DE2119966A1

DE2119966A1 - Verbessertes Verfahren zur Herstellung von L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolinamid

Info

Publication number: DE2119966A1
Application number: DE19712119966
Authority: DE
Inventors: Shumpei Suita; Fujii Toshiyuki Minoo; Osaka Sakakibara (Japan). P
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority date: 1970-04-25
Filing date: 1971-04-23
Publication date: 1971-11-25
Also published as: FR2090682A5; JPS4829225B1; CH557362A

Description

DiLMOLLER-BORt DIPL-PHYS. DR.MAMΙΤΊ DIPt.-CHEM. DR. TEUFEL DIPL-ING. FINSTERWALD DIPL-ING. GRAMKOW 2119966 PATENTANWÄLTE

' 23. APR. «71

Ph/Sv - Ϊ 1116

Tanabe Seiyaku Co., Ltd.

21, Doshomachi 3-chome, Higashi-ku,

Osaka/Japan

Verbessertes Verfahren zur Herstellung von L-Pyroglutainyl-L-histidyl-L-prolinamid

Priorität: Japan vom 2>. April 1970, Nr. 35524/70

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-prollnamid. Die Verbindung ist durch die folgende Formel dargestellt:

O <*-^ir ^ GOlOrI - GH - GOIi

GH,

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Die Verbindung ist als thyreotropin freisetzender Faktor oder als die Schilddrüse stimulierender Faktor nützlich.

ist bekannt, ein Histidyl-peptid durch die Kondensationsreak tion einer Aminosäure oder eines Peptids mit Histidin herzustel len, dessen Iminogruppe gegebenenfalls Gruppen wie Benzyl-, Benzyloxycarbonyl- und iTrityl-Gruppen aufweist. Dieses Verfahren ist jedoch für die industrielle Verwendung nicht befriedigend. Wird Histidin mit einer freien Iminogruppe der Kondensationsreaktion mit einer Aminosäure oder einem Peptid unterworfen, kann eine Nebenreaktion wie etwa eine Kondensation an der Iminogruppe des Histidine unvermeidlich während der Reaktion stattfinden. Darüberhinaus sind, da das entstehende Histidylpeptid in einem organischen Lösungsmittel schwer löslich ist, Gegenstromverteilungsverfahren oder andere komplizierte Verfahren zu seiner Gewinnung und/oder Reinigung erforderlich. Wird die Iminogruppe mit einer Gruppe wie beispielsweise der Benzyl-, Benzyloxycarbonyl- oder Trityl-Gruppe geschützt, ist die Entfernung der Schutzgruppe aus dem entstehenden Peptid möglicherweise nicht leicht durchzuführen, ohne die gleichzeitig Entfernung der Schutzgruppe an der 06 -Aminogruppe auszulösen.· Unter diesen Umständen wurde ein Versuch zur Herstellung von L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolinamid gemacht, doch war die Ausbeute beträchtlich gering (HeIv. Chim. Acta J^, 63 (1970)). Die Gesamtausbeute vom Histidin-Hethylester ist 7 ⁰P·

Es wurde nun gefunden, daß ein neues N^xm-tosyl-L-histidin-derivat der folgenden Formel:

(II)

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air· Zwischenstufe für die Synthese von L-Pyroglutarayl-L-Histidyl-L-prolinaiuid von Nutzen ist, worin X die o-Hitrophenylsulfenyl-, p-Hethoxybenzyloxycarbonyl-, t-Aiayloxycarbonyl- oder t-Butoxycai'bonyl-Gruppe, H ein Wrsserstoffatom oder eine Alkoxycarbonylgruppe mit ?. bis 7 Kohlenstoffatomen darstellt. Besonders die kondensationsreaktion des Π -Tosyl-L-histidin-derivats (H) nit L-prolinanid kann glatt in hoher Ausbeute durchgeführt v/erden, und die Schutzgruppe X kann von dem entstandenen Dipeptid ohne cledchzGJL^jjjrt; intfernung der Tosyl~ruppe abgespalten werden.

i-'rfincungsgeiüäß kann L-tyroglutamyl-L-histidyl-L-prolinamid

(I) durch kondensieren eines H -Tosyl-L-histiäin-derivats

(II) mit L-l^Jrolinamid (ill) unter .Bildung einer H^1In-!Eosyl--L-histid3⁷l-L-prolinamid-Verbindung (IV), Entfernen der Schutzgruppe X von der iX-Aminogruppe, Kondensieren des resultierenden H^im-Tosyl-L-histidyl-L-prolinamids mit L-Pyroglutaminsäure (V) mit geschützter Imidogruppe und Entfernen der Tosylgruppe und der schutzgruppe Y von der Tripeptidverbindung (VI) hergestellt werden.

Die vorgenannten erfindungsgemäßen Ifaktionen sind durch das folgende Schema dargestellt:

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K/ rr~ CHp-CH-COOH

so

CH,

HH-X

(ID

-f

COIiH

(in)

IT

r-CH ^-CH-COK.

K SO

HH-X

I-'

CH.

coira:.

Abspalten der Schutzgruppe X

(2)

-ί

'COOH · 'CONH-CH-COM

ι

H/ ι

COMH,

SO₂

GH

• Abspalten der üchutz-

fr)

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worin X eine Schutzgruppe bedeutet, X und R. dieselbe Bedeutung wie ob'en haben.

