CA1257186A

CA1257186A - Methode de dosage utilisant au moins un derive peptidique

Info

Publication number: CA1257186A
Application number: CA000481831A
Authority: CA
Inventors: Michel Flork; Marie-France Saravane; Jean-Claude Bouthillon
Original assignee: Individual
Current assignee: BOUTHILLON JEAN CLAUDE; SARAVANE MARIE FRANCE
Priority date: 1985-05-17
Filing date: 1985-05-17
Publication date: 1989-07-11

Abstract

L'invention a pour objet une méthode de dosage d'enzymes, de facteurs sanguins, de facteurs de coagulation et/ou de facteurs enzymatiques, contenus dans un milieu aqueux, caractérisée en ce qu'elle consiste à ajouter audit milieu un réactif de dosage répondant à la formule générale (I): Z1 = Y (Z2)NHZ3, dans laquelle: Z1 représente un reste d'amino-acide choisi dans le groupe constitué par les radicaux D-valyle, D-prolyle, D-phénylalanyle, L-isoleucyle, L-glutamyle, L-pyroglutamyle, N-benzoyl-L-isoleucyl-L-glytamyle, N-carbométhoxy-propionyl-L-arginyle et autres amino-acides et peptides, Y est un reste d'amino-acide choisi dans le groupe constitué par les radicaux L-leucyle, L-phénylalanyle, L-pipècolyle, glycyle et L-propyle et autres amino-acides, Z2 est un reste d'amino-acide choisi dans le groupe constitué par les radicaux L-lysyle, Larginyle, L-tyrosyle et L-valyle et autres amino-acides, Z3 représente un radical de formule NH2, NHR1 ou OH (dans laquelle R1 est un radical alcoyle inférieur, un radical alcoyle inférieur substitué, un radical aryle ou un radical aryle substitué); et en ce qu'elle consiste à doser les dérivés de formule: H2N-Z3 dans laquelle Z3 à la signification précédente, libéré par réaction enzymatique. Le dosage est notamment réalisé par mesure électrochimique par rapport à une courbe d'étalonnage. La méthode de l'invention permet d'effectuer des mesures sur des volumes très faibles, sur des solutions très diluées, sur des milieux troubles, hétérogènes et/ou très colorés.

Description

~25~

La présente invent.ion a pour objet une méthode de dosage dlenzymes, de Eacteurs sanguins, de facteurs de coagula-tion et/ou de facteurs enzymatiques, contenus dans un milieu aqueux, caractéri.sée en ce qu'elle consiste à ajouter audit milieu un réactiE de dosage répondan-t à la formule générale (IJ:

21 ~ Y (Z2 )NHZ3 ( I ) dans laquelle:
~ Zl représente un reste d'amino-acide choisi dans le groupe constitué par les radicaux D-valyle, D-prolyle, D-phényla-lanyle, D et L-isoleucyLe, L-glutamyle, L-pyroglutamyle, N-benzoyl-L-isoleucyl-L-glytamyle, N-carbométhoxy-propionyl-L-arginyle et autres amino-acides et peptides, - Y est un reste dlamino-acide choisi dans le groupe constitué par un radical L-leucyle, L-phénylalanyle, L-pipècolyle, glycyle et L-propyle et autres amino-acides, ~ Z2 est un reste d'amino-acide choisi dans le groupe constitué par un radical L-lysyle, L-arginyle, L-tyrosyle et L-valyle et autres amino-acides, - Z3 représente un radical de formule NH2, NHR1 ou OH (dans laquelle Rl est un radical alcoyle inférieur, un radical alcoyle inférieur substitué, un radical aryle ou un radical aryle substitué); et en ce qulelle consiste à doser les dérivés de formule:

H N - Z

3~ dans laquelle Z3 à la signification précédente, libéré par réaction enzymatique.
Plus particulièrement, l'invention concerne une méthode de dosage dlenzymes, de facteurs sanguins, de ~2S~

facteurs de coagulation et/ou de Eacteurs enzymatiques, con~enus dans un milieu aqueux, caractérisée en ce qu'elle consiste à ajouter audit milieu un réacti:E de dosage répondant à la Eormule générale (I):

