BR112020025715A2 - Ligantes de peptídeo bicíclico específico para nectina-4 - Google Patents

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Abstract

ligantes de peptídeo bicíclico específico para nectina-4. a presente invenção refere-se a polipeptídeos que são covalentemente ligados a estruturas moleculares de modo que duas ou mais alças de peptídeo estejam subtendidas entre os pontos de ligação à estrutura. em particular, a invenção descreve peptídeos que são ligantes de alta afinidade de nectina-4. a invenção também inclui conjugados de fármaco compreendendo os referidos peptídeos, conjugados a um ou mais grupos efetores e/ou funcionais, a composições farmacêuticas compreendendo os referidos ligantes de peptídeo e conjugados de fármaco e ao uso dos referidos ligantes de peptídeo e conjugados de fármaco na prevenção, supressão ou tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por nectina-4.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "LIGAN- TES DE PEPTÍDEO BICÍCLICO ESPECÍFICO PARA NECTINA-4".
CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a polipeptídeos que são co- valentemente ligados a estruturas moleculares de modo que duas ou mais alças de peptídeo sejam subtendidas entre os pontos de ligação à estrutura. Em particular, a invenção descreve peptídeos que são aglutinantes de alta afinidade de Nectina-4. A invenção também inclui conjugados de fármaco que compreendem os referidos peptídeo, con- jugados a um ou mais grupos efetores e/ou funcionais, a composições farmacêuticas que compreendem os referidos ligantes de peptídeo e conjugados de fármaco e ao uso dos referidos ligantes de peptídeo e conjugados de fármaco na prevenção, supressão ou tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por Nectina-4.
ANTECEDENTE DA INVENÇÃO
[002] Peptídeos cíclicos são capazes de ligação com alta afinida- de e especificidade alvo a alvos de proteína e, portanto, são uma clas- se molecular atrativa para o desenvolvimento de terapêuticas. De fato, diversos peptídeos cíclicos já são bem sucedidamente usados na clí- nica, como, por exemplo, o peptídeo antibacteriano vancomicina, o fármaco imunossupressor ciclosporina ou o fármaco anticâncer octreo- tide (Driggers et al. (2008), Nat Rev Drug Discov 7 (7), 608-24). Boas propriedades de ligação resultam de uma superfície de interação rela- tivamente grande formada entre o peptídeo e o alvo, bem como a fle- xibilidade conformacional das estruturas cíclicas. Tipicamente, macro- ciclos ligam-se a superficies de várias centenas de angstrom quadra- do, como, por exemplo, o antagonista CXCR4 do peptídeo cíclico CVX15 (400 Å2; Wu et al. (2007), Science 330, 1066-71), um peptídeo cíclico com a ligação do motif Arg-Gly-Asp à integrina αVb3 (355 Å2) (Xiong et al. (2002), Science 296 (5565), 151-5) ou a ligação do inibi-
dor de peptídeo cíclico upain-1 ao ativador de plasminogênio tipo uro- cinase (603 Å2; Zhao et al. (2007), J Struct Biol 160 (1), 1-10).
[003] Devido a sua configuração cíclica, macrociclos de peptídeo são menos flexíveis do que os peptídeos lineares, levanndo a uma menor perda de entropia após ligação a alvos e resultando em uma maior afinidade de ligação. A flexibilidade reduzida também leva ao bloqueio de conformações específicas do alvo, aumentando a especi- ficidade de ligação em comparação com peptídeos lineares. Este efei- to foi exemplificado por um inibidor potente e seletivo de metaloprotei- nase matriz 8 (MMP-8), que perdeu sua seletividade sobre outras MMPs quando seu anel foi aberto (Cherney et al. (1998), J Med Chem 41 (11), 1749-51). Propriedades de ligação favoráveis obtidas através de macrociclização são ainda mais pronunciadas em peptídeos muiti- cíclicos tendo mais de um anel de peptídeo, por exemplo, como em vancomicina, nisina e actinomicina.
[004] Diferentes equipes de pesquisa anteriormente amarraram polipeptídos com resíduos de sisteína a uma estrutura molecular sinté- tica (Kemp and McNamara (1985), J. Org. Chem; Timmerman et al. (2005), ChemBioChem). Meloen e cotrabakgadires ysaran tris(bromometil)benzeno e moléculas relacionadas para rápida e quan- titativa ciclisação de múltiplas alças de peptídeo sobre estruturas sinté- ticas para mimetismo estrutural de superfícies de proteína (Timmer- man et al. (2005), ChemBioChem). Métodos para a geração de com- postos fármaco candidatos em que os referidos compostos são gera- dos ligando cisteína contendo polipeptídeos a uma estrutura molecu- lar, por exemplo, como TATA (1,1',1''-(1,3,5-triazinano-1,3,5- triil)triprop-2-en-1-ona, Heiniset al. Angew Chem, Int Ed. 2014; 53:1602–1606).
[005] Métodos combinatoriais com base em exibição de fago fo- ram desenvolvidos para gerar e analisar grandes bibliotecas de peptí-
deos bicíclicos quanto a alvos de interesse (Heinis et al. (2009), Nat Chem Biol 5 (7), 502-7 e WO 2009/098450). Em síntese, bibliotecas combinatoriais de peptídeos lineares contendo três resíduos de cisteí- na e duas regiões de seis aminoácidos aleatórios (Cys-(Xaa)6-Cys- (Xaa)6-Cys) foram exibidas em fago e ciclisados covalentemente ligan- do as cadeias laterais de cisteína a uma pequena estrutura de molécu- la.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[006] De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é forne- cido um ligante de peptídeo específico para Nectina-4 compreendendo um polipeptídeo compreendendo pelo menos três resíduos de cisteína, separados por pelo menos duas sequências alça, e uma estrutura mo- lecular que formas ligações covalentes com os resíduos de cisteína do polipeptídeo de modo que pelo menos duas alças de polipeptídeo se- jam formadas na estrutura molecular, em que o ligante de peptídeo compreende a sequência de aminoácido: CiP[1Nal][dD]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii (SEQ ID NO: 1); em que 1NaI representa 1-naftilalanina, HArg representa homoargini- na, HyP representa hidroxiprolina e Ci, Cii e Ciii representam primeiro, segundo e terceiro resíduos de cisteína, respectivamente ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma.
[007] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido um conjugado de fármaco compreendendo um ligante de peptídeo como definido aqui conjugado a um ou mais grupos efetores e/ou funcionais.
[008] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido uma composição farmacêutica compreendendo um ligante de peptídeo ou um conjugado de fármaco como aqui definido, em combinação com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[009] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido um ligante de peptídeo ou conjugado de fármaco como aqui definido, para uso na prevenção, supressão ou tratamento de uma doença ou distúr- bio mediado por Nectina-4.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0010] Onde presente nas figuras, barras de erro representam erro padrão da média (SEM).
[0011] Figuras 1 e 2: Traços de volume de tumor após adminis- tração de BCY8245 a camundongos nus BALB/c fêmeas portadores de xenoenxerto NCI-H292.
[0012] Figuras 3 e 4: Traços de volume de tumor após adminis- tração de BCY8245 a camundongos CB17-SCID fêmeas portadores de xenoenxerto HT-1376.
[0013] Figura 5: Traço de volume de tumor após administração de BCY8245 a camundongos nus BALB/c fêmeas portadores de xenoen- xerto Panc2.13.
[0014] Figura 6: Traço de volume de tumor após administração de BCY8245 a camundongos nus BALB/c fêmeas portadores de xenoen- xerto MDA-MB-468.
[0015] Figura 7: Traço de volume de tumor após administração de BCY8549 (com BCY8245 como controle), a camundongos nus BALB/c fêmeas portadores de xenoenxerto NCI-H292.
[0016] Figura 8: Estratégia de bloqueio para Nectina-4 em Mama (T-47D e MDA-MB-468).
[0017] Figura 9: Estratégia de bloqueio para Nectina-4 em NCI- H292 e NCI-H322.
[0018] Figuras 10 e 11: Estratégia de bloqueio para Nectina-4 em NCI-H526 e HT1080, respectivamente.
[0019] Figuras 12 a 16: Estratégia de bloqueio para Nectina-4 em câncer de bexiga (HT1376; Figura 12), câncer de mama (MDA-MB- 468; Figura 13), Câncer colorretal (HT-29; Figura 14A e HCT-116; Figura 14B), câncer de pulmão (A549; Figura 15A, NCI-H292; Figura
15B, NCI-H358; Figura 15C e NCI-526; Figura 15D), e câncer de pâncreas (Panc02.13; Figura 16), respectivamente.
[0020] Figura 17: Traço de volume de tumor após administração de BCY8245 a camundongos nus Balb/c fêmeas portadores de xenoenxerto A549.
[0021] Figura 18: Traço de volume de tumor após administração de BCY8245 a camundongos nus Balb/c fêmeas portadores de xenoenxerto HCT116.
[0022] Figura 19: Traço de volume de tumor após administração de BCY8245 a camundongos CB17-SCID fêmeas portadores de xenoenxerto HT-1376.
[0023] Figura 20: Traço de volume de tumor após administração de BCY8245 a camundongos nus Balb/c fêmeas portadores de xenoenxerto MDA-MB-468.
[0024] Figura 21: Traço de volume de tumor após administração de BCY8245 a camundongos nus Balb/c fêmeas portadores de xenoenxerto NCI-H292.
[0025] Figura 22: Traço de volume de tumor após administração de BCY8245 a camundongos nus Balb/c fêmeas portadores de NCI- H526 xenograft.
[0026] Figura 23: Traço de volume de tumor após administração de BCY8245 a camundongos nus Balb/c fêmeas portadores de xenoenxerto Panc2.13.
[0027] Figura 24: Traços de volume de tumor após administração de BCY8245 ou BCY8245 em combinação com BCY8234 a camundongos nus Balb/c fêmeas portadores de xenoenxerto MDA- MB-468.
[0028] Figura 25: Traços de volume de tumor após administração de BCY8245 apenas ou BCY8245 em combinação com BCY8234 a camundongos nus Balb/c fêmeas portadores de xenoenxerto MDA- MB-468.
[0029] Figuras 26 a 31: traços de volume de tumor em xenoenxertos Lu-01-0412, LU-01-0007, CTG-1771, CTG-1171, CTG- 1106, e CTG-0896 PDX.
[0030] Figura 32: A eficácia de BT8009 (isto é, BCY8245) correlaciona-se com os xenoenxertos CDX/PDX de expressão. Xenoenxertos com pouca/nenhuma expressão de Nectina-4 mostraram taxa de crescimento de tumor reduzida. Xenoenxertos expressando Nectina-4 mostraram regressões de tumor. Ambos os modelos de PDX e CDX são incluídos nesta análise, valores são coletados de vários relatórios.
[0031] Figura 33: Células MDA-MB-468 expressam Nectina-4 e mostram retenção prolongada de MMAE em tumor.
[0032] Figura 34: HCS – Análise de dados sobre a linhagem celular MDA-MB-468.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0033] Em uma modalidade, o ligante de peptídeo de CiP[1Nal][dD]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii (SEQ ID NO: 1) compre- ende uma sequência de aminoácidos selecionada de: [B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 1) (doravante referido como BCY8234); Ac-[B-Ala][Sar5]-(SEQ ID NO: 1) (doravante referido como BCY8122); Ac-(SEQ ID NO: 1) (doravante referido como BCY8126); (SEQ ID NO: 1) (doravante referido como BCY8116); Fluoresceína-(SEQ ID NO: 1) (doravante referido como BCY8205); e [PYA][B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 1) (doravante referido como BCY8846).
[0034] Em uma outra modalidade, o ligante de peptídeo de CiP[1Nal][dD]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii (SEQ ID NO: 1) compreen- de uma sequência de aminoácidos selecionada de: [B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 1) (doravante referido como BCY8234); Ac-[B-Ala][Sar5]-(SEQ ID NO: 1) (doravante referido como BCY8122); Ac-(SEQ ID NO: 1) (doravante referido como BCY8126); (SEQ ID NO: 1) (doravante referido como BCY8116); and Fluoresceína-(SEQ ID NO: 1) (doravante referido como BCY8205).
[0035] Em ainda outra modalidade, o ligante de peptídeo de CiP[1Nal][dD]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii (SEQ ID NO: 1) compreen- de uma sequência de aminoácidos selecionada de: Ac-[B-Ala][Sar5]-(SEQ ID NO: 1) (doravante referido como BCY8122); Ac-(SEQ ID NO: 1) (doravante referido como BCY8126); e (SEQ ID NO: 1) (doravante referido como BCY8116).
[0036] Os dados são apresentados aqui na Tabela 2, que demons- tra que os ligantes de peptídeos desta modalidade exibiram níveis ex- celentes de ligação a Nectina-4 humana, conforme evidenciado pelos dados de ligação de SPR.
[0037] Em ainda outra modalidade, o ligante de peptídeo de CiP[1Nal][dD]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii (SEQ ID NO: 1) compreen- de uma sequência de aminoácidos selecionada de: Ac-[B-Ala][Sar5]-(SEQ ID NO: 1) (doravante referido como BCY8122); e Ac-(SEQ ID NO: 1) (doravante referido como BCY8126).
[0038] Os dados são apresentados aqui na Tabela 1 que demons- tra que os ligantes de peptídeos desta modalidade exibiram níveis ex-
celentes de ligação a Nectina-4 humana, conforme evidenciado pelos dados de ligação de dados de ligação de competição.
[0039] Em ainda outra modalidade, o ligante de peptídeo de CiP[1Nal][dD]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii (SEQ ID NO: 1) compreen- de uma sequência de aminoácidos selecionada de: [B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 1) (doravante referido como BCY8234).
[0040] Os dados são apresentados aqui na Tabela 3 que demons- tra que os ligantes de peptídeos desta modalidade, quando conjuga- dos a um agente citotóxico, exibiram níveis excelentes (<10 nM) de ligação a Nectina-4 humana, conforme evidenciado pelos dados de ligação a SPR.
[0041] Em uma modalidade, a estrutura molecular é 1,1',1''-(1,3,5- triazinana-1,3,5-triil)triprop-2-en-1-ona (TATA).
[0042] A menos que definido de outra forma, todos os termos téc- nicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por aqueles versados na técnica, tal co- mo nas técnicas de química de peptídeos, cultura de células e exibição de fagos, química de ácidos nucleicos e bioquímica. Técnicas padrões são usadas para biologia molecular, métodos genéticos e bioquímicos (ver Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª edi- ção, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4ª edi- ção, John Wiley & Sons, Inc.), que são incorporados aqui por referên- cia. Nomenclatura Numeração
[0043] Quando se referem às posições dos resíduos de aminoáci- dos dentro dos peptídeos da invenção, os resíduos de cisteína (Ci, Cii e Ciii) são omitidos da numeração porque são invariantes, portanto, a numeração dos resíduos de aminoácidos dentro dos peptídeos da in- venção é referida como abaixo: Ci-P1-[1Nal]2-[dD]3-Cii-M4-[HArg]5-D6-W 7-S8-T9-P10-[HyP]11-W 12-Ciii (SEQ ID NO: 1)
[0044] Para o propósito desta descrição, todos os peptídeos bicí- clicos são considerados ciclizados com 1,1',1''-(1,3,5-triazinano-1,3,5- tri-il)triprop-2-an-1-ona (TATA) e produzindo uma estrutura tri- substituída. A ciclização com TATA ocorre em Ci, Cii, e Ciii. Formato Molecular
[0045] Extensões do N-terminal ou C-terminal à sequência do nú- cleo do biciclo são adicionadas ao lado esquerdo ou direito da se- quência, separadas por um hífen. Por exemplo, uma cauda βAla- Sar10-Ala N-terminal seria denotada como: βAla-Sar10-A-(SEQ ID NO: X). Sequências de Peptídeos Inversas
[0046] À luz da descrição em Nair et al (2003) J Immunol 170 (3), 1362-1373, prevê-se que as sequências de peptídeos aqui descritas também encontrariam utilidade na sua forma retroinversa. Por exem- plo, a sequência é invertida (ou seja, o N-terminal torna-se C-terminal e vice-versa) e sua estereoquímica também é invertida (ou seja, os D- aminoácidos tornam-se L-aminoácidos e vice-versa). Ligantes de Peptídeo
[0047] Um ligante de peptídeo, como aqui referido, refere-se a um peptídeo covalentemente ligado a uma estrutura molecular. Normal- mente, esses peptídeos compreendem dois ou mais grupos reativos (isto é, resíduos de cisteína) que são capazes de formar ligações co- valentes ao arcabouço, e uma sequência subtendida entre os referidos grupos reativos que é referida como a sequência de loop, uma vez que forma um loop quando o peptídeo está ligado ao arcabouço. No pre- sente caso, os peptídeos compreendem pelo menos três resíduos de cisteína (aqui referidos como Ci, Cii e Ciii) e formam pelo menos duas voltas no arcabouço. Vantagens do Ligante de Peptídeo
[0048] Certos peptídeos bicíclicos da presente invenção têm uma série de propriedades vantajosas que os permitem serem considera- dos como moléculas similares a fármacos adequados para injeção, inalação, administração nasal, ocular, oral ou tópica. Essas proprieda- des vantajosas incluem: - Reatividade cruzada de espécies. Este é um requisito típi- co para avaliação pré-clínica de farmacodinâmica e farmacocinética; - Estabilidade de protease. Os ligantes de peptídeos bicícli- cos devem, idealmente, demonstrar estabilidade às proteases plasmá- ticas, proteases epiteliais ("ancoradas na membrana"), proteases gás- tricas e intestinais, proteases de superfície pulmonar, proteases intra- celulares e similares. A estabilidade da protease deve ser mantida en- tre diferentes espécies, de modo que um candidato de chumbo biciclo possa ser desenvolvido em modelos animais, bem como administrado com confiança em humanos; - Perfil de solubilidade desejável. Esta é uma função da proporção de resíduos carregados e hidrofílicos versus hidrofóbicos e ligação H intra/intermolecular, que é importante para fins de formula- ção e absorção; - Uma meia-vida ótima do plasma na circulação. Depen- dendo da indicação clínica e do regime de tratamento, pode ser ne- cessário desenvolver um peptídeo bicíclico para exposição curta em um cenário de gerenciamento de doença aguda ou desenvolver um peptídeo bicíclico com retenção aumentada na circulação e, portanto, é ideal para o gerenciamento de mais estados de doenças crônicas. Outros fatores que determinam a meia-vida plasmática desejável são os requisitos de exposição sustentada para eficiência terapêutica má-
xima versus a toxicologia que a acompanha devido à exposição sus- tentada do agente; e - Seletividade. Certos ligantes de pepitídeo da invenção demonstram boa seletividade sobre outras nectinas. Sais Farmaceuticamente Aceitáveis
[0049] Será apreciado que as formas de sal estão dentro do esco- po desta invenção, e as referências a ligantes de peptídeo incluem as formas de sal dos referidos ligantes.
[0050] Os sais da presente invenção podem ser sintetizados a par- tir do composto original que contém uma fração básica ou ácida por métodos químicos convencionais, tais como métodos descritos em Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, Hardco- ver, 388 páginas, Agosto de 2002. Geralmente, tais sais podem ser preparados pela reação do ácido livre ou formas básicas desses com- postos com a base ou ácido apropriado em água ou em um solvente orgânico, ou em uma mistura dos dois.
[0051] Os sais de adição de ácido (monossais ou dissais) podem ser formados com uma grande variedade de ácidos, tanto inorgânicos como orgânicos. Exemplos de sais de adição de ácido incluem mono- ou dissais formados com um ácido selecionado do grupo que consiste em acético, 2,2-dicloroacético, adípico, algínico, ascórbico (por exem- plo, L-ascórbico), L-aspártico, benzenossulfônico, benzóico, 4- acetamidobenzoico, butanoico, (+) canfórico, canforossulfônico, (+)- (1S)-camfor-10-sulfônico, cáprico, capróico, caprílico, cinâmico, cítrico, ciclâmico, dodecilsulfúrico, etano-1,2-dissulfônico, etanossulfônico, 2- hidroxietanossulfônico, fórmico, fumárico, galactárico, gentísico, gluco- heptônico, D-glucônico, glucurônico (por exemplo, D-glucurônico), glu- tâmico (por exemplo, L-glutâmico), α-oxoglutárico, glicólico, hipúrico, ácidos hidro-hálicos (por exemplo, bromídrico, clorídrico, hidriódico),
isetiônico, láctico (por exemplo (+)-L-láctico, (±)-DL-láctico), lactobiôni- co, maleico, málico, (-)-L-málico, malônico, (±)-DL-mandélico, meta- nossulfônico, naftaleno-2-sulfônico, naftaleno-1,5-dissulfônico, 1- hidróxi-2-naftoico, nicotínico, nítrico, oleico, orótico, oxálico, palmítico, pamoico, fosfórico, propiônico, pirúvico, L-piroglutâmico, salicílico, 4- amino-salicílico, sebácico, esteárico, sucínico, sulfúrico, tânico, (+)-L- tartárico, tiociânico, p-toluenossulfônico, undecilênico e ácido valérico, bem como aminoácidos acilados e resinas de troca catiônica.
[0052] Um grupo particular de sais consiste em sais formados de acético, clorídrico, iodídrico, fosfórico, nítrico, sulfúrico, cítrico, lático, sucínico, maleico, málico, isetiônico, fumárico, benzenossulfônico, to- luenossulfônico, sulfúrico, metanossulfônico (mesilato), ácidos etanos- sulfônico, naftalenossulfônico, valérico, propanoico, butanoico, malôni- co, glucurônico e lactobiônico. Um sal em particular é o sal cloridrato. Outro sal particular é o sal acetato.
[0053] Se o composto é aniônico, ou tem um grupo funcional que pode ser aniônico (por exemplo, COOH pode ser COO), então um sal pode ser formado com uma base orgânica ou inorgânica, gerando um cátion adequado. Exemplos de cátions inorgânicos adequados inclu- em, mas não estão limitados a, íons de metal alcalino, tais como Li+, Na+ e K+, cátions de metal alcalino-terroso, tal como Ca2+ e Mg2+, e outros cátions, tal como Al3+ ou Zn+. Exemplos de cátions orgânicos adequados incluem, mas não estão limitados a, íon amônio (isto é, NH4+) e íons de amônio substituídos (por exemplo, NH3R+, NH2R2+, NHR3+, NR4+). Exemplos de alguns íons de amônio substituídos ade- quados são aqueles derivados de: metilamina, etilamina, dietilamina, propilamina, diciclo-hexilamina, trietilamina, butilamina, etilenodiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina, benzilamina, fenilbenzilamina, colina, meglumina e trometamina, bem como aminoácidos, tal como lisina e arginina. Um exemplo de um íon de amônio quaternário co-
mum é N(CH3)4+.
[0054] Quando os peptídeos da invenção contêm uma função amina, estes podem formar sais de amônio quaternário, por exemplo, por reação com um agente alquilante de acordo com métodos bem conhecidos pela pessoa versada na técnica. Tais compostos de amô- nio quaternário estão dentro do escopo da invenção. Derivados Modificados
[0055] Será apreciado que os derivados modificados dos ligantes de peptídeos como aqui definidos estão dentro do âmbito da presente invenção. Exemplos de tais derivados modificados adequados incluem uma ou mais modificações selecionadas a partir de: modificações N- terminal e/ou C-terminal; substituição de um ou mais resíduos de ami- noácidos por um ou mais resíduos de aminoácidos não naturais (tal como a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos polares por um ou mais aminoácidos isostéricos ou isoeletrônicos; substituição de um ou mais resíduos de não polaraminoácidos por outros aminoá- cidos isostéricos ou isoeletrônicos não naturais); adição de um grupo espaçador; substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos sen- síveis à oxidação por um ou mais resíduos de aminoácidos resistentes à oxidação; substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos por uma alanina, substituição de um ou mais resíduos de L-aminoácidos por um ou mais resíduos de D-aminoácidos; N-alquilação de uma ou mais ligações amida dentro do ligante de peptídeo bicíclico; substitui- ção de uma ou mais ligações peptídicas por uma ligação substituta; modificação do comprimento da cadeia principal do peptídeo; substi- tuição do hidrogênio no carbono alfa de um ou mais resíduos de ami- noácidos por outro grupo químico, modificação de aminoácidos, como cisteína, lisina, glutamato/aspartato e tirosina com amina, tiol, ácido carboxílico e reagentes reativos com fenol adequados, quanto a funci- onalizar os referidos aminoácidos e a introdução ou substituição de aminoácidos que introduzem reatividades ortogonais que são adequa- das para funcionalização, por exemplo, azida ou aminoácidos conten- do grupo alcino que permitem funcionalização com grupos alcino ou contendo azida, respectivamente.
[0056] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende uma modificação N-terminal e/ou C-terminal. Em uma outra modalida- de, em que o derivado modificado compreende uma modificação N- terminal usando química amino-reativa adequada e/ou modificação C- terminal usando química carbóxi-reativa adequada. Em uma outra mo- dalidade, a referida modificação N-terminal ou C-terminal compreende a adição de um grupo efetor, incluindo, mas não se limitando a, agente acitotóxico, um radiocelador ou um cromóforo.
[0057] Em uma outra modalidade, o derivado modificado compre- ende uma modificação do N-terminal. Em uma outra modalidade, a modificação N-terminal compreende um grupo acetil N-terminal. Nesta modalidade, o grupo cisteína N-terminal (o grupo aqui referido como Ci) é tampado com anidrido acético ou outros reagentes apropriados durante a síntese peptídica levando a uma molécula que é N- terminalmente acetilada. Esta modalidade fornece a vantagem de re- mover um ponto de reconhecimento potencial para aminopeptidases e evita o potencial de degradação do peptídeo bicíclico.
[0058] Em uma modalidade alternativa, a modificação N-terminal compreende a adição de um grupo espaçador molecular que facilita a conjugação de grupos efetores e retenção da potência do peptídeo bicíclico ao seu alvo.
[0059] Em uma outra modalidade, o derivado modificado compre- ende uma modificação C-terminal. Em uma outra modalidade, a modi- ficação C-terminal compreende um grupo amida. Nesta modalidade, o grupo cisteína C-terminal (o grupo aqui referido como Ciii) é sintetizado como uma amida durante a síntese de peptídeo levando a uma molé-
cula que é C-terminalmente amidada. Esta modalidade fornece a van- tagem de remover um ponto de reconhecimento potencial para carbo- xipeptidase e reduz o potencial de degradação proteolítica do peptídeo bicíclico.
[0060] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos com um ou mais resíduos de aminoácidos não naturais. Nesta modalidade, os aminoá- cidos não naturais podem ser selecionados com cadeias laterais isos- téricas/isoeletrônicas que não são reconhecidas por proteases degra- dativas, nem têm qualquer efeito adverso sobre a potência alvo.
[0061] Alternativamente, aminoácidos não naturais podem ser usados possuindo cadeias laterais de aminoácidos restritas, de modo que a hidrólise proteolítica da ligação peptídica próxima seja confor- macionalmente e estericamente impedida. Em particular, estes dizem respeito a análogos de prolina, cadeias laterais volumosas, derivados Cα-dissubstituídos (por exemplo, ácido aminoisobutírico, Aib) e ciclo aminoácidos, um derivado simples sendo ácido amino- ciclopropilcarboxílico.
[0062] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende a adição de um grupo espaçador. Em uma outra modalidade, o derivado modificado compreende a adição de um grupo espaçador à cisteína N- terminal (Ci) e/ou a cisteína C-terminal (Ciii).
[0063] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos sensíveis à oxi- dação com um ou mais resíduos de aminoácidos resistentes à oxida- ção.
[0064] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos carregados com um ou mais resíduos de aminoácidos hidrofóbicos. Em uma modalida- de alternativa, o derivado modificado compreende a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos hidrofóbicos por um ou mais re- síduos de aminoácidos carregados. O equilíbrio correto de resíduos de aminoácidos carregados versus hidrofóbicos é uma característica im- portante dos ligantes de peptídeos bicíclicos. Por exemplo, resíduos de aminoácidos hidrofóbicos influenciam o grau de ligação às proteí- nas plasmáticas e, portanto, a concentração da fração livre disponível no plasma, enquanto os resíduos de aminoácidos carregados (em par- ticular arginina) podem influenciar a interação do peptídeo com as membranas fosfolipídicas nas superfícies celulares. Os dois em com- binação podem influenciar a meia-vida, o volume de distribuição e a exposição do fármaco peptídico e podem ser ajustados de acordo com o desfecho clínico. Além disso, a combinação correta e o número de resíduos de aminoácidos carregados versus hidrofóbicos podem redu- zir a irritação no local da injeção (se o fármaco peptídico for adminis- trado por via subcutânea).
[0065] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende a substituição de um ou mais resíduos de L-aminoácidos com um ou mais resíduos de D-aminoácidos. Acredita-se que esta modalidade aumenta a estabilidade proteolítica por impedimento estérico e por uma propensão dos D-aminoácidos para estabilizar as conformações de volta β (Tugyi et al (2005) PNAS, 102(2), 413–418).
[0066] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende a remoção de quaisquer resíduos de aminoácidos e a substituição por alaninas. Esta modalidade fornece a vantagem de remover potenciais sítios de ataque proteolítico.
[0067] Deve-se notar que cada uma das modificações acima men- cionadas serve para melhorar deliberadamente a potência ou estabili- dade do peptídeo. Outras melhorias de potência com base em modifi- cações podem ser alcançadas por meio dos seguintes mecanismos: - Incorporação de frações hidrofóbicas que exploram o efei-
to hidrofóbico e levam a taxas de desativação mais baixas, de modo que afinidades mais altas sejam alcançadas; - Incorporar grupos carregados que exploram interações iônicas de longo alcance, levando a taxas mais rápidas e a afinidades mais altas (veja, por exemplo, Schreiber et al, Rapid, electrostatically assisted association of proteins (1996), Nature Struct. Biol. 3, 427-31); e - Incorporar restrição adicional no peptídeo, por exemplo, restringindo as cadeias laterais de aminoácidos corretamente de modo que a perda de entropia seja mínima após a ligação ao alvo, restrin- gindo os ângulos de torção da cadeia principal de modo que a perda de entropia seja mínima após a ligação ao alvo e introduzindo cicliza- ções adicionais à molécula por razões idênticas. (para revisões veja Gentilucci et al, Curr. Pharmaceutical Design, (2010), 16, 3185-203, e Nestor et al, Curr. Medicinal Chem (2009), 16, 4399-418). Variações isotópicas
[0068] A presente invenção inclui todos os ligantes de peptídeos marcados com (rádio)isótopos farmaceuticamente aceitáveis da inven- ção, em que um ou mais átomos são substituídos por átomos com o mesmo número atômico, mas uma massa atômica ou número de mas- sa diferente da massa atômica ou número de massa geralmente en- contrado na natureza e ligantes de peptídeos da invenção, em que grupos quelantes de metal são anexados (denominado "efetor") e que são capazes de conter (rádio)isótopos relevantes, e ligantes de peptí- deo da invenção, em que certos grupos funcionais são covalentemente substituídos por (rádio)isótopos relevantes ou grupos funcionais mar- cados isotopicamente.
[0069] Exemplos de isótopos adequados para inclusão nos ligan- tes de peptídeos da invenção compreendem isótopos de hidrogênio,
tal como 2H (D) e 3H (T), carbono, tal como 11 C, 13 C e 14 C, cloro, tal 36 18 123 125 131 como Cl, fluor, tal como F, iodo, tal como I, Ie I, nitrogênio, 13 15 15 17 18 tal como Ne N, oxigênio, tal como O, Oe O, fósforo, tal como 32 35 64 67 P, enxofre, tal como S, cobre, tal como Cu, gálio, tal como Ga 68 90 177 ou Ga, ítrio, tal como Y e lutécio, tal como Lu, e bismuto, tal co- mo 213Bi.
[0070] Certos ligantes de peptídeos marcados isotopicamente da invenção, por exemplo, aqueles que incorporam um isótopo radioativo, são úteis em estudos de distribuição de fármaco e/ou substrato em tecido e para avaliar clinicamente a presença e/ou ausência do alvo Nectina-4 em tecidos doentes. Os ligantes de peptídeo da invenção podem ainda ter propriedades de diagnóstico valiosas em que eles podem ser usados para detectar ou identificar a formação de um com- plexo entre um composto marcado e outras moléculas, peptídeos, pro- teínas, enzimas ou receptores. Os métodos de detecção ou identifica- ção podem usar compostos que são marcados com agentes de mar- cação, como radioisótopos, enzimas, substâncias fluorescentes, subs- tâncias luminosas (por exemplo, luminol, derivados de luminol, luciferi- na, aequorina e luciferase), etc. Os isótopos radioativos de trítio, isto é, 3 14 H (T), e carbono-14, isto é, C, são particularmente úteis para este fim em vista de sua facilidade de incorporação e meios de detecção prontos.
[0071] Substituição por isótopos mais pesados, tal como deutério, isto é, 2H (D), pode proporcionar certas vantagens terapêuticas resul- tantes de uma maior estabilidade metabólica, por exemplo, meia-vida in vivo aumentada ou requisitos de dosagem reduzidos e, portanto, pode ser preferido em algumas circunstâncias.
[0072] Substituição por isótopos emissores de pósitrons, tal como 11 C, 18F, 15O e 13N, pode ser útil em estudos de Tomografia de Emissão de Pósitrons (PET) para examinar a ocupação do alvo.
[0073] Os compostos marcados isotopicamente de ligantes de peptídeos da invenção podem geralmente ser preparados por técnicas convencionais conhecidas pelos versados na técnica ou por processos análogos aos descritos nos Exemplos acompanhantes usando um re- agente marcado isotopicamente apropriado no lugar do não reagente marcado previamente usado. Estrutura Molecular
[0074] Em uma modalidade, a estrutura molecular compreende uma estrutura molecular não aromática. As referências aqui a "estrutu- ra molecular não aromático" referem-se a qualquer estrutura molecu- lar, como definido neste documento, que não contém um sistema de anel carbocíclico ou heterocíclico aromático (isto é, insaturado).
[0075] Exemplos adequados de estruturas moleculares não aro- máticas são descritos em Heinis et al (2014) Angewandte Chemie, In- ternational Edition 53(6) 1602-1606.
[0076] Conforme observado nos documentos anteriores, a estrutu- ra molecular pode ser uma pequena molécula, tal como uma pequena molécula orgânica.
[0077] Em uma modalidade, a estrutura molecular pode ser uma macromolécula. Em uma modalidade, a estrutura molecular é uma macromolécula composta de aminoácidos, nucleotídeos ou carboidra- tos.
[0078] Em uma modalidade, o arcabouço molecular compreende grupos reativos que são capazes de reagir com grupo(s) funcional(is) do polipeptídeo para formar ligações covalentes.
[0079] A estrutura molecular pode compreender grupos químicos que formam a ligação com um peptídeo, tal como aminas, tióis, álco- ois, cetonas, aldeídos, nitrilas, ácidos carboxílicos, ésteres, alcenos, alcinos, azidas, anidridos, sucinimidas, maleimidas, halogenetos de alquila e haletos de acila.
[0080] Um exemplo de um composto contendo carbonila αβ insa- turada é 1,1',1''-(1,3,5-triazinano-1,3,5-triil)triprop-2-en-1-ona (TATA) (Angewandte Chemie, International Edition (2014), 53(6), 1602-1606). Grupos Efetores e Funcionais
[0081] De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um conjugado de fármaco compreendendo um ligante de peptídeo conforme definido neste documento conjugado a um ou mais grupos efetores e/ou funcionais.
[0082] Grupos efetores e/ou funcionais podem ser ligados, por exemplo, aos terminais N e/ou C do polipeptídeo, a um aminoácido dentro do polipeptídeo ou a estrutura molecular.
[0083] Os grupos efetores apropriados incluem anticorpos e partes ou fragmentos dos mesmos. Por exemplo, um grupo efetor pode incluir uma região constante de cadeia leve de anticorpo (CL), um domínio de cadeia pesada de anticorpo CH1, um domínio de cadeia pesada de anticorpo CH2, um domínio de cadeia pesada de anticorpo CH3 ou qualquer combinação dos mesmos, além do um ou mais domínios de região constante. Um grupo efetor também pode compreender uma região de articulação de um anticorpo (tal região normalmente sendo encontrada entre os domínios CH1 e CH2 de uma molécula de IgG).
[0084] Em uma outra modalidade deste aspecto da invenção, um grupo efetor de acordo com a presente invenção é uma região Fc de uma molécula de IgG. Vantajosamente, um grupo efetor de ligante de peptídeo de acordo com a presente invenção compreende ou consiste em uma fusão Fc de ligante peptídico tendo uma meia-vida tβ de um dia ou mais, dois dias ou mais, 3 dias ou mais, 4 dias ou mais , 5 dias ou mais, 6 dias ou mais ou 7 dias ou mais. Mais vantajosamente, o ligante de peptídeo de acordo com a presente invenção compreende ou consiste em uma fusão de Fc de ligante de peptídeo com uma meia-vida tβ de um dia ou mais.
[0085] Os grupos funcionais incluem, em geral, grupos de ligação, fármacos, grupos reativos para a ligação de outras entidades, grupos funcionais que auxiliam a absorção dos peptídeos macrocíclicos nas células e similares.
[0086] A capacidade dos peptídeos de penetrar nas células permi- tirá que os peptídeos contra alvos intracelulares sejam eficazes. Os alvos que podem ser acessados por peptídeos com a capacidade de penetrar nas células incluem fatores de transcrição, moléculas de sina- lização intracelular, como tirosina cinases e moléculas envolvidas na via apoptótica. Os grupos funcionais que permitem a penetração nas células incluem peptídeos ou grupos químicos que foram adicionados ao peptídeo ou ao esqueleto molecular. Peptídeos, tais como aqueles derivados de tais como VP22, HIV-Tat, uma proteína homeobox de Drosophila (Antennapedia), por exemplo, como descrito em Chen e Harrison, Biochemical Society Transactions (2007) Volume 35, parte 4, p821; Gupta et al. em Advanced Drug Discovery Reviews (2004) Vo- lume 57 9637. Exemplos de peptídeos curtos que se mostraram efici- entes na translocação através das membranas plasmáticas incluem o peptídeo de penetratina de 16 aminoácidos da proteína Drosophila An- tennapedia (Derossi et al (1994) J Biol. Chem. Volume 269 p10444), o "modelo peptídeo anfipático" de 18 aminoácidos (Oehlke et al (1998) Biochim Biophys Acts Volume 1414 p127) e regiões ricas em arginina da proteína HIV TAT. Abordagens não peptídicas incluem o uso de mimetizadores de moléculas pequenas ou SMOCs que podem ser fa- cilmente anexados a biomoléculas (Okuyama et al (2007) Nature Me- thods Volume 4 p153). Outras estratégias químicas para adicionar grupos de guanidínio às moléculas também aumentam a penetração celular (Elson-Scwab et al (2007) J Biol Chem Volume 282 p13585). Moléculas de baixo peso molecular, como esteroides, podem ser adi- cionadas ao arcabouço molecular para aumentar a absorção nas célu-
las.
[0087] Uma classe de grupos funcionais que podem ser anexados a ligantes de peptídeo inclui anticorpos e fragmentos de ligação dos mesmos, tal como Fab, Fv ou fragmentos de domínio único. Em parti- cular, os anticorpos que se ligam à proteínas capazes de aumentar a meia-vida do ligante peptídico in vivo podem ser usados.
[0088] Em uma modalidade, um grupo efetor de ligante de peptí- deo de acordo com a invenção tem uma meia-vida tβ selecionada do grupo que consiste em: 12 horas ou mais, 24 horas ou mais, 2 dias ou mais, 3 dias ou mais, 4 dias ou mais, 5 dias ou mais, 6 dias ou mais, 7 dias ou mais, 8 dias ou mais, 9 dias ou mais, 10 dias ou mais, 11 dias ou mais, 12 dias ou mais, 13 dias ou mais, 14 dias ou mais, 15 dias ou mais ou 20 dias ou mais. Vantajosamente, um grupo ou composição do ligante de peptídeo efetor de acordo com a invenção terá uma meia-vida tβ na faixa de 12 a 60 horas. Em uma outra modalidade, ele terá uma meia-vida tβ de um dia ou mais. Em uma outra modalidade ainda, estará na faixa de 12 a 26 horas.
[0089] Em uma modalidade particular da invenção, o grupo funcio- nal é selecionado a partir de um metal quelante que é adequado para complexar radioisótopos de metal de relevância medicinal.
[0090] Grupos efetores possíveis também incluem enzimas, por exemplo, como carboxipeptidase G2 para uso em terapia enzimática/ pró-fármaco, em que o ligante peptídico substitui anticorpos em ADEPT.
[0091] Em uma modalidade particular da invenção, o grupo funcio- nal é selecionado a partir de um fármaco, tal como um agente citotóxi- co para a terapia de câncer. Exemplos adequados incluem: agentes alquilantes, tais como cisplatina e carboplatina, bem como oxaliplatina, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucila, ifosfamida; Antimetaboli- tos incluindo análogos de purina azatioprina e mercaptopurina ou aná-
logos de pirimidina; alcalóides e terpenóides vegetais, incluindo alca- lóides de vinca, tais como Vincristina, Vinblastina, Vinorelbina e Vinde- sina; Podofilotoxina e seus derivados etoposídeo e teniposídeo; Taxa- nos, incluindo paclitaxel, originalmente conhecido como Taxol; inibido- res da topoisomerase incluindo camptotecinas:irinotecano e topoteca- no, e inibidores do tipo II incluindo amsacrina, etoposido, fosfato de etoposido e teniposido. Outros agentes podem incluir antibióticos anti- tumorais que incluem o imunossupressor dactinomicina (que é usado em transplantes renais), doxorrubicina, epirrubicina, bleomicina, cali- queamicinas e outros.
[0092] Em uma outra modalidade particular da invenção, o agente citotóxico é selecionado a partir de maitansinoides (como DM1) ou monometil auristatinas (como MMAE).
[0093] DM1 é um agente citotóxico que é um derivado da maitan- sina contendo tiol e tem a seguinte estrutura:
[0094] Os dados são apresentados aqui na Tabela 3, que demons- tra os efeitos de um ligante de peptídeo conjugado a uma toxina con- tendo DM1.
[0095] Monometil auristatina E (MMAE) é um agente antineoplási- co sintético e tem a seguinte estrutura:
[0096] Os dados são apresentados aqui na Tabela 3, a qual de- monstra os efeitos dos ligantes de peptídeos conjugados a uma toxina contendo MMAE.
[0097] Em ainda outra modalidade particular da invenção, o agen- te citotóxico é selecionado a partir de monometil auristatina E (MMAE).
[0098] Em uma modalidade, o agente citotóxico está ligado ao peptídeo bicíclico por uma ligação clivável, tal como uma ligação dis- sulfeto ou uma ligação sensível à protease. Em uma outra modalidade, os grupos adjacentes à ligação dissulfeto são modificados para contro- lar o impedimento da ligação dissulfeto e, por isso, a taxa de clivagem e liberação concomitante do agente citotóxico.
[0099] O trabalho publicado estabeleceu o potencial para modificar a susceptibilidade da ligação dissulfeto à redução através da introdu- ção de impedimento estérico em ambos os lados da ligação dissulfeto (Kellogg et al (2011) Bioconjugate Chemistry, 22, 717). Um maior grau de impedimento estérico reduz a taxa de redução pela glutationa intra- celular e também por agentes redutores extracelulares (sistêmicos), consequentemente reduzindo a facilidade pela qual a toxina é liberada, tanto dentro quanto fora da célula. Assim, a seleção do ideal em esta- bilidade de dissulfeto na circulação (que minimiza os efeitos colaterais indesejáveis da toxina) versus a liberação eficiente no meio intracelular (que maximiza o efeito terapêutico) pode ser alcançada por meio da seleção cuidadosa do grau de impedimento em ambos os lados da li- gação dissulfeto.
[00100] O impedimento em ambos os lados da ligação dissulfeto é modulado através da introdução de um ou mais grupos metil na enti- dade de direcionamento (aqui, o peptídeo bicíclico) ou no lado da toxi- na do construto molecular.
[00101] Em uma modalidade, o agente citotóxico e o ligante são selecionados a partir de quaisquer combinações daquelas descritas em WO 2016/067035 (os agentes citotóxicos e seus ligantes são aqui incorporados por referência).