JJie Auscangsverbindung (II) gemäß der vorliegenden Erfindung kann leicht hergestellt werden, Beispieslsweise wird L-Histidinliethyl ester mit p-Nitrophenylsulfenylchlorid oder t-Butoxycarbonylchlorid bei -5° bis 5° ^ in Gegenwart einer organischen Base (z.B. · 'Iriäthylaiain, tyridin) in einem inerten Lösungsmittel (z.B. !^ethanol, Chloroform) behandelt. Andererseits wird L-Histidininethylester mit t-Jonylazidoformiat oder p-Kethoxybenzylazidoformiat bei 25° bis 35°G in Gegenwart einer organischen Base behandelt, öo erhaltener N -geschützter-L-Histidin-methylester wird in üblicher Weise mit .alkalimetallhydroxid (z.B.Natriumhydroxid) hydrolysiert und dann mit Tosylchlorid bei 10 bis 25°0 behandelt. iT"^lia-Tosyl-L-histidin mit einer geschützten oc-Aminogruppe kann in einer Ausbeute von ungefähr 60 bis 75 ^c/° vom L-Histidin-methylester erhalten werden. Das O-Alkoxycarbonylderivat (d.h. ein Gemisch des Anhydrid, R ist eine Alkoxycarbonylgruppe) von IT ^m-üosyl-L-histidin mit einer geschützten öt -Aminogruppe kann durch Behandeln des N ^m-!I3osyl-L-histidins mit einer geschützten oc -Aminogruppe mit einem Alkylchloroformiat bei -15° bis 0°C in einem /§rten Lösungsmittel (beispielsweise Toluol, ietrahydrofuran) hergestellt werden. Die so erhaltene Reaktionslösung der gemischten Anhydridverbindung kann als solche für 3äre nachfolgende Reaktionen verwendet werden.

Gemäß der Erfindung kann die Kondensationsreaktion des lT^im-Tosyl-L-histidin-derivats (II) mit L-trolinamid (ill) in herkömmlicher Weise durchgeführt werden. Beispielsweise kann N^lm-Tosyl-L-histidyl-L-prolinamid (IV) mit einer geschützten oO-Aminogruppe durch Behandeln von L-Prolinamid und H^lm-Tosyl-L-histidin (II, R ist Wasserstoff atom) mit einer geschützten CC-Amino gruppe in Gegenwart eines Oarbodiimid-Reagens (z.B. H, IT'-Dicyclohexylcarbodiiuid, li-Äthyl-IT'-diraethylaminopropylcarbodiimid) bei -10° bis

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10°C, vorzugsweise bei -5° bis 5°C hergestellt werden, .andererseits 'kann die Reaktion durch Behandeln von L-Prolinaiaid und einem gemischten Anhydrid (II, R « eine Alkoxycarbonylgruppe) von If^-Tosyl-L-histidin mit einer geschützten Ot-Aminogruppe durchgeführt werden. Im letzteren Falle wird die iteaktion bevorzugt bei -10° bis O⁰G durchgeführt, '.!tetrahydrofuran, Äthylacetat, Dioxan, Chloroform, Kethylenchlorid oder Dimethylformamid können als Lösungsmittel für diese Reaktionen eingesetzt werden.

Die nachfolgende Abspaltung der Schutzgruppe X von der Uipeptid-Verbindung (IV) kann nach einem bekannten Verfahren ausgeführt fc werden. Beispielsweise kann die Reaktion bevorzugt durch Behandeln mit Irifluoressigsäure oder Chlorwasserstoffsäure in einem inerten Lösungsmittel (z.B. Dioxan) ungefähr bei Raumtemperatur (d.h. 10° bis 35°C) ausgeführt werden.

Die Tosylgruppe an der Imino-Gruppe des Hisbidinteils wird während der obengenannten Kondensationsreaktion und der nachfolgenden Abspaltung der Schutzgruppe X unverändert erhalten.

Das so erhaltene H^-Tosyl-L-histidyl-L-prolinamid wird dann der Kondensation mit L-Pyroglutaminsäure (V) mit einer geschützten Imidogruppe unterworfen. Die Gruppe X, die zum Schutz der Imidogruppe der L-Pyroglutaminsäure eingesetzt werden kann, schließt ψ eine Acyl-Gruppe ein, beispielsweise die p-IIethoxybenzyloxycarbonyl-, t-Amyloxycarbonyl-, t-Butoxycarbonyl- und Benzyloxycarbonyl-Gruppe. Die Kondensationsreaktion kann in der gleichen Weise wie "bei der vorgenannten Kondensationsreaktion ausgeführt werden. Beispielsweise kann L-Pyroglutamyl-lT^lm-tosyl-L-histidyl-L-prolinamid (VI), bei dem die Imido-Gruppe des L-Pyroglutamyl-Teils geschützt ist, durch Behandeln von N^lm-Tosyl-L-histidyl-Ii-prolinamid mit L-Pyroglutaminsäure mit einer geschützten Imido-Gruppe in Gegenwart eines Carbodiimid-Reagens hergestellt werden»

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Andererseits kann die Verbindung (VI) durch Behandeln von L-Pyroglutaminsäure mit einer geschützten Imido-Gruppe mit einem Alkylchloroformiat (z.B.Äthylchloroformiat, Isobutylchloroformiat) und Behandeln des erhaltenen gemischen .Anhydrids mit N'^-Tosyl-L-histidyl-L-prolinamid hergestellt werden. I¹Ur die Kondensationsrealctionen können annähernd die gleichen Reaktionsbedingungen wie obengenannt angewandt werden.

Das Entfernen der Tosyl-Gruppe, und der Schutzgruppe Y aus dem so erhaltenen Tripeptid (Vl) kann bevorzugt durch Behandeln mit flüssigen Fluorwasserstoff bei ~5° bis 5°G> insbesondere bei etwa O⁰O durchgeführt werden.

