KR100893720B1

KR100893720B1 - 단삼 추출물을 유효성분으로 하는 Ｃ-ｋｉｔ 수용체 길항제

Info

Publication number: KR100893720B1
Application number: KR1020060129483A
Authority: KR
Inventors: 이정오; 이태룡
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2006-12-18
Filing date: 2006-12-18
Publication date: 2009-04-17
Also published as: KR20080056501A

Abstract

본 발명은 C-kit 수용체 길항제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 유효성분으로서 단삼 추출물을 함유하여 C-kit 수용체를 저해함으로써 멜라노사이트가 증식하는 것을 효과적으로 억제하고 C-kit 수용체와 관련된 각종 질병의 치료에도 이용할 수 있는 C-kit 수용체 길항제에 관한 것이다.

단삼 추출물, C-kit 수용체, 길항제, 멜라닌, 미백, 화장품, 항암제

Description

단삼 추출물을 유효성분으로 하는 Ｃ-ｋｉｔ 수용체 길항제{C-kit receptor antagonist containing the extract of Salvia miltiorrhiza}

도 1은 기니아 피그에서 C-kit 항체(ACK2)를 이용하여 C-kit를 저해함으로써 미백효과를 얻을 수 있을 보여주는 사진이다.

도 2는 자외선 조사 후 기니아 피그의 C-kit 항체(ACK2)를 피하로 투여하여 밝아진 정도를 측정한 그래프이다.

도 3은 C-kit 수용체와 그 리간드인 줄기 세포 인자(stem cell factor, SCF)의 상호작용을 관찰한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 4는 C-kit 수용체 길항제 스크리닝 시스템을 사용하여 단삼추출물의 C-kit 수용체 길항 효과를 보여주는 그래프이다.

도 5는 C-kit와 SCF의 상호작용을 억제하는 효과가 우수한 단삼 추출물의 멜라노사이트 증식 저해 효과를 관찰한 그래프이다.

도 6은 단삼 추출물의 멜라닌 생성 저해효과를 측정한 그래프이다.

본 발명은 C-kit 수용체 길항제(C-kit receptor antagonist)에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 유효성분으로서 단삼 추출물을 함유하여 C-kit 수용체를 저해함으로써 멜라노사이트가 증식하는 것을 효과적으로 억제하고 C-kit 수용체와 관련된 각종 질병의 치료에도 이용할 수 있는 C-kit 수용체 길항제에 관한 것이다.

사람의 피부색을 결정하는 멜라닌(melanin)은 멜라노사이트(melanocyte)의 멜라노좀(melanosome)이라는 소기관에서 만들어져 주위의 케라티노사이트(keratinocyte)라는 표피 세포로 이동한다. 멜라닌은 타이로신을 기질로 하여 타이로신을 산화시키는 타이로시나제에 의해 산화과정을 거치면서 만들어진다. 이와 같은 반응에는 TRP1과 TRP2도 관여하는 것으로 알려져 있는데 멜라닌이 합성되는 속도를 결정하는 단계는 바로 타이로시나제에 의해 타이로신에 하이드록시기가 붙는 단계이다. 따라서, 타이로신의 활성을 저해하면 멜라닌의 생성속도를 줄여서 피부를 밝게 할 수 있다고 알려져 있다. 그러나 피부색을 결정하는 것은 말처럼 그리 단순하지만은 않다. 멜라노사이트의 증식 및 분화, 타이로시나제의 정확한 3차구조 형성 및 당과의 결합, 타이로시나제의 ER에서 골지(Golgi)로의 이동, 멜라노좀의 멜라노사이트 내에서의 이동 및 케라티노사이트로의 전달, 합성되는 멜라닌의 종류, 피부의 산화-환원상태 및 미백에 관여하는 사이토카인과 호르몬의 생성 조절 등등 다양한 인자에 의해 영향을 받는다. 위와 같이 피부색이 결정되는 것은 실로 다양한 요인의 복합작용에 의해서 결정된다.

