CN110698557B - Acth突变体、重组蛋白及其应用，以及含有该acth重组蛋白的试剂盒 - Google Patents

Acth突变体、重组蛋白及其应用，以及含有该acth重组蛋白的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及ACTH重组蛋白及其应用，以及含有该ACTH重组蛋白的试剂盒。本发明涉及采用合成/体外表达系统(包括重组)等技术获得ACTH多肽或融合蛋白，并作为ACTH体外诊断试剂盒的标准品或某一组成成分来使用。对人ACTH的氨基酸进行体外合成或选择人ACTH氨基酸对应编码的核酸序列进行重组表达，在制备之前将ACTH对应的氨基酸序列中的KKRR(四处氨基酸是否同时突变，均包含在其中)进行突变(K变为非K，R的氨基酸；R变为非R，K的氨基酸)的设计，突变之后在ACTH免疫检测试剂中其ACTH的稳定性得到明显的提高。

Description

ACTH突变体、重组蛋白及其应用，以及含有该ACTH重组蛋白的 试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及ACTH突变体、重组蛋白及其应用，以及含有该ACTH重组蛋白的试剂盒。
背景技术
促肾上腺皮质激素缩写为ACTH，是由脑垂前叶分泌的激素。它具有刺激肾上腺皮质发育和机能的作用，主要作用于肾上腺皮质束状带，刺激糖皮质类固醇的分泌。由体外注射过量的皮质激素时，ACTH的分泌会受到抑制，肾上腺皮质发生萎缩，这被认为是引起“应激”状态所不可缺少的。ACTH还具有通过肾上腺皮质来调节抗体生成作用，与生长素起相反的作用。
ACTH的分泌过程是脉冲式的和应变的，释放的频率和幅度与昼夜交替节律性相关。总的趋势是清晨觉醒之前血液中ACTH水平出现高峰，半夜熟睡时则为低潮。应激情况下，如烧伤、损伤、中毒，以及遇到攻击使全身作出警戒性反应时，ACTH的分泌都增加，随即激发肾上腺皮质激素的释放，增进抵抗力。医学上可用于抗炎症、抗过敏等。
使用小肽(体外合成/合成肽)或重组抗原作为ACTH体外诊断试剂盒的组成成分已很常见，但是如何提高小肽(体外合成/合成肽)或某些蛋白的稳定性一直是困扰试剂和开发人员的难题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种ACTH突变体、重组蛋白及其应用，以及含有该ACTH重组蛋白的试剂盒。该ACTH重组蛋白的稳定性得到明显的提高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了ACTH突变体，如SEQ ID No.1所示的ACTH氨基酸序列的第15～18位氨基酸KKRR中的一个或多个氨基酸突变为非K和/或非R的氨基酸。
其中，ACTH(促肾上腺皮质激素)的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，ACTH(促肾上腺皮质激素)的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。表达了融合蛋白的ACTH的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，表达了融合蛋白的ACTH的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
在本发明的一些具体实施方案中，所述的ACTH突变体具有：
(Ⅰ)、如SEQ ID No.5所示的氨基酸序列；或
(Ⅱ)、如(Ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或
(III)、如(Ⅰ)所述的氨基酸序列的修饰变体，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或
(IV)与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(III)所述氨基酸序列至少有80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列。
在上述研究的基础上，本发明还提供了重组蛋白，包括所述的ACTH突变体和融合蛋白。在本发明的一些具体实施方案中，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，所述重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
本发明还提供了所述ACTH突变体或所述的重组蛋白在制备ACTH检测试剂或ACTH检测试剂盒中的应用。
此外，本发明还提供了编码所述ACTH突变体或所述的重组蛋白的核苷酸，具有
(Ⅰ)、如SEQ ID No.6所示或如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；或
(Ⅱ)、如SEQ ID No.6所示或如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或
(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(Ⅳ)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所述的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(V)、如(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)或(Ⅳ)所述的核苷酸序列的修饰变体，且与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所述的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(VI)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)或(V)所述的核苷酸序列至少有80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％同源性的核苷酸序列。
