WO1996024617A1 - Desaminononapeptide, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zur herstellung von elcatonin - Google Patents

Desaminononapeptide, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zur herstellung von elcatonin Download PDF

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Erich WÜNSCH
Václav C^¿ER^¿OVSKY
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Lonza Ag
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • Desaminononapeptides Process for their preparation and their use for the production of elcatonin
  • the invention relates to new desaminononapeptides of the general formula
  • Elcatonin are known polypeptides that can be used to treat bone loss (DE-PS 2 616 399).
  • the naturally occurring calcitonins such as eel, salmon or human calcitonin are polypeptides which consist of 32 amino acids, the first and seventh amino acids each being L-cysteine and the mercapto groups of which are linked to one another by forming a disulfide bridge.
  • These "natural calcitonins” can be obtained, for example, by extraction from the mammalian thyroid (EP-A 0452 514).
  • Fig. 5 shows a synthesis possibility of "unprotected” desaminononapepitd over partial application of the "solid phase” technique.
  • Figure 6 shows the biological activity of calcitonin derivatives.
  • an amino acid or a peptide that contains a protected ⁇ -amino group and a free carboxyl group is reacted with an amino acid or a peptide that contains a free ⁇ -amino group and a protected terminal carboxyl group by means of well-known condensation reactions in peptide chemistry.
  • the protective groups used in the oligopeptide synthesis represent protective groups which are customary for peptide synthesis (Houben Weyl, Method. Der organ. Chemie, Volume 15 (1-2), Thieme Verlag Stuttgart, 1974).
  • All protective groups based on urethane can be used as the amino protective group, such as an arylalkoxy group such as Z, an aliphatic oxycarbonyl group such as BOC or FMOC.
  • the carboxyl group can be protected by the formation of an amide, an N-substituted hydrazide or by esterification.
  • a carboxyl protecting group is expediently used with a BOC- or Z-substituted hydrazide, Bzl, C 1 -C 4 -alkyl such as Me, tBu, or NB.
  • Bzl or tBu is expediently used as the OH protective group.
  • the condensation reactions are carried out by methods known per se, such as, for example, the azide method, active ester method (ONP or OSU method) or carbodiimide methods (modified), such as the Wünsch-Weygand method, optionally also modified (Houben- Weyl, volume 15 (2), pp. 11 1 - 118, Thieme Verlag Stuttgart ,! 974).
  • the cyclization to the deaminononapeptides according to the invention can be carried out according to condensation methods known per se.
  • the cyclization can be carried out according to a modified DCCD method, according to FIG. 3, the isouronium salt method or according to the azide method.
  • the corresponding protective groups are also split off according to methods known per se.
  • the protective groups can easily be removed by hydrolysis, acidolysis, reduction or hydrazinolysis (Houben Weyl, Method. Der organ. Chemie, Volume 15 (1-2), Thieme Verlag Stuttgart, 1974).
  • Z can be eliminated by catalytic hydrogenation, BOC and C4-alkyl by hydrogen halide in a suitable solvent or by TFA and Me can be eliminated by basic or enzymatic cleavage.
  • a tripeptide of the general formula is first started from Asu, preferably from L-Asu
  • DCCD dicyclohexylcarbodiimide
  • L-2-amino acid (L-amino suberic acid)
  • Lys L-lysine Gin: L-glutamine
  • Trp L-tryptophan
  • a molecular weight (M + H + ) of 900.3 was determined from the mass spectrum.
  • Example IV Synthesis of H-SerrtBu) -Asn-Leu-Ser (tBu) -Thr (tBu) -Asu-Val-Leu-NH-NHBOC (4.8a) and H-Ser (tBu) -Asn-Leu-Ser (tBu) -Thr (tBu) -Asu-Val-Leu-OtBu (4.8h).
  • the peptide product was then treated with HF / m-cresol (9: 1) at 0 ° C. for 1 h in order to split off the peptide product from the solid and the Z and BZL protective groups present. 329 mg of unprotected peptide methyl ester (5.6) were obtained from 900 mg of peptide product solids (5.5).
  • Buffer solution (98 ml citrate buffer, pH 5), L-cysteine (1.135 g), papain (6.87 g) and aniline (22.5 ml) were added and the mixture warmed to 37 ° C. After 2 1/2 days it turned white

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Abstract

Beschrieben werden neue Desaminononapeptide der allgemeinen Formel (I), worin die Carboxyl-Funktion im endständigen Leu und die OH-Funktion von Ser und Thr gegebenenfalls geschützt vorliegen, ein neues Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung für ein Verfahren zur Herstellung von Calcitonin-Derivaten.

Description

Desaminononapeptide. Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung zur Herstellung von Elcatonin Die Erfindung betrifft neue Desaminononapeptide der allgemeinen Formel
O O
II I!
C - Ser - Asn- Leu— Ser - Thr - NH - CH - C Val - Leu— OH 1
I |
CH2 (CH2)3 CH2
worin die Carboxyl-Funktion im endständigen Leu und die OH-Funktion von Ser und Thr ge¬ gebenenfalls geschützt vorliegen, ein neues Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Ver¬ wendung für ein neues Verfahren zur Herstellung von Calcitonin-Derivaten.
Calcitonine bzw. deren Derivate wie z. B. Elcatonin sind bekannte Polypeptide, die zur Be¬ handlung von Knochenschwund eingesetzt werden können (DE-PS 2 616 399). Die natürlich vorkommenden Calcitonine wie beispielsweise Aal-, Lachs- oder Humancalcitonin sind Poly¬ peptide, die aus 32 Aminosäuren bestehen, wobei die erste und die siebte Aminosäure jeweils L-Cystein ist und dessen Mercaptogruppen durch Bildung einer Disulfid-Brücke miteinander verbunden sind. Diese "natürlichen Calcitonine" können beispielsweise durch Extraktion aus der Schildrüse von Säugetieren gewonnen werden (EP-A 0452 514).
Basierend auf der Aminosäuresequenz dieser "natürlichen Calcitonine" wurden mehrere
"synthetische" Calcitonin-Derivate hergestellt, wie beispielsweise Elcatonin
(DE-PS 2 616 399). Im Elcatonin ist die S-S-Brücke des Aal-Calcitonins durch die Dicarba- brücke der 2-Aminokorksäure ersetzt.
Bisher sind mehrere Verfahren zur Herstellung von "synthetischen" Calcitoninen mittels rein chemischen Methoden durch Kondensation der entsprechenden Aminosäuren oder Peptiden bekannt (z. B. DE-PS 2 616 399, EP-A 452 514). Diese Calcitonin-Synthesen wurden bisher durch Fragmentkondensation der Sequenzteilstücke 1-10 und 11-32 erstellt. Die Verknüpfung erfolgte durch Aktivierung am Gly.
Die Gefahr einer Racemisierung ist zwar ausgeschlossen, für die folgende Umsetzung wird aber eine geringere Nukleophilie der α-Aminogruppe (Aminokomponente) in Kauf genommen.
Aufgabe der Erfindung war es, durch Wahl zweier neuer Fragmenteinheiten mit den Sequenzen 1 - 9 und 10 - 32
1. die bessere Nukleophilie der α-Aminogruppe des Glycins auszunutzen und
2. die Möglichkeit einer enzymatischen Verknüpfung herzustellen. Dank der racemisierungsunterdrückenden Methoden wird eine Racemisierung am Carboxylende des Teilstücks 1 - 9 (Leucin) praktisch ausgeschlossen.
Diese Aufgabe wird mit dem Bereitstellen der neuen Desaminononapeptide gemäss Patentan¬ spruch 1, mit einem neuen Verfahren zu deren Herstellung gemäss Patentanspruch 4 oder 5, mit deren Verwendung zur Herstellung von Calcitonin-Derivaten gemäss Patentanspruch 6, sowie mit einem neuen Verfahren zur Herstellung von Calcitonin-Derivaten gemäss Patentan¬ spruch 7 gelöst.
Die erfindungsgemässen Verfahren zur Herstellung der Desaminononapeptide der allgemeinen Formel
O O
C Ser Asn- Leu Ser ■- Thr- NH - CH -C Val - Leu— OH l
CH2 (CH2)3 CH2
worin die Carboxyl-Funktion im endständigen Leu und die OH-Funktion von Ser und Thr ge¬ gebenenfalls geschützt vorliegen, werden derart durchgeführt, dass man entweder
a) ein Oligopeptid der allgemeinen Formel
H Ser - Asn- Leu Ser- Thr Asu - Val — Leu— OH II
worin die OH-Funktion von Ser und Thr sowie die ω-Carboxyl-Funktion von Asu gegebenenfalls geschützt vorliegen und die Carboxylfunktion von endständigem Leu geschützt vorliegt oder
b) ein Oligopeptid der allgemeinen Formel
O O ι I
C -Ser-Asn- Leu- Ser- Thr-OH H2N-CH~C Val "Leu— OH m
CH2 (CH2)3 CH2
worin die OH-Funktion von Thr und Ser gegebenenfalls geschützt vorliegen, die Aminofunktion von Asu ungeschützt sowie die Carboxylfunktion von Leu geschützt vorliegen, cyclisiert. Die Oligopeptide der allgemeinen Formel II und III werden durch klassische Kondensation von Aminosäuren oder von Peptiden aus 2 bis 5 Aminosäuren in der Reihenfolge der entsprechenden Aminosäuresequenz der Formel II oder III synthetisiert.
Fig. 1 zeigt schematisch eine Synthesemöglichkeit für Pentapeptid Z-Ser(tBu)-Asn-Leu-
Ser(tBu)-Thr(tBu)OH (1.9).
Fig. 2 zeigt schematisch eine Synthesemöglichkeit für Pentapeptid BOC-Ser(Bzl)-Asn-Leu-
Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-NHNH2 (2.6).
Fig. 3 und 4 zeigen schematisch zwei Synthesemöglichkeiten für Desaminononapeptid (2,5,6- tert. butylether bzw. -hydrazid) mittels konventioneller Technik.
Fig. 5 zeigt eine Synthesemöglichkeit von "nicht geschütztem" Desaminononapepitd über teilweiser Anwendung der "Solid-Phase"-Technik.
Fig. 6 zeigt die biologische Aktivität von Calcitonin-Derivaten.
Beispielsweise wird eine Aminosäure oder ein Peptid, das eine geschützte α-Aminogruppe und eine freie Carboxylgruppe enthält, mit einer Aminosäure oder einem Peptid, welches eine freie α-Aminogruppe und eine geschützte endständige Carboxylgruppe enthält, mittels allseits bekannter Kondensationsreaktionen der Peptidchemie umgesetzt.
