TW202317606A

TW202317606A - 胰高血糖素類似物及其醫藥用途

Info

Publication number: TW202317606A
Application number: TW111122671A
Authority: TW
Inventors: 劉偉兵; 黃旭超; 張曉謙; 吳方舟; 王雷; 曲亮
Original assignee: 大陸商北京拓界生物醫藥科技有限公司
Priority date: 2021-06-18
Filing date: 2022-06-17
Publication date: 2023-05-01
Also published as: KR20240022551A; CA3221829A1; WO2022262837A1; EP4357358A1; CN117242087A

Abstract

本揭露涉及胰高血糖素類似物及其醫藥用途。具體地，本揭露的胰高血糖素類似物具有顯著提高的體外活性、優異的物理/化學穩定性和較高的溶解度，可用於治療低血糖、肥胖症、糖尿病等代謝性疾病。

Description

胰高血糖素類似物及其醫藥用途

本申請要求2021年06月18日提交的申請號為202110676681.3的中國專利申請的優先權。

本揭露涉及胰高血糖素類似物及其醫藥用途。本揭露的胰高血糖素類似物可用於治療低血糖、肥胖症、糖尿病等代謝性疾病或緩解病症。

控制體內血糖的平衡對機體代謝極其重要。正常情況下，人體血糖水平在多種不同多肽類激素(以胰島素和胰高血糖素為主)調節下保持動態平衡。血糖失衡可能導致併發症。當血糖濃度低於正常水平，就會出現低血糖(Hypoglycemia)現象。胰島中胰腺產生胰高血糖素，使血糖水平增加到正常範圍。非嚴重的低血糖通常產生自主性的或神經性的低血糖症狀，患者能夠識別低血糖的發病，因此無需他人輔助治療。而當血液中葡萄糖濃度因其它藥物、或疾病、或者激素或酶的缺陷而下降(如治療糖尿病、腎功能衰竭、特定腫瘤、肝疾病、甲狀腺機能低下症、遺傳性代謝缺陷、敗血症與反應性低血糖所引起的一系列臨床的嚴重低血糖症狀)，體內的胰高血糖素就不足以使血糖恢復，甚至可危及到生命，通常表現為認知或身體功能受損，自我治療能力受限，所以需要他人的幫助治療才能恢復正常血糖。

目前，在低血糖防治中，完全清醒的低血糖患者的治療方法首選口服糖類食物；對於意識障礙者，需要在非醫護人員或醫護人員的幫助下接受靜脈注射50%葡萄糖液或肌肉注射0.5至2mg胰高血糖素的治療。非醫護人員較難開展50%葡萄糖液的靜脈注射。注射劑量過高則會引起反彈性高血糖，如果葡萄糖液滲漏出血管，會造成局部組織損傷。因此，在非醫院環境下，意識障礙的嚴重低血糖患者的最佳治療策略是藉由皮下或肌肉注射胰高血糖素。胰高血糖素作為嚴重低血糖的急救藥物也已應用於臨床；並且基於胰高血糖素的降脂及促進能量消耗作用，其與腸促胰素的雙重受體激動劑也使肥胖的糖尿病患者進一步獲益。

胰高血糖素為由胰腺α-細胞分泌的29個胺基酸組成的直鏈多肽，控制肝臟生產葡萄糖和酮體。胰高血糖素在夜間及兩餐之間分泌，藉由增加源自胺基酸前體的葡萄糖生成(糖異生)和促進糖原降解成葡萄糖(糖酵解)，導致肝臟的葡萄糖外流增加，從而提高血糖濃度。胰高血糖素與胰腺β細胞分泌的胰島素共同精確控制體內血糖的平衡。胰高血糖素除了有低血糖的治療效果，還抑制食欲、並活化脂肪細胞的激素敏感性脂肪酶以促進脂肪分解，從而顯示出抗肥胖效果。

胰高血糖素是抵抗低血糖防禦機制的重要組成部分，低劑量的胰高血糖素可防止胰島素誘導性的低血糖，並改善從低血糖恢復的能力。低劑量的胰高血糖素還可引起飽腹感抑制食欲，同時可活化脂肪細胞的激素敏感性脂肪酶，促進脂肪分解，從而有潛在的抗肥胖效果，可用於治療許多患有II型糖尿病患者的體重超重或者肥胖。

然而，天然胰高血糖素在中性pH的水相溶液中溶解度極低。此外，胰高血糖素含有可產生胺基酸殘基側鏈脫醯胺基化、氧化、環狀亞胺中間物形成的胺基酸或胺基酸序列，以及含有可發生異構化、肽鏈切割等的胺基酸或胺基酸序列，無法保持長時間穩定，並且在幾小時至幾天內就會形成凝膠或者原纖維(fibril)，化學及物理穩定性極差。因此，需要開發溶解度優異，物理/化學穩定性良好的新型胰高血糖素類似物以滿足注射製劑開發的要求。

第一代胰高血糖素注射製劑，如胰高血糖素應急試劑盒(Glucagon^®，Eli Lilly)、胰高血糖素試劑盒(Glucagon^®，Novo Nordisk A/S)，受限於胰高血糖素不理想的成藥性質，因而以凍乾粉末的形式儲存，使用時需要利用溶劑重溶解後再進行皮下/肌肉注射，不便於患者及非醫護照料人員使用。

第二代胰高血糖素注射製劑，如人胰高血糖素鼻噴粉末(BAQSIMI^®，Eli Lilly)、預充的人胰高血糖素注射液(GVOKE HYPOPEN^®，XERIS)，對製劑做了針對性的改良，保證治療效果的同時顯著提高了患者及非醫護人員操作的便利性。但是，BAQSIMI^®採用鼻腔噴霧給藥，起效較慢，相比肌肉注射需三倍劑量，有不良反應。GVOKE HYPOPEN^®以DMSO為製劑，雖然可直接皮下注射，但有明顯的注射部位不適及其它副作用。此外，Dasiglucagon(開發公司Zealand Pharma)是在天然人胰高血糖素的基礎上進行了7個胺基酸位點的改造，在不影響活性的基礎上，對溶解度和物理/化學穩定性進行了改善，可以注射液劑型直接皮下注射。Dasiglucagon已於近期獲得美國食品藥品管理局的批准上市。

本領域仍然亟需高活性、溶解度優異、物理/化學穩定性良好的胰高血糖素類似物。本揭露提供了一類高活性(相比天然胰高血糖素，活性提高)、水性溶液中溶解度高(尤其在生理pH下)和穩定性(包含物理穩定性和化學穩定性)改善的胰高血糖素類似物。與本領域內的胰高血糖素類似物相比，本揭露的胰高血糖素類似物具有更強的體外胰高血糖素受體激動劑活性，對降低皮下給藥的體積和次數、提高低血糖患者的使用便利性、減輕患者經濟負擔都有很大幫助。本揭露的胰高血糖素類似物可單獨或與其它治療性藥物聯合用於治療低血糖、肥胖症、糖尿病等代謝性疾病或病症方法中。

本揭露提供胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物，包含其的醫藥組成物，編碼該胰高血糖素類似物的多核苷酸、含有該多核苷酸的載體、含有該多核苷酸或載體的宿主細胞。以及，該胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物或包含其的醫藥組成物用於治療疾病、緩解病症(例如低血糖、肥胖症、糖尿病等代謝性疾病或病症)的方法和相關製藥用途。

胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物

本揭露提供了如式(I)所示結構的胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物：

R₁-His-Ser-X₃-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-X₁₅-X₁₆-X₁₇-Arg-Ala-X₂₀-X₂₁-Phe-Val-X₂₄-Trp-Leu-X₂₇-X₂₈-Thr-R₂(SEQ ID NO：50) (I)

本揭露還提供了包含式(I)所示結構的胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物，其中，R₁和/或R₂不存在；

其中，

R₁是氫、C_1-4烷基、乙醯基、甲醯基、苯甲醯基、三氟乙醯基或pGlu；

R₂是-OH或-NH₂；

X₃、X₁₅、X₁₆、X₂₀、X₂₁、X₂₄、X₂₇和X₂₈相互獨立地選自任意天然胺基酸殘基或非天然胺基酸殘基；X₁₇是Aib。

在一些實施方案中，X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；X₁₅選自Asp或Glu；X₁₆選自Ser、Thr、Leu、Val、Ile或α-甲基-Ser；X₁₇是Aib；X₂₀選自Ala、Gln、Glu，Ser，Thr或Lys；X₂₁選自Asp或Glu；X₂₄選自Ala、Gln、Ser、Glu、α-甲基-Ser或Arg；X₂₇選自Met、Glu、Nle、Leu或Ser；X₂₈選自Asn、Glu或Ser。

在一些實施方案中，X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；X₁₅是Asp；X₁₆選自Thr、Leu、Val或Ile；X₁₇是Aib；X₂₀選自Ala、Gln、Glu、Ser、Thr或Lys；X₂₁選自Asp或Glu；X₂₄選自Ala、Gln、Ser、Glu、 α-甲基-Ser或Arg；X₂₇選自Met、Glu、Nle、Leu或Ser；X₂₈選自Asn、Glu或Ser。

在一些實施方案中，X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；X₁₅選自Asp或Glu；X₁₆選自Ser、Thr、Leu、Val、Ile或α-甲基-Ser；X₁₇是Aib；X₂₀是Gln；X₂₁選自Asp或Glu；X₂₄選自Ala、Gln、Ser、Glu、α-甲基-Ser或Arg；X₂₇選自Met、Glu、Nle、Leu或Ser；X₂₈選自Asn、Glu或Ser。

在一些實施方案中，X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；X₁₅選自Asp或Glu；X₁₆選自Ser、Thr、Leu、Val、Ile或α-甲基-Ser；X₁₇是Aib；X₂₀選自Ala、Gln、Glu、Ser、Thr或Lys；X₂₁選自Asp或Glu；X₂₄選自Gln或Glu；X₂₇選自Met、Glu、Nle、Leu或Ser；X₂₈選自Asn、Glu或Ser。

