ES2433840T3 - Anticuerpos para el tratamiento del cáncer - Google Patents

Abstract

Esta invención está relacionada con el uso de un anticuerpo o unfragmento del mismo, específico contra la sustancia P, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento terapéutico de cánceres que expresen el receptor NK1 y/o un miembro de la familiaErbB (i.e. la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico), por administración directa a un mamífero, incluyendo elhombre. La administración de un anticuerpo contra la sustancia Pa un panel de líneas celulares de cáncer de mama, inhibe la activación y la expresión de HER2, causando la disminución de la expresión de diferentes genes implicados en la progresión del ciclo celular, como la ciclina D1, la ciclina E, cdk4 y cdk2. Se observauna disminución en la proliferación y un arresto en la fase G1 del ciclo celular. Por otro lado, el anticuerpo causa una inducción de apoptosis.

Description

Anticuerpos para el tratamiento del cáncer

Esta invención está relacionada con el campo de la medicina, y particularmente con el campo de la oncología. Específicamente está relacionada con anticuerpos terapéuticos para la fabricación de medicamentos para el tratamiento del cáncer.

ESTADO DE LA TÉCNICA

El tratamiento del cáncer es una espada de doble filo: debe ser tan agresivo como sea posible para destruir completamente el tumor, pero es precisamente esta agresividad la que a menudo causa efectos adversos, razón por la cual algunas terapias prometedoras no pueden aplicarse sistemáticamente.

El cáncer es actualmente abordado por diferentes aproximaciones, normalmente combinadas, que pueden clasificarse en los siguientes grupos principales: terapias biológicas, quimioterapia, terapia hormonal, radioterapia, transplantes de células madre y de médula ósea, cirugía, y terapias de soporte (p.ej. bifosfonatos, eritropoyetina, factores de crecimiento hematopoiético, esteroides y transfusiones de plaquetas). La terapia biológica, también conocida como inmunoterapia, utiliza sustancias que produce el cuerpo naturalmente para destruir las células cancerosas. Hay diversos tipos de tratamientos incluyendo anticuerpos monoclonales, inhibidores del crecimiento del cáncer, inhibidores de la angiogénesis, terapia de interferón, vacunas y terapia génica. La inmunoterapia está dirigida a una variedad de dianas.

Muchas vías moleculares, las características de diversos tipos tumorales, y la fisiología de las células neoplásicas han sido descubiertas durante las últimas décadas. Este conocimiento ha permitido el diseño de nuevos fármacos para bloquear la acción de diferentes proteínas implicadas en las diferentes vías de transducción de la señal críticas para el crecimiento y la división celular. De entre las vías mejor caracterizadas están aquellas mediadas por receptores de factores de crecimiento (p.ej. familia ErbB). Otras familias de receptores de membrana, y por lo tanto dianas moleculares atractivas, son c-kit, PDGFR, FGFR y VEGFR (platelet-derived, fibroblast, vascular endothelial growth factor receptors; receptores del factor de crecimiento endotélico, derivado de plaquetas, de fibroblástico y vascular, respectivamente). Para estos receptores se han desarrollado inhibidores de la actividad quinasa en tirosina (TK, tyrosine-kinase) (p.ej. gefitinib, erlotinib y lapatinib), así como anticuerpos monoclonales contra el dominio extracelular del receptor. De entre los anticuerpos monoclonales terapéuticos aprobados para su uso en oncología, el trastuzumab es un anti-ErbB2/HER2 para el cáncer de mama, el cetuximab es un anti-ErbB1/EGFR para el cáncer de colon, y bevacizumab es un anti-VEGF para cánceres colorectales, de mama y de pulmón (cfr. G. Adams et al., “Monoclonal antibody therapy of cáncer”, Nature Biotechnology 2005, vol. 23, pp. 1147-57). Inhibidores multidiana (tales como Sutent) que inhiben la actividad TK de VEGFR, PDGFR y FGFR, son terapias emergentes prometedoras.

Sin embargo, aun y los mayores avances en el tratamiento del cáncer debidos a la introducción de nuevos agentes de quimioterapia y inmunoterapia y la optimización de las terapias combinadas, los resultados siguen siendo modestos tanto en la enfermedad local avanzada como en el estado metastático. Así, es necesario el desarrollo de nuevas estrategias que mejoren la prognosis del paciente. Esto implica primero la identificación de nuevas dianas funcionales y epítopos en dianas existentes en el amplio espectro de cánceres.

Rao et al (2004. Cancer Res., 64, 2874-2881) describe el tratamiento del cáncer (de mama) utilizando un gen que codifica un neurotransmisor, como la sustancia P, como diana. Los autores muestran la inhibición del gen TAC1 (en este documento denominado PPT-1), codificante de la sustancia P, con siARN.

Muñoz et al (2008. Invest New Drugs, 26, 111-118) muestra que los antagonistas del receptor de NK-1 inducen la apoptosis en el cáncer de laringe.

WO03102136 propone utilizar anticuerpos que se unen a la neuroquinina B, un miembro de la familia de la sustancia P, para el tratamiento de muchas enfermedades, incluyendo el cáncer.

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

En su sentido más amplio, la invención se refiere a la materia tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Los inventores han encontrado sorprendentemente que la administración directa de un anticuerpo contra la sustancia P a diferentes líneas celulares tumorales disminuye la proliferación de la célula tumoral e induce muerte de la célula tumoral. Así, la presente invención está relacionada con el uso de un anticuerpo, específico contra la sustancia P, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento terapéutico de un cáncer que exprese el receptor NK1 y/o un miembro de la familia ErbB (i.e. la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico, epidermal growth factor receptors), por administración directa a un mamífero, incluyendo un humano.

La revelación puede alternativamente ser formulada como un método para el tratamiento terapéutico del cáncer en un mamífero incluyendo un humano, que comprende la administración a dicho mamífero de una cantidad efectiva de un anticuerpo o un fragmento del mismo, contra la sustancia P, el cual inhibe la actividad de la sustancia P en el individuo.