本发明还提供了表达载体，包括所述的核苷酸以及待转化载体。
在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的表达载体在表达所述ACTH突变体或所述的重组蛋白中的应用。
此外，本发明还提供了宿主细胞，转化有所述表达载体。
本发明还提供了所述ACTH突变体或所述的重组蛋白的表达方法，构建所述的表达载体，提取质粒导入所述的宿主细胞，诱导表达，纯化。
更重要的是，本发明还提供了ACTH检测试剂，包括所述ACTH突变体或所述的重组蛋白以及可接受的制剂。
本发明还提供了ACTH检测试剂盒，包括所述ACTH突变体、所述的重组蛋白或所述的ACTH检测试剂以及可接受的制剂。
通过研究发现，ACTH的氨基酸组成序列将其中的氨基酸进行突变可以提高其稳定性。本发明采用合成/体外表达系统(包括重组)等技术获得ACTH多肽或融合蛋白，并作为ACTH体外诊断试剂盒的标准品或某一组成成分来使用。对人ACTH的氨基酸进行体外合成或选择人ACTH氨基酸对应编码的核酸序列进行重组表达，在制备之前将ACTH对应的氨基酸序列中的KKRR(四处氨基酸是否同时突变，均包含在其中)进行突变(K变为非K，R的氨基酸；R变为非R，K的氨基酸)的设计，突变之后在ACTH免疫检测试剂中其ACTH的稳定性得到明显的提高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示ACTH-2(表达了融合蛋白的ACTH)、ACTH-3的电泳图(表达了融合蛋白的ACTH突变体)。
具体实施方式
本发明公开了一种ACTH突变体、重组蛋白及其应用，以及含有该ACTH重组蛋白的试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
通过体外合成的方式获得ACTH多肽，并作为ACTH体外诊断试剂盒的组成成分。其中所述ACTH氨基酸序列包含以下的组合：
1)
Figure BDA0002262380450000041
(第15位氨基改变为非K，R的氨基酸)
2)
Figure BDA0002262380450000042
(第16位氨基改变为非K，R的氨基酸)
3)
Figure BDA0002262380450000043
(第17位氨基改变为非R,K的氨基酸)
4)
Figure BDA0002262380450000044
(第18位氨基改变为非K，R的氨基酸)
1)2)；1)3)；1)4)；2)3)；2)4)；3)4)；1)2)3)；1)3)4)；2)3)4)；1)2)4)；1)2)3)4)以上氨基酸突变形式，均在保护范围之内。本发明在此不做限定。
通过体外表达系统(原核表达、真核表达等)获得包含ACTH氨基酸序列的蛋白，并作为ACTH体外诊断试剂盒的组成成分。其中所包含ACTH氨基酸序列包含以下的组合：
1)
Figure BDA0002262380450000045
(第15位氨基改变为非K，R的氨基酸)
2)
Figure BDA0002262380450000046
(第16位氨基改变为非K，R的氨基酸)
3)
Figure BDA0002262380450000047
(第17位氨基改变为非R,K的氨基酸)
4)
Figure BDA0002262380450000051
(第18位氨基改变为非K，R的氨基酸)
1)2)；1)3)；1)4)；2)3)；2)4)；3)4)；1)2)3)；1)3)4)；2)3)4)；1)2)4)；1)2)3)4)以上氨基酸突变形式，均在保护范围之内。本发明在此不做限定。
使用体外合成ACTH或选择人ACTH的氨基酸对应的核酸序列进行重组表达，在制备/表达之前将ACTH氨基酸组成中的KKRR(四处氨基突变是否同时突变，均包含在其中)进行突变(K变为非K的氨基酸；R变为非R的氨基酸)，制备之后其ACTH的稳定性得到提高。
本发明提供的ACTH突变体、重组蛋白及其应用，以及含有该ACTH重组蛋白的试剂盒中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1合成多肽
提供ACTH(突变前)的氨基酸序列(如SEQ ID No.1所示)委托上海生工合成：SYSMEHFRWGKPVGKKRRPVKVYPNGAEDESAEAFPLEF(命名：ACHT-1)。
ACTH(突变前)的核苷酸序列(如SEQ ID No.2所示)：
AGCTATAGCATGGAACATTTTCGTTGGGGCAAACCGGTGGGCAAAAAACGTCGTCCGGTGAAAGTGTATCCGAACGGCGCGGAAGATGAAAGCGCGGAAGCGTTTCCGCTGGAATTT
实施例2融合表达
分别合成ACTH或突变体氨基酸对应基因(5’端含BamHI对应碱基，3’端含有终止子-XhoI对应碱基)，使用引物ACTH-F和ACTH-R，PCR扩增后，经过BamHI和XhoI双酶切后，构建到pet32a载体，筛选阳性克隆菌，提取相应质粒后导入表达宿主细胞BL21DE3，经IPTG(0.1IPTG(0.1-1mM)-1mM)诱导表达出目的蛋白，进一步分别经Hitrap纯化获得达90％以上纯度的ACTH目的蛋白(ACTH-2、ACTH-3)。
具体方法如下：
1.材料和方法
1.1材料
主要试剂：Pet32a,E.Coli BL21DE3等购自novagen，高保真Pfu酶、限制性内切酶(BamHI、XhoI)、DNA连接酶、蛋白Marker等购自TaKaRa；HisTrap FF等购自GE；其他试剂分析纯级别。
主要设备：PCR仪ABI；iWO-960洗板机、化学发光免疫分析仪LUmo、促肾上腺皮质激素定量检测试剂盒(化学发光法)等购自郑州安图生物工程股份有限公司
1.2方法
1.2.1基因获得
确定的ACHT基因及其突变体基因(如SEQ ID No.2所示、如SEQ ID No.6所示)，都由上海生工合成。
SEQ ID No.2：
AGCTATAGCATGGAACATTTTCGTTGGGGCAAACCGGTGGGCAAAAAACGTCGTCCGGTGAAAGTGTATCCGAACGGCGCGGAAGATGAAAGCGCGGAAGCGTTTCCGCTGGAATTT
SEQ ID No.6：