So kann L-tyroglutamyl-L-histidyl-L-prolinamid in einer Gesamtausbeute über 45 />>, bezogen auf IT^lm-'I!osyl-histidin-derivat (II), hergestellt werden.

Bevorzugte und praktische Ausführungsfοrmen der vorliegenden ürfindun.3 sind durch die folgenden Beispiele zur Erläuterung aufgezeigt. K^lm besieht sich auf üen Itiinostickstoff von Histidin und/ oder seinem entsprechenden Teil.

.Beispiel. X

26 ml 'l'riäthylanin ^^erden einer Suspension von 12 g L-Eistidinmethylester-dihydrochlorid in Λ%) nl Kethanol bei p° bis 10°0 zugesetzt. 19 g p-Hitrophenylsulfenyl-cliloriö. v.'erden der Lösung bei der gleichen "Temperatur nach und nach in JG ais- unter kräftigem Rühren zugesetzt. Das Gemisch wird weitere 2 h gerührt. Hach der Zugabe von 300 ml Wasser wird die Mischung auf pH 2 - 3 mit verdünnter Schwefelsäure angesäuert. Das Gerisch wird dreimal mit 200 ml Äthylacetat gewaschen, sodann irit einer wässrigen ns.triuitbicarbonatlösung alkalisch gemacht. Das Gemisch wird mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird mit "Wasser gewaschen, getrocknet

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und dann bei 3O⁰O unter vermindertem Druck zur Entfernung des' Lösungsmittels eingedampft. 13»4 g H -(0-nitroplienylsulfenyl)-· L-histidin-methylester werden als öl erhalten.

13»^· S des trodukts werden in 125 ml Dioxan gelöst und 45 ml 2M-lYatriumhydro.xid der Lösung zugesetzt. Lie Lösung wird 1 h bei 10° bis 15°0 gerührt. 11 ml iCriäthylamin werden der Reaktionslösung zugegeben. Dann wird eine Lösung von 11 g Tosylchlorid in 20 ml Dioxan der Lösung unter Rühren bei 1O°C für 45 h zugesetzt. Nach einer weiteren Stunde Kühren bei 10° bis 15⁰C wird das Gemisch mit verdünnter Schwefelsäure neutralisiert. Dioxan wird bei 3O⁰C unter vermindertem Druck abdestilliert. Der so erhaltene Rückstand wird in 300 ml Wasser suspendiert. Die Suspension wird auf pH 2-3 mit verdünnter. Schwefelsäure angesäuert. Das Gemisch wird mit Äthylacetat extrahiert. Der Ithylacetat-Extrakt wird mit Wasser gewaschen, getrocknet und dann bei 30⁰C unter vermindertem Druck zur Entfernung des Lösungsmittels eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther gewaschen und aus einem G-emisch aus Äthylacetat und η-Hexan umkristallisiert, 14,4 g H^-(ü-Nitro^enylsulfenyl)-lT^im-iosyl-L-histidin werden erhalten. Ausbeute: 75,0 %, Schmelzpunkt 139° bis 140⁰C.

Beispiel 2

L-Histidin-Kethylester, aus 12,0 g L-Histidöi-methylesterdihydrochlorid gemäß dem in "Chemische Berichte" 2Z_r 2497 (1964) be-

™ schriebenen Verfahren hergestellt, wird in 20 ml trockenem Pyridin gelöst. Der Lösung werden 14,3 g t-ijnylazidoformiat zugesetzt. Das Gemisch wird drei Tage bei 3O⁰O gerührt. Pyridin wird bei 50⁰C unter vermindertem Druck abdestilliert. Dann werden 300 ml üthylacetat zum Rückstand gegeben und die unlöslichen Stoffe durch Filtrieren entfernt, ΰεε Filtrat wird bei 40⁰C unter vermindertem Druck bis zux* Irockene eingeengt. Der so erhaltene ölige Rückstand wird in 30 ml Methanol gelöst und 100 ml 1h.-ITatriumhydroxid der Lösung zugegeben. Die Lösung wird bei Raum-

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temperatur eine stunde lang gerührt. Ihr wird eine Lösung von 16,0 ^natriumcarbonat in 300 nl Wasser, sodann eine Lösung von T/,5 c iⁿosylchlorid in 50 ml Dioxan unter Kühren bei Raumt3ja.peratur zugetropft. Das Gemisch wird weitere M- h bei der gleichen Tenperatur gerührt. Hach der Zugabe von 500 ml Vasser T/ird das lieaktionsgemisch dreimal mit 100 ml Äther gewaschen. Diο wässrige ochicht wird nit verdünnter Schwefelsäure auf pH 2-5 angesäuert. Dann wird die wässrige Lösung mit Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wird mit iither gewaschen, getrocknet und dann unter vermindertem Druck bis zur trockene eingeengt. Der so - erhaltene Rückstand wird aus einem G-emisch von Äthylacetat und n~IIexan umkristallisiert. 15j8 g H°^-(t-Amyloxyca]Donyl)-N^:im-ⁱi¹osyl-L-histidin werden als Nadeln erhalten. Ausbeute: 75 fr, Schmelzpunkt 109,5 bis 110,5°C.

