 연결되어 있다. 5개 내지 7개의 2’-O-메틸리보뉴클레오티드의 스트레치 다음에는 모두 포스포로티오에이트 연결된 7개 내지 9개의 2’-데옥시리보뉴클레오티드의 스트레치가 있다. 가장 3’-말단 2’-O-메틸리보뉴클레오티드 및 스트레치로 구성되는 2’-데옥시리보뉴클레오티드의 첫번째 2’-데옥시리보뉴클레오티드간의 연결은 포스포디에스테르 연결을 통해 발생한다. 7개 내지 9개의 2’-데옥시리보뉴클레오티드의 스트레치에 인접하여 5개 내지 7개의 2’-O-메틸리보뉴클레오티드로 구성된 스트레치가 연결되어 있다. 마지막 2’-데옥시리보뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 연결을 통해 발생하는 5개 내지 7개의 2’-O-메틸리보뉴클레오티드로 구성된 스트레치의 첫번째 2’-O-메틸리보뉴클레오티드에 연결되어 있다. 상기 5 내지 7개의 2’-O-메틸리보뉴클레오티드는 포스포디에스테르 연결되어 있다. 5 내지 7개의 2’-O-메틸리보뉴클레오티드의 두번째 가닥의 3’-말단에는 다른 전화된 염기가 부착되어 있다.
이 두번째 유형은 하기의 개략적인 구조로 또한 개시될 수 있다:(세번째 생성의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 나타내는 GeneBloc 역시 하기의 개략적인 구조를 갖는다:) cap-(np)x(Ns)y(np)z-cap 또는 cap-nnnnnnnNNNNNNNNNnnnnnnn-cap. 상기에서, cap는 양쪽 단부에서 전화된 데옥시 염기 또는 유사한 변형을 나타내며; n은 2’-O-메틸리보뉴클레오티드(A, G, U, C); N은 포스포로티오에이트-연결된 데옥시리보뉴클레오티드(A, G, T, C)를 나타내며; x는 5 내지 7의 정수를 나타내며; y는 7 내지 9의 정수를 나타내며; 및 z는 5 내지 7의 정수를 나타낸다.
x 및 z는 주어진 안티센스 뉴클레오티드에서 동일한 것이 바람직하지만, 상기 정수 x, y 및 z는 각각으로부터 독립적으로 선택될 수 있다는 것을 알아야 한다. 따라서, 세번째 발생의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 염기 고안 또는 구조는 하기일 수 있다: cap-(np)5(Ns)7(np)5-cap, cap-(np)6(Ns)7(np)5-cap, cap-(np)7(Ns)7(np)5-cap, cap-(np)5(Ns)8(np)5-cap, cap-(np)6(Ns)8(np)5-cap, cap-(np)7(Ns)8(np)5-cap, cap-(np)5(Ns)9(np)5-cap, cap-(np)6(Ns)9(np)5-cap, cap-(np)7(Ns)9(np)5-cap, cap-(np)5(Ns)7(np)6-cap, cap-(np)6(Ns)7(np)6-cap, cap-(np)7(Ns)7(np)6-cap, cap-(np)5(Ns)8(np)6-cap, cap-(np)6(Ns)8(np)6-cap, cap-(np)7(Ns)8(np)6-cap, cap-(np)5(Ns)9(np)6-cap, cap-(np)6(Ns)9(np)6-cap, cap-(np)7(Ns)9(np)6-cap, cap-(np)5(Ns)7(np)7-cap, cap-(np)6(Ns)7(np)7-cap, cap-(np)7(Ns)7(np)7-cap, cap-(np)5(Ns)8(np)7-cap, cap-(np)6(Ns)8(np)7-cap, cap-(np)7(Ns)8(np)7-cap, cap-(np)5(Ns)9(np)7-cap, cap-(np)6(Ns)9(np)7-cap 및 cap-(np)7(Ns)9(np)7-cap.
본원에 개시된 기술적인 교수법을 토대로 하여 생성될 수 있으며, 의약 및/또는 진단 물질로서 사용될 수 있는 다른 유형의 화합물은 핵산, 바람직하게는 mRNA, 단백질 키나아제 N 베타에 대해 유도된 소간섭 RNA(siRNA)이다. siRNA는 일반적으로 약 21 내지 약 23개 뉴클레오티드 길이를 갖는 이중가닥 RNA이다. 두개 RNA 가닥 중 하나의 서열은 퇴화될 단백질 키나아제 N 베타에 대한 핵산 코딩과 같은 표적 핵산의 서열에 대응한다. 즉, 표적 분자, 본원의 경우에서 단백질 키나아제 N 베타의 핵산 서열 바람직하게는 mRNA 서열을 알아 이중가닥 RNA는 단백질 키나아제 N 베타의 mRNA에 상보적인 두 가닥 중의 하나와 함께 고안되어 질 수 있으며, 단백질 키나아제 N 베타에 대한 유전자, 게놈 DNA, hnRNA 또는 mRNA 코딩을 함유하는 시스템에 상기 siRNA의 적용시 각 표적 핵산은 퇴화되어서 각 단백질의 양은 감소할 것이다. 의약 및 진단물질로서 상기 siRNA의 고안, 작제 및 사용의 기본 원칙은 국제특허출원 WO 00/44895 및 WO 01/75164에 개시되어 있다.
단백질 키나아제 N 베타에 대한 상기 핵산 코딩이 공개되면, 상술한 고안 원칙을 토대로 siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 리보자임을 생성하는 것이 가능하다. 이는 또한 게놈 핵산을 포함하여 hnRNA, cDNA 등과 같은 핵산의 전구체 분자에도 적용된다. 물론 각각의 안티센스 가닥을 아는 것 또한 염기 쌍 상보성의 기본적인 원칙을 고려할 때, 바람직하게는 Watson-Crick 염기 상을 토대로 핵산 기제 화합물의 고안을 허용할 것이다. 따라서, 본 발명의 다른 면은 단백질 키나아제 N 베타에 대해 유도된 또는 특이적인 siRNA, 리보자임 및 안티센스 뉴클레오티드에 관한 것이다. 하기에서 본 발명은 siRNA에 의해 더 설명될 것이나, 본 발명은 또한 당업자가 알고 있는 바와 같이 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 리보자임에 적용한다.
그러한 siRNA는 바람직하게는 15 내지 25개 뉴클레오티드 길이를 포함하며, 이는 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 뉴클레오티드로 구성된 실질적으로 임의의 길이를 의미한다. 다른 구체예로서, 상기 siRNA는 그 이상의 뉴클레오티드를 나타낼 수 있다. 당해 기술에 잘 알려진 고안 원칙에 따르면, 각 siRNA는 생성될 수 있다. 따라서, 상기 siRNA는 PKN-베타를 암호화하는 센스 또는 안티센스 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 15 내지 25개 연속적인 뉴클레오티드 길이의 임의의 뉴클레오티드의 스트레치 및 첫번째 가닥에 적어도 부분적으로 상보적이어서 PKN-베타를 암호화하는 안티센스 가닥 및 센스 가닥에 상보적인 두번째 리보뉴클레오티드 가닥을 포함한다. siRNA의 생성 또는 제조에 관한 공지된 임의의 고안 원칙은 이러한 유형의 이중가닥 구조에 적용할 수 있다. 본원에 개시된 상기 siRNA 공간은 상술한 서열을 암호화하는 PKN-베타의 뉴클레오티드 번호 1에 대응하는 뉴클레오티드로 개시하는 siRNA 분자 안티센스 가닥을 포함한다. 그러한 다른 siRNA 분자는 상술한 서열을 암호화하는 PKN-베타의 뉴클레오티드 번호 2에 대응하는 뉴클레오티드로 개시한다. 서열을 암호화하는 PKN-베타에 대한 이러한 유형의 스캐닝(scanning)은 PKN-베타에 대해 유도될 수 있는 모든 가능한 siRNA 분자를 제공하도록 반복된다. 생성된 임의의 siRNA 분자 길이는 siRNA에 대해 적절한 임의의 길이 특히, 상술한 임의의 길이일 수 있다. 바람직하게는, 본원에 개시된 siRNA 분자 공간의 다양한 siRNA 분자는 안티센스 가닥 또는 센스 가닥의 가장 5’말단 뉴클레오티드를 제외하고 중복된다. 이렇게 수득한 안티센스 서열은 기능적으로 활성인 siRNA에 필요한 이중가닥을 적어도 부분적으로 형성하도록 염기 쌍을 통해 보충되어져야 한다는 것은 명백하다.
항체, 펩티드, 안티칼린, 아프타머, 스피에겔머, 리보자임, 안티센스 올리고뉴클레오티드뿐만 아니라 siRNA와 같은 상술한 유형의 화합물의 작용 방식을 토대로, 본원에 개시된 임의의 질환 및 질환상태에 대한 의약 또는 진단물질의 제조를 위한 단백질 키나아제 N 베타 및 단백질 키나아제 N 베타에 대한 핵산 코딩을 표적으로 하는 임의의 이들 화합물을 사용하는 것은 본 발명의 범위에 속한다. 또한, 이들 물질은 상기 질환 및 질환상태의 예후 및 적용된 임의의 치료 성공성을 모니터하는데 사용될 수 있다.
항체, 펩티드, 안티칼린, 소 분자, 아프타머, 스피에겔머, 리보자임, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 siRNA와 같이 본 발명에 따라 고안된 다양한 종류의 화합물은 약제학적 조성물에 함유될 수 있다. 바람직하게는, 그러한 약제학적 조성물은 본원에 개시된 질환 또는 질환상태를 치료하는데 사용된다. 약제학적 조성물은 상술한 하나 또는 몇몇 유형의 화합물 및/또는 하나 이상의 단일 유형 및 경우에 따라 다른 약제학적 활성 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 그러한 담체는 용액, 완충액, 알코올 용액 등과 같은 액체 또는 고형일 수 있다. 적절한 고형 담체는 녹말 등이다. 경구, 비경구, 피하, 정맥내, 근육내 등과 같은 특정 경로의 투여형태를 실시하기 위해 상술한 유형의 화합물에 따른 다양한 화합물에 대한 각각의 제형은 당업자에게 공지되어 있다.
