DE3428942A1 - (nle(pfeil hoch)8(pfeil hoch), nle(pfeil hoch)1(pfeil hoch)(pfeil hoch)8(pfeil hoch), tyr(pfeil hoch)3(pfeil hoch)(pfeil hoch)4(pfeil hoch))-h-tph(1-34)nh(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)-peptidderivate - Google Patents

Description

Beschreibung

Die Erfindung betrifft neue, humane, parathyroide Hormon-

(h-PTD)-Peptidderivate. Sie betrifft insbesondere [Nie⁸, Nie¹⁰, Tyr^]-h-PTH(1-34)NH₂ und [Nie , Nie^löJh-PTH-(1-34)-NHp, welche für die Behandlung von Hypoparathyreoidismus oder Krankheiten, bei denen PTH beteiligt ist, nützliche Arzneimittel sind. Die Verbindungen werden durch die folgende Formel

, * 2 S 4 S 6

H -S er -VaI -Ser -GIu - He -Gin

7 8 9 10 11 12

— L eu — N Ie — H is — A sn — Leu- G Iy

13 14 15 16 17 18

— L y s —His —Leu — Asn— Ser —Nie

19 20 2 1 22 23 Zd

-GIu -Arg -VaI -Glu-Trp-Leu

25 24 27 28 2? 30

— Arg —Lys —Lys —Leu —Gin —Asp

31 32 33 34

-VaI -His-Asn- _A-NH₂ C I ]

dargestellt, worin A für Tyr oder Phe steht, oder eines ihrer Salze.

Die Erfindung betrifft weiterhin eine mit Jod-125 markierte, radioaktive Verbindung des Peptids [i], worin A für Tyr steht, welches für die Diagnostik der Funktion der Nebenschilddrüse nützlich ist.

Das humane Nebenschilddrüsenhormon ist ein Peptidhormon, welches aus 84 Aminosäuren besteht. Seine biologische Aktivität wird durch den 34-Aminosäurerest seines N-endständigen Restes, nämlich h-PTH(i-34) bestimmt [Proc. Nat.Acad.Sci., U.S.A., 68, 63-67 (1971)]. Jedoch ist h-PTH, bedingt durch das vorhandene L-Methionin (Met), instabil und verliert seine Hormonaktivität, wenn es mit Jod-125 markiert ist [Recent Prog.Hormone Res., Ί§.> 295 (1962)].

Zur Beseitigung dieses Nachteils wurden h-PTH-Peptidderivate mit PTH-Aktivität, wie [Nie⁸, Nle¹⁸]h-PTH (JA-OS. 55-113753) und h-PTH(1-34)NH₂ (JA-OS 58-96052), in dem das L-Methionin in der 8- und 18-Stellung durch L-Norleucin substituiert ist, synthetisiert. Jedoch ist die PTH-Aktivität von [Nie⁸, Nle¹⁸]-h-(PTH(1-34) ungefähr gleich, jedoch nicht höher als von natürlichem h-PTH, und h-PTH(i-34) ist ebenfalls bei der Oxidation instabil, bedingt durch die Anwesenheit von Methionin in seinem Molekül.

Die Anmelderin hat h-PTH-Peptidderivate mit höherer Aktivität und Stabilität untersucht. Es wurde gefunden, daß das obige Peptid [i], nämlich [Nie⁸, Nie¹⁸, Tyr³⁴]-h-PTH(1-34)NH₂ und [Nie⁸, Nie¹⁸]-h-PTH(1-34)NH₂, nicht nur eine stärkere Affinität für PTH-Rezeptoren, verglichen mit dem bekannten h-PTH(i-34) und [Nie⁸, Nle¹⁸]-h-PTH(i-34), und eine ungefähr 1,5- bis 2fach stärkere Aktivität aufweist, sondern ebenfalls die Immunaktivität und -Stabilität besitzt. Die erfindungsgemäße Verbindung der Formel [i] ist ein nützliches Arzneimittel für die Behandlung von Hypoparathyreoidismus oder PTH-beteiligten Knochenkrankheiten.

Nach dem bekannten Assayverfahren für h-PTH, bei dem ein Peptidfragment mit h-PTH-Aktivität analysiert wird, wurde ein spezifischer Antikörper gegen das Antigen von h-PTH(I-34) hergestellt. Wie jedoch oben erwähnt wurde, besteht der Nachteil, daß h-PTH(1-34) instabil ist, bedingt durch die Anwesenheit von L-Methionin, und wenn es daher mit Jod-125 markiert wird, wird das Methionin in den 8- und 18-Stellungen oxidiert und verliert seine Hormonaktivität. Es wurde dann ein h-PTH-Derivat mit PTH-Aktivität, Immunaktivität gegenüber Anti-PTH-Antigen, stabiler Hormonaktivität bei der Markierung mit Jod-125

und stabiler Radioaktivität, d.h. [Nie⁸, Nie¹⁸, Tyr³⁴]-h-PTH(i-34), hergestellt, worin Methionin in den 8- und 18-Stellungen durch L-Norleucin ersetzt ist und L-Phenylalanin in der 34-Stellung durch L-Tyrosin ersetzt ist (JA-OS 55-113753). Dieses Peptid verliert seine Aktivität bei der Markierung mit Jod-125 nicht, da es kein Methionin in seinem Molekül enthält, jedoch ist seine Hormonaktivität nur ungefähr gleich derjenigen von natürlichem h-PTHd-34).

Es wurde gefunden, daß das erfindungsgemäße Peptid [i] [Nie⁸, Nie¹⁸, Tyr³⁴]-h-PTH(1-34)NH₂, worin A in dem obigen Peptid [i] Tyr bedeutet, seine PTH-Aktivität nicht verloren hat, eine 2fach höhere Radioaktivität, vergli-

chen mit der von [Nie⁸, Nie¹⁸, Tyr³⁴]-h-PTH(1-34), besitzt und seine biologische Aktivität bei langer Lagerung nicht verliert und somit ein nützliches Peptid für die Markierung einer Verbindung für die Diagnose der Nebenschilddrüsenfunktion ist.

Das erfindungsgemäße Peptid [i] kann wie folgt synthetisiert werden. Eine Carboxylgruppe mit endständigem C von Tyrosyl oder Phenylalanyl wird in das Amid überführt, und eine geschützte Aminosäure und/oder ein niedriges Peptid wird gemäß der Flüssigkeits-Phasenkondensation in der Reihenfolge der Aminsäure-Sequenz der Formel [i] umgesetzt und dann wird die Schutzgruppe der N-endständigen Aminogruppe und der reaktiven Gruppe der Seitenketten bei der letzten Stufe der Reaktion durch Säurezersetzung abgespalten.

Die Kondensationsreaktion kann gemäß der an sich bekannten Peptidsynthese durch wiederholtes Anbringen und Entfernen der Schutzgruppen und Kondensation erfolgen. Die Schutzgruppen für die Synthese der Ausgangsmaterialien

oder Zwischenprodukte sind die üblichen Schutzgruppen für die Peptidsynthese und können leicht durch Hydrolyse, Säurezersetzung, Reduktion, Aminolyse oder Hydrazinolyse entfernt werden.

Beispielsweise kann die Aminogruppe in an sich bekannter Weise durch eine Acylgruppe, wie Forrayl, Trifluoracetyl, Phthaloyl, p-Toluolsulfonyl oder o-Nitrophenylsulfonyl; eine Benzyloxycarbonylgruppe, wie Benzyloxycarbonyl, o-Brombenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl oder o-(oder p-)-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbcnyl oder p-Methoxybenzyloxycarbonyl; eine aliphatische Oxycarbonylgruppe, wie Trichlorethyloxycarbonyl, t-Amyloxycarbonyl, t-Butoxycarbonyl oder Diisopropylmethoxycarbonyl; oder eine Aralkyloxycarbonylgruppe, wie 2-Phenylisopropoxycarbonyl, 2-Tolylisopropoxycarbonyl oder 2-p-Diphenylisopropoxycarbonyl, geschützt werden. Diese Aminogruppen können durch Bildung eines Enamins und Umsetzung mit einem 1,3-Diketon, wie Benzoylaceton oder Acetylaceton, geschützt werden.

Die Carboxylgruppe kann durch Amidbildung, Hydrazidbildung oder Veresterung geschützt werden. Die Amidgruppe wird mit einer 3,4-Dimethoxybenzyl- oder Bis-(pmethoxyphenyl)-methylgruppe substituiert. Die Hydrazidgruppe ist mit einer Benzyloxycarbonyl-, Trichlorethyloxycarbonyl-, Trifluoracetyl-, t-Butoxycarbonyl-, Trityl- oder 2-p-Diphenyl-isopropoxycarbonylgruppe substituiert. Die Estergruppe ist mit einem Alkanol, wie Methanol, Ethanol, t-Butanol oder Cyanomethylalkohol; einem Aralkanol, wie Benzylalkohol, p-Brombenzylalkohol, p-Chlorbenzylalkohol, p-Methoxybenzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol, 2,6-Dichlorbenzylalkohol, Benzhydrylalkohol, Benzoylmethylalkohol, p-Brombenzoylmethylalkohol oder p-Chlorbenzoylmethy!alkohol; einem Phenol, wie 2,4,6-

TriChlorphenol, 2,4,5-Trichlorphenol, Pentachlorphenol, p-Nitrophenol oder 2,4-Dinitrophenol; oder einem Thiophenol, wie Thiophenol oder p-Nitrothiophenol, substituiert. Die Hydroxygruppe von Serin oder Tyrosin kann gegebenenfalls durch Veresterung oder Veretherung geschützt sein. Eine durch Veresterung geschützte Gruppe ist beispielsweise eine Acetylgruppe; eine Benzoylgruppe, Benzyloxycarbonyl oder Ethyloxycarbonyl. Eine durch Veretherung geschützte Gruppe ist beispielsweise eine Benzyl-, 2,6-Dichlorbenzyl-, Tetrahydropyranyl- oder t-Butylgruppe. Der Schutz der Hydroxygruppe kann durch eine 2,2,2-Trifluor-1-t-butyloxycarbonylaminoethyl- oder 2,2,2-Trifluor-1-benzyloxycarbonylaminoethyl-Gruppe erfolgen. Es ist jedoch nicht immer erforderlich, diese Hydroxygruppen zu schützen.

Die Amino gruppe in der Guanidino gruppe in Arginin kann durch eine Nitro-, Tosyl-, Benzyloxycarbonyl- oder Methylen-2-sulfonylgruppe geschützt sein. Es ist Jedoch nicht immer erforderlich, die Guanidinogruppe zu schützen.

Die Imino gruppe in Histidin kann durch eine Benzyl-, Trityl-, Benzyloxycarbonyl-, Tosyl-, 2,2,2-Trifluor-1-benzyloxycarbonyl-aminoethylgruppe geschützt sein, obgleich die Iminogruppe nicht immer geschützt sein muß.

Bevorzugte Schutzgruppen sind bei der vorliegenden Erfindung die folgenden: t-Butyloxycarbonyl und t-Amyloxycarbonyl für a-Aminogruppen, ο-ChIorbenzyloxycarbonyl für Seitenketten-Aminogruppen, d.h. t -Amino in Lysin, Benzylester, Ethylester und Phenacylester für oc-Carboxyl, Benzylester für Seitenketten-Carboxyl, d.h. Glutamat und Aspartat, Benzylgruppen für Hydroxyl in Serin, 2,6-Dichlorbenzyl für Hydroxyl in Tyrosin und Tosyl oder Methylen-2-sulfonyl für Amino in Guanidino des Arginins.

Das Peptid der Formel [i] wird durch Kondensation von Aminosäuren oder niedrigen Peptiden synthetisiert. Beispielsweise kann eine Aminosäure oder ein Peptid mit einer geschützten a-Aminogruppe und einer aktivierten, endständigen Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit einer freien a-Aminogruppe und einer geschützten, endständigen Carboxylgruppe umgesetzt werden. Andererseits kann eine Aminosäure oder ein Peptid mit einer aktivierten a-Aminogruppe und einer geschützten, endständigen Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit einer freien, endständigen Carboxylgruppe und einer geschützten a-Aminogruppe umgesetzt werden.