在一些實施方案中，X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；X₁₅選自Asp或Glu；X₁₆選自Ser、Thr、Leu、Val、Ile或α-甲基-Ser；X₁₇是Aib；X₂₀選自Ala、Gln、Glu、Ser、Thr或Lys；X₂₁選自Asp或Glu；X₂₄選自Ala、Gln、Ser、Glu、α-甲基-Ser或Arg；X₂₇是Glu；X₂₈是Ser。

在一些實施方案中，X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；X₁₅是Asp；X₁₆選自Thr、Leu、Val或Ile；X₁₇是Aib；X₂₀是Gln；X₂₁選自Asp或Glu；X₂₄選自Ala、Gln、Ser、Glu、α-甲基-Ser或Arg；X₂₇選自Met、Glu、Nle、Leu或Ser；X₂₈選自Asn、Glu或Ser。

在一些實施方案中，X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；X₁₅是Asp；X₁₆選自Thr、Leu、Val或Ile；X₁₇是Aib；X₂₀選自Ala、Gln、Glu、 Ser、Thr或Lys；X₂₁選自Asp或Glu；X₂₄選自Gln或Glu；X₂₇選自Met、Glu、Nle、Leu或Ser；X₂₈選自Asn、Glu或Ser。

在一些實施方案中，X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；X₁₅是Asp；X₁₆選自Thr、Leu、Val或Ile；X₁₇是Aib；X₂₀選自Ala、Gln、Glu、Ser、Thr或Lys；X₂₁選自Asp或Glu；X₂₄選自Ala、Gln、Ser、Glu、α-甲基-Ser或Arg；X₂₇是Glu；X₂₈是Ser。

在一些實施方案中，X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；X₁₅選自Asp或Glu；X₁₆選自Ser、Thr、Leu、Val、Ile或α-甲基-Ser；X₁₇是Aib；X₂₀是Gln；X₂₁選自Asp或Glu；X₂₄選自Gln或Glu；X₂₇選自Met、Glu、Nle、Leu或Ser；X₂₈選自Asn、Glu或Ser。

在一些實施方案中，X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；X₁₅選自Asp或Glu；X₁₆選自Ser、Thr、Leu、Val、Ile或α-甲基-Ser；X₁₇是Aib；X₂₀是Gln；X₂₁選自Asp或Glu；X₂₄選自Ala、Gln、Ser、Glu、α-甲基-Ser或Arg；X₂₇是Glu；X₂₈是Ser。

在一些實施方案中，X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；X₁₅選自Asp或Glu；X₁₆選自Ser、Thr、Leu、Val、Ile或α-甲基-Ser；X₁₇是Aib；X₂₀選自Ala、Gln、Glu、Ser、Thr或Lys；X₂₁選自Asp或Glu；X₂₄選自Gln或Glu；X₂₇是Glu；X₂₈是Ser。

在一些實施方案中，X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；X₁₅是Asp；X₁₆選自Thr、Leu、Val或Ile；X₁₇是Aib；X₂₀是Gln；X₂₁選自Asp或Glu；X₂₄選自Gln或Glu；X₂₇是Glu；X₂₈是Ser。

在一些實施方案中，X₃選自His或Gln；X₁₅是Asp；X₁₆選自Thr、Leu、Val或Ile；X₁₇是Aib；X₂₀是Gln；X₂₁是Glu；X₂₄選自Gln或Glu；X₂₇是Glu；X₂₈是Ser。

在一些實施方案中，R₁是氫；R₂是-OH或-NH₂。在一些實施方案中，R₁是氫；R₂是-OH。

本揭露的可藥用鹽和/或溶劑化物選自：無機鹽或有機鹽。

本揭露的胰高血糖素類似物可與酸性化合物或鹼性化合物反應而生成相應的鹽。

“與酸性化合物反應而生成相應的鹽”是指能夠保留游離鹼的生物有效性而無其它副作用的，與無機酸或有機酸所形成的鹽。無機酸鹽包括但不限於：鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽等；有機酸鹽包括但不限於：甲酸鹽、乙酸鹽、2,2-二氯乙酸鹽、三氟乙酸鹽、丙酸鹽、己酸鹽、辛酸鹽、癸酸鹽、十一碳烯酸鹽、乙醇酸鹽、葡糖酸鹽、乳酸鹽、癸二酸鹽、己二酸鹽、戊二酸鹽、丙二酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、油酸鹽、肉桂酸鹽、月桂酸鹽、蘋果酸鹽、谷胺酸鹽、焦谷胺酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、水楊酸鹽、4-胺基水楊酸鹽、萘二磺酸鹽等。可藉由本領域已知的方法製備這些鹽。

“與鹼性化合物反應而生成相應的鹽”是指能夠保持游離酸的生物有效性而無其它副作用的、與無機鹼或有機鹼所形成的鹽。衍生自無機鹼的鹽包括但不限於：鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽、鎂鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、錳鹽、鋁鹽等。衍生自有機鹼的鹽包括但不限於：第一胺、第二胺、第三胺、取代的胺、環狀胺；例如胺、異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、乙二胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二甲基乙醇胺、2-二甲胺基乙醇、2-二乙胺基乙醇、二環己胺、賴胺酸、精胺酸、組胺酸、咖啡因、普魯卡因、膽鹼、甜菜鹼、葡萄糖胺、甲基葡萄糖胺、可可鹼、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺樹脂等。較佳的有機鹼包括異丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二環己基胺、膽鹼及咖啡因。可藉由本領域已知的方法製備這些鹽。

術語“溶劑化物”表示本揭露的胰高血糖素類似物或其可藥用鹽與適宜的溶劑形成的複合物。溶劑的非限制性實例包括：水、乙醇、乙腈、異丙醇、DMSO、乙酸乙酯。在具體的實施方案中，該溶劑化物為水合物。

在一些實施方案中，本揭露提供胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物，該胰高血糖素類似物是選自SEQ ID NO：1-49中任一所示的化合物。

在一些具體的實施方案中，本揭露提供胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物，該胰高血糖素類似物是選自以下的化合物：

H-HSQGTFTSDYSKYLDTAibRAQEFVQWLEST-OH(SEQ ID NO：39)；

H-HSQGTFTSDYSKYLDLAibRAQEFVQWLEST-OH(SEQ ID NO：40)；

H-HSQGTFTSDYSKYLDVAibRAQEFVQWLEST-OH(SEQ ID NO：41)；

H-HSQGTFTSDYSKYLDIAibRAQEFVQWLEST-OH(SEQ ID NO：42)；

H-HSHGTFTSDYSKYLDLAibRAQEFVQWLEST-OH(SEQ ID NO：43)；

H-HSHGTFTSDYSKYLDLAibRAQEFVEWLEST-OH(SEQ ID NO：47)。

在本揭露的每一個胰高血糖素類似物的序列中，C端“-OH”部分(moiety)可以替換成C端的“-NH₂”。

在一些具體的實施方案中，本揭露提供胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物，該胰高血糖素類似物包含選自SEQ ID NO：39、40、41、42、43、47任一的結構，其中，該SEQ ID NO：39、40、41、42、43、47的N端的H和/或C端的OH是不存在的。

其中，

R₂是-OH或-NH₂；

X₃、X₁₇、X₂₀、X₂₁、X₂₄、X₂₇和X₂₈相互獨立地選自任意天然胺基酸殘基或非天然胺基酸殘基；X₁₅是Asp；X₁₆選自Ser、Thr、Leu、Val、Ile或α-甲基-Ser，例如選自Thr、Leu、Val或Ile。

在一些實施方案中，X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；X₁₅是Asp；X₁₆選自Ser、Thr、Leu、Val、Ile或α-甲基-Ser；X₁₇選自Aib或Ala；X₂₀不是Glu；X₂₁選自Asp或Glu；X₂₄選自Ala、Gln、Ser、Glu、α-甲基-Ser或Arg；X₂₇選自Met、Glu、Nle、Leu或Ser；X₂₈選自Asn、Glu或Ser。

在一些實施方案中，X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；X₁₅是Asp；X₁₆選自Thr、Leu、Val或Ile；X₁₇選自Aib或Ala；X₂₀不是Glu；X₂₁選自Asp或Glu；X₂₄選自Ala、Gln、Ser、Glu、α-甲基-Ser或Arg；X₂₇選自Met、Glu、Nle、Leu或Ser；X₂₈選自Asn、Glu或Ser。

在一些實施方案中，X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；X₁₅是Asp；X₁₆選自Thr、Leu、Val或Ile；X₁₇是Aib；X₂₀選自Ala、Gln、Glu、Ser、Thr或Lys；X₂₁選自Asp或Glu；X₂₄選自Ala、Gln、Ser、Glu、α-甲基-Ser或Arg；X₂₇選自Met、Glu、Nle、Leu或Ser；X₂₈選自Asn、Glu或Ser。

在一些實施方案中，X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；X₁₅是Asp；X₁₆選自Thr、Leu、Val或Ile；X₁₇是Aib；X₂₀是Gln；X₂₁選自Asp 或Glu；X₂₄選自Ala、Gln、Ser、Glu、α-甲基-Ser或Arg；X₂₇選自Met、Glu、Nle、Leu或Ser；X₂₈選自Asn、Glu或Ser。

在一些實施方案中，X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；X₁₅是Asp；X₁₆選自Thr、Leu、Val或Ile；X₁₇是Aib；X₂₀不是Glu；X₂₁選自Asp或Glu；X₂₄選自Gln或Glu；X₂₇選自Met、Glu、Nle、Leu或Ser；X₂₈選自Asn、Glu或Ser。

在一些實施方案中，X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；X₁₅是Asp；X₁₆選自Thr、Leu、Val或Ile；X₁₇是Aib；X₂₀不是Glu；X₂₁選自Asp或Glu；X₂₄選自Ala、Gln、Ser、Glu、α-甲基-Ser或Arg；X₂₇是Glu；X₂₈是Ser。

