JP2023534300A - 癌の処置のための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、癌を処置するための組成物および方法の分野に関する。特に、本発明は、インテグリンαｖβ６およびαｖβ３に結合するＲＧＤモチーフ含有ペプチドを含む新規メリチン融合ペプチドに関する。好ましくは、ＲＧＤ－含有融合ペプチドは、特にＴＮＢＣおよびＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌細胞、ならびに卵巣癌細胞を含む癌細胞の生存率を低下させることができる。上記融合ペプチドは、（１）配列番号１またはそのバリアント、および（２）ＲＧＤモチーフ含有ペプチドを含む融合ペプチドであり得、インテグリンαｖβ６およびαｖβ３に結合し得る。

Description

技術分野
本発明は、癌を処置するための組成物および方法の分野に関する。特に、本発明は、メリチン融合ペプチド、および癌を処置するためのメリチン融合ペプチドの使用に関する。

背景技術
西洋ミツバチ（Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）は、何千年もの間、蜂蜜、プロポリスおよび毒液などのヒトによって医学的に使用される多くの製品の供給源であった。ハチ毒、特に、ミツバチ毒は、抗癌活性を有することが示されている。しかしながら、ハチ毒の抗癌選択性の分子決定因子は、依然としてあまり理解されていない。

ミツバチ毒の成分の１つは、乾燥重量でミツバチ毒の約半分を構成するメリチンである。メリチンは、配列番号１の正電荷両親媒性２６アミノ酸ペプチドであり、膜二重層のリン脂質と会合し、膜貫通トロイダル細孔を形成することによって細胞死を引き起こす。直径約４．４ｎｍのこれらの細孔はまた、細胞傷害活性を有するさらなる小分子の内在化を可能にし得る。

ミツバチ毒およびメリチンの両方は、黒色腫、非小細胞肺癌、神経膠芽腫、白血病、肝細胞癌腫、卵巣癌、子宮頚癌、および膵臓癌において抗腫瘍効果を示し、非形質転換細胞と比較して癌細胞においてより高い殺滅効力を示した。ミツバチ毒とシスプラチンとの間の相加的および相乗的な抗癌効果はまた、子宮頸部および喉頭の悪性腫瘍において、および肺癌細胞におけるドセタキセルと共に報告されている。

乳癌では、ミツバチ毒は、乳癌肺転移を減少させ、腫瘍成長を阻害し、自然発生乳癌腫マウス腫瘍の生存を延長した。ミツバチ毒およびメリチンは、ルミナールＭＣＦ７細胞においてアポトーシスを誘導し、トリプルネガティブＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において細胞生存率および遊走を減少させた。

ミツバチ毒の抗新生物活性の大部分は、乳癌におけるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ軸、肝細胞およびメラノーマ細胞におけるＭＡＰＫ、卵巣癌におけるＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３、ならびに肺癌腫細胞におけるＮＦκＢシグナル伝達経路の阻害を介したメリチンに起因すると考えられている。

しかしながら、乳癌は世界中の女性において最も一般的な癌であるにもかかわらず、異なる乳癌サブタイプにわたるメリチンの正確な効果はまだ十分に理解されていない。特に、ホルモン受容体およびＨＥＲ２の発現を欠くトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、ならびにＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌は侵攻性であり、患者の転帰不良に関連する。

ＴＮＢＣの約５０％は上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）を過剰発現し、ＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ腫瘍は同じファミリーの別の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）であるＨＥＲ２を過剰発現する。ＲＴＫは、下流のＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路にしばしば依存する発癌性シグナル伝達を付与する。ＴＮＢＣにおけるＥＧＦＲシグナル伝達の遮断は、ＥＧＦＲ経路への依存性の欠如および付随経路の重要性のために、初期段階の臨床試験において限られた臨床的有効性を実証した。ＨＥＲ２標的治療は、転移状況において生存期間中央値を劇的に改善したが、このサブタイプについては長期にわたって抵抗性がほぼ避けられない。

メリチンの正確な効果もまた、卵巣癌に関してあまり理解されていない。卵巣癌（ＯＣ）は、生殖系に起源を有する婦人科癌の一種である。ＯＣは、最も致命的な婦人科癌であり、５年生存率が４６％と非常に低く、２０２０年にはオーストラリアで１，０６８人が死亡し、１，５３２人が新たに診断された。他の固形癌からの生存率は過去数十年で改善してきたが、ＯＣからの生存率は１９８０年以降変わらないままであった。これは、疾患の非特異的症候、有効なスクリーニング戦略の欠如を含むいくつかの要因に関連しており、その結果、これらの癌の大部分（７５～８０％）は進行期で診断される。ＯＣの大部分（約９０％）は上皮起源を有し、これらの中で、高悪性度の重篤な卵巣癌（ＨＧＳＯＣ）は増殖性が高く攻撃的であり、卵管に由来すると考えられている。これらの癌は、相同組換え（ＨＲ）ＤＮＡ修復遺伝子を含む経路の欠陥の結果としてのＰ５３突然変異および高いゲノム不安定性を特徴とする。これらには、ＨＧＳＯＣを発症する高いリスクを付与する腫瘍抑制因子ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２における突然変異が含まれる。ＢＲＣＡ１／２突然変異（生殖系列および体細胞）は患者の２０％で発生するが、ＢＲＣＡ１遺伝子におけるＤＮＡ高メチル化およびエピジェネティックサイレンシングは症例の１５％で観察される。

卵巣癌は、典型的には患者の予後不良に関連するため、改善された処置が必要である。メリチンの効果は、ＰＡ－１、ＳＫＯＶ３およびＯＶＣＡＲ３である限られた数の卵巣癌細胞株で報告されている。

したがって、これらの癌の処置のためのより効果的かつ選択的な治療戦略の開発が必要とされている。すべての癌治療と同様に、これらの治療は、関連する癌細胞に対して選択的でなければならない。

本発明は、特にＴＮＢＣおよびＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌細胞、ならびに卵巣癌細胞を含む癌細胞における細胞生存率を低下させることができる新規な融合ペプチドを提供する。

背景技術の前述の説明は、本発明の理解を容易にすることのみを意図している。議論は、言及された資料のいずれかが、出願の優先日における共通の一般知識であるか、またはその一部であったことの認識または承認ではない。

発明の概要
一態様では、本発明は、特にＴＮＢＣおよびＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌細胞、ならびに卵巣癌細胞を含む癌細胞における細胞生存率を低下させることができる新規な融合ペプチドを提供する。本発明の「融合ペプチド」および「メリチン融合ペプチド」への言及は、本明細書全体を通して、（１）配列番号１またはそのバリアント、および（２）ＲＧＤモチーフ含有ペプチドを含む融合ペプチドへの言及として読まれるべきである。

第１の態様では、本発明は、（１）配列番号１またはそのバリアント、および（２）ＲＧＤモチーフ含有ペプチドを含む融合ペプチドを提供する。好ましくは、融合ペプチドは、ＲＧＤモチーフ含有ペプチドに結合した配列番号１またはそのバリアントを含み、融合ペプチドは、インテグリンαｖβ６およびαｖβ３に結合する。インテグリンαｖβ６および／またはαｖβ３は、一般に、ＴＮＢＣおよびＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌細胞ならびに卵巣癌細胞において過剰発現される。本発明はまた、本明細書に記載される融合ペプチドのバリアントを提供する。

好ましくは、ＲＧＤモチーフ含有ペプチドは、配列番号２またはそのバリアントを含む。最も好ましい実施形態では、融合ペプチドは、配列番号３またはそのバリアントを含む。

第２の態様では、本発明は、配列番号３の融合ペプチドまたはそのバリアントを提供する。

第３の態様では、本発明は、本発明の融合ペプチドを含む医薬組成物を提供する。好ましくは、医薬組成物は、薬学的に許容され得る希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤および／またはアジュバントをさらに含む。好ましくは、医薬組成物は、化学治療剤をさらに含んでもよい。好ましくは、化学治療剤はドセタキセルまたはシスプラチンから選択される。

第４の態様では、本発明は、対象における癌を処置する方法であって、治療有効量の本発明の融合ペプチドを上記対象に投与することを含む方法を提供する。

好ましくは、癌は、ＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌、トリプルネガティブ乳癌または卵巣癌の群から選択される。

好ましくは、癌を処置する方法は、上記対象に化学治療剤を投与する工程をさらに含む。好ましくは、化学治療剤は、ペルツズマブ、トラスツズマブ、ドセタキセルまたはシスプラチンの１またはそれを超えるものから選択される。

第４の態様の別の実施形態では、癌を処置する方法は、抗癌療法を上記対象に投与することをさらに含む。好ましくは、抗癌療法は、ｏｍｏｍｙｃもしくはＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体またはそれらのバリアントである。

第５の態様では、本発明は、癌の処置を必要とする対象において癌を処置する方法で使用するための本発明の融合ペプチドを提供する。

第６の態様では、本発明は、癌の処置を必要とする対象における癌を処置するための医薬の製造における、本発明の融合ペプチドの使用を提供する。

第７の態様では、本発明は、対象におけるトリプルネガティブ乳癌、ＨＥＲ２ ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌または卵巣癌を処置する方法であって、以下の工程：（１）治療有効量のメリチンまたは融合ペプチドの併用療法を上記対象に投与すること；および（２）治療有効量の化学治療剤を投与することを含む方法を提供する。好ましくは、化学治療剤は、ペルツズマブ、トラスツズマブ、ドセタキセルおよび／またはシスプラチンから選択される。

第７の態様の別の実施形態では、本発明は、対象におけるトリプルネガティブ乳癌、ＨＥＲ２ ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌または卵巣癌を処置する方法であって、治療有効量のメリチンまたはメリチン融合ペプチドと抗癌療法との併用療法を上記対象に投与することを含む方法を提供する。好ましくは、抗癌療法は、ｏｍｏｍｙｃもしくはＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体またはそれらのバリアントである。

第８の態様では、本発明は、対象における腫瘍細胞生存率を低下させる方法であって、治療有効量の本発明のメリチン融合ペプチドを投与する工程を含む方法を提供する。好ましくは、メリチン融合ペプチドは、配列番号３を含む。好ましくは、本方法は、上記対象に化学治療剤を投与する工程をさらに含む。好ましくは、化学治療剤は、ペルツズマブ、トラスツズマブ、ドセタキセル、またはシスプラチンの１またはそれを超えるものから選択される。

第９の態様では、本発明は、本発明のメリチン融合ペプチドを、本発明によるその融合ペプチドの使用方法に関する説明書と共に含む、対象における癌を処置するためのキットを提供する。好ましくは、キットは、化学治療剤をさらに含む。好ましくは、化学治療剤は、ペルツズマブ、トラスツズマブ、ドセタキセルまたはシスプラチンから選択される。

第１０の態様では、本発明は、メリチン融合ペプチドをコードする核酸を提供する。好ましくは、核酸は、配列番号３のメリチン融合ペプチドをコードする（配列番号７）。

第１１の態様では、本発明は、癌に罹患している対象におけるＰＤ－Ｌ１発現を阻害する方法であって、メリチンまたは融合ペプチドを治療有効量で対象に投与する工程を含む方法を提供する。好ましくは、本方法は、化学治療剤を投与する工程をさらに含む。さらに好ましくは、化学治療剤は、ペルツズマブ、トラスツズマブ、ドセタキセル、またはシスプラチンの１またはそれを超えるものから選択される。好ましくは、対象は、トリプルネガティブ乳癌、ＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌または卵巣癌に罹患している。

第１２の態様では、本発明は、癌に罹患している対象におけるＰＤ－Ｌ１発現を阻害するための医薬の製造における、本発明の融合ペプチドの使用を提供する。

第１３の態様では、本発明は、配列番号１および配列番号３のペプチドに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体を提供する。

第１４の態様では、本発明は、癌に罹患している対象における抗癌療法の細胞透過を促進する方法であって、治療有効量の以下を含む併用療法を投与する工程を含む方法を提供する：（１）メリチンまたは融合ペプチド；および（２）対象に対する抗癌療法。好ましくは、抗癌療法は、ｏｍｏｍｙｃもしくはＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体またはそれらのバリアントである。

第１５の態様では、本発明は、（１）配列番号１またはそのバリアント、および（２）ＲＧＤモチーフ含有ペプチドを含む融合ペプチドであって、インテグリンαｖβ６およびαｖβ３に結合する、融合ペプチドを提供する。

本発明のさらなる特徴は、そのいくつかの非限定的な実施形態の以下の説明においてより完全に説明される。この説明は、単に本発明を例示する目的で含まれる。上記の本発明の広範な概要、開示または説明に対する制限として理解されるべきではない。以下、添付図面を参照して説明する。

図１は、ハチ毒およびメリチンに曝露された細胞株の腫瘍生存率アッセイの結果を示す。図１Ａは、オーストラリアのミツバチ毒（左）またはメリチン（右）で処理したヒト正常および乳癌細胞株のパネルの細胞生存率アッセイを示し、ＩＣ５０値が図１Ｂに示されている。図１Ｃは、オーストラリアのミツバチ毒（左）またはメリチン（右）で処理された、形質転換されていないマウス（ＮＩＨ／３Ｔ３）、基底様乳癌（ＢＲＣＡ^－Ｂ．１５）およびクローディン低乳癌（ｐ５３^－Ｔ１１）細胞株のパネルの細胞生存率用量応答曲線を示す。図１Ｄは、ミツバチ毒およびメリチンに曝露された各細胞型のＩＣ５０値を示す。 図１は、ハチ毒およびメリチンに曝露された細胞株の腫瘍生存率アッセイの結果を示す。図１Ａは、オーストラリアのミツバチ毒（左）またはメリチン（右）で処理したヒト正常および乳癌細胞株のパネルの細胞生存率アッセイを示し、ＩＣ５０値が図１Ｂに示されている。図１Ｃは、オーストラリアのミツバチ毒（左）またはメリチン（右）で処理された、形質転換されていないマウス（ＮＩＨ／３Ｔ３）、基底様乳癌（ＢＲＣＡ^－Ｂ．１５）およびクローディン低乳癌（ｐ５３^－Ｔ１１）細胞株のパネルの細胞生存率用量応答曲線を示す。図１Ｄは、ミツバチ毒およびメリチンに曝露された各細胞型のＩＣ５０値を示す。 図１は、ハチ毒およびメリチンに曝露された細胞株の腫瘍生存率アッセイの結果を示す。図１Ａは、オーストラリアのミツバチ毒（左）またはメリチン（右）で処理したヒト正常および乳癌細胞株のパネルの細胞生存率アッセイを示し、ＩＣ５０値が図１Ｂに示されている。図１Ｃは、オーストラリアのミツバチ毒（左）またはメリチン（右）で処理された、形質転換されていないマウス（ＮＩＨ／３Ｔ３）、基底様乳癌（ＢＲＣＡ^－Ｂ．１５）およびクローディン低乳癌（ｐ５３^－Ｔ１１）細胞株のパネルの細胞生存率用量応答曲線を示す。図１Ｄは、ミツバチ毒およびメリチンに曝露された各細胞型のＩＣ５０値を示す。 図１は、ハチ毒およびメリチンに曝露された細胞株の腫瘍生存率アッセイの結果を示す。図１Ａは、オーストラリアのミツバチ毒（左）またはメリチン（右）で処理したヒト正常および乳癌細胞株のパネルの細胞生存率アッセイを示し、ＩＣ５０値が図１Ｂに示されている。図１Ｃは、オーストラリアのミツバチ毒（左）またはメリチン（右）で処理された、形質転換されていないマウス（ＮＩＨ／３Ｔ３）、基底様乳癌（ＢＲＣＡ^－Ｂ．１５）およびクローディン低乳癌（ｐ５３^－Ｔ１１）細胞株のパネルの細胞生存率用量応答曲線を示す。図１Ｄは、ミツバチ毒およびメリチンに曝露された各細胞型のＩＣ５０値を示す。 図１は、ハチ毒およびメリチンに曝露された細胞株の腫瘍生存率アッセイの結果を示す。図１Ａは、オーストラリアのミツバチ毒（左）またはメリチン（右）で処理したヒト正常および乳癌細胞株のパネルの細胞生存率アッセイを示し、ＩＣ５０値が図１Ｂに示されている。図１Ｃは、オーストラリアのミツバチ毒（左）またはメリチン（右）で処理された、形質転換されていないマウス（ＮＩＨ／３Ｔ３）、基底様乳癌（ＢＲＣＡ^－Ｂ．１５）およびクローディン低乳癌（ｐ５３^－Ｔ１１）細胞株のパネルの細胞生存率用量応答曲線を示す。図１Ｄは、ミツバチ毒およびメリチンに曝露された各細胞型のＩＣ５０値を示す。 図１は、ハチ毒およびメリチンに曝露された細胞株の腫瘍生存率アッセイの結果を示す。図１Ａは、オーストラリアのミツバチ毒（左）またはメリチン（右）で処理したヒト正常および乳癌細胞株のパネルの細胞生存率アッセイを示し、ＩＣ５０値が図１Ｂに示されている。図１Ｃは、オーストラリアのミツバチ毒（左）またはメリチン（右）で処理された、形質転換されていないマウス（ＮＩＨ／３Ｔ３）、基底様乳癌（ＢＲＣＡ^－Ｂ．１５）およびクローディン低乳癌（ｐ５３^－Ｔ１１）細胞株のパネルの細胞生存率用量応答曲線を示す。図１Ｄは、ミツバチ毒およびメリチンに曝露された各細胞型のＩＣ５０値を示す。 図１は、ハチ毒およびメリチンに曝露された細胞株の腫瘍生存率アッセイの結果を示す。図１Ａは、オーストラリアのミツバチ毒（左）またはメリチン（右）で処理したヒト正常および乳癌細胞株のパネルの細胞生存率アッセイを示し、ＩＣ５０値が図１Ｂに示されている。図１Ｃは、オーストラリアのミツバチ毒（左）またはメリチン（右）で処理された、形質転換されていないマウス（ＮＩＨ／３Ｔ３）、基底様乳癌（ＢＲＣＡ^－Ｂ．１５）およびクローディン低乳癌（ｐ５３^－Ｔ１１）細胞株のパネルの細胞生存率用量応答曲線を示す。図１Ｄは、ミツバチ毒およびメリチンに曝露された各細胞型のＩＣ５０値を示す。

図２Ａは、アイルランド（左）および英国（右）のミツバチの集団からの毒液で処理したヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ）および乳癌細胞株（ＳＵＭ１５９およびＳＫＢＲ３）の細胞生存率用量応答曲線を示す。図２Ｂは、英国の働きバチ（左）および女王バチ（右）のマルハナバチの集団からの毒液で処理したヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ）および乳癌細胞株（ＳＵＭ１５９およびＳＫＢＲ３）の細胞生存率用量応答曲線を示す。 図２Ａは、アイルランド（左）および英国（右）のミツバチの集団からの毒液で処理したヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ）および乳癌細胞株（ＳＵＭ１５９およびＳＫＢＲ３）の細胞生存率用量応答曲線を示す。図２Ｂは、英国の働きバチ（左）および女王バチ（右）のマルハナバチの集団からの毒液で処理したヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ）および乳癌細胞株（ＳＵＭ１５９およびＳＫＢＲ３）の細胞生存率用量応答曲線を示す。 図２Ａは、アイルランド（左）および英国（右）のミツバチの集団からの毒液で処理したヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ）および乳癌細胞株（ＳＵＭ１５９およびＳＫＢＲ３）の細胞生存率用量応答曲線を示す。図２Ｂは、英国の働きバチ（左）および女王バチ（右）のマルハナバチの集団からの毒液で処理したヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ）および乳癌細胞株（ＳＵＭ１５９およびＳＫＢＲ３）の細胞生存率用量応答曲線を示す。 図２Ａは、アイルランド（左）および英国（右）のミツバチの集団からの毒液で処理したヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ）および乳癌細胞株（ＳＵＭ１５９およびＳＫＢＲ３）の細胞生存率用量応答曲線を示す。図２Ｂは、英国の働きバチ（左）および女王バチ（右）のマルハナバチの集団からの毒液で処理したヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ）および乳癌細胞株（ＳＵＭ１５９およびＳＫＢＲ３）の細胞生存率用量応答曲線を示す。