[00102] Em uma modalidade, o ligante entre o referido agente cito- tóxico e o referido peptídeo bicíclico compreende um ou mais resíduos de aminoácidos. Exemplos de resíduos de aminoácidos adequados como ligantes adequados incluem Ala, Cit, Lys, Trp e Val.
[00103] Em uma modalidade, o agente citotóxico é selecionado a partir de MMAE e o referido conjugado de fármaco compreende adici- onalmente um ligante selecionado de: -PABC-Cit-Val-Glutaril- ou - PABC-ciclobutil-Ala-Cit-βAla-, em que PABC representa p- aminobenzilcarbamato. Detalhes completos do ligante contendo ciclo- butila podem ser encontrados em Wei et al (2018) J. Med. Chem. 61, 989-1000. Em uma outra modalidade, o agente citotóxico é seleciona- do a partir de MMAE e o ligante é -PABC-Cit-Val-Glutaril-.
[00104] Em uma modalidade alternativa, o agente citotóxico é DM1 e o referido conjugado de fármaco compreende adicionalmente um ligante que é -SPDB-(SO3H)-, em que SPDB representa N-sucinimidil 3-(2-piridilditio)propionato.
[00105] Em uma modalidade alternativa, o agente citotóxico é MMAE, o peptídeo bicíclico é selecionado a partir de BCY8234 con- forme definido neste documento e o ligante é selecionado a partir de - PABC-Cit-Val-Glutaril-. Este BDC é conhecido aqui como BCY8245 e é representado esquematicamente como:
BCY8245 e também pode ser representado de forma mais detalhada como: N-terminal C-terminal Toxina Espaçador Clivável Espaçador Molecular Biciclo BCY8245
[00106] Os dados são apresentados neste documento que demons- tram excelente associação à Nectina-4 humana para BCY8245 no en- saio de ligação a SPR como mostrado na Tabela 3. Este BDC também demonstrou boa atividade antitumoral no modelo de câncer de pulmão de células não pequenas como mostrado no Exemplo 1, o modelo de câncer de bexiga como mostrado no Exemplo 2, o modelo de câncer pancreático como mostrado no Exemplo 3 e o modelo de câncer de mama como mostrado no Exemplo 4.
[00107] Em uma modalidade alternativa, o agente citotóxico é MMAE, o peptídeo bicíclico é selecionado de BCY8234 conforme defi- nido neste documento e o ligante é selecionado de -PABC-ciclobutil- (B-Ala)-. Este BDC é conhecido aqui como BCY8549. Os dados são apresentados neste documento que demonstram excelente ligação a Nectina-4 humana para BCY8549 no ensaio de ligação a SPR como mostrado na Tabela 3.
[00108] Em uma outra modalidade, o conjugado de fármaco bicícli- co é selecionado de BCY8245 ou BCY8549. Em ainda outra modali- dade, o conjugado de fármaco bicíclico é BCY8245. O conjugado de fármaco BCY8245 demonstrou atividade antitumoral dependente da dose superior conforme demonstrado nos dados aqui descritos. Síntese
[00109] Os peptídeos da presente invenção podem ser fabricados sinteticamente por técnicas padrões seguidos por reação com uma estrutura molecular in vitro. Quando isso é realizado, a química padrão pode ser usada. Isso permite a preparação rápida em grande escala de material solúvel para outros experimentos ou validação posteriores. Tais métodos podem ser realizados usando química convencional, como a descrita em Timmerman et al (supra).
[00110] Assim, a invenção também se refere à fabricação de poli- peptídeos ou conjugados selecionados conforme estabelecido neste documento, em que a fabricação compreende outras etapas opcionais, conforme explicado abaixo. Em uma modalidade, essas etapas são realizadas no produto final polipeptídeo/conjugado feito por síntese química.
[00111] Opcionalmente, resíduos de aminoácidos no polipeptídeo de interesse podem ser substituídos na fabricação de um conjugado ou complexo.
[00112] Os peptídeos também podem ser estendidos, para incorpo- rar, por exemplo, outro loop e, portanto, introduzir múltiplas especifici- dades.
[00113] Para estender o peptídeo, ele pode simplesmente ser es- tendido quimicamente em seu N-terminal ou C-terminal ou dentro dos loops usando lisinas protegidas ortogonalmente (e análogos) usando fase sólida padrão ou química de fase de solução. Técnicas de (bio)conjugação padrão podem ser usadas para introduzir um N- terminal ou C-terminal ativado ou ativável. Alternativamente, as adi- ções podem ser feitas por condensação de fragmentos ou ligação química nativa, por exemplo, como descrito em (Dawson et al. 1994.
Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science 266: 776- 779), ou por enzimas, por exemplo usando subtiligase como descrito em (Chang et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Dec 20;91(26):12544-8 ou em Hikari et al, Bioorganic & Medicinal Chemis- try Letters Volume 18, Edição 22, 15 de Novembro de 2008, Páginas 6000-6003).
[00114] Alternativamente, os peptídeos podem ser estendidos ou modificados por conjugação adicional através de ligações dissulfeto. Isso tem a vantagem adicional de permitir que o primeiro e o segundo peptídeo se dissociem um do outro uma vez dentro do ambiente redu- tor da célula. Neste caso, a estrutura molecular (por exemplo, TATA) pode ser adicionada durante a síntese química do primeiro peptídeo de modo a reagir com os três grupos de cisteína; uma cisteína ou tiol adicional poderia então ser anexado ao N-terminal ou C-terminal do primeiro peptídeo, de modo que esta cisteína ou tiol apenas reagisse com uma cisteína ou tiol livre do segundo peptídeo, formando um con- jugado peptídeo-peptídeo bicíclico ligado por dissulfeto.
[00115] Técnicas similares se aplicam igualmente à sínte- se/acoplamento de dois macrociclos bicíclicos e biespecíficos, criando potencialmente uma molécula tetraespecífica.
[00116] Além disso, a adição de outros grupos funcionais ou grupos efetores pode ser realizada da mesma maneira, usando química apro- priada, acoplamento nos N-terminais ou C-terminais ou por meio de cadeias laterais. Em uma modalidade, o acoplamento é conduzido de tal maneira que não bloqueie a atividade de qualquer entidade. Composições Farmacêuticas
[00117] De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende um ligante de peptí- deo ou um conjugado de fármaco, conforme definido neste documen- to, em combinação com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[00118] Geralmente, os presentes ligantes de peptídeos serão utili- zados na forma purificada, juntamente com excipientes ou transporta- dores farmacologicamente apropriados. Normalmente, estes excipien- tes ou transportadores incluem soluções aquosas ou alcoóli- cas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo solução salina e/ou meio tamponado. Os transportadores parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio e Ringer com lactato. Adjuvantes fisiologicamente aceitáveis adequados, se necessário para manter um complexo polipeptídico em suspensão, podem ser escolhidos a partir de espessantes, tais como carboximetil- celulose, polivinilpirrolidona, gelatina e alginatos.
[00119] Os tranportadores intravenosos incluem reforçadores de fluidos e nutrientes e reforçadores de eletrólitos, tal como aqueles ba- seados em dextrose de Ringer. Conservantes e outros aditivos, tais como antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes e gases iner- tes, também podem estar presentes (Mack (1982) Remington's Phar- maceutical Sciences, 16ª Edição).
[00120] Os ligantes de peptídeo da presente invenção podem ser usados como composições administradas separadamente ou em con- junto com outros agentes. Estes podem incluir anticorpos, fragmentos de anticorpo e vários fármacos imunoterapêuticos, tal como cilcospori- na, metotrexato, adriamicina ou cisplatina e imunotoxinas. As compo- sições farmacêuticas podem incluir "coquetéis" de vários agentes cito- tóxicos ou outros agentes em conjunto com os ligantes de proteína da presente invenção, ou mesmo combinações de polipeptídeos selecio- nados de acordo com a presente invenção com diferentes especifici- dades, tal como polipeptídeos selecionados usando diferentes ligantes alvo, sejam ou não agrupados antes da administração.
[00121] A via de administração das composições farmacêuticas de acordo com a invenção pode ser qualquer uma das comumente co- nhecidas pelos versados na técnica. Para terapia, os ligantes de pep- tídeos da invenção podem ser administrados a qualquer paciente de acordo com técnicas padrões. A administração pode ser por qualquer modo apropriado, incluindo parenteral, intravenoso, intramuscular, in- traperitoneal, transdérmico, por via pulmonar, ou também, apropria- damente, por infusão direta com um cateter. De preferência, as com- posições farmacêuticas de acordo com a invenção serão administra- das por inalação. A dosagem e a frequência de administração depen- derão da idade, sexo e condição do paciente, administração simultâ- nea de outros medicamentos, contraindicações e outros parâmetros a serem levados em consideração pelo médico.
[00122] Os ligantes de peptídeos desta invenção podem ser liofili- zados para armazenamento e reconstituídos em um transportador adequado antes do uso. Esta técnica demonstrou ser eficaz e podem ser empregues técnicas de liofilização e reconstituição conhecidas na área. Será apreciado pelas pessoas versadas na técnica que a liofili- zação e reconstituição podem levar a vários graus de perda de ativi- dade e que os níveis podem ter que ser ajustados para cima para compensar.
[00123] As composições contendo os presentes ligantes de peptí- deo ou um coquetel dos mesmos podem ser administradas para tra- tamentos profiláticos e/ou terapêuticos. Em certas aplicações terapêu- ticas, uma quantidade adequada para realizar, pelo menos, inibição parcial, supressão, modulação, eliminação ou algum outro parâmetro mensurável de uma população de células selecionadas é definida co- mo uma "dose terapeuticamente eficaz". As quantidades necessárias para atingir esta dosagem dependerão da gravidade da doença e do estado geral do próprio sistema imunológico do paciente, mas geral- mente variam de 0,005 a 5,0 mg de ligante de peptídeo selecionado por quilograma de peso corporal, com doses de 0,05 a 2,0 mg/kg/dose sendo mais comumente usado. Para aplicações profiláticas, composi- ções contendo os presentes ligantes de peptídeos ou seus coquetéis também podem ser administradas em dosagens similares ou ligeira- mente inferiores.
[00124] Uma composição contendo um ligante de peptídeo de acordo com a presente invenção pode ser utilizada em configurações profiláticas e terapêuticas para auxiliar na alteração, inativação, morte ou remoção de uma população de células alvo selecionadas em um mamífero. Além disso, os ligantes de peptídeos aqui descritos podem ser usados extracorporalmente ou in vitro seletivamente para matar, esgotar ou de outra forma remover efetivamente uma população de células alvo de uma coleção heterogênea de células. O sangue de um mamífero pode ser combinado extracorporalmente com os ligantes de peptídeos selecionados, pelo que as células indesejadas são mortas ou removidas do sangue para retornar ao mamífero de acordo com técnicas padrões. Co-administração com Um ou Mais Outros Agentes Terapêuticos
[00125] Dependendo da condição particular, ou doença, a ser trata- da, agentes terapêuticos adicionais que são normalmente administra- dos para tratar essa condição, também podem estar presentes nas composições desta invenção. Assim, em uma modalidade, a composi- ção farmacêutica compreende adicionalmente um ou mais agentes terapêuticos. Como aqui usado, os agentes terapêuticos adicionais que são normalmente administrados para tratar uma doença ou condi- ção específica, são conhecidos como "apropriados para a doença, ou condição, sendo tratada".
[00126] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método de tratamento de uma doença ou condição descrita que com- preende administrar um anel a um paciente em necessidade de uma quantidade eficaz de um composto aqui descrito ou um sal farmaceuti- camente aceitável do mesmo e coadministrar simultaneamente ou se- quencialmente, uma quantidade eficaz de um ou mais agentes tera- pêuticos adicionais, tal como aqueles aqui descritos. Em algumas mo- dalidades, o método inclui a coadministração de um agente terapêutico adicional. Em algumas modalidades, o método inclui a coadministra- ção de dois agentes terapêuticos adicionais. Em algumas modalida- des, a combinação do composto descrito e o agente ou agentes tera- pêuticos adicionais atua sinergicamente.
[00127] Um composto da presente invenção também pode ser usa- do em combinação com processos terapêuticos conhecidos, por exemplo, a administração de hormônios ou radiação. Em certas moda- lidades, um composto fornecido é usado como um radiossensibiliza- dor, especialmente para o tratamento de tumores que exibem baixa sensibilidade à radioterapia.
[00128] Um composto da presente invenção pode ser administrado sozinho ou em combinação com um ou mais outros compostos tera- pêuticos, possível terapia de combinação tomando a forma de combi- nações fixas ou a administração de um composto da invenção e um ou mais outros compostos terapêuticos sendo escalonados ou dados in- dependentemente um do outro, ou a administração combinada de combinações fixas e um ou mais outros compostos terapêuticos. Um composto da presente invenção pode, além ou adicionalmente, ser administrado especialmente para terapia tumoral em combinação com quimioterapia, radioterapia, imunoterapia, fototerapia, intervenção ci- rúrgica ou uma combinação destas. A terapia de longo prazo é igual- mente possível, assim como a terapia adjuvante no contexto de outras estratégias de tratamento, conforme descrito acima. Outros tratamen- tos possíveis são a terapia para manter o estado do paciente após a regressão do tumor, ou mesmo a terapia quimiopreventiva, por exem-
plo, em pacientes em risco.
[00129] Um ou mais outros agentes terapêuticos podem ser admi- nistrados separadamente de um composto ou composição da inven- ção, como parte de um regime de dosagem múltipla. Alternativamente, um ou mais outros agentes terapêuticos podem fazer parte de uma única forma de dosagem, misturados com um composto desta inven- ção em uma única composição. Se administrado como um regime de dosagem múltipla, um ou mais outros agentes terapêuticos e um com- posto ou composição da invenção podem ser administrados simulta- neamente, sequencialmente ou dentro de um período de tempo um do outro, por exemplo, dentro de 1, 2, 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 horas um do outro. Em al- gumas modalidades, um ou mais outros agentes terapêuticos e um composto ou composição da invenção são administrados como um regime de dosagem múltipla com mais de 24 horas de intervalo.
[00130] Conforme usado neste documento, o termo "combinação", "combinado" e termos relacionados referem-se à administração simul- tânea ou sequencial de agentes terapêuticos de acordo com esta in- venção. Por exemplo, um composto da presente invenção pode ser administrado com um ou mais outros agentes terapêuticos simultane- amente ou sequencialmente em formas de dosagem unitárias separa- das ou juntas em uma forma de dosagem unitária única. Consequen- temente, a presente invenção fornece uma forma de dosagem de uni- dade única compreendendo um composto da presente invenção, um ou mais outros agentes terapêuticos e um transportador, adjuvante ou veículo farmaceuticamente aceitável.
[00131] A quantidade de um composto da invenção e um ou mais outros agentes terapêuticos (nas composições que compreendem um agente terapêutico adicional, como descrito acima) que podem ser combinados com os materiais transportadores para produzir uma for-
ma de dosagem única irá variar dependendo do hospedeiro tratado e o modo particular de administração. Preferivelmente, uma composição da invenção deve ser formulada de modo que uma dosagem entre 0,01 a 100 mg/kg de peso corporal/dia de um composto da invenção possa ser administrada.
[00132] Nas composições que compreendem um ou mais outros agentes terapêuticos, os um ou mais outros agentes terapêuticos e um composto da invenção podem agir sinergicamente. Portanto, a quanti- dade de um ou mais outros agentes terapêuticos em tais composições pode ser menor do que a necessária em uma monoterapia utilizando apenas aquele agente terapêutico. Em tais composições, uma dosa- gem entre 0,01 a 1.000 µg/kg de peso corporal/dia de um ou mais ou- tros agentes terapêuticos pode ser administrada.
[00133] A quantidade de um ou mais outros agentes terapêuticos presentes nas composições desta invenção pode ser não mais do que a quantidade que normalmente seria administrada em uma composi- ção que compreende o agente terapêutico como o único agente ativo. De preferência, a quantidade de um ou mais outros agentes terapêuti- cos nas composições presentemente descritas variará de cerca de 50% a 100% da quantidade normalmente presente em uma composi- ção que compreende esse agente como o único agente terapeutica- mente ativo. Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes terapêuticos são administrados em uma dosagem de cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90 %, ou cerca de 95% da quantidade normalmente administrada para esse agente. Tal como aqui utilizado, a frase "normalmente administrado" significa a quanti- dade de um agente terapêutico aprovado pela FDA fornecido para do- sagem de acordo com a rótulo da FDA.
[00134] Os compostos desta invenção, ou composições farmacêuti-
cas dos mesmos, também podem ser incorporados em composições para revestir um dispositivo médico implantável, próteses tal como, válvulas artificiais, enxertos vasculares, stents e cateteres. Os stents vasculares, por exemplo, têm sido usados para superar a restenose (estreitamento da parede do vaso após a lesão). No entanto, os paci- entes que usam stents ou outros dispositivos implantáveis correm o risco de formação de coágulos ou ativação de plaquetas. Estes efeitos indesejados podem ser evitados ou mitigados por pré-revestimento do dispositivo com uma composição farmaceuticamente aceitável com- preendendo um inibidor de cinase. Dispositivos implantáveis revesti- dos com um composto desta invenção são outra modalidade da pre- sente invenção. Outros Agentes Terapêuticos Exemplares
[00135] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes tera- pêuticos é um inibidor da polimerase de ribose Poly ADP (PARP). Em algumas modalidades, um inibidor de PARP é selecionado de olapari- be (Lynparza®, AstraZeneca); rucaparibe (Rubraca®, Clovis Onco- logy); niraparibe (Zejula®, Tesaro); talazoparibe (MDV3800/BMN 673/LT00673, Medivation/Pfizer/Biomarin); veliparibe (ABT-888, Abb- Vie); e BGB-290 (BeiGene, Inc.).
[00136] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes tera- pêuticos é um inibidor de histona desacetilase (HDAC). Em algumas modalidades, um inibidor de HDAC é selecionado de vorinostato (Zo- linza®, Merck); romidepsina (Is-todax®, Celgene); panobinostato (Farydak®, Novartis); belinostato (Beleodaq®, Spectrum Pharmaceuti- cals); entinostato (SNDX-275, Syndax Pharmaceuticals) (NCT00866333); e chidamida (Epidaza®, HBI-8000, Chipscreen Bios- ciences, China).
[00137] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes tera- pêuticos são um inibidor de CDK, tal como um inibidor de
CDK4/CDK6. Em algumas modalidades, um inibidor de CDK 4/6 é se- lecionado de palbociclibe (Ibrance®, Pfizer); ribociclibe (Kisqali®, No- vartis); abemaciclibe (Ly2835219, Eli Lilly); e trilaciclibe (G1T28, G1 Therapeutics).
[00138] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes tera- pêuticos é um inibidor de fosfatidilinositol 3 cinase (PI3K). Em algumas modalidades, um inibidor de PI3K é selecionado de idelalisibe (Zyde- lig®, Gilead), alpelisibe (BYL719, Novartis), taselisibe (GDC-0032, Ge- nentech/Roche); pictilisibe (GDC-0941, Genentech/Roche); copanlisibe (BAY806946, Bayer); duvelisibe (anteriormente IPI-145, Infinity Phar- maceuticals); PQR309 (Piqur Therapeutics, Suíça); e TGR1202 (ante- riormente RP5230, TG Therapeutics).
[00139] Em algumas modalidades, um ou mais outro agente tera- pêutico é um agente terapêutico à base de platina, também referido como platinas. As platinas causam ligações cruzadas de DNA, de mo- do que inibem o reparo e/ou síntese de DNA, principalmente em célu- las de reprodução rápida, tal como células cancerosas. Em algumas modalidades, um terapêutico à base de platina é selecionado a partir de cisplatina (Platinol®, Bristol-Myers Squibb); carboplatina (Parapla- tin®, Bristol-Myers Squibb; também, Teva; Pfizer); oxaliplatina (Eloxi- tin® Sanofi-Aventis); nedaplatina (Aqupla®, Shionogi), picoplatina (Po- niard Pharmaceuticals); e satraplatina (JM-216, Agennix).
[00140] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes tera- pêuticos é um composto de taxano, que causa a ruptura dos microtú- bulos, que são essenciais para a divisão celular. Em algumas modali- dades, um composto de taxano é selecionado a partir de paclitaxel (Taxol®, Bristol-Myers Squibb), docetaxel (Taxotere®, Sanofi-Aventis; Docefrez®, Sun Pharmaceutical), paclitaxel ligado à albumina (Abra- xane®; Abraxis/Celgene), cabazitaxel (Jevtana®, Sanofi-Aventis), e SID530 (SK Chemicals, Co.) (NCT00931008).
[00141] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes tera- pêuticos são um inibidor de nucleosídeos ou um agente terapêutico que interfere na síntese normal de DNA, síntese de proteínas, replica- ção celular ou inibirá células em proliferação rápida.
[00142] Em algumas modalidades, um inibidor de nucleosídeo é selecionado a partir de trabectedina (agente alquilante de guanidina, Yondelis®, Janssen Oncology), mecloretamina (agente alquilante, Val- chlor®, Aktelion Pharmaceuticals); vincristina (Oncovin®, Eli Lilly; Vin- casar®, Teva Pharmaceuticals; Marqibo®, Talon Therapeutics); te- mozolomida (pró-fármaco para agente alquilante 5-(3-metiltriazen-1-il)- imidazol-4-carboxamida (MTIC) Temodar®, Merck); injeção de citara- bina (ara-C, análogo antimetabólico de citidina, Pfizer); lomustina (agente alquilante, CeeNU®, Bristol-Myers Squibb; Gleostine®, Nex- tSource Biotechnology); azacitidina (análogo de nucleosídeo pirimidina de citidina, Vidaza®, Celgene); mepesucinato de omacetaxina (éster de cefalotaxina) (inibidor da síntese de proteínas, Synribo®; Teva Pharmaceuticals); asparaginase Erwinia chrysanthemi (enzima para depleção de asparagina, Elspar®, Lundbeck; Erwinaze®, EUSA Phar- ma); mesilato de eribulina (inibidor de microtúbulos, antimitótico à base de tubulina, Halaven®, Eisai); cabazitaxel (inibidor de microtúbulos, antimitótico à base de tubulina, Jevtana®, Sanofi-Aventis); capacetrina (inibidor de timidilato sintase, Xeloda®, Genentech); bendamustina (derivado bifuncional de mecloretamina, que se acredita formar liga- ções cruzadas entre cadeias de DNA, Treanda®, Cephalon/Teva); ixa- bepilona (análogo semissintético da epotilona B, inibidor de microtúbu- los, antimitótico à base de tubulina, Ixempra®, Bristol-Myers Squibb); nelarabina (pró-fármaco do análogo de desoxiguanosina, inibidor me- tabólico de nucleosídeo, Arranon®, Novartis); clorafabina (pró-fármaco do inibidor da ribonucleotídeo redutase, inibidor competitivo da desoxi- citidina, Clolar®, Sanofi-Aventis); e trifluridina e tipiracila (análogo de nucleosídeo baseado em timidina e inibidor de timidina fosforilase, Lonsurf®, Taiho Oncology).
[00143] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes tera- pêuticos são um inibidor de cinase ou antagonista de VEGF-R. Inibido- res de VEGF e inibidores de cinase aprovados úteis na presente in- venção incluem: bevacizumabe (Avastin®, Genentech/Roche) um anti- corpo monoclonal anti-VEGF; ramucirumabe (Cyramza®, Eli Lilly), um anticorpo anti-VEGFR-2 e ziv-aflibercept, também conhecido como VEGF Trap (Zaltrap®; Regeneron/Sanofi). Inibidores de VEGFR, tal como regorafenibe (Stivarga®, Bayer); vandetanibe (Caprelsa®, As- traZeneca); axitinibe (Inlyta®, Pfizer); e lenvatinibe (Lenvima®, Eisai); Inibidores de Raf, tal como sorafenibe (Nexavar®, Bayer AG e Onyx); dabrafenibe (Tafinlar®, Novartis); e vemurafenibe (Zelboraf®, Genen- tech/Roche); Inibidores de MEK, tal como cobimetanibe (Cotellic®, Exelexis/Genentech/Roche); trametinibe (Mekinist®, Novartis); Inibido- res da tirosina cinase Bcr-Abl, tal como imatinibe (Gleevec®, Novartis); nilotinibe (Tasigna®, Novartis); dasatinibe (Sprycel®, BristolMyersS- quibb); bosutinibe (Bosulif®, Pfizer); e ponatinibe (Inclusig®, Ariad Pharmaceuticals); inibidores de Her2 e EGFR, tal como gefitinibe (Iressa®, AstraZeneca); erlotinibe (Tarceeva®, Genen- tech/Roche/Astellas); lapatinibe (Tykerb®, Novartis); afatinibe (Gilo- trif®, Boehringer Ingelheim); osimertinibe (visando EGFR ativado, Ta- grisso®, AstraZeneca); e brigatinibe (Alunbrig®, Ariad Pharmaceuti- cals); inibidores de c-Met e VEGFR2, tal como cabozanitibe (Come- triq®, Exelexis); e inibidores de multicinase, tal como sunitinibe (Su- tent®, Pfizer); pazopanibe (Votrient®, Novartis); Inibidores de ALK, tal como crizotinibe (Xalkori®, Pfizer); ceritinibe (Zykadia®, Novartis); e alectinibe (Alecenza®, Genentech/Roche); Inibidores da tirosina cinase de Bruton, tal como ibrutinibe (Imbruvica®, Pharmacyclics/Janssen); e inibidores do receptor Flt3, tal como midostaurina (Rydapt®, Novartis).
[00144] Outros inibidores de cinase e antagonistas de VEGF-R que estão em desenvolvimento e podem ser usados na presente invenção incluem: tivozanibe (Aveo Pharmaecuticals); vatalanibe (Ba- yer/Novartis); lucitanibe (Clovis Oncology); dovitinibe (TKI258, Novar- tis); Chiauanibe (Chipscreen Biosciences); CEP-11981 (Cephalon); linifanibe (Abbott Laboratories); neratinibe (HKI-272, Puma Biotechno- logy); radotinibe (Supect®, IY5511, Il-Yang Pharmaceuticals, S. Co- reia); ruxolitinibe (Jakafi®, Incyte Corpo-ration); PTC299 (PTC Thera- peutics); CP-547.632 (Pfizer); foretinibe (Exelexis, GlaxoSmithKline); quizartinibe (Daiichi Sankyo) e motesanibe (Amgen/Takeda).
[00145] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes tera- pêuticos são um inibidor de mTOR, que inibe a proliferação celular, angiogênese e captação de glicose. Em algumas modalidades, um ini- bidor de mTOR é everolimus (Afinitor®, Novartis); temsirolimus (Tori- sel®, Pfizer); e sirolimus (Rapamune®, Pfizer).
[00146] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes tera- pêuticos é um inibidor de proteassoma. Os inibidores de proteassoma aprovados úteis na presente invenção incluem bortezomibe (Velca- de®, Takeda); carfilzomibe (Kyprolis®, Amgen); e ixazomibe (Ninlaro®, Takeda).
[00147] Em algumas modalidades, um ou mais outro agente tera- pêutico é um antagonista do fator de crescimento, tal como um anta- gonista do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), ou fa- tor de crescimento epidérmico (EGF) ou seu receptor (EGFR). Anta- gonistas de PDGF aprovados que podem ser usados na presente in- venção incluem olaratumabe (Lartruvo®; Eli Lilly). Antagonistas de EGFR aprovados que podem ser usados na presente invenção inclu- em: cetuximabe (Erbitux®, Eli Lilly); necitumumabe (Portrazza®, Eli Lilly), panitumumabe (Vectibix®, Amgen); e osimertinibe (visando EGFR ativado, Tagrisso®, AstraZeneca).
[00148] Em algumas modalidades, um ou mais outro agente tera- pêutico é um inibidor de aromatase. Em algumas modalidades, um ini- bidor de aromatase é selecionado a partir de: exemestano (Aroma- sin®, Pfizer); anastazol (Arimidex®, AstraZeneca) e letrozol (Femara®, Novartis).
[00149] Em algumas modalidades, um ou mais outro agente tera- pêutico é um antagonista da via hedgehog. Os inibidores da via hed- gehog aprovados que podem ser usados na presente invenção inclu- em: sonidegibe (Odomzo®, Sun Pharmaceuticals); e vismodegibe (Eri- vedge®, Genentech), ambos para tratamento de carcinoma de célula basal.
[00150] Em algumas modalidades, um ou mais outro agente tera- pêutico é um inibidor de ácido fólico. Inibidores de ácido fólico aprova- dos úteis na presente invenção incluem pemetrexedo (Alimta®, Eli Lilly).
[00151] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes tera- pêuticos é um inibidor do receptor 4 de quimiocina CC (CCR4). Os ini- bidores de CCR4 sendo estudados que podem ser úteis na presente invenção incluem mogamulizumabe (Poteligeo®, Kyowa Hakko Kirin, Japão).
[00152] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes tera- pêuticos é um inibidor da isocitrato desidrogenase (IDH). Os inibidores de IDH sendo estudados que podem ser usados na presente invenção incluem: AG120 (Celgene; NCT02677922); AG221 (Celgene, NCT02677922; NCT02577406); BAY1436032 (Bayer, NCT02746081); IDH305 (Novartis, NCT02987010).
[00153] Em algumas modalidades, um ou mais outro agente tera- pêutico é um inibidor da arginase. Os inibidores de arginase sendo es- tudados que podem ser usados na presente invenção incluem: AEB1102 (arginase recombinante peguilada, Aeglea Biotherapeutics),
que está sendo estudado em ensaios clínicos de Fase 1 para leucemia mieloide aguda e síndrome mielodisplásica (NCT02732184) e tumores sólidos (NCT02561234); e CB-1158 (Calithera Biosciences).
[00154] Em algumas modalidades, um ou mais outro agente tera- pêutico é um inibidor da glutaminase. Os inibidores da glutaminase em estudo que podem ser usados na presente invenção incluem CB-839 (Calithera Biosciences).
[00155] Em algumas modalidades, um ou mais outro agente tera- pêutico é um anticorpo que se liga a antígenos tumorais, ou seja, pro- teínas expressas na superfície celular de células tumorais. Os anticor- pos aprovados que se ligam a antígenos tumorais que podem ser usa- dos na presente invenção incluem: rituximabe (Rituxan®, Genen- tech/BiogenIdec); ofatumumabe (anti-CD20, Arzerra®, GlaxoSmithKli- ne); obinutuzumabe (anti-CD20, Gazyva®, Genentech), ibritumomabe (anti-CD20 e Yttrium-90, Zevalin®, Spectrum Pharmaceuticals); dara- tumumabe (anti-CD38, Darzalex®, Janssen Bio-tech), dinutuximabe (antiglicolípido GD2, Unituxin®, United Therapeutics); trastuzumabe (anti-HER2, Herceptin®, Genentech); adotrastuzumabe emtansina (an- ti-HER2, fundido com emtansina, Kadcyla®, Genentech); e pertuzu- mabe (anti-HER2, Perjeta®, Genentech); e brentuximabe vedotina (conjugado anti-CD30-fármaco, Adcetris®, Seattle Genetics).
[00156] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes tera- pêuticos é um inibidor da topoisomerase. Os inibidores da topoisome- rase aprovados úteis na presente invenção incluem: irinotecano (Oni- vyde®, Merrimack Pharmaceuticals); topotecano (Hycamtin®, Gla- xoSmithKline). Os inibidores de Topoisomerase em estudo que podem ser usados na presente invenção incluem pixantrona (Pixuvri®, CTI Biopharma).
[00157] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes tera- pêuticos são um inibidor de proteínas antiapoptóticas, tal como BCL-2.
Os antiapoptóticos aprovados que podem ser usados na presente in- venção incluem: venetoclax (Venclexta®, AbbVie/Genentech); e blina- tumomabe (Blincyto®, Amgen). Outros agentes terapêuticos direcio- nados a proteínas apoptóticas que foram submetidas a testes clínicos e podem ser usados na presente invenção incluem navitoclax (ABT- 263, Abbott), um inibidor de BCL-2 (NCT02079740).
[00158] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes tera- pêuticos é um inibidor do receptor de andrógeno. Os inibidores do re- ceptor de andrógeno aprovados úteis na presente invenção incluem enzalutamida (Xtandi®, Astellas / Medivation); inibidores aprovados da síntese de andrógenos incluem abiraterona (Zytiga®, Centocor/Ortho); antagonista aprovado do receptor do hormônio liberador de gonado- tropina (GnRH) (degaralix, Firmagon®, Ferring Pharmaceuticals).
[00159] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes tera- pêuticos é um modulador seletivo do receptor de estrogênio (SERM), que interfere na síntese ou atividade dos estrogênios. SERMs aprova- dos úteis na presente invenção incluem raloxifeno (Evista®, Eli Lilly).
[00160] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes tera- pêuticos são um inibidor da reabsorção óssea. Um terapêutico apro- vado que inibe a reabsorção óssea é o Denosumabe (Xgeva®, Am- gen), um anticorpo que se liga ao RANKL, evita a ligação ao seu re- ceptor RANK, encontrado na superfície dos osteoclastos, seus precur- sores e células gigantes similares a osteoclastos, que medeiam o osso patologia em tumores sólidos com metástases ósseas. Outras terapêu- ticas aprovadas que inibem a reabsorção óssea incluem bifosfonatos, tal como ácido zoledrônico (Zometa®, Novartis).
[00161] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes tera- pêuticos são um inibidor da interação entre as duas proteínas supres- soras de p53 primárias, MDMX e MDM2. Os inibidores das proteínas de supressão de p53 em estudo e que podem ser usados na presente invenção incluem ALRN-6924 (Aileron), um peptídeo grampeado que se liga equipotentemente e interrompe a interação de MDMX e MDM2 com p53. ALRN-6924 está sendo avaliado em ensaios clínicos para o tratamento de LMA, síndrome mielodisplásica avançada (SMD) e lin- foma de células T periférico (PTCL) (NCT02909972; NCT02264613).
[00162] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes tera- pêuticos são um inibidor da transformação do fator de crescimento be- ta (TGF-beta ou TGFß). Os inibidores das proteínas TGF-beta sendo estudadas e que podem ser usadas na presente invenção incluem NIS793 (Novartis), um anticorpo anti-TGF-beta sendo testado na clíni- ca para o tratamento de vários cânceres, incluindo mama, pulmão, he- patocelular, colorretal, pancreático, câncer de próstata e renal (NCT 02947165). Em algumas modalidades, o inibidor de proteínas TGF- beta é fresolimumabe (GC1008; Sanofi-Genzyme), que está sendo es- tudado para melanoma (NCT00923169); carcinoma de células renais (NCT00356460); e câncer de pulmão de células não pequenas (NCT02581787). Além disso, em algumas modalidades, o agente tera- pêutico adicional é uma armadilha TGF-beta, tal como descrito em Connolly et al. (2012) Int’l J. Biological Sciences 8: 964-978. Um com- posto terapêutico atualmente em ensaios clínicos para o tratamento de tumores sólidos é o M7824 (Merck KgaA - anteriormente MSB0011459X), que é um composto armadilha anti-PD-L1/TGFß bi- específico (NCT02699515); e (NCT02517398). M7824 é composto por um anticorpo IgG1 totalmente humano contra PD-L1 fundido ao domí- nio extracelular do receptor II de TGF-beta humano, que funciona co- mo uma "armadilha" de TGFß.
[00163] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes tera- pêuticos são selecionados a partir de glembatumumabe vedotin- monometil auristatina E (MMAE) (Celldex), um anticorpo antiglicoprote- ína NMB (gpNMB) (CR011) ligado ao MMAE citotóxico. gpNMB é uma proteína superexpressada por vários tipos de tumor associados à ca- pacidade das células cancerosas de metastatizar.
[00164] Em algumas modalidades, um ou mais outro agente tera- pêutico é um composto antiproliferativo. Esses compostos antiprolife- rativos incluem, mas não estão limitados a: inibidores da aromatase; antiestrogênios; inibidores da topoisomerase I; inibidores da topoiso- merase II; compostos ativos de microtúbulos; compostos alquilantes; inibidores da histona desacetilase; compostos que induzem processos de diferenciação celular; inibidores da ciclo-oxigenase; Inibidores de MMP; inibidores de mTOR; antimetabólitos antineoplásicos; compos- tos de platina; compostos que direcionam/diminuem a atividade de uma proteína ou lipídio cinase e outros compostos antiangiogênicos; compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade de uma proteína ou fosfatase lipídica; agonistas de gonadorelina; anti- andrógenos; inibidores da metionina aminopeptidase; inibidores de metaloproteinase de matriz; bisfosfonatos; modificadores da resposta biológica; anticorpos antiproliferativos; inibidores da heparanase; inibi- dores de isoformas oncogênicas Ras; inibidores da telomerase; inibi- dores de proteassoma; compostos usados no tratamento de doenças malignas hematológicas; compostos que direcionam, diminuem ou ini- bem a atividade de Flt-3; Inibidores de Hsp90, tais como 17-AAG (17- alilaminogeldanamicina, NSC330507), 17-DMAG (17- dimetilaminoetilamino-17-desmetóxi-geldanamicina, NSC707545), IPI- 504, CNF1010, CNF2024, CNF1010 da Conforma Therapeutics; te- mozolomida (Temodal®); inibidores da proteína do fuso da cinesina, tal como SB715992 ou SB743921 da GlaxoSmithKline, ou pentamidi- na/clorpromazina da CombinatoRx; Inibidores de MEK, tais como AR- RY142886 da Array BioPharma, AZd6244 da AstraZeneca, PD181461 da Pfizer e leucovorina.
[00165] O termo "inibidor de aromatase", tal como aqui utilizado,
refere-se a um composto que inibe a produção de estrogênio, por exemplo, a conversão dos substratos androstenediona e testosterona em estrona e estradiol, respectivamente. O termo inclui, mas não está limitado a esteróides, especialmente atamestano, exemestano e for- mestano e, em particular, não esteróides, especialmente aminoglute- timida, rogletimida, piridoglutetimida, trilostano, testolactona, cetoco- nazol, vorozol, fadrozol, anastrozol e letrozol. O exemestano é comer- cializado com o nome comercial Aromasin™. O Formestano é comer- cializado com o nome comercial Lentaron™. O Fadrozol é comerciali- zado com o nome comercial Afema™. O anastrozol é comercializado com o nome comercial Arimidex™. O letrozol é comercializado sob os nomes comerciais Femara™ ou Femar™. A aminoglutetimida é co- mercializada sob o nome comercial Orimeten™. Uma combinação da invenção compreendendo um agente quimioterapêutico que é um ini- bidor de aromatase é particularmente útil para o tratamento de tumo- res positivos para receptor de hormônio, tal como tumores de mama.
[00166] O termo "antiestrogênio", como aqui utilizado, refere-se a um composto que antagoniza o efeito dos estrogênios no nível do re- ceptor de estrogênio. O termo inclui, mas não está limitado a tamoxife- no, fulvestranto, raloxifeno e cloridrato de raloxifeno. O tamoxifeno é comercializado sob o nome comercial Nolvadex™. O cloridrato de ra- loxifeno é comercializado com o nome comercial Evista™. Fulvestran- to pode ser administrado com o nome comercial Faslodex™. Uma combinação da invenção compreendendo um agente quimioterapêuti- co que é um antiestrogênio é particularmente útil para o tratamento de tumores positivos para receptor de estrogênio, tal como tumores de mama.
[00167] O termo "antiandrogênio", tal como aqui utilizado, refere-se a qualquer substância que é capaz de inibir os efeitos biológicos dos hormônios androgênicos e inclui, mas não está limitado a, bicalutami-
da (Casodex™). O termo "agonista de gonadorelina" conforme aqui utilizado inclui, mas não está limitado a abarelix, goserelina e acetato de goserelina. Goserelina pode ser administrado sob o nome comerci- al Zoladex™.
[00168] O termo "inibidor da topoisomerase I", tal como aqui utiliza- do, inclui, mas não está limitado a topotecano, gimatecano, irinoteca- no, camptoteciano e seus análogos, 9-nitrocamptotecina e o conjuga- do macromolecular de camptotecina PNU-166148. O irinotecano pode ser administrado, por exemplo, na forma como é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial Camptosar™. O topotecano é comer- cializado sob o nome comercial Hycamptin™.
[00169] O termo "inibidor da topoisomerase II", tal como aqui utili- zado, inclui, mas não está limitado às antraciclinas, tais como doxorru- bicina (incluindo formulação lipossomal, tal como Caelyx™), daunorru- bicina, epirrubicina, idarrubicina e redubicina, as antraquinonas mito- xantrona e as podofilotoxinas etoposídeo e teniposídeo. O etoposídeo é comercializado com o nome comercial Etopophos™. Teniposídeo é comercializado com o nome comercial VM 26-Bristol. A doxorrubicina é comercializada sob o nome comercial Acriblastin™ ou Adriamycin™. A epirrubicina é comercializada com o nome comercial Farmorubi- cin™. A idarrubicina é comercializada sob o nome comercial Zave- dos™. A mitoxantrona é comercializada sob o nome comercial Novan- tron.
[00170] O termo "agente ativo de microtúbulo" refere-se a compos- tos de estabilização de microtúbulos, desestabilização de microtúbulos e inibidores de polimerização de microtublina incluindo, mas não se limitando a: taxanos, tal como paclitaxel e docetaxel; alcalóides de vin- ca, tal como vinblastina ou sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina ou vincristina e vinorelbina; disco-dermólidos; cochicina e epotilonas e derivados dos mesmos. Paclitaxel é comercializado com o nome co-
mercial Taxol™. O Docetaxel é comercializado com o nome comercial Taxotere™. O sulfato de vinblastina é comercializado sob o nome co- mercial Vinblastin R.P™. O sulfato de vincristina é comercializado sob o nome comercial Farmistin™.
[00171] O termo "agente alquilante", conforme aqui utilizado, inclui, mas não está limitado a, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalano ou nitro- soureia (BCNU ou Gliadel). A ciclofosfamida é comercializada com o nome comercial Cyclostin™. Ifosfamida é comercializada sob o nome comercial Holoxan™.
[00172] O termo "inibidores da histona desacetilase" ou "inibidores de HDAC" refere-se a compostos que inibem a histona desacetilase e que possuem atividade antiproliferativa. Isso inclui, mas não está limi- tado a, ácido suberoilanilida hidroxâmico (SAHA).
[00173] O termo "antimetabólito antineoplásico" inclui, mas não está limitado a, 5-fluorouracila ou 5-FU, capecitabina, gemcitabina, compos- tos desmetilantes de DNA, tal como 5-azacitidina e decitabina, meto- trexato e edatrexato e antagonistas do ácido fólico, como pemetrexed. Capecitabina é comercializada com o nome comercial Xeloda™. A gencitabina é comercializada sob o nome comercial Gemzar™.
[00174] O termo "composto de platina", conforme usado aqui, inclui, mas não está limitado a, carboplatina, cisplatin, cisplatina e oxaliplati- na. A carboplatina pode ser administrada, por exemplo, na forma como é comercializada, por exemplo, sob a marca comercial Carboplat™. A oxaliplatina pode ser administrada, por exemplo, na forma como é co- mercializada, por exemplo, sob a marca registrada Eloxatin™.