Die bei der Oligopeptid-Synthese verwendeten Schutzgruppen stellen für die Peptidsynthese übliche Schutzgruppen dar (Houben Weyl, Method. der organ. Chemie, Band 15 (1 - 2), Thieme Verlag Stuttgart, 1974).
Als Aminoschutzgruppe können alle Schutzgruppen auf Urethanbasis verwendet werden wie beispielsweise eine Arylalkoxygruppe wie Z, eine aliphatische Oxycarbonylgruppe wie BOC oder FMOC.
Die Carboxylgruppe kann durch Bildung eines Amids, eines N-substituierten Hydrazids oder durch Veresterung geschützt werden. Zweckmässig wird als Carboxyl-Schutzgruppe ein mit BOC- oder Z-substituiertes Hydrazid, Bzl, Cι-C4-Alkyl wie Me, tBu, oder NB angewendet. Die OH-Funktion von Ser und Thr kann gegebenenfalls durch Veresterung oder Veretherung geschützt werden. Zweckmässig wird als OH-Schutzgruppe Bzl oder tBu angewendet. Die Kondensationsreaktionen werden nach an sich bekannten Methoden wie beispielsweise nach der Azid-Methode, Aktivester-Methode (ONP oder OSU-Methode) oder Carbodiimid- Methoden (modifiziert) wie beispielsweise die Wünsch- Weygand-Methode, gegebenenfalls auch modifiziert, durchgeführt (Houben- Weyl, Band 15 (2), S. 11 1 - 118, Thieme Verlag Stuttgart,! 974). Die Cyclisierung zu den erfindungsgemässen Desaminononapeptiden (Formel I) kann nach an sich bekannten Kondensationsmethoden erfolgen. Beispielsweise kann die Cyclisierung nach einer modifizierten DCCD-Methode, gemäss Fig. 3, der Isouroniumsalz-Methode oder gemäss der Azid-Methode durchgeführt werden.
Die Abspaltung der entsprechenden Schutzgruppen erfolgt ebenfalls nach an sich bekannten Methoden. Beispielsweise können die Schutzgruppen durch Hydrolyse, Acidolyse, Reduktion oder Hydrazinolyse leicht entfernt werden (Houben Weyl, Method. der organ. Chemie, Band 15 (1 - 2), Thieme Verlag Stuttgart, 1974). Die Abspaltung von Z kann durch katalytische Hydrierung, von BOC und C4-Alkyl- durch Halogenwasserstoff in einem geeigneten Lösungsmittel oder durch TFA und die Abspaltung von Me durch basische oder enzymatische Spaltung erfolgen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird zunächst ausgehend von Asu, vorzugsweise von L-Asu, ein Tripeptid der allgemeinen Formel
H-Asu-Val-Leu-OH Ha
worin die ω-Carboxylfunktion von Asu und die Carboxylfunktion von Leu geschützt vorliegen mit einem Pentapeptid der allgemeinen Formel
H-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-OH Hb
worin die Aminofunktion von Ser, die OH-Funktion von Ser und Thr geschützt und die Carboxylfunktion von Thr ungeschützt vorliegen, zu einem Oligopeptid der allgemeinen Formel
H-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Asu-Val-Leu-OH IIc worin die Aminofunktion von Ser, die OH-Funktion von Ser und Thr als auch die ω- Carboxylfunktion von Asu und die Carboxylfunktion von Leu geschützt vorliegen, kondensiert.
Nach reduktivem Entfernen der Amino-Schutzgruppe von Ser und der ω-Carboxyl- schutzgruppe von Asu wird dann das Oligopeptid der allgemeinen Formel
H-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Asu-Val-Leu-OH II worin die OH-Funktion von Ser und Thr und die Carboxylfunktion von Leu geschützt vor¬ liegen, erhalten und anschliessend zu den entsprechenden Desaminononapeptiden cyclisiert.
Zweckmässig wird die oben beschriebene Ausführungsform mittels konventioneller Synthese durchgeführt, insbesondere gemäss Fig. 3 oder 4, wobei die Oligopeptide 3.6 bzw. 3.7 oder 4.8a bzw. 4.8b zu den entsprechenden Desaminononapeptiden cyclisiert werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform wird insbesondere ein mittels "solid-phase" synthetisiertes Pentapeptid der allgemeinen Formel
H-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-O-B0 lila
worin die OH-Funktion von Ser und Thr geschützt vorliegen, mit einem durch enzymatische Synthese, aus geschützter (DL)-Asu-OH und einem Dipeptid-Derivat, erhaltenem Tripeptid der allgemeinen Formel
H-Asu-Val-Leu-OH Illb
worin die Aminofunktion von Asu und die Carboxylfunktion von Leu geschützt vorliegen zu einem Oligopeptid der allgemeinen Formel
O Festkörper Q
C Ser Asn Leu— Ser - Thr-O H,N - CH -C — Val — Leu — OH IIIc
I
CH2 — - (CH2)3 CH,
worin die OH-Funktion von Ser und Thr, die Aminofunktion (Asu- Aminofunktion) und die Carboxylfunktion von Leu geschützt vorliegen, umgesetzt. Nach Entfernen der Aminoschutzgruppe von Asu, der OH-Schutzgruppe von Ser und Thr bei gleichzeitiger Abspaltung vom Festkörper wird das Oligopeptid der allgemeinen Formel
O O
C " Ser- Asn- Leu- Ser -Thr- OH H2N-CH -C-Val -Leu— OH III
CH2 (CH2)3 CH2
worin die Carboxylfunktion von Leu geschützt vorliegt, erhalten, welches dann zum entsprechenden Desaminononapeptid-Derivat, worin die Carboxylfunktion von Leu geschützt vorliegt, cyclisiert wird. Insbesondere wird diese Ausführungsform gemäss Fig. 5 durchgeführt. Die derart hergestellten Desaminononapeptide der allgemeinen Forme 1
O O
I' ''
C Ser-Asn- Leu— Ser-Thr-NH -CH — C Val - Leu— OH *
CH2 (CH2)3 CH2
worin die Carboxyl-Funktionen im endständigen Leu und die OH-Funktionen von Ser und Thr gegebenenfalls geschützt vorliegen, sind in der Literatur nicht beschrieben und demnach Bestandteil der Erfindung.
Die bevorzugten Desaminononapeptide gemäss Formel I sind die, in welchen als Carboxyl- Schutzgruppe eine Cι-C4-Alkylgruppe, insbesondere Methyl- oder tert. Butyl-, oder ein N- substituiertes Hydrazid und als OH-Schutzgruppe Bzl- oder tBu angewendet wird. Weitere bevorzugte Desaminononapeptide sind die, in welchen sowohl die Carboxylgruppe als auch die HO-Gruppe ungeschützt vorliegen.
Diese Desaminononapeptide werden erfindungsgemäss zur semisynthetischen Herstellung von Calcitonin-Derivaten der Formel
O O
C Ser Asn— Leu— Ser — Thr— NH — CH — C-Val — Leu— X I
CH, (CH.,3 CH,
worin X ein Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz 10 - 32 von Human-, Lachs-, Schwein, Rind-, Schaf-Calcitonin oder Elcatonin, ist, verwendet. X kann auch noch eine zusätzliche sogenannte 33. Aminosäure aufweisen. Die 33. Aminosäure kann beispielsweise Alanin sein.
Dabei wird z. B. die NH2-Gruppe von Gly, aufgrund guter Nukleophilie, des gegebenenfalls seitenkettengeschützten geschützt vorliegenden Polypeptids X an das Desaminononapeptid der allgemeinen Formel I kondensiert.
Die Kondensation von Polypeptid X an das erfindungsgemässe Desaminononapeptid gemäss Formel I zum Elcatonin gemäss Formel IV kann chemisch nach an sich bekannten Methoden oder enzymatisch durchgeführt werden. Als chemische Kondensations-Methoden können beispielsweise die Carbodiimid / N- Hydroxysuccinimid-, die Mischanhydrid- oder die Azid-Methode auf fachmännisch bekannte Weise angewendet werden. Insbesondere wird die Carbodiimid/N-Hydroxysuccinimid- oder die Azid-Methode verwendet.
Die enzymatische Kondensation wird zweckmässig mittels den Proteasen Chymotrypsin oder Subtilisin bei einer Temperatur von -15 bis +10 °C durchgef hrt. Bei dieser Methode, der sog. reversiblen Proteolyse, wird wie fachmännisch üblich die Esterase- Aktivität der Protease aus¬ genützt. Diese Protease-Aktivität ist unter den Reaktionsbedinungen, die zur Synthese ver¬ wendet werden, höher als die proteolytische Aktivität (Amidase- Aktivität). Vorzugsweise wird die enzymatische Kondensation bei einer Temperatur von -5 bis +5 °C durchgeführt. Als Protease wird vorzugsweise Chymotrypsin verwendet.
Zweckmässig wird die enzymatische Kondensation bei einem pH von 6 bis 10, vorzugsweise von 8 bis 10 durchgeführt.
Als Lösungsmittel kann für die enzymatische Kondensation ein organisches Lösungsmittel- Puffer- oder ein organisches Lösungsmittel-Wasser-Gemisch, vorzugsweise ein organisches Lösungsmittel-Puffer-Gemisch verwendet werden. Als organisches Lösungsmittel-Puffer- Gemisch kann beispielsweise ein Puffer-Dimethylsulfoxid-, Puffer-Dimethylformamid-, Puffer-Acetonitril-, Puffer-Methanol-, Puffer-Ethanol-, Puffer-Propanol-, Puffer-Isopropanol-, Puffer-Trifluorethanol-, Puffer-Glycerin oder Puffer-Acetamid-Gemisch verwendet werden.
Nach einer Umsetzungszeit von 4 bis 10 Stunden kann dann das Elcatonin gemäss Formel IV durch übliche Aufarbeitungsmethoden erhalten werden.
