WO1985002404A1 - Nouveaux derives de peptides, leur procede de preparation et leur emploi comme reactif biologique - Google Patents

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Michel Louis André FLORK
Jean Claude Maurice Joseph Bouthillon
Marie-France épouse SARAVANE BOUTHILLON
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Flork Michel
Bouthillon Jean Claude Maurice
Bouthillon Marie France Epouse
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    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)

Definitions

  • the subject of the present invention is new peptide derivatives and their manufacturing process, and more particularly those of these derivatives, the terminal carboxyl of which is involved in a hydrazide or hydroxamate function, such derivatives being especially intended for the assay, by enzymatic route, blood parameters.
  • Z 1 represents in particular an amino acid residue chosen from the radicals D-valyl, D-prolyl, D-phenylalanyl, L-isoleucyl, L-glutamyl, L-pyroglutamyl, (N-benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamyl) and N- (carbomethoxypropionyl-L-arginyl) or peptides;
  • Y is an amino acid residue chosen more particularly from the group consisting of an L-leucyl, L-phenylalanyl, L-pipecolyl, glycyl and L-prolyl radical or any other amino acid; and,
  • Z 2 is an amino acid residue chosen more particularly from the group consisting of an L-lysyl, L-arginyl, L-tyrosyl, and L-valyl or any other amino acid residue; and,
  • Z 3 represents a radical of formula NH 2 ,
  • R 1 is a lower alkyl radical, a substituted lower alkyl radical, an aryl radical or a substituted aryl radical).
  • the invention relates more precisely to the compounds of general formula (I A )
  • Z ' 1 is an amino radical chosen from the group consisting of the radical D-prolyl, D-valyl, D-phenylalanyl (N-benzoyl L-isoleucyl-L-glutamyl), D-isoleucyl and L-glutamyl;
  • Y ' is an amino radical chosen from the group consisting of an L-phenylalanyl, L-leucyl, L-pipecolyl, glycyl, and L-prolyl radical;
  • Z 3 is defined as above.
  • the invention also relates to simpler derivatives of general formula (II)
  • X 1 is the acyl, aliphatic or aromatic acyl residue having from 1 to 10 carbon atoms;
  • Z 3 is defined as above.
  • Z 1 , Z 2 and Y are defined as above;
  • R 2 is a lower alkyl radical having from 1 to 6 carbon atoms in a straight or branched chain, a lower alkyl radical substituted by one or more hydroxyls, alkoxyls or acyloxy, a mono or bicyclic aryl radical substituted by a 1 three substituents chosen from halo, lower alkyl, lower alkoxyl, trifluoromethyl, trifluoromethoxy, trifluoromethylthio, cyano, aminosulfonyl or cy ⁇ loalkyl radicals.
  • the subject of the invention is also a process for preparing the compounds of general formula (I) which is characterized in that the N carboxyanhydride of amino acid Y is formed by the action of phosgene at a temperature in the region of 50 ° C and condenses the N carboxyanhydride in an aqueous alkaline medium with the amino acid Z 2 H to form, after acidification, the peptide of general formula (III)
  • Z 1 -YZ 2 -NHZ 3 which can, if desired, be salified by adding an alkaline base when Z 3 is a hydroxyl or by adding a mineral or organic acid when Z 3 is an amino radical (NHR 1 ) substituted or unsubstituted.
  • the compounds of general formula II are prepared by acylation of arginine by the action of a functional derivative of an organic ⁇ arboxylic acid in a polar solvent in the presence of a tertiary base then esterification of N-acylguanidine by an alkyl sulfate in the presence of an alkanol, separation of the alkyl sulfate of N-acylguanidinate from alkyl, conversion to base and aminolysis thereof by the action of a reagent of formula 2 HN-Z in which Z 3 is defined as above, to form a compound of general formula II
  • X 1 and Z 3 have the definitions provided above.
  • the compounds of general formula I or general formula II constitute valuable reagents for the organic industry. They allow the assay of blood parameters by the enzymatic route under conditions of sensitivity and reproducibility hitherto not yet reached. They have the major advantage over commercial reagents of being very soluble in water, of liberating products of equal hydrolysis very soluble and do not require the addition of a third solvent.
  • the detection threshold is therefore very sensitive and the measurement of the enzymatic activity perfectly linear.
  • the extreme sensitivity of the measurement makes it possible to operate on very low volumes and on very dilute solutions.
  • the determination of the amino derivative 2 HN-Z released by the enzymatic reaction is done by a simple electrochemical measurement compared to a calibration curve.
  • the optimal concentration of reagent is of the order of 5.10 -6 in the reaction blood medium.
  • the invention therefore also includes the use of the compounds of general formula (I) or of general formula (II) as biological reagents and in particular for the determination or demonstration of the various blood factors.
