CH627734A5

CH627734A5 - Procede de synthese de peptides modifies.

Info

Publication number: CH627734A5
Application number: CH414177A
Authority: CH
Inventors: Robert Sharpe; Michael Szelke
Original assignee: Nat Res Dev
Priority date: 1977-03-15
Filing date: 1977-04-01
Publication date: 1982-01-29
Also published as: FR2346316B1; FR2383917B2; JPS52142001A; US4242256A; FR2383917A2; JPS53135904A; GB1585061A; CH636344A5; DE2714141A1; DE2811267A1; FR2346316A1

Description

La présente invention a pour objet un procédé de synthèse de peptides modifiés.

La modification d'une ou de plusieurs des liaisons d'aminoacides d'un peptide physiologiquement actif par remplacement par un groupe isostérique peut conduire à une amélioration des propriétés du peptide. Ainsi par exemple, il est possible d'augmenter la stabilité du peptide in vivo sans nuire de façon inacceptable à son action physiologique.

Un but de la présente invention est de fournir un procédé de préparation d'une nouvelle classe de peptides modifiés isostérique-ment. Ce procédé est défini dans la revendication 1.

Ainsi, la présente invention a pour objet le procédé défini dans la revendication 1.

Selon cette définition, l'utilisation dans le procédé de l'analogue du dipeptide formé de deux molécules de glycine est exclue. En effet, l'emploi de cet analogue pour la synthèse de peptides modifiés à déjà été décrite, notamment par Jorgensen, Windridge et Lee, dans «Journal of Médicinal Chemistry», 1970,13,352.

Les termes aminoacide et groupe amino sont utilisés ici dans un sens large englobant les iminoacides et les groupes imino. L'expression alcoyle inférieur désigne les groupes alcoyles Q-C4.

Des analogues de dipeptides utilisés dans le procédé selon l'invention comprennent divers composés de formule R1 R2N • CH(R4) ■ CHCHR CH(RS) -COR3, dans laquelle R est un groupe organique ou une liaison au groupe — CH(R5) — formant un groupe cyclique —ÒH-CH(k5)— et notamment un atome d'hydrogène, NR1R2 est un groupe amino ou un groupe imino lié au groupe

—CH(R4) — formant un groupe cyclique HN-CH('r4)—, ou un dérivé fonctionnel d'un tel groupe amino ou imino, COR3 est un groupe carboxyle ou un de ses dérivés fonctionnels, R4 est de l'hydrogène ou un groupe organique formant la chaîne latérale a d'un a-amino- ou a-iminoacide, tel que décrit ci-dessus, qui est lié au groupe RXR2N — dans le cas des «-iminoacides ou l'atome d'azote du groupe imino fait partie d'un système cyclique (proline, hydroxyproline, acide pyroglutamique et spinacine), ou un dérivé d'une telle chaîne latérale, formé sur un ou plusieurs groupes fonctionnels de cette chaîne, et R5 est de l'hydrogène ou un groupe organique formant la chaîne latérale a d'un a-amino- ou a-iminoacide, comme décrit ci-dessus, qui est lié au groupe — CHR — dans le cas des a-iminoacides où l'atome d'azote du groupe imino fait partie d'un système cyclique, ou dérivé d'une telle chaîne latérale formé sur un ou plusieurs groupes fonctionnels de cette chaîne, les cas où R5 est de l'hydrogène ou un groupe organique monovalent étant particulièrement préférés. On voit que R4 et Rs ne peuvent pas être tous deux de l'hydrogène.

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Les composés particulièrement intéressants pour le présent procédé sont des analogues de dipeptides dérivant d'aminoacides naturels. Cependant, les dipeptides peuvent dériver non seulement des isomères L d'acides naturels, mais également des isomères L et D de ceux-ci et des autres acides qui ne se trouvent pas dans la nature. Parmi les aminoacides cités ci-dessus, il existe un grand nombre de structures diverses, les groupes —CH(R4)— et — CH(R5)— étant à chaîne droite ou ramifiée, ou (avec un groupe adjacent) un groupe cyclique qui peut porter des substituants carboxyle, amino, imino, amido, hydroxyle, sulfhydryle, phényle, indolyle, et imidazolyle.

Des exemples de types spécifiques de composés pour la mise en œuvre du procédé selon l'invention sont premièrement les composés dans lesquels le groupe central — CH2CHR— est simplement un groupe éthylène, — CH2—CH2 —, R étant de l'hydrogène. Les analogues de dipeptides dérivent des aminoacides énumérés plus haut par combinaison de ceux-ci par paires du même aminoacide ou par paires d'aminoacides différents dans n'importe quel ordre, et le plus grand nombre de ces dipeptides contiennent un groupe de liaison amide de forme — CONH—. Le remplacement du groupe carbonyle par — CH2 — et de l'atome d'azote par

>CH

conduit à un groupe éthylène. Un plus petit nombre de ces dipeptides contiennent un reste terminal — C qui dérive d'un a-iminoacide où l'atome d'azote du groupe imino fait partie d'un système cyclique, c'est-à-dire de l'hydroxyproline, de la proline, de l'acide pyroglutamique et de la spinacine, et dans le cas de ces dipeptides, le groupe amide de liaison est de la forme

—CON '< -

Le remplacement du groupe carbonyle par — CH2 — et de l'atome d'azote par

3*CH

conduit au second type de composé contenant un groupe central -CH2CH<

avec le groupe

I

-CH-

prenant la place de l'atome d'azote du cycle de l'a-iminoacide. Un troisième type de composé contient un groupement — CH2CHR— dans lequel R est un groupe alcoyle inférieur, particulièrement méthyle, et dans ce cas le dipeptide dont ce composé est un analogue peut également être considéré comme contenant un aminoacide C— terminal dont le groupe a-amino est substitué par un groupe organique monovalent, par exemple un dérivé de l'acide glutamique ou de la glutamine dont le groupe a-amino porte un substituant alcoyle inférieur.

