DE2944086A1 - Peptidderivate - Google Patents

Peptidderivate

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DE2944086A1 DE19792944086 DE2944086A DE2944086A1 DE 2944086 A1 DE2944086 A1 DE 2944086A1 DE 19792944086 DE19792944086 DE 19792944086 DE 2944086 A DE2944086 A DE 2944086A DE 2944086 A1 DE2944086 A1 DE 2944086A1
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Description

BESCHREIBUNG
Die Erfindung betrifft neue Peptidderivate, die als Substrate zur Messung der Aktivität von spezifischen Enzymen oder als Zwischenprodukte für solche Substrate geeignet sind.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, synthetische Substrate zur Verfügung zu stellen, mit deren Hilfe die Aktivität von spezifischen Enzymen in einfacher und hochempfindlicher Weise gemessen werden kann.
Diese Aufgabe wurde erfindungsgemaß durch die Synthese von Peptidderivaten der nachstehenden allgemeinen Formel gelöst :
R1-NH-CH-CONH-R2
(CH2)3
NH
C=NH J NH2
in der R1 für eine Seryl-, Phenylalanyl-seryl-, Threonyl- oder Leucyl-threonyl-Gruppe steht und Rp eine der Gruppen
oder \7~ N°2i
bedeutet.
In dem Peptidderivat der vorstehend angegebenen allgemeinen Formel kann die endständige N^-Aminogruppe durch üblicherweise
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angewendete Schutzgruppen für die !^-Aminogruppen von Peptiden geschützt sein, wie Acylgruppen, z.B. Acetyl- oder Benzoylgruppen, Carbobenzoxygruppen, tert.-Alkoxycarbonylgruppen, Tosylgruppen oder Glutarylgruppen, während die Hydroxylgruppe mit Hilfe einer Schutzgruppe geschützt sein kann, die bei den üblichen Verfahren zur Peptidsynthese verwendet wird, wie durch eine Alkyl- oder Benzylgruppe. Die Guanidinogruppe des Argininrests, der in dem Peptidderivat vorliegt, kann mit Hilfe einer N-Guanidino-Schutzgruppe geschützt sein, die bei den üblichen Verfahren zur Peptidsynthese verwendet wird, wie mit Hilfe einer Nitrogruppe, Tosylgruppe oder p-Methoxybenzolsulfonylgruppe, oder durch Addition eines Protons , wie durch Umsetzung mit einer Säure. Das vorstehend erwähnte erfindungsgemäße Peptidderivat kann in Form seines Säure-Additionssalzes, beispielsweise der Essigsäure oder Chlorwasserstoffsäure, oder in Form des Hydrats vorliegen.
Die vorstehend definierten neuen Peptidderivate können als Substrate oder Zwischenprodukt für solche Substrate für Enzyme, wie Faktor XI0, deren Aktivität in einfacher und hochempfindlicher Weise gemessen werden kann, verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Peptidderivat ist (Seryl-arginyl)-4-methylcumaryl-7-amid oder Seryl-arginin-p-nitroanilid, wenn R1 eine Serylgruppe bedeutet; es ist (Phenylalanyl-serylarginyl)-4-methylcumaryl-7-amid oder Phenylalanyl-seryl-arginin-p-nitroanilid, wenn R1 eine Phenylalanyl-seryl-Gruppe bedeutet; (Lysyl-arginyl)-4-methylcumaryl-7-amid oder Lysylarginin-p-nitroanilid, wenn R1 eine Lysylgruppe bedeutet; (Leucyl-threonyl-arginylJ-^-methylcumaryl-y-amid oder Leucylthreonyl-arginin-p-nitroanilid, wenn R1 für eine Leucylthreonyl-Gruupe steht.
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Ein p-Nitroanilid-Derivat des erfindungsgemäßen Peptidderivats kann z.B. in folgender Weise synthetisiert werden. Ein Ester von !^-geschütztem Serin wird mit Hilfe einer üblichen Methode in sein Hydrazid übergeführt und wird dann mit dem p-Nitroanilid-Derivat des Arginine umgesetzt, um Seryl-arginin-p-nitroanilid zu bilden. Ein Ester von !^-geschütztem Phenylalanyl-serin wird mit Hilfe einer üblichen Methode in sein Hydrazid übergeführt und wird mit dem p-Nitroanilid-Derivat des Arginins unter Bildung von Phenylalanyl-seryl-arginin-p-nitroanilid umgesetzt.
Ein Ester von !^-geschütztem Threonin wird mit Hilfe einer Üblichen Methode in sein Hydrazid-Derivat übergeführt und wird mit dem p-Nitroanilid-Derivat von Arginin unter Bildung von Threonyl-arginin-p-nitroanilid umgesetzt.
Ein Ester von N^-geschütztem Leucyl-threonin wird mit Hilfe einer üblichen Methode in sein Hydrazid-Derivat übergeführt und wird mit dem p-Nitroanilid-Derivat des Arginins umgesetzt, wobei Leucyl-threonyl-arginin-p-nitroanilid gebildet wird.