図３Ａは、抗メリチン抗体およびＩｇＧ対照を用いたＥＬＩＳＡによって評価された、メリチンおよびハチ毒の水溶液の吸光度（４０５ｎｍ）を表す。図３Ｂは、抗メリチン抗体をミツバチ毒（上）およびメリチン（下）と共に使用してメリチンを遮断した後のＨＤＦａおよびＳＵＭ１５９における細胞生存率アッセイを示す。データを平均±ＳＥＭとして表す。 図３Ａは、抗メリチン抗体およびＩｇＧ対照を用いたＥＬＩＳＡによって評価された、メリチンおよびハチ毒の水溶液の吸光度（４０５ｎｍ）を表す。図３Ｂは、抗メリチン抗体をミツバチ毒（上）およびメリチン（下）と共に使用してメリチンを遮断した後のＨＤＦａおよびＳＵＭ１５９における細胞生存率アッセイを示す。データを平均±ＳＥＭとして表す。 図３Ａは、抗メリチン抗体およびＩｇＧ対照を用いたＥＬＩＳＡによって評価された、メリチンおよびハチ毒の水溶液の吸光度（４０５ｎｍ）を表す。図３Ｂは、抗メリチン抗体をミツバチ毒（上）およびメリチン（下）と共に使用してメリチンを遮断した後のＨＤＦａおよびＳＵＭ１５９における細胞生存率アッセイを示す。データを平均±ＳＥＭとして表す。

図４は、ミツバチ毒またはメリチンで処理したＴＮＢＣ（ＳＵＭ１５９）、ＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ（ＳＫＢＲ３）および正常（ＨＤＦａ）細胞の細胞死の機序および動態の結果を示す。図４Ａは、ビヒクル（１）、ミツバチ毒（２－３）およびメリチン（４－５）で１８時間および２４時間処理したＳＵＭ１５９細胞における切断型カスパーゼ－３（ＣＬ－ｃｓｐ－３）の検出のためのウエスタンブロットを示す。図４Ｂは、ＩＣ５０のミツバチ毒（５．５８ｎｇ／μＬ）およびＩＣ５０のメリチン（４．２４ｎｇ／μＬ）で１時間処理したＳＵＭ１５９細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図４Ｃは、ミツバチ毒（左）またはメリチン（右）で１時間にわたって処理したヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ）および乳癌細胞（ＳＵＭ１５９およびＳＫＢＲ３）の細胞生存率アッセイを示す。図４Ｄは、ＩＣ５０のミツバチ毒（５．７７ｎｇ／μＬ）で１時間にわたって処理したＳＫＢＲ３細胞の生細胞共焦点顕微鏡法を処理後の時間（分）で示す。図４Ｅは、ビヒクル、ＩＣ５０のミツバチ毒（５．５８ｎｇ／μＬ）またはＩＣ５０のメリチン（４．２４ｎｇ／μＬ）で１時間にわたって処理したＳＵＭ１５９細胞の走査型電子顕微鏡法を示し、各処理群について２つの代表的な画像を示す。スケールバーは、示されるように２００ｎｍ、１μｍまたは１０μｍを表す。データを平均±ＳＥＭとして表す。 図４は、ミツバチ毒またはメリチンで処理したＴＮＢＣ（ＳＵＭ１５９）、ＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ（ＳＫＢＲ３）および正常（ＨＤＦａ）細胞の細胞死の機序および動態の結果を示す。図４Ａは、ビヒクル（１）、ミツバチ毒（２－３）およびメリチン（４－５）で１８時間および２４時間処理したＳＵＭ１５９細胞における切断型カスパーゼ－３（ＣＬ－ｃｓｐ－３）の検出のためのウエスタンブロットを示す。図４Ｂは、ＩＣ５０のミツバチ毒（５．５８ｎｇ／μＬ）およびＩＣ５０のメリチン（４．２４ｎｇ／μＬ）で１時間処理したＳＵＭ１５９細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図４Ｃは、ミツバチ毒（左）またはメリチン（右）で１時間にわたって処理したヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ）および乳癌細胞（ＳＵＭ１５９およびＳＫＢＲ３）の細胞生存率アッセイを示す。図４Ｄは、ＩＣ５０のミツバチ毒（５．７７ｎｇ／μＬ）で１時間にわたって処理したＳＫＢＲ３細胞の生細胞共焦点顕微鏡法を処理後の時間（分）で示す。図４Ｅは、ビヒクル、ＩＣ５０のミツバチ毒（５．５８ｎｇ／μＬ）またはＩＣ５０のメリチン（４．２４ｎｇ／μＬ）で１時間にわたって処理したＳＵＭ１５９細胞の走査型電子顕微鏡法を示し、各処理群について２つの代表的な画像を示す。スケールバーは、示されるように２００ｎｍ、１μｍまたは１０μｍを表す。データを平均±ＳＥＭとして表す。 図４は、ミツバチ毒またはメリチンで処理したＴＮＢＣ（ＳＵＭ１５９）、ＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ（ＳＫＢＲ３）および正常（ＨＤＦａ）細胞の細胞死の機序および動態の結果を示す。図４Ａは、ビヒクル（１）、ミツバチ毒（２－３）およびメリチン（４－５）で１８時間および２４時間処理したＳＵＭ１５９細胞における切断型カスパーゼ－３（ＣＬ－ｃｓｐ－３）の検出のためのウエスタンブロットを示す。図４Ｂは、ＩＣ５０のミツバチ毒（５．５８ｎｇ／μＬ）およびＩＣ５０のメリチン（４．２４ｎｇ／μＬ）で１時間処理したＳＵＭ１５９細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図４Ｃは、ミツバチ毒（左）またはメリチン（右）で１時間にわたって処理したヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ）および乳癌細胞（ＳＵＭ１５９およびＳＫＢＲ３）の細胞生存率アッセイを示す。図４Ｄは、ＩＣ５０のミツバチ毒（５．７７ｎｇ／μＬ）で１時間にわたって処理したＳＫＢＲ３細胞の生細胞共焦点顕微鏡法を処理後の時間（分）で示す。図４Ｅは、ビヒクル、ＩＣ５０のミツバチ毒（５．５８ｎｇ／μＬ）またはＩＣ５０のメリチン（４．２４ｎｇ／μＬ）で１時間にわたって処理したＳＵＭ１５９細胞の走査型電子顕微鏡法を示し、各処理群について２つの代表的な画像を示す。スケールバーは、示されるように２００ｎｍ、１μｍまたは１０μｍを表す。データを平均±ＳＥＭとして表す。 図４は、ミツバチ毒またはメリチンで処理したＴＮＢＣ（ＳＵＭ１５９）、ＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ（ＳＫＢＲ３）および正常（ＨＤＦａ）細胞の細胞死の機序および動態の結果を示す。図４Ａは、ビヒクル（１）、ミツバチ毒（２－３）およびメリチン（４－５）で１８時間および２４時間処理したＳＵＭ１５９細胞における切断型カスパーゼ－３（ＣＬ－ｃｓｐ－３）の検出のためのウエスタンブロットを示す。図４Ｂは、ＩＣ５０のミツバチ毒（５．５８ｎｇ／μＬ）およびＩＣ５０のメリチン（４．２４ｎｇ／μＬ）で１時間処理したＳＵＭ１５９細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図４Ｃは、ミツバチ毒（左）またはメリチン（右）で１時間にわたって処理したヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ）および乳癌細胞（ＳＵＭ１５９およびＳＫＢＲ３）の細胞生存率アッセイを示す。図４Ｄは、ＩＣ５０のミツバチ毒（５．７７ｎｇ／μＬ）で１時間にわたって処理したＳＫＢＲ３細胞の生細胞共焦点顕微鏡法を処理後の時間（分）で示す。図４Ｅは、ビヒクル、ＩＣ５０のミツバチ毒（５．５８ｎｇ／μＬ）またはＩＣ５０のメリチン（４．２４ｎｇ／μＬ）で１時間にわたって処理したＳＵＭ１５９細胞の走査型電子顕微鏡法を示し、各処理群について２つの代表的な画像を示す。スケールバーは、示されるように２００ｎｍ、１μｍまたは１０μｍを表す。データを平均±ＳＥＭとして表す。 図４は、ミツバチ毒またはメリチンで処理したＴＮＢＣ（ＳＵＭ１５９）、ＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ（ＳＫＢＲ３）および正常（ＨＤＦａ）細胞の細胞死の機序および動態の結果を示す。図４Ａは、ビヒクル（１）、ミツバチ毒（２－３）およびメリチン（４－５）で１８時間および２４時間処理したＳＵＭ１５９細胞における切断型カスパーゼ－３（ＣＬ－ｃｓｐ－３）の検出のためのウエスタンブロットを示す。図４Ｂは、ＩＣ５０のミツバチ毒（５．５８ｎｇ／μＬ）およびＩＣ５０のメリチン（４．２４ｎｇ／μＬ）で１時間処理したＳＵＭ１５９細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図４Ｃは、ミツバチ毒（左）またはメリチン（右）で１時間にわたって処理したヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ）および乳癌細胞（ＳＵＭ１５９およびＳＫＢＲ３）の細胞生存率アッセイを示す。図４Ｄは、ＩＣ５０のミツバチ毒（５．７７ｎｇ／μＬ）で１時間にわたって処理したＳＫＢＲ３細胞の生細胞共焦点顕微鏡法を処理後の時間（分）で示す。図４Ｅは、ビヒクル、ＩＣ５０のミツバチ毒（５．５８ｎｇ／μＬ）またはＩＣ５０のメリチン（４．２４ｎｇ／μＬ）で１時間にわたって処理したＳＵＭ１５９細胞の走査型電子顕微鏡法を示し、各処理群について２つの代表的な画像を示す。スケールバーは、示されるように２００ｎｍ、１μｍまたは１０μｍを表す。データを平均±ＳＥＭとして表す。 図４は、ミツバチ毒またはメリチンで処理したＴＮＢＣ（ＳＵＭ１５９）、ＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ（ＳＫＢＲ３）および正常（ＨＤＦａ）細胞の細胞死の機序および動態の結果を示す。図４Ａは、ビヒクル（１）、ミツバチ毒（２－３）およびメリチン（４－５）で１８時間および２４時間処理したＳＵＭ１５９細胞における切断型カスパーゼ－３（ＣＬ－ｃｓｐ－３）の検出のためのウエスタンブロットを示す。図４Ｂは、ＩＣ５０のミツバチ毒（５．５８ｎｇ／μＬ）およびＩＣ５０のメリチン（４．２４ｎｇ／μＬ）で１時間処理したＳＵＭ１５９細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図４Ｃは、ミツバチ毒（左）またはメリチン（右）で１時間にわたって処理したヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ）および乳癌細胞（ＳＵＭ１５９およびＳＫＢＲ３）の細胞生存率アッセイを示す。図４Ｄは、ＩＣ５０のミツバチ毒（５．７７ｎｇ／μＬ）で１時間にわたって処理したＳＫＢＲ３細胞の生細胞共焦点顕微鏡法を処理後の時間（分）で示す。図４Ｅは、ビヒクル、ＩＣ５０のミツバチ毒（５．５８ｎｇ／μＬ）またはＩＣ５０のメリチン（４．２４ｎｇ／μＬ）で１時間にわたって処理したＳＵＭ１５９細胞の走査型電子顕微鏡法を示し、各処理群について２つの代表的な画像を示す。スケールバーは、示されるように２００ｎｍ、１μｍまたは１０μｍを表す。データを平均±ＳＥＭとして表す。 図４は、ミツバチ毒またはメリチンで処理したＴＮＢＣ（ＳＵＭ１５９）、ＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ（ＳＫＢＲ３）および正常（ＨＤＦａ）細胞の細胞死の機序および動態の結果を示す。図４Ａは、ビヒクル（１）、ミツバチ毒（２－３）およびメリチン（４－５）で１８時間および２４時間処理したＳＵＭ１５９細胞における切断型カスパーゼ－３（ＣＬ－ｃｓｐ－３）の検出のためのウエスタンブロットを示す。図４Ｂは、ＩＣ５０のミツバチ毒（５．５８ｎｇ／μＬ）およびＩＣ５０のメリチン（４．２４ｎｇ／μＬ）で１時間処理したＳＵＭ１５９細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図４Ｃは、ミツバチ毒（左）またはメリチン（右）で１時間にわたって処理したヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ）および乳癌細胞（ＳＵＭ１５９およびＳＫＢＲ３）の細胞生存率アッセイを示す。図４Ｄは、ＩＣ５０のミツバチ毒（５．７７ｎｇ／μＬ）で１時間にわたって処理したＳＫＢＲ３細胞の生細胞共焦点顕微鏡法を処理後の時間（分）で示す。図４Ｅは、ビヒクル、ＩＣ５０のミツバチ毒（５．５８ｎｇ／μＬ）またはＩＣ５０のメリチン（４．２４ｎｇ／μＬ）で１時間にわたって処理したＳＵＭ１５９細胞の走査型電子顕微鏡法を示し、各処理群について２つの代表的な画像を示す。スケールバーは、示されるように２００ｎｍ、１μｍまたは１０μｍを表す。データを平均±ＳＥＭとして表す。 図４は、ミツバチ毒またはメリチンで処理したＴＮＢＣ（ＳＵＭ１５９）、ＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ（ＳＫＢＲ３）および正常（ＨＤＦａ）細胞の細胞死の機序および動態の結果を示す。図４Ａは、ビヒクル（１）、ミツバチ毒（２－３）およびメリチン（４－５）で１８時間および２４時間処理したＳＵＭ１５９細胞における切断型カスパーゼ－３（ＣＬ－ｃｓｐ－３）の検出のためのウエスタンブロットを示す。図４Ｂは、ＩＣ５０のミツバチ毒（５．５８ｎｇ／μＬ）およびＩＣ５０のメリチン（４．２４ｎｇ／μＬ）で１時間処理したＳＵＭ１５９細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図４Ｃは、ミツバチ毒（左）またはメリチン（右）で１時間にわたって処理したヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ）および乳癌細胞（ＳＵＭ１５９およびＳＫＢＲ３）の細胞生存率アッセイを示す。図４Ｄは、ＩＣ５０のミツバチ毒（５．７７ｎｇ／μＬ）で１時間にわたって処理したＳＫＢＲ３細胞の生細胞共焦点顕微鏡法を処理後の時間（分）で示す。図４Ｅは、ビヒクル、ＩＣ５０のミツバチ毒（５．５８ｎｇ／μＬ）またはＩＣ５０のメリチン（４．２４ｎｇ／μＬ）で１時間にわたって処理したＳＵＭ１５９細胞の走査型電子顕微鏡法を示し、各処理群について２つの代表的な画像を示す。スケールバーは、示されるように２００ｎｍ、１μｍまたは１０μｍを表す。データを平均±ＳＥＭとして表す。

図５は、ＤＥＤＥ－メリチンの抗癌活性の欠如、およびメリチン融合ペプチドＲＧＤ１－メリチンの乳癌細胞選択性を示す。図５Ａは、ＤＥＤＥ－メリチンで２４時間処理したＴＮＢＣ（ＳＵＭ１５９）およびＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ（ＳＫＢＲ３）細胞の細胞生存率アッセイを示す。図５Ｂは、メリチン、ＲＧＤ１－メリチン、ＳＶ４０－メリチン、ＴＡＴ－メリチンおよびＤＥＤＥ－メリチンで処理したＴ１１細胞の細胞生存率アッセイを示す。図５Ｃは、メリチン（上）およびＲＧＤ１－メリチン（下）で２４時間処理したヒト真皮線維芽細胞（ＨＤＦａ）およびＳＵＭ１５９の細胞生存率アッセイを示す。 図５は、ＤＥＤＥ－メリチンの抗癌活性の欠如、およびメリチン融合ペプチドＲＧＤ１－メリチンの乳癌細胞選択性を示す。図５Ａは、ＤＥＤＥ－メリチンで２４時間処理したＴＮＢＣ（ＳＵＭ１５９）およびＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ（ＳＫＢＲ３）細胞の細胞生存率アッセイを示す。図５Ｂは、メリチン、ＲＧＤ１－メリチン、ＳＶ４０－メリチン、ＴＡＴ－メリチンおよびＤＥＤＥ－メリチンで処理したＴ１１細胞の細胞生存率アッセイを示す。図５Ｃは、メリチン（上）およびＲＧＤ１－メリチン（下）で２４時間処理したヒト真皮線維芽細胞（ＨＤＦａ）およびＳＵＭ１５９の細胞生存率アッセイを示す。 図５は、ＤＥＤＥ－メリチンの抗癌活性の欠如、およびメリチン融合ペプチドＲＧＤ１－メリチンの乳癌細胞選択性を示す。図５Ａは、ＤＥＤＥ－メリチンで２４時間処理したＴＮＢＣ（ＳＵＭ１５９）およびＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ（ＳＫＢＲ３）細胞の細胞生存率アッセイを示す。図５Ｂは、メリチン、ＲＧＤ１－メリチン、ＳＶ４０－メリチン、ＴＡＴ－メリチンおよびＤＥＤＥ－メリチンで処理したＴ１１細胞の細胞生存率アッセイを示す。図５Ｃは、メリチン（上）およびＲＧＤ１－メリチン（下）で２４時間処理したヒト真皮線維芽細胞（ＨＤＦａ）およびＳＵＭ１５９の細胞生存率アッセイを示す。 図５は、ＤＥＤＥ－メリチンの抗癌活性の欠如、およびメリチン融合ペプチドＲＧＤ１－メリチンの乳癌細胞選択性を示す。図５Ａは、ＤＥＤＥ－メリチンで２４時間処理したＴＮＢＣ（ＳＵＭ１５９）およびＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ（ＳＫＢＲ３）細胞の細胞生存率アッセイを示す。図５Ｂは、メリチン、ＲＧＤ１－メリチン、ＳＶ４０－メリチン、ＴＡＴ－メリチンおよびＤＥＤＥ－メリチンで処理したＴ１１細胞の細胞生存率アッセイを示す。図５Ｃは、メリチン（上）およびＲＧＤ１－メリチン（下）で２４時間処理したヒト真皮線維芽細胞（ＨＤＦａ）およびＳＵＭ１５９の細胞生存率アッセイを示す。