Comme indiqué ci-dessus, les composés utilisés dans le procédé selon l'invention peuvent avoir leurs groupes terminaux amino et/ou carboxyle, et/ou d'autres groupes fonctionnels, présents sous forme de dérivés. Ces dérivés peuvent être de diverses formes. Un groupe correspond aux analogues des dipeptides spécifiques qui dérivent des aminoacides énumérés plus haut, dans lesquels un ou plusieurs des groupes fonctionnels est protégé de l'une des manières utilisées couramment en synthèse des peptides, comme exposé plus loin. Un autre groupe de composés a un groupe terminal amino qui porte deux, ou plus spécialement un, groupes organiques monovalents tels que des groupes alcoyles inférieurs et notamment méthyle, ou des groupes acyles et notamment formyle, et dans ces cas le dipeptide dont le composé est un analogue peut également être considéré comme contenant un aminoacide N-terminal dont le groupe a-amino est substitué par les groupes organiques en question, par exemple la N-formylglycine, ou un dérivé de la N-formylglycine, l'acide glutamique, la glutamine ou l'acide pyroglutamique dans lesquels le groupe a-amino porte un substituant alcoyle inférieur.

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Comme exemples des analogues de dipeptides utilisés dans le procédé selon l'invention, on peut citer des composés qu'on peut considérer comme dérivant des dipeptides suivants par le remplacement de leur groupe —CONH — ou

—CON <

central par les groupes — CH2CH2— ou -CH2CH<

respectivement (notamment lorsque les restes d'aminoacide individuels, lorsqu'ils sont énantiomorphes, ont la configuration L-): l'arginylproline, l'histidyltryptophane, la pyroglutamylhistidine, la séryltyrosine, la tryptophanylsérine, la tyrosylalanine (la L-tyrosyl-D-alanine étant aussi d'un certain intérêt dans ce cas) et notamment la leucylarginine, la glycylleucine et plus particulièrement la phényl-alanylglycine, la prolylglycine et la tyrosylglycine et leurs dérivés fonctionnels.

Les analogues de dipeptides, utilisés dans le procédé selon l'invention, sont préparés le plus commodément soit en construisant la portion de la molécule à extrémité C sur la portion à extrémité N de la molécule comme matière de départ, soit en fixant des précurseurs appropriés pour ces deux portions plutôt que par une tentative de modifier le dipeptide en tant que tel.

De préférence, on prépare les analogues, où le fragment à extrémité C est le groupe • CH2 -CH2 -C02H, en introduisant à son tour dans l'aminoacide correspondant au fragment à extrémité N de l'analogue trois groupes méthylène, commodément, en utilisant la série de réactions appelée la synthèse Arndt-Eistert comprenant la formation de la diazocétone suivie de sa transposition en l'acide carboxylique ou son ester.

L'aminoacide de l'extrémité N est commodément utilisé sous forme du composé N-protégé. On peut utiliser divers groupes N-protecteurs, qui restent en place pendant les diverses étapes de la synthèse, et on choisit des groupes appropriés, par exemple parmi les groupes N-protecteurs décrits dans la littérature de la chimie des peptides. Cependant, en général, on préfère utiliser un groupe protecteur bifonctionnel, par exemple phtaloyle, où l'extrémité N dérive d'un aminoacide plutôt que d'un iminoacide et contient un groupe — NH2 plutôt qu'un groupe — NH—. Cependant, en variante, et notamment lorsque l'extrémité N possède un groupe — NH, par exemple dans la proline, on peut utiliser des groupes protecteurs monofonctionnels qui, comme les groupes bifonctionnels, peuvent aussi être hydrogénolysables ou hydrolysables dans des'conditions acides ou alcalines, par exemple un groupe aralcoyloxy- ou alcoyloxycarbonyle tel que le groupe benzyloxycarbonyle ou éthoxy-carbonyle.

Pour la synthèse Arndt-Eistert, on peut commodément utiliser l'aminoacide à extrémité N sous forme d'un halogénure d'acide, tel que le chlorure ou le bromure d'acide ou l'imidazoylamide, ou notamment sous forme d'un anhydride qui peut être symétrique ou plus particulièrement mélangé afin de réduire la quantité d'aminoacide nécessaire. Des anhydrides mixtes qui conviennent particulièrement sont ceux formés avec des acides qui sont tels que le groupe aminoacylcabonyle est alors attaqué préférentiellement par des nucléophiles, par exemple les acides qui contiennent des groupes à empêchement stérique, tels que l'acide pivalique, et aussi ceux qui sont formés avec des acides alcoxyformique tels que l'acide isobutoxyformique. La réaction avec le diazométhane est dirigée de façon prédominante vers la partie aminoacide de l'anhydride mixte par des facteurs stériques, dans le cas d'un anhydride avec un acide tel que l'acide pivalique, et par des facteurs électroniques, dans le cas d'un anhydride avec un acide tel que l'acide isobutoxyformique.

Après la réaction avec le diazométhane pour donner la diazocétone, on traite commodément ce composé avec un alcool approprié en présence d'un catalyseur approprié, par exemple l'oxyde d'argent, pour former l'ester correspondant qu'on convertit alors en l'acide libre pour répéter deux fois tout ce processus. Il est commode d'utiliser un alcool tel que l'alcool benzylique pour donner un ester

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qu'on peut convertir en l'acide libre par hydrogénation catalytique. En variante, l'ester peut être hydrolysé, par exemple par hydrolyse acide dans un milieu tel que l'acide chlorhydrique aqueux/acide acétique et, dans ce cas, on peut utiliser divers alcools, par exemple un alcanol inférieur ayant de 1 à S atomes de carbone tel que l'alcool mêthylique, l'alcool éthylique, l'alcool propylique, l'alcool t-butylique et l'alcool isoamylique. En fait, dans certains cas, on peut trouver que l'hydrolyse est préférable à l'hydrogénolyse à cause de la difficulté d'enlever le groupe benzyle dans certains composés.