L-Histidin-iaethylester, hergestellt aus 12,0 g L-Histidin-methylester-dihydrochlorid gemäß dem in "Chemische Berichte" ^Z, 2497 (1964) beschriebenen Verfahren hergestellt, wird in 20 ml trockenem tyridin gelöst. Der Lösung werden 20,7 6 p-Methoxybenzylazidoformiat zugesetzt. Die Mischung wird bei 35°° 70 h/gerührt. Pyridin wird unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wird in 200 ml -äthylacetat gelöst. Die Äthyl ac etat-Lö sung wird mit einer wässrigen, Ira-schwefelsauren Lösung extrahiert. Die wässrige Schicht wird mit Uatriumbicarbonat alkalisch gemacht und dann erneut mit 200 ml Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wird mit Wasser gewaschen, getrocknet und unter vermindertem Druck bis zur Trockene eingeengt. 17 B IT^ -(p-Hethoxybenzyloxycarbonyl)-L-Histidin-methylester werden als öl erhalten.

17 g des Produkts v/erden in 30 ml !!ethanol gelöst. 100 ml 1K-Hatriumhydroxid werden der Lösung zugegeben. Die Lösung wird 1 h lang bei Kaumtemperatur gerührt. Die Eeaktionslösung wird mit Äthylacetat gewaschen. Ihr wird eine Lösung von 17 g Hatrium-

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Karbonat in 200 ml Wasser zugesetzt und dann eine Lösung von 13 g Tosylchlorid in 60 ml Dioxan unter Rühren bei 10° bis 1>°C zugetropft» Das Gemisch wird weitere 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach. Zugabe von 300 ml.Wasser wird die Reaktionsmischung mit 200 ml Äther gewaschen. Die 'wässrige Schicht wird mit verdünnter ochwefolsäure auf pH 2 - 3 angesäuert und mit 300 ml Äthylacetat extrahiert. Der Ätiiylacetat extrakt wird nit 'wasser gewaschen, getrocknet und unter "verbindertem Druck auf ungefähr 50 ml eingeengt. D^r konzentrierten Lösung werden 9 C Dicyclohexylaniin zugegeben. Die ausgeschiedenen Kristalle werden durch Filtrieren gesammelt und aus einem Gemisch von Methanol und Äthylacetat umkristallisiert. 2Pt g Bicyelohexylaninsalz von !!^-(p-Kethoxybensyloxycarbonyl)- w Ή -Tosyl-L-histidin werden erhalten. Ausbeute: 68,3 %? Schmelzpunkt 179 - 180,5⁰C

Beispiel 4

280 ml feLäthylamin werden einer Suspension von 120 g L-Histidinmethylester-dihydrochlorid in 600 ml Chloroform bei 0° bis -5°0 zugegeben. 600 ml einer Lösung von t-Butoxycarbonylchlorid in iDetrahydrofuran (t-Butoxycarbonylchlorid-Gehalt: 273 g) werden der Lösimg bei der gleichen Temperatur zugefügt. Das Gemisch wird bei Säumfceiaperatur 2 h lang gerührt. Dem Gemisch werden 5Q0 ml Chloroform zugesetzt. Die Chloroformschicht wird mit Wasser gewaschen* Mach dem Ansäuern auf pH 2 - 3 mit verdünnter Schwef elfc säure tiird die Chloroformlösung mit 5 %iger wässriger iiatrium— bicarbonatlösung und dann mit einer wässrigen gesättigten I'Tatriumchloridlösung gewaschen. Die Lösung wird getrocknet und zur Trockene eingeengt. Dem Rückstand werden 3^0 ml Methanol zugesetzt. Dann werden 450 ml 1*t-lTatriumhydroxid der Iiethano!lösung zugegeben und das Gemisch bei Raumtemperatur 2 h gerührt. ITach der Reaktion wird eine !lösung von 200 g Natriumcarbonat in 2000 ml Wasser den Gemisch zugegeben. Das Gemisch wird mit Äther gewaschen und dann eine Lösung von 123,5 g Tosylchlorid in 300 ml Dioxan dem Gemisch bei 10°C in einer Stunde zugesetzt. Das Gemisch wird 3 h

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/J

bei Raumtemperatur gerührt. Nach dreimaligem Waschen mit Äther "wird die wässrige Schicht mit verdünnter Schwefelsäure auf pH 2-3 angesäuert. Die wässrige Lösung wird nit Äthylaeetat extrahiert» Der Äthylacetatextrakt wird nit einer wässrigen gesättigten NatriumChloridlösung gewaschen, getrocknet und dann bei 4O°C unter vermindertem Druck zur Entfernung des Lösungsmittels eingeennt. 107,0 g H^ -(t-i3utoxycat>onyl)-H^ln-^riiosyl-L-liistidin werden erhalten. Ausbeute: 52 f»_t Schmelzpunkt 123 - 125°C,

Beispiel 5

2,5 G H^0C-(O-Niiropiienylsulfenyl)-lT^li:i-tosyl-L-histidin und 0,57 G L-Irolinanid werden in einem Gemisch von 20 ml Dimethylformamid und 50 ml lcetonitril gelöst, 1,1 g HjNidicyclöhexylcarboäiimid werden der Lösung zugegeben. Die Lösung wird bei O⁰C 30 min und dann bei Raumtemperatur über Uacht gerührt. Die Reaktionslösung wird zur Entfernung unlöslicher Stoffe filtriert. Das JPiltrat vird unter vermindertem Druck konzentriert, und der so erhaltene Hücicstcnä in üthylacetat gelöst. Die Äthylacetat lösung wird nacheinejader mit Ιη,-Schuef el säure, 5 /«Lg er wässriger lietriumbicarbonatlösung \uid "Wasser gev/aachen. Dann vjirc .die Lesung getrocknet und zur i&itfernung des Lcsungsriittels eingeen^· ^en Rückstand werden JO nl Iiethanol/Äther (1 : 5) sun Auslo?istallisieren zugesetzt. 2,0 g H -(ü-Iiitrcphenyl-sulfenyi)-lT^xia-tosyl-L-hiEtiä7l-Iipidinamid werden erhalten. Ausbeute: 7^ /<>· Unkristallisieren des Irodukts aus üthylacetat ergibt Kristalle nit einem Schmelzpunkt