La sustancia P (SP, Número de Registro CAS 33507-63-0) es un undecapéptido implicado en la neurotransmisión, vasodilatación y respuesta motora. La sustancia P tiene la siguiente secuencia aminoacídica: (C-ter) Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met (N-ter) (SEQ ID NO: 1). La sustancia P pertenece a una familia de péptidos muy relacionados entre ellos conocidos como taquiquininas (neuroquininas), junto con otros dos péptidos relacionados liberados endógenamente, la neuroquinina A (NKA) y la neuroquinina B (NKB). Las taquiquininas son pequeños neurotransmisores peptídicos que contribuyen a la patofisiología de varias enfermedades humanas. Las taquiquininas humanas están codificadas por el gen TAC1, incluyendo la sustancia P, NKA y NKB, las cuales interaccionan con una familia de receptores acoplados a proteínas G (GPCRs, G-protein coupled receptors), los receptores de taquiquininas NK1, NK2 y NK3, respectivamente. Estas moléculas pertenecen al eje neuroinmunoendocrino, que se ha asociado con el cáncer cuando es disfuncional. El receptor de preferencia para la sustancia P está codificado por un gen que puede generar transcritos codificados por la secuencia entera (NK1-FL) y por una truncada (NK1-Tr), esta última relacionada con la transformación de células de mama no tumorales. En cáncer de mama, se ha descrito el papel de la sustancia P y su receptor en la adquisición de propiedades oncogénicas y en la facilitación de las metástasis de médula ósea. La inhibición de la expresión de TAC1 por RNA pequeño de interferencia en células de cáncer de mama (BCCs, breast cancer cells ) muestra una pérdida de fenotipo tumoral y la inhibición de la metástasis en médula ósea en animales desnudos (cfr. G. Rao et al., “Facilitating role of preprotachykinin-I gene in the integration of breast cancer cells within the stromal compartment of the bone marrow: a model of early cancer progression”, Cancer Res. 2004, vol. 64, pp. 2874-81), mientras que la transfección estable del receptor NK1-Tr lleva a un fenotipo transformado (cfr. H.J. Patel et al., “Transformation of breast cells by truncated neurokinin-1 receptor is secondary to activation by preprotachykinin-A peptides”, Proc Natl Acad Sci USA 2005, vol. 102, pp. 17436-41). Además, la expresión de NK1-Tr en células de cáncer de mama estimula la secreción de sustancia P, llevando a la formación de un loop autocrino donde receptor y ligando se regulan mutuamente. Estudios previos han demostrado el papel importante de la sustancia P en cáncer, particularmente induciendo la proliferación de las BCCs, en la integración de las BCCs en la médula ósea así como

su función como estimuladora de la metástasis ósea (cfr. A.S. Singh et al., “Oncogenic and metastatic properties of preprotachykinin-I and neurokinin-1 genes” Vascul. Pharmacol. 2006, vol. 45, pp. 235-42; H.S. Oh et al., “Bone marrow stroma influences transforming growth factor-beta production in breast cancer cells to regulate c-myc activation of the preprotachykinin-I gene in breast cancer cells” Cancer Res. 2004, vol. 64, pp. 6327-36). También se ha demostrado las propiedades oncogénicas de la sustancia P y su receptor de alta afinidad NK1 (cfr. H.J. Patel et al., 2005 supra) por su habilidad para transformar líneas celulares de mama no tumorales.

De acuerdo con esta invención, la administración directa de un anticuerpo contra la sustancia P inhibe la activación de HER2 y su expresión en un panel de BCCs. Esta inhibición de HER2 causa una disminución de diferentes proteínas implicadas en la progresión del ciclo celular, como la ciclina D1, la ciclina E, cdk4 y cdk2. Como consecuencia, se observa una disminución de la proliferación y un arresto en la fase G1 del ciclo celular. Por otro lado, la exposición a largo plazo de las BCCs al anticuerpo causa la inducción de apoptosis, como se ha analizado por la tinción nuclear con DAPI, la tinción con annexin V/IP y por el hecho de que las células cancerosas se despegan de la placa 30-48 horas después del tratamiento. Estos efectos no se observan en líneas celulares transformadas no tumorales, las cuales no se despegan de la placa ni se ven afectadas por el tratamiento con anticuerpo, hecho que apunta a un efecto específico del anticuerpo en líneas celulares tumorales. Los efectos del tratamiento con el anticuerpo no son dependientes de HER2, aunque sus efectos parecen ser más pronunciados en líneas celulares que sobreexpresan HER2 que en otras con baja expresión de HER2. Además, en una línea celular con sobreexpresión de EGFR (MD-MBA-468), la sustancia P también induce su fosforilación, mientras que el tratamiento con el anticuerpo inhibe fuertemente su actividad, llevando a la muerte celular. Además, estos efectos antitumorales no se restringen a BCCs ya que el tratamiento de líneas celulares de cáncer de colon y de próstata con el anticuerpo también induce muerte celular e inhibe la activación basal de HER2 o EGFR en estas líneas celulares.

En esta invención, el término “administración directa” significa que el tratamiento no se hace mediante vacunación

con una forma inmunogénica de la sustancia P para la producción de anticuerpos por el mismo paciente. En la presente invención, el anticuerpo se produce (fuera del cuerpo) y se administra al paciente.

El tratamiento propuesto por la presente revelación es útil para pacientes viables (pacientes con estatus ECOG de 0 a 2) en tratamiento neoadyuvante (tratamiento antes de cirugía), en tratamiento adyuvante (tratamiento complementario después de la cirugía, cuando no hay tumor macroscópico detectable) y en tratamiento metastático. El estatus ECOG del Eastern Cooperative Oncology Group es una escala usada por los médicos e investigadores para evaluar la condición física del paciente, cómo progresa la enfermedad del paciente, cómo la enfermedad afecta a las capacidades diarias de la vida del paciente y para determinar el tratamiento apropiado y la prognosis.

Por “cáncer” se entiende un tumor maligno de potencial crecimiento ilimitado que se expande localmente por

invasión y sistémicamente por metástasis. De acuerdo con la invención, el anticuerpo o el fragmento del mismo se administran a individuos con un cáncer que expresa el receptor NK1 y/o un miembro de la familia de receptores ErbB. Miembros de la familia de receptores ErbB son los receptores HER1, HER2, HER3 y HER4.

Un miembro de la familia ErbB con funciones relevantes en cáncer es HER2. Su relación y significado en la progresión tumoral ha sido descrito en mama, próstata, pulmón, colon y otros tipos de cáncer. En cáncer de mama, aproximadamente el 20% de los pacientes muestran sobreexpresión de HER2 y amplificación génica, relacionada con un fenotipo más agresivo y mala prognosis.