L'avantage du procédé décrit plus haut, en utilisant la synthèse Arndt-Eistert, est que ce procédé convient bien parce qu'il conserve la configuration à l'atome de carbone auquel est relié le groupe amino de l'aminoacide de l'extrémité N. Dans le cas des analogues de dipeptides dans lesquels le fragment à extrémité C dérive d'un aminoacide autre que la glycine, la synthèse des analogues est compliquée par la présence d'un atome de carbone asymétrique additionnel. On indique ci-dessous deux autres procédés pour la synthèse de ces analogues:

Procédé 1

ANR'—CHR"—COCH2Br Z—CHR"'—COOB Réaction SN2 Réduction

Zinc

ANR' - CHR" - COCH, "ZnBr4

ANR' - CHR" - COCH2 - CHR'" - COOB ANR'-CHR"-CH2CH2 -CHR"'-COOB

Procédé 1

ANR'-CHR"—COCH,Br -

1. PPh,

2. Base faible

ANR'—CHR"—COCH=PPh3

1. Z—CHR'"—COOB (SN2)

2. Hydrolyse douce Réduction

ANR'-CHR" - COCH, - CHR'" - COOB

ANR' - CHR" - CH,CH, - CHR'"- COOB

où R' représente un atome d'hydrogène ou une liaison avec R", R" représente un atome d'hydrogène, un groupe organique monovalent ou un groupe organique divalent relié à AN—, R'" représente un atome d'hydrogène ou un groupe organique monovalent, A et B représentent des groupes protecteurs appropriés et Z représente un groupe qui part approprié dans la réaction SN2.

Les procédés de synthèse décrits plus haut conviennent pour la rétention de la configuration à l'un ou aux deux atomes de carbone auxquels sont liés les groupes amino des aminoacides, le dédoublement étant utilisé si la configuration est perdue sur un des centres. Dans le premier procédé, on traite une halogénocétone avec un métal approprié, par exemple le zinc, dans un solvant aprotique fortement-polaire, par exemple l'hexaméthylphosphoramide ou notamment le sulfoxyde de diméthyle dans le benzène, afin de conduire à la formation sélective de l'énolate approprié. On fait réagir l'ion carbone obtenu par une voie SN2 avec le corps réagissant Z—CHR'"—COOB qu'on obtient sans racémisation à partir de l'aminoacide correspondant, des groupes partant Z appropriés étant les anions tosylates (p-toluènesulfonate) et bromure. La réduction du groupe cèto est alors conduite par exemple en utilisant HSCH2CH2SH, puis le nickel Raney pour obtenir l'analogue désiré.

Dans le deuxième procédé, on traite une halogénocétone avec la triphénylphosphine dans des conditions appropriées pour former le sel de phosphonium qui, lors d'un traitement avec une base faible, par exemple Na2C03[H20]C2Hs0C0CH3, donne unylide. La réaction avec le corps réagissant Z—CHR'"—COOB, comme décrit plus haut, suivie d'une hydrolyse douce, donne l'analogue désirée.

Les groupes N-protecteurs A appropriés comprennent divers uréthanes et groupes N-protecteurs, notamment des groupes tels que t-butoxycarbonyle, etc. Les groupes C—protecteurs B appropriés comprennent divers groupes alcoyle, notamment des groupes alcoyle inférieur en C14 tel que le groupe méthyle et, en fait, il peut être même possible dans certains cas de simplifier le procédé en utilisant un groupe carboxy libre. La protection d'autres groupes fonctionnels réactifs dans R" et R'" selon des procédés classiques peut aussi être s nécessaire. Les a-halogénocétones sont obtenues facilement à partir des diazocétones correspondantes, par exemple par un traitement avec HBr à — 10°C. Les diverses réactions qui entrent enjeu dans les procédés 1 et 2 comprennent tous des procédés connus et leurs variantes, par exemple des variantes pour faire des analogues io contenant un groupe — CH2CHR— seront claires pour ceux du métier. En fait, on comprendra qu'en général les procédés de synthèse décrits ici ne sont pas les seuls qu'on peut utiliser pour la préparation des analogues de dipeptides selon la présente invention et qu'on peut utiliser des équivalents chimiques évidents de ces 15 procédés, ou d'autres procédés connus du métier, pour conduire des réactions analogues et leurs divers équivalents chimiques peuvent être utilisés.

On peut obtenir le composé ayant des groupes amino et carboxy libres en enlevant le groupe N-protecteur et aussi, lorsqu'il y a lieu, le 20 groupe C—protecteur qu'on a utilisé pour sa synthèse, le groupe phtaloyle par exemple, étant enlevé par hydrolyse acide.