在一些實施方案中，X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；X₁₅是Asp；X₁₆選自Thr、Leu、Val或Ile；X₁₇是Aib；X₂₀不是Glu；X₂₁選自Asp或Glu；X₂₄選自Gln或Glu；X₂₇是Glu；X₂₈是Ser。

在一些實施方案中，X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；X₁₅是Asp；X₁₆選自Thr、Leu、Val或Ile；X₁₇是Aib；X₂₀選自Ala、Gln、Glu、Ser、Thr或Lys；X₂₁選自Asp或Glu；X₂₄選自Gln或Glu；X₂₇是Glu；X₂₈是Ser。

本揭露提供了一種胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物，該胰高血糖素類似物包含如式(I)所示的結構：

其中，

R₂是-OH或-NH₂；

X₃、X₁₅、X₁₆、X₁₇、X₂₁、X₂₄、X₂₇和X₂₈相互獨立地選自任意天然胺基酸殘基或非天然胺基酸殘基；X₂₀是Gln。

在一些實施方案中，X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；X₁₅選自Asp或Glu；X₁₆選自Ser、Thr、Leu、Val、Ile或α-甲基-Ser；X₁₇選自Aib或Ala；X₂₀是Gln；X₂₁選自Asp或Glu；X₂₄選自Ala、Gln、Ser、 Glu、α-甲基-Ser或Arg；X₂₇選自Met、Glu、Nle、Leu或Ser；X₂₈選自Asn、Glu或Ser。

在一些實施方案中，X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；X₁₅選自Asp或Glu；X₁₆選自Ser、Thr、Leu、Val、Ile或α-甲基-Ser；X₁₇選自Aib或Ala；X₂₀是Gln；X₂₁選自Asp或Glu；X₂₄選自Gln或Glu；X₂₇選自Met、Glu、Nle、Leu或Ser；X₂₈選自Asn、Glu或Ser。

在一些實施方案中，X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；X₁₅是Asp；X₁₆選自Thr、Leu、Val或Ile；X₁₇選自Aib或Ala；X₂₀是Gln；X₂₁選自Asp或Glu；X₂₄選自Ala、Gln、Ser、Glu、α-甲基-Ser或Arg；X₂₇選自Met、Glu、Nle、Leu或Ser；X₂₈選自Asn、Glu或Ser。

在一些實施方案中，X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；X₁₅選自Asp或Glu；X₁₆選自Ser、Thr、Leu、Val、Ile或α-甲基-Ser；X₁₇選自Aib或Ala；X₂₀是Gln；X₂₁選自Asp或Glu；X₂₄選自Ala、Gln、Ser、Glu、α-甲基-Ser或Arg；X₂₇是Glu；X₂₈是Ser。

在一些實施方案中，X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；X₁₅是Asp；X₁₆選自Thr、Leu、Val或Ile；X₁₇選自Aib或Ala；X₂₀是Gln；X₂₁選自Asp或Glu；X₂₄選自Gln或Glu；X₂₇選自Met、Glu、Nle、Leu或Ser；X₂₈選自Asn、Glu或Ser。

在一些實施方案中，X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；X₁₅是Asp；X₁₆選自Thr、Leu、Val或Ile；X₁₇選自Aib或Ala；X₂₀是Gln；X₂₁選自Asp或Glu；X₂₄選自Ala、Gln、Ser、Glu、α-甲基-Ser或Arg；X₂₇是Glu；X₂₈是Ser。

在一些實施方案中，X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；X₁₅選自Asp或Glu；X₁₆選自Ser、Thr、Leu、Val、Ile或α-甲基-Ser；X₁₇選自Aib或Ala；X₂₀是Gln；X₂₁選自Asp或Glu；X₂₄選自Gln或Glu；X₂₇是Glu；X₂₈是Ser。

在一些實施方案中，X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；X₁₅是Asp；X₁₆選自Thr、Leu、Val或Ile；X₁₇選自Aib或Ala；X₂₀是Gln；X₂₁選自Asp或Glu；X₂₄選自Gln或Glu；X₂₇是Glu；X₂₈是Ser。

本揭露提供式(I)所示結構的胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物：

其中，

R₁是氫、C_1-4烷基、乙醯基、甲醯基、苯甲醯基或三氟乙醯基或pGlu；

R₂是-OH或-NH₂；

X₃、X₁₅、X₁₆、X₁₇、X₂₁、X₂₇和X₂₈相互獨立地選自任意天然胺基酸殘基或非天然胺基酸殘基；X₂₀是Glu，X₂₄是Arg。

在一些實施方案中，X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；X₁₅選自Asp或Glu；X₁₆選自Ser、Thr、Leu、Val、Ile或α-甲基-Ser；X₁₇是Aib；X₂₀是Glu；X₂₁選自Asp或Glu；X₂₄是Arg；X₂₇選自Met、Glu、Nle、Leu或Ser；X₂₈選自Asn、Glu或Ser。

在一些實施方案中，X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；X₁₅是Asp；X₁₆選自Thr、Leu、Val或Ile；X₁₇是Aib；X₂₀是Glu；X₂₁選自Asp或Glu；X₂₄是Arg；X₂₇選自Met、Glu、Nle、Leu或Ser；X₂₈選自Asn、Glu或Ser。

在一些實施方案中，X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；X₁₅選自Asp或Glu；X₁₆選自Ser、Thr、Leu、Val、Ile或α-甲基-Ser；X₁₇是Aib；X₂₀是Glu；X₂₁選自Asp或Glu；X₂₄是Arg；X₂₇是Glu；X₂₈是Ser。

在一些實施方案中，X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；X₁₅是Asp；X₁₆選自Thr、Leu、Val或Ile；X₁₇是Aib；X₂₀是Glu；X₂₁選自Asp或Glu；X₂₄是Arg；X₂₇是Glu；X₂₈是Ser。

本揭露的胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物具有胰高血糖素受體(GCGR)激動劑活性，其與GCGR的結合可用作激動劑活性的指示。在一些可選實施方案中，也可測量由化合物與受體結合時引起的細胞內信號轉導。例如，胰高血糖素受體激動劑對GCGR的活化，將刺激細胞環磷酸腺苷(cAMP)的形成。因此，可使用合適的表達受體的細胞中cAMP的產生來監測受體活性。例如，可使用實施例2中給出的材料(例如CHO-K1/GCGR/CRE-Luc穩轉細胞株和Cisbio-cAMP-Gs Dynamic kit)並且在該條件下進行測定。可使用EC₅₀值作為對GCGR的激動劑效力的數值量度。EC₅₀值是：在特定測定中，對於所討論的受體實現化合物最大活性的一半時，所需的該化合物的濃度。

在一些實施方案中，胰高血糖素受體是哺乳動物的胰高血糖素受體，例如人胰高血糖素受體。

在一些實施方案中，本揭露的胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物對人GCGR的激動劑活性是天然胰高血糖素的至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3.0倍、或至少3.1倍。

在一些實施方案中，本揭露的胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物對人GLP-1R和/或GIPR無激動劑活性或可以忽略不計。

在一些實施方案中，與天然胰高血糖素相比，本揭露的胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物具有提高的溶解度和/或穩定性。

在一些實施方案中，提高的溶解度可以包括或者是指：在pH 4(例如，在pH 4的醋酸鹽緩衝液中)、pH 5(例如，在pH 5的醋酸鹽緩衝液中)、pH 6(例如，在pH 6的磷酸鹽緩衝液中)、pH 7(例如，在pH7的磷酸鹽緩衝液中)和/或pH 7.5(例如，在pH 7.5的磷酸鹽緩衝液中)下，與天然胰高血糖素相比，具有提高的溶解度。作為一個示例，可以在實施例5中給出的條件下進行測定。可以期望溶解度

1mg/mL。

在一些實施方案中，例如藉由測量在280nm的吸光度，並依據比爾定律計算的，本揭露的胰高血糖素類似物在pH7.4的磷酸鹽緩衝液中的溶解度為

1.00mg/mL、

1.10mg/mL、

1.20mg/mL、

1.30mg/mL、

1.40mg/mL、

1.50mg/mL、

1.60mg/mL、

1.70mg/mL、

1.80mg/mL、

1.90mg/mL、

2.00mg/mL、

2.10mg/mL、

2.20mg/mL、

2.30mg/mL、

2.40mg/mL、

2.50mg/mL、

2.60mg/mL、

2.70mg/mL、

2.80mg/mL、

2.90mg/mL、

3.00mg/mL、

3.10mg/mL、

3.20mg/mL、

3.30mg/mL、

3.40mg/mL、

3.50mg/mL、

3.60mg/mL、

3.70mg/mL、

3.80mg/mL、

3.90mg/mL、

4.00mg/mL、

4.10mg/mL、

4.20mg/mL、

4.30mg/mL、

4.40mg/mL、

4.50mg/mL、

4.60mg/mL、

4.70mg/mL、

4.80mg/mL、

4.90mg/mL、或

5.00mg/mL。

在一些實施方案中，提高的穩定性可以包括或者是指：與天然人胰高血糖素相比提高的物理穩定性和/或提高的化學穩定性。

在一些實施方案中，提高的物理穩定性可以包括或者是指：聚集(例如形成可溶性或不溶性聚集體(例如，原纖維))的趨勢降低。可以以0.1N HCl溶解胰高血糖素類似物，以1mg/mL的濃度37℃下測定聚集(例如，原纖維形成)。可使用任何合適的時間段，例如，24小時、48小時、96小時或120小時。可以適用ThT螢光測試測定聚集。可以在實施例4給出的條件下測定聚集。

在一些實施方案中，提高的化學穩定性可以包括或者是指：在水性緩衝液(通常不存在污染性蛋白酶或肽酶活性)中肽被切割或降解的趨勢降低。可以以例如pH 7.4的磷酸鹽緩衝液，溶解胰高血糖素類似物，以1mg/mL的濃度4℃、25℃或40℃下測定穩定性。評估可包括在孵育合適的時間段例如1天、7天、14天、21天、或28天後測定穩定性。這可包括按照實施例4中所限定，來測定化合物純度，即各色譜圖中主峰相對於所有整合峰的總面積的面積百分比。可以在實施例4給出的條件下測定穩定性。

