DE2422310A1

DE2422310A1 - 1-alpha-aminoisobuttersaeure-corticotropinpeptide, deren salze und komplexe, verfahren zu ihrer herstellung und diese peptide enthaltende arzneipraeparate

Info

Publication number: DE2422310A1
Application number: DE2422310A
Authority: DE
Inventors: Ken Inouye; Hideo Otsuka
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1974-05-08
Filing date: 1974-05-08
Publication date: 1975-11-20

Description

" 1-α-Aminoisobuttersäure-certicotropinpeptide, deren Salze und Komplexe, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Peptide enthaltende Arzneipräparate II Zusatz zu Patent.........(Patentanmeldung P 21 12 553.1-42) Gegenstand des Hauptpatents ......... (Patentanmeldung P 21 12 553.1-42) sind 1-α-Aminoisobuttersäure-corticotropinpeptide mit Aminosäureresten entsprechend der Sequenz 1-16 bis 1-39 des nativen Corticotropins, deren Derivate, Säureadditions-Salze und Komplexe. Diese Peptide, die anstelle des Serinrestes im nativen Corticotropin als aminoendständige Aminosäure einen rest α-Aminoisobuttersäure/enthalten, sind dem nativen Corticotropin in Bezug auf Wirkungsstärke und Wirkungsdauer überiegen; vgl.
auch BE-PS 764 351. Diese verbesserten Eigenschaften sind auf eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber der Wirkung von intracellulären Aminopeptidasen zurückzuführen Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, daß durch Veränderungen im nativen ACTH an den Aminosäuren 1, 4, 17 und 18 sich eine weitere bemerkenswerte Aktivitätssteigerung erreichen laut.
Gegenstand der Erfindung sind 1-a-Aminoisobuttersäure-corticotropinpeptide nach Hauptpatent .......... (Patentanmeldung P 21 12 553.1-42) der allgemeinen Formel a-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-X-L-glutamyl-L-histidyl L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lystl-l-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-Y in der (a) X die L-Methionylgruppe und Y die L-Lysyl-L-lysinamidgruppe bedeutet oder (b) X die L-Norleucylgruppe und Y die L-Lysyl-L-lysinamidgruppe oder die L-Arginyl-L-argininamidgruppe bedeutet, sowie deren Salze mit Säuren und Komplexe.
Die Erfindung betrifft also die folgenden Peptide: a-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysinamid (im folgenden mit £Ibu1, Lys17,18]-ACTH(1-18)-NH2 abgekürzt), α-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-argininamid (im folgenden mit ZIbu1, Nle47-ACTH(1-18)-NH2 abgekürzt), a-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysinamid (im folgenden mit g bu1, Nle4, Lys17,18j-ACTH(1-18)-NH2 abgekürzt), sowie deren Salze mit Säuren und Komplexe.
Die vorgenannten Peptide haben eine stärkere corticotrope Wirkung als natives ACTH und bekannte Octadecapeptide, bei denen die aminoendständige Serylgruppe durch die a-Aminoisobutyrylgruppe ersetzt ist, z.B. [Ibu1]-ACTH(1-18)-NH2. ACTH-ähnliche Peptide mit einer Norleucylgruppe in der 4-Stellung anstelle der Nethionylgruppe besitzen den Vorteil, daß bei ihnen eine Inaktivierung durch Oxidation der Methionylgruppe zum entsprechenden Sulfoxid vermieden.wird. Außerdem bereitet bekanntlich die Synthese von Arginin enthaltenden Peptiden große Schwierig keiten, was auf die Guanidylgruppe zurückzuführen ist, die für verschiedene Nebenreaktionen verantwortlich ist. Durch Ersatz von Arginin durch Lysin wird also die Synthese der entsprechen.-den Peptide erleichtert.
Die Octadecapeptide der Erfindung lassen sich in an sich bekannter Weise durch schrittweises Verknüpfen der einzelnen Aminosäuren oder durch Verknüpfen von kurzen Peptidbruchstücken herstellen.