Zl ~ Y (z2)NHz3 (I) dans laquelle:
- Zl représente un reste d'amino-acide choisi dans le groupe constitué par les radicaux D-valyle, D-prolyle, D-phényla-lanyle, ~ et L-isoleucyle, L-glutamyle, L-pyroglutamyle, N-benzoyl-L-isoleucyl-L-glytamyle et N-carbométhoxy-propionyl-L-arginyle, - Y est un reste d'amino-acide choisi dans le groupe constitué par un radical L-leucyle, L-phénylalanyle, L-pipècolyle, glycyle et L-propyle, ~ Z2 est un reste dlamino-acide choisi dans le groupe constitué par un radical L-lysyle, L-arginyle, L-tyrosyle et L-valyle, - Z3 représente un radical de formule NH2, NHRl ou OH tdans laquelle R1 est un radical alcoyle inférieur ou un radical phényle~; et en ce qu'elle consiste à doser les dérivés de formule:

dans laquelle Z3 à la signi~ication précédente, libéré par réaction enzymatique.
De préférence, l'invention concerne une méthode caractérisée en ce que dans la formule générale (I) dudit réactif:
- Y est un reste d'amino-acide, ~ Zl est un reste d'amino-acide pouvant en outre comporter un groupement de l'ensemble de groupements comprenant le i7.~

groupement amino-acide libre e-t le groupement amino-acide acylé, ce dernier radical acyle pouvan-t être soit un résidu d'un acide organique carboxyli~ue, aliphatique ou aromatique, comportant de 1 à 10 atomes de carbone, soit un groupement peptidi~ue, et ~ Z2 est un reste d'amino-acide.
Avantageusement l'inven-tion concerne une méthode caractérisée en ce que le dosage du dérivé H2N-Z3 est réalisé par mesure électrochimique par rapport à une courbe d'étalonnage et de préférence, lorsque appliquée au dosage sanguin, la concentration du réactif de formule (I) est de l'ordre de 10 6 mole/l.
L'invention concerne plus précisément une méthode utilisant les composés de formule générale (IA):
1 Y -(L-arginyl)NH-Z (IA) dans laquelle:
- Zll est un radical aminé choisi dans le groupe constitué
par le radical D-prolyle, D-valyle, D-phénylalanyle, N-benzoyl L-isoleucyl-L-glutamyle, D-isoleucyle et L-glutamyle;
- Y' est un radical aminé choisi dans le groupe cons~itué
par un radical L-phénylalanyle, L-leucyle, L-pipécolyle, glycyle et L-prolyle;
- Z3 est défini comme précédemment.
Parmi les composés de formule générale (I) on retiendra plus particulièrement:
- les hydroxamates de formule générale (IB):

Zl-Y-Z2NHOH ( B) dans laquelle:
- les radicaux Zl~ Y et Z2 sont définis comme ~;257~8~

précédemment;
- les hydraz.ides non subs-titués de :Eormule genérale (Ic):

1 2 N 2 (Ic) dans la~uelle:
- les radicaux Y, Zl et Z2 sont définis comme précédemment, et, - las hydrazides substitués de formule générale (ID):