  • D-prolyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-hydrazides make it possible to dose the plasma prekallicrein
  • the D-valyl-L-leucy-L-lysyl-hydrazides make it possible to determine the plasmin
  • the D- phenylalanyl-L-pipecolyl-L-arginyl-hydrazides allow the determination of prothrombin
  • the N-benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamyl-glycyl-L-arginyl-hydrazides allow the determination of factor X
  • the N-carbomethoxypropionyl-L -arginyl-L-prolyl-L-tyrosyl-hydrazides allow it possible to measure the granulocytic elast
  • Example 1 D-valyl-L-leucyl-L-lysyl-hydrazide. - Stage A N-carboxyanhydride of L-leucine.
  • the suspension clears quickly and allows a clear, colorless solution to be obtained after 30 minutes of reaction. It is left in contact for 1 hour and then this solution is degassed before concentrating it under vacuum.
  • the N carboxyanhydride of L-leucine crystallizes at the end of the concentration.
  • the ⁇ tosylated derivative of lysine is placed in 5% solution in an aqueous molar solution of sodium carbonate. This solution is cooled to 0 ° C., placed under very vigorous stirring and the stoichiometric amount of L-leucine N-carboxyanhydride is added all at once. The pH is maintained between 10 and 10.5 with 2N sodium hydroxide for 2 minutes, corresponding to the time necessary for the complete dissolution of the N-carboxyanhydride of L-leucine.
  • N-carboxyanhydride of D-valine (prepared according to the same method only for L-leucine) is added all at once while maintaining the pH between 10 and 10.5 with 2N sodium hydroxide for 2 minutes.
  • the solution is acidified with concentrated hydrochloric acid to pH 3.5 and degassed under vacuum before being percolated on sulfonic resin.
  • the peptide fixed on the resin is then eluted with a normal ammonia solution.
  • the eluate is concentrated under vacuum and the tripeptide D-valyl-L-leucyl-L-lysine ( ⁇ tosyl) crystallizes at the end of concentration.
  • the peptide estosylated on lysine is suspended in 250 ml of 1,2-dimethoxy-ethane containing in solution 12.8 g of naphthalene and 2.2 of sodium.
  • the eluate is concentrated in vacuo and the D-valyl-L-leucyl-L-lysine peptide thus obtained is dried in the form of a meringue.
  • Methyl D-valyl-L-leucyl-L-lysinate The D-valyl-L-leucyl-L-lysine obtained in stage D is redissolved in 40 ml of methanol. 12 ml of methyl sulphate are then added and the reaction mixture is brought to reflux for 90 minutes. We remove excess methanol. A precipitate of (methysulfate) gradually appears. The mixture is left to stand at ordinary temperature for one hour and then the prepreg is separated, which is wrung out and then rinsed with methanol and which is dried under vacuum. The methylsulfate is resuspended in 50% methanol and then neutralized by adding a 10% sodium bicarbonate solution.
  • the methyl D-valyl-L-leucyl-L-lysinate is extracted with trichloroethane.
  • the organic phase is separated, filtered, wrung, washed with water, dried and evaporated to dryness. It is then redissolved hot in acetone from which it precipitates by cooling.
  • the pipecolic acid N-carboxyanhydride is prepared according to the procedure of Example 1, stage A, then it is added to an aqueous solution of arginine and molar sodium carbonate while maintaining the pH between 10 and 10 , 5, by addition of 2N sodium hydroxide. Maintained at 0 ° C. by an external cooling bath with vigorous stirring. At after 2 minutes, while maintaining the temperature at 0oC, the pH is brought to 3.5 by addition of concentrated hydrochloric acid. The peptide formed is separated by passing the solution through a column of carboxylic resin and then eluted with a solution of normal ammonia. The eluate is concentrated to dryness to obtain the pure dipeptide.
  • D-phenylalanine N-carboxyanhydride By operating as in stage A of Example 1, starting from phenylalanine and phosgene, D-phenylalanine N-carboxyanhydride is formed which is used as it is.
  • stage C D-phenylalanyl-L-pipecolyl-L-arginine.
  • D-phenylalanyl-L-pipecolyl-L-arginine is dissolved in 50 ml of ethanol. 4.5 ml of diethyl sulphate are added thereto and the mixture is brought to reflux of ethanol for 2 hours. The solution obtained is then concentrated and a precipitate of ethyl D-phenylalanyl-L-pipecolyl-L-argininate ethyl sulfate appears, which is separated by filtration, drained, then washed with acetone and dried. It is dissolved in a molar solution of sodium bicarbonate and the base ester is extracted with methylene chloride.
  • the ethyl D-phenylalanyl-L-pipecolyl-L-argininate is dissolved in 25 ml of ethanol. 10 ml of hydrazine hydrate are gradually added and the mixture is brought to 50 ° C. for 1 hour. Then allowed to cool and percolate on a carboxylic resin.