Die Carboxylgruppe kann beispielsweise mit einem Säureazid, Säureanhydrid, Säureimidazolid oder aktiven Ester aktiviert sein, z.B. durch Umwandlung in einen Cyanomethylester, Thiophenylester, p-Nitrophenylester, p-Nitrothiophenylester, 2,4-Dinitrophenylester, 2,4,5-Trichlorphenylester, 2,4,6-Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester, N-Hydroxysuccinimidester, N-Hydroxyphthalimidoester, Carbodiimid, wie N^'-Dicyclohexyl-carbodiimid, N-Ethyl-N'-3-dimethylaminopropyl-carbodiimid, Ν,Ν'-Carbonyldiimidazol oder ein Isoxazoliumsalz, wie ein Woodward-Reagens,

Die bevorzugten Kondensationsreaktionen sind die Azid-, aktiver Ester- und Carbodiimid-Verfahren. Bei der Kondensationsreaktion sollte eine Racemisierung sorgfältig vermieden werden, und die bevorzugten Verfahren sind das Azid-, das aktiver Ester-Verfahren oder das Wunsch-Verfahren [Z.Naturforsch., 216, 426 (1966)] oder das Geiger-Verfahren [Chem.Ber., 103« 788 (1970)], bevorzugt unter Verwendung von N-Ethyl-N^f-3-dimethylaminopropyl-carbodiimid (WSCI) als Kondensationsmittel.

Vor dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Kondensationsreaktion in der Aminosäure-Sequenz der Formel [i] durchgeführt, und es ist bevorzugt, die Synthese von dem endständigen C aus durchzuführen. 5

Beispielsweise ist es bevorzugt, das endständige C-Fragment der Aminosäure-Sequenz 29-34 mit der Peptidfragmentsequenz 23-28 zu synthetisieren. Die bevorzugte Kondensation des Fragments mit endständigem C mit Hexapeptid 23-28 wird nach einem modifizierten Geiger-Verfahren unter Verwendung von WSCI durchgeführt. Die Kondensation des erhaltenen Fragments 23-24 mit terminalem C mit dem Peptidfragment der Aminosäure-Sequenz 18-22 wird bevorzugt nach einem modifizierten Geiger-Verfahren unter Verwendung von WSCI durchgeführt. Das so erhaltene Fragment 18-34 mit endständigem C wird nacheinander mit einem Peptidfragment der Sequenz 13-17 einem Peptidfragment 8-12 und einem Peptidfragment 1-7 verbunden.

Bei der obigen Kondensationsreaktion wird eine Schutzgruppe für die cc-Aminogruppe, z.B. t-Butyloxycarbonyl und t-Amyloxycarbonyl, mit Trifluoressigsäure entfernt. Eine Schutzgruppe für α-Carboxyl, z.B. Ethylester, wird durch Hydrolyse mit verdünnter Natriumhydroxidlösung entfernt oder in das geschützte Hydrazid, wie Hydrazid oder Trichlorethoxycarbonyl-hydrazid, überführt. Der Phenacylester wird mit Zinkpulver in Essigsäure zersetzt und der Benzylester wird mit wasserfreiem Fluorwasserstoff gespalten oder durch Hydrierung gespalten oder in das Hydrazid überführt.

So kann ein Tetratriacontapeptid mit geschützter, N-terminaler a-Aminogruppe, t-Aminogruppe, Seitenketten-Carboxyl, Guanidino und/oder Hydroxyl erhalten werden. Diese

Schutzgruppe!! werden bevorzugt durch Säureabbau, wie in einer einstufigen Entfernung mit wasserfreiem Fluorwasserstoff oder Trifluormethansulfonat, unter Herstellung der entsprechenden Verbindung der Formel [J-] abgespalten.

Das so erhaltene Peptid [i] kann nach an sich bekannten Reinigungsverfahren für Peptide oder Proteine gereinigt werden. Beispielsweise kann es durch Gelfiltra- tion unter Verwendung von Sephadex G-25, Sephadex G-50 oder Sephadex LH-20 (alle Warenzeichen), Säulenchromatographie unter Verwendung von Carboxymethylcellulose oder Ionenaustauscherharze oder Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie gereinigt werden.

Das erfindungsgemäße Peptid [I] kann in Form der freien Base oder seiner Salze, z.B. seiner Salze mit einer anorganischen Säure oder einer organischen Säure, wie Formiat, Acetat, Propionat, Glykolat, Succinat, Malat, Tartrat oder Citrat, erhalten werden.

Das Peptid [i] kann durch Zugabe einer anorganischen oder organischen Substanz in einen Komplex überführt werden. Der Ausdruck "Komplex" bedeutet, daß er durch Zugäbe einer Substanz eine Verbindung bilden kann, die ein unbekannter Komplex ist, der auf das Peptid eine verzögernde Wirkung ausüben kann. Als Beispiele kann man eine anorganische Verbindung nennen, die sich von Calcium, Magnesium, Aluminium, Kobalt oder Zink ableitet, insbesondere ein mäßig lösliches Salz davon, wie Phosphat, Pyrophosphat oder Polyphosphat, und Hydroxide oder Polyphosphate von Alkalimetallen.

Das Peptid [i], d.h. [Nie⁸, Nie¹⁸, Tyr³⁴]-h-PTH(1-34)-NHp* ^^s^ ^a^^{s mar}kierte Verbindung für einen Radioimmuno-

assay nützlich. Beispielsweise werden das obige Peptid [i] und Chloramin T zu aliquotem, radioaktivem Jod-125 in einem Phosphatpuffer (pH 7,1) gegeben, das Gemisch wird gerührt, Natriumbisulfid wird zugesetzt und eine geringe Menge an Kaliumiodid und Serumalbumin wird ebenfalls zugegeben. Die mit Jod-125 markierten Fraktionen werden durch Chromatographie gesammelt, wobei man eine Jod-125-konjugierte Verbindung erhält.

Die PTH-Aktivität des Peptids [l]und der Jod-125-markierten, radioaktiven Verbindung wird im folgenden erläutert.

(1) Markierung mit Jod-125

Eine Lösung (10 /al) von h-PTH(1-34) (2/ug), h-PTH(i-34)-

NH₂ (2/ug), [Nie⁸, Nie¹⁸, Tyr³⁴]-h-PTH(i-34) (2/ug) oder [Nie⁸, Nie¹⁸, Tyr³⁴]-h-PTH(1-34)NH₂ (2/ug) und eine Lösung (20/Ul) von Chloramin T (3,5 mg/ml) werden zu 0,5 M Phosphatpuffer (pH 7,1, 50/ul) gegeben, welcher Jod-125-NaJ (Radioaktivität: 2 mCi) enthält. Das Gemisch wird 30 see gerührt und mit Natriumbisulfid(4,5 mg/ml)-Lösung (50/ul) zur Beendigung der Reaktion versetzt. Eine 0,1N Essigsäurelösung (0,5 ml), enthaltend 5% Humanserumalbumin, wird zugegeben und das Gemisch auf eine Säule (1 χ 50 cm) von Sephadex G-10 gegeben und dann mit der 0,1N Essigsäurelösung eluiert, wobei man markierte Verbindungen erhält.

(Assay der PTH-Aktivität)

(1) Herstellung des PTH-Rezeptors

Männliche Ratten des SD-Stamms mit einem Gewicht von 200 bis 250 g werden der Dekapitation unterworfen, ausgeblutet, laparotomisiert und dann werden die Nieren herausgeschnitten. Eine Oberflächenmembran wird entfernt, der renale Cortex wird herausgeschnitten und mit Eis gekühlt.

Die folgenden Verfahrensschritte sollten bei einer Tem-

peratur durchgeführt werden, die so niedrig wie möglich ist (bei 0 bis 4°C).

Der Nierencortex wird in eine Lösung (die im folgenden als Lösung A bezeichnet wird) aus 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) mit einem Gehalt an 0,25 M Saccharose und 1 mM EDTA eingetaucht. Dreifache Volumina der Lösung A (ml), bezogen auf den renalen Cortex (Naßgewicht), wer-

(Ή.) den zu dem renalen Cortex in einem Glasrohr mit Teflon^v '■ Pistill gegeben und homogenisiert.

Das Homogenat wird 10 min bei 150Xg zentrifugiert und die überstehende Lösung weiterhin 15 min bei 2200 X g zentrifugiert. Die überstehende Lösung wird verworfen und der obere Emulsionsteil des Niederschlags in der Lösung A suspendiert. Diese Emulsion wird 15 min bei 2200 X g zentrifugiert. Das Präzipitat wird erneut suspendiert und bei -70⁰C in einer Flasche gefroren, die bei -20°C gelagert wird.

(3) Reaktion mit PTH und PTH-Rezeptor Proben werden in 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), enthaltend 2 mM ATP-Mg, 10 mM MgCl₂, 60 mM KCl, 20/uM GTP, 1 mM Isobutylmethylxanthin, 8 mM Creatinphosphat und 0,2% Rinderserumalbumin (BSA), unter Herstellung von 2/ug/ml und 10/ug/ml Lösungen suspendiert. Standard-Rinder-PTH(1-34)-Lösung wird ebenfalls auf die gleiche Weise hergestellt.

Die obigen Lösungen [2/ug/ml und 10/ug/ml, Proben und Rinder-PTH(i-34)] (50/ul) werden in Glasreagenzgläser gegeben, jeweils in 8 Gläser, und in Eis-Wasser gehalten, um ATP und andere zu vermeiden, wobei man Testlösungen erhält.

Eine Stocklösung des PTH-Rezeptors, die bei -20⁰C gelagert worden war, wird bei Zimmertemperatur aufgetaut. Zuvor in der Lösung A gelöste Creatinkinase wird zugesetzt, wobei man eine Creatinkinase mit 0,1 mg/ml und eine PTH-Re zep to r-Präpara tion mit 1,4 mg/ml als Protein erhält, wobei man Lösung A zugibt und die Lösung unter Eiskühlung aufbewahrt. Die obigen Testlösunger werden mehrere Minuten bei 37⁰C vorinkubiert, die PTH-Rezeptor-Creatinkinase-Lösung (jeweils 50/ul) wird zugegeben und dann wird 10 min bei 37° C inkubiert. 0,1 M Acetatpuffer (pH 4,0, 100/Ul) wird zugesetzt, dann wird sofort in Eis-Wasser gestellt und das Reagensglas 1 min in siedendem Wasser zur Beendigung der Reaktion erhitzt.

(3) Assay der erzeugten c-AMP I '

Destilliertes Wasser wird zu der obigen Lösung, mit der die Reaktion beendigt wurde, für die 10- bis JOfache _„y,ßFdünnung zugegeben, und da;nn wird durch Zentrifugieren während 15 min bei 2000 X g entproteinisiert. Die c-AMP-Menge in der überstehenden Lösung wird mittels RIA-kit (Yamasa Shoyu Co.) analysiert.

(4) Bestimmung der PTH-Aktivität

Die oben bestimmten Werte für c-AMP werden in die Einheit von pM (Picomol)/mg PTH-Tezeptor-Protein/min als Bestimmung des gemessenen Wertes überführt. Der gemessene Wert der Proben werden mit demjenigen einer Standardsubstanz entsprechend einer Parallelassaylinie zwei um zwei verglichen. ■

(5) PTH-Aktivität (E/mg) Probe PTH-Ak- PTH-Aktivität nach tivität Markierung mit 12_5t

h-PTH	3000	>100
h-PTH(1-34)NH2	5100	>150
[Nie8, Nie18, Tyr34]- h-PTH(l-34)	2930	2480
[Nie8, Nie18, Tyr34]- h-PTH(1-34)NH2	5030	5000
ρ το [Nie3, Nie ]-h-PTH(1-34)NH2	5000	—

Die hierin verwendeten Abkürzungen haben folgende Bedeu-

tung: Bo c OPAC

BzI VaI OEt OBzI Trp Ser Asn

t-Butyloxycarbonyl Phenacylester

Benzyl

Valin

Ethylester

Benzylester

L-Tryptophan

L-Serin

L-Asparaginsäure

Leu L-Leucin

BzI-Cl₂ 2,6-Dichlorbenzyl

Arg L-Arginin

DCHA Dicyclohexylamin

Lys L-Lysin

NaOH Natriumhydroxid

Tyr L-Tyrosin

TosoH p-Toluolsulfonsäure

TFA Trifluoressigsäure

Aoc t-Amyloxycarbonyl Z-Cl o-Chlorbenzyloxy-

carbonyl

Tos Tosyl

He L-Isoleucin

ONP p-Nitrophenylester

Nie L-Norleucin

Phe L-Phenylalanin

GIu L-Glutaminsäure

Z(OMe) p-Methoxybenzyloxycarbonyl

Asp L-Asparaginsäure

GIy Glycin

GIn L-Glutamin

His L-Histidin

DMSO Dimethylsulfoxid

DCC Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid

Et,N Triethylamin Ether Diethylether DMF Dimethylformamid

THF	Te trahydrο furan	TBA	t-Butylamin
NMM	N'-Methylmorpholin	HOBt	1-Hydroxybenzotri-
			azol

WSCI N-Ethyl-N'-dimethylaminopropyl-carbodiimid

PF( ): PF bedeutet geschützte Aminosäure oder Peptidfragment. Die Zahlen in Klammern bedeuten die Reihe der Aminosäure-Sequenz in der Formel [I].