1 Y Z2NH-N~-R2 (ID) dans laquelle:
~ Zl~ Z2 et Y sont définis comme précédemment;
- R2 est un radical alcoyl.e inférieure ayant de 1 à 6 atomes de carbone en chaine droite ou ramifiée, un radical alcoyle inférieur substitué par un ou plusieurs hydroxyles, alcoxyles ou acyloxy, un radical aryle mono ou bicyclique substitué par un à trois substituants choisis dans le groupe constitué par les radicaux halo, alcoyle inférieur, alcoxyle inférieur, trifluorométhyle, trifluoro-méthoxy, trifluorométhylthio, cyano, aminosulfonyle ou cycloalcoyle. R2 est de préférence un radical phényle.
Parmi ceux-ci, on citera plus particulièreme~t a titre de composés plus spécialement utiles:
- la D-valyl-L-leucyl-L-lysyl hydrazide, - la D-prolyl-L-phénylalanyl-L-arginyl hydrazide, - la D-valyl-L-leucyl-L-arginyl-hydrazide, - la D-valyl-L-leucyl-L-arginyl-hydroxamate, - la D-phénylalanyl-L-pipécolyl-L-arginyl-hydrazide, - la N-benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamyl-glycyl-L-arginyl-hydrazide, - la N-carbométhoxypropionyl-L-arginyl-L-prolyl-L-tyrosyl-hydrazide, 5~

- la L-pyroglutamyl-L-prolyl-L-valyl-methyl-hydrazide, - la L-pyroglutamyl-L-prolyl-L-valyl-isobu-ty:l-hydrazide, - le ~-isoleucyl-L-prolyl-L-arginyl-hydroxamate, et - le glutamyl-glycyl-L-argillyl-hydxoxamateO
Les composés de Eormule générale (I) deEinissent des reactifs precieux pour l'industrie biologique. Ils permet-tent le dosage des paramètres sanguins par voie enzymatique dans des conditions de sensibilité et de repro-ductivité jusqu'ici non encore atteintes.
Ils présentent le gros avantage par rapport aux réactifs du commerce d'etre très solubles dans l'eau, de mettre en liberté des produits d'hydrolyse également très solubles et de ne pas nécessiter l'adjonction d'un tiers solvant.
Il est ainsi possible de doser les facteurs sanguins, les facteurs de la coagulation ou les facteurs enzymatiques impliqués dans la coagulation ou contenus dans les leucocytes à des concen-trations de l'ordre de 0,01 partie par million (lOppb). Le seuil de détection est donc très sensible et la mesure de l'activité enzymatique parfaitement linéaire.
En outre, l'extreme sensibilité de la mesure permet d'opérer sur des volumes très faibles et sur des solutions très diluées.
Le dosage du dérivé aminé H2N-~3 mis en liberté
par la réaction enzymatique se fait par une mesure électrochimique simple par rapport à une courbe d'étalonnage. La concentration optimale de réactif est de l'ordre de 5.10 6 dans le milieu sanguin réactionnel.
Les D-prolyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-hydrazides permettent notamment de doser la prekallicreine plasmatique, les D-valyl-L-leucyl-L-lysyl-hydrazides permettent de déterminer la plasmine, les D-phénylalanyl-L-pipécolyl-L-arginyl-hydrazides permettent de doser la prothrombine, les q; ~

~ ~257~
- 5a -N-benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamyl-glycyl-L-a:rginyl~hydrazides permettent de doser le facteur X, les N-carbométho~ypro-pionyl-L-arginyl-L,-prolyl-L--tyrosyl-hydrazides, l~-chymo--trypsine et les L-pyroglutamyl-L-prolyl-L,-valyl-hydrazides permettent de doser l'élastase granulocytaire.
Le procédé de préparation des composes de formule générale (I) se caractérise par le Eai-t que l'on forme le N-carboxyanhydride de l'acide aminé Y par l'action du phosgène à température voisine de 50 C et condense le N~
carboxyanhydride en milieu alcalin aqueux avec l.'amino acide Z2H pour former après acidification le peptide de formule générale (III):

2 (III) et que l'on renouvelle cette opéra-tion en formant le N-carboxyanhydride de l'amino-acide Zl et en le couplant par le mame procédé sur le peptide Y-Z2 pour obtenir après acidification le nouveau peptide de formule générale (IV):