En una realización particular, el cáncer (las células tumorales) expresan el receptor NK1 y/o el receptor HER1 receptor. En otra realización el cáncer expresa el receptor NK1 y/o el receptor HER2/neu, y particularmente, el cáncer expresa el receptor NK1 y el receptor HER2/neu. En otra realización, el cáncer expresa el receptor NK1 y/o el receptor HER3; y en otra realización, el cáncer expresa el receptor NK1 y/o el receptor HER4. En una realización más particular, el cáncer expresa el receptor NK1, el receptor HER1 y el receptor HER2/neu. Como se muestra por los experimentos, el efecto del anticuerpo se observa en líneas celulares tumorales que sobreexpresan HER2 (BT474, SKBR3, MDA-MB-453) pero también en líneas celulares tumorales con baja expresión de HER2. La expresión de los receptores NK1, HER1, HER2, HER3 y HER4 puede ser determinada en un paciente por cualquier método conocido en la técnica, como la inmunohistoquímica o la PCR.

Como se usa en la técnica, todos los términos “c-erb B2”, “ErbB2”, “EGFR2” y “HER2/neu” se refieren al mismo miembro 2 de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico. “ErbB1”, “HER1”, “EGFR” y “EGFR1” se refieren todos al miembro 1 de la familia. “HER3” y “ErbB3” corresponden al miembro 3 de la familia y “HER4” y “ErbB4” al miembro 4 de la familia.

En una realización de la invención, el cáncer de selecciona de un grupo que consiste en astrocitoma, glioma, neuroblastoma, cáncer pancreático, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de tiroides, adenoma de la pituitaria, cáncer de próstata, cáncer de colon y cáncer de mama. En una realización particular, el cáncer es cáncer de mama.

Desde que se descubrió la implicación de las taquiquininas de mamíferos en enfermedades humanas, la industria farmacéutica ha estado investigando duramente para encontrar potentes antagonistas de receptores NK. Aunque sólo se ha aprobado por la FDA un fármaco para el tratamiento de la nausea inducida por quimioterapia (aprepitan), diferentes antagonistas de NK1 están en ensayos clínicos para el tratamiento de diferentes enfermedades. Las diferentes aproximaciones desarrolladas hasta el momento se han centrado en la inhibición del receptor y por lo tanto, en el desarrollo de compuestos que compiten con la sustancia P para la unión con el receptor. Se ha sugerido en diferentes estudios que antagonistas del receptor NK1 podrían ser de utilidad en la terapia anti-cáncer (cfr. WO 2001001922 y EP 773026). En estudios con 1 nM del antagonista específico de NK1 CP-96341-1 (Pfizer) o el antagonista específico de NK2 SR 48968 (Sanofi), indujeron una disminución del 60% en la formación de colonias de BCC, mientras que el uso de ambos antagonistas resultó en una reducción del 80%, lo que sugiere que los efectos de cada antagonista deben ser aditivos. Pero los efectos de estos antagonistas no eran consecuencia de la

apoptosis o la inducción de necrosis ya que un 99% de las células eran viables (cfr. D. Singh et al., “Increased

expression of preprotachykinin-I and neurokinin receptors in human breast cancer cells: implications for bone marrow metastasis”, PNAS 2000, vol. 97, pp. 388-93). Teniendo en cuenta todo esto, estos experimentos apuntaban a un bloqueo de la proliferación celular por inhibición de los receptores NK más que por una inducción de muerte celular por supresión de las vías de transducción de señal de los NKR. En otro estudio también con un modelo de cáncer de mama humano, el antagonista de NK1 MEN 11467 y el antagonista de NK2 MEN 11420 (nepadutant) indujeron una inhibición de la proliferación (i.e. un efecto citostático y no citotóxico) contra la línea celular tumoral MDA-MB-231 (cfr. M. Bigioni et al., “Role of NK-1 and NK-2 tachykinin receptor antagonism on the growth of human breast carcinoma cell line MDA-MB-231”, Anti-cancer drugs 2005, vol. 16, pp. 1083-9). En la presente invención, la inhibición de la sustancia P por un anticuerpo es más potente que en los casos mencionados en bloquear la transducción de señal a través de su receptor, ya que la larga inhibición de la sustancia P por el anticuerpo lleva a la muerte celular.

De acuerdo con la presente invención, el tratamiento del cáncer se basa en la administración directa de un anticuerpo o un fragmento del mismo, contra la sustancia P, y los efectos observados con este tratamiento son diferentes a los de otras terapias relacionadas con la sustancia P conocidas en la técnica. Los inventores han observado que la administración del anticuerpo anti-sustancia P inhibe miembros de la familia de RTKs (receptores con actividad quinasa en tirosina). Por lo tanto, la administración del anticuerpo regula la proliferación celular y la supervivencia en parte inhibiendo la activación de RTKs.

Además, los efectos en RTKs como HER2 o HER1 por la administración de un anticuerpo contra la sustancia P son a través de vías intracelulares, al contrario de la acción de otros anticuerpos que se unen a los dominios extracelulares de los receptores, como el trastuzumab contra el receptor HER2. Muchos tumores eluden los fármacos antineoplásicos anti-HER2 y desarrollan resistencias a estos fármacos para continuar proliferando. Actualmente los cánceres de mama metastáticos HER2 positivos que no responden a la terapia estándar anti-HER2 (trastuzumab), encuentran una alternativa en lapatinib (inhibidor TK). Sin embargo es posible que esos tumores tengan éxito en evadir esta alternativa. Por ello, el tratamiento de la invención es útil en cánceres que presenten resistencia a trastuzumab y a otros fármacos anticancerosos dirigidos contra los receptores HER2 y HER1.