  • stage E By operating as in Example 1, stage E, starting from N-formylarginine, methanol and methyl sulfate, methyl N-formylargininate is obtained in the form of a colorless oil.
  • N-formylarginyl-hydroxamic acid The methyl N-formylargininate is dissolved in 25 ml of methanol and then 7 ml of a 10% hydroxylamine hydrochloride solution in water is added, then 2.5 g of potassium carbonate . The mixture is brought to reflux for one hour, allowed to cool to ordinary temperature and then percolates on carboxylic resin. The filtrate concentrated under vacuum is crystallized at the end of concentration. The precipitate is filtered, drained, rinsed with a little acetone, then dried under vacuum. N-formylarginyl-hydroxamic acid is thus obtained.
  • Methyl benzoylargininate 4.5 g of N-benzoylarginine are dissolved in 35 ml of methanol and then 2.5 ml of methyl sulphate are added. Stirring is continued for 2 hours at 60 ° C. and then the methyl sulfate precipitate is separated. This is converted to methyl N-benzoylargininate by alkalization with a sodium bicarbonate solution.
  • N-benzoylarginyl (N'methylhydrazide)
  • the methyl N-benzoylargininate is dissolved in 25 ml of methanol and then 2.5 ml of a 20% methylhydrazine solution in methanol is added.
  • the mixture is kept under vigorous stirring at 60 ° C. for two hours and then the crystalline suspension is left to stand overnight.
  • the crystals are separated by filtration, drained, washed with methanol and dried under vacuum. They are resuspended in methanol and then bubbled with a stream of hydrochloric gas for 30 minutes.
  • the precipitate of hydrochloride which has formed is allowed to settle; it is filtered, wrung, rinsed with a little methanol and dried under vacuum.
  • Methylhydrazide is thus obtained pure in the form of the hydrochloride.
  • the hydrochloride can be transformed into hydrazide by passage through an alkaline medium by addition of 2N sodium hydroxide

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Abstract

Produit chimique dérivé de peptides répondant à la formule générale: Z1 - Y - (Z2) NHZ3, dans la quelle: Z1, Y, Z2 sont des restes d'amino-acides et Z3 est un radical de formule NH2, NHR1 ou OH dans laquelle R1 est un radical alcoyle inférieur, un radical alcoyle inférieure substitué, un radical aryle ou un radical aryle substitué. L'invention vise aussi le procédé d'obtention de tels dérivés comprenant une phase d'acylation de l'arginine. Applications des produits de l'invention à la préparation de réactifs biologiques destinées au dosage enzymatique des paramètres sanguins.

Description

NOUVEAUX DERIVES DE PEPTIDES, LEUR PROCEDE DE PREPARATION ET
LEUR EMPLOI COMME REACTIF BIOLOGIQUE
La présente invention a pour objet de nouveaux dérivés de peptides et leur procédé de fabrication, et plus particulièrement ceux de ces dérivés dont le carboxyle terminal est engagé dans une fonction hydrazide ou hydroxamate, de tels dérivés étant notamment destinés au dosage, par voie enzymatique, des paramètres sanguins.
Selon la présente invention les dérivés sus-visés ont pour formule générale (I) :
Z1-Y- (Z2 ) NHZ 3 ( I) dans laquelle : Z1 représente notamment un reste d'aminoacide choisi parmi les radicaux D-valyl, D-prolyl, D-phénylalanyl, L-isoleucyl, L-glutamyl, L-pyroglutamyl, (N-benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamyl) et N-(carbométhoxypropionyl-L-arginyl) ou de peptides ; Y est un reste d'amino-acide choisi plus particulièrement dans le groupe constitué par un radical L- leucyl,L-phénylalanyl, L-pipécolyl,glycyl et L-prolyl ou tout autre amino-acide ; et,
Z2 est un reste d'amino-acide choisi plus particulièrement dans le groupe constitué par un reste L-lysyl, L-arginyl, L-tyrosyl, et L-valyl ou tout autre amino acide ; et,
Z3 représente un radical de formule NH2,
NHR1, NR1R2 ou OH, OR1 (dans laquelle R1 est un radical alcoyle inférieur, un radical alcoyle inférieur substitué, un radical aryle ou un radical aryle substitué).
L'invention concerne plus précisément les composés de formule générale (IA)
Z'1-Y'-(L-arginyl)NH-Z3 (IA) dans laquelle :
Z'1 est un radical aminé choisi dans le groupe constitué par le radical D-prolyl, D-valyl, D-phénylalanyl (N-benzoyl L-isoleucyl-L-glutamyl), D-isoleucyl et L-glutamyl ; Y' est un radical aminé choisi dans le groupe constitué par un radical L-phénylalanyl, L-leucyl, L-pipécolyl, glycyl, et L-prolyl ; Z3 est défini comme précédemment.