AGCTATAGCATGGAACATTTTCGTTGGGGCAAACCGGTGGGCGGCGGCGGCGGCCCGGTGAAAGTGTATCCGAACGGCGCGGAAGATGAAAGCGCGGAAGCGTTTCCGCTGGAATTT
1.2.2引物设计
利用分子生物学软件DNAMAN，设计含BamHI和XhoI限制性内切酶的扩增引物(上游引物如SEQ ID No.9所示；下游引物如SEQ ID No.10所示)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并计算理论表达目的蛋白分子量。
ACTH-F：5’tatggatcc agctatagcatggaacattttcg(如SEQ ID No.9所示)；
ACTH-R：5’tat ctcgag cta aaattccagcggaaacgcttc(如SEQ ID No.10所示)。
1.2.3原核表达载体构建
采用分子生物学方法(PCR分别以含ACTH-2、ACTH-3基因的质粒为模板扩增目的基因、目的基因PCR产物胶回收、双酶切、水平胶回收、连接、转化)，将该阅读框分别插入细菌表达质粒PET32a之间，得到原核表达质粒PET32a-ACTHFR-2(蛋白简称ACTH-2，理论22.2KD)、PET32a-ACTHFR-3(蛋白简称ACTH-3，理论21.9KD)。将该质粒常规分别转化E.ColiBL21DE3等表达菌株，诱导，分别表达出ACTH-2、ACTH-3重组蛋白。
1.2.4重组蛋白纯化
HisTrap FF纯化携带6*His标签的ACTH-2、ACTH-3重组蛋白。
基于His-Tag标签亲和层析纯化：
将大量诱导表达的重组蛋白，离心收集。对PET32a载体表达的ACTH-2和ACTH-3蛋白用HisTrap FF层析柱亲和纯化：用平衡缓冲液(0.02mol/L PBS pH7.4)重悬菌体，超声破碎，20000xg(4℃)离心20min，上清进行纯化，依次用平衡缓冲液和5％洗脱缓冲液(PBSpH7.4，50mmol/L咪唑)洗去杂蛋白，用洗脱缓冲液(0.02mol/L PBS pH7.4，0.5mol/L咪唑)洗脱目的蛋白，-20度备用。
1.2.5ELISA检测ACTH含量
用含10％以上蛋白质(BSA，血清等)、EDTA等的缓冲液，分别稀释待测蛋白或多肽到不同浓度梯度。一份放置4℃，一份放置37℃。10天后，分别都取出来恢复室温后，做为标本，按照促肾上腺皮质激素定量检测试剂盒(化学发光法)检测试剂的说明书操作，获得ACTH含量数据。
通过公式：1-(37℃发光值/4℃发光值)*100％，计算获的热稳定性的降幅数据后统计学分析其差异性。
2.结果：
融合表达了PET32a载体上的硫氧还蛋白(trx)蛋白(如图1所示)。
ACTH的氨基酸序列(如SEQ ID No.1所示)：
SYSMEHFRWGKPVGKKRRPVKVYPNGAEDESAEAFPLEF
ACTH的核苷酸序列(如SEQ ID No.2所示)：
agctatagcatggaacattttcgttggggcaaaccggtgggcaaaaaacgtcgtccggtgaaagtgtatccga acggcgcggaagatgaaagcgcggaagcgtttccgctggaattt
表达了融合蛋白的ACTH：
PET32a--SYSMEHFRWGKPVGKKRRPVKVYPNGAEDESAEAFPLEF(命名：ACTH-2)；
表达了融合蛋白的ACTH的氨基酸序列(如SEQ ID No.3所示)：
Figure BDA0002262380450000081
理论22.2KD
表达了融合蛋白的ACTH的核苷酸序列(如SEQ ID No.4所示)：
Figure BDA0002262380450000082
Figure BDA0002262380450000091
ACTH突变体的氨基酸序列(如SEQ ID No.5所示)：
SYSMEHFRWGKPVGGGGGPVKVYPNGAEDESAEAFPLEF
ACTH突变体的核苷酸序列(如SEQ ID No.6所示)：
agctatagcatggaacattttcgttggggcaaaccggtgggcggcggcggcggcccggtgaaagtgtatccgaacggcgcggaagatgaaagcgcggaagcgtttccgctggaattt
表达了融合蛋白的ACTH突变体：
PET32a--SYSMEHFRWGKPVGGGGGPVKVYPNGAEDESAEAFPLEF(命名：ACTH-3)。
表达了融合蛋白的ACTH突变体的氨基酸序列(如SEQ ID No.7所示)：
Figure BDA0002262380450000092
理论21.9KD。
表达了融合蛋白的ACTH突变体的核苷酸序列(如SEQ ID No.8所示)：
Figure BDA0002262380450000101
实施例3稳定性评价
对本发明提供的一个多肽(ACHT-1)，两个融合抗原(ACHT-2，ACHT-3)进行稳定性的考察。将三个抗原通过促肾上腺皮质激素定量检测试剂盒(化学发光法)试剂检测，分别将其稀释调整到(5pg/ml、10pg/ml、20pg/ml、40pg/ml)浓度后，放置4℃、37℃，10天后考察其信号值，将4℃放置与和37℃放置的抗原放置的抗原发光值做对比，以评价其稳定性。
表1 ACTH-1
Figure BDA0002262380450000102
Figure BDA0002262380450000111
表2 ACTH-2
Figure BDA0002262380450000112
表3 ACTH-3
Figure BDA0002262380450000113
对表1～表3中37℃放置10天时信号值的降幅进行统计学分析，不同组之间采用T-test方法进行比较，以P＜0.05为差异具有统计学意义。与本发明中的多肽ACTH-1相比，融合蛋白ACTH-2，ACTH-3稳定性有所提升，差异均具有统计学意义(ACTH-2：F＝0.075，P<0.01；ACTH-3：F＝0.087，P<0.01)，且均为极显著差异。进一步比较融合蛋白的稳定性，与ACTH-2相比，ACTH-3的37℃加速稳定性显著提高，差异有极显著统计学意义(F＝0.942，P<0.01)。综合比较，ACTH-3稳定性最优，不同浓度下加速稳定性降幅均小于10％，符合体外试剂盒国家要求相关标准。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 郑州伊美诺生物技术有限公司
