ES2542152T3

ES2542152T3 - Método de tratamiento que emplea anticuerpos de EGFR e inhibidores de Src y formulaciones relacionadas

Info

Publication number: ES2542152T3
Application number: ES08726810.8T
Authority: ES
Inventors: Webster Cavenee; Frank Furnari; Terrance Grant Johns; Andrew Scott
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Current assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Priority date: 2007-03-15
Filing date: 2008-03-14
Publication date: 2015-07-31
Anticipated expiration: 2028-03-14
Also published as: MX2009009782A; AU2014203395B2; AU2008227123A1; US20100092475A1; AU2017208285A1; EP2134854A1; US9023356B2; CN101688229B; WO2008115404A8; JP5898722B2; CA2680854C; AU2014203395A1; CN101688229A; JP2010521468A; JP5618549B2; EP2134854B1; CA2680854A1; AU2008227123B2; JP2014205676A; HK1139437A1

Abstract

Un anticuerpo anti-EGFR para uso en un método de tratamiento del cáncer mediado por EGFR en un mamífero, en donde dicho método comprende administrar a dicho mamífero, dicho anticuerpo anti-EGFR y un inhibidor de src, en donde dicho inhibidor de src y dicho anticuerpo anti-EGFR se administran simultáneamente, en combinación o uno después de otro en serie, y en donde dicho anticuerpo anti-EGFR es mAb806 o un fragmento del mismo que se une a antígeno, y en donde dicho inhibidor de src es dasatinib.

Description

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agente de ablación química, una toxina, un inmunomodulador, una citocina, un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico o un fármaco.

La radioinmunoterapia (RAIT) se ha incorporado en la fase clínica y ha demostrado eficacia utilizando diversos inmunoconjugados de anticuerpos. El anticuerpo anti-antígeno carcinoembrionario (anti-CEA) humanizado marcado con 131I, hMN-14, ha sido evaluado en el cáncer colorrectal (Behr TM et al., (2002) Cancer 94 (4Supl): 1373-1381) y el mismo anticuerpo marcado con 90Y ha sido evaluado en el carcinoma medular de tiroides (Stein R et al., (2002) Cancer 94(1):51-61). La radioinmunoterapia que emplea anticuerpos monoclonales también ha sido evaluada y descrita para el linfoma no Hodgkin y el cáncer de páncreas (Goldenberg DM (2001) Crit Rev Oncol Hematol 39(12): 195-201; Gold DV et al., (2001) Crit Rev Oncol Hematol 39 (1-2) 147-54). Métodos de radioinmunoterapia con anticuerpos particulares se describen también en el documento de patente de EE.UU. 6.306.393 y 6.331.175. Cirugía radioinmunoguiada que emplea anticuerpos anti-CEA y anticuerpos dirigidos contra antígenos asociados a tumores (Kim JC et al., (2002) Int J Cancer 97(4):542-7; Schneebaum S et al., (2001) World J Surg 25(12):1495-8; Avital S et al., (2000) Cancer 89(8):1692-8; Mclntosh DG et al., (1997) Cancer Biother Radiopharm 12(4):287-94).

Los anticuerpos de la presente invención se pueden administrar a un paciente que requiere un tratamiento a través de cualquier vía adecuada, generalmente mediante inyección en el torrente sanguíneo o CSF, o directamente en el sitio del tumor. La dosis precisa dependerá de una variedad de factores, incluyendo si el anticuerpo es para diagnóstico o para tratamiento, el tamaño y la ubicación del tumor, la naturaleza precisa del anticuerpo (ya sea anticuerpo completo, fragmento, diacuerpo, etc.), y la naturaleza del marcador detectable o funcional fijado al anticuerpo. Cuando se usa un radionúclido para la terapia, una dosis única máxima adecuada es de aproximadamente 45 mCi/m2, hasta un máximo de aproximadamente 250 mCi/m2. Las dosificaciones preferibles están en el intervalo de 15 a 40 mCi, con un mayor intervalo de dosificación preferido de 20 a 30 mCi, o de 10 a 30 mCi. Una terapia de este tipo puede requerir un reemplazo de médula ósea o de células madre. Una dosis de anticuerpo típica, ya sea para la formación de imágenes de tumores o el tratamiento de tumores, estará en el intervalo de 0,5 a 40 mg, preferiblemente desde 1 a 4 mg de anticuerpo en forma de F(ab')2. Los anticuerpos sin modificar se administran preferiblemente en dosis de 20 a 1000 mg de proteína por dosis, o de 20 a 500 mg de proteína por dosis, o de 20 a 100 mg de proteína por dosis. Esta es una dosis para un solo tratamiento de un paciente adulto, que se puede ajustar proporcionalmente a niños y bebés, y también ajustar a otros formatos de anticuerpo en proporción con el peso molecular. Los tratamientos se pueden repetir a diario, dos veces por semana, a intervalos semanales o mensuales, a discreción del médico. La dosificación y la administración del inhibidor o inhibidores de src pueden estar determinadas y las puede variar por un médico u otra persona experta en la técnica.

La invención se puede entender mejor haciendo referencia a los siguientes Ejemplos, que se proporcionan como ejemplares de la invención. Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de ilustrar más completamente las realizaciones preferidas de la invención.

Ejemplo 1

La eficacia de los anticuerpos específicos de EGFR se ve reforzada después de la inactivación o inhibición de src

Los factores que afectan a la eficacia de los anticuerpos monoclonales terapéuticos (mAbs) dirigidos al EGFR siguen siendo relativamente desconocidos, especialmente en el glioma. Se examinó la eficacia de dos mAbs específicos de EGFR (mAb 806 y 528) frente a xenoinjertos de glioma obtenidos a partir de U87MG que expresaban variantes de EGFR. Usando esta metodología se permitía el cambio de la forma de EGFR a la vez que se mantenía el fondo genético constante. Estas variantes incluían el EGFR de2-7 (o EGFRvIII), una mutación constitutivamente activa del EGFR expresada en glioma.