상술한 바와 같이, 상이한 유형의 다양한 화합물은 단독으로 또는 조합하여 키트로 되거나 키트에 포함된다. 그러한 키트는 각각의 화합물은 별도로 하고 부가적으로 하나 또는 몇몇의 추가 요소 또는 화합물을 포함하며, 상기 요소는 완충액, 음성 대조군, 양성 대조군 및 다양한 화합물의 사용에 대한 지시를 포함하는 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게는, 다양한 화합물은 건조 또는 액체 형태, 바람직하게는 단일투여를 위한 단위 복용량으로 존재한다. 상기 키트는 본원에 개시된 질환 및 질환상태와 관련된 치료, 진단 또는 질환의 진행을 모니터링하는데 특히 사용될 수 있다.
본 발명은 보호의 범위를 제한하지 않는 하기의 도면 및 실시예에 의해 더 설명된다.
실시예 1: 재료 및 방법
세포배양
사람 전립선 암종 PC-3 세포를 American Type Culture Collection(ATCC)로부터 수득하였다. 세포는 10% 우태혈청(CS), 겐타마이신(50㎍/ml) 및 암포테리신(50ng/ml)을 함유하는 F12K Nutrient Mixture(Kaighn 변형)에서 배양시켰다. 형질감염은 올리고펙타민, 리포펙타민(Life Technologies), 아르그펙틴50 또는 프로펙틴50(Atugen/GOT Berlin, Germany) 또는 Fugene 6(Roche)과 같은 다양한 양이온성 지질을 사용하여 제조자 지시에 따라 96 웰 또는 10-cm 플레이트(30% 내지 50% 콘플루언시에서)에서 실시하였다. GeneBloc은 GeneBloc의 예비형성된 5x 농축된 복합체 및 무혈청 배지내의 지질을 완전배지내의 세포에 부가함으로써 형질감염시켰다. 96 웰에 놓인 세포당 총 형질감염 부피는 100㎕이었으며, 10cm 플레이트내의 세포에 대해서는 10ml였다. 세포지질 농도는 세포밀도에 따라 0.8 내지 1.2㎍/ml였다; 상기 GeneBloc의 농도는 각 실험에 표시되어 있다. 배양된 세포를 트립신처리하고 배지에 의한 트립신 효과를 멈춘 다음에 채취하였다. 세척과정(PBS; 원심분리 5분/1.000rpm)을 부가하고 마지막으로 접종될 세포 수 및 부피를 고려하여 펠렛을 재현탁시켰다.
Taqman 분석에 의한 RNA 수준의 상대량의 측정
96-웰에서 형질감염된 세포의 RNA를 분리시키고 Invisorb RNA HTS 96 키트(InVitek GmbH, Berlin)를 사용하여 정제하였다. PKN 베타 mRNA 발현의 억제는 300nM PKN 베타 5’프라이머, 300nM PKN 베타 3’프라이머 및 100nM의 PKN 베타 Taqman 탐침 Fam-Tamra 라벨을 사용한 실시간 RT-PCR(Taqman) 분석에 의해 검출하였다. 상기 반응은 50㎕에서 실시하였으며 하기 조건하에서 제조자 지시에 따라 ABI PRISM 7700 서열 검출기(Applied Biosystems)로 평가하였다: 48℃에서 30분간, 95℃에서 10분간 이후에 95℃에서 15초간 및 60℃에서 1분간의 40주기.
마트리겔 매트릭스상의 실험관내 성장
PC3 세포는 Matrigel상에 살포시 5μM LY294002 또는 DMSO로 처리하였다. 세포가 살포전에 형질감염되었다면, 세포를 GeneBloc으로 형질감염시키고 형질감염 48시간 후 트립신처리하였다. 상기 세포를 배지에서 세척하고 250 1 마트리겔 기저 막 매트릭스(Becton Dickinson)로 예비 -피막된 이중 24-웰(웰당 100.000 세포)내로 살포하였다. 24시간 내지 72시간동안 배양한 후, Axiovert S100 현미경(Zeiss)에 부착된 Axiocam 카메라를 사용하여 5x 확대에서 사진을 찍었다.
Affymetrix
Matrigel상에서 성장한 세포로부터의 총 RNA는 Totally RNA 키트를 사용한 하기의 제조자 프로토콜에 따라 제조하였다. 첫번째 단계에서 침전된 총 RNA는 Invisorb 용해 완충액에서 재현탁시키고 Invisorb 스핀 세포-RNA 키트(INVITEK)를 사용하여 정제시켰다. 비오틴-라벨의 cRNA는 하기 Affymetrix 프로토콜에 따라 제조하였으며 15㎍ cRNA는 Affymetrix GeneChip set HG-U95상에서 교잡반응시켰다.
데이터 분석
원자료는 Affymetrix GeneChip software Microarray Suite v4.0을 사용하여 분석하였다. 각 탐침 세트의 강도는 한개의 전사에 대응하는 16 내지 20개 탐침 쌍의 세트에 대하여 평균으로 나타낸 불일치 올리고뉴클레오티드와 비교할 때 완벽한 일치 올리고뉴클레오티드의 교잡반응 신호의 차이로서 계산하였다. 탐침 세트의 평균 차이는 다수의 전사에 비례한다. 상이한 어레이의 총 신호 강도는 비교하기 전 동일한 수치로 측정하였다. 중첩 변화는 실험 및 베이스라인 어레이로부터 대응하는 탐침 쌍의 강도를 쌍방향으로 비교함으로써 Affymetrix software를 사용하여 계산하였다. Affymetrix에 의해 개시된 결정 매트릭스를 사용하여 상기 소프트웨어는 절대적 콜(absolute call, 실험에서 전사가 없거나, 최저 또는 존재) 및 차이 콜(difference call, 다른 실험과 비교할 때 하나의 실험에서 전사의 풍부함: 증가, 근소한 증가, 무변화, 근소한 감소, 감소)을 또한 생성한다. 결과는 Microsoft Excel(절대적 콜, 차이 콜, 중첩변화)로 정리하였다. 콜이 없거나 또는 무변화 콜을 갖는 모든 탐침 세트는 버리고 상기 테이블을 중첩 변화에 의해 분류하였다.
동물 연구
생체내 실험은 식품 및 의약청의 Nonclinical Laboratory Studies(GLP Regulation)에 대한 대응하는 Good Laboratory Practice 및 법률적 토대로서 독일 동물보호법에 따라 실시하였다.
수컷 Shoe: SPF 조건(Laminar air flow equipment, Scantainer, Scanbur)하에 유지된 NMRI-nu/nu 마우스(Tierzucht Schonwalde GmbH)를 사람 전립선 암종 세포에 대한 수용체로서 사용하였다. 생후 6-8주 및 몸무게 28-30g의 상기 동물에게 전립선의 양쪽, 왼쪽 배측 엽(iprost; 동소이식) 또는 간의 Lobus 측면 왼쪽의 팁(ihep; 이소성)내로 2x106/0.03ml 종양세포를 접종하였다. 이를 위해, 상기 마우스는 Ketanest(Parke-Davis GmbH) 및 Rompun(Bayer Vital GmbH)을 각각 100mg/kg 및 5mg/kg의 복용량으로 80:1의 혼합물을 사용하여 전신마취시켰다. 복부 표면을 소독한 다음 복부피부 및 포피선의 경계 부근에서 시작하는 복막벽을 통해 1cm 정도로 절개를 하였다. 쪽집게 및 면봉을 사용하여 전립선이 보이게 하였다. 확대유리 및 30G 0,30x13 마이크로랜스 바늘(Becton Dickinson)을 갖는 1ml 주사기(Henke Sass Wolf GmbH)를 사용하여 동소이식 세포에 접근하였다. 접종부위에서 표시된 수포가 발견되면 접종은 성공한 것이다. 복막 벽에 대해서는 상처를 봉합 재료(PGA Resorba, Franz Hiltner GmbH)에 의해 봉합하였으며 복부 피부에 대해서는 Michel 클램프 11x2mm로 봉합하였다. 상처 스프레이(Hansaplast Spruhpflaster, Beiersdorf AG)는 병변을 보호하였다. 수술후 단계중에 상기 동물을 완전히 깨어날 때까지 따뜻한 환경에서 유지시켰다. 각 그룹당 5-10마리 동물로 구성되는 치료 그룹의 수에 따라 상기 동물을 무작위로 추출하였다. 조사결과 프로토콜링을 포함하여 상기 동물들을 연속적으로 검사하였다. 임으로, Ssniff NM-Z, 10mm, 고압력(ssniff Spezialdiaten GmbH)을 강화된 식이로서 투여하였으며 음료수는 HCl에 의해 산성화하였다.
평가
실질적인 복용량 수준을 얻기위해, 치료당일에 체중을 측정하였다. 동시에, 전체 유기체에 대한 치료양상의 영향을 인식하는 것은 체중발달로부터 유도될 수 있다.
혈액천자를 실험 당일(베이스 라인); 14일; 28일 및 35일(Sacrificing)에 실시하였다. 혈액은 짧은기간 마취된 동물의 안와 정맥으로부터 채취하였다(Diethylether, Otto Fischar GmbH). 적합성에 대한 주어진 데이터 매개변수 평가 및 치료 부작용은 다음과 같다: 백혈구 수; 혈소판 수; 효소. 추가의 혈액관련 매개변수는 빌리루빈; 크레아티닌; 단백질; 요소; 요산이다.
모든 실험 동물은 완전히 해부하여 사진으로 기록하였다. 종양(전립선) 및 전이(미골부, 요추, 신장 림프절 전이)는 한쌍의 캘리퍼스에 의해 2차원으로 측정하였다. 부피는 V(㎣) = ab2/2 with b〈 a에 따라 측정하였다. 일반적으로, 치료방법에 대해 실시한 세포수는 전립선을 고려할 때 100% 종양을 유발한다. 2차적 부작용을 고려하여 추가 데이터를 발견하기 위해 일부 기관(간; 비장; 신장)의 중량을 등록하였다.