多核苷酸

本揭露提供編碼本揭露胰高血糖素類似物前體肽的多核苷酸，可以為RNA、DNA或cDNA。根據本揭露的一些實施方案，本揭露的多核苷酸是基本上分離的多核苷酸。

該前體肽是經修飾後能夠獲得本揭露胰高血糖素類似物的肽。例如，前體肽的X₁₇為Arg或其他天然胺基酸，經修飾後獲得X₁₇為Aib的本揭露胰高血糖素類似物。

本揭露的多核苷酸也可呈載體形式，可存在於載體中和/或可為載體的一部分，該載體例如質粒、黏端質粒、YAC或病毒載體。載體可尤其為表達載體，即可提供胰高血糖素類似物在體外和/或體內(即在適合宿主細胞、宿主有機體和/或表達系統中)表達的載體。該表達載體通常包含至少一種本揭露的多核苷酸，其可操作地連接至一個或多個適合的表達調控元件(例如啟動子、增強子、終止子等)。針對在特定宿主中的表達，對該元件及其序列進行選擇為所屬技術領域具有通常知識者的常識。

在一些實施方案中，載體包含5’→3’方向上的且可操作地連接的以下元件(element)：用於驅動核酸片段表達的啟動子，編碼使得能夠進行分泌(分泌至胞外相或適當時分泌到周質(periplasma)中)的前導肽的視需要的多核苷酸，編碼前體肽的多核苷酸，以及編碼終止子的視需要的多核苷酸。

本揭露的多核苷酸可基於本揭露胰高血糖素類似物前體肽的胺基酸序列的信息藉由已知的方式(例如藉由自動DNA合成和/或重組DNA技術)製備或獲得。

宿主細胞

本揭露提供表達本揭露的胰高血糖素類似物前體肽或含有本揭露的多核苷酸或載體的重組宿主細胞。一些實施方案中，宿主細胞為細菌細胞、真菌細胞或哺乳動物細胞。

細菌細胞例如包括革蘭氏陰性細菌菌株(例如大腸桿菌(Escherichia coli)菌株、變形桿菌屬(Proteus)菌株及假單胞菌屬(Pseudomonas)菌株)及革蘭氏陽性細菌菌株(例如芽孢桿菌屬(Bacillus) 菌株、鏈黴菌屬(Streptomyces)菌株、葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌株及乳球菌屬(Lactococcus)菌株)的細胞。

真菌細胞例如包括木黴屬(Trichoderma)、脈孢菌屬(Neurospora)及麴菌屬(Aspergillus)的物種的細胞；或者包括酵母屬(Saccharomyces)(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、畢赤酵母屬(Pichia)(例如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)及嗜甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica))及漢森酵母屬(Hansenula)的物種的細胞。

哺乳動物細胞例如包括例如HEK293細胞、CHO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、COS細胞等。

然而，本揭露也可使用兩栖類細胞、昆蟲細胞、植物細胞及本領域中用於表達異源蛋白的任何其他細胞。

本揭露的細胞不能發育成完成的植株或動物個體。

生產或製備方法

本揭露提供製備本揭露的胰高血糖素類似物的方法，包括例如以下的方法：

(a)藉由化學合成(例如，固相或液相合成)方法合成胰高血糖素類似物，並回收由此獲得的所合成的胰高血糖素類似物；或者

(b)由編碼前體肽的多核苷酸或載體表達前體肽，回收表達產物，以及修飾該前體肽，以產生本揭露的胰高血糖素類似物，例如，可藉由引入一種或多種非天然胺基酸(例如Aib)來修飾前體肽。

在一個實施方案中，包含以下步驟：

- 在允許表達前體肽的條件下，培養本揭露的宿主細胞；及

- 從培養物中回收前體肽；及

- 修飾該前體肽，獲得本揭露的胰高血糖素類似物。可選地，包含純化前體肽的步驟。

用於重組產生多肽的方法及試劑，例如特定適合表達載體、轉化或轉染方法、選擇標記物、誘導蛋白表達的方法、培養條件等在本領域中是已知的。類似地，適用於製造前體肽的方法中的多肽分離及純化技術為所屬技術領域具有通常知識者所公知。固相或液相合的方法在本領域中是已知的，例如，可參考WO98/11125，尤其是Fields，GB et al.，2002，“Principles and practice of solid-phase peptide synthesis”.In：Synthetic Peptides(第二版)，以及本揭露中的實施例。

在一些實施方案中，還提供胰高血糖素類似物形成其可藥用鹽和/或溶劑化物的方法。例如，本揭露胰高血糖素類似物可以與藥學上可接受的酸性或鹼性化合物反應成鹽。

在一些實施方案中，本揭露的胰高血糖素類似物可以採用微生物重組表達的方法來製備，也可以採用Fmoc固相合成的方法來製備(例如SPPS方法，包括胺基酸脫保護的方法、從樹脂上切割肽的方法及其純化的方法)。

在一些實施方案中，採用Fmoc固相合成的方法時，合成載體為Fmoc-L-Thr(tBu)-Wang樹脂(吉爾生化，載量0.533mmol/g)。在一些實施方案中，合成過程中使用的胺基酸衍生物包括：Fmoc-L-Ala-OH，Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-Asp(OtBu) -OH，Fmoc-L-Gln(Trt)-OH，Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-L-His(Trt)-OH，Fmoc-L-Ile-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Fmoc-L-Lys(Boc)-OH，Fmoc-L-Met-OH，Fmoc-L-Phe-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Ser(tBu)-OH，Fmoc-L-Thr(tBu)-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-L-Val-OH，Fmoc-Aib-OH，Fmoc-L-Nle-OH等。在一些實施方案中，合成過程包括：洗滌固相合成載體後，首先用含20% 4-甲基哌啶的N,N-二甲基甲醯胺(DMF)溶液脫去固相合成載體α-胺基上的Fmoc保護基團，接著該固相載體與序列中下一個胺基酸衍生物在過量情況下使用HCTU/4-甲基嗎啉活化後進行縮合形成醯胺鍵以延長肽鏈；重複縮合→洗滌→去保護→洗滌→下一輪胺基酸縮合的操作以達到所要合成的多肽鏈長度，最後用三氟乙酸：水：三異丙基矽烷(90：5：5，v：v：v)的混合溶液與樹脂反應將多肽從固相載體上裂解下來，再由冷凍甲基第三丁基醚沉降後得到多肽衍生物的固體粗品；多肽固體粗品由含0.1%三氟乙酸的乙腈/水的混合溶液溶解後由C-18反相製備色譜管柱純化分離後得到多肽及其衍生物的純品。

醫藥組成物

本揭露提供醫藥組成物，其含有預防、治療或緩解有效量的本揭露的胰高血糖素類似物或可藥用鹽和/或溶劑化物，以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、緩衝劑或賦形劑。

在一些實施方案中，該醫藥組成物單位劑量中可含有0.01至99重量%的本揭露的胰高血糖素類似物或可藥用鹽和/或溶劑化物。在另一些實施方案中，醫藥組成物單位劑量中含本揭露的胰高血糖素類似物或可藥用鹽和/或溶劑化物的量為0.1-2000mg；一些具體實施方案中為1-1000mg。

在一些實施方案中，醫藥組成物進一步包括至少一種具有代謝性疾病治療活性的化合物或物質。

在一些實施方案中，該具有代謝性疾病治療活性的化合物或物質選自以下中的一種或多種：葡萄糖依賴性促胰島素肽(GIP)、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)受體激動劑、胰島素、腸高血糖素、神經肽Y5受體拮抗劑、乙醯輔酶A羧化酶抑制劑、瘦素(Leptin)受體激動劑、格列奈、α-葡萄糖苷酶抑制劑(AGi)、噻唑烷二酮(TZD)、二肽基肽酶-4抑制劑類(DPP-IV)、鈉葡萄糖協同轉運蛋白2抑制劑(SGLT-2)、法尼醇X受體(FXR)激動劑和肥胖抑制素(Obestatin)。

本揭露的醫藥組成物可以藉由胃腸外給藥，用注射器(視需要的筆型注射器)，藉由皮下、肌內、腹膜內或靜脈內注射進行。或者，胃腸外給藥可以用輸注泵進行。另外的選擇是組成物可以是經鼻或肺噴霧的形式給予胰高血糖素肽的溶液劑或混懸劑；或者，其可以是透皮給藥例，如藉由無針注射或由貼劑、視需要的離子導入貼劑；或者，其可以是經黏膜(例如口腔)給藥。

試劑盒(或藥盒)

本揭露還提供了一種藥盒，該藥盒包括本揭露的胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物或包含其的醫藥組成物和施用裝置。

在一些實施方案中，該裝置包含注射器和針。在一些具體實施方案中，該裝置是預充針。

在一些實施方案中，本揭露的胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物或包含其的醫藥組成物於預充針中。

預防、治療疾病或病症的方法和製藥用途

本揭露還提供了上述胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物，和/或上述醫藥組成物在製備用於預防、治療疾病或病症的藥物中的用途。

本揭露還提供上述胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物，和/或上述醫藥組成物，其用於預防、治療疾病或病症。

本揭露還提供了預防、治療疾病或病症方法，其包括向有其需要的對象施用治療有效量的本揭露的胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物，和/或施用治療有效量的本揭露的醫藥組成物。

在一些實施方案中，該疾病或病症選自低血糖、高血糖症、2型糖尿病、1型糖尿病、冠心病、動脈粥樣硬化、β-受體阻滯劑中毒、胰島素瘤和馮吉爾克病；該病症或病症選自葡萄糖耐量減低、血脂異常、高血壓、體重超重、暴食症、肝脂肪變性、肥胖。

在一些實施方案中，該低血糖選自病理性低血糖或非病理性低血糖。

在一些實施方案中，該低血糖選自糖尿病性低血糖、非糖尿病性低血糖、空腹低血糖、藥物誘發性低血糖、急性胰島素誘發低血糖、胃旁路術誘發性低血糖、酒精誘發性低血糖、反應性低血糖和妊娠期低血糖。