La eficacia de los mAbs se correlacionaba con el número de EGFRs, sin embargo, el factor más importante era la activación del receptor. Mientras que los xenoinjertos U87MG que expresaban el EGFR de2-7 respondían a la terapia, los que mostraban una falta de actividad cinasa de EGFR de2-7 eran refractarios. Un EGFR de2-7 modificado que era activo para cinasa pero que carecía de autofosforilación, también respondió, lo que sugiere que estos mAbs actúan en xenoinjertos que expresan EGFR de2-7 bloqueando la transfosforilación. Puesto que los xenoinjertos U87MG que expresaban EGFR de2-7, coexpresaban EGFR wt, la eficacia de los anticuerpos monoclonales también se sometió a ensayo frente a xenoinjertos NR6 que expresaban el EGFR de2-7 de forma aislada. Si bien mAb 806 mostraba una actividad antitumoral frente a xenoinjertos NR6, la terapia con mAb 528 era ineficaz, lo que sugiere que mAb 528 aplica su actividad antitumoral mediante la alteración de las interacciones entre EGFR de2-7 y wt.

Por último, la alteración genética de Src en xenoinjertos U87MG que expresaban el EGFR de2-7, mejoraba enormemente la eficacia de mAb 806. El uso eficaz de anticuerpos específicos de EGFR en glioma dependerá de la identificación de tumores con EGFR activado. La combinación de EGFR e inhibidores de Src proporciona una estrategia nueva y eficaz para el tratamiento del glioma.

Antecedentes

El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) es una glicoproteína transmembranal con actividad intrínseca de tirosina cinasa. La hiperexpresión del EGFR se observa en numerosos tumores epiteliales y está asociada frecuentemente con un pronóstico clínico malo (1-3). La hiperexpresión del EGFR puede ser el resultado de la ampli

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ficación del gen EGFR, particularmente en glioma (4). En el glioma, la amplificación génica está asociada con reordenamientos de EGFR con la mutación más común, EGFR de2-7 (o EGFRvIII), caracterizada por una deleción en marco de 801 pares de bases que abarcan los exones 2 a 7 de la secuencia codificadora (4-6). Este reordenamiento produce como resultado la deleción de 267 aminoácidos del dominio extracelular y la inserción de una nueva glicina

5 en el sitio de fusión, produciendo todos ellos un péptido de unión único. Mientras que EGFR de2-7 es incapaz de unirse a ningún ligando conocido, el receptor muestra un bajo nivel de activación constitutiva y es capaz de mejorar el crecimiento de xenoinjertos de glioma y de cáncer de mama (7, 8).

La inhibición de EGFR es una estrategia racional para el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos contra el cáncer. Agentes terapéuticos potenciales incluyen anticuerpos monoclonales (mAbs) dirigidos al EGFR (por ejemplo, C225, 10 ABX-EGF, EMD 55900) (9-11) e inhibidores de la tirosina cinasa de bajo peso molecular (TKIs) del EGFR (por ejemplo, ZD1839, OSI 774) (12). De hecho, algunos de estos agentes terapéuticos han sido aprobados para uso clínico limitado en el cáncer de pulmón (ZD1839, Iressa) y el cáncer de colon (C225, Erbitux). A partir de estos ensayos clínicos está muy claro que no todos los pacientes positivos para el EGFR responden a estos agentes terapéuticos dirigidos (Tabla 1). Factores determinantes que causan que los pacientes sean susceptibles a los agentes terapéuti

15 cos de EGFR, es un objetivo importante desde un punto de vista del bienestar del paciente y económico. Del mismo modo, la comprensión de la naturaleza de la resistencia a los agentes terapéuticos de EGFR puede ayudar a identificar metodologías para su superación.

TABLA 1

Aspectos celulares asociados con la susceptibilidad a los agentes terapéuticos de EGFR.

Inhibidor de EGFR: Sistema Experimental Observación Comentario Ref(s)

PD153035: Múltiples líneas celulares in vitro Sensibilidad correlacionada con el número de EGFR wt sin datos in vivo (32)

C225: Carcinomas de células renales in vitro Solo las células que contenían el gen VHL eran sensibles sin datos in vivo (33)

EMD55900 y EMD72000: Múltiples líneas celulares in vitro y xenoinjertos Sensibilidad correlacionada con el número de EGFR wt (34)

SU1195 y ZD1839: Múltiples líneas celulares in vitro y xenoinjertos Más dificultad para inhibir la fosforilación de EGFR en presencia de ErbB2 (35)

mAbR3 y C225: Xenoinjertos A431 Xenoinjertos recurrentes después de una regresión completa eran resistentes frecuentemente a una terapia adicional Hiperexpresión de VEGF era una observación común en las líneas celulares resistentes (36)

ZD1839: Xenoinjertos A431 y NR6M (expresan el EGFR de2-7) Xenoinjertos que expresan el EGFR de2-7 eran resistentes NR6M expresa el EGFR de2-7 en ausencia de EGFR wt, clínicamente los dos se coexpresan (37)

AG1478: Líneas celulares de glioma in vitro El glioma resistente expresa EGFR-1, el cual está regulado al alza adicionalmente mediante AG1478. El efecto de EGFR-1 parece mediar a través de PI3K/Akt Observación restringida a una sola línea celular in vitro (38)

CGP59326: Células de cáncer de mama BT474 y de cáncer gástrico MKN7 in vitro Activación de heterodímeros erbB2/3 mediante resistencia generada por heregulina sin datos in vivo (39)