Ein 4-Methylcumaryl-7-amid-Derivat des erfindungsgemäßen Peptidderivats kann z.B. in folgender Weise synthetisiert werden.
7-Amino-4-methylcumarin und Arginin, dessen Aminogruppe und Guanidinogruppe geschützt sind, werden in Gegenwart eines Kondensationsmittels, wie Dicyclohexylcarbodiimid (DCCD), wie es üblicherweise für Peptidsynthesen angewendet wird, miteinander umgesetzt. Dann werden die Schutzgruppen für die Aminogruppe und Guanidinogruppe in einer Weise, die in der Peptidsynthese üblich ist, entfernt, wobei Arginyl-4-methylcumaryl-7-amid erhalten wird.
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kf -
Das erfindugsgemäße Peptidderivat kann unter Verwendung des so erhaltenen Arginyl-^-methylcumaryl-y-amids als Ausgangsmaterial mit Hilfe einer in der Peptidsynthese angewendeten üblichen Methode hergestellt werden. Dies kann beispielsweise durch Umsetzung von Serin, dessen Aminogruppe und Hydroxylgruppe geschützt sind, mit dem vorstehend erwähnten 4-Methylcumaryl-7-amid, dessen N01-Aminogruppe nicht geschützt ist, in Gegenwart eines solchen Kondensationsmittels, oder durch Umsetzung eines vorstehend erwähnten aktiven Esters von Serin mit dem vorstehend angegebenen 4-Methylcumarin-7-amid-Derivat und anschließende Entfernung der Schutzgruppen erfolgen, wobei (Na-Seryl-arginyl)-4-methylcumaryl-7-amid erhalten wird. Ferner wird durch Umsetzung von (I^-nichtgeschütztem-Seryl-N -geschütztem-arginylj^-methylcumaryl-?- amid mit einem aktiven Ester von Phenylalanin, dessen Aminogruppe geschützt ist, und anschließende Entfernung der Schutzgruppen in gleicher Weise wie vorher, (Phenylalanyl-serylarginyl)-4-methylcumaryl-7-amid erhalten. Durch Umsetzung von (I^-nicht-geschütztem-«-geschütztem-Arginyl)-4-methylcumaryl-7-amid mit einem aktiven Ester von Threonin, dessen Aminogruppe geschützt ist, und anschließende Entfernung der Schutzgruppen in gleicher Weise wie vorher wird (Threonyl-arginyl)-4-methylcumaryl-7-amid erhalten. Durch Umsetzung von (Na-nicht-geschütztem-Threonyl-arginyl)-4-methylcumaryl-7-amid mit einem aktiven Ester des Leucins, dessen Aminogruppe geschützt ist, und anschließendes Entfernen der Schutzgruppen in gleicher Weise wie vorher wird (Leucylthreonyl-arginyl)-4-methylcumaryl-7-amid erhalten.
Die Kondensationsreaktion für die Synthese des erfindungsgemäßen Peptidderivats sollte vorzugsweise in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Dimethylformamid (DMF), Dimethylsulfoxid, Wasser oder einem Gemisch solcher Lösungsmittel vorgenommen werden. Die mit einer Aminokomponente umzusetzende Carboxylkomponente sollte vorzugsweise in Form eines aktiven Esters eingesetzt werden, vorzugsweise des N-Hydroxysuccinimidesters
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oder p-Nitrophenylesters.
Die Reaktion unter Verwendung eines solchen aktiven Esters verläuft zwar ausreichend bei Raumtemperatur, sie kann aber auch gewünschtenfalls durch Erhitzen beschleunigt werden·
Nach Beendigung der Reaktion wird das Reaktionsgemisch konzentriert und unter Bildung einer festen Substanz getrocknet und der Rückstand wird durch Säulenchromatographie gereinigt und gefriergetrocknet.
Wenn die resultierende Verbindung Schutzgruppen für eine Amino- oder Carboxylgruppe aufweist, können diese Schutzgruppen mit Hilfe eines üblichen Verfahrens zur Entfernung der Schutzgruppen entfernt werden. So können beispielsweise Carbobenzoxygruppen oder Benzylestergruppen durch Hydrierung in einem Alkohol oder einem ähnlichen Lösungsmittel entfernt werden, während die tert.-Butyloxycarbonylgruppe durch Umsetzen mit Toluolsulfonsäure während etwa 90 Minuten in Essigsäure oder anderen Lösungsmitteln entfernt werden kann.
Das erfindungsgemäße Peptidderivat in isolierter Form kann in ein Säuresalz übergeführt werden oder andererseits kann das Peptidderivat, wenn es in Form eines Säuresalzes vorliegt, in die isolierte Form übergeführt werden, wie es für den entsprechenden Fall erforderlich ist. Zu Beispielen für solche Säuresalze gehören Salze anorganischer Säuren, wie das Hydrochlorid, Sulfat, Nitrat oder Phosphat, und Salze organischer Säuren, wie das Acetat, Oxalat, Tartrat, Succinat, Citrat oder Toluolsulfonat.