Como se usa aquí, “anticuerpo contra la sustancia P” significa cualquier anticuerpo policlonal o monoclonal contra la

sustancia P. La invención también contempla el uso de fragmentos de estos anticuerpos. Un fragmento significa una parte de un anticuerpo anti-sustancia P que es de un tamaño suficiente y conformación para unirse a un epítopo presente en la sustancia P y así prevenir que la sustancia P se úna a receptores celulares de la sustancia P. Como se usa aquí, el término "específico" significa que el anticuerpo no tiene asociaciones al azar con otros antígenos. Numerosas técnicas de ensayo bien conocidas basadas en reacciones inmunológicas entre antígenos y anticuerpos pueden ser utilizadas usando la sustancia P como antígeno para determinar si un anticuerpo particular, o un fragmento de anticuerpo, tiene la capacidad de unirse a un epítopo presente en la sustancia P, y para potencialmente inhibir la actividad de la sustancia P. Estas técnicas pueden ser por ejemplo ensayos inmunoabsorbentes unidos a enzima (ELISA, enzyme-linked immunosorbent essays), ensayos de inmunofluorescencia (IFA, immunofluorescence assays), radioinmunoensayos, inmunoelectroforesis, e inmunoblotting. Además, para determinar si un anticuerpo particular o un fragmento de anticuerpo tiene la capacidad de tratar el cáncer, se puede usar un ensayo de inducción de apoptosis, como la tinción con DAPI (4'-6-diamidino-2fenilindol) o con annexina (ver Ejemplos abajo).

En una realización preferida de la invención el anticuerpo o un fragmento del mismo será contra la porción Cterminal de la secuencia aminoacídica de la sustancia P, del aminoácido 5 al 11, a saber Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met (SEQ ID NO: 2).

Debe entenderse que el anticuerpo contra la sustancia P está en una forma farmacéuticamente aceptable para ser administrado a un individuo de forma oral, parenteral, intravenosa o de alguna otra manera. Además, el anticuerpo contra la sustancia P de la invención puede ser administrado sólo o en una composición con vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. La persona experta en la materia adaptará la composición dependiendo de la forma particular de administración. En el caso de administrar un anticuerpo purificado, la administración oral es el método preferido y se consigue preferiblemente a través de formas de dosificación sólidas, que incluyen cápsulas, tabletas, pastillas, polvos y gránulos, entre otros, o por formas de dosificación líquida. Las preparaciones del anticuerpo antisustancia P para la administración parenteral preferentemente incluye soluciones acuosas o no acuosas estériles, suspensiones o emulsiones.

La dosificación del ingrediente activo podrá ser seleccionada dependiendo del efecto terapéutico deseado, la vía de administración y la duración del tratamiento. La dosis de administración y la frecuencia dependerán del tamaño, edad y condiciones de salud generales del individuo, teniendo en cuenta la posibilidad de efectos secundarios. La administración también dependerá del tratamiento simultáneo con otros fármacos y la tolerancia de cada individuo al fármaco administrado. Aquellos expertos en la materia podrán establecer la dosis apropiada usando procedimientos estándares. Se entiende que la dosis deberá ser la cantidad efectiva de anticuerpo en el sentido de que el tratamiento tenga como mínimo el mismo o mejor efecto que las terapias actuales en estos pacientes.

La composición deberá comprender el anticuerpo como único agente contra el cáncer, combinaciones de esos agentes, o combinaciones con otros agentes terapéuticos dependiendo de la condición.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos aquí usados tienen el mismo significado a los comúnmente entendidos por una persona experta en el campo de la invención. Métodos y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos pueden ser usados en la práctica de la presente invención. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1 muestra los resultados de la regulación de la expresión de proteínas del ciclo celular por el tratamiento con el anticuerpo anti-sustancia P. FIG. 1A: Para el estudio de los efectos de SP y su inhibición en la expresión de proteínas del ciclo celular, las células se trataron con SP 100 nM o con anticuerpo anti-sustancia P a una dilución 1/100 durante 48 horas. El diferente patrón de expresión de proteínas se determinó por Western blot. C (control), SP, aSP (anticuerpo anti-sustancia P). FIG. 1B: Para los estudios tiempo-dependientes las células se trataron con la misma concentración de anticuerpo durante los tiempos indicados. FIG. 1C: El ratio entre p27/ciclina D1 (eje y) se determinó como un indicador del estado proliferativo de las células.

La FIG. 2 muestra los resultados de la distribución del ciclo celular de células de cáncer de mama bajo en tratamiento con anticuerpo. En la FIG. 2A, el análisis del ciclo celular se realizó en subconfluencia y en la FIG. 2B en células confluentes después del tratamiento con anticuerpo a los tiempos indicados. En la FIG. 2C, la proliferación (en %, eje y) de las BCCs bajo el tratamiento con anticuerpo (a diferentes tiempos, en horas, eje x) se determinó por el método MTS. El tratamiento con anticuerpo se muestra en barras rayadas y los controles en barras blancas. Como se muestra, la inhibición de la SP con el anticuerpo causa una disminución significativa de la tasa de proliferación de las células tumorales comparada con las células control. Los resultados son las medias ± S.E.M. para 6 muestras por grupo. Significación estadística de las diferencias (Test t de Student): *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.

La FIG. 3 muestra los resultados de la inducción de apoptosis por anticuerpo anti-sustancia P. Diferentes líneas celulares se trataron a diferentes tiempos con anticuerpo anti-sustancia P a una dilución 1/100. Como control positivo de inducción de apoptosis las células se trataron durante 24 horas con TNFa 100 !M. La tinción con DAPI mostró una disminución en el tamaño del núcleo así como otras características apoptóticas como la vacuolización nuclear y la pérdida de la integridad de la membrana.

La FIG. 4 muestra los resultados de la tinción con annexina V/IP para determinar la inducción de apoptosis. Se muestra cuántas veces se induce apoptosis vs. células no tratadas (eje y). Las barras con líneas indican tratamiento con anticuerpo a una dilución 1/250, y la barra gris indica tratamiento con anticuerpo a una dilución 1/100.

La FIG. 5 muestra cómo la SP induce la transactivación de HER2 en líneas celulares de cáncer de mama. En la FIG. 5A, para analizar los efectos de la SP en la activación de HER2 diferentes líneas celulares de cáncer de mama fueron tratadas con SP 100 nM durante los tiempos indicados (en min). Aquí sólo se muestran los resultados para las células MDA-MB-453 y MDA-MB-231 pero se observaron puntos de activación similares para las líneas celulares SKBR3, BT474 y MDA-MB-468. El eje y está en unidades arbitrarias. En la FIG. 5B, para el estudio dosis-respuesta la línea celular MDA-MB-453 se trató a diferentes tiempos (minutos, eje x) con SP 100, 200 o 500 nM, y luego se determinó la activación de HER2. Los resultados se expresan como el porcentaje del control (eje y), y cada experimento se realizó por duplicado.