ZD1839: Múltiples líneas celulares in vitro Sensibilidad correlacionada con el número de EGFR wt. MAPK constitutiva sin datos in vivo (40)

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Inhibidor de EGFR: Sistema Experimental Observación Comentario Ref(s)

activa incrementa la resistencia

AG1478: Panel celular grande in vitro Dos requerimientos de la sensibilidad: EGFR wt alto y capacidad de responder a EGF iniciando el ciclo celular sin datos in vivo (41)

ZD1839 y PD153035: Múltiples líneas celulares in vitro Una señalización sostenida a través de Akt o Erk puede causar resistencia sin datos in vivo (42)

ZD 1839: Células de cáncer de mama A431 y MDA468 in vitro Una señalización sostenida a través de Akt causa resistencia. La presencia de PTEN incrementa la eficacia de los agentes terapéuticos de EGFR sin datos in vivo (43)

ZD1839 y C225: A431 y NSCLC múltiple in vitro Sin correlación con el número de EGFR. sin datos in vivo (44)

ZD1839: Pacientes con NSCLC Pacientes con mutaciones activadoras en el dominio de la cinasa de EGFR tienen más probabilidad de responder. Los datos posteriores sugieren que no todos los pacientes con mutaciones responden (28, 45)

ZD1839: Fibroblastos NR6 y células de glioma U87MG Las células que expresan EGFR de2-7 eran resistentes, posiblemente está relacionado con una incapacidad para inhibir completamente la fosforilación de EGFR de2-7. sin datos in vivo (46)

OSI-774: Panel de líneas celulares de glioma Células capaces de incrementar el ARNm de EGFR como respuesta a una terapia son más resistentes. (47)

ZD1839 y OSI-774: Pacientes con NSCLC Una mutación secundaria en la cinasa de EGFR causa resistencia (48)

C225 y ABX: Pacientes con cáncer colorrectal Respuesta correlacionada con un incremento en el número de copias de EGFR Número de muestras bajo (26)

OSI-774 y ZD1839: Pacientes con glioma La coexpresión de EGFRvIII y PTEN está asociada con una capacidad de respuesta (49)

Los mecanismos que causan resistencia/susceptibilidad frente a TKIs dirigidos contra EGFR han sido ampliamente estudiados, mientras que los factores que afectan a la eficacia de los anticuerpos anti-EGFR siguen siendo relativamente desconocidos (véase la Tabla 1). Algunas generalizaciones se pueden extraer de estos estudios con respecto 5 a los TKIs. En primer lugar, la sensibilidad de las líneas celulares frente a la inhibición con TKIs se correlaciona con el aumento de EGFR en la superficie celular (Tabla 1), lo que sugiere que hay un cierto nivel intrínseco de expresión de EGFR requerida para que estos inhibidores funcionen. En segundo lugar, la capacidad para mantener la señalización a través de la ruta PI3-cinasa/Akt después de la inactivación de EGFR, reduce la eficacia de los TKIs (Tabla 1). Una abrumadora mayoría de estos estudios se ha realizado in vitro, por lo que no se sabe si estas observaciones 10 son válidas en el entorno in vivo. Recientemente, se ha analizado en una serie de estudios la situación del gen EGFR en pacientes con cáncer de pulmón tratados con Iressa (ZD1839) y se encontró que los pacientes que respondían al tratamiento tenían frecuentemente un aumento de mutaciones funcionales en el dominio cinasa (Tabla 1). Además, una mutación de cinasa secundaria que conduce a la resistencia frente a Iressa, también ha sido descrita (Tabla 1). Los estudios iniciales sugieren sin embargo que estas observaciones no son generales y que las mutacio

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Ensayos de crecimiento in vitro.

El efecto antiproliferativo de los mAbs 806 y 528 in vitro se examinó como se ha descrito previamente con detalle (18). Brevemente, las células se sembraron a 1 x 104 células por pocillo en placas de 24 pocillos en medios que contenían 0,5% de FCS. Después de 4 días, las células se retiraron con tripsina y se contaron usando un hemocitómetro. Los anticuerpos se utilizaron con una concentración final de 100 µg/ml, una concentración consistente con la obtenida dentro de los xenoinjertos.

Modelos de xenoinjertos.

Las células tumorales (3 x 106) en 100 µl de PBS se inocularon por vía s.c. en ambos flancos de ratones hembra sin pelo de 4 a 6 semanas de edad (Centro de Investigación Animal, Perth, Australia). Todos los estudios se llevaron a cabo usando modelos de tumores establecidos como se ha informado anteriormente (15, 16). El tratamiento se inició una vez que los tumores habían alcanzado un volumen medio de aproximadamente 100 mm3. El volumen del tumor en mm3 se determinó usando la fórmula (longitud x anchura2)/2, en donde la longitud era el eje más largo y siendo la anchura la medición en ángulos rectos frente a la longitud. Los datos se expresan como volumen tumoral medio ± SE para cada grupo de tratamiento. Todos los datos fueron analizados para la significación de la prueba t de Student. Se utilizó un mínimo de 10 xenoinjertos por grupo en cada estudio.

Inmunotransferencia.

Las células se lisaron en tampón de lisis frío (HEPES 30 mM, NaCl 150 mM, NAF 10 mM, 1% de Triton X-100, NaO3V 200 µM, 0,4% de H2O2 y el conjunto 1 de mezcla inhibidora de proteasa (Calbiochem, San Diego, CA) que contenía AEBSF 500 µM, aprotinina 150 nM, inhibidor de proteasa E-64 1 µM, EDTA 0,5 mM y leupeptina 1 µM, pH 7,4). Los lisados se inmunoprecipitaron con el mAb 806 o 528 y el precipitado resultante se analizó mediante inmunotransferencia tal y como se describe en detalle (21).

Microscopía de inmunofluorescencia.