図６は、ＤＥＤＥ－メリチンの抗癌活性の欠如、およびメリチン融合ペプチドＲＧＤ１－メリチンの乳癌細胞選択性を示す。図６Ａは、ビヒクル、メリチン、ＤＥＤＥ－メリチンまたはＲＧＤ１－メリチンのいずれかで２４時間処理したＳＵＭ１５９細胞からの細胞溶解物における切断型カスパーゼ－３（ＣＬ－ｃｓｐ－３）の検出のためのウエスタンブロットを示す。図６Ｂは、抗メリチン抗体を用いたＥＬＩＳＡに供した、メリチン、ＲＧＤ１－メリチン、ＤＥＤＥ－メリチンおよびＳＶ４０－メリチンの水溶液の吸光度（４０５ｎｍ）を示す。図６Ｃは、メリチン、ＲＧＤ１－メリチン、ＤＥＤＥ－メリチンおよびＳＶ４０－メリチンのアミノ酸配列および上位予測３Ｄモデルを示す。 図６は、ＤＥＤＥ－メリチンの抗癌活性の欠如、およびメリチン融合ペプチドＲＧＤ１－メリチンの乳癌細胞選択性を示す。図６Ａは、ビヒクル、メリチン、ＤＥＤＥ－メリチンまたはＲＧＤ１－メリチンのいずれかで２４時間処理したＳＵＭ１５９細胞からの細胞溶解物における切断型カスパーゼ－３（ＣＬ－ｃｓｐ－３）の検出のためのウエスタンブロットを示す。図６Ｂは、抗メリチン抗体を用いたＥＬＩＳＡに供した、メリチン、ＲＧＤ１－メリチン、ＤＥＤＥ－メリチンおよびＳＶ４０－メリチンの水溶液の吸光度（４０５ｎｍ）を示す。図６Ｃは、メリチン、ＲＧＤ１－メリチン、ＤＥＤＥ－メリチンおよびＳＶ４０－メリチンのアミノ酸配列および上位予測３Ｄモデルを示す。 図６は、ＤＥＤＥ－メリチンの抗癌活性の欠如、およびメリチン融合ペプチドＲＧＤ１－メリチンの乳癌細胞選択性を示す。図６Ａは、ビヒクル、メリチン、ＤＥＤＥ－メリチンまたはＲＧＤ１－メリチンのいずれかで２４時間処理したＳＵＭ１５９細胞からの細胞溶解物における切断型カスパーゼ－３（ＣＬ－ｃｓｐ－３）の検出のためのウエスタンブロットを示す。図６Ｂは、抗メリチン抗体を用いたＥＬＩＳＡに供した、メリチン、ＲＧＤ１－メリチン、ＤＥＤＥ－メリチンおよびＳＶ４０－メリチンの水溶液の吸光度（４０５ｎｍ）を示す。図６Ｃは、メリチン、ＲＧＤ１－メリチン、ＤＥＤＥ－メリチンおよびＳＶ４０－メリチンのアミノ酸配列および上位予測３Ｄモデルを示す。

図７は、ビヒクル、ミツバチ毒、メリチン、ＲＧＤ１－メリチンまたはＤＥＤＥ－メリチンで３０分間処理したＳＵＭ１５９の免疫蛍光画像を示す。

図８は、免疫ブロット法によって評価した、（Ａ）ＳＫＢＲ３および（Ｂ）ＳＵＭ１５９におけるミツバチ毒およびメリチンでの処理後、および（Ｃ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞における、メリチンでの処理後のＥＧＦＲ、ＨＥＲ２ならびに下流ＭＡＰＫおよびＡｋｔ経路のリン酸化動態を示す。 図８は、免疫ブロット法によって評価した、（Ａ）ＳＫＢＲ３および（Ｂ）ＳＵＭ１５９におけるミツバチ毒およびメリチンでの処理後、および（Ｃ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞における、メリチンでの処理後のＥＧＦＲ、ＨＥＲ２ならびに下流ＭＡＰＫおよびＡｋｔ経路のリン酸化動態を示す。 図８は、免疫ブロット法によって評価した、（Ａ）ＳＫＢＲ３および（Ｂ）ＳＵＭ１５９におけるミツバチ毒およびメリチンでの処理後、および（Ｃ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞における、メリチンでの処理後のＥＧＦＲ、ＨＥＲ２ならびに下流ＭＡＰＫおよびＡｋｔ経路のリン酸化動態を示す。

図９は、ビヒクル、５分間の２０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦありおよびなしでミツバチ毒またはメリチンで６０分間処理したＳＵＭ１５９細胞におけるＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路阻害剤の検出のためのウエスタンブロットを示す。α－チューブリンを負荷対照として使用した。

図１０は、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞における生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）による、（Ａ）ＴＡＭＲＡ－ＥＧＦ、（Ｂ）ＦＩＴＣ－メリチン、（Ｃ）ＦＩＴＣ－ＤＥＤＥ－メリチン、および（Ｄ）ＦＩＴＣ－ＥＮ１変異体のＮａｎｏＬｕｃ－ＥＧＦＲとの相互作用の動態分析を示す。 図１０は、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞における生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）による、（Ａ）ＴＡＭＲＡ－ＥＧＦ、（Ｂ）ＦＩＴＣ－メリチン、（Ｃ）ＦＩＴＣ－ＤＥＤＥ－メリチン、および（Ｄ）ＦＩＴＣ－ＥＮ１変異体のＮａｎｏＬｕｃ－ＥＧＦＲとの相互作用の動態分析を示す。 図１０は、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞における生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）による、（Ａ）ＴＡＭＲＡ－ＥＧＦ、（Ｂ）ＦＩＴＣ－メリチン、（Ｃ）ＦＩＴＣ－ＤＥＤＥ－メリチン、および（Ｄ）ＦＩＴＣ－ＥＮ１変異体のＮａｎｏＬｕｃ－ＥＧＦＲとの相互作用の動態分析を示す。 図１０は、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞における生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）による、（Ａ）ＴＡＭＲＡ－ＥＧＦ、（Ｂ）ＦＩＴＣ－メリチン、（Ｃ）ＦＩＴＣ－ＤＥＤＥ－メリチン、および（Ｄ）ＦＩＴＣ－ＥＮ１変異体のＮａｎｏＬｕｃ－ＥＧＦＲとの相互作用の動態分析を示す。

図１１は、非標識ＥＧＦ（１μＭ）の存在下または非存在下でＮａｎｏＬｕｃ－ＥＧＦＲをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞における（Ａ）ＴＡＭＲＡ－ＥＧＦ、（Ｂ）ＦＩＴＣ－メリチンおよび（Ｃ）ＦＩＴＣ－ＤＥＤＥ－メリチンの漸増濃度の飽和結合分析を示す。 図１１は、非標識ＥＧＦ（１μＭ）の存在下または非存在下でＮａｎｏＬｕｃ－ＥＧＦＲをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞における（Ａ）ＴＡＭＲＡ－ＥＧＦ、（Ｂ）ＦＩＴＣ－メリチンおよび（Ｃ）ＦＩＴＣ－ＤＥＤＥ－メリチンの漸増濃度の飽和結合分析を示す。 図１１は、非標識ＥＧＦ（１μＭ）の存在下または非存在下でＮａｎｏＬｕｃ－ＥＧＦＲをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞における（Ａ）ＴＡＭＲＡ－ＥＧＦ、（Ｂ）ＦＩＴＣ－メリチンおよび（Ｃ）ＦＩＴＣ－ＤＥＤＥ－メリチンの漸増濃度の飽和結合分析を示す。

図１２は、ＴＮＢＣ細胞に投与されたドセタキセルまたはシスプラチンとミツバチ毒またはメリチンの併用のインビトロアッセイの結果を示す。図１２Ａは、ミツバチ毒またはメリチン単独で、およびドセタキセルまたはシスプラチンとの併用で２４時間処理したＴ１１乳癌細胞の細胞生存度アッセイを示す。併用処理の代表的なプロットを平均±ＳＥＭとして示す。図１２Ｂは、ＣｏｍｐｕＳｙｎソフトウェアを使用して計算された、１２Ａの各併用処理で影響を受けた細胞の異なる画分について得られた併用指数グラフを示す。相乗的な薬物併用は、ＣＩ＜１によって示される。 図１２は、ＴＮＢＣ細胞に投与されたドセタキセルまたはシスプラチンとミツバチ毒またはメリチンの併用のインビトロアッセイの結果を示す。図１２Ａは、ミツバチ毒またはメリチン単独で、およびドセタキセルまたはシスプラチンとの併用で２４時間処理したＴ１１乳癌細胞の細胞生存度アッセイを示す。併用処理の代表的なプロットを平均±ＳＥＭとして示す。図１２Ｂは、ＣｏｍｐｕＳｙｎソフトウェアを使用して計算された、１２Ａの各併用処理で影響を受けた細胞の異なる画分について得られた併用指数グラフを示す。相乗的な薬物併用は、ＣＩ＜１によって示される。 図１２は、ＴＮＢＣ細胞に投与されたドセタキセルまたはシスプラチンとミツバチ毒またはメリチンの併用のインビトロアッセイの結果を示す。図１２Ａは、ミツバチ毒またはメリチン単独で、およびドセタキセルまたはシスプラチンとの併用で２４時間処理したＴ１１乳癌細胞の細胞生存度アッセイを示す。併用処理の代表的なプロットを平均±ＳＥＭとして示す。図１２Ｂは、ＣｏｍｐｕＳｙｎソフトウェアを使用して計算された、１２Ａの各併用処理で影響を受けた細胞の異なる画分について得られた併用指数グラフを示す。相乗的な薬物併用は、ＣＩ＜１によって示される。

図１３は、マウスに投与したドセタキセルの併用のインビボアッセイの結果を示す。図１３Ａは、ビヒクル、５ｍｇ／Ｋｇのメリチン、７ｍｇ／Ｋｇのドセタキセル、または５ｍｇ／Ｋｇのメリチン＋７ｍｇ／Ｋｇのドセタキセルで腫瘍内処置したマウスの腫瘍体積を示す。矢印は処置日を示す。３、７および９日目の腫瘍体積の相対的変化の対応する散布図を示す。図１３Ｂは、細胞の接種後４、１０、１２および１４日目のマウスにおけるＴ１１－ルシフェラーゼ腫瘍の代表的な生物発光イメージング（ＢＬＩ）画像を示す。 図１３は、マウスに投与したドセタキセルの併用のインビボアッセイの結果を示す。図１３Ａは、ビヒクル、５ｍｇ／Ｋｇのメリチン、７ｍｇ／Ｋｇのドセタキセル、または５ｍｇ／Ｋｇのメリチン＋７ｍｇ／Ｋｇのドセタキセルで腫瘍内処置したマウスの腫瘍体積を示す。矢印は処置日を示す。３、７および９日目の腫瘍体積の相対的変化の対応する散布図を示す。図１３Ｂは、細胞の接種後４、１０、１２および１４日目のマウスにおけるＴ１１－ルシフェラーゼ腫瘍の代表的な生物発光イメージング（ＢＬＩ）画像を示す。 図１３は、マウスに投与したドセタキセルの併用のインビボアッセイの結果を示す。図１３Ａは、ビヒクル、５ｍｇ／Ｋｇのメリチン、７ｍｇ／Ｋｇのドセタキセル、または５ｍｇ／Ｋｇのメリチン＋７ｍｇ／Ｋｇのドセタキセルで腫瘍内処置したマウスの腫瘍体積を示す。矢印は処置日を示す。３、７および９日目の腫瘍体積の相対的変化の対応する散布図を示す。図１３Ｂは、細胞の接種後４、１０、１２および１４日目のマウスにおけるＴ１１－ルシフェラーゼ腫瘍の代表的な生物発光イメージング（ＢＬＩ）画像を示す。

図１４Ａは、抗メリチン、抗Ｋｉ－６７、抗ＰＤ－Ｌ１、ＴＵＮＥＬアッセイ、ならびにＨｏｅｃｈｓｔおよびＨ＆Ｅで染色した、Ｔ１１接種後１４日目に抽出したマウスからの腫瘍生検における免疫組織化学および免疫蛍光の定量化を示す。図１４Ｂは、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２の発現レベルならびにｐ－ＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１０６８）およびｐ－ＨＥＲ２（Ｔｙｒ１２４８）の減少に対するメリチンおよびドセタキセルによる単独または併用阻害の効果を評価する、Ｔ１１細胞接種後１４日目に抽出されたマウスからの腫瘍生検における免疫組織化学の定量化を示す。 図１４Ａは、抗メリチン、抗Ｋｉ－６７、抗ＰＤ－Ｌ１、ＴＵＮＥＬアッセイ、ならびにＨｏｅｃｈｓｔおよびＨ＆Ｅで染色した、Ｔ１１接種後１４日目に抽出したマウスからの腫瘍生検における免疫組織化学および免疫蛍光の定量化を示す。図１４Ｂは、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２の発現レベルならびにｐ－ＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１０６８）およびｐ－ＨＥＲ２（Ｔｙｒ１２４８）の減少に対するメリチンおよびドセタキセルによる単独または併用阻害の効果を評価する、Ｔ１１細胞接種後１４日目に抽出されたマウスからの腫瘍生検における免疫組織化学の定量化を示す。

図１５は、メリチンまたはＲＧＤ１－メリチン単独で、およびドセタキセルとの併用で４８時間処理したＴ１１乳癌細胞の細胞生存度アッセイの結果を示す。併用処理の代表的なプロットを平均±ＳＥＭとして示す。 図１５は、メリチンまたはＲＧＤ１－メリチン単独で、およびドセタキセルとの併用で４８時間処理したＴ１１乳癌細胞の細胞生存度アッセイの結果を示す。併用処理の代表的なプロットを平均±ＳＥＭとして示す。

図１６は、メリチンまたはＲＧＤ１－メリチン単独で、およびｏｍｏｍｙｃとの併用で２４時間処理したＴ１１乳癌細胞の細胞生存度アッセイの結果を示す。併用処理の代表的なプロットを平均±ＳＥＭとして示す。 図１６は、メリチンまたはＲＧＤ１－メリチン単独で、およびｏｍｏｍｙｃとの併用で２４時間処理したＴ１１乳癌細胞の細胞生存度アッセイの結果を示す。併用処理の代表的なプロットを平均±ＳＥＭとして示す。

図１７Ａは、活性ＲＧＤ１－メリチンおよび変異ＲＧＤ１－メリチン（ＲＧＤ１－ＤＥＤＥメリチン）で処理したＯＶＣＡＲ３およびＣＯＶ３６２卵巣癌細胞の細胞生存率アッセイの結果を示す。図１７Ｂは、活性メリチンおよび変異メリチン（ＤＥＤＥメリチン）を用いたＯＶＣＡＲ３およびＣＯＶ３６２卵巣癌細胞の細胞生存率アッセイの結果を示す。 図１７Ａは、活性ＲＧＤ１－メリチンおよび変異ＲＧＤ１－メリチン（ＲＧＤ１－ＤＥＤＥメリチン）で処理したＯＶＣＡＲ３およびＣＯＶ３６２卵巣癌細胞の細胞生存率アッセイの結果を示す。図１７Ｂは、活性メリチンおよび変異メリチン（ＤＥＤＥメリチン）を用いたＯＶＣＡＲ３およびＣＯＶ３６２卵巣癌細胞の細胞生存率アッセイの結果を示す。 図１７Ａは、活性ＲＧＤ１－メリチンおよび変異ＲＧＤ１－メリチン（ＲＧＤ１－ＤＥＤＥメリチン）で処理したＯＶＣＡＲ３およびＣＯＶ３６２卵巣癌細胞の細胞生存率アッセイの結果を示す。図１７Ｂは、活性メリチンおよび変異メリチン（ＤＥＤＥメリチン）を用いたＯＶＣＡＲ３およびＣＯＶ３６２卵巣癌細胞の細胞生存率アッセイの結果を示す。 図１７Ａは、活性ＲＧＤ１－メリチンおよび変異ＲＧＤ１－メリチン（ＲＧＤ１－ＤＥＤＥメリチン）で処理したＯＶＣＡＲ３およびＣＯＶ３６２卵巣癌細胞の細胞生存率アッセイの結果を示す。図１７Ｂは、活性メリチンおよび変異メリチン（ＤＥＤＥメリチン）を用いたＯＶＣＡＲ３およびＣＯＶ３６２卵巣癌細胞の細胞生存率アッセイの結果を示す。

図１８Ａは、ＲＧＤ１－メリチンおよび変異ＲＧＤ１－メリチン（ＤＥＤＥ－ＲＧＤ１－メリチン）で処理したＴ１１、ＳＵＭ１５９およびＳＫＢＲ３乳癌細胞におけるＰＤ－Ｌ１発現の免疫蛍光画像を示す。図１８Ｂは、２４時間、活性ＲＧＤ１－メリチンおよび変異ＲＧＤ１－メリチンペプチドで処理した、または未処理（培地のみ）のＴ１１、ＳＵＭ１５９およびＳＫＢＲ３におけるＰＤ－Ｌ１発現レベルのｑＲＴ－ＰＣＴ分析を示す。通常の一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、各細胞株の未処理条件に対してそれぞれ有意水準を決定した（＊、＊＊、＊＊＊および＊＊＊＊は、それぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．００５、ｐ＜０．０００５およびｐ＜０．０００１を表す）。 図１８Ａは、ＲＧＤ１－メリチンおよび変異ＲＧＤ１－メリチン（ＤＥＤＥ－ＲＧＤ１－メリチン）で処理したＴ１１、ＳＵＭ１５９およびＳＫＢＲ３乳癌細胞におけるＰＤ－Ｌ１発現の免疫蛍光画像を示す。図１８Ｂは、２４時間、活性ＲＧＤ１－メリチンおよび変異ＲＧＤ１－メリチンペプチドで処理した、または未処理（培地のみ）のＴ１１、ＳＵＭ１５９およびＳＫＢＲ３におけるＰＤ－Ｌ１発現レベルのｑＲＴ－ＰＣＴ分析を示す。通常の一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、各細胞株の未処理条件に対してそれぞれ有意水準を決定した（＊、＊＊、＊＊＊および＊＊＊＊は、それぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．００５、ｐ＜０．０００５およびｐ＜０．０００１を表す）。

図１９は、ＲＧＤ１－メリチンおよびドセタキセルの単独および併用で処置したＴ１１、ＳＵＭ１５９、ＯＶＣＡＲ３およびＳＫＢＲ３乳癌細胞および卵巣癌細胞の細胞生存度アッセイの結果を示す。 図１９は、ＲＧＤ１－メリチンおよびドセタキセルの単独および併用で処置したＴ１１、ＳＵＭ１５９、ＯＶＣＡＲ３およびＳＫＢＲ３乳癌細胞および卵巣癌細胞の細胞生存度アッセイの結果を示す。 図１９は、ＲＧＤ１－メリチンおよびドセタキセルの単独および併用で処置したＴ１１、ＳＵＭ１５９、ＯＶＣＡＲ３およびＳＫＢＲ３乳癌細胞および卵巣癌細胞の細胞生存度アッセイの結果を示す。 図１９は、ＲＧＤ１－メリチンおよびドセタキセルの単独および併用で処置したＴ１１、ＳＵＭ１５９、ＯＶＣＡＲ３およびＳＫＢＲ３乳癌細胞および卵巣癌細胞の細胞生存度アッセイの結果を示す。

図２０は、ＲＧＤ１－メリチンおよびシスプラチンの単独および併用で処置したＴ１１、ＯＶＣＡＲ３およびＣＯＶ３６２乳癌細胞および卵巣癌細胞の細胞生存度アッセイの結果を示す。 図２０は、ＲＧＤ１－メリチンおよびシスプラチンの単独および併用で処置したＴ１１、ＯＶＣＡＲ３およびＣＯＶ３６２乳癌細胞および卵巣癌細胞の細胞生存度アッセイの結果を示す。 図２０は、ＲＧＤ１－メリチンおよびシスプラチンの単独および併用で処置したＴ１１、ＯＶＣＡＲ３およびＣＯＶ３６２乳癌細胞および卵巣癌細胞の細胞生存度アッセイの結果を示す。

配列表の簡単な説明
説明は、以下のアミノ酸および核酸配列を指す：

発明の詳細な説明
本発明は、ある特定のメリチン融合ペプチドが、癌細胞のある特定のサブタイプに対する向上した選択性を有するという発見に基づいている。好ましくは、メリチン融合ペプチドは、乳癌または卵巣癌の特定のサブタイプに対する増強された選択性を有する。

Ａ．一般
当業者は、本明細書に記載された本発明が具体的に記載されたもの以外の変形および修正を受けやすいことを理解するであろう。本発明は、すべてのそのような変形および修正を含む。本発明はまた、本明細書で言及または指示される工程、特徴、製剤および化合物のすべてを個別にまたは集合的に、および、ありとあらゆる組み合わせまたは任意の２つまたはそれを超える工程または特徴を含む。