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen werden die folgenden Träger und Entwicklungslösungsmittel für die Dünnschichtchromatographie (TLC) verwendet:
Träger: Silikagel G
Entwickler:
1. Chloroform-Methanol-Essigsäure (95:5:3)

2. Chloroform-Methanol-Essigsäure (85:15:5)

3. Chloroform-Methanol-Essigsäure (80:25:2)

4. Chloroform-Ethanol-Ethylacetat (5:2:5)

5. Hexan-Ethylacetat (1:1)

Träger: Merck-Cellulose (DC-Alufolien) Entwickler:

6. Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (2:2:2:3) (obere Schicht).

[Aminosäure-Analyse]

Sofern nicht anders angegeben, wird die Probe in 6N HCl 24 bis 48 h bei 110⁰C in einem geschmolzenen Rohr hydrolysiert.

Beispiel 1

Herstellung von [Nie⁸, Nie¹⁸, Tyr³⁴]-h-PTH(1-34)NH₂

1) PF<34): Boc-Tyr(Bzl-Cl₂)-NH₂ [1 ]

DCC (24,76 g, 0,12 M) in trockenem THF gibt man tropfenweise bei -5⁰C in Boc-Tyr(BzI-Cl₂)-OH (52,84 g, 0,12 M)

und p-Nitrophenol (16,6 g, 0,12 M), gelöst in trockenem THF und rührt über Nacht. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit NH,-Gas in der Filtratlösung gesättigt und 5 h gerührt. Der weitere Niederschlag wird durch Zugabe von DMF gelöst und dann im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wird aus Ether kristallisiert, filtriert und getrocknet; man erhält das Produkt [1]. Ausbeute: 44,77g (84,9%)

Fp. 214 bi£	j 216"	C 57,	C	für C, C	J1H24O4	N2Cl,	2
TLC: Rf1 =	0,62	57,		41% H	"5,5196	N 6	,38%
Elementaranalys e	,54° (	42	5,59	6	,51
berechnet:	c = 1,	DMF).
gefunden :
[αJn = -5.

2) PF(33-34): Boc-Asn-Tyr(BzI-CI₂)-NH₂ [2] 100 ml TFA gibt man unter Eiskühlung zu der in Methylenchlorid gelösten Verbindung [1] (26,36 g, 60 mM) und rührt 30 min bei Zimmertemperatur. Methylenchlorid und TFA werden im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird aus Ether kristallisiert, filtriert und getrocknet. Zu den erhaltenen Kristallen gibt man bei -15⁰C WSCI (10,98 ml, 60 mM), Boc-Asn-OH (13,93 g, 60 mM) und HOBt (8,1 g, 60 mM), gelöst in DMF und rührt über Nacht. Der Niederschlag wird durch Filtration gesammelt, mit 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung, Wasser (zweimal) und Methanol in dieser Reihenfolge gewaschen und dann getrocknet; man erhält das Produkt [2], Die Mutterlauge wird im Vakuum zur Entfernung von DMF destilliert. Die erhaltenen Kristalle werden mit Wasser und Methanol gewaschen und dann unter Bildung des Produktes [2] getrocknet, das mit dem obigen Produkt vereinigt wird.
Ausbeute: 28,64 g (86,25%)
Fp.: 240 bis 242⁰C

[<x]jp = -24,06° (c = 1, DMF)

Elementaranalyse: für ^C25^H30°6^N4^C12 berechnet: C 54,25% H 5,46% N 10,13% gefunden : 54,46 5,38 10,31

3) PF(32-34): Boc-His(Tos)-Asn-Tyr(BzI-Cl₂)-NH₂ [3] 100 ml TFA gibt man unter Eiskühlung zu der Verbindung [2] (22,14 g, 40 mMol), gelöst in einer geringen Menge an Methylenchlorid, rührt 30 min bei Raumtemperatur und entfernt TFA im Vakuum; man erhält de-Boc-Verbindung.

In 500 ml Ethylacetat suspendiertes Boc-His(Tos)-OH.DCHA (28,36 g, 48 mMol) wäscht man mit 1N H₂SO^ (zweimal) und Wasser (zweimal), trocknet mit wasserfreiem Natriumsulfat und entfernt Ethylacetat im Vakuum. Die obige de-Boc-Verbindung, gelöst in trockenem DMF, und HOBt (6,48 g, 48 mM) werden zu dem in DMF gelösten Rückstand gegeben, dann wird WSCI (8,78 ml, 48 mM) bei -15°C zugesetzt und bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Nach vollständiger Umsetzung entfernt man DMF im Vakuum, wäscht den Rückstand mit 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung und zweimal mit Wasser, trocknet und erhält das Rohprodukt, das man aus Methanol-Ether umkristallisiert; man erhält das Produkt [3]. Die Mutterlauge wird im Vakuum konzentriert und der Rückstand aus Methanol-Hexan unter Bildung der Verbindung [3] kristallisiert, die mit dem obigen Produkt [3] vereinigt wird. Ausbeute: 28,81 g (85,1%)
Fp. 170 bis 175⁰C
TLC: Rf, = 0,68, 0,42 (Tos teilweise entfernt) Elementaranalyse: für C-ZgH^OgNyCl₂S berechnet: C 53,96% H 5,24% N 11,59% gefunden : 53,03 5,65 12,04

4) PF(31-34): Boc-Val-His-Asn-Tyr(Bzl-Cl₂)-NH₂ [4] Man gibt 120 ml TFA unter Eiskühlung zu der in einer ge-

ringen Menge Methylenchlorid gelösten Verbindung [3] (28,81 g, 34,06 mM), rührt 30 min bei Zimmertemperatur und entfernt TFA im Vakuum. Man gibt Ether zu dem Rückstand, sammelt die ausgefallenen Kristalle durch Filtration, trocknet und löst sie dann in 14O ml DMF. Die Lösung wird mit NMM neutralisiert. Eine Lösung von Boc-Val-OH (8,14 g, 37,47 mM) und HOBt (5,06 g, 37,47 mM), gelöst in 60 ml DMF, und anschließend ViSCI (6,86 ml, 37,47 mM) bei -15⁰C zugesetzt und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. DMF wird im Vakuum entfernt, der Rückstand mit 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung und dreimal mit Wasser gewaschen und man erhält das Produkt [4]. Ausbeute: 27,76 g (103,2%)
Fp. 164 bis 166°C

TLC: Rf₃ =0,65

[cc]Jp = -28,38° (c=1, DMF)
Elementaranalyse: für C^gH^gOgClp
berechnet: C 54,75% H 5,87% N 14,19% gefunden : 53,37 5,78 13,43.

5) PF(30-34): Boc-Asp(OBzI)-Val-His-Asn-Tyr(BzI-CI₂)-NH [5]

Man gibt unter Eiskühlung 110 ml TFA zu der in einer geringen Menge Methylenchlorid suspendierten Verbindung [4] (27,76 g, 35,15 mM), rührt 30 min bei Zimmertemperatur und entfernt TFA im Vakuum. Man gibt Ether zu dem Rückstand, sammelt die ausgefallenen Kristalle durch Filtration, trocknet und löst sie in 120 ml DMF. Die Lösung wird durch Zugabe von 10 ml NMM neutralisiert. Boc-Asp-(OBzI)-OH (12,5 g, 38,67 mM) und HOBt (5,22 g, 38,67 mM), gelöst in 80 ml trockenem DMF, werden zugesetzt und man rührt über Nacht bei Zimmertemperatur. Man entfernt DMF im Vakuum, wäscht den Rückstand mit 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung und zweimal mit Wasser, suspendiert dann in Methanol und gibt Methanol für die Umkristallisation zu; man erhält das Produkt [5].

Ausbeute: 31,42 g (89,8%)

Fp. 214 bis 215⁰C

TLC: Rf₃ = 0,6

[a]^⁵= -23,28° (c = 1, DMF)
Elementaranalyse: für C.yHp-yO^NgClp berechnet: C 56,74% H 5,78% N 12,67% gefunden : 56,19 5,79 12,07

6) PF(29-34): Boc-Gln-Asp(OBzl)-Val-His-Asn-Tyr(BzI-Cl₂)-NH₂ [6]

Man gibt 120 ml TFA zu der in Methylenchlorid suspendierten Verbindung [5] (31,11 g, 31,27 mM), rührt 30 min bei Zimmertemperatur, entfernt TFA und Methylenchlorid im Vakuum und versetzt den Rückstand mit Ether. Die ausgefallenen Kristalle sammelt man durch Filtration, trocknet und löst sie in 100 ml trockenem DMF. Die Lösung wird mit 8 ml NMM neutralisiert. Eine Lösung von Boc-Gln-ONP (12,64 g, 34,4 mM) und HOBt (0,42 g, 3,13 mM), gelöst in trockenem DMF, wird zugesetzt und anschließend unter Eiskühlung 3,78 ml NMM und dann rührt man über Nacht. Nach Beendigung der Reaktion entfernt man DMF im Vakuum, wäscht den Rückstand mit 5%iger wäßroger Natriumbicarbonatlösung und zweimal mit Wasser, suspendiert in Methanol und kristallisiert aus Methanol um, wobei man das Produkt [6] erhält.

Ausbeute: 33,19 g (94,5%)

Fp. 81 bis 83⁰C

TLC: Rf₃ = 0,47

[cc]q⁴ = -23,98° (c = 1, DMF)

Elementaranalyse: für ^C52^H65°13^N11^C12 berechnet: C 55,61% H 5,83% N 13,72% gefunden : 54,81 5,96 13,07

Aminosäuren-Analyse: Asp 2,19 (2), GIu 1,05 (1),

VaI 1 (1), Tyr 0,73 (1), His 0,85 (1). 35

7) PF(27-28): Boc-Lys(Z-Cl)-Leu-Oet [7] Man wäscht Boc-Lys(Z-Cl)-OH.TBA (97,6 g, 0,2 M), suspendiert in 500 ml Ethylacetat, mit 1N HCl und Wasser, trocknet mit wasserfreiem Natriumsulfat und konzentriert im Vakuum unter Bildung eines öligen Materials, das in 500 ml trockenem THF gelöst wird. Man gibt H-Leu-OEt.HCl (39,14 g, 0,2 M) und HOBt (27,0 g, 0,2 M) und danach bei -15⁰C WSCI (36,6 ml, 0,2 M) zu, rührt über Nacht bei Zimmertemperatur und entfernt THF im Vakuum. Den in 600 ml Ethylacetat gelösten Rückstand wäscht man mit 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung, Wasser,1N HCl und Wasser in dieser Reihenfolge, trocknet mit wasserfreiem Natriumsulfat und konzentriert im Vakuum. Der Rückstand wird zur Kristallisation der Substanz abgekühlt, mit Hexan versetzt und filtriert, wobei man das Produkt [7] erhält.

Ausbeute: 110,62 g (99,5%)
Fp. 77 bis 80⁰C
TLC: Rf₅ = 0,48

[<x]£⁹ = -9,08° (c = 1, DMF).

8) PF(26-28): Boc-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-LeU-OEt [8] Die Verbindung [7] (110,62 g, 0,199 M) wird zu 50 ml Methylenchlorid gegeben. Unter Eiskühlung gibt man 250 ml TFA zu und rührt 1 h bei Zimmertemperatur. TFA und Methylenchlorid entfernt man im Vakuum und erhält ölige de-Bo c-Verbindung.

Man wäscht Boc-Lys(Z-Cl)-OH.TBA (97,1 g, 0,199 M), suspendiert in 500 ml Ethylenacetat, mit 300 ml 1N HCl und Wasser, trocknet mit wasserfreiem Natriumsulfat und engt im Vakuum unter Bildung einer öligen Substanz ein. Die ölige de-Boc-Verbindung und HOBt (26,9 g, 0,199 M), gelöst in 250 ml trockenem THF, gibt man zu der obigen öligen Substanz, gelöst in 150 ml trockenem THF. WSCI

(36,4 ml, 0,199 M) tropft man bei -15°C zu und rührt über Nacht bei Zimmertemperatur. THF wird im Vakuum entfernt, um agar-ähnliche Kristalle auszufällen, die man in Ethylacetat löst, mit 5%iger wäßriger. Natriumbicarbonatlösung, Wasser, 1N HCl und Wasser in dieser Reihenfolge wäscht, mit wasserfreiem Natriumsulfat trocknet und im Vakuum konzentriert. Der Niederschlag wird mit Hexan behandelt und filtriert und aus Ethylacetat-Ether-Hexan umkristallisiert, wobei man das Produkt [8] erhält. Ausbeute: 156,52 g (92,2%)
Fp. 114 bis 116⁰C
TLC: Rf₂ = 0,78
[<x]^⁹ = -20,72° (c = 1, DMF).