La FIG. 6 muestra los resultados de la inhibición de la fosforilación de HER2 con anticuerpos anti-sustancia P. En la FIG. 6A las células fueron tratadas con SP 500 nM o con anticuerpo anti-sustancia P a una dilución 1/100 durante 48 horas, y se determinaron los niveles de expresión de diferentes proteínas por Western blot. C significa control. Aunque no se muestra, para asegurar que se realizó una carga correcta de proteína la expresión de la tubulina se usó como control interno. En la FIG. 6B para los estudios tiempo-dependientes, las líneas celulares SKBR3 y BT474 se trataron con anticuerpo anti-sustancia P durante 24, 48 y 72 horas y las proteínas se analizaron por Western blot. En la FIG. 6C para los estudios dosis-respuesta, se trataron SKBR3 con anticuerpo anti-sustancia P durante 24, 48 y 72 horas a una dilución 1/500 o 1/1000. Se observó un patrón de inhibición de HER2 similar. La FIG. 6D muestra un estudio dosis-respuesta en BT474 realizado con diferentes diluciones de anticuerpo durante 48 horas, y se observa una inhibición de HER2 y de Erk dosis-dependiente.

La FIG. 7 muestra cómo el anticuerpo anti-sustancia P regula en la línea celular MDA-MB-453 la expresión de genes c-erbB. La expresión de mRNA para HER2, EGFR y HER3 se analizó por PCR a tiempo real. Los resultados se expresan como 2-"Ct lo que indica las veces que se induce/disminuye la expresión génica. Las barras blancas indican tratamiento control y las negras tratamiento con anticuerpo 1/100. Los resultados son los valores de la media ±

S.E.M. para 3 muestras por grupo. Significación estadística de las diferencias (Test t de Student): *p<0.05, **p<0.01.

La FIG. 8 muestra los resultados de la transactivación de EGFR por SP en células MDA-MB-468. FIG. 8A: para analizar los efectos de la SP en la activación de EGFR la línea celular MDA-MB-468 se trató con SP 100 nM durante los tiempos indicados (en min). Los niveles de fosfo-EGFR y fosfo-Erk se determinaron por Western blot. FIG. 8B: Los efectos de la inhibición de la SP en la activación de EGFR se determinaron de la misma manera que para HER2. C significa control.

La FIG. 9 muestra los efectos de antagonistas de NK1 en la proliferación celular. Para analizar si el antagonismo de NK1 disminuye la proliferación celular de forma similar al uso de anticuerpos anti-sustancia P, se trataron las células con un agonista (sustancia P) o un antagonista (spantide) de NK1 durante 72 horas (FIG. 9A) o cada 24 horas durante tres días (FIG. 9B). La proliferación se determinó por ensayo MTS. En la FIG. 9C las células se trataron con PBS (control), antagonist D (SEQ ID NO: 4), SP, el fragmento 1-4 de la SP (SEQ ID NO: 3) (agonista) y spantide (SEQ ID NO: 5), durante 72 horas y la tasa de proliferación se midió por el método de MTS. C significa control.

La FIG. 10 muestra los efectos del anticuerpo anti-sustancia P en líneas celulares de colon y próstata. La línea celular de cáncer de colon HT29 y las líneas celulares de cáncer de próstata PC3 y DU145 expresan receptores NK1, tal y como se determinó por PCR a tiempo real (FIG. 10A). Los resultados se expresan como 2-"Ct y esto indica el grado de inducción/disminución de la expresión génica. El tratamiento de estas líneas celulares con el anticuerpo anti-sustancia P a diluciones 1/500 y 1/250 inhibió los niveles fosforilados de Her2, EGFR y Erk dependiendo de la línea celular (FIG. 10B). De nuevo, el tratamiento de estas células también indujo muerte celular e incrementó la población positiva para tinción Annexin V/IP (eje de las y) (FIG. 10C). C significa control.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE REALIZACIONES PARTICULARES

Líneas celulares

Las siguientes líneas celulares se obtuvieron de la American Type Culture Collection y se cultivaron de acuerdo a sus instrucciones: MDA-MB-453, carcinoma metastático de efusión pericárdica; BT474, carcinoma ductal; SKBR3, adenocarcinoma de efusión pleural; MDA-MB-231, adenocarcinoma de efusión pleural; MCF7, adenocarcinoma de efusión pleural; MDA-MB-468, adenocarcinoma; MCF10A, células epiteliales de mama normales; HT29, adenocarcinoma de colon; PC3, metástasis de médula a partir de carcinoma de próstata y, Du145, metástasis de cerebro a partir de carcinoma de próstata. Todas las células se privaron de suero durante la noche anterior a la realización de los experimentos si no se indica lo contrario. Para algunos experimentos de proliferación, las células estaban en medio completo más suero fetal, tal y como se especifica.

Anticuerpos y reactivos

Los anticuerpos se compraron de diferentes fuentes: los anticuerpos fosfo-EGFR, EGFR, fosfo-p42/44 MAPK, p42/44 MAPK, fosfo-Akt y Akt eran de Cell Signalling; los anticuerpos fosfo-HER2 y HER2 eran de Upstate y BioGenex, respectivamente; los anticuerpos para ciclina D1, ciclina E, Cdk 2, Cdk 4, p21 eran de Santa Cruz, y al anticuerpo anti-tubulina de Sigma. Los reactivos utilizados para los cultivos celulares eran rhEGF de PreProtech e insulina de SIGMA. La sustancia P (SEQ ID NO: 1), el antagonista D ([D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-sustancia P, SEQ ID NO: 4), el antagonista de NK1 spantide (spantide I, [D-Arg1, D-Trp7,9, Leu11]-sustancia P, SEQ ID NO: 5) y el fragmento 1-4 de la sustancia P (Arg-Pro-Lys-Pro) fueron todos de Sigma. Todos los reactivos generales se obtubieron de Sigma, Bio-Rad y Amersham. El anticuerpo policlonal de ratón contra la sustancia P usado en los experimentos se obtuvo de Biogenesis. En algunos experimentos se usó otro anticuerpo policlonal de Biogenex.