조직학적 분석을 위해, 종양 조직 샘플 즉, 전립선 종양 및 림프절 전이 샘플을 5% 포름알데히드 및 부가된 파라핀에 고정시켰다. 일상적으로, 상기 부분을 HE 착색하였으며 필요하다면, 특이적 착색을 실시하였다(Azan, PAS).
사람 기원의 종양 및 전이성 세포를 검출하기 위해, 적절한 조직 샘플을 액체 질소에서 냉동시켰다. PCR 및 huHPRT 특이적 암플리콘에 의한 Taqman 분석을 사용할 때 본 발명자들은 5mg 조직에서 50개 사람 세포를 검출할 수 있었다.
상기 치료결과는 Mann 및 Whitney의 u-실험에 의해 통계적으로 입증되었다.
실시예 2: 하류 약물 표적의 적합성에 대한 개념의 실험적 입증
도입부에서 강조한 바와 같이, 신호 경로에 대한 표적 연결된 하류는 의약 및 진단 물질의 고안 및 개발에 있어서 중요하다. 특정 표적이 상이한 다른 경로에 연결되거나 또는 신호 경로내의 그 위치로 인하여 전이 및 이동, 성장, 번역, 세포괴사, 세포주기, DNA 회복 및 PI-3 키나아제의 경우등과 같은 다수의 생물학적 현상에 연결되어 있다면, 이 표적을 해결하는 임의의 화합물은 상기 시스템에 해로우며 의학적 관점에서 보면 바람직하지 않은 다수의 부작용을 가질 것이다. 따라서, 추가 하류에 작용하는 표적은 치료적 중개에 있어서 첫번째 선택이되어야 한다.
PI-3 키나아제 경로의 조절하에서 mTOR과는 별도로 추가의 가능한 약물 표적이 관련된다는 것을 발견하였는 바, 이는 전이 및 이동 및 종양형성의 현상을 조절하는데 특이적이다. 약학 분야에 있어서, Rapamune 상표명으로 판매되는 라파마이신이 전이 및 이동을 억제하는데 적합하다는 것을 발견하였다. 이는 하류 약물 표적을 해결하기 위한 방법의 적합성을 확인시켜주었다.
도 2에서 알수 있는 바와 같이, 라파마이신은 림프절 전이의 부피를 줄이는데 적합하며 공지된 PI-3 키나아제 억제제 LY294002에 대한 효과에 있어서 비교할 만하다. 도 2a에 도시된 바와 같이, 종양 모델을 선택하여 Rapamune에 의한 치료를 첫째날 시작하였다. 사용된 농도 즉, 0.4mg/kg/복용량-2mg/kg/복용량은 인산염 완충 식염수인 음성 대조용과 비교할 때 측정된 전이의 부피(㎣)로 나타낸 림프절 전이의 정도를 상당히 감소시켰다.
조직학적 분석을 위해, 종양 조직 샘플 즉, 전립선 종양 및 림프절 전이 샘플을 5% 포름알데히드 및 부가된 파라핀에 고정시켰다. 일상적으로, 상기 부분을 HE 착색하였으며 필요하다면, 특이적 착색을 실시하였다(Azan, PAS).
치료 개시 28일째에 확정된 종양모델에 대한 Rapamune 처리의 경우에서 기본적으로 동일한 결과를 수득하였다.
라파마이신(Rapamune)에 의한 처리 후, 동소이식 PC-3 마우스 모델에서 림프절 전이를 측정하였다. 도 2a에 모델로 택한 종양이 도시되어 있다. Nude shoe: NMRI-nu/nu 마우스(그룹당 8마리)에게 0.03ml 전립선내에서 2x106 PC3 세포를 주입하였으며, 치료는 Rapamune을 사용하여 28일동안 매일 복막강내로 2mg/kg 및 0.4mg/kg의 복용량으로 실시하였다. PBS는 대조용으로 사용하였다.
확정된 종양(b)의 치료를 위해, 세포를 28일동안 ipros에서 성장시켰으며, 치료는 주입 후 29일 내지 50일째에 Rapamune을 사용하여 경구로 실시하였다. 복용량은 a에 나타난 바와 같이 선택하였다. 동물은 각각 29일 및 51일째에 치사시켰으며 총 림프절 전이를 측정하였다.
실시예 3: PI 3-키나아제 경로내의 하류 약물 표적으로서 PKN 베타의 확인
기본적인 실험방법은 도 3에 도시되어 있다. Matrigel상에서 성장한 PC3 세포를 DMSO 또는 PI 3-K 억제제 LY294002로 처리하고 총 RNA는 각 샘플로부터 분리시켰다. 차등 Affymetrix 유전자 발현 프로파일링을 실시하였으며 발현은 실시간 RT-PCR Taqman 에세이를 사용하여 확인하였다. p110은 비-감별 표준으로서 사용하였다. PC3 세포는 PTEN -/-이며, 이는 종양억제제 PTEN은 이들 세포가 없어서 PI 3-키나아제 경로가 영구적으로 활성화되어 마트리겔 에세이에서 세포의 성장 패턴에 의해 표현되는 세포의 증가된 전이성 활성 또는 행동을 초래한다. 잠재적인 침윤성 성장을 하는 세포는 마트리겔 매트릭스와 같은 기저막상에서 향상된 성장을 나타낸다(Peterson, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A.R. 및 bissell, M. J. (1992). 기저막과의 상호작용은 정상 및 종양 사람 유방 상피세포의 성장 및 감별 패턴을 빠르게 구별하게 한다. Proc Natl Acad Sci USA, 89, 9064-9068.(Auch: Sternberger 등., 2002 안티센스 & 핵산 의약 개발 12: 131-143).
이와 관련하여, PC3 세포는 마트리겔상에서 성장하며 이를 생체내 환경과 유사한 모델 시스템으로 택하였으며, 그로부터 분리된 RNA는 원위치 환경 또는 전통적 세포 배양 플레이트와 같은 비-마트리겔 환경에서 성장한 세포로부터 수득한 임의의 제조에서보다 결과에 더 유사할 것으로 추측됨을 알아야 한다.
실시예 4: 단백질 키나아제 N 베타에 대해 유도된 최적 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대한 검사
PC3 세포는 개시된 바와 같이 상이한 GeneBloc 농도로 형질감염시켰으며, mRNA 수준은 형질감염 24시간 후 300nM PKN 베타 특이적 정방향 및 역방향 프라이머, 100nM 탐침 및 40nM 정방향 및 역방향 프라이머 및 사람 액틴에 대한 100nM 탐침에 의한 Taqman 에세이를 사용하여 측정하였다. mRNA 수준을 내부 액틴 수준으로 표준화하였으며 양은 GBC(Gene Bloc Control에 의해 형질감염된 세포)에 대해 상대적으로 나타냈다.
그 결과는 도 4에 도시되어 있다. 추가 연구를 위해, 도 4로부터 특히 유리한 안티센스 올리고뉴클레오티드로서 GeneBloc 70210 및 70211을 선택하였다.
본원에 사용된 다양한 실시예에서 GeneBloc과 관련하여, 이들은 모두 세번째 발생 안티센스 올리고뉴클레오티드이며 이는 표 1로부터 명백하듯이 상부 글자는 포스포르디에스테르 연결보다는 오히려 포스포로티오에이트를 통해 연결된 데옥시리보뉴클레오티드를 나타낸다
다양한 GeneBloc은 하기 서열번호에 대응한다:
70669: 서열번호 3
70670: 서열번호 4
24536: 서열번호 5
24537: 서열번호 6
24538: 서열번호 7
70210: 서열번호 8
70211: 서열번호 9
70671: 서열번호 10
70676: 서열번호 11
70677: 서열번호 12
또한, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드가 GeneBloc인 즉, 세번째 발생 안티센스 올리고뉴클레오티드인 점을 고려할 때 임의의 “t”는 실제적으로 “u”이다.
실시예 5: 단백질 키나아제 N 베타의 선택적 녹다운
단백질 키나아제 N 베타가 PI 3-키나아제 경로의 적절한 하류 약물 표적이라는 것을 입증하기 위해 실시예 4로부터 수득한 특히 이로운 두개의 GeneBloc을 마트리겔 기저 성장 실험에 사용하였다. 상기 마트리겔 성장 실험은 각 세포의 전이 및 이동 행동을 나타내는 대리 모델로서 채택하였다. 세포의 전이 및 이동 행동에 대한 표시로서 채택한 상기 세포의 융합 성장은 증가하였으며, 이는 상기 세포가 마트리겔에 의해 제공된 삼차원 구조에 걸쳐서 퍼지게 한다.
개시된 바와 같이, PC3 세포를 형질감염시키고 마트리겔상에 살포하여 성장을 모니터하였다. 마트리겔상에 살포된 세포의 동분량으로부터 mRNA를 분리시키고 Taqman 에세이를 사용하여 분석하였다(왼쪽패널). PHN 베타 특이적 mRNA를 내인성 p110α mRNA 수준으로 표준화시켰다. PTEN 특이적 GeneBloc은 PTEN-/-PC3 세포내의 음성 대조용으로 사용하고 p110α특이적 GeneBloc은 세포외 매트릭스내의 성장에 대한 양성 대조용으로 사용하였다. 특이적 성장 억제는 PHN 베타 특이적 GeneBloc 70210 또는 70211로 처리된 세포의 성장과 이들의 대응하는 미스매치 올리고뉴클레오티드 70676 및 70677을 비교함으로써 나타냈다.
각 결과를 도 5에 나타냈다. 이로부터 GeneBloc 70210 또는 70211가 본원에 개시된 질환 및 질환상태를 치료하기 위한 의약 또는 진단물질의 제조에 적합한 화합물이라는 것을 알 것이다.
실시예 6: HeLaB 세포에서 일시적인 siRNA의 발현에 의한 RNA 간섭
이 실험은 특이적으로 하류 약물 표적 단백질 키나아제 N 베타가 해결되게 하는 siRNA의 성공적인 고안에 대한 예이다. 도 6a에 도시된 바와 같이, siRNA 분자는 표적 특이적 서열의 발현을 유도하는 프로모터(U6+2)에 의해 생성하였다(21-mer 센스를 함유하는 유전자로부터 유도된 주형 및 12-mer 폴리 A 스트레치에 의해 연결된 역 상보적 서열). 전사시에 RNA는 이증가닥 siRNA 분자를 형성할 것이다.