Nach der Kondensation können die gegebenenfalls vorhandenen Seitenkettenschtuzgruppen durch die bereits beschriebenen Methoden abgespalten werden, um die Calcitonine der Formel IV zu erhalten. Die verwendeten Abkürzungen sind:
-OB0: O-Polymer-Träger
Z: Benzyloxycarbonyl-
BOC: Tert. Butoxycarbonyl-
FMOC: Fluorenylmethoxycarbonyl-
OSU: N-Hydroxysuccinimidesier
HOSU: N-Hydroxysuccinimid
HONP 4-Nitrophenyl-
ONP: 4-Nitrophenylester
Bzl: Benzyl-
Me: Methyl-
OMe: Methylester tBu: tert. Butyl-
OtBu: tert. Butylester
OEt: Ethylester
OPr: Propylester
DCCD: Dicyclohexylcarbodiimid
TOS-OH: Toluolsulfonsäure
HOBt: N-Hydroxy-benzotriazol
OBt: (N-Hydroxy-benzotriazol)-ester
TFA-OH: Trifluoressigsäure
TFA: Trifluoracetyl-
ONB: 4-Nitrobenzylester
NB: 4-Nitrobenzyl-
OBZL: Benzylester
HBTU: Benzotriazolyl-tetramethyluronium-herafluoφhosphat
DCHA: Dicyclohexylamin
BOP: Benzotriazol-l-yl-oxy-tris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorit
DIEA: N-Ethyl-diisopropylamin
DIC: N,N'-Diisopropylcarbodiimid
Asu: L-2-Aminokorksäure (engl. L-Amino Suberic Acid)
Val: L-Valin
Leu: L-Leucin
Ser: L-Serin
Asn: L-Asparagin
Thr: L-Threonin
Gly: L-Glycin
Lys: L-Lysin Gin: L-Glutamin
Glu: L-Glutaminsäure
His: L-Histidin
Tyr: L-Tyrosin
Pro: L-Prolin
Arg: L-Arginin
Asp: L-Asparaginsäure
Trp: L-Tryptophan
Ile: L-Isoleucin
Phe: L-Phenylalanin
Die Hydrierungen, Entacylierungen, Carbodiimid-/Azid-, Misch-Anhydrid-Kondensationen wurden analog zum experimentellen Teil gemäss Houben-Weyl, Band 15/1 und 15/2 durchgeführt.
Beispiel I. Synthese von Z-SerftBuVAsn-Leu-SerftBuVThrftBuVOH (1.9)
Beispiele
1.1 , H-SerqBu)-Thr(tBu)-QH (1,4) a) 52,5 g H-Thr(tBu)-OH (Monohydrat) (1.1b) (Houben-Weyl, Band 15/1 und 15/2) in 300 ml IN Natronlauge wurden nach Zugabe von 25 g Natriumhydrogencarbonat und 50 ml Dioxan mit 117 g Z-Ser(tBu)-OSU (1 Ja) üblich umgesetzt und aufgearbeitet. Es wurde ein Öl von Z-Ser(tBu)-Thr(tBu)-OH (1.3) erhalten.
Ausbeute: 124,5 g = 91% d. Theorie.
b) Das erhaltene Öl (124,5 g) wurde in wässrigem Methanol nach Zugabe von 1 ml Essig¬ säure katalytisch hydrogenolysiert, das Filtrat vom Katalysator eingedampft und der Rückstand aus Isopropanol/Diisopropylether umkristallisiert.
Ausbeute: 78 g = 91% d. Theorie (Ausbeute über beide Stufen: 83% d. Theorie). [α]D 20 = +16.59° und [α]5 620 = +19.10° (c = 1 in Methanol). Ein Herstellungsumweg war über Z-Ser(tBu)-Thr(tBu)-OMe (1.3a) aus Z-Ser(tBu)-OH (1.2d) und H-Thr(tBu)-OMe (1.2c) brachte ebenfalls ölig anfallendes (1.3a) und wurde dann üblich mit Natronlauge zu 1.3 verseift. Das erhaltene ölige Material wurde hydro- genolytisch zum Dipeptid (1.4) übergeführt. T.2. Z-Leu-Ser(tBuVThr(tBuVOH fl.5)
77 g H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-OH in 240 ml IN Natronlauge und 300 ml Dioxan + 19 g Natrium- hydrogencarbonat in 100 ml Wasser wurden mit 83 g Z-Leu-OSU (1.4a) üblich umgesetzt (DC-Kontrolle) und aufgearbeitet: Öl, das aus Diisopropylether / Petrolether kristallisierte. Ausbeute: 107 g = 82% d. Theorie. F = 69 -71 °C; [α]D 20 = +6.51° und [α]54620 = +7,70° (c = 1 in Methanol).
1.3. H-Leu-Ser(tBuVThr(tBuVOH (1.6)
103 g Z-Tripeptid (1.5) in 1 1 90% wässrigem Methanol wurden üblich hydrogenolysiert und aufgearbeitet: Öl, das aus Methanol/Ether kristallisierte (mit 1,5 mol Hydratwasser). Ausbeute: 75 g = 69% d. Theorie. [α]D20 = +23,54° und [α]546 20 = +27,82° (c = 1 in Methanol).
1.4. Z-Asn-Leu-Ser(tBuVThr(tBuVOH fl.7)
44.5 g Tripeptid (1.6) in 900 ml Dimethylformamid wurden bei 0 °C nach 2 Stunden bei Raumtemperatur mit 38,7 g Z-Asn-ONP über 24 Stunden umgesetzt (DC-Kontrolle). Nach Entfernen des Dimethylformamids im Vakuum kristallisierte der erhaltene ölige Rückstand, nach Lösen in heissem Essigester und anschliessendem Abkühlen, aus.
Ausbeute: 55 g = 81% d. Theorie; F = 155 °C
[α]D 20 = -10,21° und [α]546 20 = -12,36° (c = 1 in Methanol).
1.5. H-Asn-Leu-Ser(tBuVThr(tBuVOH (1.8)
54 g Z-Tetrapeptid (1.7) in 90% wässrigem Methanol wurden üblich hydrogenolysiert. das Filtrat vom Katalysator im Vakuum engedampft und der Rückstand in Isopropanol heiss ge¬ löst, auf vorsichtige Zugabe von Diisopropylether und Petrolether trat Kristallisation ein. Ausbeute: 42 g = 97% d. Theorie [α]D 20 = -5,47° und [α]54620 = -6,94° (c = 1 in Methanol).
1.6. Z-Ser(tBuVAsn-Leu-Ser(tBuVThr(tBuVOH (1 .9)
54.6 g Tetrapeptid (1.8) in 300 ml Dimethylformamid wurden anfangs bei 0 °C, später nach 2 Stunden bei Raumtemperatur, mit 39,2 g Z-Ser(tBu)-OSU über 24 Stunden umgesetzt.
Als gleichgut erwies sich die Umsetzung des Tetrapeptids in wässriger Natronlauge (1 Äqui¬ valent) in Gegenwart von 8 g Natriumhydrogencarbonat und Zugabe von 50 ml Dioxan.Nach üblicher Aufarbeitung wurde der erhaltene Rückstand aus Isopropanol/Wasser (ca. 1 : 1 ) um¬ kristallisiert und mit Ether gewaschen. Ausbeute: 74 g = 90% d. Theorie; F = 185 - 186 °C [α]D 20 = +4,20° und [α]54620 = +4,68° (c = 1 in Dimethylformamid). Beispiel II) Synthese von BOC-Ser(Bzn-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl-NHNH2) (2.6)
IIJ . BOC-Ser(BzI)-Thr(Bzl)-OBZL (2.3c)
18 g H-Thr(Bzl)-OBZL x 1/2 Oxalat(2.2d) wurden durch Verteilen zwischen Natrium- carbonat-Lösung (7,5 g) und Diethylether zum Aminosäureester freigesetzt; die abgetrennte
Ether-Phase über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Das erhaltene Öl wurde in 150 ml Dimethylformamid aufgenommen und nach Zugabe von 14,8 g BOC-
Ser(Bzl)-OH (2.2c) bei -10 °C mit 10,5 g DCCD üblich umgesetzt und aufgearbeitet. Es wurde ein Öl erhalten.
Ausbeute: 22,6 g = 78,5% d. Theorie.
11.2, H-Ser(Bzl)-Thr(Bzn-OBZL x HC1 (2.4h x HC1)
22,6 g o.g. öliger Dipeptidester (2.3) (Rohprodukt) wurden mit 250 ml eiskalter 4N HC1 in Dioxan übergössen; beim Schütteln trat alsbald Lösung ein. Nach 2 Stunden bei Raumtem¬ peratur wurde das Reaktionsgemisch im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt und mit absol. Ether versetzt: beim Anreiben trat Kristallisation ein, die sich beim Stehen in der Kälte vervollständigte; das abfiltrierte Material wurde mit absol. Ether gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 17,6 g = 70% d. Theorie über beide Stufen. F = 134 - 135 °C.
11.3, BQC-Asn-Leu-QtBu (2,2b)
34,5 g BOC Asn-OH (2Ja) in 1 1 Dimethylformamid wurden mit 21 ml Triethylamin 20,2 g HOBt und 33,5 g H-Leu-OtBu x HC1 (2Jb x HC1) versetzt, die Mischung anschliessend - beginnend bei - 10 °C - mit 31 g DCCD umgesetzt. Nach 24 Stunden (DC-Kontrolle) wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, der Rückstand zwischen Essigester und Wasser ver¬ teilt. Nach üblicher Aufarbeitung wurde der aus der Essigester-Phase erhaltene Rückstand aus Essigester/Petrolether kristallisiert. Ausbeute: 55 g = 91% d. Theorie; F = 138 - 139 °C [α]D 20 = -38,44° und [α]546 20 = -45,66° (c = 1 in Methanol).
11.4, H-Asn-Leu-OH x HC1 ( ,3 x HC1)
53 g BOC-Dipeptid (2.2b) wurden mit 250 ml eiskalten IN HC1 in Essigsäure üblich entacy- liert und die Reaktionsmischung nach beendeter Cθ2-Entwicklung in Vakuum eingeengt.
Nach Zugabe von absol. Ether trat Fällung ein. Der Niederschlag wurde abgesaugt und im
Hochvakuum getrocknet.
Ausbeute: 35 g = 91% d. Theorie
[α]D20 = -10,78° und [α]546 20 = -12,32° (c = 1 in 80%iger Essigsäure). TT.-S- BOC-Ser(Bzl)-Asn-Leu-OH (2.4a)
8,45 g Dipeptid-Hydrochlorid (2.3b) in 100 ml Dimethylformamid wurde nach Zugabe von 4,6 ml Triethylamin mit 12,9 g BOC-Ser(Bzl)-OSU (2.3a) (hergestellt aus 10 g BOC- Ser(Bzl)-OH (2.2a) + 4 g HOSU und 7 g DCCD in Dioxan (nach üblicher Aufarbeitung öliges Rohprodukt) umgesetzt. Nach weitgehender Entfernung von Dimethylformamid im Vakuum wurde in sehr verdünnte HC1 eingerührt, wobei Kristallisation eintrat. Der Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 12,6 g = 80% d. Theorie; F = 185 - 187 °C [α]D20 = -7J2° und [α]546 20 = -8,52° (c = 1 in Dimethylformamid).