在一些實施方案中，提供了一種迅速增加葡萄糖水平、使血糖水平正常、使血糖水平穩定、或者預防或治療低血糖的方法，其包括向有需要的對象施用有效量的本揭露的胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物或包含其的醫藥組成物。

在一些實施方案中，提供了一種減少體重增加或引起體重下降的方法，其包括向有需要的對象施用有效量的本揭露的胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物或包含其的醫藥組成物。減少體重增加或引起體重下降的方法預期可用於治療各種起因的肥胖，包括藥物誘導的肥胖，並減少與肥胖相關的併發症，包括血管疾病(例如冠狀動脈疾病、中風、周圍血管疾病、缺血性再灌注等)、高血壓、II型糖尿病、高脂血症和骨骼肌疾病。本揭露提供相應胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物或包含其的醫藥組成物用於製備預防、治療、緩解肥胖的藥物的製藥用途。

在一些實施方案中，提供了一種治療高血糖症或糖尿病的方法，其包括聯合施用胰島素與本揭露的胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物或包含其的醫藥組成物。聯合施用胰島素(例如基礎、速效或長效胰島素)和本揭露的胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物或包含其的醫藥組成物，能夠減少夜間低血糖和/或緩衝胰島素的使血糖過低的效應。本揭露提供相應胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物或包含其的醫藥組成物用於製備預防、治療、緩解高血糖症或糖尿病的製藥用途。

在一些實施方案中，上述方法是用於人受試者的，上述製藥用途是用於人受試者的藥物的製備用途。

圖1為藉由ThT原纖維形成測定法評價胰高血糖素類似物的物理穩定性的結果。

圖2為正常血糖大鼠模型中胰高血糖素類似物40和Dasiglucagon的藥效結果。

圖3為低血糖大鼠模型中胰高血糖素類似物40和Dasiglucagon的藥效結果。

圖4A為Dasiglucagon的溶血性檢查結果；圖4B為胰高血糖素類似物40的溶血性檢查結果。

圖5A和圖5B分別為胰高血糖素類似物40和Dasiglucagon在人肝微粒體中、人腎微粒體中的穩定性結果。

圖6為胰高血糖素類似物40和Dasiglucagon經皮下或靜脈注射給藥後的藥時曲線結果。

定義

為了更容易理解本揭露，以下具體定義了某些技術和科學術語。除顯而易見在本揭露中的它處另有明確定義，否則本揭露使用的所有其它技術和科學術語都具有本揭露所屬技術領域具有通常知識者通常理解的含義。

術語“胰高血糖素類似物”是指具有天然胰高血糖素對胰高血糖素受體的至少一部分、全部、或更高的激動劑活性的化合物。例如胰高血糖素類似物包括但不限於：在SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列基礎上包含任意胺基酸替換、添加或刪除，或包含翻譯後修飾或其他化學修飾的多肽，前提是該類似物具有刺激胰高血糖素受體的活性，例如使用實施例2描述的測定法藉由cAMP的產生來測定的。

本揭露中，胰高血糖素類似物也包括具有修飾的胺基末端和/或羧基末端的肽。例如，包含以醯胺基團取代末端羧酸的肽。例如，本揭露的胰高血糖素類似物可以在序列的胺基端(N-端)引入“H-”部分，在序列的羧基端(C-端)引入“-OH”部分或“-NH₂”部分。在這種情況下，除非另有說明，否則所討論序列N端的“H-”部分表示氫原子[即，在式(I)中，R₁=氫=H；相當於在N端存在游離第一胺基或第二胺基]，而序列C端的“-OH”或“-NH₂”部分分別表示羥基[例如，在式(I)中，R₂=OH；相當於在C端存在羧基(COOH)]或胺基[例如，在式(I)中，R₂=NH₂；相當於在C端存在醯胺基(CONH₂)]。在本揭露的每一個序列中，C端“-OH”部分可以替換成C端的“-NH₂”，反之亦然。

“天然胰高血糖素”是指具有以下序列的天然人胰高血糖素：

H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH(SEQ ID NO：51)。

“Dasiglucagon”特指由西蘭製藥公司(Zealand Pharma)開發的胰高血糖素類似物，其胺基酸序列為：H-HSQGTFTSDYSKYLDAibARAEEFVKWLEST-OH(SEQ ID NO：52)。

本揭露中，如果沒有進一步解釋，術語“GLP-1”是指人GLP-1(7-36或7-37)；術語“GIP”是指人GIP(1-42)。

本揭露所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。除非明確說明，否則本揭露中所有胺基酸殘基的構型為L-型。另外，Aib是2-胺基異丁酸(又稱α-胺基異丁酸)，α-甲基-Ser(α-甲基絲胺酸)是α位H被甲基取代的絲胺酸，pGlu是焦谷胺酸。

“天然胺基酸”是指20種常規胺基酸(即丙胺酸(A)，半胱胺酸(C)，天冬胺酸(D)，谷胺酸(E)，苯丙胺酸(F)，甘胺酸(G)，組胺酸(H)，異亮胺酸(I)，賴胺酸(K)，亮胺酸(L)，甲硫胺酸(M)，天冬醯胺(N)，脯胺酸(P)，穀胺醯胺(Q)，精胺酸(R)，絲胺酸(S)，蘇胺酸(T)，纈胺酸(V)，色胺酸(W)和酪胺酸(Y)。

“非天然胺基酸”是指不是天然編碼的或不在任何生物體的遺傳密碼中發現的胺基酸。它們可以是例如純化學合成的化合物。非天然胺基酸的實例包括但不限於：羥基脯胺酸，γ-羧基谷胺酸，O-磷酸絲胺酸，氮雜環丁烷羧酸，2-胺基己二酸，3-胺基己二酸，β-丙胺酸，胺基丙酸，2-胺基丁酸，4-胺基丁酸，6-胺基己酸，2-胺基庚酸，2-胺基異丁酸(Aib)，3-胺基異丁酸，2-胺基庚二酸，第三丁基甘胺酸，2,4-二胺基異丁酸(Dap)，鎖鏈素(desmosine)，2，2'-二胺基庚二酸，2,3-二胺基丙酸(Dab)，N-乙基甘胺酸，N-甲基甘胺酸，N-乙基天冬醯胺，高脯胺酸，羥基賴胺酸，別羥基賴胺酸(allo-hydroxylysine)，3-羥基脯胺酸，4-羥基脯胺酸，異鎖鏈素(isodesmosine)，別異亮胺酸，N-甲基丙胺酸，N-甲基甘胺酸，N-甲基異亮胺酸，N-甲基戊基甘胺酸，N-甲基纈胺酸，萘基丙胺酸(naphthalanine)，正纈胺酸，正亮胺酸(Nle)，鳥胺酸(Orn)，D-鳥胺酸，D-精胺酸，對胺基苯丙胺酸，戊基甘胺酸，哌啶酸(pipecolic acid)和硫代脯胺酸。此外，“非天然胺基酸”還包括在天然胺基酸或非天然胺基酸的C-末端羧基，N-末端胺基和/或其側鏈官能團上經化學修飾所得的化合物。

術語“激動劑”定義為激活所討論的受體類型的物質或配體。例如，本揭露上下文中使用的術語GLP-1或GIP或胰高血糖素(受體)激動劑指可以激活GLP-1受體或GIP受體或胰高血糖素受體的物質或配體。

術語“可藥用鹽”是指對待治療的患者或對象無害的鹽。這樣的鹽通常是酸加成鹽或鹼式鹽。

術語“溶劑化物”是指由限定化學計量的溶質(在這種情況下為本揭露的胰高血糖素類似物或者其可藥用鹽)和溶劑形成的複合物。

術語“醫藥組成物”表示含有一種或多種本揭露的胰高血糖素類似物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。

術語“可藥用載體”包括任何標準藥用載體或稀釋劑，例如用於適於經口、肺、直腸、鼻、局部、皮下、肌內、靜脈內、腹膜內、皮內、透皮或陰道內施用的組成物或製劑中使用的那些。

術語“治療”是指用於獲得有益的或期望的臨床結果的方法。就本揭露目的而言，有益的或期望的臨床結果包括但不限於緩解病症、減輕疾病程度、穩定(即，不惡化)疾病狀態、延遲或減緩疾病發展、改善或緩和疾病狀態以及(部分或全部地)消除(remission)，無論是可檢出的還是不可檢出的。“治療”還可以指與未接受治療時的預期存活相比延長存活期。“治療”是以防止疾病發生或改變疾病病理狀況為目的而進行的介入。因此，“治療”是指治療性處理和預防性或防護性手段二者。如在預防性或防護性手段的上下文中使用的，化合物未必完全防止疾病或病症發生。需要治療的對象包括已經患病或需要預防疾病發生的對象。“治療”也指與不進行治療的情況相比抑制或減少病理狀況或症狀(例如，體重增加或低血糖)的增加，並且不暗示相關病症的完全終止。

術語“有效量”或“治療有效量”是指足以治癒、緩解、或部分阻止、或者以其他方式促進給定病症(紊亂、疾病)或損傷以及較佳地由它們引起的併發症的治癒或康復的量或劑量。對於特定目的有效的量或劑量取決於疾病或病症的嚴重程度以及待治療對象或患者的體重和總體狀況。合適的量或劑量的確定在經過訓練的一般技術的醫生(或獸醫)的能力範圍之內。

術語“對象”可與“患者”、“個體”、“受試者”等互換使用，並且均指人或非人動物，包括但不限於哺乳動物，例如人、靈長類動物、家畜動物(例如，牛、豬)、寵物(例如，狗、貓)和齧齒類動物(例如，小鼠和大鼠)。

實施例

以下結合實施例進一步描述本揭露，但這些實施例並非限制著本揭露的範圍。本揭露實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如常規多肽Fmoc固相合成法手冊，冷泉港的抗體技術實驗手冊，分子選殖手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。