Los mAbs 806 y 528 se marcaron directamente con cianina 3 (Cy3) utilizando el kit de marcado con anticuerpo monoclonal Cy3 (Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd, Buckinghamshire, Inglaterra) según las instrucciones del fabricante. El marcado con éxito del anticuerpo se determinó mediante análisis por citometría de flujo de la unión a células U87MG.Δ2-7. El anticuerpo monoclonal, específico del endosoma temprano, anti-Early Endosome Autoantigen 1 de ratón (EEA1) se adquirió en Transduction Laboratories (San Diego, CA, EE.UU.). El anticuerpo secundario de IgG anti-ratón de burro para el fragmento F(ab')2 AffiniPure conjugado con Cy2 y el anticuerpo sin marcar que bloqueaba IgG de cabra anti-ratón para el fragmento Fab AffiniPure, fueron adquiridos en Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA, EE.UU.). Las células U87MG.Δ2-7 o NR6.Δ2-7 se cultivaron en cubreobjetos de vidrio de 12 mm o cubreobjetos de 12 mm con poli-D-lisina Biocoat Cell Environments (Becton Dickinson labware, Bedford, MA, EE.UU.) en MEM (GibcoBRL Grand Island, NY, EE.UU.) complementados con 10% de FBS, penicilina/estreptomicina y glutamato a 37ºC. La unión de los anticuerpos a las células se llevó a cabo en presencia de 0,25% de albúmina de suero bovino (BSA) (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, EE.UU.). Los mAbs 806 y 528 conjugados con Cy3 se utilizaron a concentraciones de 5 µg/ml y 2 µg/ml respectivamente y el marcado en superficie se realizó a 4ºC durante 20 min en condiciones humidificadas. Las células se lavaron tres veces en 0,25% de albúmina de suero bovino (BSA)/PBS enfriado con hielo. La internalización del anticuerpo unido a la superficie se inició mediante la incubación de cubreobjetos individuales a 37ºC. Después de la internalización durante diversos períodos de tiempo, se retiraron los cubreobjetos individuales de 37ºC, se lavaron tres veces en BSA/PBS enfriado con hielo para detener la internalización y se fijaron en 4% de PFA durante 20 minutos a TA. Los cubreobjetos se lavaron después en BSA/PBS antes del lavado en agua doblemente destilada (DDW) y se montaron en portaobjetos de vidrio con medio de montaje Fluoromount G (Southern Biotechnology, Birmingham, AL, EE.UU.). Las muestras se analizaron con microscopio confocal (Nikon Instech Co., Ltd., Kanagawa, Japón) utilizando una configuración de longitud de onda apropiada. Para los estudios de colocalización, las células se permeabilizaron con 0,1% de Triton X-100 durante 1 min. A continuación, las muestras se lavaron y se incubaron con el fragmento Fab anti-ratón de cabra sin marcar para bloquear todos los sitios de unión a ratón existentes (es decir, el mAb 806 o 528 internalizado) durante 20 min a TA. Las muestras se lavaron a continuación en BSA/PBS antes de la incubación con anti-EEA1 durante 20 min a TA. Las células se lavaron y se incubaron finalmente con el fragmento de anticuerpo secundario F(ab')2 de burro antiratón conjugado con Cy2. Los vectores de ADN para la glicoproteína lisosómica 120 marcada con proteína fluorescente verde (GFP) (lgp-120-GFP) fueron proporcionados amablemente por el catedrático Ira Mellman y el catedrático del Departamento de Biología Celular de la Facultad de Medicina, New Haven, CT, EE.UU. Las células se cultivaron en placas con micropocillos de fondo de vidrio mat-tek que contenían un cubreobjetos de vidrio de 14 mm incluido (MatTek Corp. Ashland, MA, EE.UU.), se transfectaron durante la noche utilizando reactivo LipofectAMINE (Invitrogen® Life Technologies, Mulgrave, Vic, Australia) siguiendo las instrucciones del fabricante. La formación de imágenes confocales de células transfectadas positivamente, que emitían fluorescencia verde cuando se excitaban con luz con una longitud de onda de 488 nm, se llevó a cabo 24 horas después de la transfección.

Resultados

Correlación entre la sensibilidad in vitro e in vivo.

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(Fig. 4). El tratamiento con mAb 528 inhibía significativamente el crecimiento tumoral (p <0,005), teniendo el grupo vehículo un volumen tumoral promedio de 1170 mm3 en comparación con 510 mm3 del grupo del mAb 528, el día 20 después de la inoculación. Dado que la función primaria de mAb 528 se ha presumido que es antagonista del ligando, su actividad antitumoral contra un xenoinjerto que expresa el EGFR de2-7 independiente de ligando, fue inesperada. Por lo tanto, mAb 528 probablemente interrumpe la señalización de EGFR por otros mecanismos, aparte de su capacidad para bloquear el ligando. Del mismo modo, mAb 806, que solo se une al EGFR de2-7 y no al EGFR wt en estas células, debe mediar su actividad antitumoral independientemente de cualquier efecto sobre la interacción del ligando, ya que inhibía el crecimiento de xenoinjertos que expresaban EGFR de2-7 a un nivel similar al de mAb 528. El día 21, cuando el grupo vehículo fue sacrificado, los xenoinjertos control tenían un volumen tumoral medio de 1500 mm3, en comparación con uno significativamente inferior de 390 mm3 en el grupo tratado con el mAb 806 (p <0,0001). Por lo tanto, ambos anticuerpos pueden inhibir xenoinjertos de glioma que expresan una forma independiente del ligando, pero constitutivamente activa del EGFR.