Das so erhaltene Peptidderivat wurde durch Elementaranalyse, Aminosäureanalyse und das UV-Absorptionsspektrum identifiziert.
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2 ΰ Α Λ Ο 8 6
Da die erfindungsgemäßen Peptidderivate durch Enzyme, wie
Faktor XI und dergleichen hydrolisiert werden können, sind
CL
diese Peptidderivate sehr gut geeignet als synthetische
Substrate für diese spezifischen Enzyme.
Die in den erfindungsgemäßen Peptidderivaten vorliegenden
Aminosäuren können in der L-oder D-Form vorliegen; die L-Form wird jedoch stärker bevorzugt.
Die Erfindung wird nachstehend anhand der folgenden Beispiele ausführlicher erläutert.
Beispiel 1
17,2 g L-Serin-methylester-hydrochlorid wurden in 200 ml Dichlormethan gelöst und zu dieser Lösung wurden 15,4 ml Triäthylamin zugesetzt. Zu dem so erhaltenen Gemisch wurde eine homogene Lösung von 36,2 ml tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin-N-hydroxysuccinimidester in 200 ml Tetrahydrofuran
(THF) gegeben. Das Gemisch wurde 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und danach wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck von dem Reaktionsgemisch entfernt. Der Rückstand wurde in 300 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung wurde mit 100 ml 0,5 η Chlorwasserstoffsäure geschüttelt. Die organische Schicht wurde mit 100 ml einer 5 %igen wässrigen Lösung von Natriumbicarbonat und dann mit 100 ml Wasser gewaschen und über
Magnesiumsulfat getrocknet. Das Trocknungsmittel wurde durch Filtration entfernt und die so erhaltene organische Schicht
wurde unter vermindertem Druck konzentriert,wobei eine feste Substanz erhalten wurde. Zu der verbliebenen Substanz wurden 500 ml n-Hexan zugefügt, wobei eine gelartige feste Substanz erhalten wurde. Diese feste Substanz wurde durch Filtration
gewonnen, mit n-Hexan gewaschen und getrocknet, wobei der
Methylester von tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-serin erhalten wurde.
0 3 0 U 2 0 / 0 7 6 7
J. 294AU86
Ausbeute : 36 g (98 %); Schmelzpunkt : 90 - 93°C; spezifische Drehung [α]^5 = -0,18° (c = 2,75, DMF) Elementaranalyse :
Berechnet für C18H26N2O6 1/4H2O : C 58,28 %, H 7,20 %t
N 7,55 0A', Gefunden : C 58,46 %, H 7,30 %, N 7,43 JS.
18,3 g tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-serin-methylester wurden in 50 ml Methylalkohol gelöst und zu dieser Lösung wurden 7,5 ml 80 %iges Hydrazin-monohydrat zugefügt. Das Gemisch wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und dann wurde das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck konzentriert, wobei eine feste Substanz erhalten wurde. Die feste Substanz wurde mit Äthylalkohol umkristallisiert, wobei tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-serin-hydrazid erhalten wurde.
Ausbeute : 12,8 g (70 %); Schmelzpunkt : 176 - 1770C (Zers.); spezifische Drehung [a]|5= -3,33° (c = 2,52, DMF) Elementaranalyse :
Berechnet für C17H25N4O5 : C 55,72 %, H 7,15 %, N 15,29 %; Gefunden : C 55,83 %, H 7,17 %, N 15,28
2»75 g tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-serin-hydrazid wurden in 30 ml DMF gelöst und zu dieser Lösung wurden 2,4 ml einer 6,3 η Chlorwasserstofflösung in Dioxan gegeben. Zu dem Gemisch wurden 1,17 g Isoamylnitrit unter Kühlen auf -300C gegeben und das erhaltene Gemisch wurden 15 Minuten bei -150C gerührt, wonach diesem Gemisch 2,1 ml Triethylamin zugesetzt wurden.
1,84 g des Hydrochloride von L-Arginin-p-nitroanilid wurden in 20 ml DMF gelöst und zu dieser Lösung wurde 0,7 ml Triethylamin zugefügt.
Die beiden vorstehend erhaltenen Lösungen wurden bei einer Temperatur von weniger als -100C miteinander vermischt und das so erhaltene Gemisch wurde 20 Stunden bei -70C gerührt.
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29U086
Das Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck konzentriert, wobei eine feste Substanz erhalten wurde, und die Substanz wurde in 200 ml Äthylacetat gelöst. Dazu wurden 200 ml einer mit Natriumchlorid gesättigten wässrigen Lösung zugesetzt und das Gemisch wurde geschüttelt. Die organische Schicht wurde mit 200 ml einer mit Natriumchlorid gesättigten wässrigen Lösung geschüttelt, ein weiteres Mal geschüttelt und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt und die verbleibende Substanz wurde durch Chromatographie an Silicagel gereinigt. (Säulengröße : 3 x 20 cm, Lösungsmittelsystem : Chloroform/ Methylalkohol/Essigsäure = 20/2/1 und 20/4/1). Die Hauptfraktionen wurden gewonnen und bis zur Bildung einer festen Substanz konzentriert. Die Substanz wurde in 100 ml Essigsäure gelöst und gefriergetrocknet, wobei tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-seryl-L-arginin-p-nitroanilid-hydrochlorid erhalten wurde.