本揭露主要實驗試劑(來源)：Fmoc-Thr(tBu)-Wang樹脂(吉爾生化)，HCTU(昊帆生物)，Fmoc-Aib-OH(吉爾生化)，氮，氮-二甲基甲醯胺(國藥)，二氯甲烷(國藥)，三氟乙酸(TCI Chemicals)，三異丙基矽烷(TCI Chemicals)，乙腈(Merck-Millipore)，二異丙基乙胺(Sigma)，4-甲基哌啶(TCI Chemicals)，甲基第三丁基醚(TCI Chemicals)，4-甲基嗎啉(TCI Chemicals)，Fmoc-Nle-OH(吉爾生化)。DMEM/F12(Gibco 11330032)，酪蛋白(Casein)，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(Sigma I7018-250MG)，cAMP-Gs Dynamic kit(Cisbio 62AM4PEC，20000個測試)，384孔板(Sigma CLS4514-50EA)，96V型底板(PS)(Axygen WIPP02280)，96孔板(Cisbio 66PL96100)，Countess® Cell Counting Chamber Slides(Invitrogen C10228)，Cisbio-cAMP-Gs Dynamic試劑盒(Cisbio 62AM4PEC)，0.25%胰蛋白酶-EDTA和Phenol Red(ThermoFisher 25200-114)，胎牛血清(Gibco^TM,ThermoFisher 10099-141)，人胰高血糖素(Abmole M9312)。

本揭露主要實驗儀器(來源)：H-CLASS分析型超高效液相色譜(WATERS)，Agilent 1290-6530超高效液相色譜-質譜儀(Agilent Technologies)，Prep-150製備型高效液相色譜(WATERS)，Prelude-X 多通道多肽固相合成儀(Protein Technologies)，酶標儀(BioTek H1MFD；Tecan-Infinite F Plex)。

實施例1. 胰高血糖素類似物的合成

本實施例設計並按照以下方法合成了表1的化合物。

1.化合物1的化學合成

1.1 多肽骨架的合成

稱取0.1mmol固相合成載體Fmoc-Thr(tBu)-Wang樹脂置於一次性聚丙烯多肽合成固相反應管中，加入DMF(10mL)溶脹樹脂10分鐘，真空抽掉DMF，加入DMF(10mL)洗滌樹脂，重複洗滌2次。使用Prelude-X全自動多肽合成儀完成多肽骨架的合成，其中醯胺鍵縮合使用10倍過量，相應的Fmoc-保護胺基酸，用HCTU/4-甲基嗎啉活化後在室溫下反應30分鐘進行胺基酸的縮合。Fmoc基團脫保護使用含20% 4-甲基哌啶的N,N-二甲基甲醯胺溶液在室溫下反應2次，每次10分鐘。此外，對於Aib旁N-端胺基酸的縮合，需要在室溫下進行二次乃至三次縮合，縮合時間每次30-60分鐘，這對改善粗品肽的純度至關重要。

1.2 樹脂肽的裂解

上述步驟得到的樹脂肽依次用DMF，DCM洗滌3次後進行真空乾燥，後加入新鮮配製的裂解液10mL(三氟乙酸：三異丙基矽烷：水=90：5：5，v：v：v)在室溫下振盪反應3小時。反應結束後過濾，用三氟乙酸洗滌樹脂2次，合併濾液後加入大量冷凍甲基第三丁基醚析出固體，離心後除去上清液並得到化合物1的多肽粗品。

1.3 粗品肽的反相液相色譜純化

將粗品肽溶於含有0.1%(v/v)三氟乙酸，20%(v/v)乙腈/水的混合溶劑中，經過0.22μm膜過濾後用WATERS Prep150 LC反相高效液相色譜系統進行分離，流動相為A(0.1%三氟乙酸，10%乙腈，水溶液，v/v)和B(0.1%三氟乙酸，90%乙腈，水溶液，v/v)。其中，色譜管柱為X-SELECT OBD C-18(WATERS)反相色譜管柱，純化過程中色譜儀檢測波長設定為220nm，流速為20mL/min。收集產物相關餾分凍乾後得到化合物編號1的多肽純品，收率20%。多肽純品藉由分析性高效液相色譜和液相色譜/質譜聯用確定純度及化合物身份，其中純度=96.09%，且分子量正確。

2.化合物2-49的化學合成

採用化合物1的實驗方案合成本揭露化合物2-49的多肽化合物，並用分析型超高效液相色譜和液相色譜/質譜聯用確定純度和化合物分子量，其中化合物分子量正確，純度如表2。

以下實施例對實施例1合成的胰高血糖素類似物進行了生物學測試評價。

實施例2. 胰高血糖素類似物對胰高血糖素受體(GCGR)、胰高血糖素樣肽-1受體(GLP-1R)和葡萄糖依賴性促胰島素分泌多肽受體(GIPR)的激動劑活性評估

1.實驗目的

測定本揭露的胰高血糖素類似物對人胰高血糖素受體(GCGR)、胰高血糖素樣肽-1受體(GLP-1R)和葡萄糖依賴性促胰島素分泌多肽受體(GIPR)的激動劑活性。相關化合物對GCGR的活化將刺激細胞環磷酸腺苷(cAMP)的形成。因此，可使用合適的表達受體的細胞中cAMP的產生來監測受體活性。

2.實驗方法

對GCGR的激動劑活性檢測：從液氮罐中取出凍存的CHO-K1/GCGR/CRE-Luc穩轉細胞株，放於37℃水浴鍋中快速融化，用DMEM/F12培養基(Sigma Cat#D8437)重新懸浮，離心後將細胞接種至T75培養瓶中，細胞至少傳代一次之後，再用於後續測試。測試前，胰酶消化細胞，離心後清洗一遍細胞，使用不含血清DMEM/F12培養基重新懸浮細胞，調整細胞密度，以2,500個細胞/5μL/孔的密度鋪於96孔板；配製Cisbio-cAMP-Gs Dynamic試劑盒中的1×緩衝液，添加IBMX至終濃度為0.5mM；每孔加入5μL緩衝液梯度稀釋的多肽，輕震混勻，37℃靜置孵育30分鐘；將cAMP-d2和Anti-cAMP-Eu³⁺-Cryptate分別用cAMP Lysis & Detection buffer稀釋20倍混勻，每孔加入5μL稀釋後的cAMP-d2溶液，再加入5μL稀釋後的Anti-cAMP-Eu³⁺-Cryptate溶液，輕震混勻，室溫避光靜置孵育1小時。

對GLP-1R的激動劑活性檢測：與上述對GCGR的激動劑活性檢測方法不同在於，使用的是CHO-GLP-1R穩轉細胞株。

對GIPR的激動劑活性檢測：與上述對GCGR的激動劑活性檢測方法不同在於，使用的是CHO-K1/GIPR穩轉細胞株，細胞密度是3,000個細胞/5μL/孔。

3.實驗結果

使用Tecan-Infinite F Plex酶標儀讀取HTRF的信號，激發波長為320nm，發射波長為620nm和665nm。計算信號比值(665nm/620nm*10,000)，將其與樣品濃度使用四參數方程非線性擬合，得出EC₅₀值，見表3和表4。

表3結果顯示，本揭露的胰高血糖素類似物對人GCGR的激動劑活性顯著優於Dasiglucagon。表4結果顯示，與天然胰高血糖素相比，本揭露的胰高血糖素類似物對GLP-1R和GIPR的激動劑活性極低，可以忽略，即本揭露的胰高血糖素類似物對GCGR有良好的特異性。

實施例3. 胰高血糖素類似物在生理條件緩衝液中的溶解度評估

1.實驗目的

天然胰高血糖素直接作為治療劑的使用受到限制，是因為其在中性pH 7.4條件下溶解度遠低於1mg/mL。本實施例的目的是評估本揭露胰高血糖素類似物在中性pH緩衝液中的溶解度，期望與天然胰高血糖素相比具有更高的溶解度。

2.實驗方法

在pH 7.4的磷酸鹽緩衝液中製備部分本揭露胰高血糖素類似物的飽和溶液，室溫超聲5min後，離心(10000g，5min)，吸取上清液並確保無可見沉澱。測量溶液在280nm的吸光度(Abs_λ=280nm)，基於胰高血糖素類似物序列中色胺酸和酪胺酸的含量計算多肽在280nm處的莫耳吸光係數(ε=8250M^-1cm^-1)，依據比爾定律計算各測試胰高血糖素類似物在中性pH緩衝液中的最大溶解度。

3.實驗結果

本揭露的多種胰高血糖素類似物相比天然的胰高血糖素具有顯著提升的溶解度，見表5。比較化合物2至化合物5發現，在第17位包含Aib的化合物3比在18位包含Aib的化合物4具有提升的溶解度；在第17位包含Aib的化合物3比在16或19位包含α-甲基-Ser的化合物2和化合物4具有提升的溶解度。可見胰高血糖素類似物在第17位包含Aib對提升多肽溶解度有重要作用。

實施例4. 胰高血糖素類似物的物理穩定性和化學穩定性評估

天然的胰高血糖素在溶液中的物理和化學穩定性極差。天然胰高血糖素水溶液會在數小時至數天內形成凝膠或者纖維狀沉澱，並且在多肽濃度較高、外界擾動及含鹽情況下更容易凝膠化。此外，天然胰高血糖素的化學不穩定性主要是由於其序列發生異構化(天冬胺酸殘基)、脫醯胺化(天冬醯胺、穀胺醯胺殘基)及氧化(甲硫胺酸殘基)等導致。