Die letzte Kupplungsreaktion zur Herstellung der Octadecapeptide der Erfindung wird beispielsweise so durchgeführt, daß man ein geschütztes Decapeptid der allgemeinen Formel R1 -a-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L- seryl-X-y-R2-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin in der R1 eine Aminoschutzgruppe, R2 eine Carboxylschutzgruppe, X die L-Methionyl- oder L-Norleucylgruppe bedeutet, mit einem geschützten Octapeptid der allgemeinen Formel N°-R3-L-Lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N'-R4-L-lysyl-N# R5-L-lysyl-Y', in der Y' die Nt-R6-L-Lysyl-Nt- -L-lysinamid- oder L-Arginyl-L-argininamidgruppe bedeutet, etwa 2 Stunden bis 7 Tage in einem inerten Lösungsmittel bei Temperaturen von -20 bis +600C kondensiert und vom erhaltenen geschützten Octadecapeptid der allgemeinen Formel R1 -a-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-X-y-R2-L-glutamyl-L histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-N#-R3-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-Nt-R4-L-lysyl-NE-R5-L-lysyl-Y', in der die einzelnen Symbole die vorgenannte Bedeutung haben, die Schutzgruppen in an sich bekannter Weise bei Temperaturen von -20 bis +600C innerhalb von 30 Minuten bis 24 Stunden entfernt.
Die Kondensation des Decapeptids mit dem Octapeptid kann beispielsweise nach dem Azidverfahren, dem Dicyclohexylcarbodiimidverfahren, dem Carbonyldiimidazolverfahren, dem gemischten Anhydridverfahren, dem aktivierten Esterverfahren (z.B. p-Nitrophenylester, N-Hydroxysuccinimidester, p-Nitrophenylthioçester und Pentachlorphenylester), dem Isoxazoliumverfahren, dem N-Carboxyanhydridverfahren, dem Tetraäthylpyrophosphitverfahren, dem Äthylchlorphosphitverfahren, nach einem Verfahren, das zwei oder mehr der vorgenannten Verfahren miteinander kombiniert, sowie nach all en weiteren in der Peptidchemie hierfür üblichen Verfahren durchgeführt werden. Die gewünschten Peptide können auch nach einem Verfahren zur Herstellung von Peptiden in fester Phase hergestellt werden. Zur Herstellung der Octadecapeptide der Erfindung sind insbesondere das Dicyclohexylcarbodiimidverfahren, das Azidverfahren, das gemischte Anhydridverfahren und das aktivierte Esterverfahren bevorzugt.
Bei der Herstellung der Octadecapeptide der Erfindung werden alle freien funktionellen Gruppen, die an der Umsetzung nicht teilnehmen, vorzugsweise mit einer Schutzgruppe versehen, insbesondere mit solchen Schutzgruppen,. die leicht durch Behandlung mit Wasserstoff, Säuren, Hydrazin, durch Hydrolyse oder durch Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak entfernt werden können.
Carboxylgruppen werden vorzugsweise durch Veresterung geschützt, beispielsweise mit einem niederen Alkanol, wie Methanol, Äthanol, -Propanol und tert.-Butanol, oder einem Aralkanol, wie Benzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol und p-Methoxybenzylalkohol. Diese Carboxylschutzgruppen werden nach üblichen Verfahren eingeführt.
Aminogruppen werden. vorzugsweise durch Einführungeint der folgenden Gruppen in an sich bekannter Weise geschützt: tert.-Butyloxycarbonyl-, tert. -Amyloxycarbonyl-, o-Nitrophenylsulfenyl-, 2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl-, Benzyloxycarbonyl-, Tosyl-, Formyl- oder Tritylgruppe. Zum Schutz der Guanidylgruppe im Arginin wird vorzugsweise die Nitro-, Tosyl- oder Adamantyloxycarbonylgruppe verwendet, jedoch ist der Schutz der Guanidylgruppe nicht immer notwendig. Die t E-Aminogruppe wird vorzugsweise durch die vorgenannten Aminoschutzgruppen geschützt.
Die y-Carboxylgruppe der Glutaminsäure wird vorzugsweise durch die vorgenannten Carboxylschutzgruppen geschützt. Die Imidazolgruppe des Histidins kann durch die-Tosyl-, Benzyloxycarbonyl oder Benzylgruppe geschützt werden. Ferner kann die Hydroxylgrup- pe des Serins oder des Tyrosins durch die Acetyl-, Benzyl- oder tert.-Butylgruppe geschützt werden, jedoch ist dieser Schutz nicht immer notwendig.
Beispiele für inerte Lösungsmittel, in denen die vorgenannten sreaktionen Kondensation/ durchgeführt werden können, sind Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Dioxan, Hexamethylphosphortriamid, Gemische dieser Lösungsmittel mit Wasser sowie Gemische der Lösungsmittel untereinander.