1 2 (IV) dans l.aquelle:
Zl' Z2 et Y sont définis comme précédemment, puis que l'on:
- soumet celui-ci à l'estérification à l'aide d'un sulfate dialcoylique en présence d'un alcanol pour obtenir un alcoysulfate d'ester de dipeptide, sépare celui-ci, le convertit en base d'ester d'amino-acide par alcalinisation à
l'aide d'un hydroxyde ou un carbonate de métal alcalin puis le soumet à l'action d'un réactif azoté de formule générale NH2-Z3 (dans laquelle Z3 est défini comme précedemment) pour obtenir le composé de formule générale (I) désiré;

Zl -Y-Z2-NHz3 i ~ ~
i~

~2~86 - 5b -- que l'on peut, 9i désire, salifier par addition d'une base alcaline lorsque Z3 est un hydroxyle ou par addition d'un acide mineral ou organique lorsque Z3 est un radical aminé (NHRl) substitue ou non substi-tue.
Les exemples suivants illustrent l'invention. Ils ne la limitent en aucune façon.

D-valyl-L-leucyl-L-lysyl-hydrazide.

,ij: ~ i h 1 2~'57 - Stade A
N-carboxyanhydride de la L-leucine.
On met en suspension 6,56 g de L~Leucine dans ~50 ml de dioxane. On fait barbo~er ~ temperature am biante tr~s progressivement du phos~ne jusqu'~ saturation.
Le ballon tricol dans lequel s'ef$ectue la r~action est pourvu d'un r~f r~g~rant a reflux permettant de pi~er a bas-se t.emp~ature le phosgène en exces.
La suspension s'~claircit rapidemen et permet d'obtenlr apr~s 30 minutes de r~action une solution llmpide, ~ncolore. ~n lalsse en contact pendant 1 heure puis on d~gaze cette solution avant de la concentrer sous vide.
Le N carboxyanhydride de la L-leucine cristallise en fin de concentration.
- Stade B
L-leucyl-L-lysine (~ Tosyl) On met le dérive ~ tosylé de la lysine en ~olut~on ~ 5% dans une solutlon aqueuse molaire de car-bona~e de sodium. Cette solution est refroidit à 0C, pla-c~e ~ous a~itation tres vive et l'on ajoute la quantite sto~chiom~trique d N-carboxyanhydride de la L-leucine en une seule ois. ~e pH est maintenu entre 10 et 10,5 par de la soude 2N pendant 2 minutes, correspondant au temps necesr saire pour la dissolution compl~te du N-carboxyanhydride de la L-leucine.
Puls cette solution est acidifi~e rapi-dement à pH 3,5 par de l'acide chlorhydrique concentre. Le rendement du couplage est de 99%.
-:Stade C
D-valyl-L-leucyl-L-lysine (Tosyl) La solution pr~cédente contenant le L-leucyl-L-lysine (~ tosyl) est alcalinisee jusqu'~ pH 10,5 par dissolutlon de carbonate de sodium puis refroidit ~ 0C
et placee sous agitatlon très vive.
Une quantité stoechiométri~ue de N-car-boxyanhydride de la D-valine (preparee selon le meme mode :~2~