1.實驗目的

本實施例的目的是評估本揭露胰高血糖素類似物在溶液中的物理穩定性和化學穩定性。

2.物理穩定性評估實驗方法

本實驗藉由Thioflavin-T(ThT)螢光測試方法監測原纖維形成。將凍乾後的胰高血糖素類似物溶解於0.1N HCl水溶液，濃度1mg/mL。多肽溶液在恆溫振盪器上孵育120h(37℃，300rmp)並分別於24h、48h及120h檢測溶液原纖維含量。ThT螢光測試中，準確稱取8mg ThT粉末溶於50mL PBS緩衝液(1×)，經過0.22μm濾膜過濾後避光保存於4℃備用。使用時用PBS緩衝液(1×)進行1：500的比例稀釋配製成工作溶液，在96孔板中每個孔中分別加入100μL工作溶液及5μL待測多肽溶液，混勻後室溫孵育20-30min，使用Tecan-Infinite F Plex酶標儀讀取ThT螢光信號，激發波長為450nm，發射波長為482nm，每個多肽的測試包含四次生物學重複。

3.化學穩定性評估實驗方法

將胰高血糖素類似物凍乾粉末溶於磷酸鹽緩衝液(10mM磷酸二氫鈉，15mg/mL丙二醇，0.01%吐溫-80，pH 7.4)至終濃度1mg/mL(藉由測量溶液在280nm的吸光度確定)，將樣品置於玻璃瓶中並在4℃和25℃下孵育30天。在第0天、7天、14天、21天和28天取樣後利用超高效液相色譜檢測樣品純度和降解產物，色譜使用C-18反相色譜管柱，UV=214nm。化合物純度定義為各色譜圖中主峰相對於所有整合峰的總面積的面積百分比，以給定多肽不同時間的純度參照第0天樣品的純度進行歸一化。

4.實驗結果

藉由以上實驗方法，部分本揭露胰高血糖素類似物在水溶液中的物理穩定性如圖1所示，在磷酸鹽緩衝液中的化學穩定性如表6所示。

藉由研究發現，本揭露的胰高血糖素類似物與天然胰高血糖素(Glucagon)相比展現出優異的物理穩定性和化學穩定性；其中化合物40在磷酸鹽緩衝液中的化學穩定性比Dasiglucagon更優。

實施例5. 胰高血糖素類似物在正常血糖大鼠模型體內的藥效評估

1.實驗目的

本實施例是為對比評估本揭露中的胰高血糖素類似物40、天然胰高血糖素(Glucagon)和Dasiglucagon在正常大鼠模型體內的升血糖藥效。

2.實驗方法

7-8週齡的雄性SD大鼠(Sprague-Dawley rats)適應性飼養一週。根據體重分組，分組後確保每組大鼠的平均體重和標準差相似。實驗前4小時及實驗過程中禁食，正常給水。完成禁食4小時後，實驗組大鼠分別單次皮下給予0.5nmol/kg、2nmol/kg、6nmol/kg的胰高血糖素類似物40或2nmol/kg的天然胰高血糖素或2nmol/kg的Dasiglucagon，對照組大鼠皮下給予與配置胰高血糖素類似物相同的磷酸鹽緩衝液。給藥前尾部採血測定T0點血糖，之後分別在15min、30min、45min、60min、75min、90min、105min、120min測定大鼠血糖。

3.實驗結果

胰高血糖素類似物40提升大鼠血糖水平呈現劑量依賴性，與天然胰高血糖素、Dasiglucagon都呈現短時起效的特點，但相同劑量下的胰高血糖素類似物40升糖水平更高，具體結果見圖2和表7。

4.實驗結論

結果顯示，經皮下注射給藥後，胰高血糖素類似物40、天然胰高血糖素(Glucagon)和Dasiglucagon均能快速地提高大鼠的血糖水平。0.5nmol/kg劑量的胰高血糖素類似物40與2nmol/kg劑量的Dasiglucagon對血糖提升的效果相近，且同等劑量下(2nmol/kg)，胰高血糖素類似物40的藥效明顯好於Dasiglucagon。

在正常血糖大鼠模型中，與Dasiglucagon相比，同等劑量條件下本揭露中的胰高血糖素類似物40升糖水平更高，藥效更好。

實施例6. 胰高血糖素類似物在低血糖大鼠模型體內的藥效評估

藉由皮下注射胰島素誘導大鼠出現低血糖症狀，模擬人發生低血糖場景，再皮下給予胰高血糖素類似物治療，使血糖快速恢復至正常水平。

1.實驗目的

對比Dasiglucagon，評估本揭露中的胰高血糖素類似物40在低血糖大鼠模型體內的藥效。

2.實驗方法

7-8週齡的雄性SD大鼠(Sprague-Dawley rats)適應性飼養一週。根據血糖分組，分組後確保每組大鼠的平均血糖和標準差相似。實驗前4小時及實驗過程中禁食，正常給水。完成禁食4小時後，尾部採血測定T0點血糖，造模組大鼠立即皮下注射0.65IU/kg胰島素，非造模組大鼠皮下注射相同體積的生理鹽水。之後在15min，30min，45min測定血糖。在45min時，造模組大鼠分別單次皮下給予6nmol/kg、12nmol/kg、20nmol/kg的胰高血糖素類似物40或12nmol/kg的Dasiglucagon，對照組大鼠和非造模組大鼠皮下給予與配置胰高血糖素類似物40相同的磷酸鹽緩衝液。之後繼續在60min、75min、90min、105min、120min、150min、180min測定大鼠血糖。

3.實驗結果

胰島素處理後，在大鼠血糖最低點給予本揭露中的胰高血糖素類似物40治療，能迅速恢復大鼠血糖且呈現劑量依賴性，雖然本揭露的胰高血糖素類似物40與Dasiglucagon都呈現短時起效的特點，但在相同劑量下本揭露中的胰高血糖素類似物40升糖水平更高，具體結果見圖3和表8。

4.實驗結論

結果顯示，在胰島素誘導低血糖大鼠模型中，經皮下注射給藥後，胰高血糖素類似物40、天然胰高血糖素(Glucagon)和Dasiglucagon均能在15分鐘內快速地恢復並提高大鼠的血糖水平。同等劑量下(12nmol/kg)，胰高血糖素類似物40對血糖的提升效果明顯優於Dasiglucagon，並且持續時間更長。

在胰島素誘導低血糖大鼠模型中，同等劑量條件下，胰高血糖素類似物40相比Dasiglucagon藥效更好。

實施例7. 胰高血糖素類似物的溶血性實驗評估

溶血指紅細胞膜被破壞，並且透明度增加呈深紅色的現象；某些藥物成分，輔料等含有溶血成分，可導致人體的溶血反應，引起局部腫脹，血液循環功能障礙等不良反應。根據紅細胞破裂釋放出來的血紅蛋白在可見光波段具有吸收的原理，將供試化合物溶液加入大鼠的紅細胞混懸液，孵育後用酶標儀測定吸光度值，評價溶血程度。

1.實驗目的

觀察胰高血糖素類似物40是否會引起溶血反應。

2.溶血性實驗方法

紅細胞混懸液的製備：取100μL新鮮大鼠全血，然後加入900μL 1×PBS溶液，置於平板搖床上，30rpm震搖5min，然後1000g離心5min，棄去上清液；重複以上清洗步驟，直到上清液不顯紅色為止，供測試用。

供試品溶液的製備：向供試品固體中加入適量1×PBS溶液，溶解得到標準儲備液，然後用1×PBS稀釋，得到濃度為1μg/mL、3μg/mL、10μg/mL、30μg/mL、100μg/mL和300μg/mL的供試品溶液。同時將空白1×PBS作為陰性對照，將含有0.1% Triton X-100(1μg/mL)的1×PBS溶液作為陽性對照。

孵育過程：加入500μL供試品溶液到紅細胞混懸液，平板搖床上，30rpm震搖5min，使其充分混勻，然後將混懸液在37℃下溫育1小時，然後1000g速度離心5min，取上清液100μL至酶標板單孔中，測定540nm處的吸光度。

3.實驗結果

溶血率(%)計算公式為(供試品吸光度-陰性對照吸光度)/(陽性對照吸光度-陰性對照吸光度)×100%。當結果小於5%，判斷無溶血性；當結果大於5%，判斷待測物有溶血性。

本揭露的胰高血糖素類似物的溶血性檢查結果如圖4A、圖4B和表9所示。結果顯示本揭露的胰高血糖素類似物40與Dasiglucagon，在1至300μg/mL濃度範圍內，溶血性檢查均符合規定要求，未發現顯著溶血副作用風險。

實施例8. 胰高血糖素類似物的人體肝、腎微粒體穩定性評估

肝臟和腎臟是人體最主要的代謝器官，富含一相和二相代謝酶，會影響藥物的代謝速度，對藥物的降解清除起重要作用，影響血藥濃度和半衰期。肝腎代謝常用的模型包括肝腎微粒體、S9組分、肝細胞、組織勻漿等。體外肝腎代謝穩定性是預測體內藥動和藥效學性質的主要指標之一。就肝腎微粒體模型而言，其採用從肝臟或腎臟提取的微粒體，加入還原型輔酶(NADPH)再生系統，模擬生理環境下代謝反應，評價測試化合物的體外代謝穩定性，可用於預測藥物的體內降解和清除速度。理想條件下，胰高血糖素類似物需要快速吸收和清除，在體內有相對快的降解速度，解救低血糖的同時，避免高血糖的毒副反應。

1.實驗目的

比較和評價胰高血糖素類似物在人的肝微粒體和腎微粒體體外代謝系統中的代謝穩定性。

2.人肝微粒、腎微粒體檢測實驗方法

溶液配置：稱取適量化合物純品，加入適量DMSO溶解分別得到Dasiglucagon和40的1mM供試溶液。

MgCl₂-PBS緩衝溶液配置：取200μL 200mM的PBS緩衝溶液，依次加入106μL H2O和40μL MgCl₂溶液(50mM)，渦旋混勻，得到MgCl₂-PBS緩衝溶液。