9) PF(25-28): Aoc-Arg(Tos)-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-Leu-OEt [9]

Man gibt 2500 ml TFA unter Eiskühlung zu der Verbindung [8] (156,5 g, 184 mM), gelöst in 50 ml Methylenchlorid, und rührt 1 h bei Zimmertemperatur. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum konzentriert und der in 300 ml trockenem DMF gelöste Rückstand mit NMM neutralisiert. Man gibt Aoc-Arg(Tos)-0H (86,0 g, 202 mM), gelöst in 100 ml trockenem DMF, und HOBt (27,3 g, 202 mM) und danach bei -15⁰C tropfenweise WSCI (37,0 ml, 202 mM) zu und rührt über Nacht bei Zimmertemperatur. DMF wird im Vakuum entfernt und der Rückstand in 1 1 Ethylacetat gelöst. Die Lösung wäscht man mit 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung, gesättigter NaCl-Lösung, zweimal mit 1N HCl und gesättigter Natriumchloridlösung, trocknet mit wasserfreiem Natriumsulfat und konzentriert im Vakuum. Man versetzt den Rückstand mit Ether und filtriert, wobei man das Produkt [9] erhält.
Ausbeute: 217,91 g (100,6#)
Fp. 75 bis 78⁰C

TLC: Rf₁ = 0,09, Rf₂ = 0,67
[oc]^⁸ = -14,02° (c = 1, DMF).

10) PF(24-28): Boc-Leu-Arg(Tos)-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-Leu-OEt [10]

Man gibt 100 ml Methylenchlorid und 250 ml TFA zu der Verbindung [9] (217,9 g, 0,185 M), rührt 80 min bei Zimmertemperatur und entfernt Methylenchlorid und TFA im Vakuum. Das erhaltene, ölige Material wird in 300 ml trockenem DMF gelöst und durch Zugabe von NMM neutralisiert. Boc-Leu-0H.H₂0 (50,9 g, 0,204 M) und HOBt (27,6 g, 0,204 M), gelöst in 100 ml trockenem DMF, werden zügesetzt, dann WSCI (37,3 ml, 0,204 M) bei -15°C zugetropft und dann rührt man über Nacht bei Zimmertemperatur. DMF entfernt man im Vakuum und versetzt den Rückstand mit Wasser. Das ausgefällte Produkt wird filtriert und zweimal aus Methanol-Ether-Hexan umkristallisiert, wobei man das Produkt [10] erhält.
Ausbeute: 213,63 g (90,5%)
Fp. 157 bis 16O°C
TLC: Rf₁ = 0,28, Rf₂ = 0,77
[a]p⁷ = -18,68° (c = 1, DMF).

11) PF(23-28): Boc-Trp-Leu-Arg(Tos)-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-Leu-OEt [If]

100 ml Methylenchlorid und 250 ml TFA gibt man zu der Verbindung [10] (153,17 g, 0,12 M), rührt 80 min bei Zimmertemperatur und entfernt Methylenchlorid und TFA im Vakuum. Der Rückstand wird in 250 ml trockenem DMF gelöst und durch Zugabe von NMM auf pH 7,0 neutralisiert. Man gibt HOBt (17,84 g, 0,132 M) und Boc-Trp-OH (40,17 g, 0,132 M) und anschließend tropfenweise bei -15⁰C WSCI (24,2 ml, 0,132 M) zu und rührt über Nacht bei Zimmertemperatur. DMF wird im Vakuum entfernt und der Rückstand in 5%ige wäßrige Natriumbicarbonatlösung (5 l) gegossen. Die ausgefallene Substanz wird filtriert, das Filtrat in Wasser suspendiert und dann zweimal aus Methanol-Ether umkristallisiert, wobei man das Produkt [11] erhält.

Ausbeute: 142,57 g (81,2%)

Fp. 168 bis 17O⁰C

TLC: Rf₁ = 0,31, Rf₂ = 0,82

[oc]^⁸ = -18,64° (c = 1, DMF).
5

12) PF(23-28): BoC-TrP-LeU-ATg(TOs)-LyS(Z-Cl)-LyS(Z-Cl)-Leu-OH [12]

Die Verbindung [11] (140,64 g, 96,16 mM) wird in 1200 ml heißem Ethanol gelöst. Nach dem Abkühlen filtriert man eine kleine Menge des Niederschlags ab, gibt wäßriges 1N NaOH (288 ml, 3 Mol-Äquiv.) zu und rührt 1 h bei Zimmertemperatur. Zu dem Reaktionsgemisch gibt man eine 1N Tos-OH-Lösung (192 ml, 2 Mol-Äquiv.), filtriert und entfernt Ethanol im Vakuum. Dazu gibt man 1N Tos.OH (96 ml, 1 MoI-Äquiv.) und dann 2 1 Wasser und filtriert den Niederschlag, den man unter Bildung des Produktes [12] trocknet. Ausbeute: 142,98 g (101,1%)
Fp. 125 bis 13O⁰C
TLC: Rf₂ = 0,71

[oc]ji|^{7 =} "57,24° (c = 1, DMF)

Elementaranalyse: für C₆₉H₉^O₁₅N₁₂SCl₂.2H₂O berechnet: C 56,35% H 6,72% N 11,43%

gefunden : 56,03 6,62 11,85

Aminosäure-Analyse: Leu 2 (2), Lys 2,08 (2), Arg 1,10 (1), Trp 0,83 (1).

13) PF(23-34): BoC-TrP-LeU-ATg(TOs)-LyS(Z-Cl)-LyS(Z-Cl)-Leu-Gln-Asp(OBzI)-VaI-HiS-ASn-TyT(BzI-Cl₂)-NH₂ [13 ]

Unter Eiskühlung gibt man 7 ml TFA zu der Verbindung [6] (1,68 g, 1,5 mM), gelöst in einer geringen Menge Methylenchlorid, und rührt 30 min bei Zimmertemperatur. Man entfernt TFA im Vakuum, versetzt den Rückstand mit Ether, filtriert die ausgefällten Kristalle und trocknet. Die Kristalle löst man in einer geringen Menge trockenem DMF (30 ml) und neutralisiert mit einer geringen Menge NMM.

Dazu gibt man die Verbindung [12] (2,43 g, 1,65 mM), HOBt (0,22 g, 1,65 mM) und 20 ml trockenes DMF, sodann bei -15⁰C WSCI (0,3 ml, 1,1 Mol-Äquiv.) und rührt über Nacht bei Zimmertemperatur. Man entfernt DMF im Vakuum, wäscht den Rückstand mit 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung und zweimal mit Wasser, suspendiert in Methanol, gibt Ether zu, filtriert und trocknet, wobei man das Produkt [13] erhält.
Ausbeute: 3,62 g (99,1%)
Fp. 260 bis 270°C

[a]jp = -46,6° (c = 0,3, DMF)

Aminosäure-Analyse: Asp 1,94 (2), GIu 0,96 (1), VaI 0,71 (1), Leu 2,00 (2), Tyr 0,98 (1), Lys 2,09 (2), His 0,58 (1), Arg 0,91 (1), Trp 0,78 (1). 15

14) PF(22): BOC-GIu(OBzI)-OPAC [14]

Unter Eiskühlung gibt man tropfenweise Phenacylbromid (113,5 g, 0,57 M) zu Boc-Glu(0Bzl)-0H (128,2 g, 0,38 M), gelöst in 600 ml DMF, und dann Et₃N (79,3 ml, 0,57 M)

und rührt 4 h bei 30⁰C. Man gibt 30 g Kaliumacetat zu, rührt 45 min und entfernt DMF im Vakuum. Zu dem Rückstand gibt man 600 ml Ethylacetat, wäscht zweimal mit 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung und zweimal mit Wasser. Man trocknet die Ethylacetatschicht mit wasserfreiem Natriumsulfat und entfernt das Lösungsmittel im Vakuum zur Ausfällung der Kristalle. Man gibt Hexan zu und filtriert, wobei man das Produkt [14] erhält. Ausbeute: 156,19 g (90,2%)
TLC: Rf₅ = 0,73.

15) PF(21-22): Boc-Val-Glu(OBzI)-OPAC [15]

Man gibt 50 ml Methylenchlorid zu der Verbindung [14] (147,88 g, 0,325 M). Unter Kühlen gibt man 300 ml TFA zu, rührt 1 h bei Zimmertemperatur und entfernt Methylenchlorid und TFA im Vakuum. Man versetzt den Rückstand mit

Ether, filtriert die ausgefällten Kristalle und trocknet. Die in 300 ml trockenem DMF gelösten Kristalle werden mit NMM auf pH 7 neutralisiert. Man gibt HOBt (35,14 g, 0,26 M) und Boc-Val-OH (56,49 g, 0,26 M) zu der Lösung und anschließend bei -15⁰C WSCI (47,6 ml, 0,26 M) und rührt 2 Tage bei Zimmertemperatur. DMF entfernt man im Vakuum und wäscht den in 500 ml Chloroform gelösten Rückstand mit 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung, Wasser, 1N HCl und Wasser. Die Chloroformschicht dehydratisiert man durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat, entfernt das Lösungsmittel im Vakuum, filtriert die erhaltenen Kristalle durch Zugabe von Hexan und kristallisiert aus Ethylacetat-Ether um, wobei man das Produkt [15] erhält. Ausbeute: 106,97 g (74,2%)

Fp. 139 bis 141°C
TLC: Rf₃ = 0,63
[cc]^⁹ = -18,92° (c = 1, DMF).

16) PF(20-22): Aoc-Arg(Tos)-VaI-GIu(OBzI)-OPAC [16] Man gibt 50 ml Methylenchlorid zu dem Produkt [15] (99,93 g, 0,18 M). Unter Eiskühlung gibt man 200 ml TFA zu, rührt 1 h bei Zimmertemperatur und entfernt Methylenchlorid und TFA im Vakuum. Den Rückstand versetzt man mit Hexan, dekantiert das Lösunganittel ab, gibt Ether zu und entfernt den Ether im Vakuum. Das erhaltene, ölige Material, gelöst in 200 ml trockenem DMF, wird durch NMM neutralisiert. Man gibt HOBt (24,33 g, 0,18 M), Aoc-Arg(Tos)-0H (76,60 g, 0,18 M) und 200 ml trockenes DMF und dann bei -15⁰C WSCI (32,94 ml, 0,18 M) zu und rührt über Nacht bei Zimmertemperatur. DMF wird im Vakuum entfernt und der Rückstand in 1 1 Ethylacetat gelöst. Die Lösung wäscht man mit 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung, Wasser, 1N HCl und Wasser in dieser Reihenfolge, trocknet mit wasserfreiem Natriumsulfat und entfernt das Ethylacetat im Vakuum. Die so erhaltene, ölige Substanz

kristallisiert man aus Ethylacetat-Ether um und suspendiert die Kristalle. Die gleiche Verfahrensweise wird dreimal wiederholt, wobei man das Produkt [16] erhält. Ausbeute: 149,75 g (94,696)
Fp. 110 bis 114⁰C
TLC: Rf₁ = 0,74, Rf^ = 0,81

[a]n⁹ = -11,5° (c =1, DMF).

17) PF(i9-22): Boc-Glu(OBzl)-Arg(Tos)-Val-Glu(OBzl)-OPAC [17]

Man gibt 50 ml Methylenchlorid zu der Verbindung [16] (149,40 g, 0,170 M) und dann unter Eiskülung 300 ml TFA zu, rührt 1 h bei Zimmertemperatur und entfernt Methylenchlorid und TFA im Vakuum. Den Rückstand versetzt man mit Ether, entfernt den Ether im Vakuum und löst das so erhaltene, ölige Material in 200 ml trockenem DMF. Man gibt HOBt (25,27 g, 0,187 M) und BoC-GIu(OBzI)-OH (63,09 g, 0,187 M), weiterhin 100 ml trockenes DMF und WSCI (34,22 ml, 0,187 M) bei -15°C zu und rührt über Nacht bei Zimmertemperatur. Man entfernt die Lösungsmittel und gießt den Rückstand in 6 1 Wasser. Die ausgefällten Kristalle werden durch Filtration gesammelt, die mit Methanol und Ether suspendierten Kristalle filtriert und in heißem Methanol gelöst. Nach dem Abkühlen wird der Niederschlag filtriert und erneut in Methanol suspendiert. Diese Vorgänge werden dreimal wiederholt, wobei man die Verbindung [17] erhält. Das Lösungsmittel wird aus der Mutterlauge entfernt und aus Methanol-Ether umkristallisiert, wobei man das Produkt [17] erhält (25,02 g).

Ausbeute: 141,44 g (76,796)
Fp. 119 bis 121°C
TLC: Rf₁ = 0,56, Rf₄ = 0,82
~ⁿⁿ = -12,9° (c = 1, DMF).