op~ratolre que pour la L-leucine) e5t ajoutee en une seule ~ois en maintenant le pH entre 10 et 10,5 par de la soude ~N pendant 2 minuteq.
Puis la solution est acidifiée par de 5 1 ' acide chlorhydrique concentré jusqu'~ pH 3,5 et d~gaz~e sous vlde avant d'~tre percol~e sur r~sine sulfonique.
~ e peptide flx~ sur la r~æine est ensui-te ~lu~ par une solution normale d'ammoniaque. L'~luat est conce~tr~ ~ous vide et le trip2ptlde D-valyl-L-leucyl-L-ly-sine (~ tosyl) cristalllse en fin de concentration.
- Stade D
D-valyl-L-leucyl-L lysine Le peptide ~tosyl~ sur la lysine est mis en suspension dans 250 ml de dimethoxy-l,~-éthane con-tenant en solution 12,8 gde naphtal~ne et 2,2~de sodium.
L'agitation est maintenue pendant 4 heu-res ~ l'abri de l'humidite ~ temp~rature ambian~e. 20 ml d'eau sont ensuite ajoutes goutte ~ goutte provoquant lad~
coloration de Ia solution. Le milieu reactionnel est ensui-te plac~ dans une ampoule ~ d~cantar et la phase organiqueest extraite 5 ~ois par 100 ml d'eau. Les extralts aqueux sont percol~s sur r~slne sulfonique puis ~lu~s ~ar une ~o-lution normale d'ammoni~que.
~'~luat est concentr~ sous vide et le peptide D-valyl-h-leucyl-~-lys$ne ainsi o~tenu est s~ch~
sou~ la forme d'une meringue.
- Stade E
D-valyl-L-leucyl-L-lysinate de m~thyle La D valyl-L-leucyl-L-lysine obtenue au ~tade ~ est redlssoute dans 4~ml de m~thanol. On ajoute en-suite 12 ml de sulfate de m~hyle et on porte le m~lange reactionnel au reflux pendant 90 minutes. On chasse le mé-thanol en exc~s. Il appara~t progressivement un pr~cipité
de (m~thysulfate~. On laisse reposer ~ temp~rature ordinai-re pendant une heure puis on sépare le préc~pit~ que l'onessore puis r~nce avec du methanol et que l'on s~che sous vide.

Le m~thylsulfate est remis en suspension dans le m~thanol ~ 50 ~ puis on neutralise par additlon d'u-ne 801ution de bicarbonate de sodium ~ 10 %~ Le D valyl-L-leucyl-L-lysinate de m~thyle est extrait au trichlor~thane.
S On s~pare la phase organique, la filtre, l'esqore, la lave l'eau~ la sèche,et l'~vapore ~ sec. On redissout ensuite ~ chaud dans l'ac~tone d'o~ il pr~cipite~ par refroidisse-ment.
Après sé~aration puis essorage, on ob-tient le D-valyl-L-leucyl-L-lysinate de méthyle pur.
- Stade ~
D-valyl-L-leucyl-L-lysyl-hydrazide On met en solution dans 125 ml de métha-nol 4,1 g de D valyl-L- leucyl-L-}ysinate de méthyle obte-nu au stade E puis on ajoute 10 ml d'une solution d'hydra-te d'hydrazine. On porte le m~lange ~ 45C, sous agitation en atmosphere inerte pendant 30 minutes. On laisse refroi-dir ~ température ordinaire puis on percole sur r~sine sul-~onique.
Le peptide est ensuite ~lu~ par une so-lution normale d'am~oniaque, L'~luat est CGnCentre a sec sous vide. Le r~sidu e~t ensuite neutralise par de l'acide chlorhydrique concentr~, puis cristallise dans l'ac~tone.
On le s~pare par filtration, l'essore, le la~e ~ I'acetone et le s~che 50US vide. On obtient ainsi 2,6 g de D-valyl-L-leuc:yl-L-lysyl-hydrazideO
Exemple 2 :
D-ph~nylalanyl-L-pip~colyl-L-arginyl hydrazlde.
Stade A
L-pip~colyl-L-argi~ine.
On prepare le N-carboxyanhydride de l'a-cide pip~colique selon le mode operatoire de llexemple~l, stade Ao puis on l'ajoute à une solution aqueuse d'arginine 3S ~t de carbonate de sodium molaire en maintenant le pH entre 10 et 10,5, par addltion de soude 2N. On maintient ~ O~C
par un bain r~friy~rant exterieur sous forte agitation. Au ~2~;7~