[00175] O termo "compostos de direcionamento a/decréscimo de uma atividade de proteína ou lipídeo cinase; ou uma atividade de pro- teína ou lipídeo fosfatase; ou ainda compostos antiangiogênicos" como usado aqui inclui, mas não está limitado a, proteína tirosina cinase e/ou inibidores de serina e/ou treonina cinase ou inibidores de lipídio cinase, tais como: a) compostos direcionando, diminuindo ou inibindo a atividade dos receptores do fator de crescimento derivado de plaque- tas (PDGFR), tais como compostos que direcionam, diminuem ou ini- bem a atividade de PDGFR, especialmente compostos que inibem o receptor de PDGF, como um derivado de N-fenil-2-pirimidina-amina, como imatinibe, SU101, SU6668 e GFB-111; b) compostos direcio- nando, diminuindo ou inibindo a atividade dos receptores do fator de crescimento de fibroblastos (FGFR); c) compostos direcionando, dimi- nuindo ou inibindo a atividade do receptor I do fator de crescimento similar à insulina (IGF-IR), tal como compostos que direcionam, dimi- nuem ou inibem a atividade do IGF-IR, especialmente compostos que inibem a atividade da cinase do receptor IGF-I, ou anticorpos que dire- cionam o domínio extracelular do receptor IGF-I ou seus fatores de crescimento; d) compostos direcionando, diminuindo ou inibindo a ati- vidade da família da tirosina cinase do receptor Trk ou inibidores da efrina B4; e) compostos direcionando, diminuindo ou inibindo a ativi- dade da família da tirosina cinase do receptor AxI; f) compostos direci- onando, diminuindo ou inibindo a atividade do receptor tirosina cinase Ret; g) compostos direcionando, diminuindo ou inibindo a atividade do kit/receptor de tirosina cinase SCFR, tal como imatinibe; h) compostos direcionando, diminuindo ou inibindo a atividade das tirosina cinases do receptor C-kit, que fazem parte da família PDGFR, compostos tal como que direcionam, diminuem ou inibem a atividade da família da tirosina cinase do receptor c-Kit, especialmente compostos que inibem o receptor c-Kit, tal como imatinibe; i) compostos direcionando, dimi- nuindo ou inibindo a atividade de membros da família c-Abl, seus pro- dutos de fusão de genes (por exemplo, cinase BCR-Abl) e mutantes, tal como compostos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade de c-Abl membros da família e seus produtos de fusão gênica, tal co- mo um derivado de N-fenil-2-pirimidina-amina, tal como imatinibe ou nilotinibe (AMN107); PD180970; AG957; NSC 680410; PD173955 de Parke-Davis; ou dasatinibe (BMS-354825); j) compostos direcionando, diminuindo ou inibindo a atividade de membros da família da proteína cinase C (PKC) e Raf das serina/treonina cinases, membros da MEK, SRC, JAK/pan-JAK, FAK, PDK1, PKB/Akt, Família Ras/MAPK, PI3K, SYK, TYK2, BTK e TEC, e/ou membros da família da cinase depen- dente de ciclina (CDK) incluindo derivados de estaurosporina, tal como midostaurina; exemplos de outros compostos incluem UCN-01, safin- gol, BAY 43-9006, Briostatina 1, Perifosina; llmofosine; RO 318220 e RO 320432; GO 6976; lsis 3521; LY333531 / LY379196; compostos de isoquinolina; FTIs; PD184352 ou QAN697 (um inibidor de P13K) ou AT7519 (inibidor de CDK); k) compostos direcionando, diminuindo ou inibindo a atividade de inibidores de proteína-tirosina cinase, compos- tos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade de inibidores de proteína-tirosina cinase incluem mesilato de imatinibe (Gleevec™) ou tirfostina, como Tirfostina A23/RG- 50810; AG 99; Tyrphostin AG 213; Tyrphostin AG 1748; Tyrphostin AG 490; Tyrphostin B44; Enantiômero Tirfostina B44 (+); Tyrphostin AG 555; AG 494; Tirfostina AG 556, AG957 e adafostina (ácido 4 -{[(2,5-di-hidroxifenil)metil]amino}- benzóico adamantil éster; NSC 680410, adafostina); l) compostos dire- cionando, diminuindo ou inibindo a atividade da família do fator de crescimento epidérmico das tirosina cinases receptoras (EGFR1 ErbB2, ErbB3, ErbB4 como homo- ou heterodímeros) e seus mutan- tes, tal como compostos que direcionam, diminuem ou inibem a ativi- dade da família do receptor do fator de crescimento epidérmico são especialmente compostos, proteínas ou anticorpos que inibem mem- bros da família da tirosina cinase do receptor EGF, tal como receptor EGF, ErbB2, ErbB3 e ErbB4 ou se ligam a EGF ou ligantes relaciona- dos com EGF, CP 358774, ZD 1839, ZM 105180 ; trastuzumabe (Her- ceptin™), cetuximabe (Erbitux™), Iressa, Tarceva, OSI-774, Cl-1033,
EKB-569, GW-2016, E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6. 4, E2.11, E6.3 ou E7.6.3, e derivados de 7H-pirrolo-[2,3-d]pirimidina; m) compostos dire- cionando, diminuindo ou inibindo a atividade do receptor c-Met, com- postos que direcionam, diminuem ou inibem a atividade de c-Met, es- pecialmente compostos que inibem a atividade da cinase do receptor c-Met, ou anticorpos que direcionam o domínio extracelular de c-Met ou ligam-se a HG, n) compostos direcionando, diminuindo ou inibindo a atividade de cinase de um ou mais membros da família JAK (JAK1/JAK2/JAK3/TYK2 e/ou pan-JAK), incluindo, mas não se limitan- do a PRT-062070, SB-1578, baricitinibe, pacritinibe, momelotinibe, VX- 509, AZD -1480, TG-101348, tofacitinibe e ruxolitinibe; o ) compostos direcionando, diminuindo ou inibindo a atividade de cinase de PI3 ci- nase (PI3K) incluindo, mas não se limitando a ATU-027, SF-1126, DS- 7423, PBI-05204, GSK-2126458, ZSTK-474, buparlisibe, pictrelisibe, PF -4691502, BYL-719, dactolisibe, XL-147, XL-765 e idelalisibe; e; e p) compostos direcionando, diminuindo ou inibindo os efeitos de sinali- zação das vias da proteína hedgehog (Hh) ou do receptor suavizado (SMO), incluindo, mas não se limitando a ciclopamina, vismodegibe, itraconazol, erismodegibe e IPI-926 (saridegibe).
[00176] O termo "inibidor de PI3K", tal como aqui utilizado inclui, mas não está limitado a compostos com atividade inibidora contra uma ou mais enzimas da família da fosfatidilinositol-3-cinase, incluindo, mas não se limitando a PI3Kα, PI3Kγ, PI3Kδ, PI3Kβ , PI3K-C2α, PI3K- C2β, PI3K-C2γ, Vps34, p110-α, p110-β, p110-γ, p110-δ, p85-α, p85-β, p55-γ, p150, p101 e p87. Exemplos de inibidores de PI3K úteis nesta invenção incluem, mas não estão limitados a ATU-027, SF-1126, DS- 7423, PBI-05204, GSK-2126458, ZSTK-474, buparlisibe, pictrelisibe, PF-4691502, BYL-719, dactolisibe, XL-147, XL-765 e idelalisibe.
[00177] O termo "inibidor de Bcl-2", tal como aqui utilizado, inclui, mas não está limitado a compostos com atividade inibidora contra a proteína do linfoma 2 de células B (Bcl-2), incluindo, mas não se limi- tando a ABT-199, ABT-731 , ABT-737, apogossipol, inibidores pan-Bcl- 2 da Ascenta, curcumina (e seus análogos), inibidores duplos Bcl- 2/Bcl-xL (Infinity Pharmaceuticals/Novartis Pharmaceuticals), Ge- nasense (G3139), HA14-1 (e análogos deste; ver WO2008/118802), navitoclax (e seus análogos, ver US7.390.799), NH-1 (Shenayng Pharmaceutical University), obatoclax (e seus análogos, ver WO2004/106328), S-001 (Gloria Pharmaceuticals), TW compostos da série (Univ. de Michigan) e venetoclax. Em algumas modalidades, o inibidor de Bcl-2 é uma pequena molécula terapêutica. Em algumas modalidades, o inibidor de Bcl-2 é um peptidomimético.
[00178] O termo "inibidor de BTK", tal como aqui utilizado, inclui, mas não está limitado a compostos com atividade inibidora contra Ti- rosina Cinase de Bruton (BTK), incluindo, mas não se limitando a AVL- 292 e ibrutinibe.
[00179] O termo "inibidor de SYK", tal como aqui utilizado inclui, mas não está limitado a compostos com atividade inibidora contra tiro- sina cinase do baço (SYK), incluindo, mas não se limitando a PRT- 062070, R-343, R-333, Excellair, PRT-062607 e fostamatinibe.
[00180] Outros exemplos de compostos inibidores de BTK, e condi- ções tratáveis por tais compostos em combinação com compostos es- ta invenção podem ser encontrados em WO2008/039218 e WO2011/090760, a totalidade dos quais são incorporados aqui por re- ferência.
[00181] Outros exemplos de compostos inibidores de SYK, e condi- ções tratáveis por tais compostos em combinação com compostos es- ta invenção podem ser encontrados em WO2003/063794, WO2005/007623, e WO2006/078846, a totalidade dos quais é incorpo- rada aqui por referência.
[00182] Outros exemplos de compostos inibidores de PI3K, e con-
dições tratáveis por tais compostos em combinação com compostos esta invenção podem ser encontrados em WO2004/019973, WO2004/089925, WO2007/016176, US8,138,347, WO2002/088112, WO2007/084786, WO2007/129161, WO2006/122806, WO2005/113554, e WO2007/044729 a totalidade dos quais é incorpo- rada aqui por referência.
[00183] Outros exemplos de compostos inibidores de JAK, e condi- ções tratáveis por tais compostos em combinação com compostos es- ta invenção podem ser encontrados em WO2009/114512, WO2008/109943, WO2007/053452, WO2000/142246, e WO2007/070514, a totalidade dos quais é incorporada aqui por refe- rência.
[00184] Outros compostos anti-angiogênicos incluem compostos tendo outro mecanismo para sua atividade, por exemplo, não relacio- nado à inibição de proteína ou lipídeo cinase, por exemplo, talidomida (Thalomid™) e TNP-470.
[00185] Exemplos de inibidores de proteassoma úteis para o uso em combinação com os compostos da invenção incluem, porém não são limitados a, bortezomib, disulfiram, epigalocatequin-3-galato (EGCG), salinosporamida A, carfilzomib, ONX-0912, CEP-18770, e MLN9708.
[00186] Os compostos que alvejam, diminuem ou inibem a atividade de um lipídeo fosfatase são, por exemplo, inibidores de fosfatase 1, fosfatase 2A, ou CDC25, tal como ácido ocadaico ou um derivado des- te.
[00187] Os compostos que incluem processos de diferenciação ce- lular incluem, porém não são limitados a, ácido retinoico, α- γ- or δ- tocoferol ouα- γ- ouδ-tocotrienol.
[00188] O termo inibidor deciclooxigenase, como usado aqui, inclui, porém não é limitado a, inibidores de Cox-2, ácido 2-
arilaminofenilacético substituído por 5-alquila e derivados, tal como celecoxib (Celebrex™), rofecoxib (Vioxx™), etoricoxib, valdecoxib ou um ácido 5-alquil-2-arilaminofenilacático, tal comoo ácido 5-metil-2-(2'- cloro-6'-fluoroanilino)fenil acéticoe lumiracoxib.
[00189] O termo "bisfosfonatos" como usado aqui inclui, porém não é limitado a, ácido etridônico, clodrônico, tiludrônico, pamidrônico, alendrônico, ibandrônico, risedrônico e zoledrônico.O ácido etridônico é comercializado sob o nome comercial Didronel™.O ácido clodrônico é comercializado sob o nome comercial Bonefos™.O ácido tiludrônico é comercializado sob o nome comercial Skelid™. O ácido pamidrônico é comercializado sob o nome comercial Aredia™. O ácido alendrônico é comercializado sob o nome comercial Fosamax™. O ácido ibandrô- nico é comercializado sob o nome comercial Bondranat™. O ácido risedrônico é comercializado sob o nome comercial Actonel™. O áci- do zoledrônico é comercializado sob o nome comercial Zometa™. O termo "inibidores de mTOR" refere-se aos compostos que inibem o alvo mamífero de rapamicina (mTOR) e o qual possui atividade anti- proliferativa, tal como sirolimus (Rapamune®), everolimus (Certi- can™), CCI-779 e ABT578.
[00190] O termo "inibidor de heparanase" como usado aqui refere- se aos compostos que alvejam, diminuem ou inibem a degradação de sulfato de heparina. O termo inclui, porém não é limitado a, PI-88. O termo "modificador de reposta biológica" como usado aqui refere-se a uma linfocina ou interferonas.
[00191] O termo "inibidor de isoformas oncogênicas de Ras", tal como H-Ras, K-Ras, ou N-Ras, como usado aqui, refere-se aos com- postos que alvejam, diminuem ou inibem a atividade oncogênica de Ras; por exemplo, um "inibidor de farnesil transferase" tal como L- 744832, DK8G557 ou R115777 (Zarnestra™). O termo "inibidor de te- lomerase" como usado aqui refere-se aos compostos que alvejam, di-
minuem ou inibem a atividade de telomerase. Os compostos que alve- jam, diminuem ou inibem a atividade de telomerase são especialmente compostos que inibem o receptor de telomerase, tal como telomestati- na.
[00192] O termo "inibidor de metionina aminopeptidase" como usa- do aqui refere-se aos compostos que alvejam, diminuem ou inibem a atividade de metionina aminopeptidase. Os compostos que alvejam, diminuem ou inibem a atividade de metionina aminopeptidase incluem, porém não são limitados a, bengamida ou um derivado desta.
[00193] O termo "inibidor de proteassoma" como usado aqui refere- se aos compostos que alvejam, diminuem ou inibem a atividade da proteassoma. Os compostos que alvejam, diminuem ou inibem a ati- vidade da proteassoma incluem, porém não são limitados a, Borte- zomib (Velcade™) e MLN 341.
[00194] O termo "inibidor de metaloproteinase matriz" ou (inibidor de "MMP") como usado aqui inclui, porém não é limitado a, inibidores peptidomiméticos de colágeno e não peptidomiméticos, derivados de tetraciclina, por exemplo,batimastat de inibidor peptidomimético de hi- droxamato e seu análogo oralmente biodisponível marimastat (BB- 2516), prinomastat (AG3340), metastat (NSC 683551) BMS-279251, BAY 12-9566, TAA211 , MMI270B ou AAJ996.
[00195] O termo "compostos usados no tratamento de malignidades hematológicas" como usado aqui inclui, porém não é limitado a, inibi- dores de tirosina cinase tipo FMS, os quais são compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividade de receptores de tirosina cinase tipo FMS (Flt-3R); interferon, 1-β-D-arabinofuransilcitosina (ara-c) e bissul- fan; e inibidores de ALK, os quais são compostos que alvejam, dimi- nuem ou inibem linfoma cinase anaplástico.
[00196] Os compostos que alvejam, diminuem ou inibem a atividade de receptores de tirosina cinase tipo FMS (Flt-3R) são especialmente compostos, proteínas ou anticorpos que inibem membros da família cinase receptora de Flt-3R, tais como PKC412, midostaurina, um deri- vado deestaurosporina, SU11248 e MLN518.
[00197] O termo "inibidores de HSP90" como usado aqui, inclui, po- rém não é limitado a, compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividade de ATPase intrínsica de HSP90; degradando, alvejando, di- minuindo ou inibindo as proteínas clientes de HSP90 por meio da trilha de proteossoma de ubiquitina.Os compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividade intrínsica de ATPase de HSP90 são especialmente compostos, proteínas ou anticorpos que inibem a atividade de ATPase de HSP90, tal como 17-alilamino,17-demetoxigeldanamicina (17AAG), um derivado de geldanamicina; outros compostos relacionados com geldanamicina; radicicol e inibidores de HDAC.
[00198] O termo "anticorpos antiproliferativos" como usado aqui in- clui, porém não é limitado a, trastuzumabe (Herceptin™), Trastuzuma- be-DM1, erbitux, bevacizumabe (Avastin™), rituximabe (Rituxan®), PRO64553 (anti-CD40) e anticorpo 2C4.Por anticorpos é pretendido anticorpos monoclonais intactos, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos formados de pelo menos 2 anticorpos intactos, e fra- gmentos de anticorpos contanto que eles exibam a atividade biológica desejada.
[00199] Para o tratamento de leucemia mieloide aguda (AML), os compostos da atual invenção podem ser usados em combinação com terapias de leucemia padrão, especialmente em combinação com as terapias empregadas para o tratamento de AML. Em particular, dos compostos da atual invenção podem ser administrados em combina- ção com, por exemplo, inibidores de farnesil transferase e/ou outros fármacos úteis para o tratamento de AML, tais como Daunorubicina, Adriamicina, Ara-C, VP-16, Teniposídeo, Mitoxantrona, Idarubicina, Carboplatinae PKC412.
[00200] Outros compostos antileucêmicos incluem, por exemplo, Ara-C, um análogo de pirimidina, o qual é o derivado de 2'-alfa-hidróxi ribose (arabinosida) de desoxicitidina.Também incluído é o análogo de purina de hipoxantina, 6-mercaptopurina (6-MP) e fosfato de fludarabi- na. Os compostos que alvejam, diminuem ou inibem a atividade dos inibidores de histona desacetilase (HDAC) tais como butirato de sódio e ácido suberoilanilida hidroxâmico (SAHA) inibem a atividade das en- zimas conhecidas como histona desacetilases.Os inibidores de HDAC específicos incluem MS275, SAHA, FK228 (formerly FR901228), Tri- costatina A e os compostos descritos em US 6.552.065 incluindo, po- rém não limitado a, N-hidróxi-3-[4-[[[2-(2-metil-1H-indol-3-ila)-etil]- amino]metil]fenil]-2E-2-propenamida, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste e N-hidróxi-3-[4-[(2-hidroxietil){2-(1H-indol-3-ila)etil]- amino]metil]fenil]-2E-2-propenamida, ou umsal farmaceuticamente aceitável deste, especialmenteo sal de lactato. Os antagonistas de receptor de somatoestatina, como usados aqui, referem-se aos com- postos que alvejam, tratam ou inibem o receptor de somatoestatina tais como octreotédeoe SOM230.Os métodos prejudiciais à célula de tumor referem-se aos métodos tal como radiação de ionização. O ter- mo "radiação de ionização", referido acima e posteriormente, significa radiação de ionização que ocorre como raios eletromagnéticos (tais como raios-X e raios gama) ou partículas (tais como partículas alfa e beta).A radiação de ionização é fornecida em, porém não limitado a, terapia de radiação e é conhecida na técnica. Ver Hellman, Principles of Radiation Therapy, Cancer, in Principles and Practice of Oncology, Devita e outro(s), Eds., 4ª Edição, Vol. 1 , pp. 248-275 (1993).
[00201] Também incluídos são os aglutinantes de EDG e os inibido- res de ribonucleotídeo reductase. O termo "aglutinantes de EDG", co- mo usado aqui, refere-se a uma classe de imunossupressores que modulam a recirculação de linfócito, tal como FTY720. O termo "inibi-
dores de ribonucleotídeo reductase" refere-se aos análogos de nu- cleosídeo de purina ou pirimidina incluindo, porém não limitado a, flu- darabinae/ou arabinosídeo de citosina (ara-C), 6-tioguanina, 5- fluorouracila, cladribina, 6-mercaptopurina (especialmente em combi- nação com ara-C contra ALL) e/ou pentostatina. Os inibidores de ri- bonucleotídeo reductase sãoespecialmentehidróxiureia ou derivados de 2-hidróxi-1H-isoindol-1,3-diona.
[00202] Também incluídos são, em particular, aqueles compostos, proteínas ou anticorpos monoclonais de VEGF tal como: 1-(4- cloroanilino)-4-(4-piridilmetil)ftalazina ou umsal farmaceuticamente aceitável deste, sucinato de 1-(4-cloroanilino)-4-(4-piridilmetil)ftalazina; Angiostatin™; Endostatin™; amidas de ácido antranílico; ZD4190; Zd6474; SU5416; SU6668; bevacizumab; ou anticorpos anti-VEGF ou anticorpos de receptor anti-VEGF, tais como rhuMabe e RHUFab, ap- tâmero de VEGF tal como Macugon; inibidores de FLT-4, inibidores de FLT-3, anticorpo IgGl VEGFR-2, Angiozima (RPI 4610) e Bevacizuma- be (Avastin™).
[00203] A terapia fotodinâmica, como empregada aqui, refere-se à terapia que usa certos químicos conhecidos como compostos de fo- tossensibilização para tratar ou prevenir cânceres. Exemplos de tera- pia fotodinâmica incluem o tratamento com os compostos, tal como Visudyne™ e porfímero de sódio.
[00204] Os esteroides angioestáticos, como usados aqui, referem- se aos compostos que bloqueiam ou inibem a angiogênese, tal como, por exemplo, anecortave, triancinolona, hidrocortisona, 11-α-epi- idrocotisol, cortexolona, 17α-hidroxiprogesterona, corticosterona, de- soxicorticosterona, testosterona, estrona e dexametasona.
[00205] Os implantes contendo corticosteroides referem-se aos compostos, tais como fluocinolona e dexametasona.
[00206] Outros compostos quimioterapêuticos incluem, porém não são limitados a: alcaloides de planta, compostos hormonaise antago- nistas; modificadores de resposta biológica, preferivelmente linfocinas ou interferonas; oligonucleotídeos antissentido ou derivados de oligo- nucleotídeo; shRNA ou siRNA; ou compostos heterogêneos ou com- postos com outro ou desconhecido mecanismo de ação.
[00207] A estrutura dos compostos ativos identificados por números códigos, genéricos ou nomes comerciais pode ser tirada da edição atual do compêndio padrão "The Merck Index" ou da base de dados, por exemplo, Patentes Internacionais (por exemplo, Publicações Mun- diais IMS). Agentes de Imuno-Oncologia exemplares
[00208] Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes tera- pêuticos é um agente de imuno-oncologia.Como usado aqui, o termo "um agente de imuno-oncologia" refere-se a um agente que é eficaz para realçar, estimular e/ou super-regular as respostas imunes em um indivíduo.Em algumas modalidades, a administração de um agente de imuno-oncologia com um composto da invenção possui um efeito si- nergético no tratamento de um câncer.
[00209] Um agente de imuno-oncologia pode ser, por exemplo, um fármaco de molécula pequena, um anticorpo, ou uma molécula bioló- gica ou pequena. Exemplos de agentes de imuno-oncologia biológicos incluem, porém não são limitados a, vacinas de câncer, anticorpos e citocinas. Em algumas modalidades, um anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal é humanizado ou humano.
[00210] Em algumas modalidades, um agente de imuno-oncologia é (i) um agonista de um receptor estimulatório (incluindo um coestimula- tório) ou (ii) um antagonista de um sinal inibitório (incluindo um coinibi- tório) em células T, ambos os quais resultam na amplificação das res- postas de célula T específicas de antígeno.
[00211] Certas moléculas estimulatórias e inibitórias são membros da super família de imunoglobulina (IgSF).Uma família importante de ligantes ligados por membrana que liga-se aos receptores coestimula- tórios ou coinibitórios é a família B7, que inclui B7-1, B7-2, B7-H1 (PD- L1), B7-DC (PD-L2), B7-H2 (ICOS-L), B7-H3, B7-H4, B7-H5 (VISTA), e B7-H6.Outra família de ligantes ligados por membrana que liga-se aos receptores coestimulatórios ou co-inibitórios é a família TNF de molé- culas que ligam-se aos membros da família do receptor TNF cognato, os quais incluem CD40 e CD40L, OX-40, OX-40L, CD70, CD27L, CD30, CD30L, 4-1BBL, CD137 (4-1BB), TRAIL/Apo2-L, TRAILR1/DR4, TRAILR2/DR5, TRAILR3, TRAILR4, OPG, RANK, RANKL, TWEAKR/Fn14, TWEAK, BAFFR, EDAR, XEDAR, TACI, APRIL, BCMA, LTβR, LIGHT, DcR3, HVEM, VEGI/TL1A, TRAMP/DR3, EDAR, EDA1, XEDAR, EDA2, TNFR1, Linfotoxina α/TNFβ, TNFR2, TNFα, LTβR, Linfotoxina α1β2, FAS, FASL, RELT, DR6, TROY e NGFR.
[00212] Em algumas modalidades, um agente de imuno-oncologia é uma citocina que inibe a ativação da célula T (por exemplo, IL-6, IL-10, TGF-β, VEGF, e outras citocinas imunossupressivas) ou uma citocina que estimula a ativação da célula T, para estimular uma resposta imu- ne.
[00213] Em algumas modalidades, uma combinação de um com- posto da invençãoe um agente de imuno-oncologia pode estimular as respostas da célula T. Em algumas modalidades, um agente de imu- no-oncologia é: (i) um antagonista de uma proteína que inibe a ativa- ção da célula T (por exemplo, inibidores do ponto de verificação imu- ne) tais como CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, TIM-3, Galectina 9, CEACAM-1, BTLA, CD69, Galectina-1, TIGIT, CD113, GPR56, VIS- TA, 2B4, CD48, GARP, PD1H, LAIR1, TIM-1, e TIM-4; ou (ii) um ago- nista de uma proteína que estimula a ativação da célula T tais como
B7-1, B7-2, CD28, 4-1BB (CD137), 4-1BBL, ICOS, ICOS-L, OX40, OX40L, GITR, GITRL, CD70, CD27, CD40, DR3 e CD28H.
[00214] Em algumas modalidades, um agente de imuno-oncologia é um antagonista de receptores inibitórios nas células NK ou um agonis- ta de receptores de ativação nas células NK. Em algumas modalida- des, um agente de imuno-oncologia é um antagonista de KIR, tal como lirilumabe.
[00215] Em algumas modalidades, um agente de imuno-oncologia é um agente que inibe ou esgota os macrófagos ou monócitos, incluin- do,porém não limitado a, antagonistas de CSF-1R tais como anticor- pos de antagonista de CSF-1R incluindo RG7155 (WO 2011/70024, WO 2011/107553, WO 2011/131407, WO 2013/87699, WO 2013/119716, WO 2013/132044) or FPA-008 (WO 2011/140249; WO 2013/169264; WO 2014/036357).
[00216] Em algumas modalidades, um agente de imuno-oncologia é selecionado de agentes agonísticos que ligam receptores coestimula- tórios positivos, agentes de bloqueio que atenuam a sinalização atra- vés dos receptores inibitórios, antagonistas, e um ou mais agentes que aumentam sistemicamente a frequência de células T antitumor, agen- tes que superam as distintas trilhas supressoras imunes dentro do mi- croambinete do tumor (por exemplo, comprometimento do receptor inibitório de bloqueio (por exemplo, interações PD-L1/PD-1), esgota ou inibe Tregs (por exemplo, empregando-se um anticorpo monoclonal anti-CD25 (por exemplo, daclizumab) ou por depleção de conta anti- CD25ex vivo), inibe as enzimas metabólicas tal como IDO, ou rever- ter/prevenir a exaustão ou energia de célula T) e agentes que causam a ativação imune inata e/ou inflamação em sítios de tumor.
[00217] Em algumas modalidades, um agente de imuno-oncologia é um antagonista CTLA-4. Em algumas modalidades, um antagonista CTLA-4 é um anticorpo CTLA-4 antagonístico. Em algumas modalida-
des, um anticorpo CTLA-4 antagonístico é YERVOY (ipilimumabe) ou tremelimumabe.
[00218] Em algumas modalidades, um agente de imuno-oncologia é um antagonista PD-1. Em algumas modalidades, um antagonista PD- 1 é administrado por infusão. Em algumas modalidades, um agente de imuno-oncologia é um anticorpo ou uma porção de ligação de antí- geno deste que liga-se especificamente a um receptor de Morte Pro- gramada-1 (PD-1) e inibe a atividade de PD-1. Em algumas modali- dades, um antagonista PD-1 é um anticorpo PD-1 antagonístico. Em algumas modalidades, um anticorpo PD-1 antagonístico é OPDIVO (nivolumabe), KEYTRUDA (pembrolizumabe), ou MEDI-0680 (AMP- 514; WO2012/145493). Em algumas modalidades, um agente de imu- no-oncologia pode ser pidilizumabe (CT-011). Em algumas modalida- des, um agente de imuno-oncologia é uma proteína recombinante composta do domínio extracelular de PD-L2 (B7-DC) fundida à porção Fc de IgG1, chamada AMP-224.
[00219] Em algumas modalidades, um agente de imuno-oncologia é um antagonista PD-L1. Em algumas modalidades, um antagonista PD-L1é um anticorpo PD-L1 antagonístico. Em algumas modalidades, um anticorpo PD-L1 é MPDL3280A (RG7446; WO2010/077634), dur- valumabe (MEDI4736), BMS-936559 (WO2007/005874), e MSB0010718C (WO2013/79174).
[00220] Em algumas modalidades, um agente de imuno-oncologia é um antagonista LAG-3. Em algumas modalidades, um antagonista LAG-3 é um anticorpo LAG-3 antagonístico. Em algumas modalida- des, um anticorpo LAG3 é BMS-986016 (WO 2010/19570, WO 2014/08218), ou IMP-731 ou IMP-321 (WO 2008/132601, WO 2009/44273).
[00221] Em algumas modalidades, um agente de imuno-oncologia é um agonista CD137 (4-1BB). Em algumas modalidades, um agonista
CD137 (4-1BB) é um anticorpo CD137 agonístico. Em algumas moda- lidades, um anticorpo CD137 é urelumabe ou PF-05082566 (WO 2012/32433).
[00222] Em algumas modalidades, um agente de imuno-oncologia é um agonista GITR. Em algumas modalidades, um agonista GITR é um anticorpo GITR agonístico. Em algumas modalidades, um anticor- po GITR é BMS-986153, BMS-986156, TRX-518 (WO 2006/105021, WO 2009/009116), ou MK-4166 (WO 2011/028683).
[00223] Em algumas modalidades, um agente de imuno-oncologia é um antagonista indoleamina (2,3)-dioxigenase (IDO). Em algumas mo- dalidades, um antagonista IDO é selecionado de: epacadostat (INCB024360, Incyte); indoximode (NLG-8189, NewLink Genetics Cor- poration); capmanitibe (INC280, Novartis); GDC-0919 (Genen- tech/Roche); PF-06840003 (Pfizer); BMS:F001287 (Bristol-Myers Squibb); Phy906/KD108 (Phytoceutica); uma enzima que quebra a ci- nurenina (Kynase, Kyn Therapeutics); e NLG-919 (WO 2009/73620, WO 2009/1156652, WO 2011/56652, WO 2012/142237).
[00224] Em algumas modalidades, um agente de imuno-oncologia é um agonista de OX40. Em algumas modalidades, um agonista de OX40 é um anticorpo OX40 agonístico. Em algumas modalidades, um anticorpo OX40 é MEDI-6383 ou MEDI-6469.
[00225] Em algumas modalidades, um agente de imuno-oncologia é um antagonista de OX40L. Em algumas modalidades, um antagonista de OX40L é um anticorpo OX40 antagonístico. Em algumas modali- dades, um antagonista de OX40L é RG-7888 (WO 2006/029879).
[00226] Em algumas modalidades, um agente de imuno-oncologia é um agonista de CD40. Em algumas modalidades, um agonista de CD40 é um anticorpo CD40 agonístico. Em algumas modalidades, um agente de imuno-oncologia é um antagonista de CD40. Em algumas modalidades, um antagonista de CD40 é um anticorpo CD40 antago-
nístico. Em algumas modalidades, um anticorpo CD40 é lucatumuma- be ou dacetuzumabe.
[00227] Em algumas modalidades, um agente de imuno-oncologia é um agonista de CD27. Em algumas modalidades, um agonista de CD27 é um anticorpo CD27 agonístico. Em algumas modalidades, um anticorpo CD27 é varlilumabe.
[00228] Em algumas modalidades, um agente de imuno-oncologia é MGA271 (para B7H3) (WO 2011/109400).
[00229] Em algumas modalidades, um agente de imuno-oncologia é abagovomabe, adecatumumabe, afutuzumabe, alemtuzumabe, ana- tumomabe mafenatox, apolizumabe, atezolimabe, avelumabe, blina- tumomabe, BMS-936559, catumaxomabe, durvalumabe, epacadostat, epratuzumabe, indoximode, inotuzumabe ozogamicina, intelumumabe, ipilimumabe, isatuximabe, lambrolizumabe, MED14736, MPDL3280A, nivolumabe, obinutuzumabe, ocaratuzumabe, ofatumumabe, olatatu- mabe, pembrolizumabe, pidilizumabe, rituximabe, ticilimumabe, sama- lizumabe, ou tremelimumabe.
[00230] Em algumas modalidades, um agente de imuno-oncologia é um agente imunoestimulatório. Por exemplo, os anticorpos bloqueando os eixos inibitórios PD-1 e PD-L1 podem desencadear células T reati- vas de tumor ativadas e ter sido mostrado em testes clínicos induzirem respostas antitumor duráveis no aumento de números de histologias de tumor, incluindo alguns tipos de tumor que convencionalmente não foram considerados sensíveis à imunoterapia. Ver, por exemplo, Oka- zaki, T. e outro(s) (2013) Nat. Immunol. 14, 1212–1218; Zou outro(s) (2016) Sci. Transl. Med. 8.O anticorpo anti-PD-1 nivolumabe (Opdivo®, Bristol-Myers Squibb, também conhecido como ONO-4538, MDX1106 e BMS-936558), exibiu potencial para melhorar a sobrevivência geral em pacientes com carcinoma de célula clara renal (RCC) que experi- mentou a progressão da doença durante ou após a terapia antiangio-
gênica anterior.
[00231] Em algumas modalidades,o terapêutico imunomodulatório especificamente induz a apoptose das células de tumor. Os terapêuti- cos imunomodulatórios aprovados que podem ser usados na presente invenção incluem: pomalidomida (Pomalyst®, Celgene); lenalidomida (Revlimid®, Celgene); mebutato de ingenol (Picato®, LEO Pharma).
[00232] Em algumas modalidades, um agente de imuno-oncologia é uma vacina contra câncer. Em algumas modalidades, a vacina contra câncer é selecionada de: sipuleucel-T (Provenge®, Dendreon/Valeant Pharmaceuticals), que foi aprovada para o tratamento de câncer de próstata resistente à castração metastático (hormônio-refratário) assin- tomático ou minimamente sintomático; e talimogene laherparepvec (Imlygic®, BioVex/Amgen, previamente conhecido como T-VEC), uma terapia viral oncolítica geneticamente modificada aprovada para o tra- tamento de lesões nodais cutâneas irressecáveis e subcutâneas em melanoma. Em algumas modalidades, um agente de imuno-oncologia é selecionado de uma terapia viral oncolítica tal como pexastimogene devacirepvec (PexaVec/JX-594, SillaJen/formerly Jennerex Biothera- peutics), um vírus vacínia deficiente de timidinacinase (TK-) modificado para expressar GM-CSF, para carcinoma hepatocelular (NCT02562755) e melanoma (NCT00429312); pelareorep (Reolysin®, Oncolytics Biotech), uma variante do vírus órfão entérico respiratório (reovírus) que não replica em células que não são ativadas por RAS, em numerosos cânceres, incluindo câncer colorretal (NCT01622543); câncer de próstata (NCT01619813); câncer de célula escamosa de cabeça e pescoço (NCT01166542);adenocarcinoma pancreático (NCT00998322); e câncer de pulmão de célula não pequena (NSCLC) (NCT 00861627); enadenotucirev (NG-348, PsiOxus, anteriormente conhecido como ColoAd1), um adenovírus modificado para expressar um CD80 de tamanho natural e um fragmento de anticorpo específico para a proteína CD3 receptora de célula T, em câncer de ovário (NCT02028117); tumores epiteliais metastáticos ou avançados tais como em câncer colorretal, câncer de bexiga, carcinoma de célula es- camosa de cabeça e pescoço e câncer da glândula salivar (NCT02636036); ONCOS-102 (Targovax/formerly Oncos), um adeno- vírus modificado para expressar GM-CSF, em melanoma (NCT03003676); e doença peritoneal, câncer colorretal ou câncer de ovário (NCT02963831); GL-ONC1 (GLV-1h68/GLV-1h153, Genelux GmbH), vírus de vacínia modificado para expressar o symporterbeta- galactosidase (beta-gal)/beta-glucoronidase ou beta-gal/iodeto de só- dio humano (hNIS), respectivamente, foram estudados em carcinoma- tose peritoneal (NCT01443260); câncer das trompas de falópio, câncer de ovário (NCT 02759588); ou CG0070 (Cold Genesys), um adenoví- rus modificado para expressar GM-CSF, em câncer de bexiga (NCT02365818).
[00233] Em algumas modalidades, um agente de imuno-oncologia é selecionado de: JX-929 (SillaJen/anteriormente Jennerex Biotherapeu- tics), um vírus de vacínia deficiente do fator de crescimento de vacínia e TK modificado para expressar a citosina desaminase, que é capaz de converter o pró-fármaco 5-fluorocitosina em 5-fluorouracila de fár- maco citotóxico; TG01 e TG02 (Targovax/anteriormente Oncos), agen- tes de imunoterapia com base em peptídeo alvejados para mutações RAS difíceis de tratar; e TILT-123 (TILT Biotherapeutics), um adenoví- rus modificado designado: Ad5/3-E2F-delta24-hTNFα-IRES-hIL20; e VSV-GP (ViraTherapeutics) um vírus de estomatite vesicular (VSV) modificado para expressar a glicoproteína (GP) do vírus de coriome- ningite linfocítica (LCMV), que pode ser também modificado para ex- pressar os antígenos designados para aumentar uma resposta de cé- lula T CD8+específica de antígeno.
[00234] Em algumas modalidades, um agente de imuno-oncologia é uma célula T modificada para expressar um receptor de antígeno qui- mérico ou CAR.As células T modificadas para expressar tal receptor de antígeno quimérico são referidas como células CAR-T.
[00235] CARs foi construído que consistem em domínios de liga- ção, os quais podem ser derivados de ligantes naturais, fragmentos variáveis de cadeia única (scFv) derivados de anticorpos monoclonais específicos para antígenos de superfície celular, fundidos aos en- dodomínios que são as terminações funcionais do receptor de célula T (TCR), tal como o domínio de sinalização de CD3-zeta de TCRs, que é capaz de gerar um sinal de ativação em linfócitos T.Na ligação de an- tígeno, tais CARs ligam-se às trilhas de sinalização endógenas na cé- lula efetora e geram sinais de ativação similares àqueles iniciados pelo complexo TCR.
[00236] Por exemplo, em algumas modalidades, a célula CAR-T é uma daquelas descritas na Patente dos Estados Unidos 8.906.682 (in- corporada aqui por referência em sua totalidade), que descreve as cé- lulas CAR-T modificadas para compreender um domínio extracelular tendo um domínio de ligação de antígeno (tal como um domínio que liga-se a CD19),fundido a um domínio de sinalização intracelular da cadeia zeta do complexo do receptor de antígeno de célula T (tal como CD3 zeta).Quando expresso na célula T, o CAR é capaz de redire- cionar o reconhecimento de antígeno com base na especificidade de ligação do antígeno. No caso de CD19, o antígeno é expresso em cé- lulas B malignas.Mais de 200 testes clínicos estão atualmente em pro- gresso empregando-se CAR-T em uma ampla faixa de indicações. [https://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=chimeric+antigen+receptors& pg=1].
[00237] Em algumas modalidades, um agente imunoestimulatório é um ativador de receptor  órfão relacionado ao receptor de ácido reti- noico (RORt). RORt é um fator de transcrição com papéis funda-
mentais na diferenciação e manutenção de 17 tipos de subgrupos efe- tores de células T CD4+ (Th17) e CD8+ (Tc17), bem como a diferenci- ação de subpopulações de célula imune inata expressando IL-17 tais como as células NK. Em algumas modalidades, um ativador de RORt é LYC-55716 (Lycera), o qual está atualmente sendo avaliado em tes- tes clínicos para o tratamento de tumores sólidos (NCT02929862).
[00238] Em algumas modalidades, um agente imunoestimulatório é um agonista ou ativador de um receptor tipoToll (TLR). Os ativadores adequados de TLRs incluem um agonista ou ativador de TLR9 tal co- mo SD-101 (Dynavax). SD-101 é um CpG imunoestimulatório que es- tá sendo estudado para célula B, folicular e outros linfomas (NCT02254772).Os agonistas ou ativadores de TLR8 os quais podem ser usados na presente invenção incluem motolimode (VTX-2337, VentiRx Pharmaceuticals) o qual está sendo estudado para câncer de célula escamosa da cabeça e pescoço (NCT02124850) e câncer de ovário (NCT02431559).
[00239] Outros agentes de imuno-oncologias que podem ser usa- dos na presente invenção incluem: urelumabe (BMS-663513, Bristol- Myers Squibb), um anticorpo monoclonal anti-CD137; varlilumabe (CDX-1127, Celldex Therapeutics), um anticorpo monoclonal anti- CD27; BMS-986178 (Bristol-Myers Squibb), um anticorpo monoclonal anti-OX40; lirilumabe (IPH2102/BMS-986015, Innate Pharma, Bristol- Myers Squibb), um anticorpo monoclonal anti-KIR; monalizumabe (IPH2201, Innate Pharma, AstraZeneca) um anticorpo monoclonal anti- NKG2A; andecaliximabe (GS-5745, Gilead Sciences), um anticorpo anti-MMP9; e MK-4166 (Merck & Co.), um anticorpo monoclonal anti- GITR.
[00240] Em algumas modalidades, um agente imunoestimulatório é selecionado de elotuzumabe, mifamurtide, um agonista ou ativador de um receptor tipoTolle um ativador de RORt.
[00241] Em algumas modalidades, um terapêutico imunoestimulatório é interleucina 15 humana recombinante (rhIL-15). rhIL-15 foi testada na clínica como uma terapia para melanoma e carcinoma de célula renal (NCT01021059 e NCT01369888) e leucemias (NCT02689453). Em al- gumas modalidades, um agente imunoestimulatório é interleucina 12 humana recombinante (rhIL-12). Em algumas modalidades, uma IL-15 baseada no imunoterapêutico é IL-15 heterodimérica (hetIL-15, Novar- tis/Admune), um complexo de fusão composto de uma forma sintética de IL-15 endógena complexado para a cadeia alfa do receptor de IL-15 de proteína de ligação de IL-15 solúvel (IL15:sIL-15RA), que foi testado na fase 1 dos testes clínicos para melanoma, carcinoma de célula renal, câncer de pulmão de célula não pequena e carcinoma de célula escamo- sa de cabeça e pescoço (NCT02452268). Em algumas modalidades, uma interleucina 12 humana recombinante (rhIL-12) é NM-IL-12 (Neu- medicines, Inc.), NCT02544724, ou NCT02542124.
[00242] Em algumas modalidades, um agente de imuno-oncologia é selecionado daqueles descritos em Jerry L. Adams e outro(s), "Big op- portunities for small moleculesin immuno-oncology," Cancer Therapy 2015, Vol. 14, páginas 603-622, o conteúdo do qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, um agen- te de imuno-oncologia é selecionado dos exemplos descritos na Tabe- la 1 de Jerry L. Adams e outro(s). Em algumas modalidades, um agente de imuno-oncologia é uma molécula pequena alvejando um alvo de imuno-oncologia selecionado daqueles listados na Tabela 2 de Jerry L. Adams e outro(s). Em algumas modalidades, um agente de imuno-oncologiaé um agente de molécula pequena selecionado da- queles listados na Tabela 2 de Jerry L. Adams e outro(s).
[00243] Em algumas modalidades, um agente de imuno-oncologia é selecionado dos agentes de imuno-oncologia de molécula pequena descritos em Peter L. Toogood, "Small molecule imuno-oncologia the-
rapeutic agents," Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2018, Vol. 28, páginas 319-329, o conteúdo do qual é incorporado aqui por refe- rência em sua totalidade. Em algumas modalidades, um agente de imuno-oncologiaé um agente alvejando as trilhas como descrito em Peter L. Toogood.