4.: Células que expresan una versión sin actividad cinasa del EGFR de2-7 (U87MG.DK): Células U87MG transfectadas con una versión sin actividad cinasa (DK) del EGFR de2-7 crecieron como xenoinjertos con una tasa similar a la de las células parentales (Fig. 3B) y no fueron inhibidas significativamente por ninguno de los anticuerpos (Fig. 2). Este receptor carece de fosforilación en los sitios principales asociados con la señalización, pero sigue estando fosforilado en sitios asociados con la internalización del receptor y la degradación (Fig. 4). La unión de ambos anticuerpos a estas células es similar a la observada en células que expresan EGFR de2-7 tanto in vitro como in vivo (16). Además, puesto que la variante DK del EGFR de2-7 solo contiene una sola mutación puntual intracelular, la afinidad de mAb 806 y 528, que se unen al dominio extracelular, no debe estar alterada. Este resultado demuestra que cualquier función efectora inmune mediada por estos anticuerpos in vivo es insuficiente para iniciar una respuesta antitumoral. Además, se muestra que la actividad antitumoral de los anticuerpos anti-EGFR requiere un receptor con un dominio cinasa funcional.

5.: Células que expresan una versión del EGFR de2-7 con deleción de 2 sitios importantes para la autofosforilación (U87MG.DY2): xenoinjertos U87MG que expresaban una estructura artificial EGFR de2-7 incapaz de autofosforilarse en dos sitios principales de autofosforilación (la tirosina 1068 y 1173 cambia a fenilalanina) fueron inhibidos significativamente por ambos anticuerpos cuando se cultivaban como xenoinjertos tumorales (p <0,01 y 0,006 para mAb 528 y 806, respectivamente) (Fig. 2). Esta observación, junto con la falta de actividad observada contra los xenoinjertos U87MG.DK, sugiere que la actividad cinasa, en contraposición con la autofosforilación, se correlaciona con la capacidad de respuesta a una terapia con anticuerpos.

6.: Células que expresan una versión del EGFR de2-7 incapaz de autofosforilarse (U87MG.DY5): Células U87MG que expresan una estructura artificial de EGFR de2-7 incapaz de autofosforilarse en los 5 sitios principales de autofosforilación asociados con la señalización (la tirosina 1173, 1148, 1086, 1068 y 992, cambia a fenilalanina) se cultivaron como xenoinjertos tumorales. Este receptor carece de fosforilación en los sitios principales asociados con la señalización, pero sigue estando fosforilado en sitios asociados con la internalización del receptor y la degradación (Fig. 4). De acuerdo con el resultado obtenido con xenoinjertos DY2, ambos anticuerpos inhibían significativamente el crecimiento de xenoinjertos que expresaban la estructura artificial EGFR de2-7 DY5 (p <0,0001 para ambos anticuerpos) (Fig. 2). Dado este resultado algo inesperado, este experimento se repitió con ambos anticuerpos, en una dosis más baja (0,5 frente a 1 mg por inyección), y una vez más se obtuvo una inhibición significativa del crecimiento del tumor en ambos casos (datos no mostrados). Puesto que la forma DY5 del EGFR de2-7 es incapaz de unirse directamente a moléculas adaptadoras, decisivas para la señalización aguas abajo, se sugiere que un dominio de cinasa activa en lugar de la interacción con estas moléculas, es una característica decisiva que conduce a la capacidad de respuesta frente a los anticuerpos específicos de EGFR.

Tratamiento de xenoinjertos U87MG que expresan altos niveles de EGFR de2-7.

Los datos de la Fig. 2 sugieren que cuanto más dependiente se vuelve un xenotrasplante de la señalización de EGFR, es más probable que responda a una terapia con anticuerpos específicos de EGFR. Por lo tanto, utilizando la clasificación FACS se aislaron las células que expresaban niveles muy altos del EGFR de2-7 (U87MG.Δ2-7alto) (Fig. 5A). Los xenoinjertos U87MG.Δ2-7alto crecían más rápido que los xenoinjertos U87MG.Δ2-7 originales (Fig. 5B), lo que sugiere que el rápido crecimiento de estos xenoinjertos depende de los altos niveles del EGFR de2-7. Los niveles de expresión de EGFR de2-7 se conservaron in vivo tal y como se determinó por inmunotransferencia de lisados de xenoinjerto (Fig. 5C). El tratamiento con mAb 806 o mAb 528 causó una inhibición significativa de los xenoinjertos U87MG.Δ2-7alto que era mayor que la observada para cualquier otra de las líneas celulares obtenidas a partir de U87MG (Fig. 5D). El día 18, cuando se sacrificó el grupo control por razones éticas, el volumen tumoral medio era de 1760, 90 y 90 mm3 para el vehículo y los grupos de mAb 806 y mAb 528, respectivamente (p <0,001). De manera significativa, aunque no hubo reversiones completas en ninguno de los estudios anteriores de terapia de U87MG (Fig. 2), 40% de los xenoinjertos de U87MG.Δ2-7alto tratados con mAb 806 y 20% de los tratados con mAb 528, revirtieron completamente. Uno de los tumores mAb 806 era recurrente el día 46 después de la inoculación, mientras que otros tumores no eran recurrentes el día 126, cuando los ratones fueron sacrificados. Por lo tanto, los xenoinjertos dirigidos por la hiperexpresión de una forma constitutivamente activa del EGFR, son más sensibles a anticuerpos específicos del EGFR.