本文書に引用されている各文献、参考文献、特許出願または特許は、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれており、これは、この文書の一部として読者によって読まれ検討されるべきであることを意味する。本文書で引用された文献、参考文献、特許出願または特許が本文書で繰り返されていないことは、単に簡潔さのためである。

本明細書中または参照により本明細書に組み込まれる任意の文書中で言及される任意の製品についての任意の製造者の説明書、説明、製品仕様書、および製品シートは、参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施に使用することができる。

本発明の範囲は、本明細書に記載の特定の実施形態のいずれによっても限定されない。これらの実施形態は、例示のみを目的としている。機能的に等価な生成物、製剤および方法は、明らかに本明細書に記載の本発明の範囲内である。

本明細書に記載の発明は、１またはそれを超える値の範囲（例えば、投与量、濃度など）を含むことができる。値の範囲は、範囲を定義する値、および範囲への境界を定義する値に直接隣接する値と同じまたは実質的に同じ結果をもたらす範囲に隣接する値を含む、範囲内のすべての値を含むと理解される。したがって、反対のことが示されない限り、本明細書および特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。したがって、「約８０％」は「約８０％」を意味し、「８０％」も意味する。少なくとも、各数値パラメータは、有効数字の数および通常の丸め手法に照らして解釈されるべきである。

前述の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方は、例示的かつ説明的なものにすぎず、特許請求される本発明を限定するものではないことを理解されたい。本出願では、特に明記しない限り、単数形の使用は複数形を含む。本出願では、「または」の使用は、特に明記しない限り、「および／または」を意味する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は限定的ではない。また、「要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）」または「構成要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」などの用語は、特に明記しない限り、１つの単位を含む要素および構成要素と、１つよりも多くのサブユニットを含む要素および構成要素の両方を包含する。また、「部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）」という用語の使用は、部分（ｍｏｉｅｔｙ）の一部（ｐａｒｔ）または部分全体を含むことができる。

「ポリペプチド」、「ペプチド」または「タンパク質」という用語は、天然タンパク質、すなわち天然に存在する非組換え細胞によって産生されるタンパク質のアミノ酸配列を有する高分子を意味するか；または遺伝子操作された細胞もしくは組換え細胞によって産生され、天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、または天然配列の１またはそれを超えるアミノ酸の欠失、付加、および／もしくは置換を有する分子を含む。「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、具体的には、メリチンおよびメリチン融合ペプチド、または、ペプチドの機能性に悪影響を及ぼすことなくメリチンもしくはメリチン融合ペプチドの１またはそれを超えるアミノ酸の欠失、付加、および／または置換を有する配列を包含する。

ポリペプチド（例えば、メリチン融合ペプチド）の「バリアント」は、別のポリペプチド配列と比較して１またはそれを超えるアミノ酸残基がアミノ酸配列に挿入、欠失および／または置換されているが、当技術分野で公知のアッセイを参照することによって元のポリペプチド配列の生物学的活性を保持するアミノ酸配列を含む。バリアントには、融合タンパク質が含まれる。メリチン融合ペプチドの「バリアント」は、メリチン融合ペプチドに対して１またはそれを超えるアミノ酸残基がアミノ酸配列に挿入、欠失および／または置換されているアミノ酸配列であって、細胞生存率アッセイなどの当技術分野で公知のアッセイによって測定することができるメリチン融合ペプチド様の生物学的活性を保持するアミノ酸配列を含む。

「治療有効量」という用語は、ヒトを含む哺乳動物において治療応答をもたらすと決定されたメリチンまたはメリチン融合ペプチドの量を指す。そのような治療有効量は、当業者によって容易に確認される。

「患者」および「対象」という用語は互換的に使用され、正式に診断された障害を有するヒトおよび非ヒト動物対象、正式に認識された障害を有しない対象、医学的注意を受けている対象、および障害を発症するリスクがある対象を含む。

「処置する（ｔｒｅａｔ）」および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、治療的処置、予防的処置、および対象が障害または他の危険因子を発症するリスクを低下させる適用を含む。処置は、障害の完全な治癒を必要とせず、症候、根底にある危険因子を減少させるか、または障害の進行を遅延させる実施形態を包含する。

本明細書で使用される「癌」という用語は、制御されない方法で増殖し、場合によっては転移（拡散）する傾向がある細胞の異常な増殖を指す。癌の種類には、それだけに限らないが、転移を伴うまたは伴わない疾患の任意の段階における固形腫瘍（膀胱、腸、脳、乳房、子宮内膜、心臓、腎臓、肺、肝臓、子宮、リンパ組織［リンパ腫］、卵巣、膵臓または他の内分泌器官［甲状腺］、前立腺、皮膚［メラノーマまたは基底細胞癌］のものなど）または血液腫瘍（白血病およびリンパ腫など）が含まれる。

本明細書で使用される「トリプルネガティブ乳癌」または「ＴＮＢＣ」という用語は、エストロゲン、プロゲステロンおよびＨＥＲ２受容体が腫瘍細胞によって発現されない乳癌の一種を指す。

本明細書で使用される「ＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌」という用語は、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）が腫瘍細胞によって過剰発現される乳癌の一種を指す。

本明細書で使用される「卵巣癌」という用語は、卵巣内または卵巣上に形成する癌を指す。

「結合する」または「相互作用する」という用語は、当技術分野で公知の意味を有する。１つの化合物または分子と別の化合物または分子との間、例えば標的と潜在的結合化合物との間の相互作用に関連する「結合」という用語は、潜在的結合化合物が、一般にタンパク質との会合と比較して統計的に有意な程度まで標的と会合することを示す。したがって、「特異的結合」という用語は、別の分子への非特異的結合よりも統計的に有意に高い２つの分子または化合物間の結合を指す。好ましくは、結合化合物は、１ｍＭまたはそれ未満、例えば０．１～１００ｎＭの解離定数（ｋ．ｓｕｂ．ｄ）で特定の標的と相互作用する。結合化合物は、「低親和性」、「非常に低い親和性」、「非常に低い親和性」、「中程度の親和性」、「中程度に高い親和性」、または「高親和性」で結合することができる。標的に結合する化合物の文脈では、「より大きい親和性」という用語は、化合物が参照化合物よりも強く、または参照条件での同じ化合物よりも強く結合すること、すなわち解離定数がより低いことを示す。特定の実施形態では、より大きい親和性は、少なくとも２、３、４、５、８、１０、５０、１００、２００、４００、５００、１０００、または１０，０００倍大きい親和性である。また、生体分子標的に結合する化合物の文脈において、「より高い特異性」という用語は、化合物が、関連する結合条件下で、存在し得る別の生体分子（複数可）よりも大きな程度で特定の標的に結合し、そのような他の生体分子への結合が、特定の標的への結合とは異なる生物学的活性を生じることを示す。典型的には、特異性は、限られたセットの他の生体分子に関するものである。特定の実施形態では、より高い特異性は、少なくとも２、３、４、５、８、１０、５０、１００、２００、４００、５００、または１０００倍高い特異性である。結合は、移動度シフト実験、表面プラズモン共鳴、蛍光偏光、蛍光共鳴エネルギー移動、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）およびマイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）法を含む、当技術分野で公知の様々なアッセイによって測定することができる。

本明細書で使用される場合、「メリチン」は、ミツバチ毒に由来する配列番号１の２６アミノ酸長のペプチドを指す。

「メリチン融合ペプチド」という用語は、別のペプチド、タンパク質またはその断片と融合した配列番号１のメリチンまたはそのバリアントを指す。

「単離されたペプチド」という用語は、対象タンパク質が、（１）通常見られる少なくともいくつかの他のタンパク質を含まない、（２）同じ供給源、例えば同じ種由来の他のタンパク質を本質的に含まない、（３）異なる種由来の細胞によって発現される、（４）自然界で関連しているポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または他の物質の少なくとも約５０％から分離されている、（５）自然界で関連していないポリペプチドと（共有結合または非共有結合相互作用によって）作動可能に関連している、または（６）自然界では存在しないことを意味する。典型的には、「単離されたペプチド」は、所与の試料の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約５０％を構成する。合成起源のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡもしくは他のＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせは、そのような単離されたタンパク質をコードすることができる。好ましくは、単離されたタンパク質は、その治療的、診断的、予防的、研究または他の使用を妨げるであろうその自然環境で見出されるタンパク質もしくはポリペプチドまたは他の汚染物質を実質的に含まない。

本明細書で使用される「化学治療剤」という用語は、癌の処置に有用な化学化合物を意味する。化学治療剤の例としては、アルキル化剤、例えば、テモゾロミド、アルキル化剤ダカルバジンのイミダゾテトラジン誘導体が挙げられる。化学治療剤のさらなる例としては、例えば、パクリタキセルまたはトポテカンまたはペグ化リポソームドキソルビシン（ＰＬＤ）が挙げられる。化学治療剤の他の例としては、チオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミドなどのアルキル化剤；アルキルスルホネート、例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；ベンゾドパ、カルボコン、メトレドパ、およびウレドパ等のアジリジン類；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチロメラミンを含むエチレンイミン類およびメチルアメラミン類；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ－２１８９およびＣＢＴ ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロマファジン、クロロフォスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、酸化メクロレタミン塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード類；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン等のニトロソ尿素；エンジイン系抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガムオールおよびカリケアマイシンオメガオール［例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３－１８６（１９９４）を参照］；ダイネマイシン（ダイネマイシンＡを含む）；ビスホスホネート、例えばクロドロネート；エスペラマイシン；ならびに、ネオカルジノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン（ブレオマイシンＡ２）、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトレビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリジン－ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣ等のマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ジノルビシン等の抗生物質；メトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）等の代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキセートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗アドレナリン、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；フロリン酸等の葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスアミド、グリコシド；アミノレブリン酸；エニルラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルホルミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；トグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシンおよびアンサミトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモル；ニトレリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ＠多糖複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ－２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよびアンギジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）クレモフォール・フリー、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌ．）、およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドセタキセル（Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｅ Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼロダ；イバンドロネート；イリノテカン（カンプトサール、ＣＰＴ－１１）（５－ＦＵおよびロイコボリンを用いたイリノテカンの処置レジメンを含む）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオミチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド類；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン（ＬＶ）；オキサリプラチン処置レジメン（ＦＯＬＦＯＸ）を含むオキサリプラチン；ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標））；ペルツズマブおよびトラスツズマブ、細胞増殖を低下させるＰＫＣ－α、Ｒａｆ、Ｈ－Ｒａｓ、ＥＧＦＲの阻害剤（例えばエルロチニブ（登録商標））およびＶＥＧＦ－Ａ、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容され得る塩、酸または誘導体が挙げられる。

「抗癌療法」は、癌細胞の成長および／または転移を予防または遅延させる任意の化合物、組成物または処置である。そのような抗癌療法には、化学治療剤、放射線、遺伝子治療、ホルモン治療、免疫治療、ポリペプチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド治療が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書を通して、文脈上別段の要求がない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載された整数または整数群を含むが、任意の他の整数または整数群を除外しないことを意味すると理解される。また、本開示において、特に特許請求の範囲および／または段落において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語は、米国特許法においてそれに帰される意味を有することができることに留意されたい。例えば、それらは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味することができる。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの用語は、米国特許法においてそれらに帰される意味を有し、例えば、それらは、明示的に列挙されていない要素を可能にするが、先行技術において見出されるか、または本発明の基本的もしくは新規な特徴に影響を及ぼす要素を除外する。

本明細書で使用される選択された用語の他の定義は、本発明の詳細な説明の中に見出され、全体を通して適用され得る。他に定義されない限り、本明細書で使用される他のすべての科学用語および技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。「活性剤」という用語は、１つの活性剤を意味してもよく、または２つまたはそれを超える活性剤を包含してもよい。

Ｂ．メリチン融合ペプチド
一態様では、本発明は、ＲＧＤモチーフ含有ペプチドに結合した配列番号１のメリチンを含むメリチン融合ペプチドを提供する。別の態様では、本発明は、（１）配列番号１のメリチンおよび（２）ＲＧＤモチーフ含有ペプチドを含むメリチン融合ペプチドを提供する。好ましくは、メリチン融合ペプチドは、インテグリンαｖβ６およびαｖβ３に結合する。好ましくは、ＲＧＤモチーフ含有ペプチドは、配列番号２を含む。最も好ましい実施形態では、本発明は、配列番号３のメリチン融合ペプチドまたはそのバリアントを提供する。

（ａ）メリチン
メリチンは、ミツバチ毒のポリペプチド成分である。メリチンは、腫瘍細胞の生存率を低下させることが知られている。メリチンは、原形質膜に結合することによって腫瘍細胞の生存率を低下させ、その後の細孔形成を誘導し、細胞のイオンおよび分子の漏出、細胞透過性の増強、および最終的には細胞溶解をもたらすと考えられている。

メリチンはまた、細胞のアポトーシスおよび壊死に影響を及ぼし得る。腫瘍細胞生存率の低下におけるメリチンの具体的な作用機序は、腫瘍細胞の種類に依存し得る。ＥＧＦ受容体およびＨＥＲ２を発現するトリプルネガティブ乳癌に関して、メリチンは、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２のリガンド誘導リン酸化を抑制し、乳癌細胞の下流シグナル伝達経路を動的に調節することができる。

免疫チェックポイントタンパク質プログラム死リガンド－１（ＰＤ－Ｌ１）は、免疫チェックポイントタンパク質ＰＤ－１に結合し、さもなければ腫瘍細胞に対する自然免疫応答に関与するであろうＴ細胞の活性化および免疫認識を阻害することができる。ＰＤ－Ｌ１の阻害は、Ｔ細胞の活性化をもたらす。特定の癌において、特定の化学治療剤の投与はＰＤ－Ｌ１の発現を増加させ、腫瘍細胞に対する免疫応答を低下させ、処置の全体的な有効性を低下させることも示されている。例えば、ヒト末梢血単核細胞と共培養したＨＥＲ２陽性乳癌細胞およびマウスモデルにおいて、トラスツズマブ抗ＨＥＲ２治療はＰＤ－Ｌ１の上方制御をもたらすことが示された（Ｂ．Ｋ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．４３０，４７－５６（２０１８））。同様に、卵巣癌細胞は、化学治療曝露に応答してＰＤ－Ｌ１発現を上方制御することが示されている（Ｇｒａｂｏｓｃｈ，Ｓ．，Ｚｅｎｇ，Ｆ．，Ｚｈａｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．ＰＤ－Ｌ１ ｂｉｏｌｏｇｙ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．ｊ．ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｃａｎｃｅｒ ３，Ｐ３０２（２０１５））。

本発明のいくつかの実施形態では、メリチンは、ＰＤ－Ｌ１免疫チェックポイントタンパク質のレベルを低下させ得る。したがって、メリチンは、化学治療の存在下でトリプルネガティブ乳癌などの癌において一般的である腫瘍微小環境の免疫抑制効果を減少させ得る。いくつかの実施形態では、メリチンは、トラスツズマブなどの化学治療剤によって引き起こされるＰＤ－Ｌ１の発現増加を減弱させ得る。メリチンは、肺癌腫モデルにおける腫瘍微小環境における腫瘍促進性Ｍ２様腫瘍関連マクロファージ集団を減少させることが示されている。

いくつかの実施形態では、乳癌細胞におけるＥＧＦＲおよびＨＥＲ２シグナル伝達は、腫瘍細胞におけるＰＤ－Ｌ１発現を調節する。免疫組織化学的試験は、ＰＤ－Ｌ１がＴＮＢＣ腫瘍で最も高い発現を有し、ＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ腫瘍がこれに続き、ＰＤ－Ｌ１発現が生存不良に関連することを示した。他の実施形態では、基底様乳癌において、タンパク質ＡＬＩＸの非存在は、ＥＧＦＲ活性化と相関し、エキソソーム生合成を損なう可能性がある。ＰＤ－Ｌ１は、エキソソーム障害が細胞膜上のＰＤ－Ｌ１を増加させるように、ＡＬＩＸ依存的にエキソソームを介して分泌される。ＡＬＩＸ下方制御は、ＥＧＦＲ活性化の増強およびＰＤ－Ｌ１膜蓄積を介して腫瘍生存を促進し、免疫抑制をもたらす。

メリチンのＣ末端は、正に帯電したαヘリックスを形成する。正に帯電したアルファヘリックスは、負に帯電した原形質膜への結合を媒介し、次いで細胞原形質膜に細孔を形成する。一実施形態では、メリチンのＣ末端の正のＫ_２１ＲＫＲ_２４配列は、負に帯電した原形質膜への結合を媒介し、したがって、細胞原形質膜を破壊する際のその機能に不可欠である。

（ｂ）ＲＧＤモチーフ含有ペプチド
腫瘍細胞型に対するメリチンの選択性は、健康な細胞にその効果を及ぼすよりもむしろ、腫瘍細胞を標的とするメリチンの能力を高めるために重要である。一実施形態では、特定の腫瘍細胞に対するメリチンの選択性は、メリチンを別のペプチドに融合することによって増強される。好ましくは、メリチンは、ＲＧＤペプチドモチーフを含むペプチドと融合される。

「ＲＧＤ」モチーフは、アミノ酸アルギニン、グリシンおよびアスパラギン酸からなるトリペプチドモチーフである。ＲＧＤモチーフは、いくつかの異なる細胞外タンパク質上に存在する。多くのこのようなタンパク質は、ＲＧＤモチーフを介してインテグリンタンパク質ファミリーの一部のメンバーによって認識される。知られている２４のヒトインテグリンサブタイプのうち、８つのインテグリンダイマー、すなわちαｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、αｖβ８、α５β１、α８β１およびαＩＩｂβ３は、細胞外マトリックスタンパク質内のトリペプチドＲＧＤモチーフを認識する。

ＲＧＤモチーフを含有する特定のタンパク質は、インテグリンタンパク質ファミリーの特定のメンバーに対して選択的である。例えば、口蓋発生の過程で細胞接着および細胞外マトリックス形成に関与する分子を調節することが知られているリガンドＴＧＦ－β３は、ＲＧＤモチーフを含み、ＲＧＤモチーフを介してインテグリンαｖβ６およびαｖβ３と相互作用することが知られている。インテグリンタンパク質ファミリーのメンバーに結合することが知られているいくつかの他の分子も存在する。例えば、ＴＧＦ－β１、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）およびフィブロネクチンは、αｖβ６に結合することが知られている。

ＲＧＤモチーフ含有ペプチドについては、他のペプチド選択肢がある：Ｄｏｎｇ，Ｘ．，Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎ．Ｅ．，Ｌｕ，Ｃ．＆Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｔ．Ａ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｉｎｔｅｇｒｉｎ β－ｓｕｂｕｎｉｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ ｌａｔｅｎｔ ＴＧＦ－β．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１，１０９１－１０９６（２０１４）；Ｓｏｒｏｌｌａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒｉｐｌｅ－ｈｉｔ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｔｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒｓ ｕｓｉｎｇ ｄｏｃｅｔａｘｅｌ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，ＥＮ１－ｉＰｅｐｓ ａｎｄ ＲＧＤ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１０２００３（２０１９）を参照のこと。これらは参照によりその全体が組み込まれる。

インテグリンタンパク質ファミリーの特定のメンバーは、特定の腫瘍細胞型および関連する脈管構造の原形質膜上で過剰発現される。したがって、ＲＧＤモチーフを含有するペプチドは、ＲＧＤ含有ペプチドが結合するインテグリンを過剰発現する腫瘍細胞型を標的とするのに有用であり得る。