Estudios tiempo-dependientes

Para el análisis del tratamiento con sustancia P sobre la activación de HER2 y EGFR, las células se sembraron en placas y crecieron hasta alcanzar una confluencia del 80%. Después de 24 horas de privación de suero fetal, las células se trataron a los tiempos indicados con SP 100 nM. Las células se lavaron dos veces con PBS frío y fueron rápidamente congeladas en un congelador de -80 ºC hasta la extracción de proteínas. Para los estudios de inhibición de la sustancia P, las células se sembraron como se ha descrito antes. Se añadió a las células anticuerpo antisustancia P a una dilución 1/100 a los tiempos indicados. Después del tratamiento, las células no despegadas de la placa se lavaron con PBS dos veces y se guardaron a -80 ºC, y las células que se habían despegado se centrifugaron a 1500 rpm 5 min y los precipitados se congelaron rápidamente para hacer extracción de proteína.

Ensayo de citotoxicidad

La proliferación celular se estudió en cultivos celulares subconfluentes que habían sido incubados durante 72 horas con anticuerpo anti-sustancia P o con diluciones seriadas de agonista y antagonista de NK1. Brevemente, las células se sembraron en placas de 96 pozos a una densidad de 10000 células/pozo y se dejaron adherir a la placa toda la noche. Después del tratamiento, se monitorizó la viabilidad diariamente bajo el microscopio y la proliferación celular se determinó con el compuesto de tetrazolium (MTS, Promega) con el “CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit”, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para obtener el color se añadieron 20 !l de MTS a cada pozo y luego se leyó la placa en un espectrofotómetro de placas (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) a 490 nm (longitud de onda del ensayo) y 690 nm (longitud de onda de referencia). Las diferentes dosis se ensayaron por sextuplicado y cada experimento se realizó por triplicado.

Análisis de Western Blot

Para la extracción de proteína, se lisaron las células en tampón de ensayo de immunoprecipitación frío (Tris-HCl 50 mM, pH 7.4; NP-40 1%; deoxicolato sódico, 0.25%, NaCl 150 mM; EDTA 1 mM; PMSF 1 mM; inhibidores de proteinasa; Na3VO4 1 mM y NaF 1 mM) y se sonicaron durante 10 segundos. Después de la centrifugación (13000 g 5 min) se cuantificaron los sobrenadantes para determinar el contenido de proteína. La misma cantidad de proteína para cada muestra se separó en un SDS-PAGE y se transfirió electroforéticamente a membranas de difluoruro de polivinilideno (BioRad Laboratories, Hercules, CA). Las membranas se incubaron toda la noche con el correspondiente anticuerpo primario y luego una hora con el anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa (Amersham, Bucks, USA). Para confirmar que se había cargado la misma cantidad de proteína, las membranas se incubaron con el anticuerpo monoclonal de ratón anti 1-tubulina (Sigma). La quimioluminiscencia de las bandas se detectó después del tratamiento de las membranas con ECL (Amersham, Piscataway, NJ) y el subsiguiente análisis con el sistema de imagen Fujifilm LAS3000. Las diferentes intensidades de las bandas se cuantificaron con el software Image Gauge, y el correcto Mr se comparó con los estándares de proteínas preteñidas (BioRad).

Determinación de la apoptosis

Tinción de DAPI: La morfología apoptótica se valoró por microscopía de fluorescencia después de hacer una tinción con DAPI (Roche). Se crecieron las células en cubreobjetos y se trataron a los tiempos indicados con anticuerpo anti-sustancia P a una dilución 1/100. Después del tratamiento, los cubreobjetos se fijaron en etanol frío al 95% y se lavaron con PBS, se tiñeron con DAPI y se montaron en portaobjetos. Las imágenes se obtuvieron en un microscopio invertido de epifluorescencia (Leica). Las células apoptóticas se identificaron por características típicas de apoptosis (p.e. condensación nuclear, vacuolización nuclear, pérdida de la integridad de la membrana nuclear y formación de cuerpos apoptóticos).

Tinción con Annexin V/IP: Para el análisis de la inducción de apoptosis, se sembraron las células en placas de cultivo de 6 pozos y se dejaron por la noche para que se adhiriesen. Seguidamente se trataron con un medio que contenía anticuerpo anti-sustancia P por otras 72 horas. La apoptósis se determinó con el kit Annexin-V-FLUOS Staining Kit (Roche), según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células obtenidas se bloquearon durante 30 minutos con albúmina al 1% y luego se incubaron durante 15 min 15 min con Annexin V-FITC e ioduro de propidio (IP). Los controles (sólo tampón de unión, sólo ioduro de propidio, y sólo annexin-V) se usaron para compensar correctamente los detectores y los cuadrantes en el citómetro de flujo FACSCalibur. De cada muestra se analizaron 20.000 células gracias al software CellQuest.

RT-PCR cuantitativa a tiempo real

El RNA total se aisló por el método de tiocianato de guanidina (Ultraspec RNA, Biotecx Laboratories, Houston, TX), y 1 !g de RNA se sometió a trascripción reversa en un volumen final de 100 !l con el “High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)” según las instrucciones del fabricante. El análisis de PCR cuantitativa se

realizó en el sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Para la determinación de la expresión génica se usó el “Assay-on-demand” (Applied Biosystems), que consiste en una sonda TaqMan MGB marcada con 6-FAM y los correspondientes cebadores no marcados. La mezcla de reacción de PCR consistió en 5 !M de cada cebador, 10 !l de mezcla madre (TaqMan Universal PCR Master Mix, Applied Biosystems) y 2 !l de cDNA. Los niveles de transcrito se normalizaron con los de la beta-actina (Hs99999903_m1) que se usó como control endógeno. Los niveles de HER2, EGFR y HER3 analizados por triplicado se calcularon con

el método ΔCtd.

Para determinar la expresión de los receptores NK1FL y NK1Tr se realizó una PCR cuantitativa en el iQ5 Real-Time PCR Detection System de BioRad. Los cebadores utilizados fueron el directo: 5’ CTACATACACAGTGGCCAAG 3’ (SEQ ID NO: 6); y el inverso: 5’ AATCAGTCTACTCCGGGCTC 3’ (SEQ ID NO: 7) para NK1-Tr y el directo: 5’ CTTCAAGCATGCCTTCCGG 3’ (SEQ ID NO: 8); y el inverso: 5’ CTTGGGGCCGTCCTCTGG 3’ (SEQ ID NO: 9)

para NK1-FL. La temperatura de annealing fue de 60 ºC y la reacción duró 45 ciclos. Los niveles de transcrito fueron normalizados con los de beta-actina.