In den Schemata I,1I und III ist jeweils eine bevorzugte Herstellungsweise für [Ibu1, Lys 17,18]-ACTH(1-18)-NH2,[Ibu1, Nle4]-ACTH(1-18)-NH2 bzw. zIbu1, Nle4,Lys17,18]-ACTH(1-18)-NH2 erläutert.
In den Tabellen werden folgende Abkürzungen für die Aminosäurereste verwendet: Ibu = a-Aminoisobutyryl, Tyr = L-Tyrosyl, Ser = L-Seryl, Met = L-Methionyl, Nle = L-Norleucyl, Glu = L-Giutamyl, His = L-Histidyl, Phe = L-Phenylalanyl, Arg =L-Arginyl, Trp = L-Tryptophyl, Gly = Glycyl, Lys = L-Lysyl, Pro = L-Prolyl, Val = L-Valyl, Boc = tert.-Butyloxycarbonyl, OSu = N-Hydroxysuccinimidester, Z = Benzyloxycarbonyl, OBut = tert.-Butoxy, DCC-= N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, HOSu = N-Hydroxysuccinimid, OBz = Benzyloxy, HOBt = 1-Hydroxybenzotriazol.
Schema I: Herstellung von [Ibu1, Lys17,18]-ACTH(1-18)-NH2 (Decapeptid I) Schema II: Herstellung von [Ibu1, Nle4]-ACTH(1-18)-NH2 Je nach den Reaktionsbedingungen erhält man die Octadecapeptide der Erfindung in Form der freien Basen oder in Form von pharmakologisch verträglichen Salzen mit Säuren. Die Salze leiten sich von anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, z.B.
Fluorwasserstoffsaure, Bromwasserstoffsäure und Salzsäure, Halogenwasserstoffen, wie Fluorwasserstoff, Bromwasserstoff und Chlorwasserstoff, Schwefelsäure oder Phosphorsäure, oder von organischen Säuren ab, wie Essigsäure, Ameisensäure, Bernsteinsäure Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Citronensäure, Benzoesäure, Methansulfonsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Benzolsulfonsäure oder Toluolsulfonsäure. In an sich bekannter Weise lassen sich aus den freien Basen durch Behandlung mit äquimolaren Mengen oder einem Uberschuß einer Säure die entsprechenden Salze herstellen.
Ferner können die Octadecapeptide der Erfindung mit komplexbildenden Schwermetallen, wie Zink, Kupfer, Eisen, Nickel und Kobalt, mit komplexbildenden Polyaminosäuren, wie Polyglutaminsäure, Polyasparaginsäure, Copoly-glutamyl-tyrosin und Copolyaspartyl-glutaminsäure, oder mit Gemischen aus diesen Komplexbildnern in die entsprechenden Komplexe überführt werden. Zur Herstellung der Komplexe werden die Octadecapeptide mit einer Schwermetallverbindung, wie einem Schwermetallhalogenid, z.B.
Zinkchlorid, Kupferchlorid, Eisenchlorid und Kobaltchlorid, oder einem Schwermetallhydroxid, z.B. Zinkhydroxid, unter schwach sauren Bedingungen, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7,0, auf übliche Weise in einem Gewichtsverhältnis von 1 : 0,1 behandelt. Als Schwermetall ist Zink als Komplexbildner besonders bevorzugt. Die Polyaminosäurekomplexe können dadurch her- gestellt,werden, daß man die Octadecapeptide auf übliche Weise unter schwach sauren Bedingungen, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7,0 mit einer Polyaminosäure in einem Gewichtsverhältnis von 1 : 0,1 behandelt. Die Polyaminosäuren sind Homo- oder Copolymere von Aminosäuren und können in der L-, D-oder DL-Konfiguration vorliegen. Beispiele für bevorzugte Polyaminosäuren sind Poly-L-glutaminsäure, Poly-D-glutaminsäure, Poly-DL-glutaminsäure, Poly-L-asparaginsäurey Poly-D-asparaginsäure, Poly-DL-asparaginsäure, Copoly-L-glutamyl-L-tyrosin und Copoly-L-aspartyl-L-glutaminsäure. Diese Polyaminosäuren weisen vorzugsweise ein Molekulargewicht von etwa 1000 bis etwa 100 000, insbesondere 2000 bis 6000 auf. Vorzugsweise werden diese Polyaminosäuren vor ihrer Verwendung mit alkalisch reagierenden Verbindungen, z.B. Natriumhydroxid, neutralisiert. Bei der Herstellung der Komplexe können als weitere Zusätze Konservierungsmittel, (Natrium-äthylmercurithiosalicylat) wie Benzylalkohol, Phenol oder Thimerosa Puffer, wie Citrat-, Phosphat- oder Carbonatpuffer, oder isotonisierende Mittel, wie Natriumchlorid, verwendet werden.
Die nebennierenstimulierende Wirkung der Octadecapeptide der Erfindung wurde im Vergleich zu nativem ACTH (Cortrosyn der Firma N.V. Organon, Niederlande) und Abul7-ACTH(1-18)-NH2 (vgl.