L'invention concerne également des dérivés plus simples de formule générale (II)
X1-arginyl-(NH)Z3 (II) dans laquelle :
X1 est le reste acyle carboxylique, aliphatique ou aromatique, ayant de 1 à 10 atomes de carbone ; et,
Z3 est défini comme précédemment.
Parmi les composés de formule générale (I) ou de formule générale (II), on retiendra plus particulièrement :
- les hydroxamates de formule générale
(IB) Z1-Y-Z2NHOH (IB) dans laquelle : les radicaux Z1, Y et Z2 sont définis comme précédemment ;
- les hydrazides non substitués de formule générale (IC)
Z1-Y-Z2NH-NH2 (IC) dans laquelle : les radicaux Y, Z1 et Z2 sont définis comme précédemment ; et,
- les hydrazides substitués de formule générale Z1-Y-Z2NH-NH-R2 (ID) dans laquelle :
Z1, Z2 et Y sont définis comme précédemment ;
R2 est un radical alcoyle inférieur ayant de 1 à 6 atomes de carbone en chaîne droite ou ramifiée, un radical alcoyle lnférieur substitué par un ou plusieurshydroxyles, alcoxyles ou acyloxy, un radical aryle mono ou bicyclique substitué par un 1 trois substituants choisis parmi les radicaux halo, alcoyle inférieur, alcoxyle inférieur, trifluorométhyle, trifluorométhoxy, trifluorométhylthio, cyano, aminosulfonyle ou cyσloalcoyle.
Parmi ceux-ci, on citera plus particulièrement à titre de composés plus spécialement utiles :
- la D-valyl-L-leucyl-L-lysyl hydrazide,
- la D-prolyl-L-phénylalanyl-L-arginyl hydrazide, - la D-valyl-L-leucyl-L-arginyl-hydrazide,
- le D-valyl-L-leucyl-L-arginyl-hydroxamate,
- la D-phénylalanyl-L-pipécolyl-L-arginyl -hydrazide,
- la N-benzoyl-L-isoleuσyl-L-glutamylglycyl-L-arginyl-hydrazide,
- la N-carbométhoxypropionyl-L-arginyl-L-prolyl-L-tyrosyl-hydrazide,
- la L-pyroglutamyl-L-prolyl-L-valylméthyl-hydrazide,
- la L-pyroglutamyl-L-prolyl-L-valylisobutyl-hydrazide,
- le D-isoleucyl-L-prolyl-L-arginyl-hydroxàmate,
- le glutamyl-glycyl-L-arginyl-hydroxamate.
- le N-formyl-L-arginyl-hydroxamate,
- la N-formyl-L-arginyl-N-méthyl-hydrazide,
- la N-formyl-L-arginyl-N-hydroxy-éthylhydrazide.
- la N-benzoyl-L-arginyl-hydrazide. L'invention a également pour objet un procédé de préparation des composés de formule générale (I) qui se caractérise par le fait que l'on forme le N carboxyanhydride de l'acide aminé Y par l'action du phosgène à température voisine de 50°C et condense le N carboxyanhydride en milieu alcalin aqueux avec l'amino acide Z2H pour former après acidification le peptide de formule générale (III)
Y-Z2 (III) et que l'on renouvelle cette opération en formant le N carboxyanhydride de l'amino-acide Z1 et en le couplant par le même procédé sur le peptide Y-Z2 pour obtenir après acidification le nouveau peptide de formule générale IV Z1-Y-Z2 (IV) dans laquelle : Z1, Z2 et Y sont définis comme précédem ment, puis que l'on. soumet celui-ci à l'estérification à l'aide d'un sulfate dialcoylique en présence d'un alcanol pour obtenir un alcoysulfate d'ester de dipeptide, sépare celui-ci, le convertit en base d'ester d'amino-acide par alcalinisation à l'aide d'un hydroxyde ou un carbonate de métal alcalin puis le soumet à l'action d'un réactif azoté de formule générale NH2-Z 3 (dans laquelle Z3 est défini comme précédemment) pour obtenir le composé de formule générale I désiré ;
Z1-Y-Z2-NHZ3 que l'on peut ,si désiré, salifier par addition d'une base alcaline lorsque Z3 est un hydroxyle ou par addition d'un acide minéral ou organique lorsque Z3 est un radical aminé (NHR1) substitué ou non substitué.
De la même façon, les composés de formule générale II sont préparés par acylation de l'arginine par action d'un dérivé fonctionnel d'un acide organique σarboxylique dans un solvant polaire en présence d'une base tertiaire puis estérification de la N-acylguanidine par un sulfate d'alcoyle en présence d'un alcanol, séparation de l'alcoylsulfate de N-acylguanidinate d'alcoyle, conversion en base et aminolyse de celle-ci par action d'un réactif de formule 2HN-Z dans laquelle Z3 est défini comme précédemment, pour former un composé de formule générale II
X1-arginyl NH-Z3 (II) dans laquelle :
X1 et Z3 ont les définitions fournies précédemment.