von 1SC⁰C. foC] ^Λ' + 15,1° (G = 0,5, Dinethylf omauid), D

1,28 g der kristalle werden in einen ü-enisch aus 1,5 ml Hethylenchlorid und 0,5 ^l -^oisol gelöst. Der Lösung werden unter Eiskühlung 1,5 ml ¹IrIfluoressigsäure zugegeben. Dann wi^d die lüschung bei Raumtemperatur 30 min gerührt. Das Heaktionsgemisch wird zur Entfernung des Lösungsmittels und überschüssiger Itengen von Trifluoressigsäure eingedampft. Dem Rückstand werden 30 ml "trockener

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Äther zum Ausfällen von IT "-Tosyl-L-hictidyl-L-prolinanid-tri- ' fluoracetat als Pulver zug eg eben. Das tulver wird in 5 ml wässri-Ger ITatriumcarbonatlösung (pH 6 bis 6,5) gelöst..

1,1 g Dicyclohexylaminsalζ der IT-Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutaminsäure werden in 20 ml Äthylacetat suspendiert. Der Suspension werden 5 ^ml In Schwefelsäure zugegeben. Die Athylacetatschicht wird abgetrennt, mit Wasser gewaschen und dann getrocknet. Die Losung wird zur Entfernung des Lösungsmittels eingedampft. Der Rückstand wird in 7 -QiI absolutem Tetrahydrofuran gelöst, und der Lösung 0,32 ml Triäthylamin zugegeben. Dpnn werden 2 ml einer absoluten Toluollösung mit einem Gehalt von 0,32 ml Isobutyl-chloroformiat w der Lösung bei -10° bis -7°C zugegeben. Die so erhaltene Lösung wird der obengenannten Lösung von IT ^m-Tosyl-L-histid3^1-L-prolinamid-trifluoracetat unter kräftigem Rühren bei O⁰O zugegeben. !Tech einstündigem Rühren bei Raumtemperatur wird das Gemisch eingedampft, um Tetrahydrofuran zu entfernen. Der so erhaltene Rückstand wird in 30 ml Chloroform gelöst. Die Chloroformlösung wird nacheinander mit 1n Schwefelsäure, 5 %iger wässriger ITatriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen. Die Lösung wird getrocknet und dann zur Entfernung des Lösungsmittels eingedampft. 1,1 g IT-Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamyl-IT^lm-tosyl-L-histidyl-L-prolinaia] v/erden als Rohprodukt erhalten. Ausbeute: 73»6 ^c/'°»

Das Rohprodukt wird in Chloroform/Hethanol/Essigsäure (95 : 5 ^: 3) gelöst. Die Lösung wird auf eine Säule (50 χ 1,5 cm) mit 40 g Silicagel gebracht. Dann wird die Säule mit Chloroform/iiethanol/Lssicsäure (95 · 5 * 3) eluiert und das Eluat bei 4O⁰C unter verminderten Druck zur Entfernung des Lösungsmittels eingedampft. 1T-Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamyl-H^^tosyl-L-histidyl-L-prolinamid wird in Form reiner Kristalle erhalten. Schmelzpunkt 113 - 116⁰C (Schäu-¹^ = -29,1° (C = 1, Dimethylfornamid). D

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0,2 ml Anisol werden 525 mg der Kristalle zugegeben und das Gemisch mit 2,5 "il absolutem Fluorwasserstoff versetzt. ITach einctündigem Kühren bei O⁰C wird das Gemisch zur Entfernung des Fluorwasserstoffs eingedampft. Der Rückstand wird in 10 ml 5 i-jiger Essigsäure gelöst. Die Lösung wird mit Zither und Chloroform gewaschen und die wässrige bchicht davon abgetrennt. Die wi^:.ssrigo Losung wird auf eine bäule mit 4 ml eines schwachen Anionenaustauscherharzes (Acetatform) (von der Firma Röhm & Haas unter dem Warenzeichen "Amberlite IR-45"hergestellt) gebracht. Die bäule wird mit 10 ml 5 /<>iger Essigsäure gewaschen. Die abfließende und die Uaschlösungen werden vereinigt und dann lyophilisiert. 160 mg L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolinamid werden als Pulver erhalten. Ausbeute: 89 %· Das Produkt reagiert negativ auf Ninhydrin, zeigt aber eine rote Farbe mit Pauly- = -45,1° (C « 0,5, Essigsäure).

Aminosäure-Analyse (6n HCl, 48 h, 105°C in einem Einschmelzrohr) :

Glutaminsäure zu Histidin zu Prolin = 1,00 : 1,06 : 0,9^zt-

3eispiel 6

2,5 S Π -(t-Amylo:-rycarbonyl)-lT^lm-tosyl-L-histidin und 0,7 g L-Prolinamid werden in einem Gemisch von 80 ml Acetonitril und 20 ml Dimethylformamid gelöst. 1,3 g ^,NJ-Dicyclohexylcarbodiimid werden der Lösung bei einer Temperatur unter O⁰C zugegeben. Die Lösung wird 30 min bei einer Temperatur unter 0⁰C und dann bei Haumtemporatur über riecht gerührt. Die Heaktionslösung wird filtriert, um unlösliche Stoffe zu entfernen. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck konzentriert und der so erhaltene Rückstand wird in 50 ml Äthylacetat gelöst. Die ii%lacetatlösung wird nacheinander mit 1n Schwefelsäure, 5 /^üiger wässriger Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen. Dann wird die Lösung getrocknet xmd zur Entfernung des Lösungsmittels eingedampft. 2,5 g

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in

Π - (t-JUnyloxy carbonyl)-IT^XIi-to syl-Jj-histidyl-Jj-T;rolinaiiid werden als öl erhalten. Ausbeute: 60 >o.