Ausbeute : 2,35 g (71 %); Schmelzpunkt : 1500C (Zers.); spezifische Drehung O]^5= -23,1° (c = 0,64, DMF) Elementaranalyse :
Berechnet für C29H40N8O8-HCl-CH3COOH : C 51,34 %, H 6,25 %,
N 15,45 %; Gefunden : C 51,40 %, H 6,41 %, N 14,96 %.
Beispiel 2
250 ml Äthylalkohol wurden zu 13,1 g L-Threonin gegeben und in die so erhaltene Lösung wurde Chlorwasserstoff eingeleitet, , so daß die Lösung mit Chlorwasserstoff gesättigt war. Dieses Gemisch wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und dann unter vermindertem Druck bis zur Bildung einer festen Substanz konzentriert. Zu der Substanz wurden 200 ml Dichlormethan und 15,4 ml Triäthylamin zugesetzt. Zu dieser Lösung wurde eine homogene Lösung von 32,8 g tert.-Butyloxycarbonyl-L-
0 3 ü 0 2 0 / Ü 7 6 7
M 29Λ4C)86
leucin-N-hydroxysuccinimidester in 200 ml THF zugesetzt und das so erhaltene Gemisch wurde 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und unter vermindertem Druck bis zur Bildung einer festen Substanz konzentriert. Die Substanz wurde in 300 ml Äthylacetat gelöst, dazu wurden 100 ml 1/2 η Chlorwasserstoffsäure zugesetzt und das Gemisch wurde geschüttelt. Die organische Schicht wurde dann mit 100 ml einer 5 %igen wässrigen Lösung von Natriumbicarbonat und dann mit 100 ml Wasser gewaschen. Die so erhaltene organische Schicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Trocknungsmittel wurde durch Filtration entfernt und der so erhaltene Rückstand unter vermindertem Druck bis zur Bildung einer festen Substanz konzentriert. Zu der verbleibenden Substanz wurden 50 ml Äthylacetat und 400 ml η-Hexan zugesetzt. Die Kristallisation wurde durch Reiben mit einem Glasstab unter Kühlung eingeleitet. Die gebildeten Kristalle wurden durch Filtration gewonnen und dann mit η-Hexan gewaschen, wobei der Äthylester von tert.-Butyloxycarbonyl-L-leucyl-L-threonin erhalten wurde.
Ausbeute : 34 g (94 %); Schmelzpunkt : 67 - 700C; spezifische Drehung [a]^5= -19,3° (c = 1,95, DMF) Elementaranalyse :
Berechnet für C17H32N2O6 : C 56,64 %, H 8,95 %, N 7,77 %', Gefunden : C 57,16 %, H 9,40 %, N 7,40 %.
18 g des Äthylesters von tert.-Butyloxycarbonyl-L-leucyl-L-threonin wurden in 50 ml Methylalkohol gelöst und dann wurden 7,5 ml 80 #iges Hydrazin-monohydrat zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und dann unter vermindertem Druck bis zur Bildung einer festen Substanz konzentriert.
Die Substanz wurde in 50 ml Äthylalkohol gelöst und schließlich wurde durch Zugabe von Äthyläther zu der Lösung eine gelartige feste Substanz gebildet. Die Substanz wurde durch Filtration gewonnen und dann mit Äthyläther gewaschen, wobei tert,-
030020/0767
Butyloxycarbonyl-L-leucyl-L-threonin-hydrazid erhalten wurde.
Ausbeute : 15 g (87 %)', Schmelzpunkt: 146 - 1480C; spezifische Drehung [a]^5 = -20,8° (c = 1,46, DIiF) Elementaranalyse :
Berechnet für C15H30N4O5 : C 52,00 %, H 8,73 %, N 16,18 %-, Gefunden : C 52,29 %, H 8,87 %, N 16,20 %.
2,60 g tert.-Butyloxycarbonyl-L-leucyl-L-threonin-hydrazid wurden in 30 ml DMF gelöst und dann wurden 2,4 ml einer 6,3 η Lösung von Chlorwasserstoff in Dioxan zugesetzt. Schließlich wurden 1,17 g Isoamylnitrit bei -300C zugefügt. Das erhaltene Gemisch wurde 15 Minuten bei -15°C gerührt, wonach 2,1 ml Triäthylamin bei -700C zugefügt wurden.
Andererseits wurden 1,84 g L-Arginin-p-nitroanilid-2-hydrochlorid in 20 ml DT-IF gelöst, wonach 0,7 ml Triäthylamin der Lösung zugefügt wurde.