Les analogues de dipeptides sont utilisés selon la présente invention pour la synthèse de peptides modifiés, plus grands, par l'addition d'autres aminoacides ou peptides à ces derniers par des 25 procédés exactement analogues à ceux décrits dans la littérature de la chimie des peptides pour l'addition d'aminoacides et de peptides à des dipeptides ou des aminoacides. En outre, on comprendra que ces peptides modifiés, plus grands, peuvent contenir plus qu'une liaison amide modifiée comme décrit ici. Dans de nombreux cas, l'analogue 30 de dipeptide utilisé dans de telles synthèses sera sensiblement modifié par rapport à celui qui correspond simplement au composé produit par le remplacement de la liaison amide dans un dipeptide dérivé de deux aminoacides par un groupe — CH2CHR—. De telles modifications peuvent être déjà incorporées dans l'analogue de dipeptide 35 produit par le procédé de synthèse approprié, comme indiqué plus haut, ou en variante l'analogue peut être modifié de manière appropriée avant l'utilisation. Un premier type de modification est nécessaire lorsque les aminoacides dont dérive l'analogue contiennent des groupes réactifs qui sont normalement protégés pendant les 40 synthèses des peptides. Ces groupes habituellement doivent être protégés dans l'analogue de dipeptide et cette protection peut être conduite de manière commode par des procédés analogues à ceux décrits dans le domaine de la chimie des peptides. Des exemples de ces groupes dans les aminoacides qu'on trouve couramment sont le 45 groupe e-amino de la lysine et le groupe sulfhydryle de la cystéine, le groupe ß-carboxy de l'acide aspartique et le groupe y-carboxy de l'acide glutamique, le groupe hydroxyle de la sérine, de la thréonine et de la tyrosine et, moins couramment, le groupe amide de l'asparagine et de la glutamine, le groupe sulfure de la méthionine et 50 le groupe imino du tryptophane. De plus, il sera souvent nécessaire de modifier le groupe amino ou imino ou le groupe carboxy de l'analogue de dipeptide. Cette nécessité dépend du type de réaction dans laquelle on utilise l'analogue. Ainsi, lorsqu'on ajoute un aminoacide ou un peptide à l'extrémité N de l'analogue, habituelle-55 ment on protège le groupe carboxy de celui-ci lorsqu'on fait réagir l'extrémité C de l'aminoacide ou du peptide ajouté en tant que groupe carboxy libre, en utilisant un agent de condensation approprié tel que le dicyclohexylcarbodiimide. Lorsqu'on fait réagir l'extrémité C de l'aminoacide ou du peptide ajouté en tant que dérivé 60 fonctionnel activé de celui-ci, le groupe carboxy terminal de l'analogue de dipeptide peut être protégé ou il peut être présent sous forme d'ion hermaphrodite (zwitterion) ou comme carboxylate. D'autre part, lorsqu'on ajoute un aminoacide ou un peptide à l'extrémité C de l'analogue, habituellement on protège son groupe amino- ou 65 imino-terminal et, en outre, il peut aussi convenir de modifier le groupe carboxy pour l'activer comme décrit plus haut au lieu d'utiliser le groupe carboxy libre avec un agent de condensation approprié.

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Des exemples de dérivés fonctionnels activateurs appropriés du groupe carboxy à extrémité C de l'analogue de dipeptide sont des esters actifs, des anhydrides mixtes, par exemple provenant du chlorocarbonate d'isobutyle, l'anhydride symétrique, l'azide et aussi des azides masqués tels que les dérivés — NHNHS où S représente le groupe t-butoxycarbonyle, benzyloxycarbonyle, etc. Parmi ces dérivés, les esters actifs sont particulièrement intéressants, par exemple les esters avec le p-nitrophénol, le 2,4-dinitrophénol, le 2,4,5-trichlorophénol, le 2,3,4,5,6-pentachlorophénol, le N-hydroxyphtalimide, le N-hydroxysuccinimide, la 5-chloro-8-hydroxyquinoléine, etc.

Des exemples des groupes protecteurs appropriés pour le groupe carboxy de l'extrémité C des analogues de dipeptides sont des groupes qu'on peut enlever par clivage hydrolytique et catalytique, notamment des esters et des amides, y compris des amides N—substitués, par exemple divers benzylesters et alcoylesters, (par exemple CM) substitués, y compris le t-butylester. On comprendra que le groupe carboxy peut aussi être protégé par fixation à une résine lors d'une synthèse en phase solide.

Des exemples des groupes protecteurs appropriés pour le groupe amino de la terminaison N des analogues de dipeptides sont des groupes qu'on enlève par clivage hydrolytique et catalytique, y compris les groupes benzyloxycarbonyle et de leurs dérivés tels que p-méthoxybenzyloxycarbonyle, amyloxycarbonyle, biphényl-isopropoxycarbonyle, o-nitrophénylsulfényle, phtaloyle et t-butoxycarbonyle. En outre, on peut aussi dans le cas de ces analogues de dipeptides utiliser des groupes N-protecteurs tels que des groupes acyle que normalement on n'utilise pas dans la chimie des peptides à cause de leur tendance à causer la racémisation sur l'atome de carbone a pendant le couplage.

Comme indiqué ci-dessus, on peut utiliser les analogues de dipeptide pour la synthèse d'une grande variété de peptides contenant une ou plusieurs liaisons amide modifiées. On prépare selon l'invention de tels peptides par l'addition d'un ou plusieurs aminoacides, peptides ou analogues de dipeptides, à l'une ou aux deux extrémités à extrémité C et N de l'analogue de dipeptide en utilisant soit des procédés classiques en solution, soit des procédés en phase solide, et en conduisant la réaction entre l'extrémité appropriée du corps réagissant et de l'analogue de dipeptide selon les procédés généraux indiqués plus haut. Ainsi, on peut faire réagir un groupe amino libre de l'extrémité N du corps réagissant avec le groupe carboxy de l'extrémité C d'un de ces dérivés appropriés sur l'analogue de dipeptide ou vice versa, d'autres groupes réactifs dans le corps réagissant étant protégés de manière appropriée, comme décrit plus haut.

Les exemples 1 à 5 se rapportent à divers analogues de dipeptides et l'exemple 6 illustre l'invention, à savoir comment on incorpore de tels analogues dans un analogue d'un peptide plus grand.

Tous les aminoacides utilisés ici ont la configuration L lorsqu'ils sont énantiomorphes et cette configuration est conservée dans les produits qui en dérivent.

Exemple 1:

Acide 5-amino-6-phénylhexanoïque (analogue dephénylalanylglycine où — CH2CH2 — remplace — CONH— )

(1) Acide 4-phényl-3-phtalimidobutanoïque

On ajoute 0,60 ml (5,42 mmol) de N-méthylmorpholine à une solution agitée de 1,60 g (5,42 mmol) de N-phtaloylphénylalanine dans 15,00 ml d'acétate d'éthyle sec. On refroidit la solution à — 15°C, on ajoute goutte à goutte 0,71 ml (5,42 mmol) de chlorofor-miate d'isobutyle et on garde le mélange à — 15°C pendant 8 min. On filtre la suspension et on traite le filtrat avec une solution, préalablement refroidie, de 12 mmol de diazométhane dans 70 ml d'éther sec. On garde la solution jaune à 4°C pendant 5,0 h, puis on évapore pour obtenir la diazocétone pure sous forme d'une substance solide jaune vmax. (CHC13): 2115,1780,1720 cm-1.