PKN베타의 mRNA 서열에 대해 고안된 siRNA로서 동일한 벡터 작제물에서 p110베타 및 PTEN과 같은 다양한 작제물을 각각 양성 및 음성 대조용으로 사용하였다. 도 6b에 표시된 각 고안은 U6+2 프로모터 카세트를 운반하는 발현 벡터내로 도입된 siRNA 발현에 대한 표적 유전자의 주형 서열이다.
상기 작제물을 RNAi 간섭실험을 위한 HeLaB 세포내로의 형질감염에 의해 일시적으로 발현시켰다. 형질감염된지 48시간 후 세포를 채취한 다음에 마트리겔상에 살포하였다(웰당 80000 세포). 대응하는 유전자의 발현에 대한 RNA 간섭의 영향은 마트리겔상의 성장/증식에 대한 형질감염된 세포를 검사함으로써 분석하였다. PTEN에 대한 표적 siRNA의 발현은 마트리겔(오른쪽 패널)상의 HeLaB 세포 성장에 대해 아무런 영향을 미치지 않는 반면, p110베타 및 PKN베타에 특이적인 siRNA의 발현은 마트리겔(중간 및 오른쪽 패널)상의 HeLaB 성장 행동을 심하게 방해하였다.
이러한 점에서 볼때, 특정 siRNA 서열은 본원에 개시된 질환 및 질환상태를 치료하는데 효과적인 수단임을 입증한다.
실시예 7: 사람 전립선 종양에서 단백질 키나아제 N 베타의 검출
단백질 키나아제 N 베타가 전립선 종양의 치료에 적절한 표적임을 더 입증하기 위해, 각각의 사람 전립선 조직을 원위치에서 교잡반응하였다.
원위치에서 교잡반응를 위해, pCR4 Topo 벡터중의 서열 NM 013355로부터의 뉴클레오티드 위치 1672 내지 2667로부터 센스 및 안티센스 가닥을 제조하였으며, 상기에서 T7 및 T3 폴리머라아제는 증폭 목적으로 사용하였다. 상기 사람 전립선 종양 세포(PC-3)는 마우스에서 성장시켰다. 해부 후, 조직은 이소팬탄 용액중의 -20℃에서 냉각시키고 조각 절단은 -15℃에서 하여 -80℃에서 저장하였다. 교잡반응전에 조각은 파라포름알데히드에 고정시켰다. 사람 종양 표본은 파라포름알데히드 및 파라핀에 고정시켰다. 종양 표본은 프로테인나아제 K로 처리하고 아세틸화하였다. 핵산 탐침은 35S-ATP 35S-UTP로 이중 표시하였으며, 50% 포름아미드를 함유한 교잡반응 완충액(0.4 M NaCl, 50% 포름아미드, 1x Denhadrt’s, 10mM Tris, 1mM EDTA, 10% 덱스트란 술페이트, 10㎍/ml의 각 tRNA 및 연어 정자 DNA, 10mM DTT)중의 58℃에서 조직과 함께 배양시켰다.
원위치에서 교잡반응의 결과는 도 7에 도시되어 있다. 전립선 종양의 원위치에서의 교잡반응에 대한 단백질 키나아제 N 베타 안티센스 탐침을 사용하여 상기 분비기관을 집중적으로 착색시켰다(도 7a). 이와 대조적으로, 건강한 전립선 조직은 덜 착색되었으며 다시 안티센스를 사용하여(도 7c) 배경 신호만을 제공하였다. 이와 대조적으로, 양쪽 조직과 관련하여 센스 탐침의 사용은 어떤 신호도 제공하지 않았다.
실시예 8: siRNA에 의한 일차 종양 및 림프절 전이의 생체내에서의 감소
이 실시예는 생체내에서 동소이식 전립선 종양 모델을 사용한 표적 유전자 확인에 관한 것으로, 이는 단백질 키나아제 N 베타에 대해 유도된 siRNA를 사용함으로써 일차종양 및 림프절 전이의 감소가 실현될 수 있음을 나타냈다. 상기 결과는 도 8a 내지 8c에 도시되어 있다.
도 8a에서, 실시예 1에 개시된 바와 같이 일차세포의 크기를 측정하였으며,동소이식 전립선 종양 모델에서는 임의의 하기 두개 siRNA 작제물을 사용하여 상당히 감소될 수 있다:
5’actgagcaaggagctttggag 또는
5’aaattccagtggttcattcca.
p110α 서브유닛에 대한 siRNA는 음성 대조용으로 사용하였으며 p110-β에 대한 siRNA는 양성 대조용으로 사용하였다.
두개의 개별적인 siRNA 분자의 다른 세트는 림프절 전이에서 단백질 키나아제 N 베타에 대해 암호화하는 mRNA를 퇴화시키는데 사용하였다. 림프절 전이는 하기 림프절에서 발견되는 2차적 종양이다: 미골부, 요추, 신장 및 종격동 림프절이며, 상기에서 미골부 림프절이 전립선에 가장 가까우며 종격동 림프절은 이식 종양으로부터 가장 멀리 있다. 일차종양의 경우와 같이, 상기 siRNA 작제물은 단백질 키나아제 N 베타에 대한 mRNA 코딩을 성공적으로 감소시키므로써 종양 크기를 감소시켰다(도 8b). 양성 및 음성 대조용은 일차종양의 감소와 관련하여 논의하였다. 양쪽 경우에서 즉, 일차종양 및 림프절 전이에 있어서, 사람 전립선 종양 세포는 유전학적으로 작용하여 폴리머라아제 III U6 프로모터로부터 각각의 siRNA 분자를 발현시켰다.
이들 결과와는 별도로, 도 8c1 및 도 8c2에 도시된 바와 같이 명확한 표현형 분석은 사람 전립선 종양 세포에서 siRNA 작제물의 전사 활성화 시 림프절 전이는 상당히 감소될 수 있으며, 도 8c1에 도시된 부어오른 림프절은 도 8c2에 도시된 바와 같이 siRNA로 처리된 조직에서 존재하지 않음을 보여주었다.
실시예 9: 단백질 키나아제 N 베타의 기능적 특징
이 실시예는 단백질 키나아제 N 베타의 기능적 특징 및 특히, 유도체화의 영향 즉 단백질 키나아제 활성 및 인산화에 의한 단백질 키나아제 활성의 조절에 대한 단백질 키나아제 N 베타의 기능적 아미노산 잔기의 절단 또는 돌연변이의 영향에 관한 것이다.
하기의 단백질 키나아제 N 베타 유도체는 본원에 개시된 바와 같이 야생형 서열로 불리는 아미노산 잔기에 의해 도 9c에 개략적으로 도시된 바와 같이 적어도 부분적으로 생성하였다:
a) 아미노산 535-889를 포함하는 키나아제 영역;
b) 아미노산 288-889를 포함하는 △N;
c) 리신 내지 아르기닌으로부터 위치 588에서 돌연변이를 갖는 키나아제 영역;
d) 리신 내지 글루탐산으로부터 위치 588에서 돌연변이를 갖는 키나아제 영역;
e) 알라닌(TA718) 또는 아스파르트 산 또는 글루탐산(TD718 또는 TE718)로 변화되는 아미노산 위치에서 트레오닌 잔기와 함께 인산화 부위(AGC 활성화 루프 콘센서스)에서 돌연변이를 갖는 키나아제 영역의 유도체; 및
f) 최대 길이 야생형 PKN베타 분자(889 아미노산).
각각의 단편을 HeLa 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 이들의 상대적 발현은 항-PKN 베타 항체를 사용한 HeLa 세포 추출물의 웨스턴 블럿 분석에 의해 측정하였다.
다클론성 항-PKN 베타 항혈청은 대장균에서 PKN 베타의 C-말단 아미노산(609-889)이 과잉발현된 후 생성하였다. 각각의 단백질 단편은 세포함유물 몸체로부터 겔-정화시키고 표준 방법에 따라 회수 및 농축시켰다.
단백질 키나아제 N 베타는 C-말단에서 그 촉매 영역내에 AGC-유형 키나아제 분자에 대해 상동관계를 갖는다. 키나아제 패밀리는 효소 활성화에 대해 인산화되어야 하는 촉매 영역의 활성화 루프내의 보존된 트레오닌 잔기를 특징으로 한다.활성 루프내의 트레오닌의 높은 보존 및 주위의 아미노산때문에, 이 부위에 대한 항-포스포 항체는 시판되는 공급원으로부터 이용가능하다. 각각의 항체는 도 9에서 항체-P*-PRK 및 도 10에서 항체-P*-AGC 키나아제로 불린다.
MPB는 생체내 인산화 기질에 있어서 표준인 미엘린 기저 단백질이다.
하기 결과를 수득하였다:
단백질 키나아제 N 베타 활성도
최대 길이 중량아미노산 535-889를 포함하는 키나아제 영역 ++*+*
아미노산 288-889를 포함하는 △N; -*
리신 내지 아르기닌으로부터 위치 588에서 돌연변이를 갖는 키나아제 영역 -*
리신 내지 아르기닌으로부터 위치 588에서 돌연변이를 갖는 키나아제 영역 -*
TA718 -*
TD718 또는 TE718 -* !
+: 활성
-: 비활성
!: 다른 키나아제에서 필적할 만한 돌연변이로부터 예측할 수 있는 바와 같이 “과잉 활성화”는 관찰되지 않음(Morgan 및 Debond, 1994)
상기 결과는 도 9에 도시되어 있다,
도 9는 HeLa 세포에서 일시적 과잉발현 시 표준 인산와 기질로서 MPB를 사용한 상이한 단백질 키나아제 N 베타 유도체의 겔 분석 및 이들의 활성도를 나타낸다. 도 9a로부터 알 수 있는 바와 같이, 최대 길이 단백질 키나아제 N 베타는 별도로 하고 그 다른 야생형 형태의 키나아제 영역만이 인산화 MPB에서 활성이다.