BE-PS 764 351) geprüft. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt: Tabelle I Stimulierende Wirkung auf die Nebennieren

Peptid Verabfolgungsweg

intravenös intramuskulär

[Ibu1 Lys 17,18]-ACTH 9,3 3,1

(1-18)-NH2

[Ibu1, Nle4,Lys17,18]-

ACTH (1-18)-NH2 12,3 3,0

zIbu1,Nle42-ACTH(1-18)-NH2 3,9 1,2

natives ACTH 1 1

Cortrosyn 1,8 1,0

DIbu12-ACTH(1-18)-NH2 4,1 3,3

Anmerkung: Die Werte geben eine relative Wirkungsstärke im Vergleich zu nativem ACTH an. Die Aktivitäten wurden gemäß dem in der BE-PS 764 351 angegebenen Verfahren bestimmt.

Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß die Octadecapeptide der Erfindung eine sehr hohe nebennierenstimulierende Wirkung aufweisen.
Die Octadecapeptide der Erfindung sind wertvolle Arzneistoffe, die z.B. zur Behandlung von akutem oder chronischem Gelenk-.rheumatismus, Allergosen oder Nebennierenrindenerkrankungen bei Menschen und Tieren eingesetzt werden können.
Die Octadecapeptide der Erfindung, ihre Salze mit Säuren und.
Komplexe können oral oder parenteral in üblichen Verabreichungsformen, z.B. als Injektionspräparate, Flüssigkeiten, Suspen- sionen, Emulsionen oder Aerosolen, gegebenenfalls zusammen mit üblichen Trägerstoffen, Stabilisatoren, Emulgatoren, Konservierungsmitteln, Puffern, isotonisierenden Mitteln und bzw. oder Befeuchtungsmitteln, verabfolgt werden. Typische Verabreichungsdosen betragen etwa 0,2 U/kg bis 0,8 U/kg für einen Erwachsenen.
Als Verabreichungsform ist die In3ektion bevorzugt. Gegebenenfalls wird die Verabfolgung mehrmals wiederholt.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel A a-Aminoisobutvryl-L-tvrosvl-L-servl-L-methionvl-L-lutamvl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-truptophyl-glvcyl-L-lysyl-L-rolvl-L-valvl-lvcvl-L-lvsvl-L-lvsvl-L-lvsvl-L-lvsinamid ([Ibu1, Lys 17,18]-ACTH(1-18)-NH2) 1. Nα-Benzyloxycarbenyl-N#-tet-butyloxycarbonyl-L-lysinamid (I) Eine Lösung von 9,55 g N«-Benzyloxycarbonyl-N-tert¢-butyloxycarbonyl-L-lysin-N-hydroxysuccinimidestar in 50 ml Dioxan wird mit 10 ml konzentrierter Ammoniaklösung versetzt. Anschließend wird das Gemisch 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels wird der kristalline Rückstand mit Essigsäureäthylester extrahiert. Der Extrakt wird mit kalter 0,5 n Salzsäure, 1 m Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird aus Essigsäureäthylester und Petroläther kristallisiert. Ausbeute 7,18 g (94,6 % d. Th. vom F. 145 bis 146°C.
[α] 23,5 D - 2,1 + 0,50 (c=1,004, Methanol).
C1 9H29N305: C H N ber.: 60,14 7,70 11,07 -gef.: 60,42 7,61 11,00.
2. N#-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysinamid (II) 5,69 g der Verbindung I werden 2 1/2 Stunden in 50 ml Methanol in Gegenwart von Palladiummohr als Katalysator hydriert. Anschließend wird der Katalysator abfiltriert und mit Methanol gewaschen. Das Filtrat und die Waschwässer werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene ölige Rückstand erstarrt beim Behandeln mit Petroläther. Der Feststoff wird abfiltriert und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeut-e 3,49 g (94.8 % d. Th.) vom F. 104 bis 105,5°C.
[αp]23,5 D + 8,2+0,5(c=1,006, Methanol) C11H23NO3: C H N ber.: 53,86 9,45 17,13 gef.: 53,89 9,54 17,02.
3.Nα-Benzyloxycarbonyl-N#-tert.-butyloxycaronyl-L-lystl-N#-tert-butyloxycarbonyl-L-lysinamid (III) Eine Lösung von 4,78 g Na-BenzyLoxycarbony-N-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-N-hydroxysuccinimidester in 20 ml Chloroform wird zu einer Lösung von 2,45 g der Verbindung II in 30 ml Essigsäureäthylester gegeben. Sodann wird das Gemisch 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zusatz von 20 ml Methanol wird das Rühren weitere 3 Stunden fortgesetzt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck-eingedampft und der erhaltene Rückstand in Essigsäureäthylester suspendiert. Die Suspension wird nacheinander mit kalter -0,5 n Salzsäure, Wasser, 1 m Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen. Das in Essigsäureäthylester unlösliche Material wird abfiltriert, gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Nach dem Umkristallisieren aus einer Mischung von Methanol und Diäthyläther erhält man 5,25 g (86,2 % d. Th.) Produkt vom F. 161 bis 170°C.
[α]22,5D - 11,1 + 0,3° (c=2,025, Methanol).
C30H49N508: C H N ber.: 59,29 8,13 11,52 gef.: - 59,28 8,12 11,52.
4.N#-tert. -Butyloxycarbonyl-L-lysyl-N#-tert-butyloxycarbonyl-L-lysinamid (IV) .4,25 g der Verbindung III werden 2 1/2 Stunden in 50 ml Methanol in Gegenwart von Palladiummohr als Katalysator hydriert. Sodann wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck zu einem kristallinen Feststoff eingedampft. Der Rückstand #ird aus einer Mischung von Essigsäureäthylester und n-Hexan umkristallisiert. Ausbeute 3,30 g (99,4 % d. Th.) vom F. 112 bis 1150C.