インテグリンαｖβ６およびαｖβ３は、特定の乳癌細胞および腫瘍関連血管系の原形質膜上に過剰発現される。特に、αｖβ６およびαｖβ３は、トリプルネガティブ乳癌およびＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌細胞の表面に過剰発現される。したがって、インテグリンαｖβ６およびαｖβ３に選択的に結合するペプチドは、トリプルネガティブ乳癌およびＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌細胞に対して選択的であり得る。インテグリンαｖβ６は、卵巣癌細胞の原形質膜上に過剰発現される（Ｎ Ａｈｍｅｄ ｅｔ．ａｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｖｏｌ．２３ ｎｏ．２ ｐｐ．２３７－２４４，２００２を参照）。好ましい実施形態では、配列番号２（ＲＧＤ１）のＲＧＤモチーフは、αｖβ６インテグリンに対する最良の誘引性、すなわち結合親和性を有しており、乳癌細胞および卵巣癌細胞に対して強力なものとなる。本発明の一実施形態では、ＲＧＤ１はまた、より低い親和性でαｖβ３インテグリンに結合する。

したがって、態様において、本発明は、配列番号１のメリチンが、インテグリンαｖβ６およびαｖβ３を認識するＲＧＤペプチドモチーフを含有するペプチドと融合しているメリチン融合ペプチドを提供する。好ましくは、本発明のメリチン融合ペプチドは、ＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄトリプルネガティブ乳癌細胞サブタイプおよび／または卵巣癌に対する選択性が向上している。最も好ましくは、メリチン融合ペプチドは、メリチンの抗腫瘍活性を保持し、腫瘍細胞生存率に対して、メリチンと実質的に同じまたは優れた効果を及ぼす。いくつかの実施形態では、メリチン融合ペプチドは、腫瘍細胞におけるＰＤ－Ｌ１発現に対して、実質的に同じまたは優れた効果を及ぼす。

好ましくは、ＲＧＤモチーフ含有ペプチドの配列は、ＴＧＦ－β３に由来する。より好ましくは、ＲＧＤモチーフ含有ペプチドは、配列ＨＧＲＧＤＬＧＲＬＫＫ（配列番号２）（ＲＧＤ１）を有する。好ましくは、ＲＧＤ１は、αｖβ６インテグリンおよびαｖβ３インテグリンの両方と相互作用し、αｖβ６インテグリンに対して特に高い親和性を有する。

最も好ましい実施形態では、メリチンは、Ｎ末端において配列番号２のＴＧＦ－β３のＲＧＤモチーフと融合され、以下の配列を有する：
ＨＧＲＧＤＬＧＲＬＫＫＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ（配列番号３）

一態様では、本発明の融合ペプチドは、単離されたペプチドである。

（ｃ）ＲＧＤモチーフ含有ペプチドへのメリチンの融合
一態様では、本発明のメリチン融合ペプチドは、融合ペプチドがメリチン由来の抗腫瘍効果を有するという点で二機能性であり、インテグリンαｖβ６および／またはαｖβ３を過剰発現する細胞にも選択的であり、その選択性はＲＧＤモチーフ含有ペプチドから増強される。

一態様では、メリチン融合ペプチドの二機能特性を促進するために、メリチンは、リンカーなしでＲＧＤモチーフ含有ペプチドに直接融合または結合される。

代替の実施形態では、メリチンは、リンカーを介してＲＧＤモチーフ含有ペプチドに融合または結合することができる。リンカーは、いくつかの実施形態では、特定の腫瘍部位への送達の特異性の改善を助けることができる。好ましくは、リンカーはインビボで切断可能である。最も好ましくは、リンカーは腫瘍部位で切断される。

（ｄ）メリチン融合ペプチドバリアント
いくつかの実施形態では、メリチン融合ペプチドは、上記のメリチン融合ペプチドの１またはそれを超えるアミノ酸置換を含む。当業者は、周知の技術を使用して、機能性を保持するメリチン融合ペプチドの適切なバリアントを決定することができるであろう。

特定の他の実施形態では、当業者は、例えば、活性にとって重要であると考えられない領域を標的化することによって、活性を破壊することなく改変することができるペプチドの適切な領域を同定することができる。例えば、そのような領域は、生物学的活性を破壊することなく、またはポリペプチド構造に悪影響を及ぼすことなく、保存的アミノ酸置換によって改変することができる。

最も好ましくは、本発明のメリチン融合ペプチドおよびそのバリアントのＣ末端は、正電荷を保持する。いくつかの実施形態では、正電荷の保持は、メリチン融合ペプチドの生物学的活性を維持するのに有利である。好ましくは、本発明のメリチン融合ペプチドおよびそれらのバリアントは、負に帯電したＣ末端配列を含まない。

本発明の特に好ましい形態では、バリアントのメリチン融合ペプチドは、配列番号１のメリチンのＣ末端の元の正のＫ_２１ＲＫＲ_２４（配列番号４）配列を保持する。本発明の非常に好ましい形態では、配列番号４の配列をＣ末端に保持するメリチン融合ペプチドバリアントは、配列番号３のメリチンおよびメリチン融合ペプチドに特徴的な生物学的活性を示す。

本発明の別の形態では、メリチン融合ペプチドは、正に荷電した代替Ｃ末端配列を含む。一実施形態では、メリチン融合ペプチドは、Ｓｉｍｉａｎウイルス４０（ＳＶ４０）ラージＴ抗原（ペプチドＳＶ４０－メリチン）に由来する（Ｓｉｍｉａｎウイルス４０（ＳＶ４０）ラージＴ抗原（ペプチドＳＶ４０－メリチン）中に存在する（Ｋ_２１ＫＫＲＫＶ_２６））（配列番号５）のＣ末端配列を含む。

本発明のメリチン融合ペプチドは、当技術分野で公知の日常的および標準的な技術によって製造することができる。例えば、メリチン融合ペプチドは、当技術分野で周知のペプチド合成装置の使用によって、または当技術分野で周知の標準的な組換えＤＮＡ技術によって合成することができる。

本発明によって包含されるペプチドには、共通の足場に基づくペプチドバリアントが含まれ、各ペプチドバリアントは、９９％またはそれを超える同一性；９８％またはそれを超える同一性；９７％またはそれを超える同一性；９６％またはそれを超える同一性；９５％またはそれを超える同一性；９０％またはそれを超える同一性；８５％またはそれを超える同一性；８０％またはそれを超える同一性；７５％またはそれを超える同一性；および７０％またはそれを超える同一性、からなる群から選択される一次ペプチド配列と比較したアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

好ましくは、バリアントペプチドを作製するための一次ペプチド配列に対する任意の変化は、アミノ酸欠失、アミノ酸付加および／またはアミノ酸置換を含む。

アミノ酸置換は、好ましくは当業者に公知の保存的アミノ酸置換である。例えば、当業者は、置換のために同定される特定のアミノ酸と共有されるアミノ酸の同じクラス内からアミノ酸を選択することによってアミノ酸置換を実施し得る。アミノ酸がそれらの構造およびそれらの側鎖（Ｒ基）の一般的な化学的特徴に基づいて６つの主要なクラスに分類されるアミノ酸クラスは、以下の通りである：
クラス１－グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン；
クラス２－セリン、システイン、セレノシステイン、トレオニン、メチオニン；
クラス３－プロリン；
クラス４－フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン；
クラス５－ヒスチジン、リジン、アルギニン；
クラス６－アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン

これらのクラス内の置換は、しばしば保存的であることが知られている。

代替アプローチとして、当業者は、以下の表に基づいてアミノ酸置換を選択し得る。これらの置換は、保存的であることも知られている。

本明細書で使用される「％同一性」という用語は、例えば、以下のように計算することができる。クエリ配列は、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズムを使用して標的配列に対してアラインメントされる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３－４６８０（１９９４））。アラインメントされた配列の１つ、例えば最短配列に対応するウィンドウにわたって比較が行われる。ウィンドウは、いくつかの例では、標的配列によって定義され得る。他の例では、ウィンドウはクエリ配列によって定義されてもよい。各位置のアミノ酸残基を比較し、標的配列中の同一の対応関係を有するクエリ配列中の位置のパーセンテージを同一性％として報告する。

Ｃ．医薬組成物
本発明の一態様では、本発明は、本発明のメリチン融合ペプチドを含む医薬組成物を提供する。好ましい実施形態では、メリチン融合ペプチドは、配列番号３またはそのバリアントである。好ましくは、医薬組成物は、薬学的に許容され得る希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤および／またはアジュバントをさらに含む。

最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達様式および所望の投与量に応じて当業者によって決定され得る。そのような組成物は、本発明のメリチン融合ペプチドの物理的状態、安定性、インビボ放出速度およびインビボクリアランス速度に影響を及ぼし得る。

一態様では、医薬組成物中の主なビヒクルまたは担体は、本質的に水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、特定の実施形態では、適切なビヒクルまたは担体は、注射用水、生理食塩水または人工脳脊髄液であってもよく、非経口投与用の組成物に一般的な他の材料が補充されていてもよい。いくつかの実施形態では、生理食塩水は、等張リン酸緩衝生理食塩水を含む。いくつかの実施形態では、血清アルブミンと混合された中性緩衝食塩水または生理食塩水は、さらに例示的なビヒクルである。

医薬組成物成分は、投与部位に許容され得る濃度で存在する。特定の実施形態では、緩衝液を使用して、組成物を生理学的ｐＨまたはわずかに低いｐＨ、典型的には約５～約８のｐＨ範囲内に維持する。

本発明の医薬組成物は、液体製剤の静脈内、動脈内、または筋肉内注射によって投与され得る。適切な液体組成物には、溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン、油などが含まれる。

非経口投与が企図される実施形態では、治療組成物は、追加の治療剤の有無にかかわらず、薬学的に許容され得るビヒクル中に所望のメリチン融合ペプチドを含むパイロジェンフリーの非経口的に許容され得る水溶液の形態であり得る。特定の実施形態では、非経口注射用のビヒクルは、少なくとも１つの追加の治療剤の有無にかかわらず、メリチン融合ペプチドが適切に保存された滅菌等張溶液として製剤化された滅菌蒸留水である。特定の実施形態では、調製は、生成物の制御放出または持続放出を提供することができる、注射可能なミクロスフェア、生体侵食性粒子、ポリマー化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸など）、ビーズ、ナノ粒子またはリポソームなどの薬剤での所望のメリチン融合ペプチドの製剤化を含むことができ、その結果、デポー注射を介して送達することができる。特定の実施形態では、ヒアルロン酸も使用することができ、循環中の持続時間を促進する効果を有することができる。特定の実施形態では、埋め込み型薬物送達デバイスを使用して、所望の分子を導入することができる。

特定の実施形態では、医薬組成物が製剤化されると、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体として、または脱水もしくは凍結乾燥粉末として、滅菌バイアル中に保存することができる。特定の実施形態では、そのような製剤は、すぐに使用できる形態または投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかで保存することができる。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、水溶性防腐剤を含む防腐剤を含む。使用され得る水溶性防腐剤としては、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、重硫酸ナトリウム、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、エチルアルコール、メチルパラベン、ポリビニルアルコール、ベンジルアルコールおよびフェニルエチルアルコールが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書の医薬組成物はまた、好ましくはメリチン融合ペプチドの機能に悪影響を及ぼさない相補的活性を有する追加の治療剤を含有し得る。好ましくは、医薬組成物は、化学治療剤または他の抗癌療法をさらに含む。そのような分子は、意図された目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。

一実施形態では、医薬組成物は、１またはそれを超える化学治療剤をさらに含む。好ましくは、化学治療剤は、ドセタキセル、トラスツズマブ、ペルツズマブおよび／またはシスプラチンである：例えば、Ｓｗａｉｎ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ，Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ，ａｎｄ Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ ｉｎ ＨＥＲ２－Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７２，７２４－７３４（２０１５）を参照し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、医薬組成物は抗癌療法を含む。好ましくは、抗癌療法は、ｏｍｏｍｙｃもしくはＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体またはそれらのバリアントである。

Ｄ．投与量
本明細書におけるメリチン融合ペプチド、メリチンおよび化学治療剤、ならびに他の抗癌治療薬（およびこれらの薬剤を含む組成物）は、予防的および／または治療的処置のために投与することができる。治療用途では、組成物は、疾患または状態に既に罹患している患者に、疾患または症状の症候または進行を治癒または少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で投与される。この使用に有効な量は、疾患または症状の重症度および経過、以前の治療、患者の健康状態、体重、および薬物に対する応答、ならびに処置する医師の判断に依存する。日常的な実験（限定されないが、用量漸増臨床試験を含む）によってそのような治療有効量を決定することは、十分に当業者の技術の範囲内であると考えられる。

予防的適用では、本明細書に記載されるメリチン融合ペプチド、メリチン、化学治療剤および他の抗癌治療薬（およびこれらの薬剤を含む組成物）は、特定の疾患、障害、または症状にかかりやすいか、他の点でこれらのリスクがある患者に投与される。例えば、いくつかの実施形態では、本発明のメリチン融合ペプチドによって標的化され得る、腫瘍形成中のαｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、αｖβ８、α５β１および／またはαＩＩｂβ３インテグリンの発現の増加がある。このような量を「予防有効量または用量」と定義する。この使用では、正確な量はまた、患者の健康状態、体重などに依存する。日常的な実験（例えば、用量漸増臨床試験）によってそのような予防有効量を決定することは、十分に当業者の技術の範囲内であると考えられる。患者において使用される場合、この使用のための有効量は、疾患、障害または症状の重症度および経過、以前の治療、患者の健康状態、および薬物に対する応答、ならびに処置する医師の判断に依存する。

特定の実施形態では、典型的な投与量は、上記の因子に応じて、約１μｇ／Ｋｇ～最大約１０ｍｇ／Ｋｇまたはそれを超える範囲であり得る。特定の実施形態では、投与量は、１μｇ／Ｋｇ～最大約１０ｍｇ／Ｋｇ；または１０μｇ／Ｋｇ～最大約１０ｍｇ／Ｋｇ；または１００μｇ／Ｋｇ～最大約１０ｍｇ／Ｋｇの範囲であり得る。好ましくは、ヒト用量は０．５ｍｇ／Ｋｇまたは５００μｇ／ｋｇの範囲である。

好ましくは、メリチンまたはメリチン融合ペプチドは、約１０μｇ／Ｋｇ～１０ｍｇ／Ｋｇの投与量で、より好ましくは１００μｇ／Ｋｇ～１ｍｇ／Ｋｇの投与量で投与される。いくつかの実施形態では、それは５００μｇ／Ｋｇの投与量で投与される。

好ましくは、化学治療剤は、３週間ごとに約１０～２００ｍｇ／ｍ^２ ＩＶの投与量で、より好ましくは３週間ごとに６０～１００ｍｇ／ｍ^２ ＩＶの投与量で投与される。いくつかの実施形態では、それは３週間ごとに７５ｍｇ／ｍ^２ ＩＶの投与量で投与される。好ましくは、化学治療剤はドセタキセルまたはシスプラチンである。

別の実施形態では、化学治療剤はカルボプラチンである。好ましくは、カルボプラチンは、標的ＡＵＣ ６で６サイクルのカルボプラチンで、疾患進行まで３週間ごとに、トリプルネガティブ乳癌に罹患している対象に投与され、メリチン融合ペプチドは、０．５ｍｇ／Ｋｇ～１００ｍｇ／Ｋｇの投与量で投与される。

いくつかの態様では、抗癌療法は、ペルツズマブまたはトラスツズマブによる処置をさらに含む。好ましくは、ペルツズマブは、最初のサイクルでは８４０ｍｇの用量で投与され、次いで、３週間ごとに４２０ｍｇで投与される。好ましくは、トラスツズマブは、最初のサイクルでは８ｍｇ／Ｋｇの用量で投与され、３週間ごとに６ｍｇ／Ｋｇで投与される。

他の態様では、抗癌療法はｏｍｏｍｙｃである。好ましくは、ｏｍｏｍｙｃは、０．５ｍｇ／Ｋｇ～１０ｍｇ／Ｋｇの投与量で投与される。最も好ましくは、ｏｍｏｍｙｃは、参照により組み込まれるＷａｎｇ ｅｔ．ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２０１９）３８：１４０－１５０に記載されているように、２．６ｍｇ／Ｋｇの投与量で投与される。別の態様では、抗癌療法は、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体またはそれらのバリアントである。好ましくは、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体またはそのバリアントは、２５０ｐＭ～１０００ｐＭの用量で投与される。最も好ましくは、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体またはそのバリアントは、２５０ｐＭの用量で投与される。

メリチン、メリチン融合ペプチド、またはメリチン融合ペプチドを含む医薬組成物は、様々な処置レジメンで対象に投与することができる。例えば、メリチン、メリチン融合ペプチドまたは医薬組成物は、１時間毎、１日３回、１日２回、１日１回、２日に１回、３日に１回、週に１回、２週間に１回、月に１回、２ヶ月に１回、６ヶ月に１回、および年に１回投与することができる。適切なレジメンは、処置される症状の性質に基づいて当業者によって決定され得る。例えば、メリチン、メリチン融合ペプチドまたはメリチン融合ペプチドを含む医薬組成物は、２日ごとに投与することができる。

Ｅ．処置方法
別の態様では、本発明は、対象における癌を処置する方法であって、治療有効量の本発明のメリチン融合ペプチドを上記対象に投与することを含む方法を提供する。

好ましくは、処置される癌は、インテグリンαｖβ６および／またはαｖβ３が腫瘍細胞および／または関連する脈管構造の原形質膜上で過剰発現される任意の腫瘍細胞サブタイプである。好ましくは、癌は、ＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌、トリプルネガティブ乳癌または卵巣癌の群から選択される。

好ましくは、癌を処置する方法は、上記対象に抗癌療法を投与する工程をさらに含む。

抗癌療法としては、限定されないが、ナチュラルキラー細胞ベースの免疫療法細胞（ＮＫ－９２ＭＩ）、モノクローナル抗体を含むＨＥＲ２標的剤、トラスツズマブ－エムタンシン、他の抗体－薬物コンジュゲート、リボ核タンパク質、例えばＣａｓ９－ｇＲＮＡおよびバリアント、またはポリペプチド、例えばｏｍｏｍｙｃが挙げられ、メリチンの膜破壊特性は細胞傷害性ペイロードの内部移行速度を高めることができる。本発明で使用するための抗癌療法には、将来開発される新規の化合物または処置も含まれることが理解されるべきである。

好ましくは、抗癌療法は化学治療剤であり、ドセタキセル、シスプラチン、ペルツズマブ、および／またはトラスツズマブから選択される。

別の好ましい実施形態では、抗癌療法は、ｏｍｏｍｙｃである。Ｏｍｏｍｙｃは、Ｍｙｃのロイシンジッパーに４つのアミノ酸置換を有する、Ｍｙｃのｂ－ＨＬＨ－ＬＺドメインを含むドミナントネガティブＭＹＣ変異体である（Ｓｏｕｃｅｋ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７，２４６３－２４７２；Ｓｏｕｃｅｋ，Ｌ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６２：３５０７－３５１０）。これらの置換（Ｅ６１Ｔ、Ｅ６８Ｉ、Ｒ７４Ｑ、およびＲ７５Ｎ）は、Ｍｙｃに変化した二量体化特異性を付与し、これは、その天然のパートナーＭａｘとヘテロ二量体化し、野生型ｃ－、Ｎ－およびＬ－Ｍｙｃとホモ二量体を形成する能力を保持する。Ｏｍｏｍｙｃは、ＭｙｃがそのＤＮＡ認識結合部位であるＥボックスに結合する能力を打ち消し、Ｍｙｃ依存性遺伝子トランス活性化機能をインビトロおよびインビボの両方で防止することができる。また、Ｏｍｏｍｙｃは、Ｍｙｃ発現レベルに依存してＭｙｃ誘導性アポトーシスを強く増強し、Ｍｙｃトランス抑制活性を強化する。したがって、プロモーターへのＭｉｚ－１依存的結合およびトランス抑制を保持しながら、ｏｍｏｍｙｃは、プロモーターＥ－ｂｏｘへのＭｙｃ結合および標的遺伝子のトランス活性化を妨げる。ｏｍｏｍｙｃの存在下では、Ｍｙｃインタラクトームの活性は、発癌促進性から腫瘍抑制性に変化する。