26 3A28942

18) PF(18-22): Boc-Nle-Glu(OBzl)-Arg(Tos)-VaI-GIu(OBzI)-OPAC [18]

Unter Eiskühlung gibt man Methylenchlorid und TFA (24 ml) zu der Verbindung [17] (6,51 g, 6 mM), rührt40 min bei Zimmertemperatur und entfernt Methylenchlorid und TFA im Vakuum. Zur Kristallisation gibt man Ether zu dem Rückstand und trocknet. Die Kristalle werden in trockenem DMF gelöst und durch Zugabe von NMM unter Eiskühlung auf pH 7 neutralisiert. Man gibt Boc-Nle-OH (1,67 g, 7,2 mM) und HOBt (0,97 g, 7,2 mM), gelöst in 40 ml trockenem DMF, dann bei -15⁰C WSCI (1,3 ml, 7,2 mM) zu und rührt über Nacht. Man entfernt DMF im Vakuum, versetzt den Rückstand mit Wasser, filtriert das Präzipitat und wäscht mit 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung, dreimal mit Wasser, dreimal mit 1N HCl und Methanol. Das Produkt [18] wird aus Methanol-Ether umkristallisiert. Ausbeute: 5,61 g (7896)
TLC: Rf₁ = 0,56.

19) PF(18-22): Boc-Nle-Glu(OBzl)-Arg(Tos)-VaI-GIu(OBzI)-OH [19]

Man gibt 8 g Zinkpulver zu der Verbindung [18] (5,03 g, 4,2 mM), gelöst in 30 ml Essigsäure, und rührt 5,5 h bei Zimmertemperatur. Das Zinkpulver wird abfiltriert und Essigsäure im Vakuum entfernt. Die ausgefallenen Kristalle werden mit Ether gemischt und filtriert, wobei man das Produkt [19] erhält.
Ausbeute: 4,42 g
Fp. 210⁰C (Zers.)

TLC: Rf₁ = 0,18, Rf₂ = 0,67

Amino säure-Analyse: Nie 1.01 (1), GIu 2.05 (2),

Arg 0.98 (1), VaI 1 (IJ

20) PF(i8-34):

Boc-Nle-Glu(OBzI)-Arg(Tos)-Val-Glu(OBzI)-Trp-

Leu-Arg(Tos)-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-Leu-Gin-Asp(OBzI) Val-His-Asn-Tyr(BzI-Cl₂J-NH₂ [20] Man gibt Skatol (0,5 g, 3,5 mM), Dimethylsulfid (25 ml), Ethandithiol (2,5 ml) und TFA (25 ml) zu der Verbindung [19] (8,9 g, 3,5 mM), rührt 10 min bei 0°C, dann 45 min bei Zimmertemperatur und konzentriert das Reaktionsgemisch im Vakuum. Den Rückstand versetzt man mit Ether, filtriert das Präzipitat, trocknet, löst in 100 ml trockenem DMF und neutralisiert mit NMM auf pH 7. Man gibt HOBt (0,54 g, 4 mM) und die Verbindung [19] (4,3 g, 4 mM), dann bei -15⁰C WSCI (0,73 ml) zu und rührt 2 Tage bei Raumtemperatur. Man destilliert DMF im Vakuum ab und gibt 5%ige wäßrige Natriumbicarbonatlösung zu. Der Niederschlag wird filtriert und mit Wasser gewaschen. Das Produkt wird in Ethanol gelöst und durch Zugabe von Ether ausgefällt. Diese Vorgänge werden zweimal wiederholt, wobei man das Produkt [20] erhält. Ausbeute: 11,12 g (9496)
Fp. 250°C (Zers.)
TLC: Rf₃ = 0,72
[cc]£⁸ = -4,73° (c = 0,53, DMF)

Aminosäure-Analyse:

Asp 1.98 (Z), GIu 3.04 (3), VaI 1.69 (2) Leu 2 (2), Tyr 1.07 (1), Lys 1.93 (2), His 0.59 (1),

Arg 1.97 C2), Trp 0.35 (1), Nie 1.Q7 (1)

21) PF(17): Boc-Ser(BzI)-OPAC [21] Man gibt Phenacylbromid (89,6 g (0,45 M) zu Boc-Ser(BzI)-OH (88,6 g, 0,3 M), gelöst in 400 ml DMF, und danach tropfenweise unter Eiskühlung Et,N (62,6 ml, 0,45 M) und rührt 3,5 h bei 30⁰C. Man gibt Kaliumacetat (22,1 g,

34289A2

0,225 M) zu dem Reaktionsgemisch und rührt 1 h bei Zimmertemperatur. DMF destilliert man im Vakuum ab, löst den Rückstand in 500 ml Ethylacetat und wäscht die Lösung dann mit 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung und Wasser. Nach Trocknen der Ethylacetatschicht mit wasserfreiem Natriumsulfat entfernt man das Lösungsmittel im Vakuum. Den Rückstand gibt man zur Kristallisation in einen Kühlschrank und setzt Hexan zu, wobei man das Produkt [21] erhält.
Ausbeute: 122,97 g (99,1%)
Fp. 45 bis 47⁰C

TLC: Rf₅ = 0,82

5 _β -11,88° (c = 1,0, DMF).

22) PF (16-17): Boc-Asn-Ser(BzI)-OPAC [22] Zu der Verbindung [21] (119,9 g, 0,29 M) gibt man 50 ml Methylenchlorid und dann unter Eiskühlung 250 ml TFA und rührt 1 h bei Zimmertemperatur. Nach Beendigung der Umsetzung konzentriert man das Reaktionsgemisch im Vakuum, setzt Ether zu, sammelt die ausgefallenen Kristalle durch Filtration und trocknet. Die Kristalle löst man in 400 ml trockenem DMF und neutralisiert mit NMM auf pH 7. Man gibt HOBt (31,35 g, 0,232 M) und Boc-Asn-OH (53,88 g, 0,232 M) und anschließend tropfenweise WSCI (42,46 ml, 0,232 M) zu, rührt über Nacht bei Zimmertemperatur und entfernt DMF im Vakuum. Den in 500 ml Ethylacetat gelösten Rückstand wäscht man mit 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung. Die ausgefällten Kristalle werden mit Wasser und Ether gewaschen, wobei man die Kristalle I (41,79 g) des Produktes [22] erhält. Die Ethylacetatschicht des Filtrats wird im Vakuum konzentriert, wobei man ein öliges Material erhält, das aus Ethalacetat-Ether umkristallisiert wird, wobei man die Kristalle II des Produkts [22] (6,22 g) erhält.

Ausbeute: 48,01 g (39,2%)

Fp. 174 bis 176°C

TLC: Rf₉ = 0,61, Rf^ = 0,62

_ -OQ R^ rs . ^

jö -5,54° (c = 1,0, DMF)
Aminosäure-Analyse: Asp 1,22 (1), Ser 1,00 (1). 5

23) Pf(15-17): Boc-Leu-Asn-Ser(BzI)-OPAC [23]

Zu der Verbindung [22] (80,91 g, 0,153 M) gibt man 50 ml Methylenchlorid und dann unter Eiskühlung 150 ml TFA zu und rührt 1 h bei Zimmertemperatur. Man konzentriert das Reaktionsgemisch im Vakuum, versetzt den Rückstand mit Öl, dekantiert das gebildete, ölige Material ab, löst in 150 ml trockenem DMF und neutralisiert mit NMM auf pH 7. Man gibt HOBt (22,7 g, 0,168 M), Boc-Leu-OH.H₂O (41,9 g, 0,168 M) und 100 ml DMF und dann tropfen-

weise bei -15⁰C WSCI (30,7 ml, 0,168 M) zu und rührt anschließend bei Zimmertemperatur. Sobald die Reaktionsmischung geliert, gibt man die Mischung 3 Tage in einen Eisschrank und gibt Wasser zu. Das Präzipitat wird abfiltriert, mit 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlosung und Wasser gewaschen und dann getrocknet, wobei man das Produkt [23] erhält.
. Ausbeute: 88,52 g (90,396)
Fp. 192 bis 193°C
TLC: Rf₂ = 0,80, Rf₃ = 0,88

Elementaranalyse: für C₃₃H₄₄O₉N₄

berechnet: C 61,86% H 6,92% N 8,75% gefunden : 61,81 7,05 8,56.

24) PF(14-17): Boc-His(Tos)-Leu-Asn-Ser(Bzl)-OPAC [24]

Zu der Verbindung [23] (87,55 g, 0,137 M) gibt man 100 ml Methylenchlorid, danach unter Eiskühlung 200 ml TFA und rührt 70 min bei Zimmertemperatur. Man engt das Reaktionsgemisch im Vakuum ein, versetzt den Rückstand mit Ether, filtriert das Präzipitat, trocknet, löst in 200 ml trockenem DMF und neutralisiert unter Zugabe von

NMM auf pH 7, wobei man die de-Boc-Verbindungslösung erhält.

Boc-His(Tos)-OH.DCHA (89,2 g, 0,151 M), suspendiert in 11 Ethylacetat, wäscht man mit 500 ml 1N H₂SO^ und filtriert die ausgefallenen Kristalle. Man wäscht die Ethylacetatschicht mit Wasser, trocknet mit wasserfreiem Natriumsulfat und destilliert das Lösungsmittel im Vakuum ab. Das erhaltene, Ölige Material, gelöst in 150 ml trockenem DMF, und HOBt (20,4 g, 0,151 M) gibt man zu der obigen Lösung der de-Boc-Verbindung. Man tropft WSCI (27,6 ml, 0,151 M) bei -15°C zu und rührt 3 Tage bei Zimmertemperatur. Man destilliert das Lösungsmittel im Vakuum ab, versetzt den Rückstand mit Wasser, filtriert das Präzipitat und wäscht es mit 5#iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung und Wasser und trocknet, wobei man das Produkt [24] erhält.
Ausbeute: 108,63 g (85,1%)
Fp. 154 bis 156⁰C

TLC: Rf₂ = 0,20, 0,79, Rf₃ = 0,55, 0,87 (zum Teil wird

die de-Tos-Verbindung erhalten) [α]*"⁹'⁵ = -18,58° (c = 1,0, DMF).

25) PF(13-17): Boc-Lys(Z-Cl)-His-Leu-Asn-Ser(BzI)-OPAC [25]

Zu der Verbindung [24] (107,96 g, 0,116 M) gibt man 100 ml Methylenchlorid und dann unter Eiskühlung 100 ml TFA zu und rührt 70 min bei Zimmertemperatur. Man engt das Reaktionsgemisch im Vakuum ein, versetzt den Rückstand mit Ether, filtriert das Präzipitat, trocknet, löst in 200 ml trockenem DMF und neutralisiert mit NMM auf pH 7, um eine de-Boc-Lösung zu erhalten.

Boc-Lys(Z-Cl)-OH.TBA (62,46 g, 0,128 M), suspendiert in 600 ml Ethylacetat, wird mit 1N HCl und Wasser gewaschen.

Die Ethylacetatschicht wird mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert. Die erhaltene, ölige Substanz und HOBt (17,30 g, 0,128 M) werden in 100 ml trockenem DMF gelöst. Eine Lösung davon wird zu der obigen de-Boc-Lösung zugesetzt. Man tropft WSCI (24,42 ml, 0,128 M) zu und rührt über Nacht bei Zimmertemperatur. Man entfernt das Lösungsmittel im Vakuum, gibt den Rückstand zu 5 1 einer 3%igen wäßrigen Natriumbicarbonatlösung und wäscht die ausgefallenen Kristalle mit Wasser und trocknet sie. Man gibt Ether zu der Methanollösung, um die Kristalle auszufällen, suspendiert das Präzipitat in Ethylacetat und filtriert. Diese Vorgänge wiederholt man dreimal, um das Produkt [25] zu erhalten.

Ausbeute: 114,42 g (9,1856)
Fp. 200 bis 202⁰C
TLC: Rf₂ = 0,34, Rf₃ = 0,68
[a]£⁸ = -26,94° (c = 1,0, DMF).

26) PF(13-17): Boc-Lys(Z-Cl)-His-Leu-Asn-Ser(BzI)-OH [26] Zu der Verbindung [25] (86,0 g, 80 mM), gelöst in 500 ml Essigsäure, gibt man 150 g Zinkpulver, rührt 5 h bei Zimmertemperatur und filtriert zur Entfernung des Zinkpulvers. Das Reaktionsfiltrat konzentriert man im Vakuum, versetzt den Rückstand mit Ether und filtriert die ausgefällten Kristalle, wobei man das Produkt [26] erhält, Ausbeute: 84,70 g (95,256)
Fp. 240 bis 250°C
TLC: Rf₂ = 0,47

[αξ° = -19,16° (c = 1,0, DMF)

Elementaranalyse: für C^₅H₅₂O₁₂N₉Cl.2CH₃COOH.2H₂O berechnet: C 53,76% H 6,63% N 11,52% gefunden : 52,83 6,36 11,35 Aminosäure-Analyse: Asp 1,01 (1), Ser 0,83 (1), Leu 1(1), Lys 0,93 (1), His 0,97 (1).