동일한 단백질 키나아제 N 베타 유도체를 사용하여 위치 718에서 돌연변이 T/A를 갖는 키나아제 영역을 포함하는 유도체를 제외하고, 모든 다른 유도체는 이들의 본질적인 활성에 관계없이 또한 인산화됨을 관찰할 수 있다.
상기 데이터는 위치 718에서 기능적 키나아제 영역 및 인산화의 존재는 PKN 베타 키나아제 활성에 대해 예비필수적임을 나타낸다. 그러나, 키나아제로서 작용하는 △N 부분의 무능력으로 부터 알 수 있는 바와 같이 이들은 충분하지 않다. 상기 데이터는 상기 키나아제 결여된 KR588 돌연변이체 단백질이 위치 718에서 인산화를 유지하기 때문에, PKN 베타가 아미노산 718에서 자가인산화하지 않지만 다른 키나아제 분자에 의한 인산화를 필요로 한다는 것을 나타낸다.
실시예 10: 최대 길이 PKN 베타의 특징
최대 길이 분자에서 단백질 키나아제 N 베타의 기능적 아미노산 잔기의 돌연변이를 분석하기 위해, 도 10 및 11에 나타난 바와 같이 하기 실험을 실시하였다.
생체내에서 PKN 베타의 카나아제 활성을 측정하기 위해, 재조합 HA- 또는 Myc-표시된 PKN 베타 유도체는 HeLa 또는 COS-7 세포에서 일시적으로 발현되었다. 작은 키나아제 영역 유도체는 대조용으로 작용한다. 단백질 키나아제 N 베타의 재조합 부분을 함유하는 세포 추출물은 필적할 만한 발현 수준을 입증하기 위해 실시예 9에 개시된 바와 같이 항-단백질 키나아제 N 베타를 사용하여 및 생체내 단백질 키나아제 N 베타 유도체의 상이한 인산화 정도를 나타내기 위해 항-포스포 AGC 부위 항체(항-P*-AGC-키나아제로 불림)(도 10b)를 사용하여 유사하게 탐침검사하였다.
실시예 11: 최대 길이 단백질 키나아제 N 베타의 활성에 대한 인산화 필요조건 및 실험관내 키나아제 에세이에서 HTS 에세이에 대한 단백질 키나아제 N 베타의 비-방사성 적합성의 개발
PKN 유도된 분자는 도 10에 나타난 바와 같이 항-태그(tag) 항체의 사용에 의해 세포 추출물로부터 면역-침강시켰다. 상기 면역 침강물은 개시된 바와 같이(Klippel 등., 1996) 세척하고 두 부분으로 나누었다. 한 부분은 인산화 기질로서 5㎍ MBP(UBI), 완충 용액중의 4mM MgCl2 및 감마 32P-ATP를 사용하여 실온에서 10분간 배양시켰다. 또한, 비특이적으로 작용하는 키나아제에 대한 포스파타아제 억제제 및 억제제는 Klippel 등., 1996과 같이 부가하였다. 방사성 인산염의 통합은 16% SDS-PAGE(도 11b)에 의해 반응 산물을 분리시킨 후, 자가방사선촬영에 의해 검출하였다.
면역 침강물의 두번째 부분은 200μM rATP의 존재에서 인산화 기질로서 1㎍ GST-GSK3 융합 단백질(Cell Signaling Technology)을 사용하여 배양시켰다. 이어 반응 혼합물은 8-16% 경사도 SDS-PAGE 및 항-포스포 GSK3알파 항체를 사용한 웨스턴 블럿팅에 의해 분석하였다(Cell Signaling Technology)(도 11a). 여과기를 벗겨내고 각 면역 침강물내의 PKN베타 단백질의 필적할만한 양의 존재를 확인하기 위해 항-PKN 베타 항혈청으로 재탐침하였다(도 11c).
실험관내 인산화 반응의 특이성은 활성 단백질과 병행하여 키나아제 결여된 변이체(예를들면, ATP 결합부위내의 돌연변이를 함유하는)를 분석함으로써 조절하였다.
그렇지 않다면 최대 길이 야생형 단백질 키나아제 N 베타인, 단백질 키나아제 N 베타의 아미노산 718에서 TA 돌연변이 변이체의 경우에서 신호의 결여는 이 아미노산 잔기가 항체에 의해 검출된 인산와 위치임을 나타낸다(도 10b). 키나아제 결여된 변이체(도 10 및 도 9에 각각 나타난 바와 같은 KE 또는 KR)가 이 부위에서 인산화된다는 사실은 트레오닌 718이 자가 인산화에 대한 지질이 아님을 나타낸다. 오히려, 세포내의 다른 키나아제가 이 부위의 인산화에 관여할 것이며, PDK1이 가능한 후보이다.
또한, 실시예 9중 하나와 조합한 실험으로부터 위치 718에서 단백질 키나아제 N 베타의 인산화는 단백질 키나아제 N 베타 활성에 대한 예비-필수조건이다; 이 부위에서 실험된 모든 돌연변이는 인산화를 막으며 비활성 키나아제 분자를 초래한다. 본원에 개시된 발명의 모든 요지와 관련하여 사용될 수 있는 특히 바람직한 단백질 키나아제 N 베타는 본원에 개시된 키나아제 영역만을 포함하는 유도체를 비롯한 위치 718에서 인산화된 단백질 키나아제 N 베타 또는 그 유도체이다. 상기 데이터는 키나아제 결여된 KE588 돌연변이 단백질이 위치 718에서 인산화를 유지하기 때문에 최대 길이 PKN 베타가 아미노산 718에서 자가인산화하지 않지만, 대신에 다른 키나아제 분자에 의한 인산화를 필요로 한다는 것을 나타낸다.
도 11에 도시된 바와 같이, 단백질 키나아제 N 베타 활성에 대한 검사는 단백질 키나아제 N 베타 억제제에 대한 스크리닝을 높은 유출량 계로 허용하는 포멧에 적용할 수 있다.
첫번째 단계에서, 비-방사성 스크리닝 포멧의 적합성을 측정하였으며, 실시예 10과 관련하여 이미 논의된 바와 같이 다양한 단백질 키나아제 N 베타 유도체는 적합한 기질을 인산화하는데 사용하였다. 그러한 기질은 아가로스 또는 세파로스 비드와 같은 적절한 담체상에서 또는 플라스틱 표면상에서 일반적으로 고정되는 MBP 또는 GSK3이다. 본원의 경우 및 도 11a에 도시된 바와 같이, 상기 기질은 파라미오신에 융합된 GSK3-유도된 펩티드이다. 첫번째 줄은 상이한 단백질 키나아제 N 베타 유도체를 사용한 모든 다양한 에세이는 실제적으로 상기 유도체를 함유함을 나타낸다. 실시예 9에 한정된 바와 같이, 최대 길이 야생형 단백질 키나아제 N 베타 또는 키나아제 영역만이 상기 기질을 인산화하는데 적합하다. 본원 경우에서 상기 인산화된 기질은 항-포스포 GSK3 알파 항체(상술함)에 의해 검출하였다.
도 11a에 도시된 바와 같은 비 -방사성 방법이 충분히 감광임을 확인하기 위해, 인산화 기질로서 MBP를 사용한 면역침강물의 절반과 함께 병행하여 상기 방사성 방법을 실시하였다. 키나아제 활성의 효능은 나타난 바와 같이 [32P] 통합시 자가방사선촬영에 의한 생성된 인산화된 기질의 양으로부터 알 수 있다. 도 11a 및 11b로부터 알 수 있듯이, 키나아제 영역뿐만 아니라 최대 길이 야생형 단백질 키나아제 N 베타는 활성을 나타내는 반면, 최대 길이 KE 및 최대 길이 TA 돌연변이 단백질에 있어서는 비특이적 키나아제(도 11b)의 백그라운드 활성이 전혀 검출되지 않았다.
요약하면, 본원에 개시된 바와 같이 키나아제 영역뿐만 아니라 최대 길이 야생형 단백질 키나아제 N 베타의 용도는 HTS 포멧에서 스크리닝 방법의 고안에 대한 적절한 표적 및 수단이다. 따라서, 각각의 단계는 다음의 단계를 포함한다;
a) 박테리아 계에서의 발현에 의해 용이하게 달성될 수 없는 키나아제 활성을 나타내기 위해 단백질이 인산화되어야 한다는 것을 고려하여 곤충 세포 계(상이한 키나아제에 대한 예는 Klippel 등., 1997)와 같은 비-박테리아 발현 계에서의 발현에 의한 정제된 재조합 단백질 키나아제 N 베타 생성 단계;
b) GSK3-유도된 기질 또는 유사한 기질의 고정 및 rATP, MgCl2 의 존재에서의 정제된 단백질 키나아제 N 베타 및 완충액 용액중의 억제제와 함께 상기 기질을 배양시키는 단계;
c) 연속적인 세척 후 항-포스포-GSK3 항체와 같은 적절한 검출수단에 의해 기질의 인산화 검출 및 경우에 따라 그 다음에 Delfia 또는 Lance 에세이 계(Perkin Elmer)에서 발생키는 단계를 포함하며, 상기에서 인산화 부위는 Europium-라벨 표시된 항체에 의해 결합한다. 결합된 Europium의 양은 이어 시간-분해된 형광 에세이에 의해 정량화하였다.
실시예 12: 내인성 PKN-베타의 발현 수준 측정
이 실시예에서 실험 증거는 PKN-베타는 PI 3-키나아제 의존성 방식으로 발현된다는 것이다. 도 3에 나타내져 있는 PKN 베타 RNA의 PI 3-키나아제-의존성 발현은 여기에서 단백질 수준을 추가로 확인하였다.
PC-3 세포는 실시예 1에 개시된 바와 같이 배양하였다. 상기 PC-3 세포는 American Type Culture Collection(ATCC)로부터 수득한 PTEN-/-HeLa 세포이며 Sternberger 등(2002)에 개시된 바와 같이 성장시켰다. 형질감염은 Fugene 6(Roche, Nutley, NJ)를 사용하여 제조자 지시에 따라 10-cm 플레이트에서 실시하였다. 배양된 세포는 트립신처리하고 배지에 의한 트립신 효과를 중단한 후 채취하였다.