別の好ましい実施形態では、抗癌療法は、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体またはｄＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体などのバリアントである。これらの複合体は、２つの部分：ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびＣａｓ９結合エンドヌクレアーゼからなる。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９への結合に必要な足場配列と、標的位置に特異的な特異的標的配列（標的部位）とからなる短い合成ＲＮＡである。Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体を使用して、腫瘍増殖に関与する遺伝子を編集することができる。触媒的に不活性なｄＣａｓ９－ｇＲＮＡなどのＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体のバリアントも、クロマチンを修飾するドメインにｄＣａｓ９またはバリアントが連結されているエピジェネティック修飾を誘導する目的で使用することができる。

別の態様では、本発明は、癌の処置を必要とする対象において癌を処置する方法で使用するための本発明のメリチン融合ペプチドを提供する。好ましくは、処置される癌は、インテグリンαｖβ６および／またはαｖβ３が腫瘍細胞および／または関連する脈管構造の原形質膜上で過剰発現される任意の腫瘍細胞サブタイプである。好ましくは、癌は、ＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌、トリプルネガティブ乳癌または卵巣癌の群から選択される。

別の態様では、本発明は、癌の処置を必要とする対象における癌を処置するための医薬の製造における、本発明のメリチン融合ペプチドの使用を提供する。好ましくは、処置される癌は、インテグリンαｖβ６および／またはαｖβ３が腫瘍細胞および／または関連する脈管構造の原形質膜上で過剰発現される任意の腫瘍細胞サブタイプである。好ましくは、癌は、ＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌、トリプルネガティブ乳癌または卵巣癌の群から選択される。

さらなる態様では、本発明は、対象におけるトリプルネガティブ乳癌、ＨＥＲ２ ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌または卵巣癌を処置する方法であって、治療有効量のメリチン融合ペプチドとドセタキセル、シスプラチン、ペルツズマブ、および／またはトラスツズマブとの併用療法を上記対象に投与することを含む方法を提供する。

本発明はまた、対象における腫瘍細胞生存率を低下させる方法であって、治療有効量の本発明のメリチン融合ペプチドを投与する工程を含む方法を提供する。好ましくは、メリチン融合ペプチドは、配列番号３またはそのバリアントを含む。好ましくは、本方法は、上記対象に化学治療剤または他の抗癌療法を投与する工程をさらに含む。好ましくは、化学治療剤は、ドセタキセル、シスプラチン、ペルツズマブ、ｏｍｏｍｙｃおよび／またはトラスツズマブから選択される。別の好ましい実施形態では、抗癌療法は、ｏｍｏｍｙｃもしくはＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体またはそれらのバリアントから選択される。

さらに、本発明は、癌に罹患している対象におけるＰＤ－Ｌ１発現を阻害する方法であって、メリチンまたはメリチン融合ペプチドを治療有効量で対象に投与する工程を含む方法を提供する。好ましくは、本方法は、化学治療剤を投与する工程をさらに含む。さらに好ましくは、化学治療剤は、ドセタキセル、シスプラチン、ペルツズマブ、ｏｍｏｍｙｃおよび／またはトラスツズマブである。好ましくは、対象は、トリプルネガティブ乳癌、ＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌または卵巣癌に罹患している。

免疫チェックポイントタンパク質ＰＤ－Ｌ１は、免疫チェックポイントタンパク質ＰＤ－１に結合し、さもなければ腫瘍細胞に対する自然免疫応答に関与するであろうＴ細胞の活性化および免疫認識を阻害することができる。ＰＤ－Ｌ１の阻害は、Ｔ細胞の活性化をもたらす。特定の癌において、特定の化学治療剤の投与はＰＤ－Ｌ１の発現を増加させ、腫瘍細胞に対する免疫応答を低下させ、処置の全体的な有効性を低下させることも示されている。

本発明のこの態様では、癌に罹患している対象への治療有効量のメリチンまたはメリチン融合ペプチドの投与は、腫瘍細胞におけるＰＤ－Ｌ１の発現を低下させる。これは、対象による抗腫瘍免疫応答の改善をもたらし得る。

好ましくは、処置される癌は、インテグリンαｖβ６および／またはαｖβ３が腫瘍細胞および／または関連する脈管構造の原形質膜上で過剰発現される任意の腫瘍細胞サブタイプである。好ましくは、癌は、ＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌、トリプルネガティブ乳癌または卵巣癌の群から選択される。

別の態様では、本発明は、癌に罹患している対照におけるＰＤ－Ｌ１発現の阻害に使用するための本発明のメリチン融合ペプチドを提供する。好ましくは、癌は、インテグリンαｖβ６および／またはαｖβ３が腫瘍細胞および／または関連する脈管構造の原形質膜上で過剰発現される任意の腫瘍細胞サブタイプである。好ましくは、癌は、ＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌、トリプルネガティブ乳癌または卵巣癌の群から選択される。

本発明のこの態様の好ましい実施形態では、本方法は、抗癌療法の投与をさらに含む。

別の態様では、本発明は、癌に罹患している対象におけるＰＤ－Ｌ１発現を阻害するための医薬の製造における、本発明のメリチン融合ペプチドの使用を提供する。好ましくは、癌は、インテグリンαｖβ６および／またはαｖβ３が腫瘍細胞および／または関連する脈管構造の原形質膜上で過剰発現される任意の腫瘍細胞サブタイプである。好ましくは、癌は、ＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌、トリプルネガティブ乳癌または卵巣癌の群から選択される。

さらなる態様では、本発明は、癌に罹患している対象における抗癌療法の細胞透過を促進する方法であって、治療有効量のメリチン融合ペプチドと抗癌療法との併用療法を対象に投与する工程を含む方法を提供する。

好ましくは、抗癌療法は、ｏｍｏｍｙｃもしくはＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体またはそれらのバリアントである。

好ましくは、処置される癌は、インテグリンαｖβ６および／またはαｖβ３が過剰発現される任意の癌細胞サブタイプである。最も好ましくは、癌は、ＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄトリプルネガティブ乳癌または卵巣癌の群から選択される。

Ｆ．併用療法
本発明の別の態様は、対象に治療有効量の本発明のメリチン融合ペプチド（またはメリチン融合ペプチドを含む医薬組成物）を投与する工程と、さらに該対象に抗癌療法を投与する工程とを含む、対象において癌を処置する方法を提供する。メリチン融合ペプチドは、処置を必要とする対象を処置するために、抗癌療法による処置前、処置中または処置後に投与することができる。

本発明の別の態様では、癌に罹患している対象においてＰＤ－Ｌ１の発現を低下させる方法、さらに該対象に抗癌療法を投与する工程が提供される。

好ましくは、抗癌療法は化学治療剤である。好ましくは、化学治療剤は、対象が罹患している癌のタイプに対する標準ケアにおいて使用される薬剤である。最も好ましくは、化学治療剤は、トリプルネガティブ乳癌、ＨＥＲ２ ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌または卵巣癌を有する患者を処置するために使用されるドセタキセル、トラスツズマブ、ペルツズマブおよび／またはシスプラチンから選択される。あるいは、化学治療剤はカルボプラチンである。

別の実施形態では、抗癌療法はポリペプチドである。好ましくは、ポリペプチドはｏｍｏｍｙｃである。

さらなる実施形態では、抗癌療法は、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体またはそれらのバリアントである。

いくつかの実施形態では、メリチン融合ペプチドは、ドセタキセルと共に投与される。好ましくは、トリプルネガティブ乳癌またはＨＥＲ２ ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌を処置するために、ドセタキセルは、トリプルネガティブ乳癌またはＨＥＲ２ ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌に罹患している対象に、疾患進行が停止するまで３週間ごとに６０～１００ｍｇ／ｍ^２ ＩＶの用量で投与され、メリチン融合ペプチドは、０．５～１００ｍｇ／Ｋｇの用量で投与される。好ましくは、ドセタキセルは、２日目に７５ｍｇ／ｍ^２の用量で、次いで３週間ごとに７５ｍｇ／ｍ^２の用量で投与され、用量調整は、忍容性を改善するために最大１００ｍｇ／ｍ^２、または２５％の用量減少を可能にした。好ましくは、ドセタキセルは、１またはそれを超える追加の化学治療剤と一緒に投与される。好ましくは、追加の化学治療剤はトラスツズマブおよび／またはペルツズマブである。

好ましくは、トラスツズマブは、Ｓｗａｉｎ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ，Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ，ａｎｄ Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ ｉｎ ＨＥＲ２－Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７２，７２４－７３４（２０１５）に記載の方法論に従って、ペルツズマブまたは別の同様の抗体と組み合わせて、ＨＥＲ２陽性転移性乳癌に罹患している対象に投与される。

最も好ましくは、乳癌を処置するために、トラスツズマブは、１日目に８ｍｇ／Ｋｇの投与量で投与され、次いで、疾患進行が停止するまで３週間ごとに６ｍｇ／Ｋｇで投与され、メリチン融合ペプチドは、０．５～１００ｍｇ／Ｋｇの投与量で投与される。

いくつかの態様では、抗癌療法は、ペルツズマブまたはトラスツズマブによる処置をさらに含む。好ましくは、ペルツズマブは、１日目に８４０ｍｇの用量で投与され、次いで、３週間ごとに４２０ｍｇで投与される。好ましくは、トラスツズマブは、１日目に８ｍｇ／Ｋｇの用量で投与され、３週間ごとに６ｍｇ／Ｋｇで投与される。

いくつかの態様では、本発明のメリチン融合ペプチドは、シスプラチンと共に投与される。好ましくは、シスプラチンまたはシスプラチンと他の薬剤との併用は、トリプルネガティブ乳癌、ＨＥＲ２ ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌または卵巣癌に罹患している対象に、疾患進行が停止するまで３週間ごとに６０～１００ｍｇ／ｍ^２ ＩＶのシスプラチン投与量で投与され、メリチン融合ペプチドは、好ましくは０．５～１００ｍｇ／Ｋｇの投与量で投与される。

別の態様では、メリチン融合ペプチドは、カルボプラチンと共に投与される。好ましくは、カルボプラチンは、トリプルネガティブ乳癌、ＨＥＲ２ ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌または卵巣癌に罹患している対象に投与される。カルボプラチンは、３週間ごとまたは疾患進行が停止するまで、標的ＡＵＣ ６で６サイクルにわたって投与される。メリチン融合ペプチドは、好ましくは、０．５～１００ｍｇ／Ｋｇの投与量で投与される。

別の実施形態では、メリチン融合ペプチドは、ｏｍｏｍｙｃと共に投与される。好ましくは、ｏｍｏｍｙｃは、約１０μｇ／Ｋｇ～１０ｍｇ／Ｋｇの投与量で、より好ましくは１００μｇ／Ｋｇ～１０ｍｇ／Ｋｇの投与量で投与される。いくつかの実施形態では、それは２．６ｍｇ／Ｋｇの投与量で投与される。好ましくは、ｏｍｏｍｙｃは、０．５ｍｇ／Ｋｇ～１０ｍｇ／Ｋｇの投与量で投与される。最も好ましくは、ｏｍｏｍｙｃは、２．６ｍｇ／Ｋｇの投与量で投与される。

別の実施形態では、メリチン融合ペプチドは、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体またはそのバリアントと共に投与される。好ましくは、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体またはそのバリアントは、約１０μｇ／Ｋｇ～１０ｍｇ／Ｋｇの投与量で、より好ましくは１００μｇ／Ｋｇ～１ｍｇ／Ｋｇの投与量で投与される。好ましくは、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体またはそのバリアントは、２５０ｐＭ～１０００ｐＭの用量で投与される。最も好ましくは、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体またはそのバリアントは、２５０ｐＭの用量で投与される。

さらなる態様では、本発明は、癌に罹患している対象における抗癌療法の細胞透過を促進する方法であって、治療有効量のメリチン融合ペプチドと抗癌療法との併用療法を対象に投与する工程を含む方法を提供する。

抗癌療法は、癌細胞の成長および／または転移を防止または遅延させる任意の化合物、組成物または処置であり、１００ｋＤａより大きいものを含む、小分子、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質－核酸複合体を含み得る。

理論に束縛されるものではないが、メリチン融合ペプチドは、約４．４ｎｍの内径を有する膜貫通孔を生成することができる。これらの細孔は、抗癌療法を含む（化学治療剤を含む）他の治療薬の細胞透過を促進し得る。このことは、例えばそれらのサイズのために他の方法では腫瘍細胞に容易に浸透しない抗癌療法に関して特に有益であり得る。

いくつかの態様では、メリチン融合ペプチドと抗癌療法との間に相乗作用または有益な作用がある。好ましくは、抗癌療法は化学治療剤、具体的にはドセタキセル、トラスツズマブ、ペルツズマブおよび／またはシスプラチンである。別の好ましい実施形態では、抗癌療法は、ｏｍｏｍｙｃもしくはＣａｓ９－ｇＲＮＡまたはそれらのバリアントである。

特に好ましい実施形態では、上記方法のメリチン融合ペプチドは、配列番号３またはそのバリアントを含む。

さらなる態様では、本発明は、対象に治療有効量のメリチン（またはメリチンを含む医薬組成物）を投与する工程と、さらに該対象に抗癌療法を投与する工程とを含む、対象において癌を処置する方法を提供する。メリチンは、処置を必要とする対象を処置するために、抗癌療法による処置前、処置中または処置後に投与することができる。

好ましくは、治療有効量のメリチンは、癌に罹患している患者を処置するために、治療有効量のシスプラチン、ペルツズマブ、トラスツズマブおよび／またはドセタキセルと共に投与される。より好ましくは、治療有効量のメリチンは、トリプルネガティブ乳癌、ＨＥＲ２ ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌または卵巣癌に罹患している患者を処置するために、治療有効量のシスプラチン、ペルツズマブ、トラスツズマブおよび／またはドセタキセルと共に投与される。

別の実施形態では、治療有効量のメリチンは、治療有効量のｏｍｏｍｙｃ、またはＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体もしくはそのバリアントと共に投与される。より好ましくは、治療有効量のメリチンは、トリプルネガティブ乳癌、ＨＥＲ２ ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌または卵巣癌に罹患している患者を処置するために、治療有効量のｏｍｏｍｙｃもしくはＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体またはそれらのバリアントと共に投与される。

さらなる態様では、本発明は、癌に罹患している対象における抗癌療法の細胞透過を促進する方法であって、治療有効量のメリチンと抗癌療法との併用療法を対象に投与する工程を含む方法を提供する。

抗癌療法は、癌細胞の成長および／または転移を防止または遅延させる任意の化合物、組成物または処置であり、１００ｋＤａより大きいものを含む、小分子、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質－核酸複合体をより多く含み得る。

理論に束縛されるものではないが、メリチンは、約４．４ｎｍの内径を有する膜貫通孔を生成することができる。これらの細孔は、抗癌療法を含む（化学治療剤を含む）他の治療薬の細胞透過を促進し得る。このことは、例えばそれらのサイズのために他の方法では腫瘍細胞に容易に浸透しない抗癌療法に関して特に有益であり得る。

いくつかの態様では、メリチンと抗癌療法との間に相乗作用または有益な作用がある。好ましくは、抗癌療法は化学治療剤、具体的にはドセタキセル、トラスツズマブ、ペルツズマブおよび／またはシスプラチンである。別の好ましい実施形態では、抗癌療法は、ｏｍｏｍｙｃもしくはＣａｓ９－ｇＲＮＡまたはそれらのバリアントである。

別の態様では、本発明は、癌に罹患している対象におけるＰＤ－Ｌ１発現を阻害する方法であって、メリチンまたはメリチン融合ペプチドを治療有効量で対象に投与する工程、および化学治療剤を投与する工程を含む方法を提供する。より好ましくは、化学治療剤は、ドセタキセル、トラスツズマブ、ペルツズマブ、および／またはシスプラチンである。

癌に罹患している対象への治療有効量のメリチンまたはメリチン融合ペプチドの投与は、腫瘍細胞におけるＰＤ－Ｌ１の発現を低下させ、これは、そうでなければ、トラスツズマブを含むいくつかの化学治療剤の投与によって上方制御され得る。これは、対象による抗腫瘍免疫応答の改善をもたらし得る。併用療法では、治療有効量のメリチンまたはメリチン融合ペプチドの投与は、対象による抗腫瘍免疫応答の改善をもたらし、対象における化学治療剤によるＰＤ－Ｌ１発現の任意の上方制御を減少させることができる。好ましくは、化学治療剤はドセタキセル、トラスツズマブ、ペルツズマブ、および／またはシスプラチンであり、対象はトリプルネガティブ乳癌、ＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌または卵巣癌に罹患している。

Ｇ．キット
一実施形態では、本発明は、メリチン融合ペプチドを、本発明によるその融合ペプチドの使用方法に関する説明書と共に含む、癌を処置するためのキットを提供する。

好ましい一実施形態では、メリチン融合ペプチドは、配列番号３またはそのバリアントである。好ましくは、キットは、化学治療剤をさらに含むことができる。より好ましくは、化学治療剤は、ドセタキセル、トラスツズマブ、ペルツズマブ、および／またはシスプラチンである。別の好ましい実施形態では、キットは、別の抗癌療法をさらに含むことができる。より好ましくは、抗癌療法は、ｏｍｏｍｙｃもしくはＣａｓ９－ｇＲＮＡである。キットの個々の構成要素は、別個の容器に包装することができ、そのような容器に関連して、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形態の通知とすることができ、その通知は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売の機関による承認を反映する。

キットの構成要素が１またはそれを超える液体溶液で提供される場合、液体溶液は水溶液、例えば滅菌水溶液であり得る。インビボ使用のために、発現構築物は、薬学的に許容され得る注射可能な組成物に製剤化され得る。この場合、容器手段は、それ自体が吸入器、シリンジ、ピペット、点眼器、または他のそのような装置であってもよく、そこから製剤を胸などの動物の患部に適用し、動物に注射し、またはキットの他の構成要素に適用し、それと混合することさえできる。

キットの構成要素はまた、乾燥形態または凍結乾燥形態で提供されてもよい。試薬または構成要素が乾燥形態として提供される場合、再構成は一般に適切な溶媒の添加によるものである。溶媒はまた、別の容器手段に提供されてもよいことが想定される。容器の数または種類にかかわらず、本発明のキットはまた、動物または患者の体内への最終的な複雑な組成物の注射／投与または配置を補助するための器具を含んでもよく、またはそれと共に包装されてもよい。そのような器具は、吸入器、シリンジ、ピペット、鉗子、測定されたスプーン、点眼器、または任意のそのような医学的に承認された送達ビヒクルであり得る。

Ｈ．核酸分子
一実施形態では、本発明は、本発明のメリチン融合ペプチドを含む核酸分子を含む。好ましい実施形態では、核酸分子は、配列番号３のメリチン融合ペプチドをコードする核酸配列である配列番号７または８を含む：
配列番号７
ホモサピエンス：
CACGGCAGGGGCGACCTGGGCAGGCTGAAGAAGGGCATCGGCGCCGTGCTGAAGGTGCTGACCACCGGCCTGCCCGCCCTGATCAGCTGGATCAAGAGGAAGAGGCAGCAG
配列番号８
大腸菌：
CATGGCCGCGGCGATCTGGGCCGCCTGAAAAAAGGCATTGGCGCGGTGCTGAAAGTGCTGACCACCGGCCTGCCGGCGCTGATTAGCTGGATTAAACGCAAACGCCAGCAG

当業者は、上記の議論が、メリチン融合ペプチドを同定、評価および／または作製するために、ならびにそれらのペプチドをコードし得る核酸配列のためにも使用され得ることを理解するであろう。したがって、それらのペプチドをコードする核酸配列が企図される。