/ 722,5 -27, 2+0,4° (c=2,023, Chloroform; C22H43N506: C H N ber.: 55,79 9,15 14,79 gef.: 55,75 9,14 14,85.
5.Nα-Benzyloxycaronyl-N#-tert. -butyloxycarbonyl-L-lysyl-N#-tert. -butyloxycarbonyl-L-lysyl-N#-tert. -butyloxycarbonyl-L-lvsinamid (V) Eine Lösung von 2,84 g der Verbindung IV in 50 ml Chloroform wird mit 2,87. g Nα-Benzyloxycarbonyl-N#-tert. -butyloxycarbonyl- L-lysin-N-hydroxysuccinimidester versetzt. Das erhaltene Gemisch wird 68 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Eindampfen wird der Rückstand in Essigsäureäthylester gelöst und die Lösung nacheinander mit kalter 0,1 n Salzsäure, Wasser, 1 m Natriushydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen. Der nach dem Eindampfen unter vermindertem Druck erhaltene Rückstand wird in Essigsäureäthylester gelöst. Die Lösung wird in -den Kühlschrank gegestellt. Der erhaltene gelatinöse Niederschlag wird abfiltriert, ge waschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 4,85 g vom F. 170 bis 171 0C.
[α]23,5 D -16,1+0,6° (c=1,034, Methanol).
C41H69N7011: C H N ber.: 58,90 8,32 Q 11,73 gef.: 58,78 8,32 11,47.
6. N6-tert. -Butyloxycarbonyl-L-lysyl-N#-tert.-butyloxycarbonyl-L lysyl-N#-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysinamid (VI) 3,34 g der Verbindung V werden 2 Stunden in 50 ml Methanol in Gegenwart von Palladiummohr als Katalysator hydriert.
Nach dem Entfernen des Katalysators wird das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in Essigsäureäthylester gelöst und durch Zusatz von Petroläther ausgefällt.
Der Niederschlag wirdabfiltriert, gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 2,80 g (99,6 % d. Th.) vom F. 114 bis 117°C.[α]23 D -4,2+0,5° (c=1,018, methanol).
C33H63N709: C H N ber.: 56,47 9,05 13,97 gef.: 56,46 9,08 13,83.
7. Nα-Benzyloxycarbonyl-N#-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N#-tert.-butvloxvcarbonvl-L-lsyl-N"-tert.-lysyl-N#-tert. -butyloxycarbonyl-L-lysinamid (VII) 1,43 g Nα-Benzyloxycarbonyl-N#-tert. -butyloxycarbonyl-L-lysin-N-hydroxysuccinimidester werden zu einer Lösung von 2,11 g der Verbindung VI in einem Gemisch aus 30 ml Chloroform und 3 ml Methanol gegeben. Das Gemisch wird 3 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und sodann unter vermindertem Druck eingedampft.
Der Rückstand wird in Essigsäureäthylester aufgenommen und nacheinander mit kalter 0,1 n Salzsäure, Wasser, 1 m Natriumhydrogen carbonatlösung und Wasser gewaschen. Der nach dem Eindampfen unter vermindertem Druck erhaltene Feststoff wird aus einer Mischung von Methanol und Diäthyläther umgefällt. Der Niederschlag wird abfiltriert, gewaschen und getrocknet. Ausbeute 3,04 g (95,3 % d. Th.) vom F. 194 bis 195°C [α]23,5 D -18,6+0,6° (c=1,012, methanol).
C52H89N9014: C H N ber.: 58,68 8,43 11,84 gef.: 58,89 8,73 11,84.
8. N@-tert. -Butyloxycarbonyl-L-lysyl-N#-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N#-tert. -butyloxycarbonyl-L-lysyl-N#-tert -butyloxycarbonyl-L-lysinamid (VIII) 2,15 g der Verbindung VII werden 4 1/2 Stunden in 30 ml Methanol in Gegenwart von Palladiummohr als- Katalysator hydriert. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird aus einer Mischung von Methanol und Essigsäureäthylester gefällt. Der gelatinöse Niederschlag wird abfiltriert, gewaschen und unter vermindertem L Druck getrocknet. Ausbeute 1,64 g (88,1 5' d. Th.) vom F. 168 bis 1700c. [α]24D -11,9+0,6° (c=1,006, Methanol).
C44H83N4012: C H N ber.: 56,81 8,94 13555 gef.: 56,94 8,94 13,55.
9. N-Benzvloxycarbonvl-NE-tert . -butvl~oxvcarbonvl-L-lysvl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N#-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N#-tert. -butyloxycarbonyl-L-lysyl-N#-tert. -butyloxycarbonyl-L-lysyl-N#-tert -butyloxycarbonyl-L-lysinamid (IX) Eine Lösung von 978 mg Na-Benzyloxycarbonyl-Nt-tert.-butZrloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycin(hergestellt gemäß Bull. Chem. Soc. Japan, Bd. 37 (1964), S. 1471) und 173 mg N-Hydroxysuccinimid in 10 ml Essigsäureäthylester wird mit 309 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Das Gemisch wird 1 Stunde bei 0°C und 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wird eine kalte Lösung von 1395 mg der Verbindung VlII in 15 ml Dimethylformamid zugegeben. Die erhaltene Lösung wird 64 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abfiltrieren des ausgefallenen Dicyclohexylharnstoffs wird das Filtrat unter vermindertem Druck zu einem Feststoff eingedampft. Der nach Zugabe von Methanol und Wasser erhaltene Niederschlag wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 2,40 g vom F. 217 bis 2230C (umkristallisiert aus wäßrigem Methanol). [α]24D -36,9 +0,80 (c=1,022, Methanol).