<120> ACTH突变体、重组蛋白及其应用，以及含有该ACTH重组蛋白的试剂盒
<130> MP1931299
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 39
<212> PRT
<213> ACTH
<400> 1
Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val Gly Lys Lys
1 5 10 15
Arg Arg Pro Val Lys Val Tyr Pro Asn Gly Ala Glu Asp Glu Ser Ala
20 25 30
Glu Ala Phe Pro Leu Glu Phe
35
<210> 2
<211> 117
<212> DNA
<213> ACTH
<400> 2
agctatagca tggaacattt tcgttggggc aaaccggtgg gcaaaaaacg tcgtccggtg 60
aaagtgtatc cgaacggcgc ggaagatgaa agcgcggaag cgtttccgct ggaattt 117
<210> 3
<211> 204
<212> PRT
<213> 表达融合蛋白的ACTH(ACTH with expressing the fusion protein)
<400> 3
Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp
1 5 10 15
Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp
20 25 30
Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp
35 40 45
Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn
50 55 60
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu
65 70 75 80
Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser
85 90 95
Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly
100 105 110
Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
115 120 125
Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln
130 135 140
His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met
145 150 155 160
Ala Asp Ile Gly Ser Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys
165 170 175
Pro Val Gly Lys Lys Arg Arg Pro Val Lys Val Tyr Pro Asn Gly Ala
180 185 190
Glu Asp Glu Ser Ala Glu Ala Phe Pro Leu Glu Phe
195 200
<210> 4
<211> 615
<212> DNA
<213> 表达融合蛋白的ACTH(ACTH with expressing the fusion protein)
<400> 4
atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60
gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120
ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180
atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240
ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300
aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360
catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420
ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg 480
gctgatatcg gatccagcta tagcatggaa cattttcgtt ggggcaaacc ggtgggcaaa 540
aaacgtcgtc cggtgaaagt gtatccgaac ggcgcggaag atgaaagcgc ggaagcgttt 600
ccgctggaat tttag 615
<210> 5
<211> 39
<212> PRT
<213> ACTH突变体(mutant of ACTH )
<400> 5
Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Pro Val Lys Val Tyr Pro Asn Gly Ala Glu Asp Glu Ser Ala
20 25 30
Glu Ala Phe Pro Leu Glu Phe
35
<210> 6
<211> 117
<212> DNA
<213> ACTH突变体(mutant of ACTH )
<400> 6
agctatagca tggaacattt tcgttggggc aaaccggtgg gcggcggcgg cggcccggtg 60