Les composés de formule générale I ou de formule générale II constituent des réactifs précieux pour l'industrie biologique. Ils permettent le dosage des paramètres sanguins par voie enzymatique dans des conditions de sensibilité et de reproductivité jusqu'ici non encore atteintes. Ils présentent le gros avantage par rapport aux réactifs du commerce d'être très solubles dans l'eau, de mettre en liberté des produits d'hydrolyse égale ment très solubles et de ne pas nécessiter l'adjonction d'un tiers solvant.
Il est ainsi possible de doser les facteurs sanguins, les facteurs de la coagulation ou les facteurs enzymatiques impliqués dans la coagulation ou contenus dans les leucocytes à des concentrations de l'ordre de 0,01 partie par million (10ppb). Le seuil de détection est donc très sensible et la mesure de l'activité enzymatique parfaitement linéaire. En outre, l'extrème sensibilité de la mesure permet d'opérer sur des volumes très faibles et sur des solutions très diluées.
Le dosage du dérivé aminé 2HN-Z mis en liberté par la réaction enzymatique se fait par une mesure électrochimique simple par rapport à une courbe d'étalonnage. La concentration optimale de réactif est de l'ordre de 5.10-6 dans le milieu sanguin réactionnel.
L'invention comprend donc aussi l'emploi des composés de formule générale (I) ou de formule générale (II) comme réactifs biologiques et notamment pour le dosage ou la mise en évidence des différents facteurs sanguins.
C'est ainsi que les D-prolyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-hydrazides permettent de doser la prekallicreine plasmatique, les D-valyl-L-leucy-L-lysyl-hydrazides, permettent de déterminer la plasmine, les D-phénylalanyl-L-pipécolyl-L-arginyl-hydrazides permettent de doser la prothrombine, les N-benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamyl-glycyl-L-arginyl-hydrazides permettent de doser le facteur X, les N-carbométhoxypropionyl-L-arginyl-L-prolyl-L-tyrosyl-hydrazides, l'αchymotrypsine et les L-pyroglutamyl-L-prolyl-L-valyl-hydrazides permettent de doser l'élastase granulocytaire et les N-acylarginyl-hydrazides ou hydroxamates permettent de doser les protéases.
Les exemples suivants illustrent l'invention. Ils ne la limitent en aucune façon.
Exemple 1 : D-valyl-L-leucyl-L-lysyl-hydrazide. - Stade A N-carboxyanhydride de la L-leucine.
On met en suspension 6,56 g de L-Leucine dans 250 ml de dioxane. On fait barboter à température ambiante très progressivement du phosgène jusqu'à saturation. Le ballon tricol dans lequel s'effectue la réaction est pourvu d'un réfrigérant à reflux permettant de piéger à basse température le phosgène en excès.
La suspension s'éclaircit rapidement et permet d'obtenir après 30 minutes de réaction une solution limpide, incolore. On laisse en contact pendant 1 heure puis on dégaze cette solution avant de la concentrer sous vide.
Le N carboxyanhydride de la L-leucine cristallise en fin de concentration.
- Stade B L-leucyl-L-lysine (ε Tosyl)
On met le dérivé ε tosylé de la lysine en solution à 5% dans une solution aqueuse molaire de carbonate de sodium. Cette solution est refroidit à 0°C, placée sous agitation très vive et l'on ajoute la quantité stoechiométrique de N-carboxyanhydride de la L-leucine en une seule fois. Le pH est maintenu entre 10 et 10,5 par de la soude 2N pendant 2 minutes, correspondant au temps nécesssaire pour la dissolution complète du N-carboxyanhydride de la L-leucine.
Puis cette solution est acidifiée rapidement à pH 3,5 par. de l'acide chlorhydrique concentré. Le rendement du couplage est de 99%. - Stade C
D-valyl-L-leucyl-L-lysine ( ε Tosyl)
La solution précédente contenant le L- leucyl-L-lysine (ε tosyl) est alcalinisée jusqu'à pH 10,5 par dissolution de carbonate de sodium puis refroidit à 0°C et placée sous agitation très vive.
Une quantité stoechiométrique de N-carboxyanhydride de la D-valine (préparée selon le même mode opératoire que pour la L-leucine) est ajoutée en une seule fois en maintenant le pH entre 10 et 10,5 par de la soude 2N pendant 2 minutes.
Puis la solution est acidifiée par de l'acide chlorhydrique concentré jusqu'à pH 3,5 et dégazée sous vide avant d'être percolée sur résine sulfonique.