두가지 세포 유형 즉, PC-3 세포 및 HeLa 세포는 10μM LY294002 또는 DMSO로 지시된 시간동안 처리하고, 상기에서 DMSO는 LY294002에 대한 용매로서 사용함으로써 음성 대조용으로 사용하였다.
생성된 추출물은 SDS-PAGE에 의해 분획화하였으며 그 다음에 웨스턴 블럿팅에 의해 분석하였다. 대조용으로 작용하는 p110, 내인성 PKN-베타 및 인산화된 Akt와 같은 지시된 단백질의 수준은 각각의 항체를 사용하여 검출하였다.
인산화된 Akt(P*-Akt)는 LY294002-매개 치료의 효능에 대한 대조용으로 작용한다.
상기 결과는 도 12에 도시되어 있다.
PC-3 세포에서 PI 3-키나아제의 억제는 24시간 후 내인성 PKN 베타 발현의 시각적 감소를 초래하며, 단백질 수준은 치료 48시간 후 더 감소하였다. 높은 양의 PKN 베타 단백질을 발현하는 HeLa 세포에서, 이 효과는 덜 극적이지만, 감소된 양은 LY294002로 치료한지 48시간 후 검출될 수 있다.
이로부터, PI3-키나아제는 PKN 베타의 발현을 조절한다고 결론을 내릴 수 있다.
실시예 13: PKN-베타 활성은 PI3-키나아제를 필요로 함
재조합 야생형 PKN-베타 또는 PKN-베타의 유도체(도 10-11에 도시되어 있음)는 HeLa 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 상기 유도체는 실시예 10에 개시된 바와 같은 PKN-베타 유도체 TA 및 유도체 KE이다. 상기 PKN-베타는 항-Myc 항체를 사용한 PKN-베타 또는 그 유도체의 침전을 허용하는 Myc-태그에 의해 각각의 경우에 변형시켰다.
PKN-베타의 활성을 측정하기 위해, 면역 침전물을 사용한 실험관내 키나아제 활성을 상술한 바와 같이 실시하였다. 절반의 침전물은 실험관내 키나아제 반응처리하였으며, 나머지 절반은 항-포스포-PRK 항체를 사용한 웨스턴 블럿에 의해 분석하였다. 여과기는 빼내고 항-PKN-베타 항혈청을 사용하여 재탐침 검사하였다. 포스포-p70 S6 키나아제 수준은 초기에 수득한 세포 용해물의 동분량으로부터 분석하여 치료한지 단 3시간 후에 LY294002 치료의 효능을 확인하였다. 상기 항-포스포 p70 항체는 Cell 신호로부터 수득하였다.
도 13에서 알 수 있는 바와 같이, LY294002 치료는 MBP의 인산화에 의해 측정된 PKN베타의 키나아제 활성에 대한 강한 억제를 초래한다. 이 효과는 치료한지 단 3시간 후에 육안으로 볼 수 있으며, 24시간에서 PKN베타 활성은 거의 완전하게 억제되었다. 위치 718에서 PKN베타의 인산화는 LY294002에 의한 PI3-키나아제의 억제 후에 또한 손상되었지만, 이 효과는 키나아제 활성에 대한 효과보다 적게 나타난다.
PKN-베타의 TA 유도체는 상술한 바와 같이 비활성 대조용 및 위치 718에서 포스포-트레오닌(P*-PK)에 대한 항-포스포 PRK 항체의 특이성에 대한 대조용으로 작용한다.
PKN-베타 유도체 KE는 상술한 바와 같이 키나아제-결여된 대조용으로 작용한다. 그 인산화 상태는 LY294002 치료에 의해 어느 정도 영향을 받는 것으로 나타났다. 이는 위치 718에서 PKN베타의 인산화에 관여하는 키나아제가 PI 3-키나아제-의존성 형태에서도 그러하다는 것을 나타낸다.
더 중요한 것는, 이 실험은 PKN베타가 그 발현 수준을 통해 PI 3-키나아제에 의해 조절될 뿐만 아니라 그 활성화 수준에서 또한 조절됨을 나타낸다. 이러한 발견은 PKN베타가 치료적 중재에 대한 과잉활성 PI 3-키나아제 경로를 방해하기 위한 완벽한 하류 표적임을 나타내는 것으로, 그 이유는 PKN베타가 댜양한 수준에서 PKN베타에 의해 조절되는 PI 3-키나아제에 의존하기 때문이다. 이는 단백질 PKN-베타 및 단백질 PKN-베타에 대한 핵산코딩에 명확한 효과를 나타내는 화합물을 생성하게 한다. 더욱더 중요한 것은, 전사 수준 즉, 발현된 단백질의 수준에서 보다 오히려 번역에서의 이러한 유형의 PKN-베타 활성 조절은 더욱더 전망이 있으며 전사 수준에서의 영향보다 더 오래 지속하는 것으로 보인다.
본원에 따른 추가의 스크리닝 방법은 이러한 특별한 통찰력을 기본으로 하며 바람직하게는 리드-아웃(read-out)으로서 실험관내 키나아제 에세이에서 방사성 또는 비방사성으로 사용한다.
실시예 14: PKN-베타의 편재화 신호
이 실험에서 다양한 PKN-베타 유도체의 편재화는 야생형 PKN-베타의 국소화와 비교하였다. 도 14에 나타난 바와 같이, PKN-베타 및 PKN-베타 야생형(도 14a), PKN-베타 유도체 TA(도 14b), PKN-베타 유도체 KE(도 14c) 및 PKN-베타 델타N(도 14d)와 같은 그 유토체의 세포내 분포는 공초점 형광 현미경에 의해 검사하였다. PKN-베타의 HA-표시된 재조합 유도체는 HeLa 세포에서 48시간동안 일시적으로 발현시켰다. 고정 및 삼투 후, 재조합 단백질의 발현은 항-HA 항체 후 FITC-결합된 항-마우스 항체를 사용하여 검출하였다. 상기 세포는 세포골격 액틴을 로다민-팔로이딘으로 표시함으로써 대비염색제로 착색하였다.
상기 결과는 도 14a 내지 14d에 도시되어 있으며, 상기에서 각 왼쪽의 이중가닥 그림은 FITC-특이적 자극 시 세포의 그림에 관한 것이며, 오른쪽 그림은 로다민-팔로이딘에 대해 특이적인 파장을 사용한 자극 시 동일한 세포를 타나낸다. 상기 FITC-착색은 각각의 재조합 단백질에 의해 형질감염된 세포를 나타낸다. 로다민-팔로이딘 착색은 형질감염 및 비형질감염된 세포를 나타낸다.
도 14a로부터 알 수 있는 바와 같이, 야생형 PKN-베타는 세포의 핵에 압도적으로 편재화된다. PKN-베타 TA 및 KE 돌연변이체의 인산화 부위 돌연변이체는 양쪽 모두 키나아제가 결여되었으며 야생형 PKN-베타와 비교할 때 핵내에 더 이상 집중되지 않고 오히려 세포 전체에 걸쳐 퍼져있다. 마지막으로, 도 14d에 도시된 바와 같이, N-말단 세번째 분자가 없으며 또한 키나아제-결여된(도 9 참조) PKN-베타 유도체 △N은 본질적으로 핵으로부터 제외되었다.