730 mg des Produkts werden in einen Semiscn von 1,5 chlorid und 0,2 ml Anisol gelöst. 1,5 Eil 2rifluoressi{_;säuro werden der Lösung unter Eiskühlung zugegeben. Dann wird das u-emisch bei Eaüiateisperatur JO min gerührt. Die Sealdbionsnischung wird zur Entfernung des Lösungsmittels und überschüssiger Kennen an '±ⁿrifluoressigsäure eingedampft. 50 ml trockener Äther werden den Rückstand zum Ausfällen von IT^im-Tosyl-L-h±3t±cyl-L-prolinaiaidtrifluoracetat als Pulver zugegeben. Las Pulver wird in 5 ml wässriger ITatriun_carbonatlösung (pH 6 bis 6,5) celcst.

640 H2 Bicyclohexyl amins al ζ der iT-(t-Aia.yloxycarbonyl)-L-pyroglutaainsäure werden in 20 nl Athylacetat suspendiert. 3 21I In Schwefelsäure v/erden der Suspension zu~e£eben« Dis xithylacetatschicht; i/ird abgetrennt, nit Wasser gewaschen und dann getrocknet. Die Lösung Viird zur Entfernung des Lösungsmittels eingedampft. Der Rückstand wird in 4 ml absolutem Tetrahydrofuran gelöst, und 0,32 nl 'üriäthylanin werden der Lösung augegeben. Dann wird 1 ml absoluter Toluol lösung mit einem Gehalt von 0,32 rJ. Isobutylchloroformiat der Lösung bei -10° bis -7°C zugegeben. Die so erhaltene Lösung wird der oben erwähnten Läsung von IT^im-Tosyl-L-histidyl-L-prolinamid-trifluoracetat unter kräftigem Hühren bei einer Temperatur unter O⁰C zugegeben. Fach exiistündigem Rühren bei Raumtemperatur wird die I-üschung zur Entfernung des Tetrahydrofurans eingedampft« Der so erhaltene Eüclistand wird in 20 ml Chloroform gelöst. Die Chloroformlösung wird nacheinander mit 5 %iger wässriger Hatriumbicarbonatlösung, in Schwefelsäure und Wasser gewaschen. Die Lösung wird getrocknet und dann zur Entfernung des Lösungsmittels eingedampft. 10 aal trockener Äther werden de© Hackstand zum Auskristallisieren augesetzt. 690 mg IT- (t-lmyloxycarbonyl) -L-pyro glutainyl-U^^-to sjl-L-histidyl-L-prolinamid werden als Pulver erhalten. Ausbeute: 73 %·

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Das Produkt wird in Ohloroform/Hethanol/Essigsäure (95 ^J 5 · 3) gelöst. Die Lösung wird auf eine Säule (50 χ 1,5 cm) mit 40 g Silicagel gebracht. Dann vird die Säule nit Chloroform/Methanol/ Essigsäure (95 ^: 5 ί 3) eluiert und das Eluat bei 40⁰C unter verminderten Druck zur Entfernung des Lösungsmittels eingedampft. 570 ng IT-(t-jjayloxycarbon7l)-L-pyroglutaiayl-IT^lm-tosyl-L-hisiidyl-L-prolinamid werden in Form reiner Kristalle erhalten. Schmelzpunkt 123°0 (ΖβΓΕ.)βχ7τ> ⁼ -36,6° (0 = 1,2, Dimethylformamid).

0,15 Eil Anisol werden zu 65 mg der Kristalle .gegeben und 1 ml absoluter Fluorwasserstoff den Gemisch zugesetzt. IT ach einntündigem führen bei O⁰C wird das Gemisch zur Entfernung des Fluorwasserstoffs eingedampft. Der Rückstand wird in 5 ml 5 säiger Essigsäure gelöst. Die Lösung wird mit iither und Chloroform gewaschen und die viässrige Schicht wird davon abgetrennt. Die wässrige Lösung v;ird auf eine Säule :iit 2 ml schwachen •äiiionenaustauscherharz (Acetatforn) (hergestellt von der Firma Höhn ά Haas unter den Warenzeichen ^4lAnberlite IR-45") gebracht. Die Säule wird mit 5 nl 5 ^«Lger Essigsäure gewaschen. Die abfließende und die Waschlösungen werden vereinigt und dann lyophilisiert. 37 »6 ^G L-Pyroglutam3rl-L-histid3^rl-L-prolinaniid werden erhalten. Ausbeute: S*6,5 >·

Beispiel 7

ö4,5 g Dicycloherxylaninsalz von IT -(p-IIethoxybenzylaxycarbonyl)-I\f^im-tosyl-L-histidin werden ±a 500 nl Äthylacetat suspendiert. 300 ml 1ri Schwefelsäure werden der Suspension zugesetzt und die Iiischung wird geschüttelt. Die Äthyl ac etat schicht wird zweinal mit Wasser gei-raschen. Ke.ch dem trocknen wird die ii-thylacetat-3ösung bis zur ifrockene aufkonzentriert. Der so erhaltene ölige Rückstand wird in 250 ml Acetonitril gelöst. 3»7 S L-Prolinaniiä werden in einen Gemisch von 20 ml Dimethylformamid und 3 nl Wasser gelöst und diese Lösung der Acetonitrillösung zugesetzt. Dem