Le peptide fixé sur la résine est ensuite elué par une solution normale d'ammoniaque. L'éluat est concentré sous vide et le tripeptide D-valyl-L-leucyl-L-lysine (ε tosyl) cristallise en fin de concentration.
- Stade D D-valyl-L-leucyl-L-lysine
Le peptide εtosylé sur la lysine est mis en suspension dans 250 ml de diméthoxy-1,2-éthane contenant en solution 12,8 gde naphtalène et 2,2 de sodium.
L'agitation est maintenue pendant 4 heures à l'abri de l'humidité à température ambiante. 20: ml d'eau sont ensuite ajoutés goutte à goutte provoquant la décoloration de la solution. Le milieu réaσtionnel est ensuite placé dans une ampoule à décanter et la phase organique est extraite 5 fois par 100 ml d'eau. Les extraits aqueux sont percolés sur résine sulfonique puis élués par une solution normale d'ammoniaque.
L'éluat est concentré sous vide et le peptide D-valyl-L-leucyl-L-lysine ainsi obtenu est séché sous la forme d'une meringue.
- Stade E
D-valyl-L-leucyl-L-lysinate de méthyle La D-valyl-L-leucyl-L-lysine obtenue au stade D est redissoute dans 40ml de méthanol. On ajoute ensuite 12 ml de sulfate de méthyle et on porte le mélange réactionnel au reflux pendant 90 minutes. On chasse le méthanol en excès. Il apparaît progressivement un précipité de (méthysulfate). On laisse reposer à température ordinaire pendant une heure puis on sépare le précépité que l'on essore puis rince avec du méthanol et que l'on sèche sous vide. Le méthylsulfate est remis en suspension dans le méthanol à 50 % puis on neutralise par addition d'une solution de bicarbonate de sodium à 10 %. Le D-valyl-L-leucyl-L-lysinate de méthyle est extrait au trichloréthane. On sépare la phase organique, la filtre, l'essore, la lave à l'eau, la sèche et l'évaporé à sec. On redissout ensuite à chaud dans l'acétone d'où il précipite par refroidissement.
Après séparation puis essorage, on obtient le D-valyl-L-leucyl-L-lysinate de méthyle pur.
- Stade F
D-valyl-L-leucyl-L-lysyl-hydrazide
On met en solution dans 125 ml de méthanol 4,1 g de D-valyl-L- leucyl-L-lysinate de méthyle obtenu au stade E puis on ajoute 10 ml d'une solution d'hydrate d'hydrazine. On porte le mélange à 45°C, sous agitation en atmosphère inerte pendant 30 minutes. On laisse refroidir à température ordinaire puis on percole sur résine sulfonique. Le peptide est ensuite élué par une solution normale d'ammoniaque. L'éluat est concentré à sec sous vide. Le résidu est ensuite neutralisé par de l'acide chlorhydrique concentré, puis cristallisé dans l'acétone. On le sépare par filtration, l'essore, le lave à l'acétone et le sèche sous vide. On obtient ainsi 2,6 g de D-valyl-L-leucyl-L-lysyL-hydrazide.
Exemple 2 :
D-phênylalanyl-L-pipécolyl-L-arginylhydrazide. - Stade A
L-pipécolyl-L-arginine.
On prépare le N-carboxyanhydride de l'acide pipécolique selon le mode opératoire de l'exemple 1, stade A, puis on l'ajoute à une solution aqueuse d'arginine et de carbonate de sodium molaire en maintenant le pH entre 10 et 10,5, par addition de soude 2N. On maintient à 0°C par un bain réfrigérant extérieur sous forte agitation. Au bout de 2 minutes, tout en maintenant la température à 0ºC, on amène le pH à 3,5 par addition d'acide chlorhydrique concentré. Le peptide formé est séparé par passage de la solution sur colonne de résine carboxylique puis élue par une solution d'ammoniaque normale. On concentre l'éluat à sec pour obtenir le dipeptide pur.
- Stade B
N-carboxyanhydride de la D-phenylalanine En opérant comme au stade A de l'exemple 1, au départ de la phenylalanine et du phosgène, on forme le N-carboxyanhydride de D-phénylalanine que l'on utilise tel quel.
- Stade C D-phénylalanyl-L-pipécolyl-L-arginine. En opérant comme au stade B de l'exemple
1, au départ du N-carboxyanhydride de la D-phenylalanine du L-pipécolyl-L-arginine, on obtient après chromatographie sur résine carboxylique, la D-phénylalanyl-L-pipécolyl-L-arginine. - Stade D
D-phénylalanyl-L-pipécolyl-L-argininate d'éthyle.