Distribución del ciclo celular por citometría de flujo

Para la distribución del ciclo celular, las células se sembraron en placas de 6 cm y se trataron con anticuerpo antisustancia P a los tiempos indicados. Luego, las células se tripsinizaron, se incubaron 1 hora con RNAsa y se tiñeron con ioduro de propidio a temperatura ambiente. El ciclo celular se analizó con el citómetro FACSCalibur (Becton-Dickinson) y los resultados se procesaron con el software CellQuest (Becton-Dickinson).

El tratamiento con el anticuerpo anti-sustancia P induce una disminución de las proteínas que controlan la progresión del ciclo celular y altera la distribución del ciclo celular.

Aunque la sustancia P no indujo en todos los casos un aumento de la expresión de las proteínas del ciclo celular, en todos los casos el tratamiento con el anticuerpo inhibió potentemente la expresión de estas proteínas. Estos efectos fueron más pronunciados en el caso de la ciclina D1, cdk4, cdk2, p21 y p27 (FIG. 1A). Como consecuencia, se observó un arresto del ciclo celular en la fase G1 (FIG. 2A), que causaba apoptosis en células confluentes (FIG. 2B) como se observó por el aumento de la fracción sub-G0. En este caso, las células transformadas no tumorales MCF10A no mostraron ningún cambio en ninguna de las fases del ciclo ni aumento en la fracción sub-G0 que se correlaciona con apoptosis.

Se ha propuesto que el ratio entre p27, un inhibidor de cdk2 y cdk4, y ciclina D1 pero no sus niveles totales, se pueden usar como indicador del estado de proliferación. Como se puede observar en la figura FIG. 1C, el tratamiento con la sustancia P causó una disminución del ratio p27/ciclina D1, mientras que su inhibición con el anticuerpo lo aumentaba, indicando una tasa de proliferación menor. De hecho, la proliferación de las células tratadas con el anticuerpo disminuye de forma dosis-dependiente, como se pudo medir con el ensayo MTS (FIG. 2C).

El tratamiento con el anticuerpo anti-sustancia P induce muerte celular tumoral

Con el objetivo de analizar si se producía muerte celular como resultado de la inhibición de la sustancia P, se realizó una tinción nuclear con DAPI para analizar la condensación nuclear y la vacuolización, lo que indica inducción de apoptosis. Las células se trataron con anticuerpo anti-sustancia P a una dilución 1/100 y la morfología nuclear se analizó cada 24 horas durante 96 horas. En todas las líneas tumorales analizadas se observó condensación nuclear y vacuolización así como pérdida de la integridad de la membrana nuclear a las 24 horas, efectos que incrementaron de forma tiempo-dependiente (FIG. 2). La inducción de apoptosis se observó en células con baja expresión de HER2 (MDA-MB-231 y MCF7) y en células con sobreexpresión de HER2 (MDA-MB-453), lo que sugiere que la inducción de muerte celular por inhibición de la sustancia P es independiente del estatus de HER2, pero dependiente del fenotipo tumoral ya que las células epiteliales MCF10A no se vieron afectadas por el tratamiento (FIG. 3).

Se analizaron los sobrenadantes para confirmar si las células se habían despegado de la placa de Petri por inducción de otras vías además de apoptosis. La tinción de DAPI de los precipitados obtenidos del medio de las células tratadas con el anticuerpo mostraron morfología apoptótica y detritus celulares, lo que indica que el anticuerpo no tiene efecto en la capacidad de adhesión celular sino que induce muerte celular.

Para demostrar mejor que estos efectos eran causados por inducción de apoptosis, las células tratadas con el anticuerpo anti-sustancia P se tiñeron para detectar la exposición de fosfatidilserina con annexina V. La tinción con IP también se usó para discriminar entre necrosis y apoptosis. El tratamiento con el anticuerpo a las dosis de 1/100 y 1/250 indujeron un aumento significativo en el porcentaje de células positivas para la tinción annexina V/IP, confirmando que la inducción de muerte celular por la inhibición de la sustancia P era un proceso apoptótico (FIG. 4).

El tratamiento con el anticuerpo anti-sustancia P inhibe fuertemente la actividad de HER2 y su expresión

El tratamiento de las BBCs con el anticuerpo anti-sustancia P a una dilución 1/100 inhibió la fosforilación basal de HER2 así como sus niveles totales en tres líneas diferentes que sobreexpresan HER2 (FIG. 6A). Además, la forma fosforilada y total de p42/44 MAPK (Erk 1/2) también fue inhibida en algunos casos, como consecuencia de la inhibición de la transducción de señal de HER2 (FIG. 6A). Por otro lado, el tratamiento con el anticuerpo, causó el despegado de las células de la placa de Petri, señal de pérdida de fenotipo tumoral. De estos resultados, se sugiere que el anticuerpo anti-sustancia P puede ser usado como aproximación terapéutica para inhibir HER2 y así, disminuir la proliferación y la tasa de supervivencia de las células tumorales.

Para determinar si los efectos del anticuerpo eran dosis y tiempo dependientes, las células SKBR3 y BT474 se trataron durante 24, 48 y 72 horas con anticuerpo anti-sustancia P a una dilución de 1/100, 1/500 y 1/1000. Como se puede observar en la figura FIG. 6B, la fosforilación de HER2 disminuyó a las 24 horas sin poderse detectar su forma fosforilada a las 72 horas de tratamiento. Respecto a las diferentes dosis del anticuerpo se observaron efectos similares (FIG. 6C), aunque el despegado de las placas de cultivo se encontró en la dilución 1/1000 de 48 a 72 horas.

Para demostrar mejor que los efectos observados eran producidos por una inhibición específica de la sustancia P, se usó otro anticuerpo contra la sustancia P de Biogenex. En este caso también se observó una inhibición dosis dependiente de fosfor-HER2 en células BT474 (FIG. 6D).

También se analizaron los efectos del tratamiento con el anticuerpo en el contenido de mRNA de otros miembros de la familia c-erbB. Como se muestra en la FIG. 7, el anticuerpo anti-sustancia P induce una disminución significativa en la expresión de EGFR y HER3, lo que sugiere que los efectos del anticuerpo también afectan a la expresión génica de los miembros de la familia c-erbB.