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Gemisch wird eine Lösung von 25 C Dicyclche^/lcarbodiimid in 50 Eil Acetonitril unter Kühren "bei 0⁰C zugesetzt. Das Gemisch wird bei O⁰U JO min und dann bei iiauLiterupei'atur über Nacht gerührt. Nach Zugabe von 1 ml üesiesäure wird das Keaktionsgemisch 30 min geschüttelt. Die unlöslichen Stoffe werden durch filtrieren entfernt. Das i'iltrat wird zur ilditfernung des Lösungsmittels eingedampft. Der so erhaltene ölige Rückstand wird in 500 ml Athylacetat gelöst. Die Lösung wird nacheinander mit in ü el ζ säure, Wasser, 5 /«d-gen Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Die Lösung wird getrocknet und zur Trockene eingeengt. 39 E N⁰** -(p-liethoxybenzyloxycarbonyl)-N -tosyl-L-histidyl-L-prolinataid werden als Pulver erhalten. Ausbeute: 68,4 %.

2 g des Produkts werden in einem Gemisch aus 0,5 ml tiethylenchlorid und 0,5 ^ml Anisol gelöst. 3 ml Trifluoressigsaure werden der Lösung unter Rühren bei 0⁰G zugesetzt. D&nn wird diese Lösung bei Raumtemperatur 45 min gerührt. Die Eeaktionslösung wird zur Entfernung des Lösungsmittels und überschüssiger Hengen von Trifluoressigsäure eingedampft. 40 ml trockener Äther werden dem Rückstand zugegeben und die sich abscheidenden Kristalle duaii Filtrieren gesammelt. ITach dem Trocknen werden die Kristalle in einem Gemisch aus 2 ml Dimethylformamid und 5 ml Tetrahydrofuran gelöst. 0,62 ml ij-Athyl-lT'-dimethylatainopropylcarbodiimid werden der Lösung unter Rühren bei -15°0 zugegeben. Dann werden 1,05 Z IT-Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutaminsäure der Lösung zugesetzt, ^ie Lösung wird 1,5 1-bei der gleichen Temperatur und dann 2,5 h bei O⁰O gerührt. Die Lösung wird zur Entfernung des Lösungsmittels bei O⁰C unter vermindertem Druck eingeengt. Der so erhaltene ölige Rückstand wird in 50 ml Chloroform gelöst. Die Chloroformlösung wird nacheinander mit 1.n Salzsäure, Wasser, 5 ^igen Hatriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Dann wird die Chloro-

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getrocknet und zur Entfernung des .Lösungsmittels . H-Jensyloxycartonyl-L-pyroglutamyl Ixistidyl-L-prolinar-iid wird als Pulver erhalten.

einr;eö aupft. H-Jensyloxycartonyl-L-pyroglutamyl-H ^m-tosyl-L-

"Ds.s Produkt wird in Ohloroforra/Äthylacetat/Äthanol (5 : 2/5) gelöst. Die Lösung πίτα auf eine Säule (50 χ 1,5 cm) mit 40 g Silicajvel gebracht." υρηα wird die Säule mit Chloroforio/Äthylacetat/Äthanol (5:2:5) eluiert und das ELuat bei 40⁰O unter vermindertem Druck aur Entfernung des Lösungsmittels eingedampft. 1,5 G N-Benzylo2qycarbonyl-L-pyrogltitamyl-lT^lmtosyl-L-histidyl-L-prolinamid werden als reine Kristalle er- . halten. Schmelzpunkt 111,5 - 115,0⁰O. Ausbeute: 65,8 %.

So erhaltenes H-Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamyl~N^:uil-tosyl-L-histidyl-L-prolinamid wird in derselben Weise wie in Beispiel 1 behandelt. L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolinamid wird erhalten.

Beispiel .8

12,3 C H^<X-(t-Butoxycarbonyl)-N^im-tosyl-L-histidin wird in 100 ml Chloroform gelöst und 5 ml Triäthylamin und 120 ml Tetrahydrofuran der Lösung bei einer Temperatur unter 5°Q zugesetzt. 3,9 G Äthylchloroformiat werden der Lösung bei -10° bis -12⁰G in etwa 10 min unter Rühren zugesetzt. Die liischung wird bei der gleichen Temperatur 20 min gerührt. Eine Lösung von 4,5 g L-Prolinamid in 3-ml Wasser und 45 ml Dimethylformamid \fird dem Gemisch bei -5° bis -10^GC zugegeben. Die Hischung wird 1 h bei der gleichen Temperatur und dann eine Stunde bei Haumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird bei 40⁰O unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der so erhaltene Rückstand wird in 500 ml Ithylacetat gelöst. Die Äthylacetatlösung wird nacheinander mit 1H Schwefelsäure,

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5 /öiger wässriger iTatri-umbicarbonatlö sung und Wasser gewaschen. Die Lösung wird getrocknet und zur Entfernung des Lösungsmittels eingedampft. 12,1 g N^c^-(t-Butoxycarbonyl)-N^lm-tosyl-L-histidylli-prolinamid werden als Rohprodukt erhalten.

Las Rohprodukt wird in iithylacetat/Benzol (2 : 1) gelöst. Die Lösung wird auf eine Säule (50 χ 1,5 cm) mit 200 g Silicagel gebrächt. Dann wird die Säule mit Äthylacetat/Benzol (2 ι 1) eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck zur Entfernung des Lösungsmittels eingedampft und der so erhaltene Rückstand mit Äther gextfaschen. 10,55 S ¹^ -(t-Butoxycarbonyl)-IT^li:itosyl-L-hißtidyl-L-prolinamid werden als Pulver erhalten. Ausbeute: 68,5 %.