C-kit는 멜라노사이트의 세포 표면에 존재하는 수용체 중 하나로서 멜라노사 이트의 분화 및 증식에 관여하고 있다. C-kit 수용체의 리간드는 줄기세포 인자(stem cell factor, 이하 'SCF'라 한다)이며 리간드가 수용체에 작용하면 멜라노사이트가 증식하게 된다. 멜라노사이트의 수가 많아지면 그만큼 멜라닌을 생성하는 장소가 많아짐으로써 피부를 검게 만드는 멜라닌이 많이 만들어진다. 즉, 멜라노사이트가 많아지면 위에 언급한 멜라닌 생합성에 필요한 모든 요소들이 많아지기 때문에 자외선과 같은 자극에 의해서 보다 쉽게 피부가 검게 된다. C-kit는 멜라노사이트의 증식에만 영향을 주는 것이 아니고 C-kit가 줄기 세포 인자에 의해 활성화되면 단백질 타이로신 키나아제가 활성화되어 최종적으로 MITF가 인산화되고 MITF의 전사능력이 좋아져 멜라닌 생성에 관련된 단백질들의 발현이 증가하게 된다. 따라서, C-kit를 저해하는 것은 멜라노사이트의 수를 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라 멜라닌의 생성속도 또한 줄일 수 있어서 미백의 좋은 타겟이 된다.

또한 C-kit는 급성 골수성 백혈병(Acute myelogenous leukemia, AML), 폐의 선암종(adenocarcinomas of the lung) 및 위장관 간질 종양(Gastrointestinal stromal tumors, GISTs)에서 발현되고 있음이 밝혀졌다. 또한, C-kit를 저해하는 약물인 Gleevec은 백혈병 치료에 특효가 있음이 이미 알려졌다.

지금까지는 C-kit 저해 및 이를 통한 멜라닌 생성 억제를 위한 방법으로서 여러 가지 C-kit 단백질 타이로신 키나아제 억제제를 개발하는 방향으로만 연구가 진행되었으며, 아직까지 C-kit 수용체 길항제와 관련하여 연구된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 멜라닌을 생성하는 세포인 멜라노사이트의 증식 및 분화를 억제하여 멜라노사이트의 수를 효과적으로 줄일 수 있고 또한 백혈병과 같은 암의 치료에 효과적으로 이용할 수 있는 C-kit 수용체에 대한 길항제를 개발하기 위하여 연구한 결과, 천연물인 단삼 추출물이 C-kit 수용체를 저해함을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 단삼 추출물을 유효 성분으로 포함하는 C-kit 수용체 길항제를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 천연물인 단삼 추출물을 유효 성분으로 포함하는 C-kit 수용체 길항제를 제공한다.

본 발명에 의한 조성물은 C-kit가 관여하는 인체의 기작을 조절하는 조성물로 제형화될 수 있으며, 예를 들면, 미백용 화장료 조성물 및 암 또는 종양 치료제 조성물 등을 포함하나 이에만 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 의한 C-kit 수용체 길항제를 미백용 화장료 조성물로 제형화하는 경우, 단삼 추출물이　１ｐｐｍ의　매우　작은　농도에서도　뛰어난　효과를　보이는　제형화　가능성 등을　고려하여　그　첨가량은 조성물 총 중량에 대하여 건조중량 기준으로 0.00０００1~５０ 중량%로 함유한다.

본 발명에 의한 C-kit 수용체 길항제를 항암용 또는 종양 치료용 조성물로 제형화하는 경우, 단삼 추출물이　１　ｐｐｍ의　매우　작은　농도에서도　뛰어난 　효과를　보이는 제형화　가능성 등을　고려하여　단삼 추출물을 조성물 총 중량에 대하여 건조중량 기준으로 ０．０００００１～１００　중량%로 함유한다.　

본 발명에 의한 단삼 추출물은 C-kit가　유의적으로　증가되어　있다고　보고　되고　있는　모든　질병，　특히,　급성 골수성 백혈병(Acute myelogenous leukemia, AML), 폐의 선암종(adenocarcinomas of the lung), 위장관 간질 종양(Gastrointestinal stromal tumors, GISTs)，신경내분비　종양（neuroendocrine tumors，　갑상선암（Anaplastic Thyroid Carcinoma），췌장암（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｃａｎｃｅｒ） 및　유방암（breast cancer） 등의　치료에　사용할　수　있다．　본 발명에서는 한국식물추출물은행에서　구입한　단삼 추출물을　ＤＭＳＯ에　녹여　사용하였다.

본 발명에서 유효 성분으로서 포함되는 C-kit 수용체 길항제는 C-kit에 SCF가 작용하는 것을 방지하여 멜라노사이트의 증식과 멜라닌 합성에 관여하는 단백질의 발현을 억제하여 뛰어난 미백효과를 갖는다. 또한 C-kit는 앞서 말한 바와 같이 암세포의 증식을 촉진하기 때문에 C-kit의 수용체 저해 추출물은 항암제에 사용할 수 있다.