[00244] Em algumas modalidades, um agente de imuno-oncologia é selecionado daqueles descritos em Sandra L. Ross e outro(s)., "Bispe- cific T cell engager (BiTE® ) antibody constructs can mediate bystan- der tumor cell killing", PLoS ONE 12(8): e0183390, o conteúdo do qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade. Em algumas mo- dalidades, um agente de imuno-oncologia é uma construção de anti- corpo engatador de célula T biespecífica (BiTE®). Em algumas moda- lidades, uma construção de anticorpo engatador de célula T biespecífi- ca (BiTE®) é uma construção de anticorpo biespecífico CD19/CD3. Em algumas modalidades, uma construção de anticorpo engatador de célula T biespecífica (BiTE®) é uma construção de anticorpo biespecí- fico EGFR/CD3. Em algumas modalidades, uma construção de anti- corpo engatador de célula T biespecífica (BiTE®) ativa as células T. Em algumas modalidades, uma construção de anticorpo engatador de célula T biespecífica (BiTE®) ativa as células T, a qual libera citocinas induzindo a super-regulação da molécula 1 de adesão intercelular (ICAM-1) eFAZ nas células circunstantes. Em algumas modalidades, uma construção de anticorpo engatador de célula T biespecífica (Bi- TE®) ativa as células T que resultam na lise de célula circunstante in- duzida. Em algumas modalidades, as células circunstantes estão em tumores sólidos.Em algumas modalidades, as células circunstantes sendo lisadas estão em proximidade às células T ativadas por BiTE®. Em algumas modalidades, as células circunstantes compreendem cé- lulas de câncer negativas de antígeno associadas ao tumor (TAA). Em algumas modalidades, as células circunstantes compreendem as célu-
las de câncer negativas de EGFR.Em algumas modalidades, um agen- te de imuno-oncologiaé um anticorpo que bloqueia o eixo PD-L1/PD1 e/ou CTLA4. Em algumas modalidades, um agente de imuno- oncologia é uma célula T de infiltração de tumor expandidoexvivo. Em algumas modalidades, um agente de imuno-oncologia é uma constru- ção de anticorpo biespecífico ou receptores de antígeno quiméricos (CARs) que diretamente conecta-se às células T com antígenos de superfície associados ao tumor (TAAs). Inibidores de Ponto de controle Imune Exemplares
[00245] Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico é um inibidor de ponto de controle imune como descrito aqui.
[00246] O termo "inibidor de ponto de controle" como usado aqui se refere a agentes úteis na prevenção de células cancerosas para evitar o sistema imunológico do paciente. Um dos principais mecanismos de subversão de imunidade antitumoral é conhecido como "exaustão de células T", que resulta de exposição crônica a antígenos que levou à regulação positiva dos receptores inibitórios. Esses receptores inibitó- rios servem como pontos de controle imune para prevenir reações imunológicas descontroladas.
[00247] PD-1 e receptores co-inibitórios tais como antígeno 4 de linfócito T citotóxico (CTLA-4, Atenuadores de Linfócito B e T (BTLA; CD272), Imunoglobulina de célula T e domínio 3 de Mucina (Tim-3), Gene de Ativação de Linfócito 3 (Lag-3; CD223), e outros são frequen- temente referidos como reguladores de ponto de controle. Eles agem como "guardiões" moleculares que permitem que a informação extra- celular dite se a progressão do ciclo celular e outros processos de si- nalização intracelular devem prosseguir.
[00248] Em algumas modalidades, um inibidor de ponto de controle imune é um anticorpo para PD-1. PD-1 se liga ao receptor de morte celular programada 1 (PD-1) para evitar que o receptor se ligue ao li-
gante inibitório PDL-1, substituindo assim a capacidade dos tumores de suprimir a resposta imune antitumoral do hospedeiro.
[00249] Em um aspecto, o inibidor de ponto de controle é um tera- pêutico biológico ou uma pequena molécula. Em outro aspecto, o ini- bidor de ponto de controle é um anticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado, um anticorpo totalmente humano, uma proteína de fusão ou uma combinação dos mesmos. Em um outro aspecto, o inibidor de ponto de controle inibe uma proteína de ponto de controle selecionada de CTLA-4, PDLl, PDL2, PDl, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, ligantes da família B-7 ou uma combinação dos mesmos. Em um aspecto adicional, o inibidor de ponto de controle interage com um ligante de uma proteína de ponto de controle selecionada de CTLA-4, PDLl, PDL2, PDl, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, ligantes da família B-7 ou uma combinação dos mesmos. Em um aspecto, o inibidor de ponto de controle é um agente imunoestimulador, um fator de crescimento de células T, uma interleucina, um anticorpo, uma va- cina ou uma combinação dos mesmos. Em um outro aspecto, a inter- leucina é IL-7 ou IL-15. Em um aspecto específico, a interleucina é IL-7 glicosilada. Em um aspecto adicional, a vacina é uma vacina de célu- las dendríticas (DC).
[00250] Inibidores de ponto de controle incluem qualquer agente que qualquer agente que bloqueia ou inibe, de maneira estatisticamen- te significante, as vias inibitórias do sistema imunológico. Tais inibido- res podem incluir inibidores de moléculas pequenas ou podem incluir anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que se ligam a e bloqueiam ou inibem os receptores de ponto de controle imune ou anticorpos que se ligam a e bloqueiam ou inibem ligantes de receptor de ponto de controle imune. Moléculas de ponto de controle ilustrativas que podem ser direcionadas para bloqueio ou inibição in- cluem, mas não são limitadas a, CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, GAL9, LAG3, TIM3, VISTA, KIR, 2B4 (pertence à família de moléculas CD2 e é expressa em todas as células T NK, γδ e CD8 + (αβ) de memória), CD160 (também referida como BY55), CGEN-15049, CHK 1 e CHK2 cinases, A2aR, e vários ligantes de fa- mília B-7. Ligantes de família B7 incluem, mas não são limitados a, B7- 1, B7-2, B7-DC, B7-H1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H5, B7-H6 e B7-H7. Inibidores de ponto de controle incluem anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, outras proteínas de ligação, terapêu- ticos biológicos ou pequenas moléculas que se ligam a e bloqueiam ou inibem a atividade de um ou mais de CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD 160 e CGEN-
15049. Inibidores de ponto de controle imune ilustrativos incluem Tre- melimumabe (anticorpo de bloqueio de CTLA-4), anti-OX40, Anticorpo monoclonal PD-Ll (Anti-B7-Hl; MEDI4736), MK-3475 (bloqueador de PD-1), Nivolumabe (anticorpo anti-PDl), CT-011 (anticorpo anti-PDl), anticorpo monoclonal BY55, AMP224 (anticorpo anti-PDLl), BMS- 936559 (anticorpo anti-PDLl), MPLDL3280A (anticorpo anti-PDLl), MSB0010718C (anticorpo anti-PDLl), e ipilimumabe (inibidor de ponto de controle anti-CTLA-4). Ligantes de proteína de ponto de controle incluem, mas não são limitados a PD-Ll, PD-L2, B7-H3, B7-H4, CD28, CD86 e TIM-3
[00251] Em certas modalidades, o inibidor de ponto de controle imune é selecionado de um antagonista de PD-1, um antagonista de PD-L1 e um antagonista de CTLA-4. Em algumas modalidades, o ini- bidor de ponto de controle é selecionado do grupo consistindo em ni- volumabe (Opdivo®), ipilimumabe (Yervoy®), e pembrolizumabe (Keytruda®). Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de controle é selecionado de: nivolumabe (anticorpo anti-PD-1, Opdivo®, Bristol-
Myers Squibb); pembrolizumabe (anticorpo anti-PD-1, Keytruda®, Merck); ipilimumabe (anticorpo anti-CTLA-4, Yervoy®, Bristol-Myers Squibb); durvalumabe (anticorpo anti-PD-L1, Imfinzi®, AstraZeneca); e atezolizumabe (anticorpo anti-PD-L1, Tecentriq®, Genentech).
[00252] Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de controle é selecionado do grupo consistindo em lambrolizumabe (MK-3475), nivo- lumabe (BMS-936558), pidilizumabe (CT-011), AMP-224, MDX-1105, MEDI4736, MPDL3280A, BMS-936559, ipilimumabe, lirlumabe, IPH2101, pembrolizumabe (Keytruda®), e tremelimumabe.
[00253] Em algumas modalidades, um inibidor de ponto de controle imune é: REGN2810 (Regeneron), um anticorpo anti-PD-1 testado em pacientes com carcinoma de célula basal (NCT03132636); NSCLC (NCT03088540); carcinoma de células escamosas cutâneo (NCT02760498); linfoma (NCT02651662); e melanoma (NCT03002376); pidilizumabe (CureTech), também conhecido como CT-011, um anticorpo que se liga a PD-1, em ensaios clínicos para linfoma de células B grandes difusas e mieloma múltiplob; avelumabe (Bavencio®, Pfizer/Merck KGaA), também conhecido como MSB0010718C), um anticorpo IgG1 anti-PD-L1 totalmente humano, em ensaios clínicos para câncer de pulmão de células não pequenas, carcinoma de células Merkel, mesotelioma, tumores sólidos, câncer renal, câncer de ovário, câncer de bexiga, câncer de cabeça e pesco- ço e câncer gástrico; ou PDR001 (Novartis), um anticorpo inibitório que se liga a PD-1, em ensaios clínicos para câncer de pulmão de células não pequenas, melanoma, câncer de mama triplo negativo e tumores sólidos avançados ou metastáticos. Tremelimumabe (CP-675,206; As- trazeneca) é um anticorpo monoclonal totalmente humano contra CTLA-4 que foi estudado em ensaios clínicos para várias indicações, incluindo: mesotelioma, câncer colorretal, câncer renal, câncer de mama, câncer de pulmão e câncer de pulmão de células não peque-
nas, adenocarcinoma ductal pancreático, câncer de pâncreas, câncer de células germinativas, câncer de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma hepatocelular, câncer de próstata, câncer endo- metrial, câncer metastático no fígado, câncer de fígado, linfoma de cé- lulas B grandes, câncer de ovário, câncer cervical, câncer de tireoide anaplásico metastático, câncer urotelial, câncer das trompas de Faló- pio, mieloma múltiplo, câncer de bexiga, sarcoma de tecidos moles e melanoma. AGEN-1884 (Agenus) é um anticorpo anti-CTLA4 que está sendo estudado em ensaios clínicos de Fase 1 para tumores sólidos avançados (NCT02694822).
[00254] Em algumas modalidades, um inibidor de ponto de controle é um inibidor da mucina de imunoglobulina de células T contendo pro- teína-3 (TIM-3). Inibidores de TIM-3 que podem ser usados na presen- te invenção incluem TSR-022, LY3321367 e MBG453. TSR-022 (Tesa- ro) é um anticorpo anti-TIM-3 que está sendo estudado em tumores sólidos (NCT02817633). LY3321367 (Eli Lilly) é um anticorpo anti-TIM- 3 que está sendo estudado em tumores sólidos (NCT03099109). MBG453 (Novartis) é um anticorpo anti-TIM-3 que está sendo estuda- do em malignidades avançadas (NCT02608268).
[00255] Em algumas modalidades, um inibidor de ponto de controle é um inibidor do imunorreceptor de células T com domínios Ig e ITIM, ou TIGIT, um receptor imune em certas células T e células NK. Inibido- res TIGIT que podem ser usados na presente invenção incluem BMS- 986207 (Bristol-Myers Squibb), um anticorpo monoclonal anti-TIGIT (NCT02913313); OMP-313M32 (Oncomed); e anticorpo monoclonal anti-TIGIT (NCT03119428).
[00256] Em algumas modalidades, um inibidor de ponto de controle é um inibidor de Gene 3 de ativação de linfócitos (LAG-3). Inibidores de LAG-3 que podem ser usados na presente invenção incluem BMS- 986016 e REGN3767 e IMP321. BMS-986016 (Bristol-Myers Squibb),
um anticorpo anti-LAG-3, está sendo estudado em glioblastoma e glio- sarcoma (NCT02658981). REGN3767 (Regeneron), também é um an- ticorpo anti-LAG-3 e está sendo estudado em doenças malignas (NCT03005782). IMP321 (Immutep S.A.) é uma proteína de fusão LAG-3-Ig, sendo estudada em: melanoma (NCT02676869); adenocar- cinoma (NCT02614833); e câncer de mama metastático (NCT00349934).
[00257] Inibidores de ponto de controle que podem ser usados na presente invenção incluem agonistas de OX40. Os agonistas de OX40 que estão sendo estudados em ensaios clínicos incluem: PF- 04518600/PF-8600 (Pfizer), um anticorpo anti-OX40 agonístico, em câncer renal metastático (NCT03092856) e cânceres avançados e ne- oplasias (NCT02554812; NCT05082566); GSK3174998 (Merck), um anticorpo anti-OX40 agonístico, em ensaios de câncer de Fase 1 (NCT02528357); MEDI0562 (Medimmune/AstraZeneca), um anticorpo anti-OX40 agonístico, em tumores sólidos avançados (NCT02318394 e NCT02705482); MEDI6469, um anticorpo anti-OX40 agonístico (Me- dimmune/AstraZeneca), em pacientes com câncer colorretal (NCT02559024), câncer de mama (NCT01862900), câncer de cabeça e pescoço (NCT02274155) e câncer de próstata metastático (NCT01303705); e BMS-986178 (Bristol-Myers Squibb) um anticorpo anti-OX40 agonístico, em cânceres avançados (NCT02737475).
[00258] Inibidores de ponto de controle que podem ser usados na presente invenção incluem agonistas de CD137 (também chamado de 4-1BB). Agonistas de CD137 que estão sendo estudados em ensaios clínicos incluem: utomilumabe (PF-05082566, Pfizer) um anticorpo an- ti-CD137 agonístico, em linfoma de células B grandes difusas (NCT02951156) e em cânceres avançados e neoplasias (NCT02554812 e NCT05082566); urelumabe (BMS-663513, Bristol- Myers Squibb), um anticorpo anti-CD137 agonístico, em melanoma e câncer de pele (NCT02652455) e glioblastoma e gliosarcoma (NCT02658981).
[00259] Inibidores de ponto de controle que podem ser usados na presente invenção incluem agonistas de CD27. Os agonistas de CD27 que estão sendo estudados em ensaios clínicos incluem: varlilumabe (CDX-1127, Celldex Therapeutics) um anticorpo anti-CD27 agonístico, em câncer de cabeça e pescoço de células escamosas, carcinoma de ovário, câncer colorretal, câncer de células renais e glioblastoma (NCT02335918); linfomas (NCT01460134); e glioma e astrocitoma (NCT02924038).
[00260] Inibidores de ponto de controle que podem ser usados na presente invenção incluem agonistas de receptor de fator de necrose tumoral induzida por glicocorticóides (GITR). Agonistas de GITR que estão sendo estudados em ensaios clínicos incluem: TRX518 (Leap Therapeutics), um anticorpo anti-GITR agonístico, em melanoma ma- ligno e outros tumores sólidos malignos (NCT01239134 e NCT02628574); GWN323 (Novartis), um anticorpo anti-GITR agonísti- co, em tumores sólidos e linfoma (NCT02740270); INCAGN01876 (In- cyte/Agenus), um anticorpo anti-GITR agonístico, em cânceres avan- çados (NCT02697591 e NCT03126110); MK-4166 (Merck), um anti- corpo anti-GITR agonístico, em tumores sólidos (NCT02132754) e MEDI1873 (Medimmune/AstraZeneca), uma molécula de ligante de GITR hexamérica agonística com um domínio Fc de IgG1 humana, em tumores sólidos avançados (NCT02583165).
[00261] Inibidores de ponto de controle que podem ser usados na presente invenção incluem agonistas coestimuladores de células T in- duzíveis (ICOS, também conhecido como CD278). Agonistas de ICOS que estão sendo estudados em ensaios clínicos incluem: MEDI-570 (Medimmune), um anticorpo anti-ICOS agonístico, em linfomas (NCT02520791); GSK3359609 (Merck), um anticorpo anti-ICOS ago-
nístico, na Fase 1 (NCT02723955); e JTX-2011 (Jounce Therapeutics), um anticorpo anti-ICOS agonístico, na Fase 1 (NCT02904226).
[00262] Inibidores de ponto de controle que podem ser usados na presente invenção incluem inibidores de receptor tipo IgG extermina- dor (KIR). Inibidores de KIR que estão sendo estudados em ensaios clínicos incluem: lirilumabe (IPH2102/BMS-986015, Innate Phar- ma/Bristol-Myers Squibb), um anticorpo anti-KIR, em leucemias (NCT01687387, NCT02399917, NCT02481297, NCT02599649), mi- elomas múltiplos (NCT02252263), e linfomas (NCT01592370); IPH2101 (1-7F9, Innate Pharma) em mieloma (NCT01222286 e NCT01217203); e IPH4102 (Innate Pharma), um anticorpo anti-KIR que se liga a três domínios da cauda citoplasmática longa (KIR3DL2), em linfoma (NCT02593045).
[00263] Inibidores de ponto de controle que podem ser usados na presente invenção incluem inibidores de CD47 de interação entre CD47 e proteína reguladora de sinal alfa. (SIRPa). Os inibidores de CD47/SIRPa que estão sendo estudados em ensaios clínicos incluem: ALX-148 (Alexo Therapeutics), uma variante antagonista de (SIRPa) que se liga a CD47 e impede a sinalização mediada por CD47/SIRPa, na fase 1 (NCT03013218); TTI-621 (SIRPa-Fc, Trillium Therapeutics), uma proteína de fusão recombinante solúvel criada pela ligação do domínio de ligação de CD47 N-terminal de SIRPa com o domínio Fc de IgG1 humana, atua ligando CD47 humano e impedindo de liberar seu sinal de "não comer" aos macrófagos, está na clínica ensaios na fase 1 (NCT02890368 e NCT02663518); CC-90002 (Celgene), um anticorpo anti-CD47, em leucemias (NCT02641002); e Hu5F9-G4 (For- ty Seven, Inc.), em neoplasias colorretais e tumores sólidos (NCT02953782), leucemia mielóide aguda (NCT02678338) e linfoma (NCT02953509).
[00264] Inibidores de ponto de controle que podem ser usados na presente invenção incluem inibidores de CD73. Os inibidores de CD73 que estão sendo estudados em ensaios clínicos incluem: MEDI9447 (Medimmune), um anticorpo anti-CD73, em tumores sólidos (NCT02503774); e BMS-986179 (Bristol-Myers Squibb), um anticorpo anti-CD73, em tumores sólidos (NCT02754141).
[00265] Inibidores de ponto de controle que podem ser utilizados na presente invenção incluem agonistas de estimuladores de proteína de gene de interferon (STING, também conhecido como proteína de transmembrana 173, ou TMEM173). Agonistas de STING que estão sendo estudados em ensaios clínicos incluem: MK-1454 (Merck), um dinucleotídeo cíclico sintético agonístico, em linfoma (NCT03010176); e ADU-S100 (MIW815, Aduro Biotech/Novartis), um dinucleotídeo cí- clico sintético agonístico, na Fase 1 (NCT02675439 e NCT03172936).
[00266] Inibidores de ponto de controle que podem ser usados na presente invenção incluem inibidores de CSF1R. Inibidores de CSF1R que estão sendo estudados em ensaios clínicos incluem: pexidartinibe (PLX3397, Plexxikon), um inibidor de molécula pequena CSF1R, em câncer colorretal, câncer pancreático, cânceres metastáticos e avan- çados (NCT02777710) e melanoma, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de cabeça e pescoço de células escamosas, tumor estromal gastrointestinal (GIST) e câncer de ovário (NCT02452424); e IMC-CS4 (LY3022855, Lilly), um anticorpo anti-CSF-1R, em câncer pancreático (NCT03153410), melanoma (NCT03101254), e tumores sólidos (NCT02718911); e BLZ945 metilamida de ácido (4-[2((1R,2R)- 2-hidroxiciclohexilamino)-benzotiazol-6-iloxil]-piridina-2-carboxílico, Novartis), um inibidor de CSF1R disponível por via oral, em tumores sólidos avançados (NCT02829723).
[00267] Inibidores de ponto de controle que podem ser usados na presente invenção incluem inibidores de receptor NKG2A. Inibidores de receptor NKG2A que estão sendo estudados em ensaios clínicos incluem monalizumabe (IPH2201, Innate Pharma), um anticorpo anti- NKG2A, em neoplasias de cabeça e pescoço (NCT02643550) e leu- cemia linfocítica crônica (NCT02557516).
[00268] Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de controle imune é selecionado de nivolumabe, pembrolizumabe, ipilimumabe, avelumabe, durvalumabe, atezolizumabe, ou pidilizumabe. Usos Terapêuticos
[00269] Os peptídeos bicíclicos da invenção têm utilidade específica como agentes de ligação à Nectina-4.
[00270] A nectina-4 é uma molécula de superfície que pertence à família nectina de proteínas, que compreende 4 membros. Nectinas são moléculas de adesão celular que desempenham um papel funda- mental em vários processos biológicos, tais como polaridade, prolife- ração, diferenciação e migração, para células epiteliais, endoteliais, imunes e neuronais, durante o desenvolvimento e vida adulta. Elas estão envolvidas em vários processos patológicos em humanos. Elas são os principais receptores do poliovírus, vírus do herpes simplex e vírus do sarampo. Mutações nos genes que codificam Nectina-1 (PVRL1) ou Nectina-4 (PVRL4) causam síndromes de displasia ecto- dérmica associadas a outras anormalidades. Nectina-4 é expressa du- rante desenvolvimento fetal. Nos tecidos adultos, sua expressão é mais restrita do que a de outros membros da família. Nectina-4 é um antígeno associado ao tumor em 50%, 49% e 86% de carcinomas de mama, ovário e pulmão, respectivamente, principalmente em tumores de mau prognóstico. Sua expressão não é detectada nos tecidos nor- mais correspondentes. Em tumores de mama, Nectina-4 é expressa principalmente em carcinomas triplo-negativos e ERBB2 +. No soro de pacientes com esses cânceres, a detecção de formas solúveis de Nec- tina-4 está associada a um mau prognóstico. Os níveis de Nectina-4 sérica aumentam durante a progressão metastática e diminuem após tratamento. Esses resultados sugerem que Nectina-4 pode ser um alvo seguro para o tratamento do câncer. Portanto, vários anticorpos anti- Nectina-4 foram descritos na técnica anterior. Em particular, Enfortu- mabe Vedotina (ASG-22ME) é um conjugado anticorpo-fármaco (ADC) direcionado à Nectina-4 e atualmente é investigado clinicamente para o tratamento de pacientes que sofrem de tumores sólidos.
[00271] Ligantes polipeptídicos selecionados de acordo com o mé- todo da presente invenção podem ser usados em aplicações terapêu- ticas e profiláticas in vivo, aplicações de diagnóstico in vitro e in vivo, ensaio in vitro e aplicações de reagentes e similares. Ligantes com ní- veis selecionados de especificidade são úteis em aplicações que en- volvem testes em animais não humanos, onde a reatividade cruzada é desejável, ou em aplicações de diagnóstico, onde a reatividade cruza- da com homólogos ou parálogos precisa ser controlada cuidadosa- mente. Em algumas aplicações, tais como aplicações de vacinas, a capacidade de induzir uma resposta imune a intervalos predetermina- dos de antígenos pode ser explorada para adaptar uma vacina para doenças e patógenos específicos.
[00272] Ligantes peptídicos substancialmente puros com pelo me- nos 90 a 95% de homogeneidade são preferidos para administração a um mamífero, e 98 a 99% ou mais de homogeneidade é mais preferido para usos farmacêuticos, especialmente quando o mamífero é um hu- mano. Uma vez purificados, parcialmente ou até a homogeneidade como desejado, os polipeptídeos selecionados podem ser usados em diagnóstico ou terapeuticamente (incluindo extracorporalmente) ou no desenvolvimento e realização de procedimentos de ensaio, colorações imunofluorescentes e similares. (Lefkovite and Pernis, (1979 e 1981) Immunological Methods, Volumes I e II, Academic Press, NY).
[00273] De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um ligante peptídico ou um conjugado de fármaco como aqui definido,
para uso na prevenção, supressão ou tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por Nectina-4.
[00274] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido um método de prevenção, supressão ou tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por Nectina-4, que compreende a administração a um paciente em necessidade de um grupo efetor e conjugado de fár- maco do ligante de peptídeo como definido aqui.
[00275] Em uma modalidade, a Nectina-4 é Nectina-4 de mamífero. Em uma outra modalidade, a Nectina-4 de mamífero é Nectina-4 hu- mana.
[00276] Em uma modalidade, a doença ou distúrbio mediado por Nectina-4 é selecionado de infecções virais, síndromes de displasia ectodérmica e outras anormalidades, carcinomas de mama, ovário e pulmão, progressão metastática e tumores sólidos.
[00277] Em uma outra modalidade, a doença ou distúrbio mediado por Nectina-4 é selecionado de câncer.
[00278] Exemplos de cânceres (e suas contrapartidas benignas) que podem ser tratados (ou inibidos) incluem, mas não estão limitados a tumores de origem epitelial (adenomas e carcinomas de vários tipos incluindo adenocarcinomas, carcinoma escamosos, carcinomas de cé- lulas transicionais e outros carcinomas) tais como carcinomas da bexi- ga e tcamundongo urinário, mama, tcamundongo gastrointestinal (in- cluindo o esôfago, estômago (gástrico), intestino delgado, cólon, reto e ânus), fígado (carcinoma hepatocelular), vesícula biliar e sistema biliar, pâncreas exócrino, rim, pulmão (por exemplo, adenocarcinomas, car- cinomas pulmonares de células pequenas, carcinomas pulmonares de células não pequenas, carcinomas bronquioalveolares e mesotelio- mas), cabeça e pescoço (por exemplo, cânceres de língua, cavidade bucal, laringe, faringe, nasofaringe, amígdala, glândulas salivares, ca- vidade nasal e seios paranasais), ovário, trompas de falópio, peritônio,
vagina, vulva, pênis, colo do útero, miométrio, endométrio, tiróide (por exemplo, carcinoma folicular da tiróide), adrenal, próstata, pele e ane- xos (por exemplo, melanoma, carcinoma de células basais, carcinoma de células escamosas, quecamundongoacantoma, nevo displásico); malignidades hematológicas (ou seja, leucemias, linfomas) e distúrbios hematológicos pré-malignos e distúrbios de malignidade limítrofe inclu- indo malignidades hematológicas e condições relacionadas de linha- gem linfóide (por exemplo, leucemia linfocítica aguda [LLA], leucemia linfocítica crônica [CLL], linfomas de células B tais como linfoma de células B grandes difusas [DLBCL], linfoma folicular, linfoma de Burkitt, linfoma de células do manto, linfomas de células T e leucemias, linfo- mas de células exterminadoras naturais [NK], linfomas de Hodgkin, leucemia de células pilosas, gamopatia monoclonal significativa, plas- macitoma, mieloma múltiplo e distúrbios linfoprolativos pós- transplante), e malignidades hematológicas e condições relacionadas de linhagem mieloide (por exemplo, leucemia mielogênica aguda [AML], leucemia mielóide crônica [CML], leucemia mielomonocítica crônica [CMML], síndrome hipereosinofílica, distúrbios mieloproliferati- vos, tais como policitemia vera, trombocitemia essencial e mielofibrose primária, síndrome mieloproliferativa, síndrome mielodisplásica e leu- cemia promielocítica); tumores de origem mesenquimal, por exemplo, sarcomas de tecidos moles, osso ou cartilagem, tais como os osteos- sarcomas, fibrossarcomas, condrossarcomas, rabdomiossarcomas, leiomiossarcoma, lipossarcoma, angiossarcoma, sarcoma de Kaposi, sarcoma de Ewing, sarcoma sinovial, sarcomas epitelióides, tumores estromais gastrointestinais, histiocitomas benignas e malignas, e der- matofibrossarcoma protuberante; tumores do sistema nervoso central ou periférico (por exemplo, astrocitomas, gliomas e glioblastomas, me- ningiomas, ependimomas, tumores pineais e schwannomas); tumores endócrinos (por exemplo, tumores pituitários, tumores adrenais, tumo-
res de células das ilhotas, tumores da paratireóide, tumores carcinói- des e carcinoma medular da tiróide); tumores oculares e anexiais (por exemplo, retinoblastoma); células germinativas e tumores trofoblásti- cos (por exemplo, tecamundongomas, seminomas, disgerminomas, manchas hidatiformes e coriocarcinomas); e tumores pediátricos e embrionários (por exemplo, meduloblastoma, neuroblastoma, tumor de Wilms e tumores neuroectodérmicos primitivos); ou síndromes, congê- nitas ou de outro modo, que deixam o paciente suscetível à malignida- de (por exemplo, XerodermaPigmentosum).
[00279] Em uma modalidade adicional, o câncer é selecionado de uma malignidade hematopoiética, tal como selecionada de: linfoma não-Hodgkin (NHL), linfoma de Burkitt (BL), mieloma múltiplo (MM), leucemia linfocítica crônica B (B-CLL), leucemia linfocítica aguda B e T (ALL), linfoma de células T (TCL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia de células pilosas (HCL), linfoma de Hodgkin (HL), e leuce- mia mielóide crónica (LMC).
[00280] Em ainda outra modalidade, o câncer é selecionado de câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células não pe- quenas), câncer de bexiga, câncer de pâncreas e câncer de mama. Os dados são apresentados aqui nos Exemplos 1 a 5 que demonstram que os conjugados bicíclicos de fármacos selecionados da invenção exibiram atividade antitumoral nestes modelos de câncer.
[00281] Referências aqui ao termo "prevenção" envolvem a admi- nistração da composição protetora antes da indução da doença. "Su- pressão" refere-se à administração da composição após um evento indutivo, mas antes do aparecimento clínico da doença. "Tratamento" envolve a administração da composição protetora após os sintomas da doença se manifestarem.
[00282] Sistemas de modelo animal que podem ser usados para classificar a eficácia dos ligantes peptídicos na proteção contra ou tra-
tamento da doença estão disponíveis. O uso de sistemas de modelos animais é facilitado pela presente invenção, que permite o desenvol- vimento de ligantes polipeptídicos que podem reagir de forma cruzada com alvos humanos e animais, para permitir o uso de modelos ani- mais.
[00283] Além disso, são apresentados dados aqui que demonstram uma associação entre a variação do número de cópias (CNV) e a ex- pressão do gene para Nectina-4 de múltiplos tipos de tumor. Assim, de acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um método de prevenção, supressão ou tratamento do câncer, que compreende a administração a um paciente em necessidade de um grupo efetor e conjugado de fármaco do ligante peptídico como definido aqui, em que o referido paciente é identificado como tendo uma variação do número de cópias aumentada (CNV) de Nectina-4.
[00284] Em uma modalidade, o câncer é selecionado daqueles identificados como tendo CNV aumentada de Nectina-4. Em uma mo- dalidade adicional, o câncer é selecionado daqueles identificados aqui como tendo CNV aumentada CNV de Nectina-4, a saber: mama, uteri- no, bexiga, adenocarcinoma pulmonar, pulmão escamoso, cervical, cabeça e pescoço, pancreático, tireóide, colorretal, timoma, sarcoma, carcinoma renal de células claras (RCC), próstata e estômago.
[00285] A invenção é ainda descrita abaixo com referência aos se- guintes exemplos.
EXEMPLOS Abreviações 1,2,4-TriAz 3-(1,2,4-Triazol-1-il)-alanina 1Nal 1-Naftilalanina 2FuAla 2-Furilalanina 2MePhe 2-Metil-Fenilalanina 2Nal 2-Naftilalanina
2Pal 2-Piridilalanina 3,3-DPA 3,3-Difenilalanine 3MePhe 3-Metil-Fenilalanina 3Pal 3-Piridilalanina 4,4-BPA 4,4-Bifenilalanina 4,4-DFP 4,4-Difluoroprolina 4MePhe 4-Metil-Fenilalanina 4Pal 4-Piridilalanina 4ThiAz Beta-(4-Tiazolil)-Alanina 5FTrp 5-Fluoro-L-triptofano Agb Ácido 2-amino-4-guanidinobutírico Aib Ácido aminoisobutírico AzaTrp Azatriptofano Aze Azetidina C5A Ciclopentil glicina Cha 3-Ciclo-hexil-alanina Cpa Ciclopropilalanina Cya Ácido cisteico DOPA 3,4-Di-hidróxi-fenilalanina HArg HomoArginina HGln HomoGlutamina Hleu HomeLeucina Hphe HomoFenilalanina Hse(me) Homoserina (Me) HSer HomoSerina HyP Hidroxiprolina Lys(Ac) Lisina (Acetil) Met(O2) Metionina sulfona Nle Norleucina Oic Ácido octa-hidroindolcarboxílico
Oxa Ácido oxazolidina-4-carboxílico pCoPhe para-Carbóxi-Fenilalanina PheOPhe 4-Fenóxi-fenilalanina Phg Fenilglicina Pip Ácido pipecólico Pro(4NH) 4-Amino-Prolina tBuAla t-Butil-Alanina TetraZ Tetrazol Alanina Thi Tienil-alanina THP(O) Ácido Tetra-hidropiran-4-propanoico THP(SO2) Ácido Dioxo-4-tetra-hidrotiopiranilacético Trp(Me) Metil Triptofano Materiais e Métodos Síntese de Peptídeo
[00286] Síntese de peptídeo foi baseada em química Fmoc, usando um sintetizador de peptídeo Symphony fabricado por Peptide Instru- ments e um sintetizador Syro II por MultiSynTech. Aminoácidos Fmoc padrões foram usados (Sigma, Merck), com grupos de proteção de cadeia lateral apropriados: onde condições de acoplamento padrão aplicáveis foram usadas em cada caso, seguido por desproteção usando metodologia padrão.
[00287] Alternativamente, peptídeos foram purificados usando HPLC e após isolamento eles foram modificados com 1,3,5-Triacriloil- hexa-hidro-1,3,5-triazina (TATA, Sigma). Para isto, peptídeo linear foi diluído com 50:50 de MeCN:H2O até ~35 mL, ~500 µL de 100 mM de TATA em acetonitrila foi adicionado, e a reação foi iniciada com 5 mL de 1 M de NH4HCO3 em H2O. A reação foi deixada prosseguir durante ~30-60 minutos em RT, e liofilizado uma vez que a reação foi completa (julgado por MALDI). Uma vez completa, 1 mL de 1M de mono- hidcamundongo de cloridcamundongo de L-cisteína (Sigma) em H2O foi adicionado à reação durante ~60 minutos a RT para interromper bruscamente qualquer excesso de TATA.
[00288] Após liofilização, o peptídeo modificado foi purificado como acima, enquanto substituindo o Luna C8 com uma coluna Gemini C18 (Phenomenex), e alterando o ácido para 0,1% de ácido trifluoroacético. Frações puras contendo o material modificado por TATA correto foram agrupadas, liofilizado e mantido a -20ºC durante armazenamento.
[00289] Todos os aminoácidos, a menos que de outro modo indica- do, foram usados nas configurações L.
[00290] Em alguns casos peptídeos são convertidos para dissulfe- tos ativados antes de acoplamento com o grupo tiol livre de uma toxina usando o seguinte método; uma solução de 4-metil(sucinimidil 4-(2- piridiltio)pentanoato) (100 mM) em DMSO seco (1,25 mol equiv) foi adicionado a uma solução de peptídeo (20 mM) em DMSO seco (1 mol equiv). A reação foi bem misturada e DIPEA (20 mol equiv) foi adicio- nada. A reação foi monitorada por LC/MS até conclusão. Preparação de Conjugados de Fármaco de Peptídeo Bicíclico Preparação de BCY8549
[00291] Condição de Separação：Fase A：0,075% de TFA em H2O, Fase B：MeCN
[00292] Método de Separação：18-48-55 minutos, RT=53,5 minu- tos
[00293] Coluna de Separação：Luna 200*25mm 10µm, C18, 110A e Gemin 150*30mm, C18, 5µm, 110A, conexão, 50 ºC
[00294] Método de Dissolução : DMF
[00295] Pureza de Separação : 95%
[00296] BCY8234 foi sintetizado por síntese de fase sólida.
Fase sólida Ácido
Preparação de composto 2
[00297] O peptídeo foi sintetizado usando química Fmoc padrão.
[00298] 1) Adicionar DCM ao vaso contendo Resina CTC (5 mmol, 4,3 g, 1,17 mmol/g) e Fmoc-Cit –OH (2,0 g, 5 mmol, 1,0 eq) com bor- bulhamento com N2.
[00299] 2) Adicionar DIEA (4,0 eq) gota a gota e misturar durante 2 horas.
[00300] 3) Adicionar MeOH (5 mL) e misturar durante 30 minutos.
[00301] 4) Drain e lavar com DMF durantes 5 vezes.
[00302] 5) Adicionar 20% de piperidina/DMF e reagir durante 30 mi- nutos.
[00303] 6) Drain e lavar com DMF durante 5 vezes.
[00304] 7) Adicionar solução de Fmoc-aminoácido e misturar 30 se- gundos, em seguida adicionar tampão de ativação, borbulhamento com N2 durante cerca de 1 hora.
[00305] 8) Repetir etapa 4 a 7 para o acoplamento dos seguintes aminoácidos.
[00306] Note: # Materiais Agentes de Acomplamento 1 Fmoc-Cit-OH (1,0 eq) DIEA(4,0 eq) 2 Ácido 1- HATU(2,85 eq) e DIEA(6,0 eq) etoxicarbonilciclobutanocarbo- xílico (3,0 eq)
[00307] 20% de piperidina em DMF foi usado para desproteção de Fmoc durante 30 min. A reação de acoplamento foi monitorada por teste de ninhidrina, e a resina foi lavada com DMF durante 5 vezes.
Clivagem de Peptídeo e Purificação:
[00308] 1) Adicionar tampão de clivagem (20% de TFIP/80% de DCM) ao frasco contendo o peptídeo protegido de cadeia lateral em temperatura ambiente e agitar durante 1 hora duas vezes.
[00309] 2) Filtrar e coletar o filtrado.
[00310] 3) Concentrar para remover o solvente.
[00311] 4) O peptídeo cru foi liofilizado para fornecer o produto final (1,4 g, 85,0 % de produção). Preparação de composto 3
[00312] A uma solução de composto 2 (1,65 g, 5,01 mmol, 1,0 eq) em DCM (30 mL) e MeOH (15 mL) foi adicionado EEDQ (2,48 g, 10,02 mmol, 2,0 eq) e (4-aminofenil)metanol (740,37 mg, 6,01 mmol, 1,2 eq). A mistura foi agitada a 15 °C durante 16 horas. LC-MS mostrou que composto 2 foi consumido completamente e um pico principal com m/z desejado foi detectado. TLC indicou que composto 2 foi consumido completamente e muitos novos pontos formados. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida para remover solvente para for- necer um resíduo. O resíduo foi purificado por cromatografia de sílica gel flash (ISCO®; 80 Coluna Flash de Sílica SepaFlash® Silica Flash Column, Eluente de 0~15 DCM/MeOH gradiente @ 60 mL/minutos). Composto 3 (1,3 g, 2,99 mmol, 59,72% de produção) foi obtido como um sólido amarelo. Preparação de composto 4
[00313] A uma solução de composto 3 (1,3 g, 2,99 mmol, 1,0 eq) em DMF (10 mL) foi adicionado DIEA (2,32 g, 17,95 mmol, 3,13 mL, 6,0 eq) e bis(4-nitrofenil)carbonato (3,64 g, 11,97 mmol, 4,0 eq). A mis- tura foi agitada a 15 °C durante 1 hora. LC-MS mostrou que composto 3 foi consumido completamente e um pico principal com m/z desejado foi detectado. O resíduo foi purificado por prep-HPLC (condição neu- tra). Composto 4 (1,0 g, 1,67 mmol, 55,74% de produção) foi obtido como um sólido amarelo. Preparação de composto 5
[00314] A um solução de composto 5 (250,53 mg, 417,84 µmol, 1,5 eq) em DMF (5 mL) foi adicionado HOBt (56,46 mg, 417,84 µmol, 1,5 eq) e DIEA (108,01 mg, 835,68 µmol, 145,56 µL, 3,0 eq), MMAE (0,200 g, 278,56 µmol, 1,0 eq). A mistura foi agitada a 35 °C durante 12 horas. LC-MS mostrou que MMAE foi consumido completamente e um pico principal com m/z desejado foi detectado. A reação foi direta- mente purificada por prep-HPLC (condição neutra). Composto 5 (0,180 g, 152,74 µmol, 54,83% de produção) foi obtido como um sólido ama- relo. Preparação de composto 6
[00315] A uma solução de composto 5 (0,170 g, 144,26 µmol, 1,0 eq) em THF (5 mL) e H2O (5 mL) foi adicionado LiOH.H2O (12,11 mg, 288,51 µmol, 2,0 eq). A mistura foi agitada a 15 °C durante 1 hora. LC- MS mostrou que composto 5 foi consumido completamente e um pico principal com m/z desejado foi detectado. PH=7 ajustado usado por AcOH e THF foi removido sob pressão reduzida para fornecer um re- síduo. O resíduo foi purificado por prep-HPLC (condição neutra). Composto 6 (0,185 g, bruto) foi obtido como um sólido amarelo. Preparação de BCY8549
[00316] A uma solução de composto 6 (0,100 g, 86,93 µmol, 1,0 eq) em DMA (4 mL) foi adicionado HOSu (10,00 mg, 86,93 µmol, 1,0 eq) e EDCI (16,66 mg, 86,93 µmol, 1,0 eq). Depois que o NHS éster foi for- mado, β-Ala-BCY8234 (525,98 mg, 173,85 µmol, 2,0 eq) e DIEA (33,70 mg, 260,78 µmol, 45,42 µL, 3,0 eq). A mistura foi agitada a 15 °C durante 4 horas. LC-MS mostrou que composto 6 foi consumido completamente e um pico principal com m/z desejado foi detectado. A reação foi diretamente purificada porprep-HPLC (condição de TFA). Composto BCY8549 (0,0528 g, 12,15 µmol, 13,98% de produção,
95,70% de pureza) foi obtido como um sólido branco. Tempo de reten- ção = 11,48 minutos. Massa encontrada = 1386,4 (M/3+H) Preparação de BCY8245
[00317] Condição de Separação：Fase A：0,075% de TFA em H2O, Fase B：MeCN
[00318] Método de Separação：18-48-55 minutos, RT=53,5min
[00319] Coluna de separação：Luna 200*25mm 10um, C18, 110A e Gemin150*30mm, C18, 5um, 110A, conexão, 50 ºC
[00320] Método de dissolução: DMF
[00321] Pureza de separação: 95%
[00322] BCY8234 foi sintetizado por síntese de fase sólida.
[00323] Esquema de reação de BCY8245 é mostrado abaixo: Fase sólida Ácido fraco
OH O NH N O O O O O O O O N N
O NH NH NH NH BCY00008234
O O
NH NH2 O BCY00008245 Preparação de composto 3
[00324] O composto 3 foi sintetizado por método de fase sólida. Preparação de composto 4
[00325] A uma solução de composto 3 (1,3 g, 3,23 mmol, 1,0 eq)
em DCM (10 mL) e MeOH (5 mL) foi adicionado EEDQ (1,60 g, 6,46 mmol, 2,0 eq) e (4-aminofenil)metanol (517,16 mg, 4,20 mmol, 1,3 eq). A mistura foi agitada a 20 °C durante 16 horas. LC-MS mostrou que composto 3 foi consumido completamente e um pico principal com m/z desejado foi detectado. O solvente foi removido sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia de sílica gel flash (ISCO®; 40 g de Coluna Flash de Sílica SepaFlash®, Eluente de 0~15% de DCM/MeOH gradiente @ 40 mL/min). Composto 4 (0,950 g, 1,87 mmol, 57,94% de produção) foi obtido como um sólido amarelo. Preparação de composto 5
[00326] A uma solução de composto 4 (0,950 g, 1,87 mmol, 1,0 eq) em DMF (5 mL) foi adicionado DIEA (1,21 g, 9,36 mmol, 1,63 mL, 5,0 eq) e bis(4-nitrofenil)carbonato (2,28 g, 7,49 mmol, 4,0 eq). A mistura foi agitada a 20 °C durante 1 hora. LC-MS mostrou que composto 4 foi consumido completamente e um pico principal com m/z desejado foi detectado. A reação foi diretamente purificada porprep-HPLC (condi- ção neutra). Composto 5 (0,400 g, 594,64 µmol, 31,77% de produção) foi obtido como um sólido branco. Preparação de composto 6
[00327] A uma solução de composto 5 (0,200 g, 297,32 µmol, 1,0 eq) em DMF (5 mL) foi adicionado HOBt (52,23 mg, 386,51 µmol, 1,3 eq) e DIEA (115,28 mg, 891,95 µmol, 155,36 µL, 3,0 eq), MMAE (192,12 mg, 267,59 µmol, 0,9 eq). A mistura foi agitada a 20 °C duran- te 16 horas. LC-MS mostrou que composto 5 foi consumido completa- mente e um pico principal com m/z desejado foi detectado. A reação foi diretamente purificada por prep-HPLC (condição neutra). Composto 6 (0,160 g, 127,84 µmol, 43,00% de produção) foi obtido como um só- lido branco. Preparação de composto 7
[00328] A uma solução de composto 6 (0,160 g, 127,84 µmol, 1,0 eq) em THF (3 mL) e H2O (3 mL) foi adicionado LiOH.H2O (26,82 mg, 639,21 µmol, 5,0 eq). A mistura foi agitada a 20 °C durante 1 hora. LC- MS mostrou que composto 6 foi consumido completamente e um pico principal com m/z desejado foi detectado. O THF foi removido sob pressão reduzida e ajustado o pH=7 por AcOH, a mistura foi liofilizada. Composto 7 (0,130 g, 105,05 µmol, 82,17% de produção) foi obtido como um sólido branco. Preparação de composto 8
[00329] A uma solução de composto 7 (36,27 mg, 315,15 µmol, 3,0 eq) em DMA (6 mL) e DCM (2 mL) foi adicionado EDCI (60,41 mg, 315,15 µmol, 3,0 eq). A mistura foi agitada a 15 °C durante 3 horas. LC-MS mostrou que composto 7 foi consumido completamente e um pico principal com m/z desejado foi detectado. DCM foi removido sob pressão reduzida. A reação foi diretamente purificada porprep-HPLC (condição neutra). Composto 8 (0,095 g, 71,18 µmol, 67,76% de pro- dução) foi obtido como um sólido branco.