Die beiden vorstehend erhaltenen Lösungen wurden bei -10 C oder einer Temperatur von weniger als -100C miteinander vermischt und danach wurde das Gemisch 45 Stunden lang bei 00C gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck unter Bildung einer festen Substanz konzentriert, die verbliebene Substanz wurde in 200 ml Äthylacetat und 200 ml einer mit Natriumchlorid gesättigten wässrigen Lösung gelöst und das Gemisch wurde geschüttelt. Die organische Schicht wurde wieder mit 200 ml einer mit Natriumchlorid gesättigten wässrigen Lösung geschüttelt und dann über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde durch Filtration unter vermindertem Druck entfernt und die verbleibende Substanz wurde zur Reinigung der Säulenchromatographie an Silicagel unterworfen (Kolonnengröße : 3 x 20 cm; Lösungsmittelsystem : Chloroform/Methylalkohol/Essigsäure = 20/2/1 und 20/4/1). Die Hauptfraktionen wurden gewonnen, miteinander vermischt und unter Bildung einer festen Substanz konzentriert. Die verbleibende Substanz wurde in 100 ml Essigsäure gelöst und gefriergetrocknet, wobei tert,-
0 30Q20/0767
Butyloxycarbonyl-L-leucyl-L-threonyl-L-arginin-p-nitroanilidhydrochlorid erhalten wurde·
Ausbeute : 1,82 g (56 %); Schmelzpunkt : 1520C (Zers.); spezifische Drehung O]^5= -31,6° (c = 0,82, DMF) Elementaranalyse :
Berechnet für C27H^4NgO8.HCl.CH3C0OH : C 49,39 %, H 7,00 %
N 15,89 %', Gefunden : C 49,67 %, H 7,30 %, N 15,24 %.
Beispiel 3
2,75 g tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-serin-hydrazid wurden in 30 ml DMF gelöst und dann wurden 2,4 ml einer 6,3 η Lösung von Chlorwasserstoff in Dioxan zugefügt, wonach 1,17 g Isoamylnitrit bei -300C zugesetzt wurden. Das so erhaltene Gemisch wurde 15 Minuten bei -15°C gerührt und dann wurden 2,1 ml Triäthylamin bei -700C zugefügt.
Andererseits wurden 2,51 g des Hydrochlorids von (Carbobenzoxy-L-arginyl)-4-methylcumaryl-7-amid in 50 ml Methylalkohol, 10 ml Essigsäure und 10 ml Wasser gelöst und dazu wurden 250 g eines aus 5 % Palladium auf Kohle bestehenden Katalysators zugefügt. Das gebildete Gemisch wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck unter Durchleiten von Wasserstoff zur katalytisehen Reduktion gerührt. Der Katalysator wurde dann entfernt und das Filtrat unter vermindertem Druck zur Bildung einer festen Substanz konzentriert. Die erhaltene Substanz wurde in 20 ml DMF, 15 ml Wasser und 5 ml Essigsäure gelöst.
Die beiden vorstehend erhaltenen Lösungen wurden bei nicht mehr als -10 C miteinander vermischt, dann wurde der pH-Wert der so erhaltenen Lösung durch Zugabe von Triäthylamin auf 7 eingestellt. Das gebildete Gemisch wurde 20 Stunden bei -7°C gerührt und unter vermindertem Druck zur Bildung einer festen
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Substanz konzentriert. Die erhaltene Substanz wurde in 200 ml Äthylacetat, 50 ml Methylalkohol und 200 ml einer mit Natriumchlorid gesättigten wässrigen Lösung gelöst und geschüttelt. Die organische Schicht wurde erneut mit 100 ml einer mit Natriumchlorid gesättigten wässrigen Lösung geschüttelt und dann wurde die organische Schicht abgetrennt und zur Bildung einer festen Substanz konzentriert.
Die verbleibende Substanz wurde zur Reinigung der Chromatographie an Silicagel unterworfen (Säulengröße 3 x 20 cm; Lösungsmittelsystem : Chloroform/Methylalkohol/Essigsäure = 20/2/1 und 20/4/1) und die Hauptfraktionen wurden gewonnen, miteinander vermischt und zur Bildung einer festen Substanz konzentriert. Die verbliebene Substanz wurde in 100 ml Essigsäure gelöst und gefriergetrocknet, wobei (tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-seryl-L-arginyl)-4-methylcumaryl-7-amid erhalten wurde.
Ausbeute : 2,2 g (63 %); Schmelzpunkt : 155°C (Zers.); spezifische Drehung [a]^5= -26,2° (c = 0,61, DMF) Elementaranalyse :
Berechnet für C33H43N7O8-HCl^CH3COOH : C 54,04 %, H 6,37 %,
N 11,93 %l Gefunden j C 53,09 %, H 6,44 %, N 11,76 %.