11.6. BOC-Ser(Bzl)-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-OBZL (2.5)
10,5 g BOC-Tripeptid (2.4a) und 10,3 g Dipeptidester-Hydrochlorid (2.4b x HC1) in 150 ml
Dimethylformamid wurden nach Zugabe von 2,8 ml Triethylamin und 2,5 g HOSU bei 0 °C mit 4,2 g DCCD umgesetzt. Nach üblicher Aufarbeitung kristallisierte das erhaltene
Rohprodukt - nach Aufnahme in siedendem Acetonitril - in der Kälte.
Ausbeute: 15,1 g = 77% d. Theorie; F = 160 - 162 °C
[α]D20 = -9,07° und [α]5 620 = -11,04° (c = 1 in Dimethylformamid).
11.7. BOC-Ser(Bzl)-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-NHNH2 (2.6)
10,8 g BOC-Pentapeptidester (2.5) in 150 ml Methanol und 50 ml Dimethylformamid (unter gelindem Erwärmen gelöst) wurden nach Abkühlen in Eiswasser mit 24 ml Hydrazin-hydrat (98%ig) versetzt und anschliessend 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das ausgefallene Produkt wurde mit Methanol und Wasser (dem wenig Essigsäure zugesetzt wurde) mehrfach gewaschen und zum Schluss im Hochvakuum getrocknet. Das erhaltene Material wurde sorg¬ fältig mit Acetonitril digeriert (1. Fraktion); die methanolischen Mutterlaugen wurden in Vakuum vom Lösungsmittel weitgehend befreit, nach Zusatz von Wasser trat Fällung ein, die abfiltriert, getrocknet und mit Ether sorgfältig digeriert (2. Fraktion) wurde. Beide Fraktionen wurden im Hochvakuum getrocknet. Ausbeute: 8,2 g = 82% d. Theorie; F = 223 °C (Z) [α]D20 = -6,2° und [α]546 20 = -7,6° (c = 1 in Dimethylformamid). Beispiel III) Synthese von
O P
C — Ser — Asn — Leu — Ser — Thr— NH — CH — C Val— Leu — OMe (3J 1)
CH2 (CH2)3 CH2
mittels konventioneller Synthese
UL I , H-Asw(QBZL)-QH qia)
100 ml absol. Diethylether, abgekühlt auf -50 °C, wurden mit konz. Schwefelsäure (98%ig) versetzt und anschliessend 100 ml frisch-destillierter Benzylalkohol (aldehydfrei) tropfenweise unter Schütteln zugegeben. Der Ether wurde weitgehend im Vakuum abgedampft und zur Reaktionsmischung 19 g H-Asu-OH zugegeben. Das Gemisch wurde unter Schütteln (bis Lösung erfolgt war) insgesamt 5 Stunden unter Erreichen von Raumtemperatur stehengelassen und dann mit 1,5 1 Diisopropylether versetzt. Vom ausgeschiedenen Öl wurde abdekantiert und dieses 3mal mit Diisopropylether nachgewaschen (in der Kälte wurde das Material halbfest). Der Rückstand wurde in 200 ml heissem Isopropanol rasch aufgenommen und die Lösung sofort mit 50 ml Pyridin versetzt. Der bald einsetzende sehr feine Niederschlag wurde in der Kälte vervollständigt, abfiltriert, getrocknet und letzlich aus siedender Essigsäure, nach Zugabe von etwas Wasser umkristallisiert. Ausbeute: 17,2 - 20 g = 64 - 71% d. Theorie; F= 223 °C (Z) [α]D 20 = +18,6° und [α]546 20 = +22,58° (c = 1 in Essigsäure).
Rückgewinnung von L-Asu
Die alkoholische Mutterlauge vom obigen Ansatz wurden eingedampft, der Rückstand in
80%iger Essigsäure aufgenommen, die erhaltene Lösung mit Dowex-44 (Acetat-Form) eine
Stunde lang geschüttelt. Das Filtrat vom Austauscher wurde sofort der katalytischen
Hydrogenolyse unter Palladium unterworfen.
[Verfolgung der Benzylester-Spaltung, vorwiegend H-Asu(OBZL)-OBZL und etwas H-
Asu(OBZL)-OH: CHR n-Butanol / Essigsäure / Wasser 3 : 1 : 1]
Das Filtrat vom Katalysator wurde im Vakuum eingedampft, der Rückstand aus wenig
80%iger Essigsäure umkristallisiert.
Ausbeute: 3g (15,8% d. Theorie)
[α]D20 = +20,75° und [α]546 20 = +25,0° (c = 1 in 6 N HC1) ITI.2. BOC-Asu(OBZL)-OH x DCHA (3.3a x DCHA). H-Val-Leu- Me (3.3h) und 7- Asu(OBZI-Λ-OH x DCHA (3.3c x DCHA)
TTI.2J . BOC-Asu(OBZL)-OH x DCHA (3.3a x DCHA)
1 1,2 g H-Asu(OBZL)-OH (3 Ja) und 8,4 g Natriumcarbonat wurden in 200 ml Tetra- hydrofuran / Wasser 1 : 1 eingerührt. Nach Zugabe von 8,6 g BOC-OSU wurde die Reaktionsmischung 2 Stunden gerührt, das Lösungsmittel durch Zugabe von Wasser auf das Verhältnis 2 : 3 verdünnt, erneut 8,6 g BOC-OSU und 4,2 Natriumcarbonat zugefügt und die Mischung weitere 10 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Neutralisation mit verdünnter Schwefelsäure wurde der Ansatz vom Tetrahydrofuran im Vakuum weitgehend befreit und anschliessend mit Essigsäureethylester extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden üblich gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft, zum Schluss unter Zugabe von wenig Toluol. Der erhaltene ölige Rückstand wurde in wenig Diethylether gelöst und mit 7,3 g DCHA in Diethylether versetzt. Die ätherische Lösung wurde also im Vakuum vom Diethylether befreit, der Rückstand in wenig Diisopropylether aufgenommen und mit viel Petrolether bis zur beginnenden Kristallisation versetzt. Ausbeute: 21 g = 93,5% d. Theorie; F = 102 - 103 °C; [α]D 20 = +9,80° und [α]5 6 20 = +1 1,56° (c = 1 in Methanol).
TII.2.2. H-Val-Leu-OMe x HC1 (3.3h x HC1)
III.2.2J BOC-Val-Leu-OMe (3.2)
18,15 g H-Leu-OMe x HC1 (3 Je) gelöst in Acetonitril wurden mit 14 ml Triethylamin versetzt und nach Abkühlen auf 0 °C wurden 31 ,5 g BOC-Val-OSU (3Jb) zugegeben. Nach
12stündiger Reaktionszeit bei Raumtemperatur wurde der Ansatz im Vakuum eingedampft, der Rückstand sorgfaltig mit sehr verd. Salzsäure und Wasser gewaschen und leztlich aus
Essigester / Diethylether / Petrolether umkristallisiert.
Ausbeute: 30 g = 87% d. Theorie; F = 129 - 130 °C
[ x]D20 = -53,02 ° und [α]54620 = -62,95 ° (c = 1 in Methanol)
III.2.2.2 H-Val-Leu-OMe x HC1 (3.3b x HC1)
52 g BOC-Val-Leu-OMe (3.2) wurden mit 120 ml 2N HC1 / Dioxan Übergossen, die
Reaktionsmischung 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Einengen im Vakuum wurde dies in wenig Methanol aufgenommen, die Lösung in absol. Diethylether eingerührt, die enstandene Fällung abfiltriert und sorgfältig mit absol. Essigester gewaschen und getrocknet.
Ausbeute: 41 g = 97% d. Theorie
[<α]D20 - -6,39 ° und [α]54620 = -6,99 ° (c = 1 in Methanol) IIT.2.3. Z-Asu(OBZD-OH x DCHA (3.3c x DCHA)
1,5 g H-Asu(OBZL)-OH (3 Je) und 1,15 g Natriumcarbonat wurden in 30 ml Tetrahydrofuran / Wasser 1 : 1 gelöst und nach Zugabe von 1 ,4 g Z-OSU bei Raumtemepratur 24 Stunden gerührt. Nach 3 Stunden wurden noch 0,3 g Z-OSU und 0,3 g Natriumcarbonat hinzugefügt. Nach Neutralisation mit IN H2SO4 wurde Tetrahydrofuran im Vakuum abdestilliert und der Rückstand mit Essigsäureethylester extrahiert. Die organische Phase wurde mit IN H2SO4 und Wasser gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde in Diethylether gelöst und mit 1 ,06 ml Dicyclohexylamin versetzt. Nach Zugabe von Petrolether trat Kristallisation ein. Ausbeute: 3,0 g = 94% d. Theorie [α]D 20 = +5,94 (c = 1 in CHCI3)
III.3. BOC-Asu(OBZL)-Val-Leu-OMe (3.4a) und Z-Asu(OBZL)-Val-Leu-OMe (3.4b)
III.3J . BOC-Asu(OBZL)-Val-Leu-OMe (3.4a)
Öliges BOC-Asu(OBZL)-OH (quant. freigesetzt aus 17 g des DCHA-Salzes (3.3a x DCHA) in 1 0 ml Dimethylformamid wurde mit 8,5 g H-Val-Leu-OMe HC1 (3.3b x HC1), 4,2 ml Triethylamin, 3,5 g HOSU und schliesslich bei -5 °C mit 6,2 g DCCD versetzt. Nach 12 Stunden Reaktionszeit unter Erreichen von Raumtemperatur wurde das Dimethylformamid im Vakkum abgezogen, der Rückstand üblich aufgearbeitet. Die Lösung des verbleibenden Öls in Diethylether wurde erschöpfend mit Natriu carbonat-Lösung extrahiert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum eingedampft. Das Öl, das aus Diisopropylether / Petrolether kristallisierte. Nach Umkristallisation aus wenig Essigsäureethylester / Diisopropylether / Petrolether:
Ausbeute: 12 g = 80% d. Theorie (bez. auf umgesetztes Material; aus der Natriumcarbonat- Lösung wurden 3 g BOC-Asu(OBZL)-OH DCHA zurückgewonnen). F = 92 - 93 °C; [α]D 20 = -47,03° und [α]546 20 = -56,03° (c = 1 in Methanol).