aaagtgtatc cgaacggcgc ggaagatgaa agcgcggaag cgtttccgct ggaattt 117
<210> 7
<211> 204
<212> PRT
<213> 表达融合蛋白的ACTH突变体(mutant of ACTH with expressing thefusion protein)
<400> 7
Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp
1 5 10 15
Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp
20 25 30
Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp
35 40 45
Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn
50 55 60
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu
65 70 75 80
Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser
85 90 95
Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly
100 105 110
Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
115 120 125
Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln
130 135 140
His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met
145 150 155 160
Ala Asp Ile Gly Ser Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys
165 170 175
Pro Val Gly Gly Gly Gly Gly Pro Val Lys Val Tyr Pro Asn Gly Ala
180 185 190
Glu Asp Glu Ser Ala Glu Ala Phe Pro Leu Glu Phe
195 200
<210> 8
<211> 615
<212> DNA
<213> 表达融合蛋白的ACTH突变体(mutant of ACTH with expressing thefusion protein)
<400> 8
atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60
gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120
ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180
atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240
ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300
aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360
catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420
ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg 480
gctgatatcg gatccagcta tagcatggaa cattttcgtt ggggcaaacc ggtgggcggc 540
ggcggcggcc cggtgaaagt gtatccgaac ggcgcggaag atgaaagcgc ggaagcgttt 600
ccgctggaat tttag 615
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tatggatcca gctatagcat ggaacatttt cg 32
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tatctcgagc taaaattcca gcggaaacgc ttc 33

Claims (9)

1.ACTH突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
2.重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。
3.如权利要求1所述ACTH突变体或如权利要求2所述的重组蛋白在制备ACTH检测试剂或ACTH检测试剂盒中的应用。
4.编码如权利要求1所述ACTH突变体或如权利要求2所述的重组蛋白的核酸，其特征在于，其核苷酸序列
（Ⅰ）、如SEQ ID No.6所示或如SEQ ID No.8所示；或
（Ⅱ）、与（Ⅰ）的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与（Ⅰ）的核苷酸序列不同。
5.表达载体，其特征在于，包括如权利要求4所述的核酸以及待转化载体。
6.宿主细胞，其特征在于，转化有如权利要求5所述表达载体。
7.如权利要求1所述ACTH突变体或如权利要求2所述的重组蛋白的表达方法，其特征在于，构建如权利要求5所述的表达载体，提取质粒导入如权利要求6所述的宿主细胞，诱导表达，纯化。
8.ACTH检测试剂，其特征在于，包括如权利要求1所述ACTH突变体或如权利要求2所述的重组蛋白以及可接受的制剂。
9.ACTH检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述ACTH突变体、如权利要求2所述的重组蛋白或如权利要求8所述的ACTH检测试剂以及可接受的制剂。
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