8,0 g des Produkts werden in 20 ml Methylenchlorid gelöst. 20 ml Trifluoressigsäure werden der Lösung unter Eiskühlung zugegeben. Dann wird das Gemisch 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird.eingedampft, um Lösungsmittel und überschüssige Menge an Irifluoressigsäure zu entfernen. 500 ml trockener Äther werden dem Rückstand zugegeben, um if^-tosyl-L-histidyl-L-prolinamid-trifluoracetat als Pulver auszufällen.

So erhaltenes N^lm-tosyl-L-histidyl-L-prolinaniid wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 behandelt. L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolinamid wird erhalten.

- Patentansprüche - 18 -

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Claims

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/J

a t e η t a η fj ρ r ü c Ii e

L-iiistidin-derivat der allgemeinen Formel:

CH₂—GH —COOK
KH X

SO,

worin 2 die o-Hitrophenylsulfe^l-, p-Kethoxybensyloxyc-arbcnyl-, t-Aniyloxycarbonyl- oder t-Butc^carbonyl-Gruppc, j;v ein WccsoiOtoffaton oder cine -alko^carbonylgruppe uii: 2 bis 7 !"-ohlonctoffatomen darstellt.

:. L-Histidin-Dcrivat nach ünsprucli 1, vjorin κ ein Wacserctoffdarstellt.

3. L-Histidin-üeriva.t nach iaispruch 1, v;orin ü eine Alkoxycarbonyl-u-ruppe mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt.

M-. Verfahren zur Herstellung von L-tyroglutamyl-L-histidyl-L-prolinamidj gekennz eich net durch Kondensieren von L-lrolinamid mit einer Verbindung der Formel;

Üiu- COOfi
HH X

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worin X die ο-Nitrophenylsulfenyl-, p-liethoxybenzyloxy-■ carbonyl-, t-Amyloxycarbonyl- oder t-Butoxycarbonyl-Gruppe, R ein Wasserstoffatom oder eine Alkoxycarbonylgruppe mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen darstellt, Entfernen der Gruppe X an der QL-Aminogruppe von der erhaltenen Dipeptidverbindung, Kondensieren des H^lm-tosyl-L-histidyl-L-prolinamids mit L-Pyroglutaminsäure mit einer geschützten Imido-Gruppe und Entfernen der Tosyl-Gruppe und der Schutzgruppe an der Imido-Gruppe des L-Pyroglutamylteils von dem erhaltenen Tripeptid.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennz ei c h net, daß die Kondensationsreaktion des L-Prolinamids mit einem N^-Tosyl-L-histidin mit einer geschützten oG-Aminogruppe in Gegenwart eines GarbodiimidSdurchgeführt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 4-, dadurch gekennzeichnet,· daß die Kondensationsreaktion von L-Prolinamid mit einem Ν ^m-Tosyl-L-histidin mit einer geschützten O^-Aminogruppe in Gegenwart von !!,N'-Dicyclohexylcarbodiimid oder N-lthyl-N¹-dimethylaminopropylcarbodiimid bei -10° bis 10°C in einem inerten Lösungsmittel durchgeführt wird.

7· Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gek-ennz ei ch-

n e t, daß die Kondensationsreaktion von L-Frolinamid mit " einem O-Alkoxycarbonylderivat von N^-geschütztem-li^-tosyl-L-histidin bei -10° bis O⁰C in einem inerten Lösungsmittel durchgeführt wird.

8. Verfahren nach Jinspruch 4·, dadurch gekennzeichnet, daß die Eondensationsreaktion von N^^-Tosyl-L-histidy L-prolinamid mit L-Pyroglutaminsäure mit einer geschützten Imido-Gruppe durch Behandeln in Gegenwart eines Carbodiimids durchgeführt wird.

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9. Verfahren nach Anspruch 4-, dadurch gekennzeichnet, daß die Kondensationsreaktion von li^lm-Tosyl-L-histidyl-L-prolinamid mit L-Pyroglutaminsäure mit einer geschützten Imido-Gruppe in Gegenwart von ΙΤ,ΙΤ'-dicyclohexyl-carbodiimid oder U-Äthyl-W-dinethylaminopropylcarbodiimid bei -10° bis 10⁰C in einem inerten Lösungsmittel durchgeführt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 4-, dadurch gekennzeichnet, daß die Kondensationsreaktion von H^lm-Tosyl-L-histidy 1-Ii-prölinamid mit L-Pyroglutaminsäure mit einer geschützten Imido-G-ruppe durch Behandeln der L-Pyr ο glutaminsäure mit einer schützten *fiaido-Gruppe mit Alkylchloroformiat bei -15° bis 0°0 in einem inerten Lösungsmittel, gefolgt von einer Kondensation der erhaltenen gemischten Anhydrid-Verbindung mit N^-Iosyl-L-histidyl-L-prolinamid bei -10° bis 0⁰C durchgeführt wird.

11· Verfahren naoh Anspruch 4, dadurch gekennzeich- ' net, daß die Abspaltung der Schutzgruppe X durch Behandeln '. mit 2rifluoressigsäure oder Chlorwasserstoffsäure in einem inerten Lösungsmittel annähernd bei Raumtemperatur durchgeführt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Abspaltung der Sosy-l-G-ruppe und der Schutzgruppe an der Imido-Gruppe des !«-Pyroglutamyl-ilieils vom feipeptid durch Behandeln mit flüssigem Fluorwasserstoff bei -5° bis 5⁰C in einem inerten Lösungsmittel durchgeführl wird.