一実施形態では、本発明は、本明細書に記載の核酸分子を含むベクターを含む。

一実施形態では、本発明は、本明細書に記載の核酸分子を含む宿主細胞を含む。

Ｉ．選択的結合剤
本明細書で使用される場合、「選択的結合剤」という用語は、本明細書に記載される本発明のペプチドに対して特異性を有する分子を指す。適切な選択的結合剤には、抗体およびその誘導体、ポリペプチドおよび小分子が含まれるが、これらに限定されない。適切な選択的結合剤は、当技術分野で公知の方法を使用して調製され得る。例示的な選択的結合剤は、本発明のペプチドの一部に結合することができる。そのような結合剤は、組織または個々の細胞における本発明のペプチドの存在を決定し、他の分子との結合活性および／または局在化を決定するために利用することができる。

本発明のペプチドに結合する抗体および抗体断片などの選択的結合剤には、単一特異性ポリクローナル、モノクローナル（ＭＡｂ）、組換え、キメラ、ヒト化、例えばＣＤＲグラフト、ヒト、単鎖および／または二重特異性、ならびにそれらの断片、バリアントまたは誘導体が含まれる。抗体断片には、ペプチド上のエピトープに結合する抗体の部分が含まれる。そのような断片の例としては、全長抗体の酵素的切断によって生成されるＦａｂ断片およびＦ（ａｂ’）断片が挙げられる。他の結合断片には、抗体可変領域をコードする核酸配列を含有する組換えプラスミドの発現などの組換えＤＮＡ技術によって生成されるものが含まれる。

抗体を含む選択的結合剤は、投与された本発明のペプチドのインビボイメージングにも有用である。検出可能な部分で標識された抗体は、動物に、好ましくは血流中に投与され得、宿主中の標識された抗体の存在および位置がアッセイされる。抗体は、核磁気共鳴、放射線学、または当技術分野で公知の他の検出手段によるかどうかにかかわらず、動物において検出可能な任意の部分で標識され得る。

本発明はまた、選択的結合剤（抗体など）および生物学的試料中の本明細書に記載のペプチドのレベルおよび局在化を検出するのに有用な他の試薬を含むキットに関する。そのような試薬は、検出可能な標識、ブロッキング血清、陽性および陰性対照試料、ならびに検出試薬を含み得る。

特に、抗体を使用して、生物学的試料中に存在する本発明のペプチドを検出することができる。適切な試料は、好ましくは乳房または卵巣組織からのものであるが、脳、皮膚、心臓、肺、結腸、膵臓、精巣、肝臓、筋肉、前立腺および骨組織などの組織の抽出物も含み得る。本発明のそのような抗体は、固体支持体に結合され得、および／または適切な試薬、対照、説明書などと共に適切な容器内のキットに包装され得る。

一実施形態では、本発明は、配列番号１および／または配列番号３のメリチンに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体を含む。

本発明のさらなる特徴は、以下の非限定的な実施例においてより完全に説明される。この説明は、単に本発明を例示する目的で含まれる。上記のような本発明の広範な説明に対する制限として理解されるべきではない。

実施例１
抗癌有効性および選択性を評価するために、オーストラリアのパースで収集されたヨーロッパミツバチ由来の毒液およびメリチンペプチドの両方を、内因性乳癌サブタイプを表す細胞株のパネルおよび非形質転換細胞において用量応答アッセイで評価した。ミツバチ毒は、高い抗癌選択性を示し、ＴＮＢＣ（例えば、ＳＵＭ１５９、ＳＵＭ１４９）およびＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌細胞株（例えばＭＤＡ－ＭＢ－４５３、ＳＫＢＲ３）において有意により高い効力を有し、続いてルミナール乳癌細胞（ＭＣＦ７およびＴ－４７Ｄを含む）において効力を有し、正常細胞（初代真皮線維芽細胞ＨＤＦａ、および乳腺非形質転換ＭＣＦ１０ＡおよびＭＣＦ－１２Ａ細胞）に対する影響は最も低かった（図１Ａ、左；一般化線形モデル、ｐ＜０．００１）。ＴＮＢＣ ＳＵＭ１５９（５．５８ｎｇ／μＬ）およびＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ ＳＫＢＲ３（５．７７ｎｇ／μＬ）乳癌細胞の両方について、正常ＨＤＦａ細胞株と比較して（２２．１７ｎｇ／μＬ）、最大半量阻害濃度（ＩＣ_５０）の有意な低下が観察された（図１Ｂ、左；一元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０１）。

同様に、メリチンは、正常細胞と比較してＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌およびＴＮＢＣに対して有意により強力であり（図１Ａ－Ｂ、右；一般化線形モデル、ｐ＜０．００１）、ＩＣ_５０値は、ヒトＴＮＢＣおよびＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌細胞では０．９４～１．４９μＭ、非形質転換細胞では１．０３～２．６２μＭであった。マウス乳癌および正常細胞株におけるミツバチ毒およびメリチンの細胞生存率アッセイにより、ｐ５３変異クローディン低Ｔ１１およびＢＲＣＡ変異Ｂ．１５株などの攻撃的マウス腫瘍細胞株に対する選択性の向上が確認された（図１Ｃ）。これらの用量応答アッセイのそれぞれについてのＩＣ_５０値を図１Ｄに示す。表は、ヒト細胞株およびマウス細胞株において試験された乳癌正常細胞株および癌細胞株のパネルについての、ミツバチ毒およびメリチンの最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を示す。データは、ｎｇ／μＬまたはμＭ（小数点第２位まで）の平均±ＳＥＭとして提示している。実験は生物学的に３連で行った。

アイルランドおよび英国の異なるミツバチ集団からのミツバチ毒は、ＳＵＭ１５９およびＳＫＢＲ３細胞の生存率を、非形質転換ＨＤＦａ細胞の生存率よりも有意に低下させた（図２Ａ；一元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．００１）。英国からのマルハナバチＢｏｍｂｕｓ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓからの毒液も試験し、働きバチおよび女王バチの両方からの試料は、高濃度の毒液でさえも、ミツバチ毒と比較して乳癌細胞において最小限の細胞死を誘発した（図２Ｂ）。

次いで、メリチンを認識するマウスモノクローナル抗体を開発して、すべてのミツバチおよびマルハナバチの毒液試料におけるメリチンの相対存在量をＥＬＩＳＡによって評価した。メリチンの相対存在量は、異なる場所からのすべてのミツバチ毒液試料にわたって有意に異ならなかった（二元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＞０．９９９）。しかしながら、メリチン濃度は、マルハナバチ毒およびアイソタイプＩｇＧ対照と比較して、ミツバチ試料において有意により高かった（図３Ａ；二元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．００１）。

メリチンの抗癌効果は、抗メリチン抗体を利用してＨＤＦａおよびＳＵＭ１５９細胞における細胞生存率を救済するインビトロのブロッキング実験によっても支持された。細胞を、漸増濃度の抗メリチン抗体と組み合わせて、ミツバチ毒またはメリチンで処理した。ミツバチ毒またはメリチンペプチドに曝露されたＨＤＦａ細胞およびＳＵＭ１５９細胞のための抗メリチン抗体でメリチンをブロックした場合、細胞生存率は有意により高かった（図３Ｂ；ｔ検定、ｐ＜０．０００１）。これらのデータは、ミツバチ毒中に存在するメリチンが、研究されたすべての毒液の中で最も顕著な生物活性抗癌化合物であることを示唆している。

実施例２
細胞死の機構および動態を調べるために、ＴＮＢＣ細胞を、ＩＣ_５０のミツバチ毒またはメリチンのいずれかで１８時間および２４時間処理し、切断型カスパーゼ－３アッセイで調べてアポトーシス細胞死を定量した。免疫ブロット法により、ＳＵＭ１５９細胞における切断型カスパーゼ－３の誘導が確認され、処置の１８時間後および２４時間後の両方において、メリチン単独は、ミツバチ毒よりも高レベルのアポトーシスを誘導した（図４Ａ）。

処置後のアポトーシス細胞集団、壊死細胞集団または死細胞集団を定量するために、アネキシンＶ（アポトーシスの初期マーカー）を検出するためのフローサイトメトリーを行った。ＳＵＭ１５９細胞をビヒクル、ミツバチ毒またはメリチンのいずれかで６０分間処理した（図４Ｂ）。有意により後期のアポトーシス／壊死細胞が、ミツバチ毒（８．３±１．９％）およびビヒクル対照（４．８±０．４％）と比較して、メリチン処理試料（２３．６±５．７％）で観察された（二元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．００１、平均±ＳＥＭ）。しかしながら、すべての条件にわたって初期アポトーシス細胞または壊死細胞のレベルに有意差はなかった（二元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＞０．０５、平均±ＳＥＭ）。

より短時間での細胞死の動態を特徴付けるために、ＩＣ_５０濃度のミツバチ毒またはメリチンで最大１時間処理したＨＤＦａ、ＳＫＢＲ３およびＳＵＭ１５９細胞について、細胞生存率を測定した（図４Ｃ）。ミツバチ毒は細胞生存率を急速に低下させ、正常細胞株と癌細胞株との間には１時間にわたって有意差はなかった（二元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．９７）。対照的に、メリチンは、１０分以降、正常細胞と比較して両方の乳癌細胞株の生存率を有意に低下させ、３０分以降、ＳＵＭ１５９はＳＫＢＲ３より有意に高かった（二元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００１）。

ＳＫＢＲ３およびＳＵＭ１５９細胞における生細胞共焦点顕微鏡法（図４Ｄ）および走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）（図４Ｅ）は、１０～６０分にわたり、ビヒクル対照と比較してミツバチ毒およびメリチン処理による原形質膜の急速な破壊および収縮を示した。

実施例３
メリチンのＣ末端における正（Ｋ_２１ＲＫＲ_２４）配列（配列番号４）の機能的役割を評価するために、負に荷電したメリットンペプチド（Ｄ_２１ＥＤＥ_２４－メリチン；配列番号６）を設計した。これらの負の残基は、メリチンと原形質膜との結合を破壊すると予測された。ＤＥＤＥ－メリチンは、試験した細胞株のいずれにおいても抗癌活性を支持しなかった（図５Ａ～Ｂ）。重要なことに、ＤＥＤＥ－メリチンの抗癌活性は、細胞透過能を有するＳｉｍｉａｎウイルス４０（ＳＶ４０）ラージＴ抗原（ペプチドＳＶ４０－メリチン；配列番号９）中に存在する正電荷配列（Ｋ_２１ＫＫＲＫＶ_２６）（配列番号５）によって救済された（図５Ｂ）。同様に、より大きな正電荷を帯びたＴＡＴ配列（ＨＩＶ－１由来のトランス活性化転写）をメリチンのＣ末端にグラフトすると、ＤＥＤＥ－メリチンの活性も回復した（ペプチドＴＡＴ－メリチン；配列番号１０、図５Ｂ）。しかしながら、メリチンおよびＳＶ４０－メリチンの効力は、ＴＡＴ－メリチンよりも大きく、これは、ＴＡＴのサイズが大きいことに起因し得る。これらのデータは、メリチン活性に必要な残基が、原形質膜との相互作用に必要ないくつかの重要な正に荷電した残基を含む、Ｃ末端αヘリックスに存在する残基を含むことを実証している。

実施例４
癌細胞選択性を増強するために、Ｎ末端アルファ螺旋ＲＧＤペプチドモチーフ（ＲＧＤ１－メリチン、ＴＧＦ－β３由来；配列番号２：ＨＧＲＧＤＬＧＲＬＫＫ）を操作することによって、二機能性メリチンペプチドを生成した。

ＲＧＤ１－メリチンのＩＣ_５０は、Ｔ１１細胞において親メリチンと比較して有意に異ならず、効力がＲＧＤモチーフによって影響されないことを示した（図５Ｂ；ｔ検定、ｐ＝０．６５２）。ＲＧＤ１－メリチン（２．７３±０．１４）に関するＨＤＦａ／ＳＵＭ１５９のＩＣ_５０比をメリチン（１．７６±０．０４）と比較すると、ＲＧＤモチーフは、正常細胞株とＴＮＢＣ細胞株との間の治療域を有意に増加させ、ＲＧＤによってもたらされる癌細胞選択性の増強を示した（図５Ｃ；ｔ検定、ｐ＜０．０１、平均±ＳＥＭ）。メリチン、ＤＥＤＥ－メリチン、およびＲＧＤ１－メリチンで２４時間処理したＳＵＭ１５９ ＴＮＢＣ細胞におけるアポトーシスの誘導により、メリチンとＲＧＤ１－メリチンの両方の抗癌活性が確認されたが、ＤＥＤＥ－メリチンは確認されなかった（図６Ａ）。

抗メリチン抗体とメリチンとの間の相互作用は、ＲＧＤ１－メリチンと有意に異ならなかった（図６Ｂ；二元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＞０．９９９）が、ＤＥＤＥ－メリチンおよびＳＶ４０－メリチンとは有意に異なり（二元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０５）、ＳＶ４０－メリチンの吸光度はＩｇＧ対照と有意に異ならなかった（二元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＞０．１）。これらのデータは、モノクローナル抗メリチン抗体が、Ｎ末端標的化ペプチドの操作によって破壊されない立体構造エピトープを認識することを示唆した。

モデリング研究は、操作されたペプチドのメリチン部分の立体構造が、ＲＧＤモチーフのＣ末端突然変異またはＮ末端付加のいずれによっても破壊されないことを示した（図６Ｃ）。各ペプチドは、潜在的に細孔の形成を促進する特徴的な屈曲したアルファ－ヘリックス構造を保持しており、変異体間の抗癌活性の差が、膜との静電相互作用によるものであり、ペプチド構造の全体的な変化によるものではないことを示唆している。

メリチンの活性形態を認識する抗メリチン抗体の特異性を使用して、ＩＣ_５０濃度でビヒクル、ミツバチ毒、メリチン、ＲＧＤ１－メリチン、またはＤＥＤＥ－メリチンのいずれかで３０分間処理したメリチン感受性ＴＮＢＣ細胞株（ＳＵＭ１５９）における免疫蛍光によってペプチドの細胞内局在を検出した（図７）。メリチンは、ミツバチ毒、メリチンおよびＲＧＤ１－メリチン処理でＥＧＦＲを過剰発現する細胞の原形質膜に主に局在することが見出され、潜在的に膜破壊およびエンドソームの形成に起因して、ミツバチ毒およびメリチン処理細胞についてある程度の細胞内染色が観察された。

さらに、ＲＧＤ１－メリチンの染色パターンは、原形質膜のみを明確に標的としているように見え、これは腫瘍細胞表面部分に対する標的化ペプチドの選択性の向上と一致している。ＤＥＤＥ－メリチン処理細胞では、メリチン抗体の反応性の欠如が観察された。

要約すると、これらの結果は、ＲＧＤモチーフが乳癌細胞膜へのメリチンの標的化を増強するが、Ｃ末端陽性モチーフが抗癌活性に重要であると思われることを明らかにする。

実施例５
次いで、ミツバチ毒およびメリチンの両方が、乳癌腫細胞におけるＥＧＦＲおよびＨＥＲ２のリガンド依存性活性化を遮断することによってＲＴＫ関連シグナル伝達経路を破壊するかどうかを調べた。

これを評価するために、免疫ブロット分析を、ＥＧＦに曝露され、ＩＣ_５０のミツバチ毒またはメリチンで２．５～２０分処理された細胞のＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２^＋、ＥＧＦＲ^＋）およびＳＵＭ１５９（ＥＧＦＲ^＋）抽出物に対して行った（図８Ａ～Ｂ）。ミツバチ毒およびメリチンの両方が、ＲＴＫのリン酸化を下方制御し、関連するＰＩ３Ｋ／ＡｋｔおよびＭＡＰＫシグナル伝達経路を時間依存的様式で調節した。

ＳＫＢＲ３細胞をミツバチ毒およびメリチンで処理すると、ｐ－ＨＥＲ２（Ｔｙｒ１２４８）、ｐ－ＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１０６８）、ｐ－ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）およびｐ－Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３およびＴｈｒ３０８）が５分後から強く下方制御され、総ＨＥＲ２、ＥＧＦＲおよびＡｋｔタンパク質は、ミツバチ毒処理の１０分後にのみわずかに減少し（図８Ａ）、これはエンドソーム媒介受容体分解に関連し得る。

ＳＵＭ１５９において、ｐ－ＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１０６８）は、１０～２０分から、ミツバチ毒およびメリチンによって強く下方制御された（図８Ｂ）。ＳＵＭ１５９をメリチンで処理すると、ｐ－Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３およびＴｈｒ３０８）もすべての時点で抑制されたが、ｐ－ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）は１０～２０分から上方制御され、一方、ミツバチ毒では、ｐ－ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）およびｐ－Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３およびＴｈｒ３０８）が１０～２０分から上方制御された。ＭＡＰＫおよびＡｋｔ経路は、細胞をアポトーシス細胞死から保護するためにＥＲＫシグナル伝達をトリガーする負の調節フィードバックループの放出のために、ＳＵＭ１５９細胞において上方制御されている可能性がある。抗メリチン抗体は、両方の細胞株の溶解物中に存在するメリチンの量が経時的に増加していることを示し、両方の細胞株において、ミツバチ毒と比較してメリチン処理についてのより強いシグナルを示した。

別のＴＮＢＣモデルにおけるシグナル伝達経路に対する効果を特徴付けるために、免疫ブロットを、ＥＧＦ処理がＥＧＦＲをリン酸化し、ＥＧＦＲ発現を誘導したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対して行った（図８Ｃ）。メリチンはＥＧＦＲおよびＭＡＰＫのリン酸化を減少させ、主要な発癌性増殖経路を下方制御した。ＳＵＭ１５９細胞とは異なり、ＥＧＦによるＥＧＦＲ刺激は、潜在的にＥＧＦＲシグナル伝達経路とＡｋｔ経路との間の解離に起因して、ｐ－Ａｋｔにおけるリン酸化の増加と相関しなかった。ＶＥＧＦＲ１などの他の成長因子受容体は、これらの経路の活性化を媒介し得る。

さらに、メリチンは卵巣癌においてＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３シグナル伝達を阻害することが以前に示されているので、ＳＵＭ１５９細胞におけるＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路に対するミツバチ毒およびメリチンの効果を評価した。ミツバチ毒またはメリチンで６０分間処理した後、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路阻害剤に対して調節効果は観察されなかった（図９）。

ＥＧＦへのＲＴＫの結合を妨害することによってメリチンが成長因子受容体リン酸化を抑制するかどうかを決定するために、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）実験を行った。この実験では、ＮａｎｏＬｕｃレポーターを生物発光ドナー分子として使用し、ＥＧＦＲに遺伝的に融合した。速度論的および飽和ＢＲＥＴ実験を使用して、ＮａｎｏＬｕｃ－ＥＧＦＲをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞における、蛍光タグ化アクセプター分子ＴＡＭＲＡ－ＥＧＦ（陽性対照）、ＦＩＴＣ－メリチンおよびＦＩＴＣ－ＤＥＤＥ－メリチン（陰性対照）とのＮａｎｏＬｕｃ－ＥＧＦＲの近接性をモニタリングした。ＢＲＥＴシグナルは、生物発光ドナータンパク質からの発光に対する蛍光アクセプターからの発光の比をモニタリングすることによって決定され、これは１０ｎｍ未満の範囲内で起こり、目的のタグ化分子間の相互作用を示す。

ＦＩＴＣ－ＤＥＤＥ－メリチンの対応するモル濃度を有するＦＩＴＣ－メリチンのＩＣ_５０を含む各ペプチドの濃度範囲を選択した。ＢＲＥＴシグナルは、ＴＡＭＲＡ－ＥＧＦおよびＦＩＴＣ－ＤＥＤＥ－メリチンでは用量依存的に増加し、ＦＩＴＣ－メリチンではより少ない程度で増加することが見出された（図１０Ａ～Ｃ）。Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ １（ＥＮ１）転写因子（ＦＩＴＣ－ＥＮ１変異体）に対して設計された非特異的ペプチドは、ＦＩＴＣ－ＤＥＤＥ－メリチンと同様のＢＲＥＴ比および速度論を示し（図１０Ｄ）、ＥＧＦＲとの結合相互作用の特異性を確認するためにさらなる実験が必要であることを示した。