[00330] Preparação de BCY8245
[00331] A uma solução de BCY8234 (66,41 mg, 22,48 µmol, 1,0 eq) em DMA (4 mL) foi adicionado DIEA (8,72 mg, 67,44 µmol, 11,75 µL, 3,0 eq) e composto 8 (0,030 g, 22,48 µmol, 1,0 eq). A mistura foi agi- tada a 20 °C durante 16 horas. LC-MS mostrou que BCY8234 foi con- sumido completamente e um pico principal com m/z desejado ou mas- sa desejada foi detectada. A reação foi diretamente purificada por prep-HPLC (Condição de TFA). Composto BCY8245 (0,0427 g, 10,16 µmol, 45,19% de produção, 99,30% de pureza) foi obtido como um só- lido branco. Tempo de retenção = 11,7 minutos. Massa encontrada = 1043,9 (M/4+H)
DADOS BIOLÓGICOS Ensaio de Ligação Direta à Nectina-4
[00332] A afinidade dos péptidos da invenção para Nectina-4 (Ki)
humana foi determinada usando um ensaio de polarização de fluores- cência, de acordo com os métodos descritodescritos em WO2016/067035. Peptídeos da invenção com um marcador fluores- cente (ou fluoresceína, SIGMA ou Alexa Fluor488™, Fisher Scientific) foram diluídos para 2,5 nM em PBS com 0,01% de tween 20 ou 50 mM de HEPES com 100 mM de NaCl e 0,01% de tween pH 7,4 (ambos referidos como tampão de ensaio). Isto foi combinado com uma titula- ção de proteína no mesmo tampão de ensaio que o peptídeo para for- necer 1 nM de peptídeo em um volume total de 25 µL em placas de 384 cavidades de baixo volume de ligação baixa e de parede e fundo preto, tipicamente 5 µL de tampão de ensaio, 10 µL de proteína então 10 µL de peptídeo fluorescente. Uma em duas diluições em série fo- ram usadas para fornecer 12 concentrações diferentes com concen- trações superiores variando de 500 nM para ligantes de alta afinidade conhecidos a 10 µM para ligantes de baixa afinidade e ensaios de se- letividade. Medições foram conduzidas em um BMG PHERAstar FS equipado com um módulo óptico "FP 485 520 520" que excita a 485 nm e detecta emissões paralelas e perpendiculares a 520 nm. O PHERAstar FS foi ajustado a 25 ºC com 200 flashes por cavidade e um retardo de posicionamento de 0,1 segundo, com cada cavidade medida em intervalos de 5 a 10 minutos durante 60 minutos. O ganho usado para a análise foi determinado para cada marcador ao final dos 60 minutos em que não havia proteína na cavidade. Os dados foram analisados usando Systat Sigmaplot versão 12.0. Os valores de mP foram ajustados a uma equação quadrática definida pelo usuário para gerar um valor Kd: f = ymin+(ymax-ymin)/Lig*((x+Lig+Kd)/2- sqrt((((x+Lig+Kd)/2)^2)-(Lig*x))). "Lig" foi um valor definido da concen- tração do traçador usado. Ensaio de Ligação de Competição por Nectina-4
[00333] Peptídeos sem um marcador fluorescente foram testados em competição com ACPFGCHTDWSWPIWCA-Sar6-K (Fl) (SEQ ID NO: 2) e (Kd = 5 nM - determinado usando o protocolo acima). Peptí- deos foram diluídos para uma concentração apropriada em tampão de ensaio, como descrito no ensaio de ligação direta com um máximo de 5% de DMSO, em seguida, diluídos em série 1 em 2. Cinco µL de pep- tídeo diluído foram adicionados à placa seguidos por 10 µL de Nectina- 4 humana e, em seguida, 10 µL de peptídeo fluorescente adicionados. Medições foram realizadas como para o ensaio de ligação direta, en- tretanto, o ganho foi determinado antes da primeira medição. Análise de dados foi feita no Systat Sigmaplot versão 12.0, onde os valores de mP foram ajustados a uma equação cúbica definida pelo usuário para gerar um valor Ki: f=ymin+(ymax-ymin)/Lig*((Lig*((2*((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^2- 3*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp- Prot*c)+Klig*Kcomp))^0,5*COS(ARCCOS((- 2*(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^3+9*(Klig+Kcomp+Lig+Comp- Prot*c)*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp)-27*(- 1*Klig*Kcomp*Prot*c))/(2*((((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^2- 3*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp))^3)^0,5)))/3))- (Klig+Kcomp+Lig+Comp- Prot*c)))/((3*Klig)+((2*((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^2- 3*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp- Prot*c)+Klig*Kcomp))^0,5*COS(ARCCOS((- 2*(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^3+9*(Klig+Kcomp+Lig+Comp- Prot*c)*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp)-27*(- 1*Klig*Kcomp*Prot*c))/(2*((((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^2- 3*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp))^3)^0,5)))/3))- (Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)))).
[00334] "Lig", "KLig" e "Prot" foram todos valores definidos em rela- ção a: concentração de peptídeo fluorescente, o Kd do peptídeo fluo-
rescente e concentração de Nectina, respectivamente. Ensaio de Ligação Biacore SPR a Nectina-4
[00335] Experimentos Biacore foram realizados para determinar va- lores ka (M-1s-1), kd (s-1), KD (nM) de peptídeos monoméricos que se li- gam à proteína Nectina-4 humana (obtida de Charles River).
[00336] Nictina-4 humana (resíduos Gly32-Ser349; NCBI RefSeq: NP_112178.2) com uma sequência de sinal gp67 e marcador FLAG C- terminal foi clonado em pFastbac-1 e bacilovírus feito usando protoco- los Bac-to-Bac™ padrão (Life Technologies). Células Sf21 a 1 x 106ml- 1 em meio Excell-420 (Sigma) a 27°C foram infectados a um MOI de 2 com um estoque de vírus P1 e o sobrenadante coletado em 72 horas. O sobrenadante foi ligado em batelada durante 1 hora a 4 °C com re- sina de agarose de afinidade Anti-FLAG M2 (Sigma) lavada em PBS e a resina subsequentemente transferida para uma coluna e lavada ex- tensivamente com PBS. A proteína foi eluída com 100 µg/ml de peptí- deo FLAG. A proteína eluída foi concentrada para 2 mL e carregada em uma coluna S-200 Superdex (GE Healthcare) em PBS a 1 mL/min. Frações de 2 mL foram coletadas e as frações contendo proteína Nec- tina-4 foram concentradas para 16mg/ml.
[00337] A proteína foi biotinilada aleatoriamente em PBS usando o reagente EZ-Link ™ Sulfo-NHS-LC-LC-Biotina (Thermo Fisher) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. A proteína foi exten- sivamente dessalinizada para remover a biotina desacoplada usando colunas de rotação em PBS.
[00338] Para a análise da ligação de peptídeo, um instrumento Bia- core 3000 foi usado utilizando um chip CM5 (GE Healthcare). Estrep- tavidina foi imobilizada no chip usando química de acoplamento de amina padrão a 25 °C com HBS-N (10 mM de HEPES, 0,15 M de NaCl, pH 7,4) como tampão de execução. Resumidamente, superfície de carboximetil dextrano foi ativada com uma injeção de 7 minutos de uma relação de 1:1 de 0,4 M de cloridcamundongo de 1-etil-3- (3- dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC)/0,1 M de N-hidroxi succinimida (NHS) em um taxa de fluxo de 10 μl/min. Para a captura da estreptavi- dina, a proteína foi diluída para 0,2 mg/ml em 10 mM de acetato de sódio (pH 4,5) e capturada por injeção de 120 µl de estreptavidina na superfície do chip ativado. Grupos ativados residuais foram bloquea- dos com uma injeção de 7 minutos de 1 M de etanolamina (pH 8,5) e Nectina-4 biotinilada capturada a um nível de 1,200-1,800 RU. Tam- pão foi alterado para PBS / Tween 20 a 0,05% e uma série de dilui- ções dos peptídeos foi preparado neste tampão com uma concentra- ção final de DMSO de 0,5%. A concentração de peptídeo superior foi de 100 nM com mais 6 diluições de 2 vezes. A análise SPR foi execu- tada a 25 °C a uma taxa de vazão de 50 µl/minuto com 60 segundos de associação e dissociação entre 400 e 1,200 segundos, dependendo do peptídeo individual. Os dados foram corrigidos para efeitos de vo- lume excluídos de DMSO. Todos os dados foram duplamente referen- ciados para injeções em branco e superfície de referência usando pro- cedimentos de processamento padrão e processamento de dados e ajuste cinético foram realizados usando o software Scrubber, versão
2.0c (Software BioLogic). Dados foram ajustados usando modelo de ligação 1: 1 simples, permitindo efeitos de transporte de massa quan- do apropriado.
[00339] Certos ligantes peptídicos da invenção foram testados nos ensaios de ligação de Nectina-4 mencionados acima e os resultados são mostrados na Tabela 1: Tabela 1: Dados de ligação de competição para ligantes peptídicos selecionados da invenção Biciclo No. Ki (µM) Número de Experimentos BCY8122 0,003 2 BCY8126 0,0027 6
[00340] Certos peptídeos bicíclicos da invenção foram testados no ensaio SPR mencionado acima e os resultados são mostrados na Ta- bela 2: Tabela 2: Dados SPR para ligantes peptídicos selecionados da inven- ção Biciclo No. Kd de SPR Humano (nM) n BCY8122 0,89 1 BCY8126 1,07 4 BCY8116 0,372 1 n = número médio de experimentos
[00341] Certos peptídeos bicíclicos da invenção foram conjugados a agentes citotóxicos e testados no ensaio SPR mencionado acima e os resultados são mostrados na Tabela 3: Tabela 3: Dados SPR para BDCs selecionados da invenção Conjugado de Peptídeo Kd de SPR Fármaco Bicícli- humano (nM) co (BDC) No. BCY8245 MMAE-PABC-Cit-Val-Glutaril- 5,12 (n = 4) BCY8234 BCY8549 MMAE-PABC-ciclobutil-(B-Ala)- 1,44 (n = 1) BCY8234 Estudos In Vivo
[00342] Em cada um dos Exemplos 1 a 5 e 9, a seguinte metodolo- gia foi adotada para cada estudo: Artigos de teste e controle positivo Número Descrição Físi- Peso Mole- Pureza Condição de ca cular Armazenamento BCY8245 Pó liofilizado 4173,85 99,60% armazenado a -80oC BCY8549 Pó liofilizado 4157,81 95,70% armazenado a -80oC Métodos e Procedimentos Experimentais (i) Observações
[00343] Todos os procedimentos relacionados ao manejo, cuidados e tratamento dos animais no estudo foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas pelo Comitê de Uso e Cuidado de Animais Ins- titucional (IACUC) do WuXi AppTec, seguindo as orientações da Asso- ciação para Avaliação e Acreditação de Cuidados com Animais de La- boratório (AAALAC). No momento do monitoramento de rotina, os animais foram verificados diariamente quanto a quaisquer efeitos do crescimento do tumor e tratamentos sobre o comportamento normal, tal como mobilidade, consumo de comida e água (apenas olhando), ganho/perda de peso corporal, emaranhado de olhos/cabelo e qual- quer outro efeito anormal, como estabelecido no protocolo. Morte e os sinais clínicos observados foram registrados com base no número de animais em cada subconjunto. (ii) Medições de Tumor e as Finalidades
[00344] O principal objetivo era ver se o crescimento do tumor po- deria ser atrasado ou se os camundongos poderiam ser curados. Vo- lume do tumor foi medido três vezes por semana em duas dimensões usando um calibrador, e o volume foi expresso em mm3 usando a fór- mula: V = 0,5 a x b2 onde a e b são os diâmetros longo e curto do tu- mor, respectivamente. O tamanho do tumor foi então usado para cál- culos do valor T/C. O valor T/C (em porcentagem) é uma indicação da eficácia antitumoral; T e C são os volumes médios dos grupos tratados e de controle, respectivamente, em um determinado dia.
[00345] O TGI foi calculado para cada grupo usando a fórmula: TGI (%) = [1-(Ti-T0)/ (Vi-V0)] ×100; Ti é o volume médio do tumor de um grupo de tratamento em um determinado dia, T0 é o volume médio do tumor do grupo de tratamento no dia do início do tratamento, Vi é o vo- lume médio de tumor do grupo de controle de veículo no mesmo dia com Ti, e V0 é o volume médio do tumor do grupo do veículo no dia do início do tratamento. (iii) Análise Estatística
[00346] Estatísticas de resumo, incluindo a média e o erro padrão da média (SEM), são fornecidas para o volume do tumor de cada gru- po em cada ponto de tempo.
[00347] Análise estatística da diferença no volume do tumor entre os grupos foi realizada com base nos dados obtidos no melhor ponto de tempo terapêutico após a dose final. Uma ANOVA unilateral foi rea- lizada para comparar o volume do tumor entre os grupos, e quando uma estatística F significativa (uma relação da variância do tratamento para a variância do erro) foi obtida, comparações entre os grupos fo- ram realizadas com o teste Games-Howell. Todos os dados foram analisados usando GraphPad Prism 5.0. P <0,05 foi considerado esta- tisticamente significativo. Exemplo 1: Teste de eficácia in vivo de BCY8245 no tratamento de xenoenxerto NCI-H292 (modelo de câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC)) em camundongos nus BALB/c
1. Objetivo de Estudo
[00348] O objetivo da pesquisa foi avaliar a eficácia antitumoral in vivo de BCY8245 no tratamento do modelo de xenoenxerto NCI-H292 em camundongos pelados BALB/c.
2. Design Experimental Gru- Tratamen- N Dose Volume de Do- Via de Do- Crono- po to (mg/kg) sagem (µl/g) sagem grama 1 Veículo 3 -- 10 iv Biw 2 BCY8245 3 1/3/5 10 iv qw 3 BCY8245 3 3 mg/kg 10 iv qw 4 BCY8245 3 3 mg/kg 10 iv Biw 5 BCY8245 3 5 mg/kg 10 iv qw Nota: n: número de animal; Volume de dosagem: ajustar o volume de dosagem com base no peso corporal 10 l/g.
3. Materiais
3.1 Animais e condições de habitação
3.1.1. Animais
[00349] Espécie: Mus Musculus
[00350] Cepas: Balb/c nus
[00351] Idades: 6 a 8 semanas
[00352] Sexo: fêmea
[00353] Peso corporal: 18 a 22 g
[00354] Número de animais: 18 camundongos para BCY8245 mais sobressalente
[00355] Fornecedor de animais: Shanghai LC Labocamundongory Animal Co., LTD.
3.1.2. Condição de habitação
[00356] Os camundongos foram mantidos em gaiolas de ventilação individuais com temperatura e umidade constantes com 3 animais em cada gaiola.
[00357]  Temperatura: 20~26 oC.
[00358]  Umidade: 40 a 70%.
[00359] Gaiolas: Fabricado em policarbonato. O tamanho é 300 mm x 180 mm x 150 mm. O material de cama é espiga de milho, que é tro- cada duas vezes por semana.
[00360] Dieta: Os animais tiveram livre acesso a ração granulada seca esterilizada por irradiação durante todo o período do estudo.
[00361] Água: os animais tiveram livre acesso a água potável esteri- lizada.
[00362] Identificação da gaiola: As etiquetas de identificação de ca- da gaiola continham as seguintes informações: número de animais, sexo, linhagem, data de recebimento, tratamento, número do estudo, número do grupo e data de início do tratamento.
[00363] Identificação dos animais: os animais foram marcados por um código de orelha.
3.2 Artigos de teste e controle positivo
4. Métodos e procedimentos experimentais
4.1 Cultura de células
[00364] As células tumorais NCI-H292 serão mantidas em meio su- plementado com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor a 37ºC em atmosfera de 5% de CO2 em ar. As células tumorais serão rotinei- ramente subcultivadas duas vezes por semana. As células que cres- cem em uma fase de crescimento exponencial serão colhidas e conta- das para inoculação de tumor.
4.2 Inoculação de tumor
[00365] Cada camundongo será inoculado por via subcutânea no flanco direito com células tumorais NCI-H292 (10 x 106) em 0,2 ml de PBS para o desenvolvimento do tumor. Os animais serão randomiza- dos e o tratamento será iniciado quando o volume tumoral médio atin- gir aproximadamente 158-406 mm3. A administração do artigo de teste e o número de animais em cada grupo são mostrados na seguinte ta- bela de design experimental.
4.3 Preparação de formulação de artigo de teste Artigo de teste Con. (mg/ml) Formulação Veículo - 25 mM de Histidina pH 7 10% de sacarose 1 Dissolver 1,61 mg de BCY8245 com 1,604 ml de tampão (veículo) 0,1 Diluir 90 µl 1 mg/ml de matéria prima de BCY8245 com 810 µl de tampão (veículo) BCY8245 0,3 Diluir 270 µl 1 mg/ml de matéria prima de BCY8245 com 630 µl de tampão (veículo) 0,5 Diluir 450 µl 1 mg/ml de matéria prima de BCY8245 com 450 µl de tampão (veículo) Artigo de teste Con. (mg/ml) Formulação Veículo - 25 mM de Histidina pH 7 10% de sacarose BCY8245 1 Dissolver 10,56 mg de BCY8245 em 10,518 ml de tampão de Histidina
Artigo de teste Con. (mg/ml) Formulação BCY8245 0,5 Diluir 400 µl 1 mg/ml de matéria prima de BCY8245 com 400 µl de tampão de Histi- dina BCY8245 0,3 Diluir 240 µl 1 mg/ml de matéria prima de BCY8245 com 560 µl de tampão de Histi- dina
4.4 Coleção de Amostra
[00366] No final do estudo, o plasma foi coletado em 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos e 120 minutos após a última dosa- gem.
5. Resultados
5.1 Curvas de Crescimento de Tumor
[00367] As curvas de crescimento do tumor são mostradas nas Fi- guras 1 e 2.
5.2 Rastreamento de volume de tumor
[00368] Volume médio de tumor ao longo do tempo em camundon- gos nus Balb/c fêmeas portando xenoenxerto NCI-H292 é mostrado nas tabelas abaixo:
Tabela 4: Rastreamento de volume de tumor ao longo do tempo
Tratamento 0 2 4 7 9 11 14 16 Veículo, qw 410±77 516±69 627±61 931±141 1118±225 1208±257 1495±365 1743±419 BCY8245, 404±65 391±42 542±14 721±136 762±115 607±95 614±89 626±93 1/3/5 mpk, qw
Tratamento 18 21 23 25 28 30 32 35 Veículo, qw 1950±551 2149±639 BCY8245, 611±93 654±152 732±139 755±132 713±114 762±165 968±290 1119±216
106/204 1/3/5 mpk, qw
Tabela 5: Rastreamento de volume de tumor ao longo do tempo Tratamento Dias após o início do tratamento 0 2 4 7 9 11 14 Veículo, qw 161±2 270±14 357±14 448±17 570±16 720±36 948±61 BCY8245, 160±5 220±11 266±15 218±23 167±10 161±36 149±43 3 mpk, qw BCY8245, 162±13 243±19 211±12 101±11 100±8 87±7 65±3 3 mpk, biw BCY8245, 160±9 176±7 191±3 105±8 82±3 91±14 83±8 5 mpk, qw
5.3 Análise de Inibição de Crescimento de Tumor
[00369] Taxa de inibição do crescimento do tumor para BCY8245 no modelo de xenoenxerto NCI-H292 no dia 14 foi calculada com base nas medições do volume do tumor. Tabela 6: Análise de inibição de crescimento tumoral Tratamento Volume de T/Cb (%) TGI (%) Valor de P comparado Tumor com veículo 3 a (mm ) Veículo, qw 2149±639 -- -- -- BCY8245, 654±152 30,4 85,7 p<0,05 1/3/5 mpk,qw a. Média ± SEM. b. A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo para o grupo tratado pelo volume tumoral mé- dio do grupo para o grupo de controle (T/C). Tabela 7: Análise de inibição de crescimento tumoral Tratamento Volume de Tumor T/Cb (%) TGI (%) Valor de P compa- (mm3)a rado com veículo Veículo, qw 948±61 -- -- -- BCY8245, 149±43 15,8 101,4 p<0,001 3 mpk, qw BCY8245, 65±3 6,9 112,2 p<0,001 3 mpk, biw BCY8245, 83±8 8,8 109,8 p<0,001 5 mpk, qw a. Média ± SEM. b. A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo para o grupo tratado pelo volume tumoral mé- dio do grupo para o grupo de controle (T/C).
6. Resumo e discussão dos resultados
[00370] Neste estudo, a eficácia terapêutica de BCY8245 no mode- lo de xenoenxerto NCI-H292 foi avaliada. Os volumes de tumor medi-
dos de todos os grupos de tratamento em vários pontos de tempo são mostrados nas Figuras 1 e 2 e nas Tabelas 4 a 7.
[00371] O tamanho médio do tumor dos camundongos tratados com veículo atingiu 879 mm3 no dia 14.
[00372] BCY8245 a 1 mg/kg não produziu atividade antitumoral sig- nificativa, o artigo de teste mostrou atividade antitumoral óbvia após aumentar a dosagem para 3 mg/kg a partir do dia 7, mas a eficácia não foi melhorada depois de aumentar a dosagem para 5 mg/kg no dia
21. Neste estudo, todos os animais de tratamento mostraram perda de peso corporal contínua durante o cronograma de dosagem, isto pode ser devido à carga tumoral e à toxicidade dos artigos de teste.
[00373] BCY8245 a 3mg/kg, qw(TV = 149 mm3, TGI = 101,4%, p<0,001), 3mg/kg, biw(TV = 65 mm3, TGI = 112,2%, p<0,001) e 5mg/kg, qw(TV = 83mm3, TGI = 109,8%, p<0,001) produziu atividade antitumoral significativa. Exemplo 2: Teste de eficácia in vivo de BCY7825, BCY8245, BCY8253, BCY8254 e BCY8255 no tratamento de xenoenxerto HT- 1376 (modelo de câncer de bexiga) em camundongos CB17-SCID
1. Objetivo de Estudo
[00374] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumoral in vivo de artigos de teste no tratamento do xenoenxerto HT-1376 em camundongos CB17-SCID.
2. Design Experimental Grupo Tratamento n Dose Volume de Via de Crono- (mg/kg) Dosagem Dosagem grama (µl/g) 1 Veículo 3 -- 10 iv qw a 2 BCY8245 3 1/3 mg/kg 10 iv qw 3 Veículo 5 -- 10 iv qw 4 BCY8245 3 3 mg/kg 10 iv qw 5 BCY8245 3 3 mg/kg 10 iv biw 6 BCY8245 3 5 mg/kg 10 iv qw a 1 mg/kg na primeira semana e 3 mg/kg nas 2 semanas seguintes
3. Materiais
3.1 Animais e condições de habitação
3.1.1. Animais
[00375] Espécies: Mus Musculus
[00376] Linhagem: CB17-SCID
[00377] Idade: 6 a 8 semanas
[00378] Sexo: fêmeas
[00379] Peso corporal: 18 a 22 g
[00380] Número de animais: 21-41 ratos mais sobressalentes
[00381] Fornecedor de animais: Shanghai LC Labocamundongory Animal Co., LTD.
3.1.2. Condição de habitação
[00382] Os camundongos foram mantidos em gaiolas de ventilação individuais com temperatura e umidade constantes com 3 ou 5 animais em cada gaiola.
[00383]  Temperatura: 20~26 oC.
[00384]  Umidade: 40 a 70%.
[00385] Gaiolas: Feitas de policarbonato. O tamanho é 300 mm x 180 mm x 150 mm. O material de cama é espiga de milho, que é tro- cada duas vezes por semana.
[00386] Dieta: Os animais tiveram livre acesso a alimentos granula- dos secos esterilizados por irradiação durante todo o período de estu- do.
[00387] Água: Os animais tiveram livre acesso a água potável este- rilizada.
[00388] Identificação da gaiola: As etiquetas de identificação de ca- da gaiola continham as seguintes informações: número de animais, sexo, linhagem, data de recebimento, tratamento, número do estudo, número do grupo e data de início do tratamento.
[00389] Identificação do animal: Os animais foram marcados por um código de orelha.
4. Métodos e procedimentos experimentais
4.1 Cultura de Célula
[00390] As células tumorais HT-1376 foram mantidas in vitro como cultura em monocamada em meio EMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado por calor a 37ºC em atmosfera de 5% de CO2 em ar. As células tumorais foram rotineiramente subcultivadas duas vezes por semana por tratamento com tripsina-EDTA. As células que crescem em uma fase de crescimento exponencial foram colhidas e contadas para inoculação do tumor.
4.2 Inoculação de Tumor
[00391] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com células tumorais HT-1376 (5 x 106) em 0,2 ml de PBS com matrigel (1:1) para o desenvolvimento do tumor. Os animais foram randomizados quando o volume médio do tumor atingiu 153-164 mm3. A administração do artigo de teste e o número de animais em cada grupo foram mostrados na tabela de projeto experimental.
4.3 Preparação de formulação de artigo de teste Artigo de Con. Formulação Teste (mg/ml) Veículo - 25 mM de Histidina pH 7 10% de sacarose BCY8245 0,1 Diluir 90 µl 1 mg/ml de matéria prima de BCY8245 com 810 µl de tampão (veículo) BCY8245 0,3 Diluir 270 µl 1 mg/ml de matéria prima de BCY8245 com 630 µl de tampão (veículo) Artigo de Con. Formulação Teste (mg/ml) Veículo - 25 mM de Histidina pH 7 10% de sacarose BCY8245 0,5 Diluir 400µl 1 mg/ml de matéria prima de BCY8245 com 400µl de tampão de Histidina
Artigo de Con. Formulação Teste (mg/ml) BCY8245 0,3 Diluir 240µl 1 mg/ml de matéria prima de BCY8245 com 560µl de tampão de Histidina
4.4 Coleção de Amostra
[00392] No final do estudo, o plasma do grupo 2 foi coletado em 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos e 120 minutos após a úl- tima dosagem. O plasma do grupo 6 foi coletado aos 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos e 120 minutos após a última dosa- gem. O tumor do grupo 6 foi coletado 2 horas após a última dosagem. O tumor dos grupos 4 e 5 foi coletado 2 horas após a última dosagem.
5. Resultados
5.1 Curvas de Crescimento de Tumor
[00393] Curvas de Crescimento de Tumor são mostradas nas Figu- ras 3 e 4.
5.2 Rastreamento de Volume de Tumor
[00394] Volume médio do tumor ao longo do tempo em camundon- gos CB17-SCID fêmeas com xenoenxerto HT-1376 é mostrado nas Tabelas 8 e 9.
Tabela 8: Rastreamento de Volume de Tumor ao Longo do Tempo
Gr.
Tratamento Dias após o início do tratamento 0 2 4 7 9 11 14 16 18 21 1 Veículo, qw 168±37 220±47 274±56 391±73 442±75 503±82 576±84 649±81 801±84 884±81 2 BCY8245, 164±16 184±12 206±14 265±21 291±10 281±28 335±16 354±11 309±19 347±14 1/3 mpk, qw Tabela 9: Rastreamento de Volume de Tumor ao Longo do Tempo
Gr.
Tratmento Dias após o início do tratamento
112/204 0 2 5 7 9 12 14 3 Veículo, qw 153±16 266±30 398±41 529±56 721±76 908±91 1069±90 4 BCY8245,3 153±26 254±53 298±69 398±61 468±73 502±67 603±76 mpk, qw 5 BCY8245,3 154±30 248±58 203±15 273±45 356±50 391±53 407±53 mpk, biw 6 BCY8245,5 153±15 237±41 228±36 317±31 394±20 438±31 465±33 mpk, qw
5.3 Análise de Inibição de Crescimento de Tumor
[00395] Taxa de inibição do crescimento do tumor para artigos de teste no modelo de xenoenxerto HT-1376 foi calculada com base nas medições do volume do tumor no dia 21 após o início do tratamento. Tabela 10: Análise de inibição de crescimento tumoral Gr Tratamento Volume de T/Cb (%) TGI (%) Valor de P compa- Tumor (mm3)a rado com veículo 1 Veículo, qw 884±81 -- -- -- 2 BCY8245,3 347±14 39,2 74,5 p<0,001 mpk, qw a. Média ± SEM. b. A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo para o grupo tratado pelo volume tumoral mé- dio do grupo para o grupo de controle (T/C). Tabela 11: Análise de inibição de crescimento tumoral Gr Tratamento Volume de T/Cb (%) TGI (%) Valor de P compa- Tumor (mm3)a rado com veículo 3 Veículo, qw 1069±90 -- -- -- 4 BCY8245,3 603±76 56,4 50,9 p<0,01 mpk, qw 5 BCY8245,3 407±53 38,1 72,3 p<0,001 mpk, biw 6BCY8245,5 465±33 43,5 66,0 p<0,001 mpk, qw a. Média ± SEM. b. A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo para o grupo tratado pelo volume tumoral mé- dio do grupo para o grupo de controle (T/C).
6. Sumário e discussão dos resultados
[00396] Grupos 1 e 2
[00397] Neste estudo, a eficácia terapêutica dos artigos de teste no modelo de xenoenxerto HT-1376 foi avaliada. Os volumes de tumor medidos de todos os grupos de tratamento em vários pontos de tempo são mostrados na Figura 3 e nas Tabelas 8 e 10.
[00398] O tamanho médio do tumor dos camundongos tratados com veículo atingiu 884 mm3 no dia 21. BCY8245 a 1 mg/kg produziu ativi- dade antitumoral leve e melhor eficácia foi encontrada após aumentar a dosagem para 3 mg/kg a partir do dia 7.
[00399] Neste estudo, alguns camundongos tratados com o artigo de teste a 3 mg/kg mostraram mais de 10% de perda de peso corporal. Grupos 3 a 6
[00400] Neste estudo, a eficácia terapêutica dos artigos de teste no modelo de xenoenxerto HT-1376 foi avaliada. Os volumes de tumor medidos de todos os grupos de tratamento em vários pontos de tempo são mostrados na Figura 4 e nas Tabelas 9 e 11.
[00401] BCY8245 a 3mg/kg, qw (TV = 603 mm3, TGI = 50,9%, p<0,01), 3 mg/kg, biw (TV = 407 mm3, TGI = 72,3%, p<0,001) e 5mg/kg, qw (TV = 465 mm3, TGI = 66,0%, p<0,001) produziu atividade antitumoral significativa.
[00402] Neste estudo, BCY8245 a 5 mg/kg qw causou mais de 10% de perda de peso corporal do animal durante o esquema de tratamen- to. Exemplo 3: Estudo de eficácia in vivo de BCY8245 no tratamento de xenoenxerto Panc2.13 (modelo de câncer pancreático) em camundon- gos nus Balb/c
1. Objetivo de Estudo
[00403] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumoral in vivo de artigos de teste no tratamento do xenoenxerto Panc2.13 em camundongos nus Balb/c.
2. Design Experimental
Gru- Tratamento N Dose Volume de Do- Via de Crono- po (mg/kg) sagem(µl/g) Dosagem grama 1 Veículo 5 -- 10 iv qw 2 BCY8245 3 3 mg/kg 10 iv qw 3 BCY8245 3 3 mg/kg 10 iv biw 4 BCY8245 3 5 mg/kg 10 iv qw
3. Materiais
3.1 Animais e Condição de habitação
3.1.1 Animais
[00404] Espécies: Mus Musculus
[00405] Linhagem: Balb/c nus
[00406] Idade: 6 a 8 semanas
[00407] Sexo: fêmeas
[00408] Peso corporal: 18 a 22 g
[00409] Número de animais: 41 camundongos mais sobressalentes
[00410] Fornecedor de animais: Shanghai LC Labocamundongory Animal Co., LTD.
3.1.2. Condição de habitação
[00411] Os camundongos foram mantidos em gaiolas de ventilação individuais com temperatura e umidade constantes: com 3 ou 5 ani- mais em cada gaiola.
[00412]  Temperatura: 20 ~ 26 oC.
[00413]  Umidade: 40 a 70%.
[00414] Gaiolas: Feito de policarbonato. O tamanho é 300 mm x 180 mm x 150 mm. O material de cama é espiga de milho, que é tro- cada duas vezes por semana.
[00415] Dieta: Os animais tiveram livre acesso a alimentos granula- dos secos esterilizados por irradiação durante todo o período de estudo.
[00416] Água: Os animais tiveram livre acesso a água potável este- rilizada.
[00417] Identificação da gaiola: As etiquetas de identificação de ca- da gaiola continham as seguintes informações: número de animais, sexo, linhagem, data de recebimento, tratamento, número do estudo, número do grupo e data de início do tratamento.
[00418] Identificação do animal: Os animais foram marcados por um código de orelha.
4. Métodos e procedimentos experimentais
4.1 Cultura de Célula
[00419] As células tumorais Panc2.13 serão mantidas em meio RMPI1640 suplementado com 15% de soro fetal bovino inativado pelo calor e 10 unidades / ml de insulina humana recombinante a 37ºC em atmosfera de 5% CO2 em ar. As células tumorais serão rotineiramente subcultivadas duas vezes por semana. As células que crescem em uma fase de crescimento exponencial serão colhidas e contadas para inoculação do tumor.
4.2 Inoculação de Tumor
[00420] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com células tumorais Panc2.13 (5 x 106) com Matrigel (1: 1) em 0,2 ml de PBS para o desenvolvimento do tumor. 41 animais foram randomizados quando o volume médio do tumor atingiu 149 mm3. A administração do artigo de teste e o número de animais em cada grupo foram mostrados na tabela de projeto experimental.
4.3 Preparação da formulação de artigo de teste Artigo de Con. Formulação teste (mg/ml) Veículo - 25 mM de Histidina pH 7 10% de sacarose BCY8245 0,5 Diluir 400 µl 1 mg/ml de matéria prima de BCY8245 com 400 µl de tampão de Histidina BCY8245 0,3 Diluir 240 µl 1 mg/ml de matéria prima de BCY8245 com 560 µl tampão de Histidina
4.4 Coleção de Amostra
[00421] No final do estudo, o tumor de todos os grupos foi coletado 2 horas após a última dosagem.
5. Resultados
5.1 Curvas de Crescimento de Tumor
[00422] A curva de crescimento do tumor é mostrada na Figura 5.
5.2 Rastreamento de Volume de Tumor
[00423] O volume médio do tumor ao longo do tempo em camun- dongos nus Balb / c fêmeas portando xenoenxerto Panc2.13 é mostra- do na Tabela 12. Tabela 12: Rastreamento de Volume de Tumor ao Longo do Tempo Gr. Tratamento Dias após o início do tratamento 0 2 4 7 9 11 14 1 Veículo, qw 149±12 202±12 240±9 321±17 410±27 479±32 545±17 2 BCY8245,3 149±34 160±33 191±39 215±53 242±62 259±59 271±54 mpk, qw 3 BCY8245,3 148±46 170±38 204±57 216±56 236±59 241±60 231±57 mpk, biw 4 BCY8245,5 149±18 180±11 231±33 242±34 248±40 231±37 238±40 mpk, qw
5.3 Análise de Inibição de Crescimento de Tumor
[00424] A taxa de inibição do crescimento do tumor para artigos de teste no modelo de xenoenxerto Panc2.13 foi calculada com base nas medições do volume do tumor no dia 14 após o início do tratamento. Tabela 13: Análise de inibição de crescimento tumoral Gr Tratamento Volume de Tu- T/Cb (%) TGI (%) Valor de P com- mor (mm3)a parado com veí- culo 1 Veículo, qw 545±17 -- -- -- 2 BCY8245,3 271±54 49,6 69,2 p<0,01 mpk, qw 3 BCY8245,3 231±57 42,3 79,1 p<0,001 mpk, biw
Gr Tratamento Volume de Tu- T/Cb (%) TGI (%) Valor de P com- mor (mm3)a parado com veí- culo 4 BCY8245,5 238±40 43,6 77,5 p<0,001 mpk, qw a. Média ± SEM. b. Inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tu- moral médio do grupo para o grupo tratado pelo volume tumoral médio do grupo para o grupo de controle (T/C).
6. Sumário e discussão dos resultados
[00425] Neste estudo, a eficácia terapêutica dos artigos de teste no modelo de xenoenxerto Panc2.13 foi avaliada. Os volumes de tumor medidos de todos os grupos de tratamento em vários pontos de tempo são mostrados na Figura 5 e nas Tabelas 12 e 13.
[00426] BCY8245 a 3 mg/kg, qw (TV = 271 mm3, TGI = 69,2%, p<0,01), 3 mg/kg, biw (TV = 231 mm3, TGI = 79,1%, p<0,001) e 5 mg/kg, qw (TV = 238 mm3, TGI = 77,5%, p<0,001) produziu atividade antitumoral significativa. Exemplo 4: Estudo de eficácia in vivo de BCY8245 no tratamento de xenoenxerto MDA-MB-468 (modelo de câncer de mama) em camun- dongos nus Balb/c
1. Objetivo de Estudo
[00427] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumoral in vivo do BCY8245 no tratamento do xenoenxerto MDA-MB-468 em ca- mundongos pelados Balb/c.
2. Design Experimental Grupo Tratamento n Dose Volume de Do- Via de Crono- (mg/kg) sagem (µl/g) Dosagem grama 1 Veículo 5 -- 10 iv Qw 2 BCY8245 3 3 mg/kg 10 iv Qw 3 BCY8245 3 3 mg/kg 10 iv Biw 4 BCY8245 3 5 mg/kg 10 iv Qw
3. Materiais
3.1 Animais e Condição de habitação
3.1.1 Animais
[00428] Espécies: Mus Musculus
[00429] Linhagem: Balb/c nus
[00430] Idade: 6 a 8 semanas
[00431] Sexo: fêmeas
[00432] Peso corporal: 18 a 22 g
[00433] Número de animais: 41 camundongos mais sobressalentes
[00434] Fornecedor de animais: Shanghai LC Labocamundongory Animal Co., LTD.
3.1.2. Condição de habitação
[00435] Os camundongos foram mantidos em gaiolas de ventilação individuais em temperatura e umidade constantes: com 3 ou 5 animais em cada gaiola.
[00436]  Temperatura: 20 ~ 26 oC.
[00437]  Umidade: 40 a 70%.
[00438] Gaiolas: Feito de policarbonato. O tamanho é 300 mm x 180 mm x 150 mm. O material de cama é espiga de milho, que é tro- cada duas vezes por semana.
[00439] Dieta: Animais tiveram livre acesso a alimentos granulados secos esterilizados por irradiação durante todo o período de estudo.
[00440] Água: Animais tiveram livre acesso a água potável esterili- zada.
[00441] Identificação da gaiola: As etiquetas de identificação de ca- da gaiola continham as seguintes informações: número de animais, sexo, linhagem, data de recebimento, tratamento, número do estudo, número do grupo e data de início do tratamento.
[00442] Identificação do animal: Os animais foram marcados por um código de orelha.
4. Métodos e procedimentos experimentais
4.1 Cultura de Células
[00443] As células tumorais foram mantidas em meio L-15 de Lei- bovitz suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor a 37ºC em uma atmosfera de 5% de CO2 no ar. As células tumorais foram rotineiramente subcultivadas duas vezes por semana. As células que crescem em uma fase de crescimento exponencial foram colhidas e contadas para inoculação do tumor.
4.2 Inoculação de Tumor
[00444] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com células tumorais MDA-MB-468 (10 x 106) em 0,2 ml de PBS suplementado com matrigel 50% para o desenvolvimento do tumor. 41 animais foram randomizados quando o volume médio do tumor atingiu 196 mm3. A administração do artigo de teste e o número de animais em cada grupo foram mostrados na tabela de projeto experimental.
4.3 Preparação da formulação do artigo de teste Artigo de Con. Formulação Teste (mg/ml) Veículo - 25 mM de Histidina pH 7 10% de sacarose BCY8245 1 Dissolver 10,56 mg de BCY8245 em 10,518 ml de tampão de Histidina BCY8245 0,5 Diluir 400 µl 1 mg/ml de matéria prima de BCY8245 com 400 µl de tampão de Histidina BCY8245 0,3 Diluir 240 µl 1 mg/ml de matéria prima de BCY8245 com 560 µl de tampão de Histidina
4.4 Coleção de Amostra
[00445] No dia 21 do estudo, o plasma do grupo 2 foi coletado aos 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos e 120 minutos após a última dosagem. Os tumores dos grupos 1 e 3 foram coletados 2 horas após a última dosagem. Os animais do grupo 4 foram mantidos cor- rendo por mais 21 dias sem qualquer dosagem, e os tumores desses grupos foram coletados no dia 42.
5. Resultados
5.1 Curvas de Crescimento de Tumor
[00446] A curva de crescimento do tumor é mostrada na Figura 6.
5.2 Rastreamento de Volume de Tumor
[00447] O volume médio do tumor ao longo do tempo em camun- dongos nus Balb/c fêmeas com xenoenxerto MDA-MB-468 é mostrado nas Tabelas 14 e 15.
Tabela 14: Rastreamento de Volume de Tumor ao Longo do Tempo (Dia 0 ao dia 21)
Gr.
Tratamento Dias após o início do tratamento 0 2 4 7 9 11 14 16 18 21 1 Veículo, qw 199±6 217±9 235±15 274±14 291±14 314±20 348±24 374±33 398±39 447±39 2 BCY8245, 194±12 192±26 184±20 131±20 113±17 104±13 94±25 81±23 87±23 85±31 3 mpk, qw 3 BCY8245, 195±33 193±27 154±20 103±20 83±16 67±14 49±11 45±14 32±12 22±4 3 mpk, biw
122/204 4 BCY8245, 199±28 193±11 135±4 98±5 58±5 49±5 47±2 37±4 35±3 29±3 5 mpk, qw Tabela 15: Rastreamento de Volume de Tumor ao Longo do Tempo (Dia 23 ao dia 42)
Gr.
Tratamento Dias após o início do tratamento 23 25 28 32 35 39 42 4 BCY8245, 35±5 48±5 37±7 28±6 24±4 28±6 26±6 5 mpk, qw
5.3 Análise de Inibição de Crescimento de Tumor
[00448] A taxa de inibição do crescimento do tumor para artigos de teste no modelo de xenoenxerto MDA-MB-468 foi calculada com base nas medições do volume do tumor no dia 21 após o início do tratamen- to. Tabela 16: Análise de inibição de crescimento tumoral Gr Tratamento Volume de T/Cb (%) TGI (%) Valor de P Tumor com 1 Veículo, qw 447±39 -- -- -- 2 BCY8245, 85±31 18,9 144,2 p<0,001 3 mpk, qw 3 BCY8245, 22±4 4,9 169,8 p<0,001 3 mpk, biw 4 BCY8245, 29±3 6,6 168,4 p<0,001 5 mpk, qw a. Média ± SEM. b. A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo para o grupo tratado pelo volume tumoral mé- dio do grupo para o grupo de controle (T/C).