III.3.2. Z-Asu(OBZL)-Val-Leu-OMe (3.4b)
Öliges Z-Asu(OBZL)-OH (aus 2,9 g des DCHA-Salzes freigesetzt) in 25 ml Dimethylformamid wurde mit 1,36 g H-Val-Leu-OMe x HC1 (3.3b x HC1) 0,68 ml Triethylamin, 0,56 g HOSU und schliesslich bei -5 °C mit 1,0 g DCCD versetzt. Nach 2 Stunden Rühren bei -5° bis 0 °C und 18 Stunden bei Raumtemperatur wurde der Niederschlag abfiltriert, das Dimethylformamid im Vakuum abgezogen, der Rückstand in Ethylacetat gelöst, mit IN H2SO4 und Wasser gewaschen, getrocknet, Ethylacetat im Vakuum abdestilliert und der Rückstand aus Dissopropylether und Petrolether umkristallisiert. Ausbeute: 2,7 g = 86,5% d. Theorie [α]D20 = .28,09 (c = 1 in CHCI3) ΪTΪ.4. H-ASu(QBZL)-Val-Leu-QMe x HCl (3.5a x HCl) und H-Asu(OH)-Val-Leu-OMe (3.5h)
ΪΪI 4.1 H-Asu(OBZI -Val-Leu-OMe (3.5a x HCl)
1 1 g BOC-Tripeptidester-Derivat (3.4) wurden mit 100 ml eiskalter 3NHC1 /Dioxan übergössen und 3 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Mischung wurde im
Vakuum eingedampft und der Rückstand mit absol. Diethylether verrieben. Das feste Material wurde abfiltriert und im Vakuum über KOH scharf getrocknet.
Ausbeute: 9,6 g = 98% d. Theorie; F = 190 °C;
[cx]D20 = -25,5° und [α]5 6 20 = -30,2° (c = 1 in Methanol).
III .4.2. H-Asu(OH)-Val-Leu-OMe (3.5b)
2,5 g Z-Asu(OBZL)-Val-Leu-OMe in 100 ml 90% Methanol wurde auf Pd/C Katalysator 26 Stunden hydrogenolisiert. Nach 2 Stunden wurden 10 Tropfen von Essigsäure gegeben. Das Filtrat vom Katalysator wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand mit Diethylether ver¬ rieben.
Ausbeute: 1,41 g = 87% d. Theorie [α]D 20 = -28,87 (c = 1 in CH3COOH)
III.5. Z-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu(OBZL)-Val-Leu-OMe (3.6a) und Z-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu(OH)-Val-Leu-OMe (3.6h)
TTI.5.1 . Z-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu(OBZL)-Val-Leu-OMe (3.6a) 8,2 g Z-Pentapeptid-Derivat (1.9) und 5,4 g Tripeptidmethylesterhydrochlorid-Derivat (3.5 x HCl) in 200 ml Dimethylformamid wurden mit 1J g HOSU, 1,6 g Hydroxyoxobenzotriazin und 1,4 ml Triethylamin versetzt und nach Abkühlen der Mischung auf -10 °C wurden 2 g Dimehtylaminopropylethylcarbodiimidhydrochlorid zugefügt. Der Ansatz wurde 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, erneut auf -5 °C abgekühlt, vom Harnstoff-Derivat abfiltriert; das Filtrat Hess man sodann in viel Wasser einfliessen. Das ausgefallene Material wurde abgesaugt und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 10,6 g = 81 % der Theorie.
III.5.2. Z-Ser(tBu)-ASn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu(OH)-Val-Leu-OMe (3.6b) 2,47 g Z-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-OH (1.9) und 0,35 g HOSU in 50 ml Di¬ methylformamid wurden nach Abkühlen auf -10 °C mit 0,62 g DCCD versetzt. Der Ansatz wurde erst 2 Stunden bei -5° bis 0 °C und dann 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, er¬ neut auf 0 °C abgekühlt und vom Harnstoff-Derivat abfiltriert.
Das Filtrat wrude zu der, auf -10 °C abgekühlten Suspension von 1,25 g H-Asu(OH)-Val-Leu- OMe zugegeben und erst 2 Stunden bei -5° bis 0 °C, dann 48 Stunden und nach Zugabe von 10 ml Dimethylformamid noch weitere 36 Stunden bei Raumtemperatur gerührt (die Suspen¬ sion blieb).
Danach wurde etwa 20 ml Dimethylformamid abdestilliert und der Rückstand in 700 ml Wasser und Eis gegossen. Der Niederschlag wrude abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet.
Ausbeute: 3,2 g = 87,4% d. Theorie Nu20 = -17,89 (c = 1 in Dimethylformamid)
III.6. H-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu(OH)-Val-Leu-OMe x HCl (3.7 x HCl) 10 g Z-Oktapeptidmethylester-Derivat (3.6a) in 250 ml Methanol (teilweise Suspension) wurden üblicher katalytischer Hydrierung unterworfen unter gleichzeitiger Titration der freiwerdenden Aminogruppe mit IN HCl / Methanol (Verbrauch: 7,7 ml; es erfolgt hierbei vollständige Lösung). Das Filtrat vom Katalysator wurde im Vakuum weitgehend eingeengt und mit absol. Essigsäureethylester gefällt. Das Produkt wurde abfiltriert und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute: 8,2 g = 93% d. Theorie (ber. für das Di-Hydrat); F = 236 °C (Z) [α]D20 = -10,48° und [αJ54620 = -12,66° (c = 1 in Dimethylformamid).
III ,. Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu-Val-Leu— OMe (3.8)
3,3 g (3 mmol) Oktapeptidmethylester-hydrochlorid (3.7) in 300 ml Dimethylformamid wurden mit 0,59 g HOBt und 1,26 ml Triethylamin versetzt und die erhaltene Mischung zu 1 ,7 g HBTU in 2.2 1 DMF unter Rühren bei Raumtemperatur eingetropft. Nach 72 Stunden Rühren wurde im Vakuum auf ca 100 ml eingeengt und mit 300 ml Wasser und 1,26 ml Triethylamin versetzt. Die gebildete Fällung wurde abfiltriert und sorgfältig mit Wasser und letzlich mit Diethylether gewaschen. Erhalten wurde ein farbloses Pulver. Ausbeute: 2,46 g ( = 77% d. Theorie) F = 257 °C; [α]D 20 = -43,70° und [α]546 20 = -52,72° (c = 1 in Essigsäure).
III.8. Ser(tBu) — Asn— Leu — Ser(tBu) — Thr(tBu) — Asu — Val — Leu — OH (3.9)
93,53 mg Desaminononapeptidester (3.8) wurden in Methanol (1 ml) gelöst, mit 0,2 M Natriumcarbonat-Puffer (pH 9,0; 1 ml) verdünnt und mit Subtilisin (Nagarsi, 0,99 mg) behandelt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h lang gerührt, wobei alle 15 min. Proben für die Chromatographie entnommen wurden. Nach Beendigung der Reaktion (insgesamt ca. nach 15 min.) wurde die Reaktionsmischung durch Zugabe von einer Amberlit CG50 Suspension, in Methanol, neutralisiert. Dann wurde die Suspension mit 2-Propanol (5 ml) verdünnt und das Amberlit nochmals mit 2-Propanol gewaschen. Die vereinigten Lösungen wurden bis zur Trockene im Vakuum eingeengt: Öl Ausbeute 85,6 mg.
III.9. L- Ser(tBu) - Asn - Leu — Ser(tBu) — Thr(tBu) — Asu — Val — Leu — N2H3 (3.10)
107 mg Hydrazinhydrat (0,2 ml) wurde zu einer Lösung von Desaminononapeptidester (3.8) in 2 ml Methanol / Dimethylformamid (3:1) hinzugefügt. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurde das Methanol abgedampft.
Der Rest wurde mit Wasser verdünnt, mit Essigsäure angesäuert und einige Zeit kühl aufbewahrt. Das entstandene Präzipitat wurde abfiltriert und mit Wasser und einer Mischung aus Wasser-Methanol (5:1) gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 69 mg.
IIIJO. Ser — Asn- Leu — Ser — Thr — Asu- Val- -Leu-OMe (3.1 1)
260 mg Desaminononapeptidester (3.8) wurden mit TFA-OH (2 ml) bei Raumtemperatur 60 min lang behandelt. Dann wurde TFA-OH im Vakuum abgedampft, der Rückstand mit Diethylether (trocken) zerrieben aufs Filter gebracht und dann mit Diethylether gewaschen, im Vakuum getrocknet und letztlich aus Methanol / Diethylether (1 : 1 ) rekristallisiert. Ausbeute: 167 mg (= 76% d. Th.)
Aminosäureanalyse: Asp 1,05; Thr 0,96; Ser 1,80; Val 1,04: Leu 2,05; Asu 1,10.
Aus dem Massenspektrum wurde ein Molekulargewicht (M + H+) von 900,3 bestimmt.
Beispiel IV) Synthese von H-SerrtBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu-Val-Leu-NH- NHBOC (4.8a) und H-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu-Val-Leu-OtBu (4.8h).
IVJ . Z-Val-Leu-NHNHBOC (4.3a)
Man Hess 34,8 g Z-Val-OSU (4.2b) und 24,5 g H-Leu-NHNHBOC (4.2a) (Chem. Ber. 98, 803. 1965) in 300 ml Dioxan über Nacht rühren. Nach Abdampfen des Lösungsmittels im Va¬ kuum und üblicher Aufarbeitung (verteilen zwischen Essigester und sehr verdünnter Schwefelsäure; rasche Aufarbeitung erforderlich!) kristallisierte man aus Essigester und wenig Petrolether.
Ausbeute: 42 g = 88% d. Theorie; F = 172 - 173 °C [σ-lD20 = -53,18° und [α]54620 = -63,59° (c = 1 in Ethanol). TV-2. H-Val-Leu-NHNHBOC (4.4a)
41 g Dipeptid-derivat (4.3a) wurden in wässrigem Methanol katalytisch entacyliert, das Katalysator-Filtrat eingedampft und der erhaltene Rückstand aus Diisopropylether kristallisiert.