On traite une solution de diazocétone (100% de la quantité obtenue) et d'alcool benzylique sec (5,85 g, 54,2 mmol) dans 34 ml de dioxane sec avec 0,25 g (1,08 mmol) d'oxyde d'argent, on agite la suspension et on la chauffe au bain d'huile (70° C) pendant 0,5 h. On laisse refroidir le mélange jusqu'à la température ordinaire, on filtre, on évapore et on hydrogénolyse le benzylester brut dans 35 ml de méthanol sur 0,20 g de catalyseur de charbon palladié à 10%

pendant 18 h à la température et à la pression ordinaire. On filtre le produit réactionnel, on l'évaporé et on le redissout dans 50 ml d'acétate d'éthyle. L'extraction avec 1M, 3 x 25 ml de bicarbonate de sodium et l'acidification donnent l'acide libre, c'est-à-dire l'acide 4-phényl-3-phtalimidobutanoïque, sous forme d'une substance solide blanche. La cristallisation à partir de méthanol aqueux donne l'acide sous forme d'une poudre blanche: 1,00 g (60%) qui fond à 123-124,5°C.

(2) Acide 5-phényl-4-phtalimidopentanoïque

On ajoute 0,27 ml (2,42 mmol) de N-méthylmorpholine à une solution agitée de 0,75 g (2,42 mmol) d'acide 4-phényl-

3-phtalimidobutanoïque dans 7,50 ml d'acétate d'éthyle sec. On réfrigère la solution à — 15°C, on ajoute goutte à goutte 0,32 ml (2,42 mmol) de chloroformiate d'isobutyle et on garde le mélange à

— 15°C pendant 8 min. On filtre la suspension et on traite le filtrat avec une solution préalablement refroidie de 6 mmol de diazométhane dans 40 ml d'éther sec et on garde à 4°C pendant 18 h. L'évaporation donne la diazocétone pure en tant que substance solide jaune, vmax (CHC13): 2110,1775,1710cm-1.

On agite une solution de la diazocétone (90% de la quantité obtenue) et d'alcool benzylique sec (2,44 g, 22,60 mmol) dans 15 ml de dioxanne sec avec 0,10 g (0,45 mmol) d'oxyde d'argent et on chauffe au bain d'huile (70°C) pendant 0,5 h. On laisse refroidir la suspension jusqu'à la température ordinaire, on filtre, on évapore et on hydrogénolyse le benzylester brut dans 20 ml de méthanol sur 0,09 g de charbon palladié à 10%, comme catalyseur, pendant 25 h à la température et à la pression ordinaire. On filtre le mélange, on l'évaporé et on redissout l'huile résiduelle dans 25 ml d'acétate d'éthyle. L'extraction avec du bicarbonate de sodium (1M, 3 x 10 ml) et l'acidification donnent l'acide libre, c'est-à-dire l'acide 5-phényl-4-phtalimidopentanoïque sous forme d'une substance solide blanche qui, après cristallisation dans le méthanol aqueux, est obtenu sous forme de 0,357 g (50%) d'une poudre blanche qui fond à 142-143,5°C.

L'hydrogénolyse de la fraction insoluble dans le bicarbonate donne encore 0,050 g de l'acide; on obtient au total 0,407 g (57%).

(3) 6-phényl-5-phtalimidohexanoate de méthyle

On ajoute 0,135 ml (12,37 mmol) de N-méthylmorpholine à une solution agitée de 0,40 g (1,237 mmol) d'acide 5-phényl-

4-phtalimidopentanoïque dans 8,25 ml d'acétate d'éthyle sec. On refroidit la solution à — 15°C, on ajoute goutte à goutte 0,16 ml (1,237 mmol) de chloroformiate d'isobutyle et on garde le mélange à

— 15°C pendant 8 min. On filtre la suspension et on traite le filtrat avec une solution prérefroidie de 6 mmol de diazométhane dans 40 ml d'éther sec et on garde à 4°C pendant 48 h. L'évaporation donne la diazocétone pure sous forme d'une substance solide huileuse; vmax (CHCU): 2110,1773,1710 cm-1.

On traite une solution de la diazocétone (90% de la quantité obtenue) dans 9,00 ml de méthanol avec 0,052 g (0,224 mmol)

d'oxyde d'argent, on agite la suspension et on la chauffe sur un bain d'huile à 70° C pendant 15 min. On laisse refroidir le produit jusqu'à la température ordinaire, on le filtre et on l'évaporé pour obtenir le 6-phényl-5-phtalimidohexanoate de méthyle brut.

(4) Acide 5-amino-6-phénylhexanoïque

On dissout le 6-phênyl-5-phtalimidohexanoate de méthyle (toute la quantité de substance brute obtenue) dans 2,50 ml d'acide acétique glacial. On ajoute 12,00 ml d'acide chlorhydrique 6N Analar et on chauffe le mélange à 110°C pendant 16,5 h dans six tubes scellés. On

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extrait le produit réactionnel avec 6 x 10 ml d'acétate d'éthyle et on évapore la phase aqueuse pour obtenir 0,235 g du chlorhydrate d'acide 5-amino-6-phénylhexanoïque brut.