6. Resumo e discussão dos resultados
[00449] Neste estudo, foi avaliada a eficácia terapêutica dos artigos de teste no modelo de xenoenxerto MDA-MB-468. Os volumes de tu- mor medidos de todos os grupos de tratamento em vários pontos de tempo são mostrados na Figura 6 e nas Tabelas 14 a 16.
[00450] BCY8245 a 3 mg/kg, qw (TV = 85 mm3, TGI = 144,2%, p<0,001), 3 mg/kg, biw (TV = 22 mm3, TGI = 169,8%, p<0,001) e 5 mg/kg, qw (TV = 29 mm3, TGI = 168,4%, p<0,001) produziu atividade antitumoral significativa de maneira dependente da dose ou da fre- quência da dose.
[00451] Os grupos de dosagem de 5 mg/kg foram suspensos a par- tir do dia 21, os tumores não mostraram qualquer recidiva durante o cronograma de monitoramento extra de 3 semanas. Exemplo 5: Teste de eficácia in vivo de BCY8549 em tratamento de xenoenxerto de NCI-H292 (Modelo de câncer de pulmão de célula não pequena (NSCLC)) em camundongos BALB/c nus.
1. Objetivo do estudo
[00452] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumor in vivo de BCY8549 em tratamento de xenoenxerto de NCI-H292 em camun- dongos BALB/c nus.
2. Projeto experimental Grupo Tratamento n Dose Volume de Do- Rotina de Do- Es- (mg/kg) sagem(µl/g) sagem quema 1 Veículo 4 -- 10 iv qw 2 BCY8549 3 3 10 iv qw
3. Materiais
3.1 Animais e Condição de Habitação
3.1.1. Animais
[00453] Espécies: Mus Musculus
[00454] Cepa: Balb/c nu
[00455] Idade: 6 a 8 semanas
[00456] Sexo: fêmea
[00457] Peso corporal: 18 a 22 g
[00458] Número de animais: 43 camundongos mais sobressalentes
[00459] Fornecedor de animal: Shanghai Lingchang Biotechnology Experimental Animal Co. Ltd 3,1,2. Condição de Habitação
[00460] Os camundongos foram mantidos em gaiolas de ventilação individuais em temperatura constante e umidade com 3 ou 4 animais em cada gaiola.
[00461]  Temperatura: 20 ~ 26 oC.
[00462]  Umidade 40 a 70%.
[00463] Gaiolas: Preparadas de policarbonato. O tamanho é 300 mm x 180 mm x 150 mm. O material da cama é espiga de milho, que é trocada duas vezes por semana.
[00464] Dieta: Os animais tiveram livre acesso a alimentos granula- dos secos esterilizados por irradiação durante todo o período de estu- do.
[00465] Água: Animais tiveram livre acesso à água potável esterili- zada.
[00466] Identificação da gaiola: As etiquetas de identificação para cada gaiola continham as seguintes informações: número de animais, sexo, cepa, a data de recebimento, tratamento, número do estudo, número do grupo e a data de início do tratamento.
[00467] Identificação do animal: Animais foram marcados por um código de orelha.
4. Procedimentos e Métodos Experimentais
4.1 Cultura celular
[00468] As células de tumor NCI-H292 foram mantidas in vitro como uma cultura de monocamada em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal inativado por calor a 37ºC em uma atmosfera de 5% de CO2 no ar. As células tumorais foram rotineiramente subcul- tivadas duas vezes por semana por tratamento de tripsina-EDTA. O desenvolvimento das células em uma fase de desenvolvimento expo- nencial foi colhido e contado para inoculação do tumor.
4.2 Inoculação de tumor
[00469] Cada camundongo foi inoculado subcutaneamente no flan- co direito com células de tumor NCI-H292 (10 x 106) em 0,2 ml de PBS para desenvolvimento de tumor. 43 animais foram randomizados quando o volume de tumor médio atingiu 168 mm3. A administração do artigo teste e os números de animal em cada grupo foram mostrados na tabela de projeto experimental. Preparação de Formulação de Artigo Teste
Tratamento Con. Formulação (mg/ml) Veículo -- Histidina a 25 mM pH 7 sacarose a 10% BCY8549 1 Dissolvidos 2 mg de BCY8549 com 1914 µl de tampão de veículo BCY8549 0,3 Diluídos 240 µl de 1 mg/ml de armazenagem de BCY8549 com 560 µl de tampão de veículo
4.4 Coleta de amostra
[00470] No fim do estudo, o plasma de camundongos do grupo 2 foi coletado em 5 minutos,15 minutos, 30 minutos, 1 hora e 2 horas após a última dosagem.
5. Resultados
5.1 Curvas de Desenvolvimento de Tumor
[00471] A curva de desenvolvimento de tumor é mostrada na Figura
7.
5.2 Traço de Volume de Tumor
[00472] Volume médio do tumor ao longo do tempo em camundon- gos Balb/c nu fêmeas portando xenoenxerto de NCI-H292 é mostrado na Tabela 17. Tabela 17: Traço de Volume de Tumor ao longo do tempo Dias após o início de tratamento Gr. Tratamento 0 2 4 7 9 11 14 1 Veículo, qw 168±16 297±48 362±58 460±62 548±69 697±102 843±152 BCY8549,3 2 168±30 187±36 164±31 205±50 234±57 240±98 251±66 mpk, qw BCY8550,3 3 167±18 208±21 237±16 324±35 421±35 489±44 545±77 mpk, qw BCY8783,3 4 167±28 182±27 161±40 137±19 135±22 97±20 97±19 mpk, qw BCY8784,3 5 167±36 165±28 111±19 121±12 123±8 99±10 94±7 mpk, qw
5.3 Análise de Inibição de Desenvolvimento de Tumor
[00473] Taxa de inibição de desenvolvimento de tumor para artigos teste no modelo de xenoenxerto de NCI-H292 foi calculada com base nas medições de volume de tumor no dia 14 após o início de tratamen- to. Tabela 18: Análise de Inibição de Desenvolvimento de Tumor Gr Tratamento Volume de Tumor T/Cb (%) TGI (%) Valor de P (mm3)a 1 Veículo, qw 843±152 -- -- -- 2 BCY8549,3 251±66 29,8 87,7 p<0,05 mpk, qw a. ± SEM médio. b. Inibição de desenvolvimento de tumor é calculada dividindo o vo- lume de tumor médio do grupo para o grupo tratado pelo volume de tumor médio do grupo para o grupo de controle (T/C).
6. Discussão e Sumário de Resultados
[00474] Neste estudo, a eficácia terapêutica de BCYs no modelo de xenoenxerto de NCI-H292 foi avaliada. O volume de tumor medido de todos os grupos de tratamento em vários pontos de tempo é mostrado na Figura 7 e Tabelas 17 e 18.
[00475] O tamanho de tumor médio de camundongos tratados por veículo atingiu 843 mm3 no dia 14. BCY8549 em 3 mg/kg mostrou sig- nificante atividade antitumor. Neste estudo, todos os camundongos mantiveram peso corporal bem. Exemplo 6: Investigação de Associação entre Variação de Número de Cópia (CNV) e expressão de gene para Nectina-4 de tipos de tumor múltiplo Métodos
1. Selecionar todos os estudos em cBioPortal (http://www.cbioportal.org/) e pesquisa para NECTIN4. (a) Remover estudos provisórios. (b) Desmarcar estudos com amostras sobrepostas para preve- nir viés de amostra (com base no aviso em cBioPortal)- sempre man- tenha o estudo PanCancer se esta for uma opção.
(c) Estudos selecionados para análise (Tabela 19). Tabela 19: Estudos analisados de cBioPortal e unidades em estudo Nome de estudo Unidades Câncer de Mama (METABRIC, Expressão de mRNA (microarranjo) Nature 2012 & Nat Commun 2016) Carcinoma Invasivo de Mama Lote de expressão de mRNA norma- (TCGA, PanCancer Atlas) lizada/fundida de Ilumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Carcinoma Endometrial de Corpo Lote de expressão de mRNA norma- Uterino (TCGA, PanCancer Atlas) lizada/fundida de Ilumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Carcinoma Urotelial de Bexiga RSEM (Lote normalizada de Ilumina (TCGA, PanCancer Atlas) HiSeq_RNASeqV2) Adenocarcinoma de pulmão Expressão de mRNA, RSEM (Lote (TCGA, PanCancer Atlas) normalizada de Ilumina HiS- eq_RNASeqV2) Carcinoma de Célula Escamosa RSEM (Lote normalizada de Ilumina Cervical (TCGA, PanCancer HiSeq_RNASeqV2) Atlas) Carcinoma de Célula Escamosa Lote de expressão de mRNA norma- do Pulmão (TCGA, PanCancer lizada/fundida de Ilumina HiS- Atlas) eq_RNASeqV2 syn4976369 Carcinoma de Célula Escamosa Expressão de mRNA, RSEM (Lote da Cabeça e Pescoço (TCGA, normalizada de Ilumina HiS- PanCancer Atlas) eq_RNASeqV2) Adenocarcinoma Pancreático =Lote de expressão de mRNA nor- (TCGA, PanCancer Atlas) malizada/fundida de Ilumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Carcinoma da Tireoide (TCGA, Lote de expressão de mRNA norma- PanCancer Atlas) lizada/fundida de Ilumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Adenocarcinoma de Cólon RSEM (Lote normalizada de Ilumina (TCGA, PanCancer Atlas) HiSeq_RNASeqV2)
Nome de estudo Unidades Timoma (TCGA, PanCancer lote de expressão de mRNA norma- Atlas) lizada/fundida de Ilumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Sarcoma (TCGA, PanCancer lote de expressão de mRNA norma- Atlas) lizada/fundida de Ilumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Adenocarcinoma de Estômago lote de expressão de mRNA norma- (TCGA, PanCancer Atlas) lizada/fundida de Ilumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Adenocarcinoma da Próstata expressão de mRNA, RSEM (Lote (TCGA, PanCancer Atlas) normalizada de Ilumina HiS- eq_RNASeqV2) Cromofóbico renal (TCGA, Pan- expressão de mRNA, RSEM (Lote Cancer Atlas) normalizada de Ilumina HiS- eq_RNASeqV2) Adenocarcinoma do Reto (TCGA, lote de expressão de mRNA norma- PanCancer Atlas) lizada/fundida de Ilumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Câncer da Próstata Metastático, expressão de mRNA / captura (RNA SU2C/PCF Dream Team (Robin- Seq RPKM) son et al., Cell 2015) Feocromocitoma e Paraganglio- Lote de expressão de mRNA norma- ma (TCGA, PanCancer Atlas) lizada/fundida de Ilumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Carcinoma Renal de Células Cla- Expressão de mRNA, RSEM (Lote ras do Rim (TCGA, PanCancer normalizada de Ilumina HiS- Atlas) eq_RNASeqV2) Adenocarcinoma da Próstata Expressão de mRNA (Fred Hutchinson CRC, Nat Med 2016) Adenocarcinoma Colorretal RNA Seq RPKM (TCGA, Nature 2012) Cistadenocarcinoma seroso de Lote de expressão de mRNA norma- ovário (TCGA, PanCancer Atlas) lizada/fundida de Ilumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369
Nome de estudo Unidades Carcinoma Renal de Células Pa- Expressão de mRNA, RSEM (Lote pilares do Rim (TCGA, PanCan- normalizada de Ilumina HiS- cer Atlas) eq_RNASeqV2) Glioma de Menor Grau do Cére- RSEM (Lote normalizada de Ilumina bro (TCGA, PanCancer Atlas) HiSeq_RNASeqV2) Adenocarcinoma Esofágico RSEM (Lote normalizada de Ilumina (TCGA, PanCancer Atlas) HiSeq_RNASeqV2) Adrenocortical Carcinoma RSEM (Lote normalizada de Ilumina (TCGA, PanCancer Atlas) HiSeq_RNASeqV2) Glioblastoma Multiforme (TCGA, Expressão de mRNA, RSEM (Lote PanCancer Atlas) normalizada de Ilumina HiS- eq_RNASeqV2) Adenocarcinoma da Próstata Expressão de mRNA (MSKCC, Cancer Cell 2010) Carcinosarcoma Uterino (TCGA, Lote de expressão de mRNA norma- PanCancer Atlas) lizada/fundida de Ilumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Leucemia Mieloide Aguda Expressão de mRNA, RSEM (Lote (TCGA, PanCancer Atlas) normalizada de Ilumina HiS- eq_RNASeqV2) Melanoma Cutâneo da Pele Lote de expressão de mRNA norma- (TCGA, PanCancer Atlas) lizada/fundida de Ilumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Mesotelioma (TCGA, PanCancer Lote de expressão de mRNA norma- Atlas) lizada/fundida de Ilumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Colangiocarcinoma (TCGA, Pan- RSEM (Lote normalizada de Ilumina Cancer Atlas) HiSeq_RNASeqV2) Leucemia Linfoide Aguda Pediá- NECTIN4: expressão de mRNA trica – Fase II (TARGET, 2018) (RNA-Seq RPKM) Linfoma de Célula B Grande Di- Expressão de mRNA, RSEM (Lote fusa (TCGA, PanCancer Atlas) normalizada de Ilumina HiS- eq_RNASeqV2)
Nome de estudo Unidades Enciclopédia de Linhagem Celu- Expressão de mRNA (microarranjo) lar Cancerígena (Novartis/Broad, Nature 2012) Melanoma Uveal (TCGA, Pan- Lote de expressão de mRNA norma- Cancer Atlas) lizada/fundida de Ilumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Tumor de Wilms Pediátrico NECTIN4: expressão de mRNA (TARGET, 2018) (RNA-Seq RPKM) Tumores de Células Germinati- Lote de expressão de mRNA norma- vas Testiculares (TCGA, Pan- lizada/fundida de Ilumina HiS- Cancer Atlas) eq_RNASeqV2 syn4976369 Carcinoma Hepatocelular do Fí- NECTIN4: expressão de mRNA, gado (TCGA, PanCancer Atlas) RSEM (Lote normalizada de Ilumina HiSeq_RNASeqV2)
2. Exportar dados de expressão de CNV e RNA de cBioPortal.
3. Testar se CNVs são estatisticamente significantemente associados com mudanças em expressão de mRNA para Nectina-4 (log2 não apli- cado). (a) Executar teste Kruskal-Wallis não paramétrico em GraphPad Prism (7,04) e R/R studio (limite de significância: p<0,01). (i) GraphPad Prism: configurar tabela de coluna, executar teste não paramétrico sem correspondência ou emparelhamento e não assumir distribuição Gaussian. (ii) Pacotes usados em R:
1. XLConnect
2. dplyr
3. Kruskal-Wallis Rank Sum Test: Kruskal.test.
4. Ajustar para comparações múltiplas (incluir todas as possíveis comparações mesmo se n=1 dentro de um grupo) em R/Rstudio usando teste de Dunn (limite de significância: p<0,025). (a) dunn.test com método de comparação múltipla = "bonferonni".
Resultados
[00476] Os resultados são mostrados na tabela 20 abaixo. Em 41 conjuntos de dados TCGA disponíveis publicamente que relatam da- dos de expressão de gene de tumor CNV e mRNA para Nectina-4, existem muitas indicações onde casos foram reportados com ganhos de número de cópias de Nectina-4 (2 a 3 cópias) ou amplificações (>3 cópias). Além disso, casos separados demonstraram ter deleções su- perficiais (< 2 cópias) com relatórios raros de tumores contendo dele- çoes profundas consistentes com mais do que 1 perda de cópia ou perda de nectina-4 bialélica. Indicações onde amplificações foram de- tectadas mais frequentemente foram câncer de mama (10-22%), cân- cer de bexiga (20%), câncer de pulmão (5-7%) e carcinoma hepatoce- lular (8%). Indicações com perdas de número de cópia mais frequente foram cromófobo renal (77%), carcinoma renal de células claras (RCC)(6,5%), sarcoma (10%), câncer de cólon (10%), câncer de cabe- ça e pescoço (7%) e câncer escamoso de pulmão. Estes dados indi- cam que existe uma faixa de CNV dentro de e nas indicações de tumor e uma diversidade de padrões de número de cópias em diferentes in- dicações.
[00477] Além das CNVs no conjunto de dados TCGA, o nível médio de expressão de mRNA da Nectina-4 por indicação cobre aproxima- damente 210 faixas. Portanto, faixa de níveis de expressão de mRNA de Nectina-4 fornecida e as CNVs observadas através e dentro de tes- te estatístico de tipos de tumor foram realizadas para identificar asso- ciações potenciais entre níveis de mRNA de Nectina-4 e CNVs de Nectina-4 em conjuntos de dados/indicações de TCGA individuais. Tumores por indicação foram alocados para 1 de 5 classes: a) Deleção profunda; b) Deleção superficial; c) Diplóide;
d) Ganho; ou e) Amplificação.
[00478] Teste de Kruskall-Wallis foi então realizado para detectar se as distribuições de valores de expressão de mRNA por classes diferi- ram entre classes (P < 0,01). Para aqueles conjuntos de dados de TCGA com P < 0,01 e para identificar que classes eram diferentes umas das outras, teste post hoc foi realizado calculando estatísticas Z com valores P ajustados calculados (Bonferonni). Para simplicidade de interpretação, comparações por pares vs. diplóide por indicação foram revisadas (embora todos os valores P dos pares tenham sido calcula- dos). 18/41 estudos de TCGA encontraram Kruskall-Wallis P <0,01 & Bonferonni P <0,025 para comparações de Ganho vs. Diploide e/ou Amplificação vs. Diploide, indicando uma associação de expressão aumentada de mRNA de Nectina-4 com número de cópias de Nectina- 4 aumentado. Estes 18 estudos representaram 14 histologias tumorais independentes: mama, útero, bexiga, adenocarcinoma pulmonar, pulmão escamoso, cervical, cabeça e pescoço, pancreático, tireoidiano, color- retal, timoma, sarcoma, carcinoma renal de células claras (CCR) e es- tômago.
[00479] Além disso, 6 estudos diminuíram a expressão de mRNA associada com a perda de número de cópias. Quatro desses seis es- tudos não apenas mostraram uma associação entre perda de CNV e expressão reduzida, mas também relataram ganhos de CNV associa- dos com alta expressão: estômago, pulmão escamoso, cólon e tireóide.
[00480] Enquanto duas indicações, cromófobo renal e câncer de próstata relataram apenas associações com perda de CNV e baixa abundância de transcritos. Além disso, houve um estudo separado do câncer de próstata (Metastatic Prostate Cancer, SU2C / PCF Dream
Team (Robinson et al., Cell 2015)) que mostrou ganhos de número de cópias associados com alta expressão (em relação a diploide).
[00481] Estas observações de perda e ganho de CNV do tumor com níveis de expressão de mRNA podem representar o mecanismo por trás da expressão da proteína tumoral Nectina-4 nas indicações onde tais associações foram observadas. É claro que existem Indica- ções onde CNVs não parecem impactar os níveis de expressão de mRNA em um padrão previsível, como carcinoma hepatocelular. A efi- cácia pré-clínica in vivo com certos conjugados de fármacos bicíclicos de Nectina-4 da invenção demonstrou correlacionar-se com a expres- são da proteína Nectina-4 como medido por IHC. Portanto, se os CNVs de Nectina-4 tumorais associarem-se aos níveis de mRNA e preverem os níveis de expressão de proteínas, é formalmente possível que os pacientes com tumores contendo aumentos no número de có- pias (ganho ou amplificação) possam ter maior probabilidade de res- ponder aos conjugados de fármacos bicíclicos de Nectina-4 da inven- ção. Se os pacientes pudessem ser identificados com CNV aumentado em Nectina-4, então esta informação poderia ser usada para selecio- nar pacientes para o tratamento com conjugados de fármacos bicícli- cos de Nectina-4 da invenção.
Tabela 20: Resultados de Investigação de Associação entre Variação de Número de Cópia (CNV) e expressão de gene para Nectina-4 Número de amostras/grupo (n=X) Teste Kruskal-Wallis Comparação por pares, estatística Z (valor P ajus- tado), Bonferonni Nome de estu- Unidades Deleção Deleção Diplóide Ganho Ampli- Estatística Valor p Deleção Diplóide – Diplóide- Amplificação - do profunda superficial ficação Kruskal- profunda - deleção Ganho Diplóide Wallis Diplóide superficial Câncer de Expressão de 0 11 745 706 404 380,4 < 2,2e- N/A 0,568782 -11,89096 18,85085 ma- mRNA (microar- 16 (1,0000) (0,0000)* (0,0000)* ma(METABRIC ranjo) , Nature 2012 & Nat Commun 2016) Carcinoma Lote de expressão 0 13 244 640 97 219,5 < 2,2e- N/A 1,186089 -12,30176 12,07432
135/204 Invasivo de de mRNA normali- 16 (0,7068) (0,0000)* (0,0000)* Mama (TCGA, zada/fundida de PanCancer Ilumina HiS- Atlas) eq_RNASeqV2 syn4976369 Carcinoma Lote de expressão 0 5 274 210 18 76,392 < 2,2e- N/A 1,130854 -7,274308 5,601260 Endometrial de de mRNA normali- 16 (0,7743) (0,0000)* (0,0000)* Corpo Uterino zada/fundida de (TCGA, Pan- Ilumina HiS- Cancer Atlas) eq_RNASeqV2 syn4976369 Carcinoma RSEM (Lote nor- 0 16 171 145 70 67,078 1,80E-14 N/A 0,060907 -3,323839 8,054269 Urotelial de malizada de Ilumi- (1,0000) (0,0027)* (0,0000)* Bexiga (TCGA, na HiS- PanCancer eq_RNASeqV2) Atlas)
Número de amostras/grupo (n=X) Teste Kruskal-Wallis Comparação por pares, estatística Z (valor P ajus- tado), Bonferonni Nome de estu- Unidades Deleção Deleção Diplóide Ganho Ampli- Estatística Valor p Deleção Diplóide – Diplóide- Amplificação - do profunda superficial ficação Kruskal- profunda - deleção Ganho Diplóide Wallis Diplóide superficial Adenocarcino- Expressão de 0 9 129 332 33 59,578 7,24E-13 N/A 0,237200 -6,244156 6,247228 ma do Pulmão mRNA, RSEM (1,0000) (0,0000)* (0,0000)* (TCGA, Pan- (Lote normalizada Cancer Atlas) de Ilumina HiS- eq_RNASeqV2) Carcinoma de RSEM (Lote nor- 0 7 115 147 6 51,372 4,08E-11 N/A 1,093749 -6,170067 3,815296 Célula Escani- malizada de Ilumi- (0,8222) (0,0000)* (0,0004)* sa Cervical na HiS-
136/204 (TCGA, Pan- eq_RNASeqV2) Cancer Atlas) Carcinoma de Lote de expressão 0 22 199 222 23 42,128 3,77E-09 N/A 2,819759 -3,034709 4,860629 Célula Esca- de mRNA normali- (0,0144)* (0,0072)* (0,0000)* mosa do Pul- zada/fundida de mão (TCGA, Ilumina HiS- PanCancer eq_RNASeqV2 Atlas) syn4976369 Carcinoma de Expressão de 0 32 330 122 4 37,81 3,10E-08 N/A 1,736867 -4,848550 3,033083 Célula Esca- mRNA, RSEM (0,2472) (0,0000)* (0,0073)* mosa da Cabe- (Lote normalizada ça e Pescoço de Ilumina HiS- (TCGA, Pan- eq_RNASeqV2) Cancer Atlas)
Número de amostras/grupo (n=X) Teste Kruskal-Wallis Comparação por pares, estatística Z (valor P ajus- tado), Bonferonni Nome de estu- Unidades Deleção Deleção Diplóide Ganho Ampli- Estatística Valor p Deleção Diplóide – Diplóide- Amplificação - do profunda superficial ficação Kruskal- profunda - deleção Ganho Diplóide Wallis Diplóide superficial Adenocarcino- Lote de expressão 0 7 105 50 6 36,863 4,92E-08 N/A 1,333193 -4,388701 4,166401 ma Pancreático de mRNA normali- (0,5474) (0,0000)* (0,0001)* (TCGA, Pan- zada/fundida de Cancer Atlas) Ilumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Carcinoma da Lote de expressão 0 3 451 26 0 31,882 1,19E-07 N/A 2,486724 -5,021279 N/A Tireoide de mRNA normali- (0,0193)* (0,0000)*
137/204 (TCGA, Pan- zada/fundida de Cancer Atlas) Ilumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Adenocarcino- RSEM (Lote nor- 0 40 266 80 2 31,309 7,32E-07 N/A 3,811621 -2,987223 1,759508 ma de Cólon malizada de Ilumi- (0,0004)* (0,0084)* (0,2355) (TCGA, Pan- na HiS- Cancer Atlas) eq_RNASeqV2) Timoma Lote de expressão 0 0 95 22 2 26,213 2,03E-06 N/A N/A -4,962115 1,567541 (TCGA, Pan- de mRNA normali- (0,0000)* (0,1755) Cancer Atlas) zada/fundida de Ilumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369
Número de amostras/grupo (n=X) Teste Kruskal-Wallis Comparação por pares, estatística Z (valor P ajus- tado), Bonferonni Nome de estu- Unidades Deleção Deleção Diplóide Ganho Ampli- Estatística Valor p Deleção Diplóide – Diplóide- Amplificação - do profunda superficial ficação Kruskal- profunda - deleção Ganho Diplóide Wallis Diplóide superficial Sarcoma Lote de expressão 0 22 120 74 14 26,831 6,39E-06 N/A -0,410850 -4,582047 3,106262 (TCGA, Pan- de mRNA normali- (1,0000) (0,0000)* (0,0057)* Cancer Atlas) zada/fundida de Ilumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Adenocarcino- Lote de expressão 0 11 253 134 9 19,096 0,000261 N/A 2,835658 -2,921683 -0,265333 ma de Estôma- de mRNA normali- 1 (0,0137)* (0,0104)* (1,0000)
138/204 go (TCGA, zada/fundida de PanCancer Ilumina HiS- Atlas) eq_RNASeqV2 syn4976369 Adenocarcino- Expressão de 3 15 437 29 3 19,125 0,000742 -2,532734 3,202764 -1,351661 0,509151 ma da Próstata mRNA, RSEM 6 (0,0566) (0,0068)* (0,8824) (1,0000) (TCGA, Pan- (Lote normalizada Cancer Atlas) de Ilumina HiS- eq_RNASeqV2) Cromófobo Expressão de 0 50 14 1 0 13,851 0,000982 N/A 3,609735 -0,058395 N/A renal (TCGA, mRNA, RSEM 3 (0,0005)* (1,0000) PanCancer (Lote normalizada Atlas) de Ilumina HiS- eq_RNASeqV2)
Número de amostras/grupo (n=X) Teste Kruskal-Wallis Comparação por pares, estatística Z (valor P ajus- tado), Bonferonni Nome de estu- Unidades Deleção Deleção Diplóide Ganho Ampli- Estatística Valor p Deleção Diplóide – Diplóide- Amplificação - do profunda superficial ficação Kruskal- profunda - deleção Ganho Diplóide Wallis Diplóide superficial Adenocarcino- Lote de expressão 0 11 91 33 1 14,056 0,00283 N/A 1,050760 -2,951363 1,809506 ma do Re- de mRNA normali- (0,8801) (0,0095)* (0,2111) to(TCGA, Pan- zada/fundida de Cancer Atlas) Ilumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Câncer de Expressão de 0 3 75 37 2 12,336 0,006317 N/A 0,040058 -3,420479 -0,362109 Prósata Metas- mRNA / captura (1,0000) (0,0019)* (1,0000)
139/204 táico, (RNA Seq RPKM) SU2C/PCF Dream Team (Robinson et al., Cell 2015) Feocromocito- Lote de expressão 0 14 123 19 5 11,573 0,008998 N/A -1,271308 -2,597791 2,201970 ma e Paragan- de mRNA normali- (0,6109) (0,0281) (0,0830) glioma (TCGA, zada/fundida de PanCancer Ilumina HiS- Atlas) eq_RNASeqV2 syn4976369 Carcinoma Expressão de 0 22 297 32 1 11,314 0,01014 N/A -0,748380 -2,996852 1,502464 renal de células mRNA, RSEM (1,0000) (0,0082)* (0,3989) claras (TCGA, (Lote normalizada PanCancer de Ilumina HiS- Atlas) eq_RNASeqV2)
Número de amostras/grupo (n=X) Teste Kruskal-Wallis Comparação por pares, estatística Z (valor P ajus- tado), Bonferonni Nome de estu- Unidades Deleção Deleção Diplóide Ganho Ampli- Estatística Valor p Deleção Diplóide – Diplóide- Amplificação - do profunda superficial ficação Kruskal- profunda - deleção Ganho Diplóide Wallis Diplóide superficial Adenocarcino- Expressão de 0 1 59 66 7 9,8842 0,01958 N/A 0,677737 -0,409530 3,028793 ma de Próstata mRNA (1,0000) (1,0000) (0,0074)* (Fred Hutchin- son CRC, Nat Med 2016) Adenocarcino- RNA Seq RPKM 0 4 153 34 2 9,4054 0,02 N/A 0,062894 -1,860678 2,514653 ma Colorretal (1,0000) (0,1884) (0,0357) (TCGA, Nature
140/204 2012) Cistadenocar- Lote de expressão 0 7 75 117 2 9,3101 0,02544 N/A 1,589035 -2,168253 0,062706 cinoma seroso de mRNA normali- (0,3362) (0,0904) (1,0000) de ovário zada/fundida de (TCGA, Pan- Ilumina HiS- Cancer Atlas) eq_RNASeqV2 syn4976369 Carcinoma Expressão de 1 19 239 15 0 9,1134 0,02782 1,607764 -0,569938 -2,552083 N/A renal de células mRNA, RSEM (0,3237) (1,0000) (0,0321) papilares dos (Lote normalizada rins (TCGA, de Ilumina HiS- PanCancer eq_RNASeqV2) Atlas) Glioma de Me- RSEM (Lote nor- 0 11 462 32 2 4,769 0,1895 N/A 0,462462 -1,718955 1,261960 nor Grau Cere- malizada de Ilumi- (1,0000) (0,2569) (0,6209) bral (TCGA, na HiS- PanCancer eq_RNASeqV2) Atlas)
Número de amostras/grupo (n=X) Teste Kruskal-Wallis Comparação por pares, estatística Z (valor P ajus- tado), Bonferonni Nome de estu- Unidades Deleção Deleção Diplóide Ganho Ampli- Estatística Valor p Deleção Diplóide – Diplóide- Amplificação - do profunda superficial ficação Kruskal- profunda - deleção Ganho Diplóide Wallis Diplóide superficial Esophageal RSEM (Lote nor- 0 8 78 86 9 4,267 0,234 N/A 0,747441 -0,768855 1,756911 Adenocarcino- malizada de Ilumi- (1,0000) (1,0000) (0,2368) ma (TCGA, na HiS- PanCancer eq_RNASeqV2) Atlas) Carcinoma RSEM (Lote nor- 0 9 54 11 2 4,0298 0,2583 N/A 0,157281 -0,131234 1,984800 Adrenocortical malizada de Ilumi- (1,0000) (1,0000) (0,1415) (TCGA, Pan- na HiS-
141/204 Cancer Atlas) eq_RNASeqV2) Glioblastoma Expressão de 0 3 115 27 0 2,6252 0,2691 N/A 0,180194 -1,593755 N/A Multiforme mRNA, RSEM (1,0000) (0,1665) (TCGA, Pan- (Lote normalizada Cancer Atlas) de Ilumina HiS- eq_RNASeqV2) Adenocarcino- Expressão de 0 3 78 4 0 2,181 0,3361 N/A 1,423206 0,454433 N/A ma da Próstata mRNA (0,2320) (0,9743) (MSKCC, Can- cer Cell 2010) Carcinosarco- Lote de expressão 0 4 14 37 1 3,308 0,3465 N/A 0,104285 -0,539065 1,764353 ma Uterino de mRNA normali- (1,0000) (1,0000) (0,2330) (TCGA, Pan- zada/fundida de Cancer Atlas) Ilumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369
Número de amostras/grupo (n=X) Teste Kruskal-Wallis Comparação por pares, estatística Z (valor P ajus- tado), Bonferonni Nome de estu- Unidades Deleção Deleção Diplóide Ganho Ampli- Estatística Valor p Deleção Diplóide – Diplóide- Amplificação - do profunda superficial ficação Kruskal- profunda - deleção Ganho Diplóide Wallis Diplóide superficial Leucemia Mie- Expressão de 0 0 163 2 0 0,82638 0,3633 N/A N/A 0,909052 N/A loide Aguda mRNA, RSEM (0,1817) (TCGA, Pan- (Lote normalizada Cancer Atlas) de Ilumina HiS- eq_RNASeqV2) Melanoma Lote de expressão 1 19 146 189 8 3,6483 0,4557 -0,898187 -1,116994 -1,235317 0,900287 Cutâneo da de mRNA normali- (1,0000) (1,0000) (1,0000) (1,0000) Pele (TCGA, zada/fundida de
142/204 PanCancer Ilumina HiS- Atlas) eq_RNASeqV2 syn4976369 Mesotelioma Lote de expressão 0 2 56 23 1 2,3747 0,4984 N/A -1,426445 0,418206 0,143440 (TCGA, Pan- de mRNA normali- (0,4612) (1,0000) (1,0000) Cancer Atlas) zada/fundida de Ilumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Colangiocarci- RSEM (Lote nor- 0 0 13 18 5 1,3058 0,5205 N/A N/A -0,653051 1,121055 noma (TCGA, malizada de Ilumi- (0,7706) (0,3934) PanCancer na HiS- Atlas) eq_RNASeqV2) Leucemia Lin- NECTIN4: expres- 0 4 66 10 1 2,2337 0,5253 N/A 0,133399 -0,504875 -1,375728 foide Agudo são de mRNA (1,0000) (1,0000) (0,5067) Padiátrico Fase (RNA-Seq RPKM) II (TARGET, 2018)
Número de amostras/grupo (n=X) Teste Kruskal-Wallis Comparação por pares, estatística Z (valor P ajus- tado), Bonferonni Nome de estu- Unidades Deleção Deleção Diplóide Ganho Ampli- Estatística Valor p Deleção Diplóide – Diplóide- Amplificação - do profunda superficial ficação Kruskal- profunda - deleção Ganho Diplóide Wallis Diplóide superficial Linfoma de Expressão de 0 2 25 9 1 1,4939 0,6837 N/A 0,374642 1,170326 -0,405844 Célula B Gran- mRNA, RSEM (1,0000) (0,7256) (1,0000) de Difusa (Lote normalizada (TCGA, Pan- de Ilumina HiS- Cancer Atlas) eq_RNASeqV2) Enciclopédia de Expressão de 1 112 396 319 49 1,9013 0,7539 -0,398204 0,562427 -0,847920 -0,379251 Linhagem Celu- mRNA (microar- (1,0000) (1,0000) (1,0000) (1,0000) lar Canceríge- ranjo)
143/204 na (Novar- tis/Broad, Natu- re 2012) Melanoma Lote de expressão 0 0 72 8 0 0,067914 0,7944 N/A N/A -0,260603 N/A Uveal (TCGA, de mRNA normali- (0,3972) PanCancer zada/fundida de Atlas) Ilumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Tumor de NECTINA4: ex- 0 1 50 46 4 0,78538 0,853 N/A 0,165021 -0,815915 -0,090701 Wilms Pediátri- pressão de mRNA (1,0000) (1,0000) (1,0000) co (TARGET, (RNA-Seq RPKM) 2018)
Número de amostras/grupo (n=X) Teste Kruskal-Wallis Comparação por pares, estatística Z (valor P ajus- tado), Bonferonni Nome de estu- Unidades Deleção Deleção Diplóide Ganho Ampli- Estatística Valor p Deleção Diplóide – Diplóide- Amplificação - do profunda superficial ficação Kruskal- profunda - deleção Ganho Diplóide Wallis Diplóide superficial Testicular Lote de expressão 0 1 76 67 0 0,14279 0,9311 N/A -0,366969 0,061216 N/A Germ Cell Tu- de mRNA normali- (1,0000) (1,0000) mors (TCGA, zada/fundida de PanCancer Ilumina HiS- Atlas) eq_RNASeqV2 syn4976369 Carcinoma NECTINA4: ex- 0 1 89 224 34 0,2908 0,9618 N/A 0,082418 0,188961 0,363341 hepatocelular pressão de mRNA, (1,0000) (1,0000) (1,0000)
144/204 Renal (TCGA, RSEM (Lote nor- PanCancer malizada de Ilumi- Atlas) na HiS- eq_RNASeqV2)
Exemplo 7: Análises de expressão de Nectina-4 em 6 linhagens celu- lares
1. Objetivo do estudo
[00482] O objetivo do estudo foi avaliar a expressão de Nectina-4 em 6 linhagens celulares por citometria de fluxo, incluindo linhagens celulares de 2 cânceres de mama (T-47D, MDA-MB-468), 3 cânceres de pulmão (NCI-H292, NCI-H322, NCI-H526) e 1 fibrossarcoma (HT- 1080).
2. Design do Painel
[00483] Painel para FCM em T-47D, MDA-MB-468, NCI-H292, NCI- H322 e HT-1080 Fluorocromo Em branco Isótipo Painel PE - Isótipo ctrl Nectina-4 Painel para NCI-H526 Fluorocromo Em branco Isótipo Painel PE - Isótipo ctrl Nectina-4 BV421 Vivo/morto Vivo/morto Vivo/morto
3. Material
3.1 Amostra Lista de linhagens celulares Item Linha- Tipo de Fornece- Proprie- Meio de cultura gens câncer dor dades celula- da cultu- res ra 1 T-47D Câncer ATCC- aderente RPMI- de ma- HTB-133 1640+0,2 Uni- ma dades/ml de insulina bovi- na+10% de
FBS 2 MDA- Câncer ATCC- aderente Leibovitz's L- MB-468 de ma- HTB-132 15+10% de ma FBS
Item Linha- Tipo de Fornece- Proprie- Meio de cultura gens câncer dor dades celula- da cultu- res ra 3 NCI- Pulmão 91091815 aderente RPMI- H292 1640+10% de
FBS 4 NCI- Pulmão 95111734 aderente RPMI- H322 1640+Glutamin a a 2 mM+10% de FBS 5 NCI- Pulmão CRL-5811 round RPMI- H526 clusters 1640+10% de in sus- FBS pension 6 HT1080 Fibros- ECACC- aderente EMEM+Glutam sarcoma 85111505 ina a 2 mM+1% de aminoáci- dos não es- senciais (NEAA)+10% de FBS
3.2. Reagentes Anticorpos e kit para análise de citometria de fluxo Fluores- Marcador Catálogo Fornecedor Comentário cência PE Nectina-4 FAB2659P R&D AAAO0217021 PE Controle de Isótipo IC0041P R&D de BICY- IgG2b 20161117A
[00484] DPBS (Corning-21-031-CV)
[00485] Tampão de manchamento (eBioscience-00-4222)
[00486] Tampão de fixação (BD-554655)
3.3. Instrumentos Centrífuga Eppendorf 5810R Citômetro de fluxo BD FACS Canto (BD)
4. Procedimentos e Métodos Experimentais
4.1 Coleta de amostra
[00487] Colher as linhagens celulares em desenvolvimento em uma fase de desenvolvimento exponencial. Contagem de células por he- mocitômetro com manchamento com azul Trypan. Centrifugar as célu- las a 400Xg durante 5 minutos a 4 °C, lavar as células duas vezes com tampão de manchamento, e suspender as células em tampão de man- chamento para 1 X107/mL.
4.2 Manchamento de Anticorpo
[00488] 1) Aliquotou 100 μL de suspensão celular para cada cavi- dade de uma placa V de 96 cavidades.
[00489] 2) Adicionou controle de isótipo ou anticorpos em células de suspensão e incubou durante 30 minutos a 4 °C no escuro.
[00490] 3) Lavou as células 2X por centrifugação a 400Xg durante 5 minutos a 4 °C e descartou o sobrenadante.
[00491] 4) Ressuspendeu as células com tampão de fixação de 100 μL e incubou durante 30 minutos a 4 °C no escuro.
[00492] 5) Lavou as células 2X por centrifugação a 300Xg durante 5 minutos a 4 °C e removeu o sobrenadante
[00493] 6) Ressuspendeu as células em tampão de manchamento de 400 μL.
[00494] 7) Analisou os dados de FACS usando o software FlowJo V10.
4.3 Análise de Dados
[00495] Todos os dados de FACS foram analisados por software Flowjo V10 e Graphpad Prism ou software Excel.
5. Resultados
5.1 Estratégia de Bloqueio para Painel
[00496] A Estratégia de Bloqueio para Nectina-4 é mostrada nas Figuras 8 a 11.
5.2 Análise de Dados
5.2.1. Viabilidade de linhagens celulares
[00497] A viabilidade de linhagens celulares foi como abaixo. No. Linhagem celular Tipo de câncer Viabilidade Células/milhão viáveis 1 T-47D Mama 98,1 8,6 2 MDA-MB-468 Mama 98,7 5,3 3 NCI-H292 Pulmão 98,7 10,4 4 NCI-H322 Pulmão 98,5 6,6 5 NCI-H526 Pulmão 79,9 4,0 6 HT1080 Fibrossarcoma 98,0 14,7
5.2.2. A expressão positiva de Nectina-4 em linhagens celulares
[00498] A expressão positiva e MFI de Nectina-4 em 6 linhagens celulares foram como a lista. No. Linhagem celular Nectina-4 MFI-Isótipo MFI-Painel 1 T-47D 99,0 % 132 1808 2 MDA-MB-468 99,0 % 184 2324 3 NCI-H292 97,9 % 180 729 4 NCI-H322 99,1 % 145 1655 5 NCI-H526 0,21% 104 91,3 6 HT1080 1,53 % 134 134
6. Discussão
[00499] Houve uma expressão elevada de Nectina-4 em câncer de mama T-47D (99,0%), MDA-MB-468 (99,0%) e câncer de pulmão NCI- H292 (97,9%), NCI-H322 (99,1%). Em NCI-H526 e HT-1080, nenhuma expressão de Nectina-4 foi encontrada. Exemplo 8: Análises de expressão de Nectina-4 em 9 linhagens celu- lares CDX por citometria de fluxo
1. Objetivo do estudo
[00500] O objetivo deste projeto é avaliar a expressão de superfície de Nectina-4 (PVRL-4) em 9 linhagens celulares, incluindo 1 câncer de mama (MDA-MB-468), 4 cânceres de pulmão (NCI-H292, NCI-H358, NCI-H526, A549), 1 câncer pancreático (Panc02,13), 2 cânceres color- retais (HCT-116, HT-29) e 1 câncer de bexiga (HT1376) linhagens ce- lulares.
2. Design do Painel Painel para FCM em 9 linhagens celulares Fluorocromo Em branco Isótipo Painel PE - Controle de Isótipo IgG2b Nectina-4 BV421 Vivo/morto Vivo/morto Vivo/morto
3. Materiais
3.1 Amostras Lista de linhagens celulares Item Linha- Tipo de Fornecedor Proprieda- Meio de cul- gem ce- câncer des da cultu- tura lular ra 1 HT1376 Bexiga ATCC- aderente EMEM + CRL-1472 10% de FBS 2 MDA- Mama ATCC- aderente L-15 de Lei- MB-468 HTB-132 bovitz +10% de FBS 3 HCT-116 Colorre- ATCC- aderente RPMI 1640 + tal CCL-247 10% de FBS 4 HT-29 Colorre- ATCC- aderente 5a de McCoy tal HTB-38 + 10% de
FBS 5 A549 Pulmão ATCC- aderente F-12K + 10% CCL-185 de FBS 6 NCI- Pulmão ECACC- suspensão RPMI 1640 + H292 91091815 10% de FBS 7 NCI- Pulmão ECACC- aderente RPMI 1640 + H358 95111733 10% de FBS 8 NCI-526 Pulmão ATCC- aderente RPMI 1640 + CRL-5811 10% de FBS
Item Linha- Tipo de Fornecedor Proprieda- Meio de cul- gem ce- câncer des da cultu- tura lular ra 9 Panc02, Pân- ATCC- aderente RPMI- 13 creas CRL-2554 1640+15% de FBS+5 ug/ml de in- sulina huma- na
3.2. Reagentes
[00501] 1) DPBS (Corning, 21-031-CV )
[00502] 2) Tripsina a 0,25% (Invitrogen- 25200072)
[00503] 3) Tampão de manchamento (eBioscience, 00-4222)
[00504] 4) Tampão de fixação (BD, 554655)
[00505] 5) Anticorpo Fluorescência Marcador Catálogo Fornecedor Comentário PE Nectina-4 FAB2659P R&D AAAO0217021 PE Camundon- IC0041P R&D go IgG2b BV421 Vivo/morto L34964 Invitrogen -
3.3. Instrumentos
[00506] Centrífuga Eppendorf 5810R
[00507] Citômetro de fluxo BD FACS Canto (BD) (Dia 0 ao dia 21)
4. Procedimentos e Métodos Experimentais
4.1 Cultura celular
[00508] Descongelamento de células
[00509] 1) Limpou os frascos congelados com álcool a 70% e rapi- damente descongelou os frascos em banho de água a 37 oC.