27) PFC13-34): B ο c - L y s ( Z - C 1 )

-His-Leu-Asn-SerCBzI) -N 1e-

GIu(O BzI)-Ar₂(To s ) - V a I - G 1 u (

0 B ζ I )-Trp-Leu-Arg(Tos )-L y s (

Z-C 1 ) -Ly s ( Z-C 1 ) -Le u -G 1 Q -As ρ ( 0 BzI)-Vat-His-Asn-Tyr(BzI-Cl₂) -NH₂ C27]

Zu der Verbindung [20] (10,77 g, 3,2 mM) gibt man 0,46 g (3,2 mM) Skatol, 25 ml Dimethylsulfid, 2,5 ml Ethandithiol und 25 ml TFA, rührt 10 min bei O⁰C und 60 min bei Zimmertemperatur und engt das Reaktionsgemisch im Vakuum ein. Ether wird zu dem Rückstand gegeben, das Präzipitat filtriert, getrocknet, in 100 ml trockenem DMF gelöst und mit NMM auf pH 7 neutralisiert. Dazu gibt man HOBt (0,51 g, 3,8 mM) und die Verbindung [26] (4,23 g, 3,8 m), anschließend bei -15⁰C WSCI (0,70 ml) und rührt bei Zimmertemperatur. DMF wird im Vakuum entfernt, der Rückstand mit Wasser versetzt, der Niederschlag filtriert, mit Wasser gewaechen und getrocknet, wobei man das Produkt [27] erhält.

Ausbeute: 13,60 g (1OO#)
Fp. 138 bis 16O,5°C
Aminosäure-Analyse:

Asp 2.96 (3), Ser 0.62 (1), GIu 3.02 (3)

VaI 1.72 (2), Leu 3 (3), Tyr 1.06 (1), . 30

Lys 3.01 C3) , His 1.43 (2), Arg 1.98 (2),

Trp 0.60 (1), Nie 1.06 (1)

28) PF(11-12): Boc-Leu-Gly-OBzl [28] 50 ml trockenes Benzol wird zu Boc-Leu-0H.H₂0 (4,99 g,

20 mM), gelöst in 30 ml trockenem THF, gegeben und das Lösungsmittel azeotrop abdestilliert. Man löst das erhaltene, ölige Material in 70 ml trockenem THF, gibt H-Gly-OBzl.TosOH (20 mM) und HOBt (2,7 g, 20 mM) und anschließend bei -5⁰C 5 ml WSCI zu und rührt über Nacht bei Zimmertemperatur. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abdestilliert und der Rückstand in 100 ml Ethylacetat gelöst. Die Lösung wird zweimal mit 1N HCl, zweimal mit 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung und zweimal mit Wasser gewaschen. Die Ethylacetatschicht wird durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zu dem öligen Produkt [28] konzentriert.

29) PF(10-12): Boc-Asn-Leu-Gly-OBzl [29]

Man gibt bei -15⁰C kO ml einer 4,39N Chlorwasserstoff/ Dioxan-Lösung zu dem vorstehenden, öligen Produkt [28], rührt 90 min und konzentriert im Vakuum. Man versetzt den Rückstand mit Ether, sammelt den Niederschlag durch Filtration, trocknet und löst in 30 ml trockenem DMF. Man gibt bei -5°C Et,N zur Einstellung des pH auf 7 zu, fügt HOBt (0,3 g, 2,2 mM) und Boc-Asn-ONP (7,77 g, 22 mM) zu und rührt 3 Tage bei Zimmertemperatur. Das Reaktionsgemisch wird mit Wasser versetzt und das Präzipitat mit 200 ml Chloroform extrahiert. Die Chloroformschicht wird mit 1N HCl, 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Entfernung des Lösungsmittels konzentriert. Der Rückstand wird aus Ethylacetat-Hexan umkristallisiert, wobei das Produkt [29] erhalten wird.

Ausbeute: 8,0 g (73,8%)
Fp. 152 bis 156°C
[cc]£⁴ = -36,1° (c = 1,0, DMF).

30) PF(9-12): Boc-His-Asn-Leu-Gly-OBzl [30]

Zu der Verbindung [29] (7,36 g, 15,5 mM) gibt man 5 ml

Methylenchlorid, anschließend unter Eiskühlung 32 ml TFA und rührt 60 min bei Zimmertemperatur. Man konzentriert das Reaktionsgemisch im Vakuum, versetzt den Rückstand mit Ether, sammelt das Präzipitat durch Filtration, trocknet, löst in 40 ml trockenem DMF und neutralisiert mit NMM auf pH 7, wobei man eine de-Boc-Lösung erhält.

Man gibt 150 ml Ethylacetat und 90 ml 0,5N H₂SO^ zu Boc-His(Tos)-OH.DCHA (10,99 g, 18,6 mM) und schüttelt. Die Ethylacetatschicht wird dreimal mit Wasser gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Ethylacetat im Vakuum abdestilliert, wobei man eine ölige Substanz erhält. Die ölige Substanz und HOBt (2,5 g, 18,6 mM) werden in 60 ml trockenem DMF gelöst. Man gibt die Lösung zu der vorerwähnten de-Boc-Lösung und anschließend bei -15⁰C WSCI (3,4 ml, 18,6 mM) zu und rührt über Nacht bei Zimmertemperatur. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abdestilliert, der Rückstand in Ethylacetat gelöst, dreimal mit 5#iger, wäßriger Natriumbicarbonatlösung und zweimal mit Wasser gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert. Den Rückstand versetzt man mit Ether und sammelt die ausgefällten Kristalle durch Filtration. In diesen Kristallen ist Tos von His teilweise entfernt. Um Tos vollständig zu entfernen, löst man die Kristalle in 100 ml DMF, gibt 7,05 g HOBt zu und rührt das Gemisch 3 Tage bei Zimmertemperatur. Man entfernt DMF im Vakuum, löst den Rückstand in Ethylacetat, wäscht zweimal mit 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung und Wasser, trocknet mit wasserfreiem Natriumsulfat und destilliert dann das Lösungsmittel im Vakuum ab. Man gibt Ether zu den Kristallen und filtriert, wobei man das Produkt [30] erhält. Ausbeute: 7,32 g (74,856)
TLC: Rf₂ = 0,1.

31) PF(8-12): Boc-Nle-His-Asn-Leu-Gly-OBzl [31] Zu der Verbindung [30] (7,32 g, 11,6 mM) gibt man 5 ml Methylenchlorid und anschließend unter Eiskühlung 30 ml TFA zu und rührt 40 min bei Zimmertemperatur. Man konzentriert das Reaktionsgemisch im Vakuum, versetzt den Rückstand mit Ether, filtriert den Niederschlag, trocknet, löst in 40 ml trockenem DMF und stellt den pH durch Zugabe von NMM auf 7 ein. Man gibt HOBt (1,9 g, 13,92 mM) und Boc-Nle-OH (3,23 g, 13,92 mM), gelöst in trockenem DMF, und anschließend WSCI (2,5 ml, 13,92 mM) zu und rührt das Reaktionsgemisch über Nacht bei Zimmertemperatur. Man entfernt das Lösungsmittel im Vakuum, versetzt den Rückstand mit Wasser, filtriert den Niederschlag, wäscht zweimal mit 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung, zweimal mit 1N HCl und dreimal mit Wasser und trocknet, wobei man das Produkt [31] erhält. Ausbeute: 3,70 g (42,9%)
TLC: Rf₂ = 0,20.

32) PF(8-12): Boc-Nle-His-Asn-Leu-Gly-OH [32] Zu der Verbindung [31] (2,8 g, 3,8 mM), gelöst in 100 ml Ethanol, gibt man 300 mg 10% Pd/C und leitet 3 h bei Zimmertemperatur Wasserstoffgas ein. Man filtriert unlösliches Material, das in der Reaktionsmischung ausgefallen ist, wäscht mit DMF und konzentriert das Filtrat im Vakuum. Der Rückstand wird mit Ethanol-Ether versetzt, der Niederschlag durch Filtration gesammelt und getrocknet, wobei man das Produkt [32] erhält.
Ausbeute: 1,76 g (71,1%)

Fp. 112,5⁰C

TLC: Rf₂ = 0,05

Aminosäure-Analyse: Asp 0,96 (1), GIy 0,98 (1), Leu 1(1), His 0,95 (1), Nie 0,94 (1).

33) PFC8-34): _{Bo c}__{Nl e}__{HI s}__{As R}

-Leu-Gly-Ly s(Z-C I)-Hi s-Leu-Asn-Se r(Bzl )-Nle-Gl u(0 BzI)-ArgCTos )-V a 1-GIu(O BzI ) _ T r μ - L e u - A r g ( T ο s ) - L y s ( Z - C 1 ) - L y a ( Z-Cl)-Leu-GIn-As ρ (0 Bz1)-VaI -H i 3 -A 3 η-T/ r ( B ζ I -C I ₂ )- NH₂

(33)

Zu der Verbindung [27] (10,60 g, 2,5 mM) gibt man 0,33 g (2,5 mM) Skatol, 25 ml Dimethylsulfid, 2,5 ml Ethandithiol und 25 ml TFA, rührt 10 min bei 0°C und 50 min bei Zimmertemperatur und engt im Vakuum ein. Den Rückstand versetzt man mit Ether, filtriert den Niederschlag, trocknet, löst in 100 ml DMF und gibt unter Eiskühlung NMM zur Einstellung des pH auf 7 zu. Zu der Lösung gibt man HOBt (0,36 g, 2,7 mM) und die Verbindung [32] (1,76 g, 2,7 mM) und dann bei -15⁰C 0,5 ml WSCI und rührt über Nacht bei Zimmertemperatur. Der Niederschlag wird filtriert, mit Wasser gewaschen, getrocknet und erneut aus Ethanol-Ether ausgefällt, wobei man das Produkt [33] erhält. Ausbeute: 10,94 g (91,756)
Fp. 140,5 bis 162°C

C « ) ²D - /■ ⁹ * ^{C C =} °- ^{S 2} ' ^{D M F }} Aminosäure-Analyse: As ρ i. <T 7 (♦), Serft? i(0,

GIuJ. J <M3), Gl/0.77(0, Va 1 /. S V- (2),

Leu <M4), Tyr/.ö ^(D, Lysi,2i(Jl, His 35

2. 3 7 (3), ArgZ/ <i(z), Tr ρ 0. 7 J (D , NU

2.0 7 (2).

34) PF(7): Boc-Leu-OPAC [34]

Et-jN (12,5 ml, 90 mM) gibt man tropfenweise zu Boc-Leu-OH-H₂O (15,0 g, 60 mM) und Phenacylbromid (17,9 g, 90 mM), gelöst in 100 ml DMF, und rührt 2 h bei 30⁰C. Man setzt Kaliumacetat (4,42 g, 45 mM) zu, rührt 45 min bei Zimmertemperatur und destilliert DMF ab. Man wäscht den in Ethylacetat gelösten Rückstand zweimal mit 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung und zweimal mit Wasser, trocknet die Ethylacetatschicht mit wasserfreiem"Natriumsulfat und destilliert das Lösungsmittel im Vakuum ab.

Den Rückstand stellt man in einen Eisschrank und trocknet die ausgefällten Kristalle, wobei man das Produkt [34] erhält.

Ausbeute: 21,23 g (100%)

TLC: Rf₁ = 0,89.

35) PF(6-7): Boc-Gln-Leu-OPAC [35] Zu der Verbindung [34] (20,96 g, 60 mM) gibt man 20 ml Methylenchlorid, dann unter Eiskühlung 80 ml TFA, rührt 40 min bei Zimmertemperatur und konzentriert das Reaktionsgemisch im Vakuum, den Rückstand versetzt man mit Ether, filtriert das Präzlpitat, trocknet, löst in 70 ml trockenem DMF und stellt den pH unter Zugabe von NMM und unter Eiskühlung auf 7 ein. Zu der Lösung gibt man HOBt (8,1 g, 60 mM) und Boc-Gln-OH (14,78 g, 60 mM), gelöst in 90 ml trockenem DMF, und weiterhin bei -15°C WSCI (10,9 ml, 60 mM) und rührt über Nacht bei Zimmertemperatur. Man entfernt DMF im Vakuum, löst den Rückstand in Ethylacetat und wäscht zweimal mit 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung, zweimal mit 1N HCl und dreimal mit Wasser. Man trocknet die Ethylacetatschicht mit wasserfreiem Natriumsulfat, destilliert das Lösungsmittel im Vakuum ab, gibt Hexan zu den ausgefällten Kristallen, filtriert und trocknet, wobei man das Produkt [35] erhält.

Ausbeute: 17,25 g (60,2%)
TLC: Rf₁ = 0,38.