El tratamiento con el anticuerpo anti-sustancia P también induce una disminución de fosfo-EGFR

Para comprobar si la sustancia P también inducía la activación de EGFR, se trataron las células MDA-MB-468 a los tiempos indicados con SP 100 nM. Se observó la activación de EGFR a los dos minutos, con un segundo pico de activación al minuto 6 (FIG. 8A). De forma interesante, igual que se observó para HER2, el tratamiento con el anticuerpo anti-sustancia P también inhibía los niveles basales de fosfo-EGFR (FIG. 8B).

Efectos de antagonistas o agonistas de NK1 en la proliferación celular

Con el objetivo de estudiar si antagonistas de NK1 podrían tener los mismos efectos que la inhibición de la sustancia P en la proliferación celular, se determinó si la tasa de proliferación de BCCs se alteraba con el uso de un agonista y un antagonista NK1: el fragmento 1-4 de la sustancia P y spantide Como se puede observar en la FIG. 9, la tasa de proliferación de las BCCs medida con el ensayo MTS, no se vio alterada por el uso de antagonistas de NK1 ni por la adición de sustancia P a dosis en el rango de 0.1 a 1000 nM. Estos resultados sugieren que a las dosis testadas: 1) la adición de sustancia P no siempre afecta a la proliferación celular, lo que sugiere que la vía de la sustancia P-NK1 puede funcionar como un sistema saturado y, 2) la inhibición de NK1 por antagonistas no es una aproximación correcta para analizar sus efectos en estudios de proliferación celular a tiempos cortos. De hecho, estudios previos dónde NK1 se inhibía con el uso de antagonistas eran ensayos clonogénicos en los cuales se necesitan dos semanas de crecimiento para obtener resultados (cf. G. Rao et al., Cancer Res 2004, supra).

Efectos del anticuerpo anti-sustancia P en líneas celulares de colon y próstata

Para determinar si el tratamiento con anticuerpo podía inducir muerte celular en células de cáncer de otro orígen, se determinó si células de cáncer de colon y próstata expresaban receptores NK1. Las células HT29 (cáncer de colon) y PC3 y Du145 (cáncer de próstata) expresan receptores NK1 (isoformas de longitud completa y truncadas) (FIG. 10A), sugiriendo que de manera similar a las BCCs, la sustancia P tiene efectos biológicos en estas líneas celulares. De hecho, la inhibición de la sustancia P por el anticuerpo anti-sustancia P disminuyó los niveles fosforilados de Her2, EGFR y Erk1/2 dependiendo de la línea celular (FIG. 10B). De manera similar a los resultados observados con BCCs, el anticuerpo anti-sustancia P también indujo muerte celular en las líneas celulares de cáncer HT29, PC3 y Du145, como se determinó por tinción con Annexin V/IP (FIG. 10C). La inducción de apoptosis en estas líneas celulares fue dosis-dependiente puesto que cantidades crecientes de anticuerpo anti-sustancia P incrementaban la muerte celular.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Universidad de Barcelona Hospital Clínic i Provincial de Barcelona Fundació Clínic per a la Recerca Biomèdica

<120> Anticuerpos para el tratamiento del cáncer

<130> WO AVCRI028

<150> ES200801071

<151> 2008-04-09

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> fragmento 5-11 de la secuencia de aminoácidos de la sustancia P

<400> 2

<210> 3

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> fragmento 1-4 de la secuencia aminoacídica de la sustancia P

<400> 3 <210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> D antagonista

<220>

<221> D-aminoácido

<222> (1)..(1)

<223> D-Arg

<220>

<221> D-aminoácido

<222> (5)..(5)

<223> D-Phe

<220>

<221> D-aminoácido

<222> (7)..(7)

<223> D-Trp

<220>

<221> D-aminoácido

<222> (9)..(9)

<223> D-Trp

<220>

<221> D-aminoácido

<222> (11)..(11)

<223> D-Leu

<400> 4

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> spantide I

<220>

<221> D-aminoácido

<222> (1)..(1)

<223> D-Arg

<220>

<221> D-aminoácido

<222> (7)..(7)

<223> D-Trp

<220>

<221> D-aminoácido

<222> (9)..(9)

<223> D-Trp <220>

<221> D-aminoácido

<222> (11)..(11)

<223> D-Leu

<400> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cebador directo

<400> 6

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cebador inverso

<400> 7

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cebador directo

<400> 8

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cebador inverso

<400> 9

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Anticuerpo específico contra la sustancia P para uso en un método de tratamiento terapéutico de un cáncer que expresa el receptor NK1 y/o un miembro de la familia de receptores ErbB, por administración directa a un mamífero, incluyendo un humano.

2. 2.

   Anticuerpo según la reivindicación 1 para uso según la reivindicación 1, donde el cáncer expresa el receptor NK1 y/o el receptor HER1.

3. 3.

   Anticuerpo según la reivindicación 1 para uso según la reivindicación 1, donde el cáncer expresa el receptor NK1 y/o el receptor HER2/neu.

4. 4.

   Anticuerpo según la reivindicación 3 para uso según la reivindicación 3, donde el cáncer expresa el receptor NK1 y el receptor HER2/neu.

5. 5.

   Anticuerpo según la reivindicación 1 para uso según la reivindicación 1, donde el cáncer expresa el receptor NK1 y/o el receptor HER3.

6. 6.

   Anticuerpo según la reivindicación 1 para uso según la reivindicación 1, donde el cáncer expresa el receptor NK1 y/o el receptor HER4.

7. 7.

   Anticuerpo según la reivindicación 1 para uso según la reivindicación 1, donde el cáncer expresa el receptor NK1, el receptor HER1 y el receptor HER2/neu.

8. 8.

   Anticuerpo según la reivindicación 1 para uso según la reivindicación 1, donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en astrocitoma, glioma, neuroblastoma, cáncer pancreático, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de tiroides, adenoma de la pituitaria, cáncer de próstata, cáncer de colon y cáncer de mama.

9. 9.

   Anticuerpo según la reivindicación 8 para uso según la reivindicación 8, donde el cáncer es cáncer de mama.

10. 10.

    Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para uso según las reivindicaciones 1-9, donde el anticuerpo reconoce la secuencia aminoacídica SEQ ID NO:2.

    REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

    Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden 5 excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

    Documentos de patentes citados en la descripción

    Literatura diferente de patentes citadas en la descripción