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La localización lisosómica de mAb 806 después de la unión e internalización de EGFR de2-7 en las células U87MG.Δ2-7 se logró a través de análisis de colocalización en células transfectadas transitoriamente con lgp-120-GFP (Fig. 8B). Las células transfectadas positivamente con lgp-120-GFP mostraban una fluorescencia verde perinuclear citoplasmática, lo que es consistente con la localización, en compartimentos lisosómicos, tal y como se esperaba (Fig. 8B; lgp-120-GFP). Antes de la inducción de la internalización, mAb 806-Cy3 solo se detectaba en la superficie celular (Fig. 8B; 0 min, mAb 806-Cy3), y no se colocalizaba con lgp-120-GFP (Fig. 8B; 0 min, fusión). Después de un calentamiento a 37ºC durante 30 min, se observaron pequeñas estructuras vesiculares intracelulares correspondientes al mAb 806 internalizado (Fig. 8B; 30 min, mAb 806-Cy3). Algunas de estas estructuras se colocalizaban con lgp-120-GFP, sin embargo la mayoría de la señal roja y verde permanecía separada (Fig. 8B; 30 min, fusión). Una incubación más larga a 37ºC durante 60 y 120 minutos, dio como resultado una mayor colocalización del mAb 806-Cy3 internalizado y lgp-120-GFP (Fig. 8B; 60-120 min, fusión). Estas observaciones son consistentes con la hipótesis de que mAb 806 pasa inicialmente al compartimiento endocítico temprano, pero después de períodos más largos se traslada a compartimentos lisosómicos en donde se acumula.

La internalización de mAb 806 después de la unión al EGFR de2-7 expresado en células U87MG.Δ2-7 también se analizó mediante microscopía electrónica. Después de 5 minutos de incubación a 37ºC, partículas de oro, correspondientes a mAb 806, se observaron en estructuras que se asemejaban a cráteres revestidos con clatrina (Fig. 9A y B). También se detectaron partículas de oro en vesículas revestidas de clatrina libres, ubicadas dentro del citoplasma (Fig. 9C). No se observaron partículas de oro en las estructuras que se asemejan a caveolas (Fig. 9D). Después de 10 minutos de captura a 37ºC, mAb 806 se localizaba en grandes estructuras vesiculares tubulares que se asemejan a compartimentos endocíticos tempranos (Fig. 9E). Períodos de captura más largos de 30 minutos dieron lugar a la localización de los anticuerpos en estructuras semejantes a cuerpos multivesiculares (Fig. 9F). Estas observaciones son consistentes con los datos de microscopía por inmunofluorescencia, que indicaban una colocalización de mAb 806 con lgp-120 entre 30 y 60 minutos.

Internalización de mAb 806 y 528 en células NR6.Δ2-7.

Dadas las diferencias en la eficacia terapéutica de los mAbs 806 y 528 frente a xenoinjertos NR6.Δ2-7, se investigaron las características de la internalización de cada anticuerpo en esta línea celular. Además, puesto que las células NR6.Δ2-7 no expresan ningún miembro endógeno de la familia ErbB, en esta línea celular se puede determinar si se requiere la presencia de EGFR wt para la internalización de estos anticuerpos. Las células incubadas con mAb 806-Cy3 a 4ºC mostraban una tinción de la membrana sin fluorescencia intracelular, tal y como se esperaba (Fig. 10; mAb 806, 0 min). En contraste con las células U87MG.Δ2-7 (Fig. 8), la tinción de la membrana no fue uniforme. Una tinción más intensa se asoció con uniones de membrana entre las células (Fig. 10; mAb 806, 0 min) y adhesiones focales (Fig. 10; mAb 806, 0 min). Algunas células mostraron muy poca tinción de la membrana (Fig. 10; mAb 806, 0 min). Después de la inducción de la internalización elevando la temperatura a 37ºC, se observaron estructuras vesiculares puntiformes, intracelulares características. Estas se acumulaban en un patrón perinuclear (Fig. 10; mAb 528 15-60 min) lo que es consistente con una localización lisosómica rápida. La localización inicial (Fig. 10; mAb 528, 0 min) y la subsiguiente internalización (Fig. 10; mAb 528, 1-60 min) de mAb 528 era idéntica a la de mAb 806. Por tanto, ambos anticuerpos se internalizaban rápidamente en el compartimento lisosómico después de la unión al EGFR de2-7, incluso en ausencia del EGFR wt.

Discusión

mAb 528. Muchos, pero no todos los estudios anteriores han sugerido que el número de EGFR en la superficie celular es un factor que influye en la eficacia de los agentes terapéuticos dirigidos a EGFR, especialmente los TKIs (Tabla 1). Sin embargo, estos experimentos siempre han comparado la actividad antitumoral utilizando diferentes líneas celulares y, por lo tanto, no están controlados con respecto al fondo genético, la presencia de otros miembros de la familia ErbB y la aparición de otros receptores funcionales/cinasas capaces de modular la vía de señalización del EGFR. Además, muchos de estos estudios se han realizado in vitro, lo que hemos mostrado que no se correlaciona con la actividad in vivo. Aumentando 10 veces el número de EGFR wt, los xenoinjertos de glioma U87MG se convierten de ser resistentes a mAb 528 a sensibles al anticuerpo. Dado que el aumento del número de EGFR wt no alteraba la tasa de crecimiento de los xenoinjertos U87MG, el advenimiento de una actividad antitumoral no era simplemente el resultado de mAb 528 que inhibía una ventaja del crecimiento inducido. La presencia de más EGFR wt dentro de los xenoinjertos U87MG.wtEGFR casi seguro que conducía a una mayor localización de los anticuerpos en el sitio del tumor. Dado que mAb 528 posee una función efectora inmune baja pero medible (25), el aumento del nivel de anticuerpo en el sitio del tumor puede dar como resultado un aumento de la deposición del complemento y del reclutamiento de células inmunes, que contribuyen a la inhibición del crecimiento tumoral. Sin embargo, un papel de la función efectora inmune en el inicio de la actividad antitumoral de mAb 528 parece poco probable, dados nuestros datos con los xenoinjertos U87MG.DK. Estos xenoinjertos tienen tantos sitios de unión a mAb 528 como los xenoinjertos U87MG.wtEGFR, pero no están inhibidos por el anticuerpo. Una posibilidad intrigante es que la hiperexpresión del EGFR wt conduce a una señalización de EGFR independiente del ligando (U87MG parental parece no tener un bucle fuerte autocrino-ligando), lo que a su vez hace que las células se vuelvan más dependientes del sistema de señalización del EGFR. Por lo tanto, los xenoinjertos U87MG.wtEGFR responden a la terapia con mAb 528 porque, a diferencia de la línea celular parental, la vía de señalización de EGFR está activa y es funcional. Por lo tanto, la hiperexpresión de EGFR wt es un marcador sustituto de la dependencia de las células de la señalización de EGFR y por lo tanto es más probable, pero no se garantiza, que tales células respondan a los agentes terapéuti

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cos de EGFR (26).