bout de 2 minutes, tout en maintenant la temp~rature ~ 0C, on am~na le pH ~ 3,5 par addition d'acide chlorhydrique co~
centr~. Le peptide ~orm~ est s~par~ par passage de la solu-tion sur colonne de r~sine carboxylique puis ~lu~ par une solution d ' ammonla~ue normala . On canoentre 1 ' elua~ ~ sec pour obtenir le dipeptlde pur.
Stade B
N-carboxyanhydride de la D-phenylalanine En op~rant comme au ~ ade A de l'exemple 1~ au d~part de la phenylalanine et du phosg~ne, on forme le N~carboxyanhydride de D-ph~nylalanine que l'on utilisa tel quel.
- Stade C
D-~hénylalanyl-L-pip~colyl-L-arginine.
En opérant comme au stade B de l'exemple 1, au d~part du N-carboxyanhydride de la D-phenylalanine du L-pip~colyl-L-arginine, on obtient apr~s chromatographie sur resine carboxylique, la D-phenylalanyl-L-pip~colyl-L-arginine.
- Stade D
D-ph~ylalanyl-L-pip~colyl-L-argininate d'~thyle.
On dissout la D-phénylalanyl-~ pipecolyl -L-arginlne dans 50 ml d'~thanol. On y ajoute 4,5 ml de su~
fate di~thyllque et on porte le m~lange au reflux de ~'~thar nol pendant 2 heures. La solution obtenue e~t ensuite con centr~e et il apparait un precipit~ d'ethylsulfate de D-ph~
nylalanyl-L-pip~colyl-L-argininate d'~tllyle que l'on s~pare par filtration, essore puis lave ~ l'ac~tone et sèche. On le di~sou$ dans une solu~ion molaire de bicarbonate de so-dium et l'ester base est extrait par du chlorure de m~thy-l~ne. On s~pare la phase chloromethylénique que l'on lave trois fois ~ l'eau puis seche sur sulfate de sodium, deco-lore au charbon, filtre et ~vapore ~ sec sous vide. On re-cueill~ ainsl le D-phenylalanyl-L~pip~colyl-L-argininate d'~thyle sous forme d'un produit huileux insoluble dans l'eau et soluble dans les solvants organiques.

lo ~25~

- Stade E
D-ph~nylalanyl-L~pipécolyl-L-arginyl-hydra2ide.
On met an solutlon le D-ph~nylalanyl-L-pipecolyl-L argininate d'~thyle dan~ ~5 ~1 d'~thanol. On a-joute progressivement 10 ml d'hydrate d'hydrazine et on po~
ts le mélange à 50~C pendant 1 heure. On laisse ensuite re-~roidir et percole sur une r~sine carboxylique.
L'elution par une ~olution d'ammoniaque normale puis la concentration ~ sec de cet eluat permet d'o~
tenir une huile ~ui cristalllse dans un m~lange m~thanol-a-c~tone. On sépare le pr~cipit~ d'hyd~azide ~ue l'on essore fond, lave ~ l'ac~tone puis s~che.
Exempl~ 3 Acide N-formylarginyl hydroxamique - Stade A
N-formylargininate de méthyle En operant comme ~ l'exemple 1, stade E, au d~part de la N-formylarginine, d~l methanol et du sulfate 2n de m~thyle, on obtient le N-formylargininate de m~thyle sous forme d'une huile incolore.
- Stade B
Acide N-formylarginyl-hydroxamique On dissout le N-formylargininate de me-thyle dans 25 ml de methanol puis on ajoute 7 ml d'une so-lution de chlorhydrate d'hydroxylamine ~ 10 % dans l'eau, puis 2,5 g de carbonate de potassium. On porte le m~lange au reflux pendant une heure, laisse refroidir ~ temperature ordin~ire puis percole sur resine carboxylique~ Le filtrat concentr~ sous vlde est cristallis~ en fin de concentration.
On filtre le precipit~, on l'essore, le rince avec un peu d'acetone, puis le sèche sous vide. On obtient ainsi l'aci-de N-~ormylarginyl-hydroxamique.
Exemple 4 (~-benzoylarginyl)N'-methyl-hydrazine - Stade A
N-benzoylargininate de methyle 7 ~