ι 36) PF(5-7): Boc-Ile-Gln-Leu-OPAC [36] Zu der Verbindung [35] (17,19 g, 36 mM) gibt man 10 ml Methylenchlorid, dann unter Eiskühlung 70 ml TFA, rührt 60 min bei Zimmertemperatur und konzentriert das Reaktionsgemisch im Vakuum. Den Rückstand trocknet man im Vakuum, löst in 130 ml trockenem DMF und stellt unter Eiskühlung den pH durch Zugabe von NMM auf 7 ein. Zu der Lösung gibt man tropfenweise HOBt (5,3 g, 39,6 mM) und Boc-Ile-OH.1/2H₂0 (9,5 g, 39,6 mM) und rührt über Nacht bei Zimmertemperatur. Man destilliert DMF im Vakuum ab, versetzt den Rückstand mit 5#iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung, filtriert das Präzipitat, wäscht mit 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung, zweimal mit 1N HCl und dreimal mit Wasser und trocknet. Das Präzipitat wird erneut aus Ethanol-Ether sedimentiert, wobei man das Produkt [36] erhält.
Ausbeute: 16,35 g (76,9%)
TLC: Rf₁ = 0,41, Rf₂ = 0,68.

37) PF(4-7): BOC-GIu(OBzI)-IIe-GIn-LeU-OPAC [37] Man gibt 10 ml Methylenchlorid zu der Verbindung [36] (16,24 g, 27,5 mM), versetzt die Lösung mit 70 ml TFA, rührt 60 min bei Zimmertemperatur und konzentriert das Reaktionsgemisch im Vakuum. Den Rückstand versetzt man mit Ether, filtriert den Niederschlag, trocknet, löst in 100 ml DMF und stellt unter Eikühlung den pH durch Zugabe von NMM auf 7 ein. Zu der Lösung gibt man HOBt (4,09 g, 30,25 mM) und Boc-Glu(OBzI)-OH (10,2 g, 3O,25mM), gelöst in 50 ml trockenem DMF, tropft bei -15⁰C 5,5 ml WSCI zu und rührt über Nacht bei Zimmertemperatur. DMF wird im Vakuum abdestilliert und der Rückstand mit 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung versetzt. Der gebildete Niederschlag wird filtriert, mit 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung, zweimal mit 1N HCl und viermal mit Wasser gewaschen und getrocknet. Durch erneutes

Ausfällen aus Ethanol-Ether erhält man das Produkt [37]. Ausbeute: 21,68 g (97,1%)
TLC: Rf₁ = 0,52.

38) PF(3-7): Boc-Ser(Bzl)-GIu(OBzI)-Ile-Gln-Leu-OPAC [38] Zu der Verbindung [37] (21,46 g, 26,5 mM) gibt man 10 ml Methylenchlorid, dann unter Eiskühlung 90 ml TFA, rührt bei Zimmertemperatur und engt das Reaktionsgemisch im Vakuum ein. Den Rückstand versetzt man mit Ether, filtriert den Niederschlag, trocknet, löst in 150 ml trockenem DMF und stellt den pH durch Zugabe von NMM unter Eiskühlung auf 7 ein. HOBt (3,9 g, 29,15 mM) und Boc-Ser-(BzI)-OH (8,6 g, 29,15 mM), gelöst in 50 ml trockenem DMF, werden zu der Lösung gegeben. Man setzt WSCI (5,3 ml, 29,15 mM) zu und rührt über Nacht bei Zimmertemperatur. Man destilliert DMF im Vakuum ab, versetzt den Rückstand mit 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung und filtriert den Niederschlag. Das Präzipitat wäscht man mit 5 %iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung, zweimal mit 1N HCl und viermal mit Wasser, suspendiert in Ether und filtriert, wobei man das Produkt [38] erhält. Ausbeute: 24,8 g (94,7%)
TLC: Rf₁ = 0,53.

39) PF(2-7): BOC-VaI-SOr(BzI)-GIu(OBzI)-IIe-GIn-LeU-OPAC [39]

Zu der Verbindung [38] (24,68 g, 25 mM) gibt man 20 ml Methylenchlorid, danach unter Eiskühlung 100 ml TFA und rührt 50 min bei Zimmertemperatur. Das Reaktionsgemisch konzentriert man im Vakuum, versetzt den Rückstand mit Ether, filtriert den Niederschlag und trocknet. Den getrockneten Niederschlag löst man in 120 ml trockenem DMF und stellt den pH der Lösung durch Zugabe von NMM unter Eiskühlung auf 7 ein. Zu der Lösung gibt man HOBt (4,05 g, 30 mM) und Boc-Val-OH (6,5 g, 30 mM), gelöst in 80 ml

trockenem DMF, tropft bei -15⁰C WSCI (5,5 ml, 30 mM) zu und rührt über Nacht bei Zimmertemperatur. Nach Zugabe von Wasser filtriert man das gebildete Präzipitat, wäscht zweimal mit 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung, zweimal mit 1N HCl und viermal mit Wasser, suspendiert in Ether und filtriert, wobei man das Produkt [39] erhält.

Ausbeute: 26,32 g (96,8%)
TLC: Rf₁ = 0,49.
10

40) PF(i-7): Boc-Ser(Bzl)-Val-Ser(BzI)-GIu(OBzI)-IIe-Gln-Leu-OPAC [40]

Zu der Verbindung [39] (26,07 g, 24 mM) gibt man 20 ml Methylenchlorid, anschließend 100 ml TFA und rührt 40 min bei Zimmertemperatur. Man konzentriert das Reaktionsgemisch im Vakuum, versetzt den Rückstand mit Ether, filtriert das Präzipitat, trocknet und löst in 100 ml trockenem DMF. Den pH der Lösung stellt man durch Zugabe von NMM auf 7 ein. Zu der Lösung gibt man HOBt (3,9 g, 28,8 mM) und Boc-Ser(BzI)-OH (8,5 g, 28,8 mM), gelöst in 50 ml trockenem DMF, fügt dann bei -15⁰C WSCI (5,3 ml, 28,8 mM) zu und rührt über Nacht bei Zimmertemperatur. In dem Reaktionsgemisch bildet sich ein Niederschlag, der mit Wasser versetzt wird. Der Niederschlag wird filtriert, mit 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung, 1N HCl und Wasser gewaschen, in Ether suspendiert und filtriert. Diesen Vorgang wiederholt man zweimal, wobei man das Produkt [40] erhält.
Ausbeute: 28,0 g (92,3%)

TLC: Rf₁ = 0,53.

41) PF(1-7): Boc-Ser(Bzl)-VaI-SOr(BzI)-GIu(OBzI)-IIe-Gln-Leu-OH [41]

Zu der Verbindung [40] (12,6 g, 10 mM), gelöst in 300 ml Essigsäure, gibt man 15 g Zinkpulver, rührt 4 h bei 50⁰C

und filtriert das Zinkpulver ab. Man destilliert die Essigsäure im Vakuum ab, versetzt den Rückstand mit Ether, sammelt die ausgefällten Kristalle und wäscht sie, wobei man das Produkt [41] erhält. Ausbeute: 11,15 g (97,4%)
Fp. 260⁰C (Zers.)
TLC: Rf₁ = 0,14, Rf₂ = 0,64
Aminosäure-Analyse: Ser 1,81 (2), GIu 2,02 (2),

VaI 0,95 (1), Leu 1 (1), lie 0,92 (1). 10

42)geschütztes-( N 1 e*, Nl e '", Ty r ** ] - h - P T H (

/ _ j φ ) NH₂ ; B ο c - S e r ( B ζ 1 ) - V a I

-S β r C B ζ I )-GI u(OBz I ) - I Ie-GIn

-Leti-Nle-His-AsQ-Leu-Gly-Lys

(Z-C I ) - H i s-Le u-As ti-Se r (Bz I ) -N I e -G 1 u ( OB ζ 1 ) -A r g ( T ο s ) - Va I -

GlulOBil)-Trp-Lu-Arg(Tos)-

Lys(Z-Cl)-L/s(Z-Cl )-Leu-Gin -As p(OBz I ) -Va 1 -H i s -As n-Ty r (

BzI-Cl^)-NH₂ C 42] Unter Eiskühlung gibt man zu der Verbindung [33] (10,86 g, 2,28 mM) 0,30 g (2,28 mM) Skatol, 25 ml Dimethylsulfid, 2,5 ml Ethandithiol und 25 ml TFA, rührt 60 min bei Zimmertemperatur und engt im Vakuum ein. Den Rückstand versetzt man mit Ether, filtriert das Präzlpitat, trocknet, löst in einem Gemisch von 100 ml trockenem DMF und 10 ml DMSO und stellt den pH unter Zugabe von NMM und unter Eiskühlung auf 7 ein. Man gibt HOBt (0,37 g, 2,74 mM) und die Verbindung [41] (3,14 g, 2,74 mM), dann bei -15°C WSCI (0,50 ml, 2,74 mM) zu und rührt über Nacht bei Zim-

mertemperatur. Man gibt Wasser zu dem Reaktionsgemisch, filtriert das Präzipitat und wäscht es mit Wasser und Ethanol-Ether, wobei man das Produkt [42] erhält. Ausbeute: 12,87 g (97,3%)

Fp. 139,5 bis 175⁰C

C a ] ² _D ⁸ - /. 9 7* C C = 0. S / . DMF ) Aminosäure-Analyse: Asp 3, 7 2 (*)_} Se r 2. 7 ά (3) ,

GIu J; s ε (5) _s GIy 0. έ ? (ι) , Va I 2. <Γ έ 0) , 9 > *

He/,/ /ID, Leui(J), Tyrö.f ?(ι)_; L/s 2. S 7(3) , Hiai/ f(3), Arg ^. 0 έ (2) , Tr ρ

O₁^i(Il, Nl β /. ? ό (2)
15

43) [Nie⁸, Nie¹⁸, Tyr³⁴]-h-PTH(1-34)NH₂ Zu der Verbindung [42] (2,9 g, 0,5 mM) gibt man 3,5 ml Anisol, 0,35 ml Ethandithiol, 3,5 ml Dimethylsulfid und 35 ml wasserfreien HF und rührt 60 min. Man destilliert HF im Vakuum ab, versetzt den Rückstand mit Ether, sammelt das Präzipitat und löst es in 0,1N Essigsäure. Die Lösung leitet man über eine Säule (3,5 x 12 cm) aus Dowex XV^R^(Acetat-Typ). Die Ninhydrin-positiven Fraktionen werden gesammelt und gefriergetrocknet, wobei man das rohe Produkt (1,87 g) erhält. Das in 50 ml 0,1N Essigsäure gelöste Produkt gibt man auf eine CM-Cellulose-Säule (2 χ 33 cm) und eluiert mittels linearer Gradientenelution mit 0,05 M Ammoniumacetat (pH 5,1; 1 1) 0,4 M Ammoniumacetat (pH 6,0; 1 l).Jewe£ß9,0 ml-Fraktionen mit einem ungefähren Rfg = 0,30, die Fraktionen 74-84, werden gesammelt und gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Material löst man in einer kleinen Menge 0,1N HCl, gibt die Lösung auf eine Sephadex G-25-Säule (3 x 115 cm) und eluiert mit 0,1N Essigsäure. Jede Fraktion

wird auf ihre Absorption bei 280 nm geprüft, und Fraktionen, die einen Hauptpeak zeigen, werden gesammelt öund gefriergetrocknet, wobei man [Nie⁸, Nie¹⁸, Tyr³⁴]-h-PTH(I-34)NH₂ erhält.
Ausbeute: 140 mg
TLC: Rf₆ = 0,30

Aminosäure-Analyse (hydrolysiert mittels 6N HCl, enthaltend 3% Thioglykolsäure): Asp 3,98(4), Ser 2,10(3), GIu 4.93 (5), GIy 0.97 (1), VaI 2.66 (3), He 0.87 (1), Leu 5.00 (5), Tyr 1.11 (1), Lys 3.26 (3), His 2.30 (2), Arg 2.03 (2), Trp 0.62 (1), Nie 2.22 (2).

HPLC: Säule; Nucleosil 5C18 (4 mm ID χ 150 mm)

Puffer: 0,1% Essigsäure-Acetonitril, enthaltend 0,1 M Phosphat (das Verhältnis von Acetonitril wird bestimmt

Lineargradient in 20% während anfänglicher 5 min und 20-40% während späterer 20 min) Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min
Bestimmung: 225 nm
Ergebnis: einziger Peak bei 19,07 min.