Beispiel 4
2,60 g tert.-Butyloxycarbonyl-L-leucyl-L-threonin-hydrazid wurden in 30 ml DMF gelöst und dann wurden 2,4 ml einer 6,3 η Lösung von Chlorwasserstoff in Dioxan zugefügt. Schließlich wurden 1,17 g Isoamylnitrit bei -300C zugegeben. Das so erhal- tene Gemisch wurde 15 Minuten bei -15°C gerührt und schließlich wurden 2,1 ml Triäthylamin bei einer Temperatur von -700C zugegeben.
0 3 U 0 2 0 / ü 7 6 7
Λ5- 29U086
Andererseits wurden 2,51 g (Carbobenzoxy-L-arginyl)-4-methylcumaryl-7-amid in 50 ml Äthylalkohol, 10 ml Essigsäure und 10 ml Wasser gelöst und zu der Lösung wurden 250 mg eines aus 5 % Palladium auf Kohle bestehenden Katalysators gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck unter Durchleiten von Wasserstoff gerührt, um die katalytische Reduktion durchzuführen. Der Katalysator wurde dann entfernt und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck bis zur Bildung einer festen Substanz konzentriert. Die erhaltene Substanz wurde in 20 ml DMF, 15 ml Wasser und 5 ml Essigsäure gelöst.
Die beiden wie vorstehend erhaltenen Lösungen wurden bei -100C bzw. weniger als -100C vermischt und der pH-Wert des so erhaltenen Gemisches wurde durch Zugabe von Triäthylamin auf 7 eingestellt. Das so gebildete Gemisch wurde 45 Stunden bei O0C gerührt und dann unter vermindertem Druck konzentriert, bis eine feste Substanz gebildet war. Die erhaltene Substanz wurde in 200 ml Äthylacetat, 50 ml Methylalkohol und 200 ml einer mit Natriumchlorid gesättigten wässrigen Lösung gelöst und das so erhaltene Gemisch wurde geschüttelt. Die organische Schicht wurde erneut mit 100 ml einer mit Natriumchlorid gesättigten wässrigen Lösung geschüttelt und die erhaltene organische Schicht wurde unter Bildung einer festen Substanz konzentriert. Die verbleibende Substanz wurde der Chromatographie an Silicagel unterworfen, um sie zu reinigen. Zur Chromatographie wurde eine Säulengröße von 3 x 20 cm und ein Lösungsmittelsystem aus Chloroform/Methylalkohol/Essigsäure = 20/2/1 und 20/4/1 angewendet. Die Hauptfraktionen wurden gewonnen, miteinander vermischt und unter Bildung einer festen Substanz konzentriert. Die verbleibende Substanz wurde in 100 ml Essigsäure gelöst und gefriergetrocknet, wobei (tert.-Butyloxycarbonyl-L-leucyl-L-threonyl-L-arginyl)-4-methylcumaryl-7-amid-hydrochlorid erhalten wurde.
030020/0767
2 9 A Λ U 8 6
Ausbeute : 1,90 g (56 %); Schmelzpunkt : 16O°C (Zers.); spezifische Drehung [a]^5= -40,0° (c = 0,35, DMF) Elementaranalyse :
Berechnet für C31H47N7Og.HCl-2CH,C00H : C 52,39 %, H 7,04 %,
N 12,22 % Gefunden : C 51,96 %, H 7,19 %, N 12,44 %.
Beispiel 5
5,02 g (Carbobenzoxy-L-arginyl)-4-methylcumaryl-7-amid-hydrochloridsalz wurden in 20 ml Essigsäure, 100 ml Methylalkohol und 20 ml Wasser gelöst und dann wurden 500 mg eines aus 5 % Palladium auf Kohle bestehenden Katalysators zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck unter Durchleiten von Wasserstoff gerührt, um die katalytische Reduktion durchzuführen. Dann wurde der Katalysator entfernt und das FiItrat wurde unter vermindertem Druck unter Bildung einer festen Substanz konzentriert. Die verbleibende Substanz wurde in 20 ml DMF und 2 ml Wasser gelöst und dann wurden 4,7 g tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-serin-N-hydroxysuccinimid-ester zugesetzt. Das so erhaltene Gemisch wurde gerührt. Das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt. Die verbleibende Substanz wurde durch Chromatographie an Silicagel gereinigt (Kolonnengröße : 4 χ 20 cm; Lösungsmittelsystem : Chloroform/Methylalkohol/ Essigsäure = 85/15/5) und die Hauptfraktionen wurden gewonnen und miteinander vermischt.
Zu der verbleibenden Substanz wurde Äther zugefügt, wobei ein Pulver erhalten wurde. Das Pulver wurde durch Filtration gewon- ■ nen. Auf diese Weise wurde das Hydrochlorid von (tert.-Butyloxycarbonyl-0-benzyl-L-seryl-L-arginyl)-4-methylcumaryl-7-amid erhalten.