On dissout 4,5 g de N-benzoylarginine dans 35 ml de m~thanol puis on ajoute 2,5 ml de sulfate de m~thyle. On maintient sous agitatlon pendant,:2 heures à
60C puis on s~pare le pr~cipit~ de m~thylsulfate.
Celui-cl est converti ~n N-benzoylargi-nlnate ~e m~thyle par alcallnisation avec une solution de ~lcarbonate de sodium.
A - Stade ~N-ben~oylarginyl) ~N'~thylhydrazide~
Le N-benzoylargininate de m~thyle est mis en solution dans 25 ml de m~thanol puis on ajoute 2,5 ml ~'une ~olution de m~thylhydrazine ~ 20 ~ dans le m~tha-nol. ~n ma~ntient sous forte agitation ~ 60C, pendant deux heures pu~s on laisse reposer la ~uspension cristalline penr dant une nuit. On s~pare les cr~staux par filtration, les essore, les lave au m~thanol et les seche sous vide. On les remet en sus~ension dans le methanol puis fait barboter un couran~ de gaz chlorhydrique ~endant 30 minutes. On laisse d~canter le precipit~ de chlorydrate qui s'est form~ ; on le filtre; l'essore/ le rince avec un peu de m~thanol et le sache sous v~de. ~e methylhydrazide est ainsi obtenu pur sous ~orme de chlorhydrate. Le chlorhydrate peut ~tre tran~
form~ en hydrazide par passage en milieu alcalin par addi-tion de soude 2 N.

Claims

Les réalisations de l'invention, au sujet desquelles un droit exclusive de propriété ou de privilège est revendiqué, sont définies comme il suit:

1. Méthode de dosage d'enzymes, de facteurs sanguins, de facteurs de coagulation et/ou de facteurs enzymatiques, contenus dans un milieu aqueux, caractérisée en ce qu'elle consiste à ajouter audit milieu un réactif de dosage répondant à la formule générale (I):

Z1 - Y (Z2)NHZ3 (I) dans laquelle:
- Z1 représente un reste d'amino-acide choisi dans le groupe constitué par les radicaux D-valyle, D-prolyle, D-phénylalanyle, D et L-isoleucyle, L-glutamyle, L-pyrogluta-myle, N-benzoyl-L-isoleucyl-L-glytamyle,N-carbométhoxy-propionyl-L-arginyle, - Y est un reste d'amino-acide choisi dans le groupe constitué par un radical L-leucyle, L-phénylalanyle, L-pipècolyle, glycyle et L-propyle, - Z2 est un reste d'amino-acide choisi dans le groupe constitué par un radical L-lysyle, L-arginyle, L-tyrosyle et L-valyle, - Z3 représente un radical de formule NH2, NHR1 ou OH (dans laquelle R1 est un radical alcoyle inférieur, un radical alcoyle inférieur substitué, un radical aryle ou un radical aryle substitué); et en ce qu'elle consiste à doser les dérivés de formule:

dans laquelle Z3 à la signification précédente, libéré par réaction enzymatique.

2. Méthode de dosage d'enzymes, de facteurs sanguins, de facteurs de coagulation et/ou de facteurs enzymatiques, contenus dans un milieu aqueux, caractérisée en ce qu'elle consiste à ajouter audit milieu un réactif de dosage répondant à la formule générale (I):

Z1 - Y (Z2)NHZ3 (I) dans laquelle:
- Z1 représente un reste d'amino-acide choisi dans le groupe constitué par les radicaux D-valyle, D-prolyle, D-phényla-lanyle, D et L-isoleucyle, L-glutamyle, L-pyroglutamyle, N-benzoyl-L-isoleucyl-L-glytamyle et N-carbométhoxy-propionyl-L-arginyle, Y est un reste d'amino-acide choisi dans le groupe constitué
par les radicaux L-leucyle, L-phénylalanyle, L-pipècolyle, glycyle et L-propyle, - Z2 est un reste d'amino-acide choisi dans le groupe constitué par les radicaux L-lysyle, L-arginyle, L-tyrosyle et L-valyle, - Z3 représente un radical de formule NH2, NHR1 ou OH (dans laquelle R1 est un radical alcoyle inférieur ou un radical phényle); et en ce qu'elle consiste à doser les dérivés de formule:

dans laquelle Z3 a la signification précédente, libéré par réaction enzymatique.