On dissout la D-phénylalanyl-L-pipécolyl-L-arginine dans 50 ml d'éthanol. On y ajoute 4,5 ml de sulfate diéthylique et on porte le mélange au reflux de l'éthanol pendant 2 heures. La solution obtenue est ensuite concentrée et il apparaît un précipité d'éthylsulfate de D-phénylalanyl-L-pipécolyl-L-argininate d' éthyle que l'on sépare par filtration, essore puis lave à l'acétone et sèche. On le dissout dans une solution molaire de bicarbonate de sodium et l'ester base est extrait par du chlorure de méthylène. On sépare la phase chlorométhylénique que l'on lave trois fois à l'eau puis sèche sur sulfate de sodium, décolore au charbon, filtre et évapore à sec sous vide . On recueille ainsi le D-phénylalanyl-L-pipécolyl-L-argininate d'éthyle sous forme d'un produit huileux insoluble dans l'eau et soluble dans les solvants organiques. - Stade E D-phénylalanyl-L-pipécolyl-L-arginylhydrazide.
On met en solution le D-phénylalanyl-L-pipécolyl-L-argininate d'éthyle dans 25 ml d'ethanol. On ajoute progressivement 10 ml d'hydrate d'hydrazine et on porte le mélange à 50°C pendant 1 heure. On laisse ensuite refroidir et percole sur une résine carboxylique.
L'élution par une solution d'ammoniaque normale puis la concentration à sec de cet éluat permet d'obtenir une huile qui cristallise dans un mélange méthanol-a-cétone. On sépare le précipité d'hydrazide que l'on essore à fond, lave à l'acétone puis sèche.
Exemple 3 Acide N-formylarginyl-hydroxamique
- Stade A
N-formylargininate de méthyle En opérant comme à l'exemple 1 , stade E, au départ de la N-formylarginine, du méthanol et du sulfate de méthyle, on obtient le N-formylargininate de méthyle sous forme d'une huile incolore.
- Stade B
Acide N-formylarginyl-hydroxamique On dissout le N-formylargininate de méthyle dans 25 ml de méthanol puis on ajoute 7 ml d'une solution de chlorhydrate d'hydroxylamine à 10 % dans l'eau, puis 2,5 g de carbonate de potassium. On porte le mélange au reflux pendant une heure, laisse refroidir à température ordinaire puis percole sur résine carboxylique. Le filtrat concentré sous vide est cristallisé en fin de concentration. On filtre le précipité, on l'essore, le rince avec un peu d'acétone, puis le sèche sous vide. On obtient ainsi l'acide N-formylarginyl-hydroxamique.
Exemple 4 (N-benzoylarginyl)N'-méthyl-hydrazine
- Stade A N-benzoylargininate de méthyle On dissout 4,5 g de N-benzoylarginine dans 35 ml de méthanol puis on ajoute 2,5 ml de sulfate de méthyle. On maintient sous agitation pendant 2 heures à 60°C puis on sépare le précipité de méthylsulfate. Celui-ci est converti en N-benzoylargininate de méthyle par alcalinisation avec une solution de bicarbonate de sodium.
- Stade B
(N-benzoylarginyl) (N'méthylhydrazide) Le N-benzoylargininate de méthyle est mis en solution dans 25 ml de méthanol puis on ajoute 2,5 ml d'une solution de méthylhydrazine à 20 % dans le méthanol. On maintient sous forte agitation à 60°C, pendant deux heures puis on laisse reposer la suspension cristalline pendant une nuit. On sépare les cristaux par filtration, les essore, les lave au méthanol et les sèche sous vide. On les remet en suspension dans le méthanol puis fait barboter un courant de gaz σhlorhydrique pendant 30 minutes. On laisse décanter le précipité de chlorydrate qui s'est formé ; on le filtre, l'essore, le rince avec un peu de méthanol et le sèche sous vide. Le méthylhydrazide est ainsi obtenu pur sous forme de chlorhydrate. Le chlorhydrate peut être transformé en hydrazide par passage en milieu alcalin par addition de soude 2 N.

Claims

R E V E N D I C A T I O N S
1.- Dérivé de tripeptide caractérisé : en ce qu'il répond à la formule générale
Z1-Y-(Z2)NHZ3 (I) dans laquelle : Z1 représente un reste d'amino -acide choisi parmi les radicaux D-valyl, D-prolyl, D-phénylalanyl, L-isoleucyl, L-glutamyl, L-pyroglutamyl, (N- benzoyl-L-isoleuσyl-L-glutamyl) (N carbométhoxy-propionyl -L-arginyl) et autres amino-acides et peptides,
Y est un reste d'amino-acide choisi dans le groupe constitué par un radical L-leucyl, L-phénylalanyl, L-pipécolyl, glycyl et L-prolyl et autres amino-acides, Z2 est un reste d'amino-acide choisi dans le groupe constitué par un radical L-lysyl, L-arginyl, L-tyrosyl et L-valyl et autres amino-acides, Z3 représente un radical de formule NH2, NHR1 ou OH (dans laquelle R1 est un radical alcoyle inférieur, un radical alcoyle inférieur substitué, un radical aryle ou un radical aryle substitué).