C75H128N14020: C H N ber.: 58,27 8,35 12,68 gef.: 58,14 8,38 12,83.
10. tert.-ButyloxYcarbonyl--aminoisobutsrYl-L-tyrosYl-L-ser L-methioninhydrazid (X) 8,94 g tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-methioninmethylester werden in 13 ml Essigsäureäthylester gelöst und unter Eiskühlung mit 16 ml einer 21prozentigen Lösung von Chlorwasserstoff in Essigsäureäthylester versetzt. Sodann wird das Gemisch 1 Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen und anschließend unter vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird in 37 ml Dichlormethan gelöst. Die Lösung wird 5 Minuten unter Kühlen mit 9,3 ml einer 50prozentigen Kaliumcarbonatlösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zu einem kristallinen Rückstand eingedampft. Dieser Rückstand wird mit 25 ml Diäthyläther versetzt. Das Gemisch wird abfiltriert und der Rückstand unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 6,15 g L-Seryl-L-methionin-methylester.
10,65 g tert, -Butyloxycarbonyl-α-aminoisobutyryl-L-tyrosinhydrazid werden bei Raumtemperatur in 70 ml 1 n Salzsäure gelöst. Die erhaltene Lösung wird gekühlt und sodann mit 14 ml einer 2 m Natriumnitritlösung versetzt. Das Gemisch wird 5 Minuten .gerührt. Sodann wird das Reaktionsgemisch zweimal mit je 70 ml Diäthyläther extrahiert, über Natriumsulfat getrocknet und bei 0°C unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält 11,2 g tert.-Butyloxycarbonyl-a-aminoisobutyryl-L-tyrosinazid.
Dieses Azid wird in 58 ml kaltem AcetonitriL gelöst. Die Lösung wird unter Eiskühlung gerührt. Sodann wird die Lösung mit 6,15 g des vorstehend erhaltenen L-Seryl-L-methionin-methylesters versetzt. Das Gemisch wird 4 Tage bei 40C stehengelassen.
Nach Eindampfen unter vermindertem Druck erhält man einen öligen Rückstand, der in 150 ml Essigsäureäthylester gelöst wird. Die Lösung wird nacheinander mit kalter 1 n Salzsäure, Sprozentiger Natriumhydrogencarbonatlösung und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält 13 g tert. -Butyloxycarbonyl-α-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionin-methylester in Form eines öligen Rückstands.
Der vorstehend erhaltene Tetrapeptidester wird in 80 ml Methanol gelöst und mit 6,15 g Hydrazinhydrat versetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden unter Rückfluß erwärmt und anschließend unter vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene ölige Rückstand wird mit 20 ml Methanol und 400 ml Essigsäureäthylester behandelt und anschließend 1 1/2 Stunden kühl gestellt. Das nach Zusatz von 100 ml Diäthyläther und 100 ml Essigsäureäthylester gebildete Gel wird 1 1/2 Stunden kühl gestellt. Man erhält 9,1 g Produkt vom F. 178 bis 179°C (Zers.). [α]23,5D -28,8+0,7° (c=1,004, Methanol).
C26H4208N6S: C H N S ber.: 52,14 7,08 14,04 5,25 gef.: 52,06 7,00 14,05 5,31.
11, tert.-Butyloxycarbonyl-α-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl L-methionYl-Y-tert.-butyl-L-glutamyl-L-hi.stidXl-L-phen alanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin (XI) 1,67 g der Verbindung X werden bei Raumtemperatur in 17 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird in einem Eis-Kochsalzbad gekühlt. Anschließend werden 8,4 ml 1 n Salzsäure und 3,4 ml 1 m Natriumchloridlösung zugegeben. Das erhaltene Gemisch wird 5 Minuten unter Eiskühlung gerührt. Sodann wird das Reaktionsgemisch mit 60 ml Essigsäureäthylester extrahiert. Die organischen Extrakte werden mit kalter Natriumhydrogencarbonatlösung und mit Wasser gewaschen und anschließend über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet.
1,933 g Benzyloxycarbonyl-y-tert. -butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin (hergestellt gemäß Bull. Chem. Soc. Japan, Bd. 38 C1965, S. 1148) werden in 38 ml 50prozentiger Essigsäure gelöst und sodann 3 Stunden bei Raumtemperatur in Gegenwart von Palladiummohr als Katalysator hydriert. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat.
unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 30 bis 50°C eingedampft. Der erhaltene ölige Rückstand wird in 20 ml Essigsäure gelöst. Die Lösung wird lyophilisiert. Man erhält 2,62 g y-tert.-Butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin in Form eines flockigen Pulvers.