Se ha supuesto que la actividad antitumoral de anticuerpos tales como mAb 528 está mediada predominantemente por su capacidad para antagonizar la activación del ligando del EGFR. Dado que mAb 528 inhibía el crecimiento de los xenoinjertos U87MG.wtEGFR en ausencia de una expresión significativa del ligando, se sugiere que otros mecanismos pueden contribuir al efecto antitumoral. Además, mAb 528 mostraba una eficacia significativa contra xenoinjertos que expresaban el EGFR de2-7 independiente del ligando. Esta actividad antitumoral no podía ser el resultado directo de la unión de mAb 528 al EGFR wt endógeno, coexpresado en estos xenoinjertos, ya que no inhibía el crecimiento de xenoinjertos U87MG parentales o U87MG.DK, en donde ambos expresan niveles idénticos del EGFR wt. Excluyendo la función efectora inmune, los mecanismos antitumorales alternativos podrían incluir una regulación a la baja del receptor, una inducción de una señalización inapropiada, una translocación del receptor a dominios de membrana inadecuados y una interferencia con la dimerización del receptor y/o la oligomerización. De hecho, algunos TKIs dirigidos al EGFR no solo actúan inhibiendo la actividad cinasa, sino que inducen dímeros inactivos capaces de "limpiar" el exceso de ligando, un mecanismo antitumoral inesperado (27).

Curiosamente, un estudio inmunohistoquímico reciente que analiza la expresión de EGFR en pacientes con cáncer de colon que muestran una respuesta diferencial a C225, describía que varios pacientes "negativos" para EGFR tenían respuestas clínicas frente a este anticuerpo específico de EGFR (26). Es de suponer que estos pacientes tienen niveles de EGFR por debajo de la sensibilidad de detección del análisis inmunohistoquímico, aunque el EGFR presente se activa y contribuye al crecimiento tumoral/supervivencia. Esta observación sugiere que la activación de EGFR es al menos tan importante, si no más, que simplemente el nivel de expresión de EGFR. Nuestros datos que muestran que mAb 528 no inhibía el crecimiento de xenoinjertos U87MG que expresaban una versión sin actividad cinasa de este receptor truncado (U87MG.DK), apoyan la opinión de que la eficacia de los anticuerpos específicos de EGFR está íntimamente asociada con receptores con la cinasa activa. Como se ha sugerido anteriormente, la hiperexpresión de EGFR representa un mecanismo por el que puede tener lugar esta activación; la expresión de un mutante constitutivamente activo, tal como el EGFR de2-7 indica otro. Esta activación continua del EGFR hace que las células se conviertan en "adictas" a la señalización de EGFR, lo que a su vez las hace volverse susceptibles a la terapia anti-EGFR. Este concepto es análogo a la situación en pacientes con cáncer de pulmón, en donde la mayoría de los pacientes que responden a TKIs específicos de EGFR son portadores de mutaciones activadoras en el dominio cinasa de EGFR (28).

La capacidad de mAb 528 para inhibir el crecimiento de xenoinjertos U87MG.DY2 o DY5 pone de relieve la importancia de un dominio de cinasa activa en oposición a la autofosforilación como determinante de la eficacia. Por lo tanto, es una cinasa activa la que determina la respuesta a una terapia con anticuerpos, no la interacción directa de tirosinas fosforiladas con un adaptador o moléculas de señalización. Una conclusión de este resultado es que mAb 528 aparentemente inhibe el crecimiento de xenoinjertos U87MG.Δ2-7/DY2/DY5 mediante la prevención de la transfosforilación de una diana aguas abajo (Fig. 11). Puesto que todas estas líneas celulares obtenidas a partir de U87MG coexpresan el EGFR wt, y dado que recientemente hemos demostrado que el EGFR de2-7 puede formar dímeros y fosforilar el EGFR wt (29), el EGFR wt es un candidato probable para esta diana secundaria. Esta propuesta se apoya en el hecho de que las células NR6 que expresan el EGFR de2-7 en ausencia del EGFR wt eran completamente refractarias a los efectos antitumorales de mAb 528. Tomados en conjunto, estos estudios sugieren que mAb 528, junto con sus propiedades de bloqueo de ligando, actúa en parte evitando la homodimerización del EGFR wt hiperexpresado y la heterodimerización entre el EGFR wt y EGFR de2-7. Curiosamente, la estructura de C225 (un anticuerpo muy similar al mAb 528) que forma un complejo con el EGFR, sugiere que, aparte de un bloqueo del ligando, este anticuerpo puede evitar la dimerización de EGFR inhibiendo parcialmente el desanclaje de EGFR (30).