0 3ijf: ?n / π 767
2 9 Λ Λ ϋ 8
Ausbeute : 2,6 g (40 %); Schmelzpunkt : 1500C (Zers.); spezifische Drehung [a]^5 =-20,5° (c = 0,43, EMF) Elementaranalyse :
Berechnet für C31H40O7N6-HCLCH3COOH : C 56,20 %, H 6,43 %,
N 11,92 % Gefunden : C 55,71 %, H 6,29 %, N 12,00 %.
Beispiel 6
5,02 g (Carbobenzoxy-L-arginyl)-4-methylcumaryl-7-amid wurden in 20 ml Essigsäure, 100 ml Methylalkohol und 20 ml V/asser gelöst. Dazu wurden 500 mg eines aus 5 % Palladium auf Kohle bestehenden Katalysators zugesetzt. Das gebildete Gemisch wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck gerührt, während Viasserstoff zur katalytisehen Reduktion durchgeleitet wurde.
Der Katalysator wurde dann entfernt und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck aus dem Filtrat abdestilliert. Der so erhaltene Rückstand wurde in 20 ml DMF und 2 ml Wasser gelöst und dann wurden 4,9 g tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-threonin-N-hydroxysuccinimid-ester zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde 20 Stunden gerührt und dann unter vermindertem Druck bis zur Bildung einer festen Substanz konzentriert.
Die verbleibende Substanz wurde durch Chromatographie an SiIicagel gereinigt (Kolonnengröße : 4 χ 20 cm; Lösungsmittelsystem : Chloroform/Methylalkohol/Essigsäure = 95/5/3 und 85/15/5) und die Hauptfraktionen wurden gewonnen und bis zur Bildung einer festen Substanz konzentriert. Die Substanz wurde in 20 ml heißer Essigsäure gelöst und dann umkristallisiert, wobei (t.-Butyloxycarbonyl-0-benzyl-L-threonyl-L-arginyl)-4-methylcumaryl-7-amid-hydrochlorid erhalten wurde.
0 3 Π 020/0 7 67
AS- 29ΑΛ086
Ausbeute : 3,1 g; Schmelzpunkt : 2180C (Zers.); spezifische Drehung [α]^5 = -24,4° (c = 0,71, DMF) Elementaranalyse :
Berechnet für C32H42O7N6-HCLCH3COOH : C 56,77 %, H 6,59 %,
N 11,69 % Gefunden : C 57,33 %, H 6,56 %, N 11,74 %.
Beispiel 7
1»29 g (tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-seryl-L-arginyl)-4-methylcumaryl-7-amid-hydrochlorid, 4 ml Essigsäure und 450 mg p-Toluolsulfonsäure-monohydrat wurden miteinander vermischt und 3 Stunden bei 200C gerührt. Durch Zugabe von 100 ml Äther wurde eine pulverförmige Substanz ausgefällt, die durch Filtration gewonnen wurde. Das Pulver wurde in 10 ml DMF gelöst und der pH-Wert wurde durch Zugabe von Triäthylamin auf 7 eingestellt. Zu dem so erhaltenen Gemisch wurden 1,09 g tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin-N-hydroxysuccinimidester zugesetzt und das so erhaltene Gemisch wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann bis zur Bildung einer festen Substanz konzentriert. Die verbleibende Substanz wurde in 50 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung wurde mit 50 ml 0,5 η Chlorwasserstoff säure und dann mit 50 ml Wasser gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet und schließlich unter Bildung einer festen Substanz konzentriert. Die verbleibende Substanz wurde zur Reinigung einer Chromatographie an Silicagel unterworfen (Säulengröße : 2 χ 15 cm; Lösungsmittelsystem : Chloroform/Methylalkohol/Essigsäure = 95/5/3 und 95/30/3), wobei die Hauptfraktionen gewonnen und unter Bildung einer festen Substanz konzentriert wurden.
Die erhaltene Substanz wurde in 50 ml Essigsäure gelöst und gefriergetrocknet, wobei (tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-0-benzyl-L-seryl-arginyl)-4-methylcumaryl-7-amid-hydrochlorid erhalten wurde.
03 00 2 0/0767
29UU86
Ausbeute : 1,21 g (76 %); Schmelzpunkt: 15O0C (Zers.); spezifische Drehung [a]^5 = -10,6° (c = 0,52, DMF) Elementaranalyse :
Berechnet für C40H49OgN74HClOH3COOH : C 59,18 %, H 6,39%,
N 11,51 % Gefunden : C 59,51 %, H 6,10 %, N 10,83.
Die Aktivität von Faktor XI wurde in folgender Weise bestimmt : Zu Faktor XI (A280=I,72) und Faktor XIIa (A280=O,028) wurden 5 pl hochmolekulares Kininogen (HMW Kininogen) (HMW-K; 65, 32,5» 3,25, 0,65 bzw. 0 pMol/ml) zugemischt und dann wurden 10 pl Kaolin (1,25 mg/ml) zugesetzt. Die so erhaltenen Gemische wurden 30 Minuten bei 37°C inkubiert, wonach 5 ul (tert,-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-seryl-L-arginyl)-4-methylcumaryl-7-amid (=Boc-Phe-Ser-Arg-MCA; 10 mM) zugesetzt wurden. Das durch die enzymatische Reaktion freigesetzte 7-Amino-4-methylcumarin (AMC) wurde mit Hilfe eines Fluoreszenzphotometers (Hitachi Spectrofluorophotometer) gemessen.