Exemple 2:

A rìde 5-t-butoxycarbonylamino-6-phènylhexanoïque

On traite une solution de 0,235 g (0,97 mmol) de chlorhydrate d'acide 5-amino-6-phénylhexanoïque brut, préparé comme décrit dans l'exemple 1, et 0,438 g (2,90 mmol) de tétraméthylguanidine dans 6,60 ml de diméthylformamide avec 0,276 g (1,93 mmol) de t-butoxycarbonylazide dans 3,00 ml de diméthylformamide et on agite la solution pendant 48 h à la température ordinaire. On évapore le diméthylformamide et on partage le produit entre l'acétate d'éthyle et l'acide citrique 1M. L'extraction de la phase organique avec de l'ammoniac aqueux à 3%, suivie d'acidification et d'extraction,

donne l'acide 5-t-butoxycarbonylamino-6-phénylhexanoïque qu'on purifie encore par Chromatographie sur couche mince préparatrice, en utilisant un mélange 95/25/4 (v/v/v) de benzène/dioxanne/acide acétique pour le développement. L'élution avec l'acétate d'éthyle donne l'acide pur sous forme d'une substance solide blanche. On obtient 0,180 g (53 %) calculé par rapport à l'acide 5-phényl-4-phtalimidopentanoïque. La cristallisation à partir d'acétate d'éthyle/pétrole (60-80°C) donne l'acide sous forme d'une poudre blanche qui fond à 94,5-96,5QC et qui a les valeurs: t(CDC13): —0,67 (1H, s,D20-échangeable), 2,82 (5H,s), 5,58 br (1H, D2-échangeable), 6,28 br (1H), 7,28 (2H,d, J = 6,5HZ), 7,68 (2H multiplet), 8,05-8,90 (10H, complex); vmax (CHC13): 2600 (très large) 1710,1500 cm-1.

Exemple 3:

Acide 5-amino-6-(4-hydroxyphènyl)hexanoïque

(Analogue de la tyrosylglycine où — CH2CH2— remplace -CONH-)

On prépare ce composé par un procédé pratiquement analogue à celui décrit pour l'analogue de phénylalanylglycine correspondant de l'exemple 1, mais on protège le groupe 4-hydroxyphényl pendant la synthèse par acétylation.

(1) Acide 4- (4-acètoxyphènyl)-3-phtalimidobutanoïque

On traite l'O-acétyl-N-phtaloyltyrosine (P.F. = 176-179°C, préparé avec un rendement de 81 % en traitant la N-phtaloyltyrosine avec l'anhydride acétique dans la pyridine; la N-phtaloyltyrosine étant préparée avec un rendement de 91 % à partir de N-carbêtoxy-phtalimide de triéthylamine et de L-tyrosine dans le sulfoxyde de diméthyle (à cause de la faible solubilité de la L-tyrosine dans l'eau) pratiquement comme décrit dans l'exemple 1 (1) pour obtenir l'acide 4-(4-acétoxyphényl)-3-phtalimidobutanoïque avec un rendement de 49%; P.F.: 151-153,5°C.

(2) Acide5-(4-acêtoxyphényl)-4-phtalimidopentanoïque

On traite l'acide 4-(4-acétoxyphényl)-3-phtalimidobutanoïque pratiquement selon le procédé décrit dans l'exemple 1(2) pour obtenir l'acide 5-(4-acétoxyphényl)-4-phtalimidopentanoïque avec un rendement de 54,5%; P.F.: 142,5-144,5'C.

(3) A cide 5-amino-6- ( 4-hydroxyphényl) hexanoïque

On traite l'acide 5-(4-acétoxyphényl)-4-phtalimidopentanoïque pratiquement comme dans le procédé décrit dans l'exemple 1(3),

pour obtenir le 6-(4-acétoxyphényl)-5-phtalimidohexanoate de méthyle. On conduit par acidolyse l'enlèvement du groupe protecteur de ce composé en présence de phénol pour obtenir l'acide 5-amino-6-(4-hydroxyphényl)hexanoïquebrut.

Exemple 4:

A cide 5-t-butoxycarbonylamino-6- (4-hydroxyphényl)hexanoïque

On traite l'acide 5-amino-6-(4-hydroxyphényl)héxanoïque brut, préparé comme il est décrit dans l'exemple 3 — pratiquement selon le procédé décrit dans l'exemple 2 — pour obtenir l'acide 5-t-butoxy-

carbonylamino-6-(4-hydroxyphényl)héxanoïque sous forme d'une gomme; t(CDC13): 1,80 (1H, large, D20-échangeable), ta 3,02, td 3,26 (4H, A2B2, J = 9HJ, environ 5,3-6,5 (complex, partiellement D20-échangeable), 7,40 (2H, d, J = 6 H^, environ 7,5-9,0 (6H, complex), 8,65 (9H, s); vmax (CHC13); 3600,3400, environ 2600 très large, 1710,1515 cm-1.

Exemple 5:

Acide 4-(2-N-t-butoxycarbonylpyrrolidyl) butanoïque

(Analogue de prolylglycine N-t-Boc protégé où — CH2CH2— remplace -CONH-)

On prépare ce composé pratiquement comme il est décrit pour l'analogue de phénylalanylglycine N-t-Boc protégé dans les exemples 1 et 2, sauf qu'on effectue la protection de N- avec un groupe t-butoxycarbonyle plutôt qu'un groupe phtalimido pendant tout le procédé.

(1) Acide (2-N-t-butoxycarbonylpyrrolidyljëthanoïque

On traite la t-butoxycarbonylproline selon le procédé décrit dans l'exemple 1(1) pour obtenir l'acide (2-N-t-butoxycarbonyl-pyrrolidyl)éthanoïque avec un rendement de 69%; P.F.: 98-99,5°C.

(2) Acide 3-(2-N-t-butoxycarbonylpyrrolidyl)propanoïque

On traite l'acide (2-N-t-butoxycarbonylpyrrolidyl)éthanoïque pratiquement selon le procédé décrit dans l'exemple 1(2) pour obtenir l'acide 3-(2-N-t-butoxycarbonylpyrrolidyl)propanoïque avec un rendement de 63% sous forme d'une gomme (sel de dicyclohexylamine); P.F.: 108,5-109,5°C.

(3) Acide 4-(2-N-t-butoxycarbonylpyrrolidyl) butanoïque

On traite l'acide 3-(2-N-t-butoxycarbonylpyrrolidyl)butanoïque selon le procédé des étapes (1) et (2) pour obtenir l'acide 4-(2-N-t-butoxycarbonylpyrrolidyl)propanoïque avec un rendement d'environ 23% sous forme d'une gomme, t(CDC13): —0,16 (1H, s, D20-échangeable), 6,25 (1H, multiplet), 6,68 (2H, multiplet), 7,45 à environ 8,9 (10H, complex), 8,55 (9H, s); vmax (CHC13): 1710, 1680, 1400 cm-1.