[00510] 2) Centrifugou a suspensão celular a aproximadamente 1000 rpm durante 5 minutos, removeu o sobrenadante e adicionou meio de pré-aquecimento aos frascos.
[00511] 3) Incubou os frascos de cultura a 37 °C, 5% de incubador de CO2.
[00512] Passagem celular
[00513] 1) Aqueceu o meio e tripsina em banho de água a 37°C.
[00514] 2) Removeu o meio de cultura e enxaguou a camada celu- lar com DPBS.
[00515] 3) Adicionou 5 mL de solução de tripsina a 0,25% ao frasco e diluiu tripsina com meio de 5 mL.
[00516] 4) Centrifugou a suspensão celular a 1000 rpm durante 5 minutos.
[00517] 5) Adicionou meio fresco de 15 mL e ressuspendeu as célu- las por pipeta levemente.
[00518] 6) Adicionou suspensão celular apropriada a novos frascos de cultura.
[00519] 7) Incubou frascos de cultura a 37°C, incubador de CO2 a 5%.
4.2. Coleta de Amostras
[00520] Colheu as linhagens celulares em desenvolvimento em uma fase de desenvolvimento exponencial. Contou as células com man- chamento azul Trypan. Centrifugou as células a 400×g durante 5 minu- tos a 4°C, lavou células com tampão de manchamento duas vezes e suspendeu as células em tampão de manchamento para 5×106/mL.
4.3. Manchamento de Anticorpo
[00521] Aliquotou 100 μL de suspensão celular em cada cavidade da placa V de 96 cavidades. Adicionou controle de isótipo ou anticor- pos em células de suspensão e incubou durante 30 minutos a 4°C no escuro. Lavou as células 2 vezes por centrifugação a 400×g durante 5 minutos a 4 °C e descartou o sobrenadante. Ressuspendeu as células em tampão de manchamento de 300 μL. Analisou os dados de FACS usando software Flow Jo V10.
4.4. Análise de Dados
[00522] Todos os dados de FACS foram analisados por software Flow Jo V10 e GraphPad Prism ou software Excel.
5. Resultados
5.1. Estratégia de Bloqueio para Painel
[00523] Estratégia de Bloqueio for Nectina-4 é mostrada nas Figu- ras 12 a 16.
5.2. Análise de Dados
[00524] Expressão positiva e MFI de Nectina-4 em 9 linhagens celu- lares foram como lista. No. Linhagem celular Nectina-4 MFI-Isótipo MFI-Painel 1 HT1376 92,4 % 36,2 803 2 MDA-MB-468 97,1 % 28,9 460 3 HCT-116 1,85 % 14,5 15,6 4 HT-29 40,0 % 20,5 88,3 5 A549 1,07% 20,5 21,6 6 NCI-H292 71,1 % 22,9 149 7 NCI-H358 90,1 % 26,5 361 8 NCI-526 1,22 % 8,33 12,1 9 Panc02,13 51,9 % 36,2 128
6. Discussão
[00525] Houve uma expressão elevada de Nectina-4 em câncer de bexiga HT-1376 (92,4%), câncer de mama MDA-MB-468 (97,1%) e câncer de pulmão NCI-H358 (90,1%). Uma expressão média de Necti- na-4 foi encontrada em HT-29 (40,0%), NCI-H292 (71,1%) e Panc02,13 (51,9%). Em HCT-116, A549 e NCI-526, nenhuma expres- são de Nectina-4 foi encontrada. Este dado será usado para guiar se- leção de modelo para estudos de eficácia. Exemplo 9: Estudos de Eficácia In vivo Exemplo 9.1: Estudo de eficácia in vivo de artigos teste no tratamento de xenoenxerto de A549 em camundongos Balb/c nus
1. Objetivo do estudo
[00526] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumor in vivo de artigos teste no tratamento de xenoenxerto de A549 em camun- dongos Balb/c nus.
2. Projeto experimental Gru- Tratamento n Dose Volume de Do- Rotina de Do- Es- po (mg/kg) sagem (µl/g) sagem quema 1 Veículo 5 -- 10 iv qw 2 BCY8245 3 3 mg/kg 10 iv qw 3 BCY8245 3 3 mg/kg 10 iv biw 4 BCY8245 3 5 mg/kg 10 iv qw
3. Materiais Animais e Condição de Habitação
3.1.1. Animais
[00527] Espécies: Mus Musculus
[00528] Cepa: Balb/c nu
[00529] Idade: 6 a 8 semanas
[00530] Sexo: fêmea
[00531] Peso corporal: 18 a 22 g
[00532] Número de animais: 41 camundongos mais sobressalentes
3.1.2. Condição de Habitação
[00533] Os camundongos foram mantidos em gaiolas de ventilação individuais em temperatura constante e umidade com 3 ou 5 animais em cada gaiola.
[00534]  Temperatura: 20 ~ 26 oC.
[00535]  Umidade 40 a 70%.
[00536] Gaiolas: Preparadas de policarbonato. O tamanho é 300 mm x 180 mm x 150 mm. O material da cama é espiga de milho, que é trocada duas vezes por semana.
[00537] Dieta: Os animais tiveram livre acesso a alimentos granula- dos secos esterilizados por irradiação durante todo o período de estu- do.
[00538] Água: Animais tiveram livre acesso à água potável esterili-
zada.
[00539] Identificação da gaiola: As etiquetas de identificação para cada gaiola continham as seguintes informações: número de animais, sexo, cepa, a data de recebimento, tratamento, número do estudo, número de grupo e a data de início do tratamento.
[00540] Identificação do animal: Animais foram marcados por um código de orelha.
4. Procedimentos e Métodos Experimentais
4.1. Cultura celular
[00541] As células tumorais A549 foram mantidas in vitro como uma cultura de monocamada em meio F-12K suplementado com 10% de soro bovino fetal inativado por calor a 37 ºC em uma atmosfera de 5% de CO2 no ar. As células tumorais foram rotineiramente subcultivadas duas vezes por semana por tratamento de tripsina-EDTA. O desenvol- vimento das células em uma fase de desenvolvimento exponencial foi colhido e contado para inoculação do tumor.
4.2. Inoculação de tumor
[00542] Cada camundongo foi inoculado subcutaneamente no flan- co direito com células tumorais A549 (5 x 106) em 0,2 ml de PBS para desenvolvimento de tumor. 41 animais foram randomizados quando o volume de tumor médio atingiu 158 mm3. A administração do artigo teste e os números de animal em cada grupo foram mostrados na ta- bela de projeto experimental.
4.3. Preparação de Formulação de Artigo Teste Con. Artigo teste Formulação (mg/ml) Veículo - Histidina a 25 mM pH 7 10% de sacarose Diluir 400 µl de 1 mg/ml de armazenagem de BCY8245 0,5 BCY8245 com tampão de histidina de 400 µl Diluir 240 µl de 1 mg/ml de armazenagem de BCY8245 0,3 BCY8245 com tampão de histidina de 560 µl
4.4. Coleta de amostra
[00543] No fim do estudo, o tumor de todos os grupos foram coleta- dos a 2 horas após a última dosagem.
5. Resultados
5.1. Curvas de Desenvolvimento de Tumor
[00544] A curva de desenvolvimento de tumor é mostrada na Figura
17.
5.2. Traço de Volume de Tumor
[00545] Volume de tumor médio ao longo do tempo em camundon- gos Balb/c nus fêmeas portadores de xenoenxerto de A549 é mostra- do na tabela 21. Tabela 21: Traço de Volume de Tumor ao longo do tempo Gr. Tratamento Dias após o início de tratamento 0 2 5 7 9 12 14 1 Veículo, qw 158±13 235±24 278±26 346±39 387±35 471±45 568±49 2 BCY8245,3 157±10 208±15 197±25 257±40 293±41 341±54 356±53 mpk, qw 3 BCY8245,3 157±14 183±27 158±16 184±6 182±8 190±15 194±27 mpk, biw 4 BCY8245,5 157±14 179±22 147±10 172±23 173±24 204±36 228±33 mpk, qw
5.3. Análise de Inibição de Desenvolvimento de Tumor
[00546] Taxa de inibição de desenvolvimento de tumor para artigos teste no modelo de xenoenxerto de A549 foi calculada com base nas medições de volume de tumor no dia 14 após o início de tratamento. Tabela 22: Análise de Inibição de Desenvolvimento de Tumor Gr Tratamento Volume de Tumor T/Cb (%) TGI (%) Valor de P (mm3)a comparado com veículo 1 Veículo, qw 568±49 -- -- -- 2 BCY8245,3 356±53 62,8 51,4 p<0,05 mpk, qw 3 BCY8245,3 194±27 34,2 90,8 p<0,001 mpk, biw
Gr Tratamento Volume de Tumor T/Cb (%) TGI (%) Valor de P (mm3)a comparado com veículo 4 BCY8245,5 228±33 40,2 82,6 p<0,001 mpk, qw a. ± SEM médio. b. Inibição de desenvolvimento de tumor é calculada dividindo o vo- lume de tumor médio do grupo para o grupo tratado pelo volume de tumor médio do grupo para o grupo de controle (T/C).
6. Discussão e Sumário de Resultados
[00547] Neste estudo, a eficácia terapêutica de artigos teste no mo- delo de xenoenxerto de A549 foi avaliada. Os volumes de tumor medi- dos de todos os grupos de tratamento em vários pontos de tempo são mostrados na Figura 17 e Tabelas 21 e 22.
[00548] O tamanho de tumor médio de camundongos tratados por veículo atingiu 568 mm3 no dia 14. BCY8245 a 3 mg/kg, qw (TV = 356 mm3, TGI = 51,4%, p<0,05), 3 mg/kg, biw (TV = 194 mm3, TGI = 90,8%, p<0,01) e 5 mg/kg, qw (TV = 228 mm3, TGI = 82,6%, p<0,001) produziram significante atividade antitumoral em dose ou maneira de- pendente da frequência da dose.
[00549] Animais em grupos BCY8245 mantiveram o peso corporal bem. Nesta linhagem celular, que mostra expressão mínima de Necti- na-4 em estudos FACS, desenvolvimento de tumor é recebido por BCY8245, porém, o tumor não sofre regressão, enfatizando o requisito direcionado ao alvo para a eficácia ideal. Exemplo 9.2: Estudo de eficácia in vivo de artigos teste no tratamento de xenoenxerto de HCT116 em camundongos Balb/c nus
1. Objetivo do estudo
[00550] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumor in vivo de artigos teste no tratamento de xenoenxerto de HCT116 em camun- dongos Balb/c nus.
2. Projeto experimental Grupo Tratamento n Dose Volume de Rotina de Esquema (mg/kg) Dosagem Dosagem (µl/g) 1 Veículo 5 -- 10 iv qw 2 BCY8245 3 3 10 iv qw 3 BCY8245 3 3 10 iv biw 4 BCY8245 3 5 10 iv qw
3. Materiais
3.1. Animais e Condição de Habitação
3.1.1. Animais
[00551] Espécies: Mus Musculus
[00552] Cepa: Balb/c nu
[00553] Idade: 6 a 8 semanas
[00554] Sexo: fêmea
[00555] Peso corporal: 18 a 22 g
[00556] Número de animais: 41 camundongos mais sobressalentes
3.1.2. Condição de Habitação
[00557] Os camundongos foram mantidos em gaiolas de ventilação individuais em temperatura constante e umidade com 3 ou 5 animais em cada gaiola.
[00558]  Temperatura: 20 ~ 26oC.
[00559]  Umidade 40 a 70%.
[00560] Gaiolas: Preparadas de policarbonato. O tamanho é 300 mm x 180 mm x 150 mm. O material da cama é espiga de milho, que é trocada duas vezes por semana.
[00561] Dieta: Os animais tiveram livre acesso a alimentos granula- dos secos esterilizados por irradiação durante todo o período de estu- do.
[00562] Água: Animais tiveram livre acesso à água potável esterili- zada.
[00563] Identificação da gaiola: As etiquetas de identificação para cada gaiola continham as seguintes informações: número de animais, sexo, cepa, a data de recebimento, tratamento, número do estudo, número de grupo e a data de início do tratamento.
[00564] Identificação do animal: Animais foram marcados por um código de orelha.
4. Procedimentos e Métodos Experimentais
4.1 Cultura celular
[00565] As células HCT116 foram mantidas em meio suplementado com 10% de soro bovino fetal inativado por calor a 37ºC em uma at- mosfera de 5% de CO2 no ar. As células tumorais foram rotineiramente subcultivadas duas vezes por semana. O desenvolvimento das células em uma fase de desenvolvimento exponencial foi colhido e contado para inoculação do tumor.
4.2. Inoculação de tumor
[00566] Cada camundongo foi inoculado subcutaneamente no flan- co direito com células tumorais HCT116 (5,0 x 106) em 0,2 ml de PBS para desenvolvimento de tumor. 41 animais foram randomizados quando o volume de tumor médio atingiu 166 mm3. A administração do artigo teste e os números de animal em cada grupo foram mostrados na tabela de projeto experimental.
4.3. Preparação de Formulação de Artigo Teste Artigo teste Conc. Formulação (mg/ml) Veículo - Histidina a 25 mM pH 7 10% de sacarose BCY8245 0,5 Diluir 400 µl de 1 mg/ml de armazenagem de BCY8245 com tampão de histidina de 400 µl BCY8245 0,3 Diluir 240 µl de 1 mg/ml de armazenagem de BCY8245 com tampão de histidina de 560 µl
4.4. Coleta de amostra
[00567] No fim do estudo no dia 14, os tumores de grupo 1 e 2 fo-
ram coletados para FFPE. Para grupo 4, os plasmas foram coletados a 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos e 120 minutos após a dosagem. Os tumores foram também coletados e armazenados a - 80oC.
5. Resultados
5.1. Curvas de Desenvolvimento de Tumor
[00568] A curva de desenvolvimento de tumor é mostrada na Figura
18.
5.2. Traço de Volume de Tumor
[00569] Volume de tumor médio ao longo do tempo em camundon- gos Balb/c nus fêmeas portadores de xenoenxerto de HCT116 é mos- trado na tabela 23. Tabela 23: Traço de Volume de Tumor ao longo do tempo GrupoTratamento Dias após o início de tratamento 0 2 4 7 9 12 14 1 Veículo, 166±12219±21323±29397±28488±36630±49 769±71 qw 2 BCY8245,3167±11209±13227±17269±33324±39348±27 425±28 mpk, qw 3 BCY8245,3166±18229±40215±42213±49213±48206±55 197±50 mpk, biw 4 BCY8245,5166±35201±42176±15183±17170±16125±18 134±12 mpk, qw
5.3. Análise de Inibição de Desenvolvimento de Tumor
[00570] Taxa de inibição de desenvolvimento de tumor para artigos teste no modelo de xenoenxerto de HCT116 foi calculada com base nas medições de volume de tumor no dia 14 após o início do tratamen- to.
Tabela 24: Análise de Inibição de Desenvolvimento de Tumor Grupo Tratamento Volume de T/Cb (%) TGI (%) Valor de P Tumor (mm3)a 1 Veículo, 769±71 -- -- -- qw 2 BCY8245, 425±28 55.2 57,1 p＜0,001 3 mpk, qw 3 BCY8245, 197±50 25,6 94,9 p＜0,001 3 mpk, biw 4 BCY8245, 134±12 17,4 105.2 p＜0,001 5 mpk, qw a. ± SEM médio; b. Inibição de desenvolvimento de tumor é calculada dividindo o volume de tumor médio do grupo para o grupo tratado pelo volume de tumor médio do grupo para o grupo de controle (T/C).
6. Discussão e Sumário de Resultados
[00571] Neste estudo, a eficácia terapêutica de artigos teste no mo- delo de xenoenxerto de HCT116 foi avaliada. Os volumes de tumor medidos de todos os grupos de tratamento em vários pontos de tempo são mostrados na Figura 18 e Tabelas 23 e 24.
[00572] O tamanho de tumor médio de camundongos tratados por veículo atingiu 769 mm3 no dia 14 após o início de tratamento. BCY8245 a 3 mg/kg, qw (TV = 425 mm3, TGI = 57,1%, p＜0,001), 3 mg/kg, biw (TV = 197 mm3, TGI = 94,9%, p<0,001) e 5 mg/kg, qw (TV = 134 mm3, TGI = 105.2%, p<0,001) produziram significante atividade antitumoral em dose ou maneira dependente da frequência da dose.
[00573] Neste estudo, os animais em todos de grupos de 5 mg/kg qw perderam em média 10% do peso corporal.
[00574] Nesta linhagem celular, que mostra expressão mínima de Nectina-4 em estudos FACS, desenvolvimento de tumor é recebido por BCY8245, porém, o tumor não sofre regressão, enfatizando o re-
quisito direcionado ao alvo para a eficácia ideal.
[00575] Exemplo 9.3: Estudo de eficácia in vivo de artigos teste no tratamento de enxerto de HT-1376 rm camundongos CB17-SCID
1. Objetivo do estudo
[00576] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumor in vivo de artigos teste no tratamento de xenoenxerto de HT-1376 em camun- dongos CB17-SCID.
2. Projeto experimental Grupo Tratamento n Dose Volume de Rotina Esquema (mg/kg) Dosagem de Do- (µl/g) sagem 1 Veículo 5 -- 10 iv qw 2 BCY8245 3 3 mg/kg 10 iv qw 3 BCY8245 3 3 mg/kg 10 iv biw 4 BCY8245 3 5 mg/kg 10 iv qw
3. Materiais
3.1 Animais e Condição de Habitação
3.1.1. Animais
[00577] Espécies: Mus Musculus
[00578] Cepa: CB17-SCID
[00579] Idade: 6 a 8 semanas
[00580] Sexo: fêmea
[00581] Peso corporal: 18 a 22 g
[00582] Número de animais: 41 camundongos mais sobressalentes
3.1.2. Condição de Habitação
[00583] Os camundongos foram mantidos em gaiolas de ventilação individuais em temperatura constante e umidade com 3 ou 5 animais em cada gaiola.
[00584]  Temperatura: 20 ~ 26 oC.
[00585]  Umidade 40 a 70%.
[00586] Gaiolas: Preparadas de policarbonato. O tamanho é 300 mm x 180 mm x 150 mm. O material da cama é espiga de milho, que é trocada duas vezes por semana.
[00587] Dieta: Os animais tiveram livre acesso a alimentos granula- dos secos esterilizados por irradiação durante todo o período de estu- do.
[00588] Água: Animais tiveram livre acesso à água potável esterili- zada.
[00589] Identificação da gaiola: As etiquetas de identificação para cada gaiola continham as seguintes informações: número de animais, sexo, cepa, a data de recebimento, tratamento, número do estudo, número de grupo e a data de início do tratamento.
[00590] Identificação do animal: Animais foram marcados por um código de orelha.
4. Procedimentos e Métodos Experimentais
4.1 Cultura celular
[00591] As células tumorais HT-1376 serão mantidas em meio EMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal inativado por calor a 37ºC em uma atmosfera de 5% de CO2 no ar. As células tumorais serão rotineiramente subcultivadas duas vezes por semana. O desen- volvimento das células em uma fase de desenvolvimento exponencial será colhido e contado para inoculação do tumor.
4.2 Inoculação de tumor
[00592] Cada camundongo foi inoculado subcutaneamente no flan- co direito com células tumorais HT-1376 (5 x 106) com Matrigel (1:1) em 0,2 ml de PBS para desenvolvimento de tumor. 41 animais foram randomizados quando o volume de tumor médio atingiu 153 mm3. A administração do artigo teste e os números de animal em cada grupo foram mostrados na tabela de projeto experimental.
4.3. Preparação de Formulação de Artigo Teste
Artigo teste Con. Formulação (mg/ml) Veículo - Histidina a 25 mM pH 7 10% de sacarose BCY8245 0,5 Diluir 400 µl de 1 mg/ml de armazenagem de BCY8245 com tampão de histidina de 400 µl BCY8245 0,3 Diluir 240 µl de 1 mg/ml de armazenagem de BCY8245 com tampão de histidina de 560 µl
4.4. Coleta de amostra
[00593] No fim do estudo, o plasma de grupo 4 foi coletado a 5 mi- nutos, 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos e 120 minutos após a última dosagem. O tumor de grupo 4 foi coletado a 2 horas após a última do- sagem. O tumor de grupos 1, 2 e 3 foram coletados a 2 horas após a última dosagem.
5. Resultados
5.1. Curvas de Desenvolvimento de Tumor
[00594] A curva de desenvolvimento de tumor é mostrada na Figura
19.
5.2. Traço de Volume de Tumor
[00595] Volume de tumor médio ao longo do tempo em camundon- gos CB17-SCID fêmeas portadores de xenoenxerto de HT-1376 é mostrado na tabela 25. Tabela 25: Traço de Volume de Tumor ao longo do tempo Gr. Tratamento Dias após o início de tratamento 0 2 5 7 9 12 14 1 Veículo, qw153±16 266±30 398±41 529±56 721±76 908±91 1069±90 2 BCY8245,3 153±26 254±53 298±69 398±61 468±73 502±67 603±76 mpk, qw 3 BCY8245,3 154±30 248±58 203±15 273±45 356±50 391±53 407±53 mpk, biw 4 BCY8245,5 153±15 237±41 228±36 317±31 394±20 438±31 465±33 mpk, qw
5.3. Análise de Inibição de Desenvolvimento de Tumor
[00596] Taxa de inibição de desenvolvimento de tumor para artigos teste no modelo de xenoenxerto de HT-1376 foi calculada com base nas medições de volume de tumor no dia 14 após o início de tratamen- to. Tabela 26: Análise de Inibição de Desenvolvimento de Tumor Gr Tratamento Volume de T/Cb (%) TGI (%) Valor de P compa- Tumor rado com veículo 3 a (mm ) 1 Veículo, qw 1069±90 -- -- -- 2 BCY8245,3 603±76 56,4 50,9 p<0,01 mpk, qw 3 BCY8245, 407±53 38,1 72,3 p<0,001 3 mpk, biw 4 BCY8245,5 465±33 43,5 66,0 p<0,001 mpk, qw a. ± SEM médio. b. Inibição de desenvolvimento de tumor é calculada dividindo o vo- lume de tumor médio do grupo para o grupo tratado pelo volume de tumor médio do grupo para o grupo de controle (T/C).
6. Discussão e Sumário de Resultados
[00597] Neste estudo, a eficácia terapêutica de artigos teste no mo- delo de xenoenxerto de HT-1376 foi avaliada. Os volumes de tumor medidos de todos os grupos de tratamento em vários pontos de tempo são mostrados na Figura 19 e Tabelas 25 e 26.
[00598] O tamanho de tumor médio de camundongos tratados por veículo atingiu 1069 mm3 no dia 14. BCY8245 a 3 mg/kg, qw (TV = 603 mm3, TGI = 50,9%, p<0,01), 3 mg/kg, biw (TV = 407 mm3, TGI = 72,3%, p<0,001) e 5 mg/kg, qw (TV = 465 mm3, TGI = 66,0%, p<0,001) produziram significante atividade antitumoral. Neste estudo, BCY8245 a 5 mg/kg qw causou mais de 10% de perda de peso corporal do ani- mal durante o esquema de tratamento. Exemplo 9.4: Estudo de eficácia in vivo de artigos teste no tratamento de xenoenxerto de MDA-MB-468 em camundongos Balb/c nus
1. Objetivo do estudo
[00599] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumor in vivo de artigos teste no tratamento de xenoenxerto de MDA-MB-468 em camundongos Balb/c nus.
2. Projeto experimental Grupo Tratamento n Dose Volume de Rotina Esquema (mg/kg) Dosagem de Do- (µl/g) sagem 1 Veículo 5 -- 10 iv qw 2 BCY8245 3 3 mg/kg 10 iv qw 3 BCY8245 3 3 mg/kg 10 iv biw 4 BCY8245 3 5 mg/kg 10 iv qw
3. Materiais
3.1 Animais e Condição de Habitação
3.1.1. Animais
[00600] Espécies: Mus Musculus
[00601] Cepa: Balb/c nu
[00602] Idade: 6 a 8 semanas
[00603] Sexo: fêmea
[00604] Peso corporal: 18 a 22 g
[00605] Número de animais: 41 camundongos mais sobressalentes
3.1.2. Condição de Habitação
[00606] Os camundongos foram mantidos em gaiolas de ventilação individuais em temperatura constante e umidade com 3 ou 5 animais em cada gaiola.
[00607]  Temperatura: 20 ~ 26 oC.
[00608]  Umidade 40 a 70%.
[00609] Gaiolas: Preparadas de policarbonato. O tamanho é 300 mm x 180 mm x 150 mm. O material da cama é espiga de milho, que é trocada duas vezes por semana.
[00610] Dieta: Os animais tiveram livre acesso a alimentos granula- dos secos esterilizados por irradiação durante todo o período de estu- do.
[00611] Água: Animais tiveram livre acesso à água potável esterili- zada.
[00612] Identificação da gaiola: As etiquetas de identificação para cada gaiola continham as seguintes informações: número de animais, sexo, cepa, a data de recebimento, tratamento, número do estudo, número de grupo e a data de início do tratamento.
[00613] Identificação do animal: Animais foram marcados por um código de orelha.
4. Procedimentos e Métodos Experimentais
4.1 Cultura celular
[00614] As células tumorais foram mantidas em meio de Leibovitz L-15 suplementado com 10% de soro bovino fetal inativado por calor a 37ºC em uma atmosfera de 5% de CO2 no ar. As células tumorais fo- ram rotineiramente subcultivadas duas vezes por semana. O desen- volvimento das células em uma fase de desenvolvimento exponencial foi colhido e contado para inoculação do tumor.
4.2 Inoculação de tumor
[00615] Cada camundongo foi inoculado subcutaneamente no flan- co direito com células tumorais MDA-MB-468 (10 x 106) em 0,2 ml de PBS suplementado com 50% de matrigel para desenvolvimento de tumor. 41 animais foram randomizados quando o volume de tumor médio atingiu 196 mm3. A administração do artigo teste e os números de animal em cada grupo foram mostrados na tabela de projeto expe- rimental.
4.3 Preparação de Formulação de Artigo Teste
Artigo teste Con. (mg/ml) Formulação Veículo - Histidina a 25 mM pH 7 10% de sacarose BCY8245 1 Dissolver 10,56 mg de BCY8245 em Tam- pão de histidina de 10,518 ml BCY8245 0,5 Diluir 400 µl de 1 mg/ml de armazenagem de BCY8245 com tampão de histidina de 400 µl BCY8245 0,3 Diluir 240 µl de 1 mg/ml de armazenagem de BCY8245 com tampão de histidina de 560 µl
4.4 Coleta de amostra
[00616] No dia 21 do estudo, o plasma de grupo 2 foi coletado a 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos e 120 minutos após a úl- tima dosagem. Os tumores de grupos 1 e 3 foram coletados a 2 horas após a última dosagem. Os animais em grupo 4 foram mantidos em execução durante mais 21 dias sem qualquer dosagem, e os tumores destes grupos foram coletados no dia 42.
5. Resultados
5.1 Curvas de Desenvolvimento de Tumor
[00617] A curva de desenvolvimento de tumor é mostrada na Figura
20.
5.2 Traço de Volume de Tumor
[00618] Volume de tumor médio ao longo do tempo em camundon- gos Balb/c nus fêmeas portadores de xenoenxerto de MDA-MB-468 é mostrado nas tabelas 27 e 28.
5.3 Análise de Inibição de Desenvolvimento de Tumor
[00619] Taxa de inibição de desenvolvimento de tumor para artigos teste no modelo de xenoenxerto de MDA-MB-468 foi calculada com base nas medições de volume de tumor no dia 21 após o início do tra- tamento.
Tabela 27: Traço de Volume de Tumor ao longo do tempo (Dia 0 ao dia 21)
Gr.
Tratamento Dias após o início de tratamento 0 2 4 7 9 11 14 16 18 21 1 Veículo, qw 199±6 217±9 235±15 274±14 291±14 314±20 348±24 374±33 398±39 447±39 2 BCY8245, 194±12 192±26 184±20 131±20 113±17 104±13 94±25 81±23 87±23 85±31 3 mpk, qw 3 BCY8245, 195±33 193±27 154±20 103±20 83±16 67±14 49±11 45±14 32±12 22±4 3 mpk, biw
168/204 4 BCY8245, 199±28 193±11 135±4 98±5 58±5 49±5 47±2 37±4 35±3 29±3 5 mpk, qw
Tabela 28: Traço de Volume de Tumor ao longo do tempo (Dia 23 ao dia 42) Gr. Tratamento Dias após o início de tratamento 23 25 28 32 35 39 42 4 BCY8245, 35±5 48±5 37±7 28±6 24±4 28±6 26±6 5 mpk, qw Tabela 29: Análise de Inibição de Desenvolvimento de Tumor Gr Tratamento Volume de T/Cb (%) TGI (%) Valor de P com- Tumor parado com (mm3)a veículo 1 Veículo, qw 447±39 -- -- -- 2 BCY8245, 85±31 18,9 144.2 p<0,001 3 mpk, qw 3 BCY8245, 22±4 4,9 169,8 p<0,001 3 mpk, biw 4 BCY8245, 29±3 6,6 168,4 p<0,001 5 mpk, qw a. ± SEM médio. b. Inibição de desenvolvimento de tumor é calculada dividindo o vo- lume de tumor médio do grupo para o grupo tratado pelo volume de tumor médio do grupo para o grupo de controle (T/C).
6. Discussão e Sumário de Resultados
[00620] Neste estudo, a eficácia terapêutica de artigos teste no mo- delo de xenoenxerto de MDA-MB-468 foi avaliada. Os volumes de tu- mor medidos de todos os grupos de tratamento em vários pontos de tempo são mostrados na Figura 20 e Tabelas 27 a 29.
[00621] O tamanho de tumor médio de camundongos tratados por veículo atingiu 447 mm3 no dia 21. BCY8245 a 3 mg/kg, qw (TV = 85 mm3, TGI = 144,2%, p<0,001), 3 mg/kg, biw (TV = 22 mm3, TGI = 169,8%, p<0,001) e 5 mg/kg, qw (TV = 29 mm3, TGI = 168,4%,
p<0,001) produziram significante atividade antitumoral em dose ou maneira dependente da frequência da dose.
[00622] A dosagem de grupos de 5 mg/kg foram suspensas de dia 21, os tumores não mostraram qualquer recaída durante o esquema de monitoramento de 3 semanas extras. Nesta linhagem celular, que mostra expressão elevada de Nectina-4 em estudos FACS, BCY8245 causa regressão do tumor enfatizando a natureza direcionada ao alvo da eficácia ideal. Exemplo 9.5: Estudo de eficácia in vivo de artigos teste no tratamento de xenoenxerto de NCI-H292 em camundongos Balb/c nus
1. Objetivo do estudo
[00623] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumor in vivo de artigos teste no tratamento de xenoenxerto de NCI-H292 em ca- mundongos Balb/c nus.
2. Projeto experimental Grupo Tratamento n Dose Volume de Rotina de Esquema (mg/kg) Dosagem Dosagem (µl/g) 1 Veículo 5 -- 10 iv qw 2 BCY8245 3 3 mg/kg 10 iv qw 3 BCY8245 3 3 mg/kg 10 iv biw 4 BCY8245 3 5 mg/kg 10 iv qw
3. Materiais
3.1. Animais e Condição de Habitação
3.1.1. Animais
[00624] Espécies: Mus Musculus
[00625] Cepa: Balb/c nu
[00626] Idade: 6 a 8 semanas
[00627] Sexo: fêmea
[00628] Peso corporal: 18 a 22 g
[00629] Número de animais: 41 camundongos mais sobressalentes
3.1.2. Condição de Habitação
[00630] Os camundongos foram mantidos em gaiolas de ventilação individuais em temperatura constante e umidade com 3 ou 5 animais em cada gaiola.
[00631]  Temperatura: 20 ~ 26 oC.
[00632]  Umidade 40 a 70%.
[00633] Gaiolas: Preparadas de policarbonato. O tamanho é 300 mm x 180 mm x 150 mm. O material da cama é espiga de milho, que é trocada duas vezes por semana.
[00634] Dieta: Os animais tiveram livre acesso a alimentos granula- dos secos esterilizados por irradiação durante todo o período de estu- do.
[00635] Água: Animais tiveram livre acesso à água potável esterili- zada.
[00636] Identificação da gaiola: As etiquetas de identificação para cada gaiola continham as seguintes informações: número de animais, sexo, cepa, a data de recebimento, tratamento, número do estudo, número de grupo e a data de início do tratamento.
[00637] Identificação do animal: Animais foram marcados por um código de orelha.
4. Procedimentos e Métodos Experimentais
4.1. Cultura celular
[00638] As células de tumor NCI-H292 foram mantidas in vitro como uma cultura de monocamada em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal inativado por calor a 37ºC em uma atmosfera de 5% de CO2 no ar. As células tumorais foram rotineiramente subcul- tivadas duas vezes por semana por tratamento de tripsina-EDTA. O desenvolvimento das células em uma fase de desenvolvimento expo- nencial foi colhido e contado para inoculação do tumor.
4.2. Inoculação de tumor
[00639] Cada camundongo foi inoculado subcutaneamente no flan- co direito com células de tumor NCI-H292 (10 x 106) em 0,2 ml de PBS para desenvolvimento de tumor. 41 animais foram randomizados quando o volume de tumor médio atingiu 162 mm3. A administração do artigo teste e os números de animal em cada grupo foram mostrados na tabela de projeto experimental.
4.3. Preparação de Formulação de Artigo Teste Artigo teste Con. (mg/ml) Formulação Veículo - Histidina a 25 mM pH 7 10% de sacarose Dissolver 10,56 mg de BCY8245 em Tam- BCY8245 1 pão de histidina de 10,518 ml Diluir 400 µl de 1 mg/ml de armazenagem de BCY8245 0,5 BCY8245 com tampão de histidina de 400 µl Diluir 240 µl de 1 mg/ml de armazenagem de BCY8245 0,3 BCY8245 com tampão de histidina de 560 µl
4.4. Coleta de amostra
[00640] No fim do estudo, o tumor de todos os grupos foram coleta- dos a 2 horas após a última dosagem.
5. Resultados
5.1 Curvas de Desenvolvimento de Tumor
[00641] A curva de desenvolvimento de tumor é mostrada na Figura
21.
5.2. Traço de Volume de Tumor
[00642] Volume médio do tumor ao longo do tempo em camundon- gos Balb/c nu fêmeas portando xenoenxerto de NCI-H292 é mostrado na Tabela 30.
Tabela 30: Traço de Volume de Tumor ao longo do tempo Gr. Tratamento Dias após o início de tratamento 0 2 4 7 9 11 14 1 Veículo, qw 161±2 270±14 357±14 448±17 570±16 720±36 948±61 2 BCY8245,3 160±5 220±11 266±15 218±23 167±10 161±36 149±43 mpk, qw 3 BCY8245,3 162±13 243±19 211±12 101±11 100±8 87±7 65±3 mpk, biw 4 BCY8245,5 160±9 176±7 191±3 105±8 82±3 91±14 83±8 mpk, qw
5.3. Análise de Inibição de Desenvolvimento de Tumor
[00643] Taxa de inibição de desenvolvimento de tumor para artigos teste no modelo de xenoenxerto de NCI-H292 foi calculada com base nas medições de volume de tumor no dia 14 após o início de tratamen- to. Tabela 31: Análise de Inibição de Desenvolvimento de Tumor Gr Tratamento Volume de T/Cb (%) TGI (%) Valor de P comparado Tumor com veículo (mm3)a 1 Veículo, qw 948±61 -- -- -- 2 BCY8245,3 149±43 15,8 101,4 p<0,001 mpk, qw 3 BCY8245,3 65±3 6,9 112,2 p<0,001 mpk, biw 4 BCY8245,5 83±8 8,8 109,8 p<0,001 mpk, qw a. ± SEM médio. b. Inibição de desenvolvimento de tumor é calculada dividindo o vo- lume de tumor médio do grupo para o grupo tratado pelo volume de tumor médio do grupo para o grupo de controle (T/C).
6. Discussão e Sumário de Resultados
[00644] Neste estudo, a eficácia terapêutica de artigos teste no mo- delo de xenoenxerto de NCI-H292 foi avaliada. Os volumes de tumor medidos de todos os grupos de tratamento em vários pontos de tempo são mostrados na Figura 21 e Tabelas 30 e 31.
[00645] O tamanho de tumor médio de camundongos tratados por veículo atingiu 948 mm3 no dia 14. BCY8245 a 3 mg/kg, qw (TV = 149 mm3, TGI = 101,4%, p<0,001), 3 mg/kg, biw (TV = 65 mm3, TGI = 112,2%, p<0,001) e 5 mg/kg, qw (TV = 83 mm3, TGI = 109,8%, p<0,001) produziram significante atividade antitumoral.
[00646] Todos os artigos teste a 3 mg/kg, qw, 3 mg/kg, biw e 5 mg/kg, qw mostraram atividade antitumoral comparável, a eficácia também não melhorou quando aumentando a dosagem ou frequência de dosagem.
[00647] Neste estudo, camundongos em todos os grupos mantive- ram o peso corporal bem.
[00648] Nesta linhagem celular, que mostra expressão elevada de Nectina-4 em estudos FACS, BCY8245 causa regressão do tumor en- fatizando a natureza direcionada ao alvo da eficácia ideal. Exemplo 9.6: Estudo de eficácia in vivo de artigos teste no tratamento de xenoenxerto de NCI-H526 em camundongos Balb/c nus
1. Objetivo do estudo
[00649] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumor in vivo de artigos teste no tratamento de xenoenxerto de NCI-H526 em ca- mundongos Balb/c nus.
2. Projeto experimental Grupo Tratamento n Dose Volume de Do- Rotina de Esquema (mg/kg) sagem (µl/g) Dosagem 1 Veículo 3 -- 10 iv qw 2 BCY8245 3 3 10 iv qw 3 BCY8245 3 3 10 iv biw 4 BCY8245 3 5 10 iv qw
3. Materiais
3.1. Animais e Condição de Habitação
3.1.1. Animais
[00650] Espécies: Mus Musculus
[00651] Cepa: Balb/c nu
[00652] Idade: 6 a 8 semanas
[00653] Sexo: fêmea
[00654] Peso corporal: 18 a 22 g
[00655] Número de animais: 21 camundongos mais sobressalentes
3.1.2. Condição de Habitação
[00656] Os camundongos foram mantidos em gaiolas de ventilação individuais em temperatura constante e umidade com 3 animais em cada gaiola.
[00657]  Temperatura: 20 ~ 26 oC.
[00658]  Umidade 40 a 70%.
[00659] Gaiolas: Preparadas de policarbonato. O tamanho é 300 mm x 180 mm x 150 mm. O material da cama é espiga de milho, que é trocada duas vezes por semana.
[00660] Dieta: Os animais tiveram livre acesso a alimentos granulados secos esterilizados por irradiação durante todo o período de estudo.
[00661] Água: Animais tiveram livre acesso à água potável esterili- zada.
[00662] Identificação da gaiola: As etiquetas de identificação para cada gaiola continham as seguintes informações: número de animais, sexo, cepa, a data de recebimento, tratamento, número do estudo, número de grupo e a data de início do tratamento.
[00663] Identificação do animal: Animais foram marcados por um código de orelha.
4. Procedimentos e Métodos Experimentais
4.1 Cultura celular
[00664] As células NCI-H526 foram mantidas em meio suplementa- do com 10% de soro bovino fetal inativado por calor a 37ºC em uma atmosfera de 5% de CO2 no ar. As células tumorais foram rotineira- mente subcultivadas duas vezes por semana. O desenvolvimento das células em uma fase de desenvolvimento exponencial foi colhido e contado para inoculação do tumor.
4.2. Inoculação de tumor
[00665] Cada camundongo foi inoculado subcutaneamente no flan- co direito com células tumorais NCI-H526 (5,0 x 106) em 0,2 ml de PBS para desenvolvimento de tumor. 21 animais foram randomizados quando o volume de tumor médio atingiu 181 mm3. A administração do artigo teste e os números de animal em cada grupo foram mostrados na tabela de projeto experimental.
4.3. Preparação de Formulação de Artigo Teste Artigo teste Con. Formulação (mg/ml) Veículo - Histidina a 25 mM pH 7 10% de sacarose BCY8245 0,5 Diluir 400 µl de 1 mg/ml de armazenagem de BCY8245 com tampão de histidina de 400 µl BCY8245 0,3 Diluir 240 µl de 1 mg/ml de armazenagem de BCY8245 com tampão de histidina de 560 µl
4.4. Coleta de amostra
[00666] No fim do estudo no dia 14, todos os tumores foram coleta- dos para FFPE.
5. Resultados
5.1. Curvas de Desenvolvimento de Tumor
[00667] A curva de desenvolvimento de tumor é mostrada na Figura
22.
5.2. Traço de Volume de Tumor
[00668] Volume de tumor médio ao longo do tempo em camundon- gos Balb/c nus fêmeas portadores de xenoenxerto de NCI-H526 é mostrado na tabela 32.
Tabela 32: Traço de Volume de Tumor ao longo do tempo
Grupo Tratamento Dias após o início de tratamento 0 2 4 7 9 12 14 1 Veículo, 181±32 262±56 431±90 563±72 729±115 1076±155 1365±208 qw 2 BCY8245, 180±32 256±51 403±72 545±68 657±83 1019±155 1205±79 3 mpk, qw 3 BCY8245, 182±43 232±49 308±79 440±112 530±121 810±197 1109±250 3 mpk, biw
177/204 4 BCY8245, 180±52 209±66 236±72 383±119 375±115 365±79 476±103 5 mpk, qw
5.3. Análise de Inibição de Desenvolvimento de Tumor
[00669] Taxa de inibição de desenvolvimento de tumor para artigos teste no modelo de xenoenxerto de NCI-H526 foi calculada com base nas medições de volume de tumor no dia 14 após o início do tratamen- to. Tabela 33: Análise de Inibição de Desenvolvimento de Tumor Grupo Tratamento Volume de T/Cb (%) TGI (%) Valor de P Tumor (mm3)a 1Veículo, qw 1365±208 -- -- -- 2 BCY8245, 1205±79 88,3 13,4 p＞0,05 3 mpk, qw 3 BCY8245, 1109±250 81,3 21,6 p＞0,05 3 mpk, biw 4 BCY8245, 476±103 34,9 75,0 p＜0,01 5 mpk, qw a. ± SEM médio; b. Inibição de desenvolvimento de tumor é calculada dividindo o vo- lume de tumor médio do grupo para o grupo tratado pelo volume de tumor médio do grupo para o grupo de controle (T/C).
6. Discussão e Sumário de Resultados
[00670] Neste estudo, a eficácia terapêutica de artigos teste no mo- delo de xenoenxerto de NCI-H526 foi avaliada. Os volumes de tumor medidos de todos os grupos de tratamento em vários pontos de tempo são mostrados na Figura 22 e Tabelas 32 e 33.