Faktor XII„ wurde in Form einer Lösung eingesetzt, die 0,1 m
el
Natriumchlorid und 0,02 m Trispuffer (pH 8,0) und Rinder serum albumin (0,1 mg/ml) enthielt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 1 aufgetragen. Wie aus Fig. 1 ersichtlich ist, ist die Aktivität von Faktor XI
proportional dem Volumen an hochmolekularem Kininogen und die Volumteile des Faktors XI können daher mit Hilfe von Boc-Phe-Ser-Arg-MCA bestimmt werden.
In Tabelle 1 sind die relativen Reaktionsraten von Faktor IX ,
Faktor XI„ und Faktor XII_ gegenüber erfindungsgemäßen 7-Amino-
SL el
4-methylcumarinderivaten gezeigt. Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, wird Boc-Phe-Ser-Arg-MCA partiell durch Faktor IX
und Faktor XII hydrolysiert; es ist jedoch unmöglich, daß diese partielle Hydrolyse einen ungünstigen Einfluß auf die Bestimmung von Faktor XI hat, da Faktor IX die Fraktion des Faktors XI praktisch nicht verunreinigt.
0 3 0 0 2 0/0767
Faktor XII kann praktisch vernachlässigt werden, da seine Fähigkeit zur Hydrolyse von Boc-Phe-Ser-Arg-MCA nur etwa 1/5 beträgt, selbst wenn Faktor XII als Verunreinigung vorhanden ist.
Wie die Tabelle 1 zeigt, ist (tert.-Butyloxycarbonyl-L-leucyl-L-threonyl-L-arginyl)-4-methylcumaryl-7-amid (=Boc-Leu-Thr-Arg-MCA) als Substrat für Faktor XIa stärker spezifisch als Boc-Phe-Ser-Arg-MCA.
Tabelle 1
. . . Relative Reaktionsrate Substrat
Faktor IXQ Faktor XI Faktor a a
Boc-Phe-Ser-Arg-MCA 29 100 14
Boc-Leu-Thr-Arg-MCA nicht be- 182 10
stimmbar
Durch die gleichen Versuche, wie die vorstehend beschriebenen wurde bestätigt, daß die anderen erfindungsgemäßen Peptidderivate ebenfalls gute Substrate für Faktor XI darstellen.
030020/0767

Claims (5)

  1. RA T - Nj T \ N Λ'Λ LTE
    SCHIFF ν. FÜNER STREHL SCHÜBtL-HÜPF EBBINGHAUS FINCK
    MARIAHILFPl AiZ 2 A 3, MÜNCHEN 9O ^ ,^ f, ,-
    POSTADRESSE: POSTFACH 95 O1 bO, D-80OO MÖNCHEN Θ5 £ J 'γ '-*■ IJ Q U
    ALSO PROF E-SSlONAL RtRWT Sr.NTATivES BEfORE THE EUROPEAN PATENT OfFlCE
    • KARL LUDWIG SCHIFF (1ΡΠ4-197Β)
    D)PL. CHEM. D». ALEXANDER v. FLJNhR
    DIPL. ING. RE-TER SlRtHL
    DIPL. CMEM. DR. UWSULA SCMÜBEL- MQRF
    DIPL. ING. DlETtR FHRINGHAUS
    DR. ING. DiEIEW FINCK
    TEL EFON (OPβ) 4Θ2Ο64
    TELEX 633665 AURO D
    TELEGRAMME AUROMARCPAT MÖNCHEN
    AJINOMOTO CO., INC. DEA-13 330
    31. Oktober 1979
    Peptidderivate
    PATENTANSPRÜCHE
    \ 1.i Peptidderivate der Formel
    R1-NH-CH-CONH-R
    (CH2) 3
    NH
    C=NH
    in der R^ eine Seryl-, Phenylalanyl-seryl-, Threonyl- oder
    Leucyl-threonylgruppe und Rp eine der Gruppen
    030020/0767
    oder \ ,./
    bedeuten,
    und deren Säure-Additionssalze.
  2. 2. Peptidderivate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die endständige I^-Aminogruppe geschlitzt ist.
  3. 3. Peptidderivate nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß die Hydroxylgruppe geschützt ist.
  4. 4. Peptidderivate nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß als Schutzgruppe für die endständige N01-Ami no gruppe eine Acyl-, Carbobenzoxy-, t er t,- Alkyl oxy carbonyl-, Tosyl- oder Glutarylgruppe vorliegt.
  5. 5. Peptidderivate nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß die in dem Peptidderivat vorliegende Guanidingruppe des Argininrests mit Hilfe einer N-Guanidino-Schutzgruppe geschützt ist.
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