또한 C-kit를 저해하는 것으로 알려진 Gleevec은 C-kit의 세포안 신호전달 매체인 단백질 타이로신 키나아제를 저해하는 반면, 본 발명은 세포막 외부에 존재하는 C-kit 수용체에 리간드인 줄기 세포 인자가 결합하는　것을　막아서 C-kit의 활성화를　원천적으로 봉쇄하는 것이다. 이렇게 하면 세포 투과 면에서 유리하기 때문에 세포를 투과해야 하는 Gleevec 보다 좋은 효과를 기대할 수 있다. 즉, 본 발명에 의한 단삼 추출물은 C-kit와　그　리간드인　ＳＣＦ의　결합을　막는　작용을　하는 C-kit 수용체의 길항제로서, C-kit 수용체에 그 리간드인 SCF가 대신 결합하여 C-kit 수용체와 리간드의 결합으로 인한 C-kit 의　시그널링이　활성화되는 것을 방지한다．　도 ４에서는 단삼 추출물을　농도별로　처리하였을　때　C-kit에　붙어　있는　ＳＣＦ의　양이　줄어드는　것을　확인할 수 있었다． 그리고　그　뒤에　나오는　세포　증식　억제　실험과　멜라닌　합성　저해　실험에서 C-kit 의　활성화를 통한　멜라노사이트의　증식과　멜라닌합성증가　현상이　모두　억제되었으므로 본 발명에 의한 단삼　추출물이　C-kit 수용체의 길항제로서 작용한다는 것을 입증할 수 있었다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

[참고예 1] 기니아 피그를 이용한 C-kit 저해를 통한 미백효과 검증

500g의 기니아 피그의 등 부위 털을 제거하고 세척한 후 펜토바르비탈(pentobarbital)로 마취하였다. 피부에 1㎠의 원형 창문이 뚫린 플라스틱판을 올리고 Waldman UV 800으로 자외선을 조사하였다. 다음날에도 같은 방법으로 자외선을 조사하였다. 마지막으로 태닝(tanning)한 다음날 주사기로 C-kit에 대한 항체인 시료를 피하에 50ul 주입하고 그 다음날에도 같은 방법으로 시료를 주사하였다. 그 리고 일주일 뒤에 기니아 피그의 자외선 조사부위의 태닝(tanning)을 사진으로 기록하고 색차계를 이용하여 L값을 측정하여 밝기의 변화를 관찰하였으며, 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.

도 1의 결과를 통하여 기니아 피그에 C-kit의 항체인 ACK2를 피하에 투여했을 때 C-kit의 기능이 차단되면서 피부가 검어지는 것이 억제되었고 심지어는 제모 후 자라나는 털의 색깔조차도 ACK2를 투여한 부위에서만 하얗게 탈색됨을 알 수 있었다. 이는 모낭에 존재하는 멜라노사이트에서 멜라닌의 생성이 억제되어 모발에 멜라닌을 공급하지 못하기 때문이다.

도 2의 결과로부터 자외선을 조사하면 SCF의 발현도 증가하고 C-kit 신호체계가 활성화되어 멜라노사이트의 숫자가 증가하고 멜라닌의 합성도 증가하므로 ACK를 투여하여 그 신호를 억제했을 때 기니아 피그의 피부가 대조군에 비해 3배 이상 밝아짐을 확인할 수 있었다.

[시험예　１] C-kit 수용체 길항제 스크리닝 시스템 배치

C-kit 수용체 길항제를 스크리닝하기 위하여 C-kit의 수용체와 그 기질인 줄기 세포 인자를 준비하였다. C-kit 수용체 도메인은 일정량 96공 평판기에 고정화한 후 2% BSA를 사용하여 비특이적 결합을 막은 후 기질인 SCF를 일정량 첨가하였다. 결합하지 않은 SCF를 제거한 다음 결합되어 있는 SCF를 항체를 이용하여 검출하였다. 검출한 정도를 파악하기 위하여 퍼옥시다아제(peroxidase)를 이용하여 450nm에서 흡광도의 차이를 측정하였다.

도 3은 C-kit 수용체와 그 리간드인 줄기 세포 인자(stem cell factor, SCF)의 상호작용을 관찰한 것이다. C-kit 수용체 20ng을 사용하고 SCF 4ng을 사용해도 충분히 그 상호작용을 관찰할 수 있었다. C-kit 수용체 또는 SCF를 넣지 않았을 때 신호가 나오지 않는 것을 보면 그 상호작용이 선택성이 있음을 알 수 있다. 따라서, 이렇게 마련한 시스템은 신호 대비 비신호의 크기가 우수하여 상호작용 저해물질을 스크리닝하는데 무리가 없음을 확인하였다.