3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit reactif répond à la formule générale (IA):

Z1-Y-(L-arginyl)NH-Z3 (IA) dans laquelle:

- Z'1 est un reste d'acide aminé choisi dans le groupe constitué par les radicaux D-propyle, D-valyle, D-phényla-lanyle, N-benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamyle, D-isoleucyle et L-glutamyle;
- Y' est un reste d'amino-acide choisi dans le groupe constitué par les radicaux L-phénylalanyle, L-leucyle, L-pipécolyle, glycyle et L-propyle;
- Z3 est défini comme dans la revendication 1 ou 2.

4. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit réactif répond à la formule générale (IB):
Z1-Y-Z2NHOH (IB) dans laquelle les radicaux Z1, Z2 et Y sont définis comme dans la revendication 1 ou 2.

5. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit réactif répond à la formule générale (IC):

Z1-Y-Z2NHNH2 (IC) dans laquelle les radicaux Z1, Z2 et Y sont définis comme dans la revendication 1 ou 2.

6. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit reactif répond à la formule:

Z1-Y-Z2NH-NHR2 (ID) dans laquelle les radicaux Z1, Z2 et Y sont définis comme dans la revendication 1 ou 2, et R2 est un radical alcoyle inférieure ayant de 1 à 6 atomes de carbone en chaîne droite ou ramifiée, un radical alcoyle inférieur substitué par un ou plusieurs hydroxyles, alcoxyles ou acyloxy, un radical aryle mono ou bicyclique substitué par un à trois substituants choisis dans le groupe constitué par les radicaux halo, alcoyle inférieur, alcoxyle inférieur, trifluorométhyle, trifluorométhoxy, trifluorométhylthio, cyano, aminosulfonyle et cycloalcoyle.

7. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit réactif répond à la formule générale (I'D):

Z1-Y-Z2NH-NH (I'D) dans laquelle les radicaux Z1, Z2 et Y sont définis comme dans la revendication 1 ou 2.

8. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le réactif de formule générale (I) est choisi dans le groupe constitué par:
- la D-valyl-L-leucyl-L-lysyl hydrazide, - la D-prolyl-L-phénylalanyl-L-arginyl hydrazide, - la D-valyl-L-leucyl-L-arginyl-hydrazide, - la D-valyl-L-leucyl-L-arginyl-hydroxamate, - la D-phénylalanyl-L-pipécolyl-L-arginyl-hydrazide, - la N-benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamyl-glycyl-L-arginyl-hy-drazide, - la N-carbométhoxypropionyl-L-arginyl-L-prolyl-L-tyrosyl-hydrazide, - la L-pyroglutamyl-L-prolyl-L-valyl-méthyl-hydrazide, - la L-pyroglutamyl-L-prolyl-L-valyl-isobutyl-hydrazide, - le D-isoleucyl-L-prolyl-L-arginyl-hydroxamate, - le glutamyl-glycyl-L-arginyl-hydroxamate,

9. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que dans la formule générale (I) dudit réactif:
- Y est un reste d'amino-acide, - Z1 est un reste d'amino-acide pouvant en outre comporter un groupement de l'ensemble de groupements comprenant le groupement aminoacide libre et le groupement amino-acide acylé, ce dernier radical acyle pouvant être soit un résidu d'un acide organique carboxylique, aliphatique ou aromatique, comportant de 1 à 10 atomes de carbone, soit un groupement peptidique, et - Z2 est un reste d'amino-acide.

10. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le dosage du dérive H2N-Z3 est réalisé par mesure électrochimique par rapport à une courbe d'étalonnage.

11. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le dosage du dérivé H2N-Z3 est réalisé par mesure électrochimique par rapport à une courbe d'étalonnage et en ce lorsque appliquée au dosage sanguin, la concentration du réactif de formule (I) est de la l'ordre de 10-6 mole/l.