Ausbeute: 26,4 g = 90% d. Theorie; F = 147 - 149 °C [o.]D20 = -57,96° und [α]546 20 = -69,27° (c = 1 in Ethanol).
IV.3. FMQC-Asu(OBZL)-OH (4,4b)
5,6 H-Asu(OBZL)-OH (4.3b) und 4,25 g Natriumcarbonat wurden in 150 ml Tetrahydro- furan/Wasser unter Rühren weitgehend gelöst und dann 7,2 g FMOC-OSU zugesetzt 1 : 1 mit 7,2 g FMOC-OSU umgesetzt. Man liess 12 Stunden rühren, wobei durch Zugabe von Wasser auf ein Tetrahydrofuran/Wasser- Verhältnis von 1:3 verdünnt wurde. Nach weitgehender Ent¬ fernung des organischen Lösungsmittels im Vakuum wurde mit verdünnter Schwefelsäure angesäuert. Das ausfallende Öl wurde in Essigester aufgenommen, dann die abgetrennte Essigester-Phase üblich gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der erhaltene Rückstand kristallisierte aus Diethylether / Petrolether und wurde aus wenig Essigsäureethylester / Petrolether umkristallisiert. Ausbeute: 9,9 g = 98% d. Theorie; F = 99 - 100 °C; [α]π20 = +14,38° und [α]54620 = +17,04° (c = 1 in Chloroform).
IV.4. FMOC-Asu(OBZL)-Val-Leu NHNHBOC (4.5 )
4,15 g H-Val-Leu-NHNHBOC (4.4a), 6,03 g FMOC-Asu(OBZL)-OH (4.4b) und 1 ,4 g HOSU in 200 ml Dichlormethan wurden bei -10 °C mit 5,25 g DCCD versetzt. Die
Reaktionsmischung wurde nach Rühren auf Raumtemperatur (12 Stunden) vom ausgefallenen
Harnstoff befreit, im Vakuum eingedampft. Man nahm das verbleibende Öl in 50 ml
Dimethylformamid auf und liess unter Rühren in 1 1 Wasser einfliessen. Die Fällung wurde abfiltriert, getrocknet und mit ca. 250 ml Methanol ausgerührt, erneut filtriert und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute: 9,2 g = 93% d. Theorie; F = 165 - 166 °C;
[α]D 20 = -54,08° und [α]546 20 = -64,61° (c = 1 in Methanol).
IV.5. H-Asu(OBZL)-Val-Leu NHNHBOC (4.6a)
7,5 g FMOC-Tripeptid-derivat (4.5a) wurden mit 100 ml Morpholin versetzt, die erhaltene
Lösung 40 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und anschliessend in 1 ,5 1 eiskaltes Wasser eingerührt. Die Fällung wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Das Produkt wurde in Essigsäureethylester aufgenommen, mit Wasser gewaschen, über
Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft, zum Schluss unter Zusatz von Toluol getrocknet (gewogener Kolben).
Ausbeute: 8 g (Rohprodukt, das 1 Äquivalent Fluorenyl-methyl-morpholin enthielt). TV.6. Z-Ser(tBn)-ASn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu(OBZL)-Val-Len-NHNHBOC (4.7a) 8 g Tripeptid-NHNHBOC-Rohprodukt (4.6a) - 1,04 g HOSU, 1,5 g HOBt und 7,45 g Z- Pentapeptid (1.9) wurden in 200 ml Dimethylformamid gelöst und nach Abkühlen auf -10 °C mit 1 ,75 g Ethyldimethylaminopropyl-carbondiimid-hydrochlorid als modifiziertes DCCD umgesetzt.
Man liess 48 Stunden bei Raumtemperatur rühren, wobei die Mischung gallertartig wurde, verflüssigte erneut durch Zusatz von 50 ml Dimethylformamid und liess dann in 1 ,5 1 eiskaltes Wasser, das 2 g Citronensäure enthielt, unter kräftigem Rühren einfliessen. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert, sorgfältig mit Wasser gewaschen und getrocknet, dann wurde das ganze in ca. 50 ml Dimethylformamid aufgenommen und nunmehr in eiskaltes Wasser, das 2 ml Pyridin enthielt, einfliessen gelassen. Der gebildete Niederschlag wurde abgesaugt, sorgfältig mit Wasser und 50%igem Isopropanol gewaschen und zum Schluss im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 10,5 g = 83% d. Theorie. F = 255 °C [ct.D20 = -12,34° und [α]546 20 = 15,1° ° (c = 1 in Dimethylformamid).
ΪV.7. H-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu-Val-Leu-NHNHBOC x HCl. (4.8a) 8,5 g Z-Oktapeptid-NHNHBOC (4.7a) in 300 ml 95%igem Methanol wurden üblich kataly- tisch hydriert (zum Abfangen der gebildeten Aminofunktion unter Zutropfen von 1 N HCl / Methanol, pH 5). Das Filtrat vom Katalysator wurde im Vakuum weitgehend eingedampft und der Rückstand mit Diethylether behandelt, das festgewordene Material abfiltriert, sorgfältig mit Ether gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 6,86 g = 94% d. Theorie, F = 234 °C (Z) [α]D 20 = -28,22° und [α]546 20 = -34,09° ° (c = 1 in Essigsäure).
IV.8. Z-Val-Leu-OtBu (4.3c)
22,5 g H-Leu-OtBu HCl (4.2c HCl) in 150 ml Dimethylformamid wurden mit 14 ml Triethylamin bei -5 °C mit 34,8g Z-Val-OSU (4.2d) üblich umgesetzt und die Reaktions¬ mischung üblich aufgearbeitet. Durch Umkristallisieren aus Diethylether/ Petrolether wurden Kristalle erhalten.
Ausbeute: 39 g = 92,5% d. Theorie; F = 65 - 67 °C [α]D 20 = -47,8° und [α]54620 = -56,83° (c = 1 in Methanol).
IV.9. H-Val-Leu-OtBu x HCl (4.4c x HCl)
18 g Z-Dipeptid (4.3c) in 500 ml Methanol wurden üblich hydriert unter gleichzeitiger titrimetrischer Neutralisation mit IN methanolischer HCl (43 ml). Das Filtrat wurde im
Vakuum eingedampft. Der Rückstand kristallisierte aus Essigester / Hexan / Petroläther.
Ausbeute: 13,4 g = 97% d. Theorie; F = 184 - 185 °C
[α]D 20 = -16,89° und [α]546 20 = -19,72° (c = 1 in Methanol). IV.10. FMOC-Asu(OBZL)-Val-Leu-OtBu (4.5h)
5,02 g FMOC-Asu(OBZL)-OH (4.4b) und 3,25 H-Val-Leu-OtBu x HCl (4.4c x HCl) in 150 ml Dichlormethan wurden mit 1,4 ml Triethylamin und dann bei -10 °C mit 2J g DCCD versetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 24 Stunden gerührt. Das Filtrat vom Harnstoff wurde im Vakuum eingedampft und üblich aufgearbeitet. Der Rückstand wurde in wenig Essigsäureethylester aufgenommen und mit Diethylether / Petrolether versetzt: voluminöse Fällung; wurde abfiltriert und im Hochvakuum getrocknet. Ausbeute: 8J5 g = 98% d. Theorie, F = 143 - 144 °C; [α]D 20 = -44,29° und [α]546 20 = -52,95° (c = 1 in Methanol).
IV, 11 , H-Asu(OBZL)-Val-Leu-QtBu (4.6b)
5,93 g FMOC-Tripeptid-tert-Butylester (4.5b) wurden in 50 ml Morpholin gelöst. Man liess die Mischung 40 Minuten bei Raumtemperatur rühren und anschliessend in 1 1 eiskaltes
Wasser einfliessen. Die Fällung wurde abfiltriert, mit Wasser neutral gewaschen und in
Essigsäureethylester / Methyl-tert-Butylether aufgenommen. Man wusch die erhaltene Lösung mit Wasser, trocknete über Natriumsulfat und dampfte im Vakuum, zum Schluss unter
Zugabe von Toluol, zur Trockene ein.
Ausbeute: 6,4 g (Mischung aus Tripeptidester und N-Fluorenyl-methyl-morpholin; theoretische Ausbeute; 6,26 g).
IVJ 2. Z-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu(OBZL)-Val-Leu-OtBu (4.7h) 6,4 g Tripeptid-OtBu-Rohprodukt (4.6b) - 1,15 g HOSU, 1,63 g HOBt und 6,58 g Z- Pentapeptid (1.9) wurden in 150 ml Dimethylformamid gelöst, die Mischung bei -10 °C mit 1 ,53 g Ethyl-dimethylaminopropyl-carbodiimid-hydrochlorid als modifiziertes DCCD umgesetzt. Nach 24 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde der gallertartige Ansatz durch Zugabe von 50 ml Dimethylformamid wieder verflüssigt und dann in 1,5 1 eiskaltes Wasser, das 2 ml IN Schwefelsäure enthielt, eingegossen. Die Fällung wurde abfiltriert, sorgfaltig mit Wasser und Ether gewaschen und getrocknet. Das erhaltene Produkt wurde wiederum in 50 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung in 1,5 1 eiskaltes Wasser, das 2 g Natriumcarbonat enthielt, eingerührt. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser und letztlich 50%igem Isopropanol sorgfaltig gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 7,85 g = 72% d. Theorie, F = 243 °C [α]D 20 = -28,70° und [α]5 6 20 = -34,73° (c = 1 in Essigsäure).
IVJ 3. H-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu-Val-Leu-OtBu (4.8b) 7 g Z-Oktapeptid-tert-butylester (4.7b) in 250 ml Methanol wurden üblich katalytisch hydriert (Titration der frei werdenden Aminofunktion mit IN HCl / MeOH bei pH 5; zum Schluss auf pH 4,5). Das Filtrat vom Katalysator wurde im Vakuum eingeengt, der Rückstand mit Diethylether sorgfältig verrieben, abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 5,4 g = 92% d. Theorie, F = 230 °C [α]D20 = -24,61° und [α]54620 = -29,75° (c = 1 in Essigsäure).