[시험예 ２]

C-kit 길항제 스크리닝위에서 셋업한 스크리닝 시스템을 사용하여 C-kit 수용체와의 결합을 저해하는 물질을 선별하였다. 천연물은 한국식물추출물은행에서 구입한 300여종의 천연추출물을 사용하였다. 천연추출물은 위에서　셋업한　스크리닝　시스템에　추출물을　함께　처리하여　C-kit　수용체와　결합하는　ＳＣＦ의　양을　감소시키는　천연물을　선별하였다． C-kit　수용체에　대한　저해도는 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.

저해도 = (SCF처리군 450nm-시료처리군 450nm)/(SCF 처리군 450nm-scf 비처리군 450nm) x 100

도 4는 도 3에서 개발한 C-kit 수용체 길항제 스크리닝 시스템을 사용하여 천연물 300여종을 스크리닝한 결과로서 단삼 추출물이 농도의존적으로　ＳＣＦ가 C-kit 수용체에　결합하는　것을　막고　있다는　것을　보여주는　그래프이다.

[시험예 3] 선별된 천연물의 멜라노사이트의 증식 저해효과

SCF의 리간드 작용을 저해하는 선별된 천연물이　C-kit의　길항작용을　실제　세포에서　일으키고　있는지　확인하기　위해　SCF와 함께 또는 SCF만 멜라노사이트의 일종인 HM3KO 세포에 처리하여　ＳＣＦ가　C-kit에　작용했을 때　나타나는　세포증식　현상이　얼마나　억제되고　있는지　시험하였다．96공　평판기에 0.5x10⁴의 HM3KO를 10% FBS, MEM 배지에 섞어 넣은 후 37℃, 10% 이산화탄소 배양기에 넣고 세포를 플레이트에 부착시키고 다음날 SCF와 천연추출물을 처리하였다. 시료 처리하고 3일 후 멜라노사이트의 수를 MTT 시약을 이용하여 측정하였다. 다시 말해 배지 100ul에 10ul의 0.5%를 1시간 처리한 후 배지를 제거한 다음 DMSO를 넣어 포르마잔(formazan)을 용해하여 560nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 새로운 배지와 시료를 다시 처리하여 계속 배양하고 처음 시료 처리 후 6일 째 같은 방법으로 멜라노사이트의 수를 측정하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에서 보여지듯이, 본 발명에 의한 단삼 추출물은 C-kit와 SCF의 상호작용을 억제하는 효과가 우수하여 멜라노사이트의 증식을 억제하고 있음을 확인할 수 있다. 본 발명에 의한 단삼 추출물 3ppm을 사용하였을 때 멜라노사이트의 증식을 70% 정도 억제하는 뛰어난 효능을 보임을 확인하였다.

[시험예 4] 선별된 천연물의 멜라닌 합성 저해 효과

SCF의 리간드 작용을 저해하는 선별된 천연물이　C-kit의　길항작용을　실제　세포에서　일으키고　있는지　확인하기　위하여　SCF와 함께 또는 SCF만 멜라노사이트의 일종인 HM3KO 세포에 처리하여　ＳＣＦ가　C-kit에　작용했을 때　나타나는　멜라닌합성　과정이　얼마나　억제되고　있는지　시험하였다． 사람 멜라노마 세포주 HM3KO 5x10⁴의 개수로 10% FBS, MEM 배지에 고루 분산하여 6공 평판기에 넣고 37℃ 10% 이산화탄소 배양기내에서 배양하였다. 3일 후 배지를 제거하고 새로운 배지에 단삼 추출물 1ppm을 넣고 계속 배양하였다. 단삼 추출물 처리 후 2일 뒤에 단삼 추출물을 다시 한번 처리하고 그로부터 2일 뒤에 세포를 추출용액으로 깨어 단백질과 멜라닌 양을 측정하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6의 결과, 단삼 추출물 1ppm을 사용하여 HM3KO를 처리했을 때 최종 멜라닌 생성량이 대조군 대비 80% 가까이 억제되고 있음을 확인할 수 있었다. 이는 화장품 원료로 많이 사용되는 알부틴과 비교했을 때도 더 뛰어난 멜라닌 생성 저해 효과를 보이고 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의한 조성물은 단삼 추출물을 유효성분으로 사용함으로써 SCF의 C-kit에 대한 작용을 억제하여 C-kit의 활성화와 관련된 피부 흑화와 각종 암 등등과 같은 모든 현상을 개선 또는 치료하는데 이용할 수 있다.

Claims

단삼 추출물을 유효성분으로 함유하고 줄기 세포 인자와 세포막 외부에 존재하는 C-kit 수용체의 상호작용을 억제하는 C-kit 수용체 길항제 조성물.
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