[00671] O tamanho de tumor médio de camundongos tratados por veículo atingiu 13653 no dia 14 após o início de tratamento. BCY8245 a 3 mg/kg, qw (TV = 1205 mm3, TGI = 13,4%, p＞0,05) e 3 mg/kg, biw (TV = 1109 mm3, TGI = 21,6%, p>0,05) mostraram ligeira atividade antitumoral, BCY8245 a 5 mg/kg, qw (TV = 476 mm3, TGI = 75,0%, p<0,01) mostrou significante atividade antitumoral. Neste estudo, BCY8245 a 5 mg/kg biw causou mais de 10% de perda de peso corpo-
ral do animal. Nesta linhagem celular, que mostra expressão mínima de Nectina-4 em estudos FACS, desenvolvimento de tumor é recebido por BCY8245, porém, o tumor não sofre regressão, enfatizando o re- quisito direcionado ao alvo para a eficácia ideal. Exemplo 9.7: Estudo de eficácia in vivo de artigos teste no tratamento de xenoenxerto de Panc2.13 em camundongos Balb/c nus
1. Objetivo do estudo
[00672] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumor in vivo de artigos teste no tratamento de xenoenxerto de Panc2.13 em ca- mundongos Balb/c nus.
2. Projeto experimental Grupo Tratamento n Dose Volume de Rotina de Esquema (mg/kg) Dosagem Dosagem (µl/g) 1 Veículo 5 -- 10 iv qw 2 BCY8245 3 3 mg/kg 10 iv qw 3 BCY8245 3 3 mg/kg 10 iv biw 4 BCY8245 3 5 mg/kg 10 iv qw
3. Materiais
3.1. Animais e Condição de Habitação
3.1.1. Animais
[00673] Espécies: Mus Musculus
[00674] Cepa: Balb/c nu
[00675] Idade: 6 a 8 semanas
[00676] Sexo: fêmea
[00677] Peso corporal: 18 a 22 g
[00678] Número de animais: 41 camundongos mais sobressalentes
3.1.2. Condição de Habitação
[00679] Os camundongos foram mantidos em gaiolas de ventilação individuais em temperatura constante e umidade com 3 ou 5 animais em cada gaiola.
[00680]  Temperatura: 20 ~ 26 oC.
[00681]  Umidade 40 a 70%.
[00682] Gaiolas: Preparadas de policarbonato. O tamanho é 300 mm x 180 mm x 150 mm. O material da cama é espiga de milho, que é trocada duas vezes por semana.
[00683] Dieta: Os animais tiveram livre acesso a alimentos granula- dos secos esterilizados por irradiação durante todo o período de estu- do.
[00684] Água: Animais tiveram livre acesso à água potável esterili- zada.
[00685] Identificação da gaiola: As etiquetas de identificação para cada gaiola continham as seguintes informações: número de animais, sexo, cepa, a data de recebimento, tratamento, número do estudo, número de grupo e a data de início do tratamento.
[00686] Identificação do animal: Animais foram marcados por um código de orelha.
4. Procedimentos e Métodos Experimentais
4.1. Cultura celular
[00687] As células tumorais Panc2.13 serão mantidas em meio RMPI1640 suplementado com 15% de soro bovino fetal inativado por calor e 10 unidades/ml de insulina recombinante humana a 37ºC em uma atmosfera de 5% de CO2 no ar. As células tumorais serão rotinei- ramente subcultivadas duas vezes por semana. O desenvolvimento das células em uma fase de desenvolvimento exponencial será colhido e contado para inoculação do tumor.
4.2. Inoculação de tumor
[00688] Cada camundongo foi inoculado subcutaneamente no flan- co direito com células tumorais Panc2.13 (5 x 106) com Matrigel (1:1) em 0,2 ml de PBS para desenvolvimento de tumor. 41 animais foram randomizados quando o volume de tumor médio atingiu 149 mm3. A administração do artigo teste e os números de animal em cada grupo foram mostrados na tabela de projeto experimental.
4.3. Preparação de Formulação de Artigo Teste Artigo teste Con. Formulação (mg/ml) Veículo - Histidina a 25 mM pH 7 10% de sacarose BCY8245 0,5 Diluir 400 µl de 1 mg/ml de armazenagem de BCY8245 com tampão de histidina de 400 µl BCY8245 0,3 Diluir 240 µl de 1 mg/ml de armazenagem de BCY8245 com tampão de histidina de 560 µl
4.4. Coleta de amostra
[00689] No fim do estudo, o tumor de todos os grupos foram coleta- dos a 2 horas após a última dosagem.
5. Resultados
5.1. Curvas de Desenvolvimento de Tumor
[00690] A curva de desenvolvimento de tumor é mostrada na Figura
23.
5.2. Traço de Volume de Tumor
[00691] Volume de tumor médio ao longo do tempo em camundon- gos Balb/c nus fêmeas portadores de xenoenxerto de Panc2.13 é mos- trado na tabela 34. Tabela 34: Traço de Volume de Tumor ao longo do tempo Dias após o início de tratamento Gr. Tratamento 0 2 4 7 9 11 14 1 Veículo, qw 149±12 202±12 240±9 321±17 410±27 479±32 545±17 BCY8245,3 2 149±34 160±33 191±39 215±53 242±62 259±59 271±54 mpk, qw BCY8245,3 3 148±46 170±38 204±57 216±56 236±59 241±60 231±57 mpk, biw BCY8245,5 4 149±18 180±11 231±33 242±34 248±40 231±37 238±40 mpk, qw
5.3. Análise de Inibição de Desenvolvimento de Tumor
[00692] Taxa de inibição de desenvolvimento de tumor para artigos teste no modelo de xenoenxerto de Panc2.13 foi calculada com base nas medições de volume de tumor no dia 14 após o início de tratamen- to. Tabela 35: Análise de Inibição de Desenvolvimento de Tumor Volume de Tu- Valor de P compa- Gr Tratamento T/Cb (%) TGI (%) mor (mm3)a rado com veículo 1 Veículo, qw 545±17 -- -- -- BCY8245,3 2 271±54 49,6 69,2 p<0,01 mpk, qw BCY8245, 3 231±57 42,3 79,1 p<0,001 3 mpk, biw BCY8245, 4 238±40 43,6 77,5 p<0,001 5 mpk, qw a. ± SEM médio. b. Inibição de desenvolvimento de tumor é calculada dividindo o vo- lume de tumor médio do grupo para o grupo tratado pelo volume de tumor médio do grupo para o grupo de controle (T/C).
6. Discussão e Sumário de Resultados
[00693] Neste estudo, a eficácia terapêutica de artigos teste no mo- delo de xenoenxerto de Panc2.13 foi avaliada. Os volumes de tumor medidos de todos os grupos de tratamento em vários pontos de tempo são mostrados na Figura 23 e Tabelas 34 e 35.
[00694] O tamanho de tumor médio de camundongos tratados por veículo atingiu 545 mm3 no dia 14. BCY8245 a 3 mg/kg, qw (TV = 271 mm3, TGI = 69,2%, p<0,01), 3 mg/kg, biw (TV = 231 mm3, TGI = 79,1%, p<0,001) e 5 mg/kg, qw (TV = 238 mm3, TGI = 77,5%, p<0,001) produziram significante atividade antitumoral. Neste estudo, animais em todos de 5 mg/kg de grupos qw perderam em média 15% do peso corporal. Nesta linhagem celular, que mostra somente expressão mo-
derada de Nectina-4 em estudos FACS, desenvolvimento de tumor é recebido por BCY8245 ,porém, o tumor não sofre regressão. Exemplo 9.8: Estudo de eficácia in vivo de artigos teste no tratamento de xenoenxerto de MDA-MB-468 em camundongos Balb/c nus
1. Objetivo do estudo
[00695] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumor in vivo de BCY8245 e BCY8245 em combinação com BCY8234 no tratamento de xenoenxerto de MDA-MB-468 em camundongos Balb/c nus para determinar o papel que a ligação ao alvo deve desempenhar na eficá- cia ideal.
2. Projeto experimental Grupo Tratamento Dose N Rotina de Esquema (mg/kg) Dosagem 1 Veículo -- 4 i.v. Qw, 3 sema- nas 2 BCY8245 0,3 4 i.v. Qw, 3 sema- nas 3 BCY8245 1 4 i.v. Qw, 3 sema- nas 4 BCY8245 3 4 i.v. Qw, 3 sema- nas 5 BCY8245+BCY8234 1+300 4 i.v. Qw, 3 sema- nas 6 BCY8245+BCY8234 3+300 4 i.v. Qw, 3 sema- nas Nota: N, o número de animais em cada grupo.
3. Materiais
3.1. Animais e Condição de Habitação
3.1.1. Animais
[00696] Espécies: Mus Musculus
[00697] Cepa: Balb/c nu
[00698] Idade: 6 a 8 semanas
[00699] Sexo: fêmea
[00700] Peso corporal: 18 a 22 g
[00701] Número de animais: 36 camundongos mais sobressalentes
3.1.2. Condição de Habitação
[00702] Os camundongos foram mantidos em gaiolas de ventilação individuais em temperatura constante e umidade com 4 animais em cada gaiola.
[00703]  Temperatura: 20 ~ 26 oC.
[00704]  Umidade 40 a 70%.
[00705] Gaiolas: Preparadas de policarbonato. O tamanho é 300 mm x 180 mm x 150 mm. O material da cama é espiga de milho, que é trocada duas vezes por semana.
[00706] Dieta: Os animais tiveram livre acesso a alimentos granula- dos secos esterilizados por irradiação durante todo o período de estu- do.
[00707] Água: Animais tiveram livre acesso à água potável esterili- zada.
[00708] Identificação da gaiola: As etiquetas de identificação para cada gaiola continham as seguintes informações: número de animais, sexo, cepa, a data de recebimento, tratamento, número do estudo, número de grupo e a data de início do tratamento.
[00709] Identificação do animal: Animais foram marcados por um código de orelha.
4. Procedimentos e Métodos Experimentais
4.1. Cultura celular
[00710] As células tumorais foram mantidas em meio de Leibovitz L-15 suplementado com 10% de soro bovino fetal inativado por calor a 37ºC em uma atmosfera de 0% de CO2 no ar. As células tumorais fo- ram rotineiramente subcultivadas duas vezes por semana. O desen- volvimento das células em uma fase de desenvolvimento exponencial foi colhido e contado para inoculação do tumor.
4.2. Inoculação de tumor
[00711] Cada camundongo foi inoculado subcutaneamente no flan- co direito com células tumorais MDA-MB-468 (10 x 106) em 0,2 ml de PBS suplementado com 50% de matrigel para desenvolvimento de tumor. 36 animais foram randomizados quando o volume de tumor médio atingiu 186 mm3. A administração do artigo teste e os números de animal em cada grupo foram mostrados na tabela de projeto expe- rimental.
4.3. Preparação de Formulação de Artigo Teste Artigo Pureza Conc. Formulação teste (mg/ml) Veículo - - Histidina a 25 mM, pH 7 sacarose a 10% BCY8245 99,4% 1 Dissolver 5,0 mg de BCY8245 em Tam- pão de histidina1 a 4,97 ml 0,03 Diluir 36 µl de 1 mg/ml de armazenagem de BCY8245 com Tampão de histidina de 1164 µl 0,1 Diluir 120 µl de 1 mg/ml de armazenagem de BCY8245 com Tampão de histidina de 1080 µl 0,3 Diluir 360 µl de 1 mg/ml de armazenagem de BCY8245 com Tampão de histidina de 840 µl BCY8234 98,10% 30 Dissolver 147 mg de BCY8234 em Tam- pão de histidina de 4,807 ml
4.4. Coleta de amostra
[00712] No dia 21 do estudo, os tumores de grupo 5 e 6 foram cole- tados para FFPE. No fim do estudo, os tumores de grupo 3 foram cole- tados para FFPE.
5. Resultados
5.1. Curva de Desenvolvimento de Tumor
[00713] A curva de desenvolvimento de tumor é mostrada na Figura
24.
5.2. Traço de Volume de Tumor
[00714] Volume de tumor médio ao longo do tempo em camundon- gos Balb/c nus fêmeas portadores de xenoenxerto de MDA-MB-468 é mostrado nas Tabelas 36 a 38.
5.3. Análise de Inibição de Desenvolvimento de Tumor
[00715] Taxa de inibição de desenvolvimento de tumor para artigos teste no xenoenxerto de modelo MDA-MB-468 foi calculada com base nas medições de volume de tumor no dia 21 após o início do tratamen- to.
6. Discussão e Sumário de Resultados
[00716] Neste estudo, a eficácia terapêutica de artigos teste no xe- noenxerto de modelo MDA-MB-468 foi avaliada. Os volumes de tumor medidos de todos os grupos de tratamento em vários pontos de tempo são mostrados na Figura 24 e Tabelas 36 a 39.
[00717] O tamanho de tumor médio de camundongos tratados por veículo atingiu 420 mm3 no dia 21. BCY8245 a 1 mg/kg, qw (TV = 204 mm3, TGI = 92,1%, p<0,001), 3 mg/kg, qw (TV = 27 mm3, TGI = 164,9%, p<0,001) produziram significante atividade antitumoral de ma- neira dependente da dose. BCY8245 a 0,3 mg/kg qw ou biw não mos- trou qualquer atividade antitumor.
[00718] BCY8245 a 1 mg/kg, qw e 3 mg/kg, qw em combinação com BCY8234 (o peptídeo cognato livre de toxina) 300 mg/kg, qw pro- duziram significante atividade antitumoral (TV = 242 mm3, TGI = 75,4%, p<0,01). Quando comparando com BCY8245 sozinho, a ativi- dade antitumoral de BCY8245 a 3 mg/kg foi antagonizada por BCY8234 a 300 mg/kg (p<0,001). Esta redução em eficácia pelo pep- tídeo livre de toxina competidor demonstra a importância de ligação ao alvo para eficácia ideal. Durante o seguinte esquema de monitora- mento, os camundongos tratados com BCY8245, 1 mg/kg qw mostra-
ram recidiva óbvia do tumor, enquanto os camundongos tratados com BCY8245, 3 mg/kg qw não mostraram qualquer recidiva do tumor.
Tabela 36: Traço de Volume de Tumor ao longo do tempo (Dia 0 ao dia 21)
Dias após o início de tratamento Gr.
Tratamento 0 2 4 7 9 11 14 16 18 21 1 Veículo, qw 182±15 196±18 217±18 260±15 283±19 302±26 335±27 362±28 386±31 420±37 BCY8245 2 188±21 189±19 211±21 235±28 252±25 253±33 275±26 277±27 295±26 300±27 0,3 mpk, qw BCY8245 3 185±21 187±22 183±22 190±28 205±29 195±27 201±25 197±22 218±24 204±19 1 mpk, qw
188/204 BCY8245 4 181±14 171±17 163±10 141±21 113±16 92±5 66±4 58±2 41±2 27±1 3 mpk, qw BCY8245+BCY 5 8234 184±15 189±22 194±28 212±30 221±34 221±39 223±36 211±38 221±51 242±67 1+300 mpk, qw BCY8245+BCY 6 8234 184±16 178±57 193±36 197±46 179±44 138±41 137±32 114±24 110±24 99±18 3+300 mpk, qw
Tabela 37: Traço de Volume de Tumor ao longo do tempo (Dia 23 ao dia 32) Dias após o início de tratamento Gr.
Tratamento 23 25 28 30 32 1 Veículo, qw 434±35 460±38 504±32 535±46 548±51 BCY8245 2 0,3 mpk, 284±14 268±10 254±15 240±21 241±32 qw BCY8245 3 200±16 199±13 210±6 221±14 239±16 1 mpk, qw BCY8245 4 22±3 19±3 20±3 15±2 15±1 3 mpk, qw Tabela 38: Traço de Volume de Tumor ao longo do tempo (Dia 35 ao dia 91)
Dias Grupo 1, Veícu- Grupo 2, Grupo 3 Grupo 4, lo, qw, dosado BCY8245, 0,3 BCY8245, 1 BCY8245, 3 com BCY8245 5 mpk, qw mpk, qw mpk, qw mpk em PG-D32 35 455±81 237±33 255±15 19±2 37 373±92 246±40 292±19 16±2 39 247±48 248±37 304±36 14±1 42 134±18 245±48 314±42 14±2 44 108±3 251±48 327±42 18±4 46 79±3 248±61 342±55 19±4 49 63±8 250±65 356±59 20±4 51 62±5 264±68 374±71 18±5 53 53±12 268±81 381±87 22±4 56 52±13 271±87 416±104 21±4 58 58±0 267±95 433±113 20±5 60 61±7 270±108 464±119 18±6 64 71±23 276±132 532±154 23±6 67 66±14 269±137 550±162 23±5 71 73±5 280±155 565±170 24±7
Dias Grupo 1, Veícu- Grupo 2, Grupo 3 Grupo 4, lo, qw, dosado BCY8245, 0,3 BCY8245, 1 BCY8245, 3 com BCY8245 5 mpk, qw mpk, qw mpk, qw mpk em PG-D32 74 82±4 295±167 594±173 27±8 78 90±8 313±194 612±195 23±6 81 104±17 291±192 639±206 27±8 84 110±1 301±194 695±234 34±7 88 106±7 277±194 743±236 32±7 91 110±3 293±209 771±240 26±6 Tabela 39: Análise de Inibição de Desenvolvimento de Tumor Gr Tratamento Volume de T/Cb TGI Valor de P Combo Tumor (%) (%) comparado comparado (mm3)a com veículo com BCY8245 1 Veículo, qw 420±37 -- -- -- -- 2 BCY8245 300±27 71,4 52,7 p>0,05 0,3 mpk, qw 3 BCY8245 204±19 48,6 92,1 p<0,001 1 mpk, qw 4 BCY8245 27±1 6,5 164,9 p<0,001 3 mpk, qw 5 BCY8245+ 242±67 57,8 75,4 p<0,01 p>0,05 BCY8234 1+300 mpk, qw 6 BCY8245+ 99±18 23,5 135,9 p<0,001 P<0,001 BCY8234 3+300 mpk, qw a. ± SEM médio. b. Inibição de desenvolvimento de tumor é calculada dividindo o vo- lume de tumor médio do grupo para o grupo tratado pelo volume de tumor médio do grupo para o grupo de controle (T/C).
[00719] Exemplo 9.9: Estudo de eficácia in vivo de artigos teste no tratamento de xenoenxerto de MDA-MB-468 em camundongos Balb/c nus
1. Objetivo do estudo
[00720] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumor in vivo de BCY8245 sozinho ou em combinação com BCY8234 no tratamento de xenoenxerto de MDA-MB-468 em camundongos Balb/c nus.
2. Projeto experimental Grupo Tratamento Dose N Rotina de Esquema (mg/kg) Dosagem 1 Veículo -- 5 i.v. Qw, 3 semanas 2 BCY8245 1 5 i.v. Qw, 3 semanas 3 BCY8245 3 5 i.v. Qw, 3 semanas 4 BCY8245+ 3+300=300 5 i.v. Qw, 3 semanas BCY8234
[00721] Nota: N, o número de animais em cada grupo.
3. Materiais
3.1 Animais e Condição de Habitação
3.1.1. Animais
[00722] Espécies: Mus Musculus
[00723] Cepa: Balb/c nu
[00724] Idade: 6 a 8 semanas
[00725] Sexo: fêmea
[00726] Peso corporal: 18 a 22 g
[00727] Número de animais: 20 camundongos mais sobressalentes
3.1.2. Condição de Habitação
[00728] Os camundongos foram mantidos em gaiolas de ventilação individuais em temperatura constante e umidade com 5 animais em cada gaiola.
[00729]  Temperatura: 20 ~ 26 oC.
[00730]  Umidade 40 a 70%.
[00731] Gaiolas: Preparadas de policarbonato. O tamanho é 300 mm x 180 mm x 150 mm. O material da cama é espiga de milho, que é trocada duas vezes por semana.
[00732] Dieta: Os animais tiveram livre acesso a alimentos granula- dos secos esterilizados por irradiação durante todo o período de estu- do.
[00733] Água: Animais tiveram livre acesso à água potável esterili- zada.
[00734] Identificação da gaiola: As etiquetas de identificação para cada gaiola continham as seguintes informações: número de animais, sexo, cepa, a data de recebimento, tratamento, número do estudo, número de grupo e a data de início do tratamento.
[00735] Identificação do animal: Animais foram marcados por um código de orelha.
4. Procedimentos e Métodos Experimentais
4.1 Cultura celular
[00736] As células tumorais foram mantidas em meio de Leibovitz L-15 suplementado com 10% de soro bovino fetal inativado por calor a 37ºC em uma atmosfera de 0% de CO2 no ar. As células tumorais fo- ram rotineiramente subcultivadas duas vezes por semana. O desen- volvimento das células em uma fase de desenvolvimento exponencial foi colhido e contado para inoculação do tumor.
4.2. Inoculação de tumor
[00737] Cada camundongo foi inoculado subcutaneamente no flan- co direito com células tumorais MDA-MB-468 (10 x 106) em 0,2 ml de PBS suplementado com 50% de matrigel para desenvolvimento de tumor. 20 animais foram randomizados quando o volume de tumor médio atingiu 464 mm3. A administração do artigo teste e os números de animal em cada grupo foram mostrados na tabela de projeto expe- rimental.
4.3. Preparação de Formulação de Artigo Teste
Artigo Pureza Conc. Formulação teste (mg/ml) Veículo - - Histidina a 25 mM pH 7 10% de sacarose BCY8245 99,7% 1 Dissolver 5,0 mg de BCY8245 em Tampão de histidina1 de 4,985 ml 0,1 Diluir 140 µl de 1 mg/ml de armazenagem de BCY8245 com Tampão de histidina de 1260 µl 0,3 Diluir 420 µl de 1 mg/ml de armazenagem de BCY8245 com Tampão de histidina de 980 µl BCY8234 98,10% 30 Dissolver 147 mg de BCY8234 em Tampão de histidina de 4,807 ml
1. Histidina a 25 mM pH 7 10% de sacarose
4.4. Coleta de amostra
[00738] No fim do estudo, os tumores de grupo 3 foram coletados para FFPE.
5. Resultados
5.1. Curva de Desenvolvimento de Tumor
[00739] A curva de desenvolvimento de tumor é mostrada na Figura
25.
5.2. Traço de Volume de Tumor
[00740] Volume de tumor médio ao longo do tempo em camundon- gos Balb/c nus fêmeas portadores de xenoenxerto de MDA-MB-468 é mostrado nas Tabelas 40 a 42.
5.3. Análise de Inibição de Desenvolvimento de Tumor
[00741] Taxa de inibição de desenvolvimento de tumor para artigos teste no xenoenxerto de modelo MDA-MB-468 foi calculada com base nas medições de volume de tumor no dia 28 após o início do tratamen- to.
6. Discussão e Sumário de Resultados
[00742] Neste estudo, a eficácia terapêutica de artigos teste no xe- noenxerto de modelo MDA-MB-468 foi avaliada. Os volumes de tumor medidos de todos os grupos de tratamento em vários pontos de tempo são mostrados na Figura 25 e Tabelas 40 a 43.
[00743] O tamanho de partida do tumor inicial foi intencionalmente maior do que aquele anteriormente usado para determinar se BCY8245 mostrou eficácia neste tamanho maior. O tamanho de tumor médio de camundongos tratados por veículo atingiu 773 mm3 no dia
28. BCY8245 a 1 mg/kg, qw (TV = 384 mm3, TGI = 126,6%, p<0,001) e 3 mg/kg, qw (TV = 50 mm3, TGI = 234,6%, p<0,001) produziram signi- ficante atividade antitumoral de maneira dependente de dose no dia
28. Entre eles, os camundongos tratados com BCY8245, 3 mg/kg qw mostraram alguma recidiva tumoral após cessação do tratamento, a outra dosagem do dia 76 não funcionou na regressão completa do tu- mor.
[00744] BCY8245 a 3 mg/kg, qw em combinação com BCY8234 300 mg/kg, qw produziram significante atividade antitumoral (TV = 55 mm3, TGI = 234,0%, p<0,001) no dia 28, e os tumores não mostraram qualquer recaída durante todo o esquema de monitoramento.
[00745] Os camundongos de grupo de veículo tratados com 10 mg/kg de Nectina-4 ADC ou 5 mg/kg de BCY8245 e os camundongos de grupo 2 (BCY8245, 1 mpk, qw) tratados com 5 mg/kg de BCY8245 em PG-D28 mostraram regressão tumoral eficaz nas 3 semanas se- guintes, depois disso, os tumores mostraram novo crescimento nas 4 semanas seguintes quando retirados os fármacos.
[00746] BCY8245 foi capaz de causar regressão de tumor nos tu- mores de aproximadamente 450 mm3, porém, também quando admi- nistrado ao grupo anteriormente recebendo veículo, em tumores com um volume de partida de aproximadamente 770 mm3.
Tabela 40: Traço de Volume de Tumor ao longo do tempo (Dia 0 ao dia 28)
Dias após o início de tratamento Gr.
Tratamento 0 2 5 7 9 12 14 16 19 21 23 26 28 1 Veículo, qw 466±89 494±94 529±106 548±109 574±117 602±130 632±133 659±129 686±133 706±145 741±148 769±157 773±155 BCY8245 2 466±22 480±24 453±29 474±25 446±31 461±34 460±28 433±37 412±32 430±32 421±34 382±37 384±41 1mpk, qw BCY8245 3 464±28 451±24 388±25 333±30 284±26 168±24 129±20 93±23 83±17 71±19 60±17 49±17 50±17 3 mpk, qw BCY8245+BCY8234 4 467±45 457±46 401±47 389±42 309±25 205±9 150±9 125±5 95±3 90±5 78±5 66±4 55±5 (3+300) mpk, qw
195/204
Tabela 41: Traço de Volume de Tumor ao longo do tempo (Dia 30 ao dia 75)
Dias Grupo 1, Veí- Grupo 2, Grupo3, Grupo após o culo, dosado BCY8245, 1mpk, BCY8245, 3 4，BCY8245+ início de com 5 mpk alteração em 5 mpk, qw BCY82343+30 trata- BCY8245 em mpk em PG-D28 0 mpk, qw mento PG-D28 30 625±27 351±42 44±18 49±8 33 477±31 213±29 43±20 33±10 35 405±65 151±18 44±20 31±10 37 237±36 98±16 50±24 31±10 40 148±33 89±17 55±29 36±14 42 142±33 95±16 66±32 40±13 44 132±69 103±20 71±33 35±11 48 146±100 106±21 80±36 43±14 51 171±122 103±21 91±43 45±18 55 227±166 104±20 108±53 42±13 56 264±182 120±23 125±58 43±12 62 288±206 145±29 146±70 40±12 65 316±212 163±31 147±74 41±14 68 347±215 173±32 155±81 46±13 72 368±242 180±36 170±89 45±20 75 385±245 196±40 223±115 43±19
Tabela 42: Traço de Volume de Tumor ao longo do tempo (Dia 79 ao dia 103) Gr.
Tratamen- Dias após o início de tratamento to 79 82 86 89 93 96 100 103 BCY8245 3 221±118 198±107 185±105 180±102 155±91 166±95 221±119 250±125 3 mpk, qw
Tabela 43: Análise de Inibição de Desenvolvimento de Tumor Gr Tratamento Volume de T/Cb (%) TGI (%) Valor de P Tumor comparado (mm3)a com veículo 1 Veículo, qw 773±155 -- -- -- 2 BCY8245 384±41 49,7 126,6 p<0,001 1mpk, qw 3 BCY8245 50±17 6,4 234,6 p<0,001 3 mpk, qw 4 BCY8245+BCY8234 55±5 7,1 234,0 p<0,001 3+300 mpk, qw a. ± SEM médio. b. Inibição de desenvolvimento de tumor é calculada dividindo o volume de tumor médio do grupo para o grupo tratado pelo volume de tumor médio do grupo para o grupo de controle (T/C). Exemplo 10: Estudos PK In Vivo.
[00747] Os animais de xenoenxerto MDA-MB-468 foram injetados com BCY8245 (BT8009) a 3 mg/kg. Em vários pontos de tempo, os animais foram eutanizados e plasma e tumour retirados e congelados. As amostras foram analisadas para MMAE. Os níveis de plasma de BT8009 (BCY8245) são de estudos PK históricos. As concentrações de MMAE em plasma, MMAE em tumor, e BT8009 em plasma são mostradas na Figura 33. MMAE foi retirado no tumor por mais tempo do que no plasma suportando a hipótese de que a exposição sistêmica é significantemente menor do que a exposição de tumor. Exemplo 11: Ensaio HCS
[00748] Ensaio HCS foi usado em estudo de ligação de BDC a Nec- tina-4. As células foram incubadas com agente teste e então lavadas. A detecção foi por um anticorpo fluorescente para MMAE. As células MDA-MB-468 mostraram expressão de nectina-4 moderada com 20000 células fornecendo as melhores imagens. As células NCI-H292 mostraram baixa expressão neste ensaio, detecção de MMAE foi ruim mesmo com 20000 células.
[00749] Os dados de HCS em linhagem celular MDA-MB-468 são mostrados na Figura 34 e Tabela 44. Tabela 44 Item Test Intensidade fluo- Kd (nM) Kd Histórico (nM) rescente máxima Nectina-4 ADC 33,63 0,2 0,28±0,07 BCY8245 13,34 3,52 5,18 MMAE 2,95 >10000 >10000
[00750] Nectina-4 ADC e BCY8245 foram retidos nas células e co- localizados com uma mancha de membrana. BCY8781 e MMAE mos- traram retenção mínima. Kd de todos os compostos em linhagem ce- lular MDA-MB-468 foram consistentes com dados históricos. O ADC de Nectina-4 mostrou afinidade de ligação detectável em linhagem ce- lular MDA-MB-468. BCY8425 mostrou afinidade nanomolar de dígito único com um Bmax menor do que para a Nectina-4 ADC. Esta inten- sidade fluorescente máxima reduzida é porque o ADC de Nectina-4 tem um MMAE para relação de fármaco de 4 enquanto que BCY8245 tem um MMAE para relação de fármaco de 1. BCY8781 mostrou so- mente afinidade de ligação muito fraca em linhagem celular MDA-MB- 468 enquanto MMAE não mostrou quase nenhuma afinidade de liga- ção detectável em linhagem celular MDA-MB-468. Exemplo 12: Eficácia in vivo de BCY8245 em dois modelos de PDX de câncer de pulmão Objetivo
[00751] Avaliar a eficácia de BCY8245 em um modelo de PDX de célula não pequena escamosa e adenocarcinoma (ambos carcinomas de célula não pequena). Animais
[00752] Espécies: Mus Musculus
[00753] Cepa: Balb/c nu
[00754] Idade: 6 a 8 semanas
[00755] Sexo: fêmea
[00756] Peso corporal: 18 a 22 Agentes em teste
[00757] BCY8245 e Nectina-4 ADC ou BCY8781 Animais de pré-estudo
[00758] Cada camundongo foi inoculado subcutaneamente no flan- co direito com fragmento de tumor LU-01-0007ou LU-01-0412 (~30 mm3) para desenvolvimento de tumor. Os animais foram randomizados quando o volume de tumor médio atingiu 161mm3 (LU-01-0007) ou 147 mm3 (LU-01-0412) Medições Em Vida e as Finalidades
[00759] Os animais foram checados diariamente para quaisquer efeitos de desenvolvimento de tumor e tratamentos em comportamen- to normal, tais como, mobilidade, consumo de alimento e água (olhan- do apenas), ganho/perda de peso corporal, comparação olho/cabelo e qualquer outro efeito anormal como estabelecido no protocolo. Morte e sinais clínicos observados foram gravados na base dos números de animais dentro de cada subconjunto.
[00760] O objetivo principal era ver se o desenvolvimento do tumor poderia ser atrasado ou se os camundongos poderiam ser curados. O volume tumoral foi medido três vezes por semana em duas dimensões usando um paquímetro, e o volume foi expresso em mm3 usando a fórmula: V = 0,5 a x b2 onde a e b são os diâmetros longo e curto do tumor, respectivamente. O tamanho do tumor foi então usado para cálculos do valor T/C. O valor T/C (em porcentagem) é uma indicação da eficácia antitumoral; T e C são os volumes médios dos grupos tra- tados e controle, respectivamente, em um determinado dia.
[00761] TGI foi calculado para cada grupo usando a fórmula: TGI (%) = [1-(Ti-T0)/ (Vi-V0)] ×100; Ti é o volume de tumor médio de um grupo de tratamento em um determinado dia, T0 é o volume de tumor médio do grupo de tratamento no dia do início do tratamento, Vi é o volume de tumor médio do grupo de controle de veículo no mesmo dia com Ti, e V0 é o volume de tumor médio do grupo de veículo no dia do início do tratamento.
[00762] Os Resultados destes estudos são mostrados na Figuras 26 e 27.
[00763] Lu-01-0412 (Figura 26): BCY8245 produziu uma eficácia relacionada à dose neste modelo PDX com uma redução na taxa de crescimento do tumor a 1 mg/kg qw, mas regressão do tumor marcada a 3 mg/kg qw à linha de base. Após cessação da dosagem (Dia 21), 5/6 animais mostraram que não houve regeneração do tumor até 105 dias após o início do estudo. O único animal com regeneração foi res- ponsivo a 3 mg/kg de BCY8245 e mostrou a regressão rearmazenada à linha de base. BCY8781 o BDC não ligante produziu doença estável a 3 mg/kg e na cessação do tumor de dosagem cresceu rapidamente na mesma taxa que o grupo tratado com veículo, enfatizando a eficá- cia aumentada que a ligação de Nectina-4 proporciona a esses agen- tes. Os grandes tumores (o grupo tratado com veículo) regrediram em resposta a uma única dose de BCY8245 ou BCY8781.
[00764] LU-01-0007 (Figura 27): BCY8245 produziu uma eficácia relacionada à dose com 1 mg/kg qw produzindo doença estável e 3 mg/kg produzindo regressão completa. A dosagem teve que ser man- tida até o dia 56 para atingir a regressão completa (quando cessou a dosagem). Não houve crescimento do tumor neste grupo para além (sendo o último mantido até 126 dias após o início do estudo). O ADC de Nectina-4 forneceu um grau similar de eficácia. O grupo de doença estável de 1 mg/kg respondeu aos aumentos na dosagem (3 e 5 mg/kg), sugerindo que doses baixas de BCY8245 não levam ao de- senvolvimento de resistência.
Exemplo 13: Avaliação in vivo de BCY8245 em modelos de PDX de passagem baixa de câncer de mama, esofágico e de bexiga humano em camundongos imunocomprometidos. Objetivo
[00765] Avaliar a atividade antitumoral de Agente Biciclo em Mode- los de Enxerto de Tumor Campões de Baixa Passagem de câncer de mama, esôfago e bexiga humano em camundongos imunocomprome- tidos. Sistema Teste
[00766] Espécie: Camundongo
[00767] Cepa: Foxn1nu nú atímico (Imuno-comprometido)
[00768] Fonte: Envigo: Indianápolis, Indiana
[00769] Sexo: Feminino
[00770] Idade alvo no início da dosagem: Pelo menos 6 a 8 sema- nas de idade
[00771] Peso alvo no início da dosagem: Pelo menos 18 gramas
[00772] Período de aclimatação: 3 dias Planejamento Experimental
[00773] Animais pré-estudo: quando animais de estoque suficien- tes atingem 1,0 a 1,5 cm3, tumores serão colhidos para reimplante em animais pré-estudo. Animais pré-estudo serão implantados unilateral- mente sobre o flannco esquerdo com fragmentos de tumor colhidos de animais de estoque. Cada animal é implantado de um lote de passa- gem específica e documentado.
[00774] Animais de estudo: Volumes de tumor pré-estudo são re- gistrados para cada experimento começando sete a dez dias após o implante. Quando os tumores atingem um volume de tumor médio de 150 a 300 mm3, os animais serão comparados pelo volume de tumor nos grupos de tratamento ou controle a ser usados para dosagem e a dosagem iniciada no Dia 0.
Agentes em teste
[00775] Conjugado de Fármaco Anticorpo Nectina-4 e BCY8245, comparação com controle de veículo. Padrão de agente de cuidados Docetaxel pode ser incluído. Todos os agentes a serem dosados qw por via intravenosa, as doses são indicadas nos gráficos. Avaliações em vida
[00776] Volume de Tumor de Eficácia: Os volumes de tumor se- rão verificados duas vezes por semana. Um volume final de tumor será verificado no dia que o estudo chega ao fim. Se possível, um volume final de tumor será verificado se um animal for encontrado moribundo.
[00777] Pesos de Animal de Eficácia: Os animais serão pesados duas vezes por semana. Um peso final será verificado no dia do térmi- no do estudo ou se o animal for encontrado moribundo, se possível. Aos animais apresentando ≥ 10% de perda de peso quando compara- dos ao Dia 0 será fornecido DietGel® ad libitum. Qualquer animal apresentando > 20% de perda de peso líquido durante um período de 7 dias ou se os camundongos apresentarem >30% de perda de peso líquido quando comparado ao Dia 0 serão considerados moribundos e eutanaziados. Análise de dados
[00778] Toxicidade de Agente: Começando no Dia 0, os animais serão observados diariamente e pesados duas vezes por semana usando uma escala digital; os dados incluindo os pesos em gramas individuais e médios (Peso Médio We ± SEM), mudança de percentual média de peso versus Dia 0 (%vD0) serão registrados para cada grupo e %vD0 plotado no término do estudo. As mortes de animais serão registradas diariamente e designadas como relacionadas com o fár- maco (D), técnicas (T), relacionadas com o tumor (B), ou desconheci- das (U) com base na perda de peso e observação superficial; único agente ou grupos de combinação relatando uma %vD0 média >20%
e/ou >10% de mortalidade será considerada acima da dose máxima tolerada (MTD) para esse tratamento no regime avaliado. Média má- xima %vD0 (peso nadir) para cada grupo de tratamento é relatado no término do estudo. Eficácia de Agente
[00779] Inibição de Crescimento de Tumor - Começando no Dia 0, as dimensões do tumor são medidas duas vezes por semana por compasso de calibre digital e os dados incluido volumes de tumor es- timados individuais e médios (TV Médio ± SEM) registrado para cada grupo; volume de tumor é calculado usando a fórmula (1): TV= ampli- tude 2 x comprimento x 0,52. Na conclusão doestudo, os valores de inibição percentual do crescimento de tumor (%TGI) serão calculados e relatados para cada grupo de tratamento (T) versus o controle (C) usando medições do tumor inicial (i) e final (f) pela fórmula (2): %TGI = 1 - (Tf-Ti ) / (Cf-Ci). Os camundongos individuais relatando um volume de tumor ≤ 30% da medição do Dia 0 para duas medições consecuti- vas serão considerados respondedores parciais (PR). Os camundon- gos individuais sem tumores palpáveis (0,00 mm3 para duas medições consecutivas) serão classificados como respondedores completos (CR); um CR que persiste até a conclusão do estudo será considerado um sobrevivente sem tumor (TFS). Tempo de duplicação de tumor (DT) será determinado para os grupos tratados com o veículo usando a fórmula DT = (Df – Di) * log2 / (logTVf – logTVi) onde D = Dia e TV = Volume de Tumor . Todos os dados coletados neste estudo são con- trolados eletronicamente e armazenados em um sistema servidor re- dundante.
[00780] Os resultados destes estudos são mostrados nas Figuras 28 a 31.
[00781] BCY8245 foi testado em quatro modelos PDX de baixa passagem PDX representando câncer de bexiga (CTG-1771), um cân-
cer de mama positivo para Her2 negativo para estrogênio e progeste- rona (CTG-1171), um câncer de mama triplo negativo (CTG-1106) e um câncer esofágico (CTG-0896). Em todos estes modelos BCY8245 mostrou excelente eficácia evocando regressão de tumor em três das quatro regressões totais para a linha de base.
A eficácia foi compará- vel ao ADC em todos os casos e superior ou igual ao Docetaxel SOC.
Em todos os modelos BCY8245 foi melhor tolerado do que o Doceta- xel.

Claims (19)

REIVINDICAÇÕES
1. Ligante de peptídeo específico para Nectina-4 com- preendendo um polipeptídeo, que compreende pelo menos três resí- duos de cisteína, separados por pelo menos duas sequências alça, e uma estrutura molecular que formas ligações covalentes com os resí- duos de cisteína do polipeptídeo de modo que pelo menos duas alças de polipeptídeo sejam formadas na estrutura molecular, caracterizado pelo fato de que o ligante de peptídeo compreende a sequência de aminoácido: CiP[1Nal][dD]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii (SEQ ID NO: 1); em que 1NaI representa 1-naftilalanina, HArg representa homoargini- na, HyP representa hidroxiprolina e Ci, Cii e Ciii representam primeiro, segundo e terceiro resíduos de cisteína, respectivamente, ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma.
2. Ligante de peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de amino- ácido selecionada de: [B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 1) (doravante referida como BCY8234); Ac-[B-Ala][Sar5]-(SEQ ID NO: 1) (doravante referida como BCY8122); Ac-(SEQ ID NO: 1) (doravante referida como BCY8126); (SEQ ID NO: 1) (doravante referida como BCY8116); Fluoresceína-(SEQ ID NO: 1) (doravante referida como BCY8205); e [PYA][B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 1) (doravante referida como BCY8846).
3. Ligante de peptídeo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido selecionada de:
[B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 1) (doravante referida como BCY8234); Ac-[B-Ala][Sar5]-(SEQ ID NO: 1) (doravante referida como BCY8122); Ac-(SEQ ID NO: 1) (doravante referida como BCY8126); (SEQ ID NO: 1) (doravante referida como BCY8116); e Fluoresceína-(SEQ ID NO: 1) (doravante referida como BCY8205).
4. Ligante de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido selecionada de: Ac-[B-Ala][Sar5]-(SEQ ID NO: 1) (doravante referida como BCY8122); Ac-(SEQ ID NO: 1) (doravante referida como BCY8126); e (SEQ ID NO: 1) (doravante referida como BCY8116).
5. Ligante de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido selecionada de: Ac-[B-Ala][Sar5]-(SEQ ID NO: 1) (doravante referida como BCY8122); e Ac-(SEQ ID NO: 1) (doravante referida como BCY8126).
6. Ligante de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido selecionada de: [B-Ala][Sar10]-(SEQ ID NO: 1) (doravante referida como BCY8234).
7. Ligante de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a estrutura mole- cular é selecionada de 1,1',1''-(1,3,5-triazinano-1,3,5-triil)triprop-2-en-1- ona (TATA).
8. Ligante de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o sal farmaceuti- camente aceitável é selecionado do ácido livre ou o sal de sódio, po- tássio, cálcio, amônio.
9. Ligante de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a Nectina-4 é Nec- tina-4 humana.
10. Conjugado de fármaco, caracterizado pelo fato de que compreende um ligante de peptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, conjugado a um ou mais grupos efetores e/ou funcionais.
11. Conjugado de fármaco, como definido na reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ser conjugado a um ou mais agentes citotóxicos.
12. Conjugado de fármaco, como definido na reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o referido agente citotóxico é sele- cionado de MMAE ou DM1, em particular MMAE.
13. Conjugado de fármaco, como definido na reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o agente citotóxico é MMAE e o re- ferido conjugado adicionalmente compreende um ligante selecionado de: -PABC-Cit-Val-Glutaril- ou -PABC-ciclobutil-Ala-Cit-βAla-, tal como -PABC-Cit-Val-Glutaril-, em que PABC representa p- aminobenzilcarbamato.
14. Conjugado de fármaco, como definido na reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o agente citotóxico é DM1 e o refe- rido conjugado adicionalmente compreende um ligante que é -SPDB- (SO3H)-, em que SPDB representa N-sucinimidil 3-(2- piridilditio)propionato.
15. Conjugado de fármaco, como definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizado pelo fato de que é sele-
cionado de: BCY8245 ou BCY8549, em particular BCY8245.
16. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o peptídeo ligante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou conjugado de fármaco, como definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 15, em combinação com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
17. Composição farmacêutica, como definida na reivindi- cação 16, caracterizada pelo fato de que adicionalmente compreende um ou mais agentes terapêuticos.
18. Conjugado de fármaco, como definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 15, caracterizado pelo fato de que se destina ao uso na prevenção, supressão ou tratamento de uma doen- ça ou distúrbio mediado por Nectina-4.
19. Método para a prevenção, supressão ou tratamento de câncer, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um paciente em necessidade do mesmo, conjugado de fármaco, como definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 15, em que o referi- do paciente é identificado como tendo uma variação de número de có- pias aumentado (CNV) de Nectina-4.
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