Beispiel V) Synthese von
O O
! i li
C Ser Asn ™ Leu - Ser ~ Thr -NH — CH-C — Val — Leu — OMe 5.7
I
CH2 (CH2)3 CH2
unter Verwendung der "Solid Phase"-Technik
V.1 . BOC-Thr(Bzl)-O-B0 (5.2)
Das nach "Merrifield"-chlormethylierte Polystyrol als Festkörper wurde auf 60 °C mit 1,5
Aequivalenten BOC-Thr(Bzl)-OH (5J) und 0,75 Aequivalenten Kaliumcarbonat 5 h lang in
Dimethylformamid, Wasser und Methanol gewaschen und dann getrocknet. Die
Aminosäuresubstitution wurde mittels "Pikrin-Test" bestimmt. Von 4,06 g chlormethyliertem
Festkörper (1,4 mmol Chlor/g) wurden 5,48 g BOC-Thr(Bzl)-O-B0 mit 1,1 mmol Thr/g erhalten.
V.2. H-Ser(Bzl)-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-O-B0 (5.3)
Für die Synthese dieses Pentapeptids wurden die Aminosäuren Ser, Leu, Asn, Ser in der angegebenen Reihenfolge an H-Thr(Bzl)-O-B0 synthetisiert. Die einzelnen Schritte wurden wie folgt durchgeführt:
Zuerst wurde das Produkt (5.2) mit TFA-OH wie üblich entacyliert. Das gebildete amino freie Festkörperprodukt wurde wie üblich stufenweise in Sequenzfolge mit den Aminosäure¬ derivaten BOC-Ser(Bzl)-OH, BOC-Leu-OH, BOC-Asn-OH und letztlich BOC-Ser(Bzl)-OH nach der HOBt-aktiv-Ester-Methode umgesetzt.
Insgesamt wurden ausgehend von 0,91 g (1 mmol) BOC-Thr(Bzl)-O-B0 1,24 g H-Ser(Bzl)- Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-O-B0, entsprechend einer Ausbeute von 89% erhalten. Die Gehaltsbestimmung erfolgte gemäss Pikrintest.
__ 5.5
Figure imgf000025_0001
0,71 g (0,5 mmol) Pentapeptid (5.3), gebunden am Festkörper, wurden mit 412 mg (0,75 mmol) Z-Asu-Val-Leu-OMe (5.4), erhalten nach Beispiel VIII), 333 mg BOP oder DIC, 101 mg HOBt und 260 μl DIEA in 7 ml Dimethylformamid für 15 h gerührt. Die Ausbeute an entsprechendem Peptid-Produkt (5.5) 0,95 g.
Anschliessend wurde das Peptid-Produkt mit HF/m-Kresol (9:1) bei 0 °C, 1 h lang, behandelt, um das Peptid-Produkt vom Festkörper und die vorhandenen Z und BZL-Schutzgruppen abzuspalten. Von 900 mg Peptid-Produkt-Festkörper (5.5) wurden 329 mg ungeschützter Peptid-Methylester (5.6) erhalten.
V.4 o o
C Ser - Asn Leu Ser Thr NH — CH ~C — Val — Leu — OMe 5.7
I
CH2 (CH2)3 CH2
Zu einer Lösung von 200 mg Peptid-Methylester (5.6) in Dimethylformamid wurde innerhalb 8 h eine Lösung von 45 mg HOBt, 124 mg O-benzotriazol-l-yl-N,N,N'N'-tetramethyl- uroniumhexafluorphosphat und 72 μl Triethylamin in 180 ml Dimethylformamid hinzuge¬ geben. Nach nochmaligem Rühren (12 h) wurde Dimethylformamid eingeengt und das Roh¬ produkt mit Wasser präzipitiert. Das Material wurde 2 h mit Ethylacetat behandelt, abfitriert und getrocknet.
Ausbeute 92 mg (HPLC-Gehalt 95.5%), Aminosäureanalyse (1 10 °C. 20 h), Asp 1 J0; Ser 1 ,99; Thr 0,93, Val 0,99, Leu 1 ,99. Aus dem Massenspektrum wurde ein Molekulargewicht (M+H+) von 900,7 bestimmt.
Beispiel VI) Enzymatische Kondensation des Polvpeptids X an das Desaminononapeptid (Formel I)
VIJ . Herstellung von Elcatonin
Zu einer Lösung von dem Polypeptid X(a) der Formel H-Gly- Lys- Leu- Ser- Gin- Glu- Leu- His- Lys- Leu- Gin- Thr- Tyr- Pro- Arg- Thr- Asp- Val- Gly- Ala- Gly- Thr- Pro-NH2 (10 mg) in 0,2 M Natrium-Veronal-Puffer (pH 9, 1,2 ml) wurde eine Lösung von Desaminonona- peptid-Methylester (3.9) in Dimethylsulfoxid (0,8 ml) hinzugefügt und die Mischung bei 0 °C gerührt. Nach Zugabe einer Lösung von α-Chymotrypsin (0,04 mg) in 0,01 M CaCl2 (2 μl) wurde das ganze 3 Stunden lang bei 0 °C gerührt. Der Reaktionsverlauf wurde mittels HPLC verfolgt. Nach vollständiger Umsetzung des Desaminononapeptids wurde 1 % wässrige Trifluoressigsäure (0,4 ml) hinzugefügt und dann wurde Elcatonin und nicht umgesetztes Polypeptid obiger Formel mittels präparativer HPLC isoliert. Insgesamt wurden 1 ,6 mg Elcatonin, isoliert als Elcatonin-trifluoracetat, erhalten und 4,6 mg des Polypeptids X(a) obiger Formel zurückgewonnen. Beide waren gemäss HPLC oder Hochspannungs-Papier- Elektrophorese homogen. Aminosäure-Analyse von Elcatonin:
Asp 2,1 1 ; Thr 3,93; Ser 2,76; Glu 3,07; Pro 1,85; Gly 3,07; Ala 1,56; Val 1,98; Asu 1,04; Leu 4,81 ; Tyr 0,96; Lys 2,00; His 0,99; Arg 0,88.
Beispiel VII) Herstellung von geschätzten Elcatonin-Derivaten
VIIJ . Chemische Kondensation des Polvpeptids X an das Desaminononapeptid (Formel T)
a) mittels Aktivester-Methode
5,08 mg geschütztes Desaminononapeptid (3.8) aus Beispiel III.7. wurden in Dimethyl- amino-propyl-ethylcarbodiimid-hydrochlorid (1,24 mg) und HOSU (4J7 mg), bei 20 °C, in Dimethylformamid (50 μl) (Totalvolumen 2 ml) gelöst. Nach 30 min. wurde eine Suspension des Polypeptids X(b) (14,26 mg, 11,18 Di-Z-geschütztes Polypeptid X(b)) in Dimethylformamid (150 μl) und Trifluorethanol (50 μl) hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde 24 h lang gerührt. Der Reaktionsverlauf wurde mittels HPLC verfolgt. Nach 24stündiger Reaktion wurden die Lösungsmittel im Vakuum eingedampft und der Rückstand in 30% Acetonitril, in 0,05 M Magnesiumperchlorat-Puffer (Verhältnis 30:70), gelöst und mittels präparativer HPLC (Vydac C18-Säule) separiert. Das Produkt (Hauptpeak) wurde isoliert und das Eluat im Vakuum eingeengt, wie üblich aufgearbeitet und lyophilisiert.
b) mittels Azid-Methode
10,7 mg geschütztes Desaminononapeptid-Hydrazid (erhalten aus geschütztem Desaminononapeptid 3.8 (Beispiel III.7.) analog zu Beispiel III.9.) wurden in Dimethylformamid (0,25 ml) gelöst, die Mischung wurde mit -60 °C abgekühlt und dann wurde 3,5 M HCl in Dioxan (0,02 ml) und n-Butylnitrit (2 ml) hinzugefügt. Die Lösung wurde innerhalb von 5 min. auf -10 °C erwärmt, die Temperatur wurde weitere 10 min. bei dieser Temperatur gehalten und dann innerhalb von 5 min. auf -40 °C abgekühlt. Anschliessend wurde Polypeptid X(b) (20 mg) hinzugefügt. Der pH- Wert der Mischung wurde auf pH 9,0 mit Diisopropylethylamin gestellt. Die Reaktionsmischung wurde 30 min. lang bei -20 °C gehalten, über Nacht bei 0 °C und dann das ganze zur Trockne eingedampft. Das Produkt wurde mit 0JN HCl zerrieben, gekühlt, abgefiltert und dann mit Wasser gewaschen. Das Rohprodukt wurde mittels HPLC (Vydac 218TP510 Säule) mittels einem Gradienten von 60 - 100% Methanol / 0,05% Trifluoressigsäure innerhalb 80 min. eluiert und dann lyophilisiert.
VI1.2. Chemische Kondensation des Polvpeptids X(c) der Formel H-Glv-Thr-Tvr-Thr-Gln- Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lvs(BOC)-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Glv-Val-Glv-Ala-Pro- H^ (15-tert. Butyl-. 18-tert. butyloxycarbonyl-humancalcitonin-(10 - 32) an das Desaminononapeptid (Formel I)
43 mg geschütztes Desaminononapeptid (3.9) wurden in 1 ml Acetonitril mit HOSU (7,6 mg) und DCCD (7,2 mg) bei 0 °C gerührt. Nach 75 min. wurde Dimethylformamid (0,5 ml) hinzugegeben, wobei die leicht trübe Lösung klar wurde. Das Hydrochlorid des Polypeptids X(c) Humanes Calcitonin (HC 10-32; 15-tert. butyl, 18-tert. butyloxycarbonyl-Derivats 86 mg wurde zusammen mit einer weiteren Portion HOSU (7,6 mg), und HOBt (5 mg) und Methyl- diisopropylamin (12 ul) in 1 ml Dimethylformamid gelöst und dann zur ersten Lösung hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 5 h bei 0 °C gerührt, dann weitere 12 h bei 20 °C. Dann wurde eine weitere Portion von geschütztem Desaminononapeptid (22 mg) obiger Formel, DCCD (5,2 mg) und Methyl-diisopropylamin (12 ul) hinzugefügt und unter HPLC- Kontrolle gerührt. Nach 4 Tagen war alles HC 10-32-Derivat verbraucht. Dimethylformamid wurde bei 20 ° C im Vakuum abgedampft und der Rest 2mal mit Wasser zerrieben. Der ungelöste Teil wurde abzentrifugiert und das Produkt mit 60% wässrigem Acetonitril zerrieben. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum verdampft, der Rest in 6 ml Dimethylformamid gelöst und dann durch eine präparative "reverse phase"- Säule, äquilibriert mit Acetonitril -Wasser-System, enthaltend 0,05% Trifluoressigsäure separiert. Die vereinigten Eluate des Hauptpeaks wurden im Vakuum eingeengt und dann lyophilisiert. Es wurden 13,8 mg Produkt l-Desamino-2-Ser-8-Val-dicarba-Human-Calcitonin-2,5,6J5-tetra- tert. Butyl- 18-tert. Butyloxycarbonyl-Dervat erhalten. Durch Aminosäure-Analyse wurde bestätigt, dass das Produkt alle Aminosäuren enthielt. Aus dem Massenspektrum wurde ein Molekulargewicht (M + H )+ von 3691,5 bestimmt.