Exemple 6:

L'utilisation de l'acide 5-amino-6-phénylhexanoïquepour la synthèse de l'analogue d'un peptide qui est:

Ser-NHCH(CH2 C6H5 ) CH2 CH2 CH2 CO-Leu-Arg-Pro-NHCzHs

(1) Préparation d'ester N-t-butoxycarbonyl-Leu-N-tosyl-Arg-Pro-rèsine

Ester N-t-butoxycarbonyl-Pro-résine

On mélange 5 g (2,5 mmol) de Biobeads chlorométhylé réticulé à 1% (SX1, Cl = 0,5 mmol/g), 0,75 g (3,5 mmol) de N-t-butoxy-carbonyl (Boc)-proline, 0,42 ml (3 mmol) de triéthylamine et 10 ml d'éthanol absolu et on chauffe la suspension à reflux pendant une nuit. On filtre le mélange et on lave à fond les perles de résine avec l'éthanol, le dichlorométhane, 10% (v/v) de triéthylamine dans le dichlorométhane, le dichlorométhane, l'éthanol et l'éther successivement. L'analyse des aminoacides de la résine séchée indique que 0,25 mM:g de Boc-proline est incorporé sur la résine par une liaison ester.

Ester N-t-butoxycarbonyl-Leu-N-tosyl-Arg-Pro-résine On traite un échantillon de 1,8 g (0,45 mmol) d'ester de résine Boc-Pro comme suit: toutes les opérations sont conduites dans un récipient entièrement en verre analogue à celui décrit par Corley et al., «Biochem. Biophys. Res. Comm», 1972,47,1353.

(a) Laver trois fois avec CH2C12, trois fois à l'isopropanol et trois fois au CH2C12 successivement.

(b) Faire réagir avec l'acide trifluoroacétique à 40% (v/v) dans CH2C12 (1 min) et répéter pendant 20 min.

(c) Répéter l'étape (a).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

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(d) Répéter l'étape (b).

(e) Répéter l'étape (a). On prélève un échantillon et le soumet aux essais pour des groupes amino libres avec la ninhydrine (essai Kaiser) (résultat fortement positif).

(f) Laver avec 10% de triéthylamine dans CH2C12 (2x2 min).

(g) Répéter l'étape (a).

(h) Ajouter un mélange de 0,505 g (1,5 mmol) d'a-N-t-butoxy-carbonyl -» N-tosy larginine (tosyle ou Tos représente le groupe p-toluènesulfonyle) dans un mélange de 11,5 ml de CH2C12,

0,5 ml de diméthylformamide et 0,5 ml (1,5 mmol) d'une solution de 3,0 g de dicyclohexylcarbodiimide (DCC) dans 5 ml de CH2C12 et fait réagir pendant 2 h.

(i) Répéter l'étape (a). On prélève un échantillon et on le soumet à l'essai Kaiser (négatif).

(j) Laver avec 10% (v/v) de triéthylamine dans CH2C12 (2x2 min), (k) Répéter l'étape (a).

(1) Acétyler avec 0,17 g (1,5 mmol) d'acétylimidazole dans 12 ml de diméthylformamide pendant 2 h.

On répète alors le cycle complet des étapes (a) à (1) avec les variantes suivantes:

(f) et (j) Dans chaque cas, on prélève un échantillon de résine et on fait réagir avec la fluorescamine pour déterminer si le couplage est complet (négatif après 2 h).

(h) Le réactif utilisé est 0,38 g (1,5 mmol) d'hydrate de N-t-butoxy-carbonylleucine dans un mélange de 10 ml de CH2C12 et 1,0 ml (3,0 mmol) de la même solution de dicyclohexylcarbodiimide. L'ester Boc-Leu-Arg(Tos)-Pro-résine est lavé à fond avec CH2C12, l'isopropanol-CH2Cl2,10% de triéthylamine dans CH2C12, l'éthanol et l'éther successivement puis séché; on obtient 1,887 g.

(2) Préparation de O-benzyl-Ser-NHCH

Ester (CH2)C6H5-CH2CH2CH2CO-Leu-N-t-tosyl-Arg-Pro-résine

On traite un échantillon de 0,5 g (0,1 mmol) d'ester Boc-Leu-Arg(Tos)-Pro-résine dans deux cycles successifs pour ajouter d'autres composants du composé désiré en utilisant le cycle d'étape (a) à (1) décrit sous (1) ci-dessus avec les variantes suivantes:

Premier cycle:

Dans l'étape (h), on traite 30,8 mg (0,1 mmol) d'acide 5-t-

butoxycarbonylamino-6-phénylhexanoïque dans 2,5 ml de CH2C12 avec 0,1 ml (0,11 mmol) d'une solution DCC mère (1,15 g/5 ml de CH2C12), puis on ajoute celle-ci à la résine. On utilise la fluorescamine pour mesurer la réaction de couplage à l'étape (i) et, bien que s les perles donnent encore une réaction positive après 4 h, on poursuit les étapes (j), (k) et (1) et alors la résine donne un essai négatif à la fluorescamine.

Deuxième cycle:

io A l'étape (h), on traite 120 mg (0,4 mmol) d'O-benzyl-N-t-butoxycarbonylsérine dans 2,5 ml de CH2C12 avec 0,4 ml (0,44 mmol) de la solution mère de dicyclohexylcarbodiimide et on l'ajoute à- la résine. Après 2 h, on obtient un essai négatif à la fluorescamine (on obtient un résultat positif après déprotection avec 15 40% (v/v) d'acide trifluoroacétique à l'étape (b), ce qui confirme l'incorporation du dipeptide modifié dans le premier cycle).