Das Produkt wird in 40 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung mit ort78 ml Triäthylamin versetzt. Die erhaltene Lösung wird mit Eis gekühlt und sodann mit einer Lösung des vorstehend erhaltenen Tetrapeptidazids in Essigsäureäthylester vermischt. Das Gemisch wird 222 Stunden unter Eiskühlung gerührt. Der erhaltene Feststoff wird abfiltriert und sodann bei 40 bis 45°C in 30 ml Essigsäure gelöst. Die Lösung wird lyophilisiert und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 1,691 g flockiges Pulver.
24 «a724 24,2+0,70 (c=0,960 90prozentige Essigsäure).
C69H96017N6S.3H20: C H N S ber.: 54,97 6,82 14,86 2,13 gef.: 55,15 6,73 14,81 3,15.
12. tert-Butyloxycarbonyl-α-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionvl-v-tert.-butYl-L-glutamYl-L-histidvl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-N@-tet-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N@-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N@-tert. -butyloxycarbonyl-L-lysyl-N@-tert. -butyloxyearbonvl-L-lysyl-Nt-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysinamid (XII) 200 mg der Verbindung IX werden 5 Stunden in 20 ml Methanol in Gegenwart von Palladiummohr als Katalysator hydriert. Das nach dem Abfiltrieren des Katalysators erhaltene Filtrat wird unter vermindertem Druck auf etwa 3 ml eingeengt. Die eingeengte Lösung wird mit 6 ml Benzol und.30 ml Petroläther versetzt. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert, gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 181 mg N@-tert. -Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N@j-tert,-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N@-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N@-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N@-tert. -butyloxycarbonyl-L-lysinamid, das sich dünnschichtchromatographisch an Kieselgel (n-Butanol Essigsäure : Wasser = 4 : 1 : 2 Volumteile) homogen verhält.
Eine Lösung von 200 mg der Verbindung XI in 5 ml Dimethylformamid wird unter Eiskühlung mit 0,3 ml 1 n Salzsäure versetzt. Das Gemisch wird sofort tropfenweise zu einem eisgekühlten Gemisch aus 50 ml Essigsäureäthylester und 50 ml Diäthyläther gegeben.
Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert, gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 234 mg Benzyloxycarbonyl-a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-ytert.-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-E-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-hydrochlorid.
234 g des geschützten Decapeptid-hydrochlorids, 32 mg des vorstehend erhaltenen, partiell geschützten Octapeptids und 0,021 ml Triäthylamin werden bei 0°C in 4 ml Dimethylformamid gelöst. Diese Lösung wird mit einer kalten Lösung von 107 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Das erhaltene Gemisch wird 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der nach Zusatz von 15 ml Essigsäureäthylester gebildete Niederschlag wird abfiltriert, gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Der Rückstand ergibt nach Lyophilisation aus Essigsäure 351 mg Produkt in Form eines flockigen Pulvers.
13. a-Aminoisobutvryl-L-tvrosvl-L-servl-L-methionyl-L-utamvl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lvsvl-L-urolvl-L-valvl-lvcyl-L-lysvl-L-lysvl-L-lvsvl-L-lvsinamid ([Ibu1. Lys 17,18]-ACTH (1-18)-NH2) (XIII) Äthylendimercaptan 351 mg der Verbindung XII, 0,2 ml / und 0,35 ml Anisol werden in 4 ml 90prozentiger wäßriger Trifluoressigsäure gelöst. Die Lösung wird 1 Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach Zusatz von 20 ml Diäthyläther zum Reaktionsgemisch wird der gebildete Niederschlag abfiltriert, gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Sodann wird der Niederschlag in 2 ml 0,1 n Essigsäure gelöst und die Lösung auf eine mit Amberlite CG-400 (Acetatform) beschickte Säule der Abmessungen 0,9 x 30 cm aufgesetzt. Die Säule wird mit 0,1 n Essigsäure eluiert, bis das Eluat keine Folin-Lowry-Färbung mehr ergibt.
Die Eluate werden auf ein geringes Volumen eingeengt und anschließend zu 267 mg Pulver lyophilisiert. Dieses Pulver wird anschließend auf eine mit Carboxymethylcellulose (Whatman CM-52) beschickte Säule der Abmessungen 2,2 x 30 cm aufgesetzt.