Beispiel VIII) Biologische Aktivität von Elcatonin und vom Dicarha-Analogon des
Laehs-Cgleitonins
Die biologische Aktivität vom Carba-Analogon des Aal-Calcitonins (Elcatonin) und des Lachs-Calcitonins (hergestellt durch enzymatische Kondensation von Polypeptid X(d) der Formel H-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr- Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 mit dem Desaminononapeptid -Methylester (3.9) analog zu Beispiel VIIJ .) wurden anhand der Fähigkeiten gemessen, die Calcium-Konzentration im Serum von Ratten zu verringern. Hierzu wurde den Ratten (Wistar mit einem Gewicht von ca. 70 g) nach 24stündigem Fasten 3 verschiedene Konzentrationen (11,33 und 100 ng / Tier) subcutan injiziert. Der Zeitraum zwischen Injektion und Blutentnahme betrug ca. 1 h. Der Inhalt der Ampullen wurde mit Essigsäure (pH 4,4) und mit 0,1% Albumin als Protein-Carrier versetzt. Blut wurde vom Herzen unter Anästhesie mit Halotan entnommen.Der Calcium-Gehalt im Blut wurde kolorimetrisch bestimmt. Die Resultate wurden statistisch gemäss Zanelli et al., ("Bone and Mineral", 11, 1990) ausgewertet.
Die "Log dose / reponse" -Kurve ist in Fig. 2 dargestellt. Wie ersichtlich, besitzt das Carba- Analogon vom Lachs die höchste biologische Aktivität.
Der biologische Test wurde bestätigt, indem das Carba-Analogon des Aal-Calcitonins (Elcatonin) von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) bezogen wurde. Wurde diese Präparation als Standard angewandt, wurde eine spezifische Aktivität von 5721 / U / mg bestimmt, welche bestätigte, dass Elcatonin, hergestellt nach dem erfindungsgemässen Verfahren und WHO-Elcatonin, dieselbe biologische Aktivität besitzen.
Beispiel IX) Herstellung von Z-Asu-Val-Leu-OMe durch enzymatische Kondensation mittels Thermolvsin
IX.1 Herstellung von Z-Asu-Val-Leu-OMe (5.4)
Zu einer Lösung von Z-DL-Asu-OH (1,62 g, 5 mmol) in einer Mischung von 1 M NaOH (8,5 ml) und Wasser (1,5 ml), wurde H-Val-Leu-OMe x HCl (0,85 g, 3 mmol) zugegeben. Nach
Hinzufügen von CaCl2 x 2 H2O (10 mg) und Thermolysin (20 mg) wurde das Ganze bei
Raumtemperatur 24 h lang gerührt. Dabei fiel das Peptid-Produkt aus. Um die Präzipitation zu vervollständigen wurde 1 M HCl hinzugefügt und dann das Präzipitat mit 1 M HCl und
Wasser gewaschen. Das Produkt wurde in Ethylacetat gelöst und mit einer Lösung aus 0,5 M
Natriumacetat- Puffer (pH 6,0) und Wasser gewaschen. Nach Trocknen mit Natriumsulfat und
Einengen wurde der Rest aus Ethylacetat/Petrolether auskristallisiert.
Ausbeute: 1,14 g (= 83 d. Th.)
Sch p.: 153 - 154 °C
Für C28H43N3O8 (549,7) wurden kalkuliert: 61,8% C, 7,89% H, 7,64% N; gefunden: 61,30% C, 8,04% H, 7,71% N.
[α]D -50,3° (c: 0,48, Methanol)
Aus dem Massenspektrum wurde ein Molekulargewicht (M+H)+ von 550,6 bestimmt. Beispiel X) Synthese von L-Asu
X.1. Synthese von Z-Asu-OH
D, L-Aminokorksäure (40,27 g; 212,4 mol) und 2N NaOH wurden bei 0 °C vorgelegt. Dann wurde Z-Chlorid und 4N NaOH während ca 45 Min. dazugegeben und das ganze ca. 30 Min. bei Raumtemperatur nachrühren gelassen. Anschliessend wurde mit Diethylether (200 ml) extrahiert. Die wässrige Phase wurde mit IN HCl auf pH 3 gestellt und über Nacht gerührt. Der zu Klumpenbildung neigende Feststoff wurde zerkleinert, filtriert und nach Trocknung im Vakuum erhielt man: 43,52 g kristallisiertes Material (Rohprodukt).
Zur Umkristallisation von 43,52 g Rohprodukt wurde dieses in 200 ml Essigester zum Rückfluss erhitzt, das nicht gelöste Produkt abgenutscht, zur Lösung 700 ml Hexan hinzugegeben. Diese ausgefallene N-Z-Aminokorksäure wurde abfiltriert und über Nacht im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 32,35 g (F = ca. 1 18°C)
X.2. Racematspaltung von Z-(DL)-Aminokorksäure
Zur 39,5 g (121,4 mmol) N-Z-Aminokorksäure wurde IN NaOH (124,5 ml) hinzugegeben
(Die N-Z-Aminokorksäure löste sich nicht vollständig). Dann wurden H2O (98 ml),
Pufferlösung (98 ml Citratpuffer, pH 5), L-Cystein (1,135 g), Papain (6,87 g) und Anilin (22,5 ml) dazugegeben und das Gemisch auf 37 °C erwärmt. Nach 2 1/2 Tagen wurde das weisse
Gemisch abfiltriert. Zum Rohprodukt wurde Essigsäureethylester (600 ml) bei 70 °C hinzgegeben.
Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde IN HCl (100 ml) hinzugefügt wobei zwei Phasen entstanden. Der noch vorhandene Feststoff wurde abfiltriert. Dann wurde noch 2mal mit IN
HCl (200 ml) und lmal mit H2O (400ml) extrahiert. Danach wurde die organische Phase mit
MgSÜ4 getrocknet und eingeengt.
Man erhielt 19,12 g rohes Z-L-Asu-anilid.
X.3. Synthese von L-Aminokorksäure
Obiges Rohprodukt wurde mit 6N HCl bei Raumtemperatur übergössen und zum Rückfluss erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht stehengelassen und nochmals zum Rückfluss erhitzt, wobei alles in Lösung ging. Nach 2 Stunden wurde Aktivkohle dazugegeben, nach ca. 30 Min. zum Rückfluss erhitzt, abfiltriert und im Vakuum eingedampft. Die Lösung des gelben Rückstands in H2O wurde mit Diethylether gewaschen, die abgenom¬ mene wässrige Phase mit konz. NH3 auf pH3 gestellt. Die gebildete Suspension wurde gekühlt, letztlich das ausgefallene Produkt abfiltriert und im Hochvakuum getrocknet. Nach Umkristallisieren aus Essigsäure / H2O (2mal):Ausbeute: 6,83 (= 75,2% d. Th.) [α]D 20 = +20,6 ±1 ° [α]54o20 = +24,8 (c = 1 in 6 N HCl)

Claims

Patentansprüche:
1. Desaminononapeptide der allgemeinen Formel
O O ιj il
C Ser Asn Leu Ser Thr-NH-CH C Val- Leu— OH l
CH2 (CH2)3 CH2
worin die Carboxyl-Funktion im endständigen Leu und die OH-Funktion von Ser und Thr gegebenenfalls geschützt vorliegen.
2. Desaminononapeptide nach Patentanspruch 1, worin als Carboxyl-Schutzgruppe eine C] -C4-Alkylgruppe oder ein N -substituiertes Hydrazid angewendet wird.
3. Desaminononapeptide nach Anspruch 1, worin die Carboxyl-Funktion im endständigen Leu und die OH-Funktion von Ser und Thr ungeschützt vorliegen.
4. Desaminononapeptide nach Patentanspruch 1 worin als OH-Schutzgruppe eine Benzyl- oder tert. Butylgruppe angewendet wird.
5. Verfahren zur Herstellung von Desaminononapeptiden der allgemeinen Formel I gemäss Patentanspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass man ein Oligopeptid der allgemeinen Formel
H Ser Asn- Leu- Ser- Thr- Asu - Val Leu— OH II
worin die OH-Funktion von Thr und Ser, die ω-Carboxyl-Funktion von Asu gege¬ benenfalls geschützt vorliegen und die Carboxylfunktion von endständigem Leu geschützt vorliegt, cyclisiert.
6. Verfahren zur Herstellung von Desaminononapeptiden der allgemeinen Formel I gemäss Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass man ein Oligopeptid der allgemeinen Formel
O O
C - Ser - Asn -Leu- Ser -Thr- OH H,N~CH-C Val Leu— OH III
CH2- (CH2)3 CH2 worin die OH-Funktion von Thr und Ser gegebenenfalls geschützt vorliegen, die Aminofunktion von Asu ungeschützt sowie die Carboxylfunktion von Leu geschützt vorliegen, cyclisiert.
7. Verwendung der Desaminononapeptide der allgemeinen Formel I gemäss Patentanspruch 1 zur Herstellung von Calcitonin-Derivaten.
8. Verfahren zur Herstellung von Calcitonin-Derivaten der Formel
O i
C- Ser— Asn — Leu— Ser — Thr— NH-CH-C — Val— Leu— X IV
I
CH2 (CH2)3 CH2
worin X ein Polypeptid, bestehend aus der Aminsäuresequenz 10 - 32 von Human-, Lachs-, Schwein-, Rind-, Schaf-Calcitonin oder Elcatonin, ist, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Desaminononapeptid der allgemeinen Formel I gemäss Patentanspruch 1 an die NH2-Gruppe eines Polypeptids X, welches gegebenenfalls seitenkettengeschützt vorliegt, kondensiert
9. Verfahren nach Patentanspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kondensation chemisch oder enzymatisch durchfuhrt.
10. Verfahren nach Patentanspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kondensation enzymatisch mittels Chymotrypsin oder Subtilisin bei einer Temperatur von -5 bis +5 °C durchführt.
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