穩定性實驗過程：樣本分別按照以下方式進行處理，

(1)孵育系統準備

a)加入NADPH：取10μL 20mg/mL的肝微粒體和40μL 10mM NADPH溶液加入到孵育系統中，肝微粒體和NADPH的終濃度分別為0.5mg/mL和1mM；

b)不加NADPH：取10μL 20mg/mL的肝微粒體和40μL H₂O加入到孵育系統中。

(2)孵育反應系統中加入4μL 100μM的測試化合物溶液和陽性對照化合物(人肝微粒體採用維拉帕米(Verapamil)，人腎微粒體採用鹽酸苄達明)，孵育體系終濃度為1μM，孵育溫度為37℃；其中，維拉帕米和鹽酸苄達明分別為已知的肝代謝酶和腎代謝酶的受質(參見Pauli-Magnus C等，J Pharmacol Exp Ther.2000 May；293(2)：376-82.)，用於確證微粒體孵育系統的酶反應活性；

(3)分別在0min、15min、30min、60min和120min取樣50μL，加入4倍體積的含有內標和3%甲酸的乙腈溶液終止反應。樣本進一步經過3220g速度離心40min，取100μL上清液，加入等體積的H₂O混合均勻，進HPLC-MS/MS分析。

3.實驗結果：

本揭露中的胰高血糖素類似物人肝微粒體和腎微粒體的穩定性結果如圖5A、圖5B和表10、表11所示。

4.實驗結論

肝代謝方面，其一，Dasiglucagon和胰高血糖素類似物40在肝微粒體中代謝速度比腎微粒體中慢，代謝與NADPH無關。其二，胰高血糖素類似物40降解比Dasiglucagon稍快(體外T1/2：40為68.76min，Dasiglucagon為161.74min)。

腎代謝方面，其一，Dasiglucagon和胰高血糖素類似物40在腎微粒體中被代謝，但代謝與NADPH無關；其二，胰高血糖素類似物40降解比Dasiglucagon更快(體外T1/2：40為35.73min，Dasiglucagon為51.27min)。

總之，在肝腎微粒體孵育過程中，本揭露中的胰高血糖素類似物40比Dasiglucagon的代謝速度更快，因此體內更容易被清除，高血糖副反應的發生風險更低，更有利於糖尿病患者的血糖控制。

實施例9. 胰高血糖素類似物的大鼠體內藥物代謝動力學評估

動物藥物代謝動力學研究一般方法是採用臨床擬用的給藥途徑，給予動物一定劑量的測試化合物，然後採用HPLC、GC、HPLC-MS等分析儀器方法測定血液，尿液等生物基質中藥物濃度隨著時間的變化情況，從而瞭解該化合物在體內的動態變化規律，獲得血藥濃度-時間曲線測定，進而得到藥物的藥代動力學參數，闡明化合物的吸收，分佈，代謝和排泄過程和特點。

1.實驗目的

以雄性SD大鼠為受試動物，單次皮下注射給予Dasiglucagon和胰高血糖素類似物40，研究Dasiglucagon和胰高血糖素類似物40在SD大鼠體內(血漿)的藥物代謝動力學特徵。

2.實驗方法

(1)按照表12對動物分組，給藥前大鼠自由飲水和進食。

(2)採血

採樣時間：給藥前0min(predose)，給藥後2min、4min、7min、10min、20min、40min、1h和2h。從大鼠頸靜脈插管採血。

(3)樣本採集

1)每個時間點取0.2mL全血，轉移至含有EDTA-K2抗凝的離心管中；

2)血樣本在4℃下4000g速度離心5min，分離獲得血漿；

3)血漿樣本儲存在-80℃冷凍保存。

(4)生物樣本分析

樣本前處理方法：取100μL血漿樣本，加入300μL含有1ng/mL內標(維拉帕米)甲醇溶液，渦旋5min，低溫離心10min，取上清液100μL，加入100μL 0.1%甲酸水溶液，混合均勻，進儀器分析；

液相色譜和質譜分析：使用LC-30A液相色譜系統(日本島津公司)；API 5500型液相色譜-三重四級杆質譜聯用儀(Analyst Software數據處理系統，美國AB公司)。色譜管柱為nanomicro Unisil C18aq(4.6mm×150mm，5μm)色譜管柱；管柱溫40℃；流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸乙腈溶液；流速0.5mL/min；進樣量20μL；梯度條件如下表13所示。質譜採用電噴霧離子源(ESI)，正離子分析模式，多反應監測(MRM)掃描方式。

3.實驗結果

採用以上HPLC-MS/MS方法測定血漿中各待測物的血藥濃度，繪製血藥濃度時間曲線，並用PKSolver軟體計算藥動學參數。藉由以上實驗方法，本揭露的胰高血糖素類似物的藥物代謝動力學(PK)參數如表14和圖6所示。

4.實驗結論

結果顯示，經皮下注射給藥後，胰高血糖素類似物40的T1/2明顯短於Dasiglucagon(40的T_1/2為0.41h，Dasiglucagon的T_1/2為0.51h)，說明胰高血糖素類似物40的清除速度更快；胰高血糖素類似物40的T_max也短於Dasiglucagon(40的T_max為0.117h，Dasiglucagon的T_max為0.167h)，說明胰高血糖素類似物40的吸收速度要明顯比Dasiglucagon更快。

總之，與Dasiglucagon相比，胰高血糖素類似物40能夠更快地吸收起效和更迅速的清除，具有更優的藥物代謝動力學特性。

Claims

一種胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物，其是式(I)結構所示：

R₁-His-Ser-X₃-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-X₁₅-X₁₆-X₁₇-Arg-Ala-X₂₀-X₂₁-Phe-Val-X₂₄-Trp-Leu-X₂₇-X₂₈-Thr-R₂ (I)

其中，

R₁是氫、C_1-4烷基、乙醯基、甲醯基、苯甲醯基、三氟乙醯基或pGlu；

R₂是-OH或-NH₂；

X₃、X₁₅、X₁₆、X₂₀、X₂₁、X₂₄、X₂₇和X₂₈相互獨立地選自任意天然胺基酸殘基或非天然胺基酸殘基；X₁₇是Aib。
如請求項1所述的胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物，其中，

X₃選自His、Dap(Ac)或Gln；

X₁₅選自Asp或Glu；

X₁₆選自Ser、Thr、Leu、Val、Ile或α-甲基-Ser；

X₂₀選自Ala、Gln、Glu、Ser、Thr或Lys；

X₂₁選自Asp或Glu；

X₂₄選自Ala、Gln、Ser、Glu、α-甲基-Ser或Arg；

X₂₇選自Met、Glu、Nle、Leu或Ser；

X₂₈選自Asn、Glu或Ser。
如請求項1或2所述的胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物，其中，

X₁₅是Asp；

X₁₆選自Thr、Leu、Val或Ile。
如請求項1至3中任一項所述的胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物，其中，X₂₀是Gln。
如請求項1至4中任一項所述的胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物，其中，X₂₄選自Gln或Glu。
如請求項1至4中任一項所述的胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物，其中，X₂₇是Glu；X₂₈是Ser。
如請求項1至6中任一項所述的胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物，其中，

X₃選自His或Gln；

X₁₅是Asp；

X₁₆選自Thr、Leu、Val或Ile；

X₁₇是Aib；

X₂₀是Gln；

X₂₁是Glu；

X₂₄選自Gln或Glu；

X₂₇是Glu；

X₂₈是Ser。
如請求項7所述的胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物，其中，

R₁是氫；R₂是-OH或-NH₂，較佳-OH。
如請求項1至8中任一項所述的胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物，其中該胰高血糖素類似物選自以下任一項的化合物：

H-HSQGTFTSDYSKYLDLAibRAQEFVQWLEST-OH(SEQ ID NO：40)；

H-HSQGTFTSDYSKYLDTAibRAQEFVQWLEST-OH(SEQ ID NO：39)；

H-HSQGTFTSDYSKYLDVAibRAQEFVQWLEST-OH(SEQ ID NO：41)；

H-HSQGTFTSDYSKYLDIAibRAQEFVQWLEST-OH(SEQ ID NO：42)；

H-HSHGTFTSDYSKYLDLAibRAQEFVQWLEST-OH(SEQ ID NO：43)；

H-HSHGTFTSDYSKYLDLAibRAQEFVEWLEST-OH(SEQ ID NO：47)。
一種醫藥組成物，其包含：

如請求項1至9中任一項所述的胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物，以及

一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、緩衝劑或賦形劑。
如請求項10所述的醫藥組成物，其進一步包括至少一種具有代謝性疾病治療活性的化合物。
如請求項11所述的醫藥組成物，其中該具有代謝性疾病治療活性的化合物選自以下中的一種或多種：葡萄糖依賴性促胰島素肽(GIP)、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)受體激動劑、胰島素、腸高血糖素、神經肽Y5受體拮抗劑、乙醯輔酶A羧化酶抑制劑、瘦素(Leptin)受體激動劑、格列奈、α-葡萄糖苷酶抑制劑(AGi)、噻唑烷二酮(TZD)、二肽基肽酶-4抑制劑類(DPP-IV)、鈉葡萄糖協同轉運蛋白2抑制劑(SGLT-2)、法尼醇X受體(FXR)激動劑和肥胖抑制素(Obestatin)。
一種如請求項1至9中任一項所述的胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物或如請求項10至12中任一項所述的醫藥組成物在製備用於治療疾病或病症的藥物中的用途；

較佳地，該疾病或病症選自低血糖、高血糖症、2型糖尿病、1型糖尿病、冠心病、動脈粥樣硬化、β-受體阻滯劑中毒、胰島素瘤、馮吉爾克病、葡萄糖耐量減低、血脂異常、高血壓、體重超重、暴食症和肝脂肪變性。
如請求項13所述的用途，其中該低血糖是病理性低血糖或非病理性低血糖。
如請求項13所述的用途，其中該低血糖選自糖尿病性低血糖、非糖尿病性低血糖、空腹低血糖、藥物誘發性低血糖、急性胰島素誘發低血糖、胃旁路術誘發性低血糖、酒精誘發性低血糖、反應性低血糖和妊娠期低血糖。
一種製備如請求項1至9中任一項所述的胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物的方法，其包括採用固相合成、液相合成或細胞重組表達的方法製備該胰高血糖素類似物或其可藥用鹽和/或溶劑化物。