メリチンがＥＧＦ結合部位でＥＧＦＲに結合するかどうかを決定するために、飽和ＢＲＥＴアッセイを行って、ＮａｎｏＬｕｃ－ＥＧＦＲに結合する各ペプチドとのＥＧＦの競合を評価した。ＮａｎｏＬｕｃ－ＥＧＦＲへのＴＡＭＲＡ－ＥＧＦの結合は飽和性であり、１μＭのＥＧＦの存在下では有意に減少したが（図１１Ａ；二元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００１）、ＦＩＴＣ－メリチンおよびＦＩＴＣ－ＤＥＤＥ－メリチンのＢＲＥＴシグナルは飽和性ではなく、１μＭのＥＧＦの有無で有意に異ならず（図１１Ｂ～Ｃ；二元配置分散分析、ｐ＞０．９９９）、メリチンもＤＥＤＥ－メリチンもＥＧＦ結合部位に結合しないことを示唆した。

全体として、理論に拘束されることを望むものではないが、これらのデータは、メリチンがＣ末端に存在する荷電配列を介して癌細胞の原形質膜に組み込まれ、原形質膜リモデリングおよび破壊を誘導するモデルを支持する。ＢＲＥＴデータは、内因性成長因子結合部位を妨害することなく、メリチンがＲＴＫから１０ｎｍ以内の距離に配置され得ることを示している（図１１）。

実施例６
メリチンは、直径約４．４ｎｍの膜貫通孔を形成し、化学治療薬の癌細胞への受動的進入を促進し得る。したがって、メリチンが化学治療剤と相乗作用して、より強力な治療有効性を達成できるかどうかを調査した。

マウスｐ５３^－ＴＮＢＣ細胞株Ｔ１１を、ドセタキセルまたはシスプラチンと、ミツバチ毒またはメリチンのいずれかとの併用で処理し、細胞生存率アッセイを行って、処理間の併用指数（ＣＩ）を決定した（図１２Ａ）。１未満の併用指数が試験したすべての濃度について観察され、強い相乗的相互作用を示した（図１２Ｂ）。

インビボでのＴＮＢＣ成長の減少におけるメリチンとドセタキセルとの併用の有効性を調べるために、Ｔ１１細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスに移植した。この同種移植片モデルは、無傷の免疫系を有するマウスにおいて非常に攻撃的なＴＮＢＣクローディン低疾患を再現する。Ｔ１１腫瘍（約５０ｍｍ^３）の発生の３日後、マウスを４つの群（ｎ＝１２マウス／群）に無作為化し、ビヒクル、メリチン（５ｍｇ／Ｋｇ）、ドセタキセル（７ｍｇ／Ｋｇ）、またはメリチン（５ｍｇ／Ｋｇ）とドセタキセル（７ｍｇ／Ｋｇ）の併用のいずれかで腫瘍内処置した。マウスを３日目から２日ごとに合計７回処置した。

併用処置の腫瘍制御は、特にＴ１１細胞の接種後７日目および９日目に、治療単独またはビヒクルのいずれかと比較して優れており、併用は腫瘍体積の有意な減少を達成した（図１３Ａ、一元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．００１）。これは、ドセタキセルに耐性の腫瘍を、メリチンの添加によって感受性にすることができることを示唆している。これらの研究は、ルシフェラーゼ含有構築物でタグ化されたＴ１１細胞におけるインビボ腫瘍成長の変化を非侵襲的に追跡するために生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって検証された（図１３Ｂ）。ここでも、１０、１２および１４日目において、他のすべての群と比較して、ドセタキセルとメリチンの併用処置について腫瘍制御の改善が見られた。

メリチンおよびドセタキセルの治療効果を、Ｔ１１細胞の接種後１４日目に、免疫組織化学および免疫蛍光法によって腫瘍組織において検証した（図１４Ａ）。抗メリチン抗体により、メリチン陽性細胞の腫瘍内局在が、メリチン処置群（６１．９±０．７％）および併用処置群（５５．８±１．３％）の両方で確認され、ビヒクル対照では確認されなかった（一元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．００１、平均±ＳＥＭ）。腫瘍細胞増殖の有意な減少（Ｋｉ－６７発現によって評価）が、メリチン（３１．７±１．３％）またはドセタキセル単独（２１．０±１．３％）のいずれかと比較して、ビヒクル（５９．８±１．７％）と比較してメリチンとドセタキセルの併用（５．７±０．８％）で処置された腫瘍で見られた（一元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０１、平均±ＳＥＭ）。ＴＵＮＥＬ染色により、ビヒクル（１．０±０．４％）と比較して、併用群（８１．０±３．１％）で有意により高いＤＮＡ断片化およびアポトーシス誘導が確認された（一元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０１、平均±ＳＥＭ）。

興味深いことに、ドセタキセルは、腫瘍における免疫チェックポイントタンパク質プログラム死リガンド－１（ＰＤ－Ｌ１）のレベルに影響を及ぼさなかった。ＰＤ－Ｌ１は、活性化Ｔ細胞の機能性を低下させる。その結果、化学治療と組み合わせた免疫チェックポイント遮断は、Ｔ細胞ＰＤ－Ｌ１認識を妨げ、ＴＮＢＣにおけるこの適応免疫耐性を防ぎ、それによって化学治療単独よりも治療有効性を高める。

ドセタキセル単独（８４．３±０．６％）とは対照的に、メリチンは、ビヒクル（８４．９±１．６％）と比較して、単独（５２．９±２．４％）または併用（４４．３±４．２％）で使用した場合、腫瘍におけるＰＤ－Ｌ１発現を有意に減少させた（一元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０１、平均±ＳＥＭ）。

要約すると、これらの研究は、メリチンがドセタキセル処置に対してＴ１１細胞を感作するという考え、およびメリチンが免疫チェックポイントタンパク質の発現を減弱させ、その結果、抗腫瘍免疫応答を改善するのを助けることができるという考えを支持する。

次いで、処理したＴ１１腫瘍において免疫組織化学を実施して、ｐ－ＨＥＲ２（Ｔｙｒ１２４８）およびｐ－ＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１０６８）を検出した（図１４Ｂ）。ＥＧＦＲの発現は、ビヒクル（１００．０±９．１％）と比較して、メリチンとドセタキセルの併用（７５．８±６．４％）によって中程度であるが有意に減少した（一元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０５、平均±ＳＥＭ）。ＨＥＲ２の発現は、すべての処置群にわたって有意差はなかった（一元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．１５３６）。ｐ－ＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１０６８）の場合、リン酸化は、ビヒクル（１００．０±８．１％）と比較して、メリチンとドセタキセルの併用処置（９．０±２．４％）によって有意により低いレベルに減少した（一元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００１、平均±ＳＥＭ）。ｐ－ＨＥＲ２（Ｔｙｒ１２４８）のレベルも、ビヒクル（１００．０±５．６％）と比較して、メリチンとドセタキセルの併用処置（５０．３±７．８％）で有意により低いレベルに低下した（一元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００１、平均±ＳＥＭ）。メリチン処置後のインビボでのＥＧＦＲおよびＨＥＲ２リン酸化の減少は、ＳＫＢＲ３、ＳＵＭ１５９およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるこれらのＲＴＫのリン酸化の減少におけるメリチンの観察された効果と一致している（図８）。

実施例７
マウスｐ５３^－ＴＮＢＣ細胞株Ｔ１１を、ドセタキセルと、メリチンまたはＲＧＤ１－メリチンのいずれかとの併用で処理し、細胞生存率アッセイを行って、処理間の併用効果を決定した（図１５）。メリチンとＲＧＤ１－メリチンの両方は、インビトロで、ドセタキセルと組み合わせた場合に有益な効果を有した。ＲＧＤ１－メルチンとドセタキセルの併用は、ＲＧＤ－１メリチンまたはドセタキセル単独よりも効果的に腫瘍細胞生存率を低下させた。

実施例８
マウスｐ５３^－ＴＮＢＣ細胞株Ｔ１１を、ｏｍｏｍｙｃと、メリチンまたはＲＧＤ１－メリチンのいずれかとの併用で処理し、細胞生存率アッセイを行って、処理間の併用効果を決定した（図１６）。メリチンとＲＧＤ１－メリチンの両方は、インビトロで、ｏｍｏｍｙｃと組み合わせた場合に有益な効果を有した。ＲＧＤ１－メルチンとｏｍｏｍｙｃの併用は、ＲＧＤ－１メリチンまたはｏｍｏｍｙｃ単独よりも効果的に腫瘍細胞生存率を低下させた。

実施例９
ＯＶＣＡＲ３およびＣＯＶ３６２卵巣癌細胞株を、活性ＲＧＤ１－メリチンおよび変異ＲＧＤ１－メリチン（ＤＥＤＥ－ＲＧＤ１－メリチン）で処理した。ＣＯＶ３６２細胞を、１０％ ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ低グルコース培地中で培養した。ＯＶＣＡＲ３細胞を、２０％ ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ培地中で増殖させた。細胞を５０００細胞／ｐ９６ウェルプレートの密度で一晩播種し、活性ＲＧＤ１－メリチンおよび変異ＲＧＤ１－メリチン（ＲＧＤ１－ＤＥＤＥメリチン）で、最大２０μＭの濃度で２４時間処理した。処理後、製造業者のプロトコルに従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）アッセイを用いて細胞生存率を評価した（Ｐｒｏｍｅｇａ；ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）。ＥｎＶｉｓｉｏｎマルチラベルプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎｓＥｌｍｅｒ Ｉｎｃ．；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して発光シグナルを測定した。ＩＣ５０を計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェア分析（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって提供される９５％信頼区間を変換した。

結果は、活性ＲＧＤ１－メリチンペプチドが、不活性変異ＲＧＤ１－メリチンと比較して、高侵襲性卵巣癌に対して有意により選択的であることを示した（ｐ＜０．００５）。さらに、活性ＲＧＤ１－メリチンは、メリチンよりも卵巣癌に対して有意により選択的であった。ＯＶＣＡＲ３細胞株の活性ＲＧＤ１－メリチンのＩＣ_５０は、活性メリチンの１８．１５μＭと比較して３．３５８μＭであり（約６倍低い）、ＣＯＶ３６２細胞株の活性ＲＧＤ１－メリチンのＩＣ_５０は、活性メリチンの７．８１０μＭと比較して２．０９５μＭであった（約３．７倍低い）。細胞生存率アッセイの結果を図１７に示す。

実施例１０
活性ＲＧＤ１－メリチンおよび変異ＲＧＤ１－メリチン（ＤＥＤＥ ＲＧＤ１－メリチン）で処理したＴＮＢＣ細胞（Ｔ１１およびＳＵＭ１５９）およびＨＥＲ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌細胞（ＳＫＢＲ３）のＰＤ－Ｌ１の発現を、免疫蛍光を用いて測定した。

細胞をポリ－Ｌ－リジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）でコーティングしたｐ２４ウェルプレート内のカバースリップ上に３×１０５の密度で２０分間一晩播種し、次いで精製水で２回洗浄した。細胞をＲＧＤ１－メリチンおよび変異ＲＧＤ１－メリチンでＩＣ５０濃度で２４時間処理した。翌日、細胞を４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、５％正常ヤギ血清で室温で１時間ブロックし、抗体希釈液（ＰＢＳ中１％ ＢＳＡおよび０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）中のａ－Ｋｉ－６７（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＃９４４９、１：５００）およびａ－ＰＤ－Ｌ１（Ａｂｃａｍ ＃２３８６９７；１：５００）と４°Ｃで一晩別々にインキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ＰＢＳ中のヤギα－マウス二次Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲート抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃Ａ１１００１、１：５００）およびＨｏｅｃｈｓｔ－３３２５８（１：５０００）と室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳをさらに３回洗浄した後、細胞を含有するカバースリップを、ＳｌｏｗＦａｄｅ Ｄｉａｍｏｎｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えるガラス製カバースリップ上に取り付けた。共焦点蛍光Ｎｉｋｏｎ Ｔｉ倒立顕微鏡を使用してスライドを画像化した。画像を４０倍の倍率で撮影し、ＩｍａｇｅＪを使用して処理した。

結果を図１８に示す。図１８Ａでは、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８で染色された細胞核が青色で示され、Ｋｉ－６７およびＰＤ－Ｌ１について陽性染色された細胞がそれぞれ緑色で示されている。結果は、ＲＧＤ１－メリチン（不活性ＲＧＤ１－メリチンではない）が、３つすべての細胞株（Ｔ１１、ＳＵＭ１５９およびＳＫＢＲ３）において細胞増殖およびＰＤ－Ｌ１発現を減少させることを示した。

ＰＤ－Ｌ１発現のレベルを、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して、活性ＲＧＤ１－メリチンおよび変異ＲＧＤ１－メリチンペプチドで処理したＴ１１、ＳＵＭ１５９およびＳＫＢＲ３において、またはビヒクルのみで処理したものにおいて測定した。

細胞をｐ６ウェルプレートに３×１０５の密度で一晩播種した。翌日、細胞をＲＧＤ１－メリチンおよび変異ＲＧＤ１－メリチンでＩＣ５０濃度で２４時間処理した。細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓを用いて細胞からＲＮＡを抽出した。試薬（ＱＩＡＧＥＮ）を製造者の説明書に従って使用する。Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、５００ｎｇの精製全ＲＮＡをｃＤＮＡ合成の鋳型として使用した。蛍光ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によってＰＤ－Ｌ１転写物発現の相対定量を得て、ＶｉｉＡ ７ＴＭリアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実行した。データをＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏリアルタイムＰＣＲソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって分析し、結果を、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルに対して正規化した後、それぞれ未処理細胞と比較した倍率変化として表した。

結果を図１８Ｂに示す。活性ＲＧＤ１－メリチンは、３つの細胞株のそれぞれにおいてＰＤ－Ｌ１のレベルを有意に低下させることが見出された（Ｔ１１細胞株についてはｐ＜０．００５、ＳＵＭ１５９細胞株についてはｐ＜０．０５、ＳＫＢＲ３細胞株についてはｐ＜０．００５）。

実施例１１
ＲＧＤ１－メリチン単独およびドセタキセルとの併用で処理したＴ１１、ＯＶＣＡＲ３、ＳＵＭ１５９およびＳＫＢＲ３細胞の細胞生存率アッセイを行った。細胞を５０００細胞／ｐ９６ウェルプレートの密度で一晩播種し、活性ＲＧＤ１－メリチン単独またはドセタキセルとの併用で処理し、それぞれの細胞株において一定でない比率で示される濃度で２４時間投与した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）アッセイを用いて細胞生存率を評価した。

結果を図１９に示す。各併用において影響を受けた細胞の異なる画分に対する併用効果を、自由に入手可能なＣｏｍｐｕＳｙｎソフトウェアに含まれるＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙアルゴリズムを使用して計算した。併用指数（ＣＩ）＜１は相乗作用を意味し、ＣＩ＝１は相加を意味し、ＣＩ＞１は拮抗作用を意味する。結果は、ＲＧＤ１－メリチンが、試験した４つの細胞株すべてをドセタキセルに対して有意に感作させたことを示している。

実施例１２
ＲＧＤ１－メリチン単独およびシスプラチンとの併用で処理したＴ１１、ＯＶＣＡＲ３およびＣＯＶ３６２細胞の細胞生存率アッセイを行った。細胞を５０００細胞／ｐ９６ウェルプレートの密度で一晩播種し、活性ＲＧＤ１－メリチン単独またはドセタキセルとの併用で処理し、それぞれの細胞株において一定でない比率で示される濃度で２４時間投与した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）アッセイを用いて細胞生存率を評価した。

結果を図１９に示す。各併用において影響を受けた細胞の異なる画分に対する併用効果を、自由に入手可能なＣｏｍｐｕＳｙｎソフトウェアに含まれるＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙアルゴリズムを使用して計算した。併用指数（ＣＩ）＜１は相乗作用を意味し、ＣＩ＝１は相加を意味し、ＣＩ＞１は拮抗作用を意味する。結果は、ＲＧＤ１－メリチンが、試験した３つの細胞株すべてをシスプラチンに対して有意に感作させたことを示している。

Claims (21)

1. （１）配列番号１またはそのバリアント、および（２）ＲＧＤモチーフ含有ペプチドを含む融合ペプチドであって、インテグリンαｖβ６およびαｖβ３に結合する、融合ペプチド。
2. ＲＧＤモチーフ含有ペプチドに結合した配列番号１またはそのバリアントを含む融合ペプチドであって、インテグリンαｖβ６およびαｖβ３に結合する、融合ペプチド。
3. 前記ＲＧＤモチーフ含有ペプチドが、配列番号２またはそのバリアントを含む、請求項１または２に記載の融合ペプチド。
4. 配列番号３を含む、請求項３に記載の融合ペプチド。
5. 配列番号３またはそのバリアントを含む、融合ペプチド。
6. 請求項１～５に記載の融合ペプチドを含む医薬組成物。
7. 治療有効量の請求項１～５に記載の融合ペプチドまたは請求項６に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、癌を処置する方法。
8. 前記癌が、前記インテグリンαｖβ６および／またはαｖβ３が腫瘍細胞および／または関連する脈管構造の原形質膜上で過剰発現される癌のタイプである、請求項７に記載の方法。
9. 腫瘍細胞生存率を低下させる方法であって、請求項１～５のいずれか１項に記載の融合ペプチドまたは請求項６に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に治療有効量で投与する工程を含む、方法。
10. 治療有効量の抗癌療法を、前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項７～９に記載の方法。
11. トリプルネガティブ乳癌、ＨＥＲ２ ｅｎｒｉｃｈｅｄ乳癌または卵巣癌を処置する方法であって、それを必要とする対象に、（１）治療有効量のメリチンを投与する工程、および（２）治療有効量のドセタキセルまたはシスプラチンを投与する工程を含む、方法。
12. 癌を処置する方法における使用のための、請求項１～５に記載の融合ペプチド。
13. 癌の処置を必要とする対象における癌を処置するための医薬の製造における、請求項１～５に記載の融合ペプチドの使用。
14. 請求項１～５に記載の融合ペプチドと、前記融合ペプチドの使用方法に関する説明書とを含む、対象における癌を処置するためのキット。
15. 請求項１～５に記載の融合ペプチドをコードする核酸分子。
16. 癌に罹患している対象におけるＰＤ－Ｌ１発現を阻害する方法であって、治療有効量のメリチンを、それを必要とする対象に投与する工程を含む、方法。
17. 癌に罹患している対象におけるＰＤ－Ｌ１発現を阻害する方法であって、治療有効量の請求項１～５に記載の融合ペプチドを、それを必要とする対象に投与する工程を含む、方法。
18. 癌に罹患している対象におけるＰＤ－Ｌ１発現を阻害するための医薬の製造における、請求項１～５に記載の融合ペプチドの使用。
19. 配列番号１および／または配列番号３のペプチドに特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体。
20. 癌に罹患している対象における抗癌療法の細胞透過を促進する方法であって、前記対象に、治療有効量の併用療法を投与する工程を含み、前記併用療法が、（１）請求項１～５に記載の融合ペプチド、および（２）抗癌療法を投与することを含む、方法。
21. 癌に罹患している対象における抗癌療法の細胞透過を促進する方法であって、前記対象に、治療有効量の併用療法を投与する工程を含み、前記併用療法が、（１）メリチン、および（２）抗癌療法を投与することを含む、方法。