명세서, 서열 리스트, 청구항 및/또는 도면에 개시된 본 발명의 특징은 다양한 형태의 본 발명의 실현하기 위한 물질과 별도로 및 조합될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> atugen AG <120> Further use of protein kinase N beta <130> A 19015 PCT <160> 12 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 889 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(889) <223> protein kinase N beta (PKN beta) <400> 1 Met Glu Glu Gly Ala Pro Arg Gln Pro Gly Pro Ser Gln Trp Pro Pro 1 5 10 15 Glu Asp Glu Lys Glu Val Ile Arg Arg Ala Ile Gln Lys Glu Leu Lys 20 25 30 Ile Lys Glu Gly Val Glu Asn Leu Arg Arg Val Ala Thr Asp Arg Arg 35 40 45 His Leu Gly His Val Gln Gln Leu Leu Arg Ser Ser Asn Arg Arg Leu 50 55 60 Glu Gln Leu His Gly Glu Leu Arg Glu Leu His Ala Arg Ile Leu Leu 65 70 75 80 Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Ala Glu Pro Val Ala Ser Gly Pro Arg 85 90 95 Pro Trp Ala Glu Gln Leu Arg Ala Arg His Leu Glu Ala Leu Arg Arg 100 105 110 Gln Leu His Val Glu Leu Lys Val Lys Gln Gly Ala Glu Asn Met Thr 115 120 125 His Thr Cys Ala Ser Gly Thr Pro Lys Glu Arg Lys Leu Leu Ala Ala 130 135 140 Ala Gln Gln Met Leu Arg Asp Ser Gln Leu Lys Val Ala Leu Leu Arg 145 150 155 160 Met Lys Ile Ser Ser Leu Glu Ala Ser Gly Ser Pro Glu Pro Gly Pro 165 170 175 Glu Leu Leu Ala Glu Glu Leu Gln His Arg Leu His Val Glu Ala Ala 180 185 190 Val Ala Glu Gly Ala Lys Asn Val Val Lys Leu Leu Ser Ser Arg Arg 195 200 205 Thr Gln Asp Arg Lys Ala Leu Ala Glu Ala Gln Ala Gln Leu Gln Glu 210 215 220 Ser Ser Gln Lys Leu Asp Leu Leu Arg Leu Ala Leu Glu Gln Leu Leu 225 230 235 240 Glu Gln Leu Pro Pro Ala His Pro Leu Arg Ser Arg Val Thr Arg Glu 245 250 255 Leu Arg Ala Ala Val Pro Gly Tyr Pro Gln Pro Ser Gly Thr Pro Val 260 265 270 Lys Pro Thr Ala Leu Thr Gly Thr Leu Gln Val Arg Leu Leu Gly Cys 275 280 285 Glu Gln Leu Leu Thr Ala Val Pro Gly Arg Ser Pro Ala Ala Ala Leu 290 295 300 Ala Ser Ser Pro Ser Glu Gly Trp Leu Arg Thr Lys Ala Lys His Gln 305 310 315 320 Arg Gly Arg Gly Glu Leu Ala Ser Glu Val Leu Ala Val Leu Lys Val 325 330 335 Asp Asn Arg Val Val Gly Gln Thr Gly Trp Gly Gln Val Ala Glu Gln 340 345 350 Ser Trp Asp Gln Thr Phe Val Ile Pro Leu Glu Arg Ala Arg Glu Leu 355 360 365 Glu Ile Gly Val His Trp Arg Asp Trp Arg Gln Leu Cys Gly Val Ala 370 375 380 Phe Leu Arg Leu Glu Asp Phe Leu Asp Asn Ala Cys His Gln Leu Ser 385 390 395 400 Leu Ser Leu Val Pro Gln Gly Leu Leu Phe Ala Gln Val Thr Phe Cys 405 410 415 Asp Pro Val Ile Glu Arg Arg Pro Arg Leu Gln Arg Gln Glu Arg Ile 420 425 430 Phe Ser Lys Arg Arg Gly Gln Asp Phe Leu Arg Arg Ser Gln Met Asn 435 440 445 Leu Gly Met Ala Ala Trp Gly Arg Leu Val Met Asn Leu Leu Pro Pro 450 455 460 Cys Ser Ser Pro Ser Thr Ile Ser Pro Pro Lys Gly Cys Pro Arg Thr 465 470 475 480 Pro Thr Thr Leu Arg Glu Ala Ser Asp Pro Ala Thr Pro Ser Asn Phe 485 490 495 Leu Pro Lys Lys Thr Pro Leu Gly Glu Glu Met Thr Pro Pro Pro Lys 500 505 510 Pro Pro Arg Leu Tyr Leu Pro Gln Glu Pro Thr Ser Glu Glu Thr Pro 515 520 525 Arg Thr Lys Arg Pro His Met Glu Pro Arg Thr Arg Arg Gly Pro Ser 530 535 540 Pro Pro Ala Ser Pro Thr Arg Lys Pro Pro Arg Leu Gln Asp Phe Arg 545 550 555 560 Cys Leu Ala Val Leu Gly Arg Gly His Phe Gly Lys Val Leu Leu Val 565 570 575 Gln Phe Lys Gly Thr Gly Lys Tyr Tyr Ala Ile Lys Ala Leu Lys Lys 580 585 590 Gln Glu Val Leu Ser Arg Asp Glu Ile Glu Ser Leu Tyr Cys Glu Lys 595 600 605 Arg Ile Leu Glu Ala Val Gly Cys Thr Gly His Pro Phe Leu Leu Ser 610 615 620 Leu Leu Val Cys Phe Gln Thr Ser Ser His Ala Arg Phe Val Thr Glu 625 630 635 640 Phe Val Pro Gly Gly Asp Leu Met Met Gln Ile His Glu Asp Val Phe 645 650 655 Pro Glu Pro Gln Ala Arg Phe Tyr Val Ala Cys Val Val Leu Gly Leu 660 665 670 Gln Phe Leu His Glu Lys Lys Ile Ile Tyr Arg Asp Leu Lys Leu Asp 675 680 685 Asn Leu Leu Leu Asp Ala Gln Gly Phe Leu Lys Ile Ala Asp Phe Gly 690 695 700 Leu Cys Lys Glu Gly Ile Gly Phe Gly Asp Arg Thr Ser Thr Phe Cys 705 710 715 720 Gly Thr Pro Glu Phe Leu Ala Pro Glu Val Leu Thr Gln Glu Ala Tyr 725 730 735 Thr Gln Ala Val Asp Trp Trp Ala Leu Gly Val Leu Leu Tyr Glu Met 740 745 750 Leu Val Gly Glu Cys Pro Phe Pro Gly Asp Thr Glu Glu Glu Val Phe 755 760 765 Asp Cys Ile Val Asn Met Asp Ala Pro Tyr Pro Gly Phe Leu Ser Val 770 775 780 Gln Gly Leu Glu Phe Ile Gln Lys Leu Leu Gln Lys Cys Pro Glu Lys 785 790 795 800 Arg Leu Gly Ala Gly Glu Gln Asp Ala Glu Glu Ile Lys Val Gln Pro 805 810 815 Phe Phe Arg Thr Thr Asn Trp Gln Ala Leu Leu Ala Arg Thr Ile Gln 820 825 830 Pro Pro Phe Val Pro Thr Leu Cys Gly Pro Ala Asp Leu Arg Tyr Phe 835 840 845 Glu Gly Glu Phe Thr Gly Leu Pro Pro Ala Leu Thr Pro Pro Ala Pro 850 855 860 His Ser Leu Leu Thr Ala Arg Gln Gln Ala Ala Phe Arg Asp Phe Asp 865 870 875 880 Phe Val Ser Glu Arg Phe Leu Glu Pro 885 <210> 2 <211> 2670 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mRNA <222> (1)..(2670) <223> mRNA / cDNA of PKN beta <400> 2 atggaggagg gggcgccgcg gcagcctggg ccgagccagt ggcccccaga ggatgagaag 60 gaggtgatcc gccgggccat ccagaaagag ctgaagatca aggagggggt ggagaacctg 120 cggcgcgtgg ccacagaccg ccgccacttg ggccatgtgc agcagctgct gcggtcctcc 180 aaccgccgcc tggagcagct gcatggcgag ctgcgggagc tgcacgcccg aatcctgctg 240 cccggccctg ggcctggccc agctgagcct gtggcctcag gaccccggcc gtgggcagag 300 cagctcaggg ctcggcacct agaggctctc cggaggcagc tgcatgtgga gctgaaggtg 360 aaacaggggg ctgagaacat gacccacacg tgcgccagtg gcacccccaa ggagaggaag 420 ctccttgcag ctgcccagca gatgctgcgg gacagccagc tgaaggtggc cctgctgcgg 480 atgaagatca gcagcctgga ggccagtggg tccccggagc cagggcctga gctactggcg 540 gaggagctac agcatcgact gcacgttgag gcagcggtgg ctgagggcgc caagaacgtg 600 gtgaaactgc ttagtagccg gagaacacag gaccgcaagg cactggctga ggcccaggcc 660 cagctacagg agtcctctca gaaactggac ctcctgcgcc tggccttgga gcagctgctg 720 gagcaactgc ctcctgccca ccctttgcgc agcagagtga cccgagagtt gcgggctgcg 780 gtgcctggat acccccagcc ttcagggaca cctgtgaagc ccaccgccct aacagggaca 840 ctgcaggtcc gcctcctggg ctgtgaacag ttgctgacag ccgtgcctgg gcgctcccca 900 gcggccgcac tggccagcag cccctccgag ggctggcttc ggaccaaggc caagcaccag 960 cgtggccgag gcgagcttgc cagtgaggtg ctggctgtgc taaaggtgga caaccgtgtt 1020 gtggggcaga cgggctgggg gcaggtggcc gaacagtcct gggaccagac ctttgtcatc 1080 ccactggagc gagcccgtga gctggagatt ggggtacact ggcgggactg gcggcagcta 1140 tgtggcgtgg ccttcctgag acttgaagac ttcctggaca atgcctgtca ccaactgtcc 1200 ctcagcctgg taccgcaggg actgcttttt gcccaggtga ccttctgcga tcctgtcatt 1260 gagaggcggc cccggctgca gaggcaggaa cgcatcttct ctaaacgcag aggccaggac 1320 ttcctgaggc gttcgcagat gaacctcggc atggcggcct gggggcgcct cgtcatgaac 1380 ctgctgcccc cctgcagctc cccgagcaca atcagccccc ctaaaggatg ccctcggacc 1440 ccaacaacac tgcgagaggc ctctgaccct gccactccca gtaatttcct gcccaagaag 1500 acccccttgg gtgaagagat gacaccccca cccaagcccc cacgcctcta cctcccccag 1560 gagccaacat ccgaggagac tccgcgcacc aaacgtcccc atatggagcc taggactcga 1620 cgtgggccat ctccaccagc ctcccccacc aggaaacccc ctcggcttca ggacttccgc 1680 tgcttagctg tgctgggccg gggacacttt gggaaggtcc tcctggtcca gttcaagggg 1740 acagggaaat actacgccat caaagcactg aagaagcagg aggtgctcag ccgggacgag 1800 atagagagcc tgtactgcga gaagcggatc ctggaggctg tgggctgcac agggcaccct 1860 ttcctgctct ccctccttgt ctgcttccag acctccagcc atgcccgctt tgtgactgag 1920 tttgtgcctg gtggtgacct catgatgcag atccacgagg atgtcttccc cgagccccag 1980 gcccgcttct acgtggcttg tgttgtcctg gggctgcagt tcttacacga gaagaagatc 2040 atttacaggg acctgaagtt ggataacctt ctgctggatg cccagggatt cctgaagatc 2100 gcagactttg gactctgcaa ggaagggatc ggcttcgggg accggactag caccttctgt 2160 ggcaccccgg agttcctggc tcccgaggtg ctgacccagg aggcatacac acaggccgtc 2220 gactggtggg cgctgggtgt gctgctctac gagatgctgg tgggtgagtg cccgttccca 2280 ggggacacag aggaagaggt gtttgactgc atcgtcaaca tggacgcccc ctaccccggc 2340 tttctgtcgg tgcaagggct tgagttcatt cagaagctcc tccagaagtg cccggagaag 2400 cgcctcgggg caggtgagca ggatgccgag gagatcaagg tccagccatt cttcaggacc 2460 accaactggc aagccctgct cgcccgcacc atccagcccc ccttcgtgcc taccctgtgt 2520 ggccctgcgg acctgcgcta ctttgagggc gagttcacag ggctgccgcc tgccctgacc 2580 ccacctgcac cccacagcct cctcactgcc cgccaacagg ccgccttccg ggacttcgac 2640 tttgtgtcag agcgattcct ggaaccctga 2670 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (7)..(15) <223> DNA linked through phosphorothioate linkages <220> <221> misc_feature <222> (16)..(21) <223> RNA <400> 3 ggagguccag tttctgagag g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (7)..(15) <223> DNA linked through phosphorothioate linkages <220> <221> misc_feature <222> (16)..(21) <223> RNA <400> 4 uguuucacct tcagcuccac a 21 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (8)..(16) <223> DNA linked through phosphorothioate linkages <220> <221> misc_feature <222> (17)..(23) <223> RNA <400> 5 aggacaacac aagccacgua gaa 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (8)..(16) <223> DNA linked through phosphorothioate linkages <220> <221> misc_feature <222> (17)..(23) <223> RNA <400> 6 gcucugacac aaagtcgaag ucc 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (8)..(16) <223> DNA linked through phosphorothioate linkages <220> <221> misc_feature <222> (17)..(23) <223> RNA <400> 7 gcagucaaac acctctuccu cug 23 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (7)..(15) <223> DNA linked through phosphorothioate linkages <220> <221> misc_feature <222> (16)..(21) <223> DNA linked through phosphorothioate linkages <400> 8 caacacggtt gtccaccuuu a 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (7)..(15) <223> DNA linked through phosphorothioate linkages <220> <221> misc_feature <222> (16)..(21) <223> RNA <400> 9 ucagugcttt gatggcguag u 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (7)..(15) <223> DNA linked through phosphorothioate linkages <220> <221> misc_feature <222> (16)..(21) <223> RNA <400> 10 cuucucgcag tacaggcucu c 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (7)..(15) <223> DNA linked through phosphorothioate linkages <220> <221> misc_feature <222> (16)..(21) <223> RNA <400> 11 caagacgctt gtgcacguuu a 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (7)..(15) <223> DNA linked through phosphorothioate linkages <220> <221> misc_feature <222> (16)..(21) <223> RNA <400> 12 ucagagctta gttggcguug u 21

Claims (30)