(3) Préparation de Ser-NHCH(CH2C6Hs) CH2CH2CH2CO-Leu-Arg-Pro-NHC2Hs 20 On met en suspension le composé protégé, fixé à une résine obtenue sous (2) ci-dessus, dans 15 ml de diméthylformamide et on traite avec 5 ml d'éthylamine. On agite alors la suspension pendant une nuit dans un récipient réactionnel bien fermé. On filtre le mélange et on lave les perles de résine à fond avec le diméthylform-25 amide. On Chromatographie le filtrat sur Sephadex LH20 dans le diméthylformamide pour obtenir Ser(benzyl)—NHCH— (CH2C6H5)CH2CH2CH2 CO-Leu-Arg(Tos)-Pro-NHCH2H5. On dissout ce composé protégé exempt de résine dans 40 ml d'ammoniac liquide anhydre à reflux et on traite la solution avec de petits 30 morceaux de sodium jusqu'à ce qu'une couleur bleue persiste tout juste. On détruit la couleur en ajoutant deux gouttes d'acide acétique glacial, puis on chasse l'ammoniac par évaporation. On sèche le résidu sous vide et on le Chromatographie successivement sur du Sephadex G25 SF équilibré et on élue avec de l'acide acétique aqueux 35 désaéré à 50% contenant 0,01% (v/v) de mercaptoéthanol, puis on équilibre a^ec Whatman CM52 dans 0,05M d'acétate d'ammonium de pH = 7,0 et on élue avec un gradient linéaire de 0,05M à 0,5M d'acétate d'ammonium de pH = 7 pour obtenir Ser-NHCH (CH2C6H5)CH2CH2CH2CO-Leu-Arg-Pro-NHC2H5.

R

Claims

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1. Procédé de préparation de peptides modifiés, dans lequel un analogue de dipeptide, ou un dérivé de cet analogue, résultant de la transformation d'un ou de plusieurs groupe(s) fonctionnels) présents), est mis en réaction par l'un ou les deux de ses groupes terminaux avec un aminoacide ou un peptide, ou un dérivé de ceux-ci, avec formation d'une liaison peptidique, caractérisé en ce que ledit analogue de dipeptide ou son dérivé est formé de l'un des aminoaci-des suivants: alanine, arginine, asparagine, acide aspartique, cystine, cystéine, dopa, 3,5-dibromotyrosine, 3,5-diiodotyrosine, glycine, acide glutamique, glutamine, histidine, hydroxylysine, hydroxypro-line, isoleucine, leucine, lysine, méthionine, Ornithine, phénylalanine, proline, acide pyroglutamique, hydroxyproline, sérine, spinatine, thréonine, thyroxine, tryptophane, tyrosine et valine et d'un autre des aminoacides précités ou, sauf dans le cas de la glycine, de deux molécules du même aminoacide, le groupe amide de liaison du dipeptide étant modifié dans l'analogue par remplacement du groupe carbonyle par le groupe divalent — CH2 — et par remplacement de l'atome d'azote par le groupe trivalent

>CH

ou, lorsque le reste d'aminoacide portant le groupe terminal — C du dipeptide est autre que celui de l'hydroxyproline, de la proline, de l'acide pyroglutamique et de la spinacine, par un groupe trivalent

B*C-

(alcoyle inférieur).

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les aminoacides sont choisis parmi les suivants: alanine, arginine, asparagine, acide aspartique 3,5-dibromotyrosine, cystéine, cystine, dopa, glycine, acide glutamique, glutamine, histidine, hydroxylysine, hydroxyproline, 3,5-diiodotyrosine, isoleucine, leucine, lysine, méthionine, Ornithine, phénylalanine, proline, acide pyroglutamique, sérine, spinacine, thréonine, thyroxine, tyrosine et valine, la combinaison valylglycine étant exclue du dipeptide.

2

REVENDICATIONS

3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que les aminoacides sont choisis parmi les suivants: alanine, arginine, asparagine, acide aspartique, cystine, cystéine, glycine, acide glutamique, glutamine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, méthionine, phénylalanine, proline, sérine thréonine, tryptophane, tyrosine et valine.

4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les aminoacides, lorsque ce sont des énantiomorphes, sont de la configuration L.

5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le groupe trivalent qui, dans l'analogue, remplace l'atome d'azote du groupe amide de liaison du dipeptide est le groupe

>CH

6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le reste d'aminoacide portant le groupe terminal C— du dipeptide est celui d'un aminoacide autre que l'hydroxyproline, la proline, l'acide pyroglutamique et la spinacine.

7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le groupe amide de liaison du dipeptide est modifié dans l'analogue par remplacement par un groupe éthylène.

8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'analogue de dipeptide est celui d'un des dipeptides suivants: L-tyrosylglycine, L-phénylalanylglycine, L-prolylglycine, L-leucyl-L-arginine et glycyl-L-leucine ou de l'un de leurs dérivés.

9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'analogue de dipeptide est celui de la L-tyrosylglycine ou de la L-phénylalanylglycine ou un dérivé de ceux-ci.

10. Procédé selon l'une des revendicatinons 1 à 8, caractérisé en ce que le reste d'aminoacide portant le groupe terminal C— du dipeptide est celui de la glycine.

11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le ou les corps réagissant avec l'analogue de dipeptide ou son dérivé sont:

a) un aminoacide de formule R1R2N—X— C02R3, où X est un groupe organique et NR*R2. est ungroupe amino ou un groupe imino lié au groupe X formant un groupe cyclique H&—& — ou un dérivé fonctionnel d'un tel groupe amino ou imino, et COR3 est un groupe carboxyle ou un de ses dérivés fonctionnels, ou b) un peptide comprenant deux ou plusieurs aminoacides identiques ou différents tels que définis liés par des liaisons de peptide.

12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que X est un groupe — CH(R4) — où R4 est un atome d'hydrogène, un groupe organique monovalent ou un groupe organique bivalent lié au groupe RXR2N—.

13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le ou les corps réagissant avec l'analogue de dipeptide ou son dérivé sont un aminoacide pris parmi ceux cités dans la revendication 1 ou un peptide comprenant deux ou plusieurs de ces aminoacides, identiques ou différents, liés par des liaisons de peptide.