mAb 806. La capacidad de respuesta de las líneas celulares obtenidas a partir de U87MG in vivo frente a mAb 806 se ajusta completamente a la observada con mAb 528, lo que indica que se aplican muchos de los principios anteriores, aunque hay algunas diferencias importantes. Este estudio confirma y amplía nuestros estudios previos, demostrando que la reactividad de mAb 806 está asociada con la activación de EGFR (16). A diferencia de mAb 528, y todos los anticuerpos actuales en la evaluación clínica, mAb 806 no se dirige a un tejido normal como el hígado, ya que la activación del EGFR es extremadamente baja o no detectable en órganos tales como el hígado. Una gran cantidad de factores pueden estimular la activación de EGFR dentro de los tumores (véase (31) para una revisión). Hemos confirmado que al menos tres de ellos, hiperexpresión de EGFR (15), mutación (17) y presencia de un bucle autocrino (Johns et al., en preparación) pueden conducir a la reactividad de mAb 806. La asociación de la hiperexpresión de EGFR wt para la actividad antitumoral de mAb 806 está íntimamente relacionada con su especificidad única ya que la hiperexpresión aumenta la forma transitoria, no anclada al EGFR, reconocida por mAb 806, a través de múltiples mecanismos, tales como la activación independiente de ligando y las alteraciones en la glicosilación de EGFR (21). Dado que el trabajo que se describe en esta memoria, junto con los datos clínicos obtenidos con TKIs específicos de EGFR, sugieren que los inhibidores de EGFR son más eficaces contra tumores con un EGFR activado, la capacidad única de mAb 806 para reconocer específicamente formas activadas del EGFR, hace que éste sea un agente terapéutico ventajoso.

La formación de modelos moleculares sugiere que la unión de mAb 806 impediría la formación de dímeros activos de EGFR wt (14), una hipótesis que hemos confirmado mediante la resolución de la estructura cristalina de mAb 806 formando un complejo con su epítopo (Johns et al., en preparación). A pesar de que este mAb 806 no inhibe signifi

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cativamente la fosforilación del EGFR de2-7 o wt en modelos de xenoinjertos (16), sugiere firmemente que cualquier mecanismo de acción propuesto para mAb 806 incluye más de un bloqueo de la autofosforilación. Además, dianas conocidas aguas abajo de la señalización de EGFR tales como Akt y MAPK, tampoco están inhibidas por mAb 806

(T.G. Johns, observaciones no publicadas). Concordando con esta hipótesis, mAb 806 muestra actividad antitumoral fuerte frente a xenoinjertos U87MG.DY2/DY5, dos modelos en los que la autofosforilación no es relevante. La falta de eficacia de mAb 806 contra los xenoinjertos U87MG.DK, pone de relieve que la presencia de una cinasa activa y los eventos de transfosforilación (Fig. 11) son factores decisivos que conducen a la sensibilidad. En contraste con mAb 528, mAb 806 era capaz de inhibir el crecimiento de células NR6 que expresaban el EGFR de2-7, en ausencia de otros miembros de la familia ErbB. Este resultado indica que mAb 806 altera potencialmente otras dianas de la transfosforilación de EGFR de2-7, distintas del EGFR wt. Curiosamente, no había ninguna diferencia obvia en la internalización y el seguimiento intracelular de mAb 806 y 528 después de la unión de cualquiera de los anticuerpos a la superficie de EGFR de2-7 en células NR6, lo que sugiere que el tráfico de los anticuerpos no contribuía a la diferencia de la eficacia en este modelo de xenoinjerto.

En esta memoria se presenta por primera vez que Y845 está fosforilado sobre EGFR de2-7 de una manera dependiente de Src. Por lo tanto, se examinó si la interacción entre el EGFR de2-7 y Src era una diana potencial de la actividad de mAb 806. Si mAb 806 mediaba en parte su actividad antitumoral mediante la inhibición de esta interacción, entonces la alteración genética de esta interacción usando un DNSrc debería reducir la eficacia de mAb 806. En contraste con esta posibilidad, la presencia de un DNSrc mejoraba enormemente la actividad antitumoral de mAb

806. Esto sugiere que Src tiene un papel en la limitación de la eficacia de los agentes terapéuticos de EGFR y proporciona una justificación para el uso de inhibidores de Src y EGFR en combinación.

Conclusión

Estos estudios demuestran la relevancia de los estudios in vivo para analizar la sensibilidad de líneas celulares frente a agentes terapéuticos de EGFR. A diferencia de estudios anteriores, hemos sido capaces de llevar a cabo la mayor parte de nuestro análisis en el mismo fondo genético, haciendo que la variable predominante fuera la naturaleza del EGFR. Con esta metodología mostramos de manera concluyente la importancia del número de receptores para la eficacia. Aunque el número de EGFR está relacionado con la susceptibilidad terapéutica de EGFR, este factor por sí solo no es suficiente, ya que el receptor también debe contener una cinasa funcional. De hecho, aunque un tanto intuitivo, este trabajo muestra formalmente que "forzar" una línea celular para que utilice la señalización de EGFR, ya sea por la hiperexpresión de EGFR wt o la expresión de un mutante constitutivo activo, puede hacer que cambie de no ser capaz de responder a ser capaz de responder. Por lo tanto, el EGFR no solo debe estar presente en la superficie celular, sino que debe contribuir significativamente al crecimiento y la supervivencia de la célula. Por lo tanto, las estrategias para la selección de pacientes que van a responder al agente terapéutico de EGFR se deben dirigir a la identificación de tumores que sean muy dependientes del EGFR, no solamente a la presencia o ausencia de la proteína del receptor. Esta tarea puede ser relativamente sencilla en algunos casos, tales como cuando están presentes los EGFR de2-7, una amplificación del gen EGFR o mutantes que activan la cinasa, pero es claramente más difícil en casos en los casos en los que el EGFR wt es genéticamente normal. En estos casos la compleja interacción de múltiples cinasas del receptor dificulta la identificación de aquellos tumores que dependen realmente de la señalización del EGFR. A largo plazo, un perfil detallado de la expresión de genes diana que aún no se han identificado, únicos para cada cinasa del receptor, puede ser el único enfoque viable para hacer frente a este problema.

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