  1. PI 3-키나아제 경로의 하류 표적, 바람직하게는 PI 3-키나아제 경로의 하류 약물 표적으로서 단백질 키나아제 N 베타 또는 단편 또는 그 유도체의 용도.
  2. 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 제조용 및/또는 질환의 진단을 위한 진단 물질의 제조용 단백질 키나아제 N 베타 또는 단편 또는 그 유도체의 용도에 있어서, 상기 질환은 암, 전이성 암 및 PI 3-키나아제 경로를 포함하는 임의의 병리적 상태로 구성된 그룹으로부터 선택된 질환인 용도.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 단백질 키나아제 N 베타는 서열번호 1 또는 데이터뱅크 진입 PID g7019489 또는 데이터뱅크 진입 gi 7019489에 따른 아미노산 또는 일부분 또는 그 유도체를 갖는 것을 특징으로 하는 용도.
  4. 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 및/또는 질환의 진단용 진단 물질의 제조를 위한 단백질 키나아제 N 베타 또는 단편 또는 그 유도체의 용도에 있어서, 상기 질환은 암, 전이성 암 및 PI 3-키나아제 경로를 포함하는 임의의 병리적 상태로 구성된 그룹으로부터 선택된 질환인 용도.
  5. 제 4항에 있어서, 단백질 키나아제 N 베타는 서열번호 1 또는 데이터뱅크 진입 PID g7019489 또는 데이터뱅크 진입 gi 7019489에 따른 아미노산 또는 일부분 또는 그 유도체를 갖는 것을 특징으로 하는 용도.
  6. 제 4항 또는 제 5항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 2 또는 데이터뱅크 진입 gi 7019488 또는 NM_01335, 바람직하게는 NM_01335.1.에 따른 핵산을 특징으로 하는 용도.
  7. 제 1항, 제 4항 또는 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 키나아제 N 베타는 서열번호 2 또는 데이터뱅크 진입 gi 7019488 또는 NM_01335, 바람직하게는 NM_01335.1.에 따른 핵산에 의해 암호화되는 용도.
  8. 제 4항에 있어서, 상기 핵산 서열은 유전자 코드의 퇴화가 없다면 제 4항의 핵산과 교잡반응하는 용도.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 서열은 엄격한 조건하에서 서열번호 2 또는 데이터뱅크 진입 gi 7019488 또는 NM_01335, 바람직하게는 NM_01335.1.에 따른 핵산서열 또는 그 일부분과 교잡반응하는 핵산서열인 용도.
  10. 제 2항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상지 질환은 세포가 PTEN 활성이 없는 상기 질환에 관련되거나 증가된 공격성 행동을 보이거나 또는 말기 단계 종양의 세포인 것을 특징으로 하는 용도.
  11. 제 2항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환은 말기 단계 종양인 용도.
  12. 질환의 치료 및/또는 예방용 및/또는 질환의 진단을 위한 진단 물질의 제조용 물질의 스크리닝 방법에 있어서, 상기 질환은 암, 전이성 암 및 하기 단계로 구성된 PI 3-키나아제 경로를 포함하는 임의의 병리적 상태로 구성된 그룹으로부터 선택된 질환인 방법:
    a) 후보 화합물을 제공하는 단계;
    b) 단백질 키나아제 N 베타에 대한 발현 시스템 및/또는 단백질 키나아제 N 베타의 활성 검출 시스템을 제공하는 단계;
    c) 상기 후보 화합물을 단백질 키나아제 N 베타에 대한 발현 시스템 및/또는 단백질 키나아제 N 베타의 활성 검출 시스템과 접촉시키는 단계;
    d) 단백질 키나아제 N 베타의 발현 및/또는 활성이 후보 화합물의 영향하에서 변하는지 여부를 측정하는 단계.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 후보 화합물은 화합물의 라이브러리에 함유된 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 12항 또는 제 13항에 있어서, 상기 후보 화합물은 펩티드, 단백질, 항체, 안티칼린, 기능적 핵산, 천연 화합물 및 소 분자로 구성되는 종류의 화합물 그룹으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 기능적인 핵산은 아프타머, 아프타짐, 리보자임, 스피에겔머, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 siRNA로 구성되는 그룹으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 질환의 치료 및/또는 예방하기 위한 의약 개발 및 제조용 및/또는 질환의 진단을 위한 진단 물질의 제조용 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체 및/또는 표적분자로서 단백질 키나아제 N 베타에 대한 핵산 또는 일부분 또는 그 유도체 코딩의 용도에 있어서, 상기 질환은 암, 전이성 암 및 하기 PI 3-키나아제 경로를 포함하는 임의의 병리적 상태로 구성된 그룹으로부터 선택된 질환인 용도.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 의약 및/또는 진단 물질은 항체, 펩티드, 안티칼린, 소분자, 안티센스 분자, 아프타머, 스피에겔머 및 RNAi 분자로 구성된 그룹으로부터 선택된 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 물질은 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체와 상호작용하는 것을 특징으로 하는 용도.
  19. 제 17항에 있어서, 상기 물질은 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체에 대한 핵산 코딩, 특히 단백질 키나아제 N 베타에 대한 mRNA, 게놈 핵산 또는 cDNA와 상호작용하는 것을 특징으로 하는 용도.
  20. 질환의 치료 및/또는 예방하기 위한 의약 개발 및 제조용 및/또는 질환의 진단을 위한 진단 물질의 제조용 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체와 상호작용하는 폴리펩티드의 용도에 있어서, 상기 질환은 암, 전이성 암 및 하기 PI 3-키나아제 경로를 포함하는 임의의 병리적 상태로 구성된 그룹으로부터 선택된 질환인 용도.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체에 대한 항체 및 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체와 결합하는 폴리펩티드를 포함하는 그룹으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 용도.
  22. 질환의 치료 및/또는 예방하기 위한 의약 개발 및 제조용 및/또는 질환의 진단을 위한 진단 물질의 제조용 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체와 상호작용하는 핵산의 용도에 있어서, 상기 질환은 암, 전이성 암 및 하기 PI 3-키나아제 경로를 포함하는 임의의 병리적 상태로 구성된 그룹으로부터 선택된 질환인 용도.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 핵산은 아프타머 및 스피에겔머를 포함하는 그룹으로부터 선택된 핵산인 것을 특징으로 하는 용도.
  24. 질환의 치료 및/또는 예방하기 위한 의약 개발 및 제조용 및/또는 질환의 진단을 위한 진단 물질의 제조용 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체에 대한 핵산 코딩과 상호작용하는 핵산의 용도에 있어서, 상기 질환은 암, 전이성 암 및 하기 PI 3-키나아제 경로를 포함하는 임의의 병리적 상태로 구성된 그룹으로부터 선택된 질환인 용도.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 상호작용하는 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임 및/또는 siRNA인 것을 특징으로 하는 용도.
  26. 제 24항 또는 제 25항에 있어서, 상기 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체에 대한 핵산 코딩은 cDNA, mRNA 또는 hnRNA인 것을 특징으로 하는 용도.
  27. 제 16항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 키나아제 N 베타 및/또는 단백질 키나아제 N 베타에 대한 핵산코딩은 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 개시된 것인 용도.
  28. 제 12항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 키나아제 N 베타 및/또는 단백질 키나아제 N 베타에 대한 핵산코딩은 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 개시된 것인 방법.
  29. 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체, 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체 또는 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체에 대한 핵산 코딩과 상호작용하는 소 분자, 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체에 대해 특이적인 항체, 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체와 상호작용하는 폴리펩티드, 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체에 대한 핵산 코딩, 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체와 상호작용하는 핵산, 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체에 대한 핵산 코딩과 상호작용하는 핵산으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 물질 및 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 있어서, 상기 질환은 암, 전이성 암 및 PI 3-키나아제 경로를 포함하는 임의의 병리적 상태로 구성된 그룹으로부터 선택된 질환인 조성물.
  30. 암, 전이성 암 및 PI 3-키나아제 경로를 포함하는 임의의 병리적 상태로 구성된 그룹으로부터 선택된 질환 또는 상태, 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체, 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체에 대한 특이적인 항체, 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체와 상호작용하는 폴리펩티드, 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체 또는 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체에 대한 핵산 코딩과 상호작용하는 폴리펩티드, 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체와 상호작용하는 핵산, 단백질 키나아제 N 베타 또는 일부분 또는 그 유도체에 대한 핵산 코딩과 상호작용하는 핵산으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 물질 및 경우에 따라 하나 이상의 다른 화합물을 포함하는 키트.
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