2.- Dérivé selon la revendication 1, caractérisé : en ce qu'il répond à la formule générale Z'1-Y'-(L-arginyl)NH-Z3 (IA) dans laquelle :
Z'1 est un reste d'acide aminé choisi dans le groupe constitué par le radical D-prolyl, D-valyl, D-phénylalanyl, N-benzoyl-L-isoleucyl-L- glutamyl, D-isoleucyl et L-glutamyl et autres amino-acides,
Y' est un reste d'amino-acide choisi dans le groupe constitué par un radical L-phénylalanyl, L-Leucyl, L-pipécolyl, glycyl et L-prolyl etautres amino-acides, Z3 est défini comme précédem ment.
3.- Dérivé selon la revendication 1, caractérisé : en ce qu'il répond à la formule générale Z1-Y-Z2NHOH (IB) dans laquelle :
Les radicaux Z1, Z2 et Y ont les définitions fournies antérieurement.
4.- Dérivé selon la revendication 1, caractérisé : en ce qu'il répond à la formule générale Z1-Y-Z2NHNH2 (IC) dans laquelle : les radicaux Z1, Z2 et Y sont définis comme précédemment.
5.- Dérivé selon la revendication 1, caractérisé : en ce qu'il répond à la formule générale
Z1-Y-Z2NH-NHR2 (ID) dans laquelle : Z1, Z2 et Y ont les définitions fournies antérieurement ; et, R2 est un radical alcoyle inférieur ayant de 1 à 6 atomes de carbone en chaîne droite ou ramifiée, un radical alcoyle inférieur substitué par un ou plusieurs hydroxyles, alcoxyles ou acyloxy ; un radical aryle mono ou bicyclique ayant jusqu'à 10 atomes de carbone ou un radical aryle mono ou bicyclique substitué par un à trois substituants choisis dans le groupe constitue par un radical halogène, alcoyle inférieur, alcoxyle inférieur, trifluorométhyle, trifluoromethoxy, trifluorométhylthio, cyano, aminosulfonyle ou cycloalcoyle.
6.- Dérivé selon la revendication 1, caractérisé : en ce qu'il répond à la formule générale
X1-arginyl(NH)Z3 (II) dans laquelle :
X1 est le reste acyle d'un acide organique carboxylique , aliphatique ou aromatique ayant de 1 à 10 atomes de carbone et, Z3 est défini comme précédemment.
7.- Procédé d'cbtention d'un dérivé selon la revendication 1, caractérisé: en ce que l'on forme un N-carboxyanhydride d'un amino-acide Y par action du phosgène dans un solvant inerte anhydride puis fait réagir ce N- carboxyanhydride ainsi formé avec l'amino acide Z2 par couplage en milieu aqueux alcalin à une température voisine de 0°C suivi d'une acidification à pH 3,5, puis que l'on condense à nouveau le N-carboxyanhydride d'un aminoacide Z1 (préparé comme le NCA Y) sur le dipeptide Y-Z2 précédemment formé en milieu alcalin aqueux pour obtenir après acidification le peptide de formule générale Z 1-Y-Z2 (III) dans laquelle : Z1, Z2 et Y sont définis comme précédemment en ce que l'on soumet celui-ci à l'estérification à l'aide d'un sulfate dialcoylique en présence d'un alcanol pour obtenir un alcoylsulfate d'ester de tripeptide, sépare celui-ci, le convertit en base d'ester d'amino-acide par alcalinisation puis le soumet à l'action d'un réactif azoté de formule générale
NH2-Z3 dans laquelle : Z3 est défini comme précédemment pour obtenir le composé de formule générale désiré : Z1-Y-Z2-NHZ3 que l'on peut, si désiré, salifier par addition d'un aci de minéral ou organique.
8.- Procédé d'obtention d'un dérivé selon la revendication 6, caractérisé : en ce que l'on soumet à l' action d'un agent acylant l'arginine dans un solvant polaire en présence d'une base tertiaire puis estérification de la N-acylguanidine par un sulfate d'alcoyle en présence d'un alcanol, séparation de l' alcoylsulfate de N-acylguanidinate d'alcoyle, conversion en base et aminόlyse de celle-ci par action d'un réactif de formule 2HN-Z3 dans laquelle Z3 est défini comme précédemment pour former un composé de formule générale
X1-arginyl-NH-Z3 (II) dans laquelle
X1 et Z3 ont les définitions
9.- Application des composés selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, à la préparation de réactifs biologiques destinés au dosages enzymatiques et plus particulièrement au dosage des paramètres sanguins.
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