Beispiel 2

[Nie⁸, Nle¹⁸]-h~PTH (1-34)NH₃:
44) PF(23-34): Boc-Trp-Leu-Arg(TOs)-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-Leu-

GIn-Asp COBzI)-Val-His-Asn-Phe-NH₂ [43]

Z(OMe)-Gln-Asp(OBzI)-Val-His-Asn-Phe-NH₂ (1,68 g), hergestellt gemäß dem Verfahren der JA-OS 55-113753, wird in einer kleinen Menge Methylenchlorid suspendiert. Unter Eiskühlung gibt man 7 ml TFA zu und rührt 30 min bei Zimmertemperatur. Man destilliert TFA im Vakuum ab, ver-

setzt den Rückstand mit Ether, filtriert die ausgefällten Kristalle und trocknet sie. Die in 30 ml trockenem DMF gelösten Kristalle werden mit einer geringen Menge NMM neutralisiert. Man gibt 2,43 g der in Beispiel 1 erhaltenen Verbindung [12], 0,22 g HOBt, 20 ml trockenes DMF und bei -15⁰C WSCI (0,3 ml, 1,1 Mol-Äquiv.) zu und rührt über Nacht bei Zimmertemperatur. DMF wird im Vakuum abdestilliert, der Rückstand mit 59oiger wäßriger Natriumbicarbonatlösung und zweimal mit Wasser gewaschen, in Methanol suspendiert, mit Ether versetzt, filtriert und getrocknet, wobei man das Produkt [43] erhält. Ausbeute: 3,62 g
Fp. 262 bis 271⁰C
[<x]Jp = -4,51° (c = 0,3, DMF)

Aminosäure-Analyse:

Asp 1.94 (2), GIu 0.96 (1), VaI 0.71 (1),

Leu 2.00 (.2), Phe 0.98 (1), Lys 2.09 (2), His 0.58 (1), Arg 0.91 (1), Trp 0.78 (1).

45) PFU8-34): Boc-Nle-GlutOBzl) -Arg (Tosl-Val-Glu (OBzI) Trp-Leu-Arg(Tos)-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-Leu-Gln-Asp(OBzll-VaI-HiS-ASn-PlIe-NH₂ [44]

Zu der in Beispiel 1 hergestellten Verbindung [13](8,9 g, 3,5 mM) gibt man 0,5 g (3,5 mM) Skatol, 25 ml Dimethylsulfid, 2,5 ml Ethandithiol und 25 ml TFA, rührt 10 min bei O⁰C und 45 min bei Zimmertemperatur und konzentriert das Reaktionsgemisch im Vakuum. Den Rückstand versetzt man mit Ether, filtriert das Präzipitat, trocknet, löst in 100 ml DMF und neutralisiert mit NMM auf pH 7. Man gibt 0,54 g HOBt und 4,3 g Verbindung [43] und bei -15⁰C 0,73 ml WSCI zu und rührt 2 Tage bei Zimmertemperatur.

DMF destilliert man im Vakuum ab, versetzt den Rückstand

mit 5#iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung, filtriert den Niederschlag und wäscht mit Wasser. Man löst das Produkt in Ethanol und versetzt den Niederschlag mit Ether. Dieser Vorgang wird zweimal wiederholt, wobei man das Produkt [44] erhält.

Ausbeute: 11,12 g (95,6%)
Fp. 252⁰C (Zers.)
TLC: Rf₃ = 0,73
[a]^⁸ = -4,81° (c = 0,53, DMF)
Aminosäure-Analyse:

Asp 1.98 (2), GIu 3.04 (3),

VaI 1.69 (2), Leu 2 (2), Phe 1.07 (1), Lys 1.93 (2), His 0.59 (1), Arg 1.97 (2), Trp 0.35 (1), Nie 1.07 (1).

46) PF(i3-34):

Boc-Lys(Z-Cl)-His-Leu-Asn-Ser(BzI)-Nle-Glu(OBzI)—

Arg(Tos)-Val-Glu(OBzI)-Trp-Leu-Arg(Tos)-Lys(Z-Cl) Lys(Z-Cl)-Leu-Gln-Asp(OBzI)-Val-His-Asn-Phe-NH₂ [45]

Zu 10,77 g der in Beispiel 1 hergestellten Verbindung [20] gibt man 0,46 g Skatol, 25 ml Dimethylsulfid, 2,5 ml Ethandithiol und 25 ml TFA, rührt 10 min bei O⁰C und 60 min bei Zimmertemperatur und engt im Vakuum ein. Den Rückstand versetzt man mit Ether, filtriert den Niederschlag und trocknet. Das getrocknete Material löst man in 100 ml trockenem DMF und neutralisiert durch Zugabe von NMM auf pH 7. Man gibt 0,51 g HOBt, 4,23 g Verbindung [44] und bei -15⁰C 0,70 ml WSCI zu und rührt bei Zimmertemperatur. Man destilliert DMF im Vakuum ab, setzt Wasser zu, filtriert den Niederschlag, wäscht mit Wasser und trocknet, wobei man das Produkt [45] erhält. Ausbeute: 13,60 g

Fp. 140 bis 155°C

^ = -2,00° (c .= 0,56, DMF)

Aminosäure-Analyse:

Asp 2.96 (3), Ser 0.62 (1),

GIu 3.02 (3), VaI 1.72 (2), Leu 3 (3), Phe 1.06 (1), Lys 3.01 (3), His 1.43 (2), Arg 1.98 (2), Trp 0.60 (1), Nie 1.06 (1).

47) PF(8-34):

Boc-Nle-His-Asn-Leu-Gly-Lys(Z-Cl)-His-Leu-Asn-

ser(BzI)-NIe-GIu(OBzI)-Arg(Tos)-VaI-GIu(OBzI)-Trp-Leu-Arg(Tos)-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-Leu-Gln-Asp(OBzI)-Val-His-Asn-Phe-NH₂ [46]

Zu 10,60 g der Verbindung [45] gibt man 0,33 g Skatol, 25 ml Dimethylsulfid, 2,5 ml Ethandithiol und 25 ml TFA, rührt 10 min bei 0°C und 50 min bei Zimmertemperatur und konzentriert im Vakuum. Den Rückstand versetzt man mit Ether, filtriert den Niederschlag, trocknet, löst in 100 ml trockenem DMF und stellt unter Eiskühlung den pH durch Zugabe von NMM auf 7 ein. Zu der Lösung gibt man HOBt (0,36 g, 2,7 mM) und Verbindung [32] (1,76 g, 2,7 mM)., hergestellt in Beispiel 1, und bei .-15⁰C 0,5 ml WSCI und rührt über Nacht bei Zimmertemperatur. Man filtriert das ausgefällte Material, wäscht mit Wasser, trocknet und fällt erneut aus Ethanol-Ether aus, wobei man das Produkt [46] erhält.
Ausbeute: 10,94 g
Fp. 143 bis 161°C
[cc]£⁸= -2,01° (c = 0,52, DMF)

Aminosäure-Analyse:

Asp 3.87 (4), Ser 0.76 (1),

GIu 3.34 (3), GIy 0.77 CD, VaI 1.84 (2), Leu 4 (4), Phe 1.04 (1), Lys 3.28 (3), His 2.37 (4}, ; Arg 2.14 (2), Trp 0.73 (1), Nie 2.07 (2). \

48) geschütztes - [Nie⁸, Nie¹⁸]-h-ΡΤΗ(1-34)NH₂: Boc-Ser(BzI) Val-Ser(BzI)-GIu(OBzI)-Ile-Gln-Leu-Nle-His-Asn-Leu-Gly-Lys(Z-Cl)-His-Leu-Asn-Ser(BzI)-NIe-GIu (OBzI)-Arg(Tos)-VaI-GIu(OBzI)-Trp-Leu-Arg(Tos)-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-Leu-Gln-Asp(OBzI)-Val-His-Asn-Phe-NH-[47]

Unter Eiskühlung gibt man zu 10,86 g Verbindung [46]

0,30 g Skatol, 25 ml Dimethylsulfid, 2,5 ml Ethandithiol und 25 ml TFA, rührt 60 min bei Zimmertemperatur und konzentriert im Vakuum. Den Rückstand versetzt man mit Ether, filtriert den Niederschlag und trocknet. Das getrocknete Material löst man in einer Mischung von 100 ml trockenem DMF und 10 ml DMSO und stellt den pH unter Eiskühlung durch Zugabe von NMM auf 7 ein. Man gibt 0,37 g HOBt, 3»14 g in Beispiel 1 erhaltene Verbindung [41] und bei -15⁰C 0,51 mlWSCI zu und rührt über Nacht bei Zimmertemperatur. Zu dem Reaktionsgemisch gibt man Wasser, fil- triert den Niederschlag, wäscht mit Wasser und dann mit Ethanol-Ether, wobei man das Produkt [47] erhält. Ausbeute: 12,87 g Fp. 141 bis 171⁰C [a]^⁸ = - 1,97° (c = 0,71, DMF)

Aminosäure-Analyse:

Asp 3.72 (4) , Ser 2.76 (3) ,

GIu 5.58 'C5), GIy 0.69 (IJ , VaI 2.86 ■ (3) , He 1.11 CH, Leu 5 (5), Phe 1.01 (1), Lys 2.87 (3), His 2.19 (.3), Arg 2.06 (2), Trp 0.65 (1), Nie 1.96 (2).

49) [Nie⁸, Nie¹⁸]-h-PTH(1-34)NH₂

Zu der Verbindung [47](2,9 g) gibt man bei O⁰C 3,5 ml Anisol, 0,35 ml Ethandithiol, 3,5 ml Dimethylsulfid und 35 ml wasserfreien HF und rührt 60 min. Man destilliert HF im Vakuum ab, versetzt den Rückstand mit Ether, sam-

melt den Niederschlag und löst In 0,1 N Essigsäure. Die Lösung leitet man durch eine Säule (3,5 x 12 cm) aus Dowex X1 (Acetat-Typ); die Ninhydrin-positiven Fraktionen werden gesammelt und gefriergetrocknet, wobei man das rohe Produkt (1,87 g) erhält. Dieses löst man in 0,1 N Essigsäure (50 ml), gibt auf eine Säule (2 χ 33 cm) aus CM-Cellulose und eluiert dann mit Lineargradienten von 0,05 M Ammoniumacetat (pH 5,1; 1 l) bis 0,4 M Ammoniumacetat (pH 6,0; 1 1). Jede 9,0 ml Fraktion wird fraktioniert, und die Fraktionen 74 bis 84 mit einem ungefähren Rf₈ =0,28 werden gesammelt und gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wird in einer kleinen Menge 0,1N HCl gelöst, auf eine Säule (3 x 115 cm) aus Sephadex G-25 gegeben und mit 0,1N Essigsäure eluiert. Fraktionen, die eine Absorption bei 280 nm in einem Hauptpeak zeigen, werden gesammelt und gefriergetrocknet, wobei man [Nie , Nie¹⁸]-h-PTH( 1-34)-NH₂ erhält.
Ausbeute: 140 mg
TLC: Rf₆ = 0,28

Aminosäure-Analyse.(hydrolysiert mit 6N HCl, enthaltend 3% Thioglykolsäure):' _Asp 3.98 (4), Ser 2.10 (3),

GIu	4.93	C5),	GIy	0.97	(D,	VaI	2.	66	(3) ,
He	0.87	(D,	Leu	5.00	(5),	Phe	1.	01	(1).
Ly s	3.26	C3),	His	2.30	(3) ,	Arg	2.	03	(2) ,
Trp	0.62	(D,	Nie	2.22	(2) .

HPLC: Säule; Nucleosil 5C18 (4 mm ID χ 150 mm) Puffer: 0,1% Essigsäure-Acetonitril, enthaltend 0,1 M Phosphat (Verhältnis von Acetonitril; die ersten 5 min 20%, spätere 20 min 20 bis 40% Lineargradient).

Claims (2)

KRAUS · WEISERT & PARTNER PATENTANWÄLTE UND ZUGELASSENE VERTRETER VOR DEM EUROPÄISCHEN PATENtAMT DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER · DR-ING. DIPL.-ING. ANNEKÄTE WEISERT ■ DIPL.-PHVS. JOHANNES SPIEi IRMGARDSTRASSE 15 · D - 8OOO MÜNCHEN 71 · TELEFON 089/797077 TELEGRAMM KRAUSPATENT · TELEX 5-212156 kpat d · TELEFAX (OB9) 7 91 82 33 4630 AW/My TOYO JOZO KABUSHIKI KAISHA Tagata, Japan [Nie8, Nie18, Tyr34]-h-PTH(1-34)NH2-Peptidderivate Patentanspr ü c h e

1. J Ein Peptid der Formel
H-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Nle-His-Asn-Leu-Gly

-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Nle-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu j

-ATg-LyS-LyS-LeU-GIn-ASp-VaI-HiS-ASn-A-NH₂ \ worin A für Tyr oder Phe steht, oder eines seiner Salze.

2. Ein Jod-125-markiertes [Nie⁸, Nie¹⁸, Tyr³⁴]-h-PTH(I-34)NH₂.