Die Säule wird bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 60 ml/ Stunde mit insgesamt 2000 ml Ammoniumacetatpuffer vom pH-Wert 6,50 eluiert, wobei ein linearer Konzentrationsgradient von 0,01 m bis 0,40 m eingehalten wird. Die Fraktionen Nr. 235 bis 290 (10 ml/Reagensglas) werden vereinigt, eingeengt und zu 153 mg Pulver lyophilisiert. Dieses Pulver wird in einem Gemisch gelöst aus n-Butanol/Essigsäure/Pyridin/Wasser (12 : 3 : 4 : 6) / und der Verteilungschromatographie an einer mit Sephadex G-25 beschickten Säule der Abmessungen 2,7 x 80 cm unterworfen, Diese Säule wird bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 70 ml/ Stunde mit dem vorgenannten Lösungsmittel eluiert. Die Fraktionen Nr. 45 bis 80 (7 ml Reagensglas) werden vereinigt, eingeengt und lyophilisiert. Das erhaltene Pulver wird wiederum auf die vorstehend beschriebene Weise der Säulenchromatographie an Carboxymethylcellulose unterworfen. Nach dem Lyophilisieren erhält man 117 mg eines flockigen Pulvers.
A 723 -67,7+2, (c=0,489, 0,1 n Essigsäure).
Aminosäureanalyse: Lysin 5,3, Histidin 1,1, Ammoniak 1,2, Arginin 1,0, Serin 0,9, Glutaminsäure 1,1, Prolin 1,0, Glycin 2,0, «-Aminoisobuttersäure 0,9, Valin 1,0, Methionin 1,0, Tyrosin 1,0 und Phenylalanin 1,0. Durch UV-Analyse in 0,1 n Natriumhydroxidlösung wird ein Tryptophan/Tyrosin-Verhältnis von 1,1 bestimmt. Das Produkt gibt.nach Dünnschichtchromatographie auf Celluloseplatten (n-Butanol/Essigsäure/Pyridin/Wasser - 30 : 6 : 20 : 24 Volumteile, n-Butanol/Essigsäure/Wasser = 4 : 1 : 2 Volumteile) einen einzigen Flecken, der auf Ninhydrinreagens, Ehrlich-Reagens, Pauly-Reagens und Sakaguchi-Reagens positiv reagiert.
Beispiel B a-Aminoisobutyryl-L-tyrosvl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-erginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lyslyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-argininemid ((Ibul .Nle4l-ACTHCl-18)-NH2j 1.p-methyoxybenzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycinmethylester (I) 2,50 g p-Methoxybenzyloxycarbonyl-L-histidinhydrazid werden in 19 ml eiskalter 1 n Salzsäure gelöst und diese Lösung wird mit 4,2 ml eiskalter 2 m Natriumnitritlösung versetzt. Das Gemisch -wird 3 bis 4 Minuten bei o0c gerührt und anschließend mit 20 ml eiskaltem Essigsäureäthylester und 12 ml eiskalter 50prozentiger Kaliumcarbonatlösung versetzt. Die wäßrige Phase wird mit eiskaltem Essigsäureäthylester extrahiert. Die organischen ExtraKte werden vereinigt, über Magnesiumsulfat getrocknet und zu einer Lösung von 3,35 g L-Phenylalanyl-L-nitroarginyl-L-tryptophylglycin-methyester-formiat und 0,70 ml Triäthylamin in 10 ml Dimethylformamid gegeben. Aus dem Gemisch wird bei einer Badtemperatur unter 200C der Essigsäureäthylester entfernt. Die erhaltene klare Lösung wird 2 Tage bei 40C stehengelassen. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wird der erhaltene sirupöse Rückstand mit Essigsåureäthylester behandelt.
Es lassen sich 5,46 g Rückstand abfiltrieren. Nach dem Umfällen aus wäßrigem Methanol unter anschließendem Behandeln mit heißem - Methanol erhält man 2,53 g (53 % d. Th.) reines Produkt.
[α]22,5D -20,5+0,7° (c=1,0, 50prozentige Essigsäure ) und [α]22,5D -30,0+0,7° (c=1,0 Dimethylformamid).
C44H52N12O11.3/2H2O: C H N ber.: 55,51 5,82 17,66 gef.: 55,65 5,76 17,62.
2. n-Methoxvbenzvloxvcarbonyl-L-histidvl-L-henvlalanvl-L-nitroarginsl-L-trvPtõphvl-glycin (II) 6,60 g einer Lösung der Verbindung I in 7 ml Dimethylformamid und 63 ml Methanol wenden in einem Eisbad gekühlt. Anschließend werden 14 ml 1 m Natriumhydroxidlösung zugegeben, und das Gemisch wird 40 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Sodann wird in einem Eisbad gekühlt und mit 14 ml 1 m Salzsäure neutralisiert. Nach Zusatz von 120 ml Wasser wird der Niederschlag abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Das auf diese Weise erhaltene Produkt wird in wäßrigem Methanol suspendiert, das einige ml Essigsäure enthält. Die Suspension wird einige Minuten gekocht, um die Kristallisation einzuleiten. Anschließend wird über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Der kristalline Niederschlag wird abfiltriert, mit Methanol und Diäthyläther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 5,54 g (87 % d.
Th.) vom F. >2320C (Zers.). [α]24 22,9+1,20 (c=0,5, 50prozentige Essigsäure).
C43H50N12011.1/2H20: C H N ber.: 56,14 5,59 18,27 gef. : 56,22 5,55 18,30.
3, L-Histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glyein (III) Ein Gemisch aus 6,50 g der Verbindung II und 6,5 ml 2-Mercaptoäthanol wird bei 0°C mit 65 ml Trifluoressigsäure versetzt. Das Gemisch wird 45 Minuten bei 0°C stehengelassen. Der nach Zusatz von Diäthyläther gebildete Niederschlag wird abfiltriert, mit Diäthyläther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet.
Das erhaltene Trifluoressigsäuresalz des genannten Pentapeptids wird in 75 ml Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung wird auf eine mit Amberlite CG-400 (Acetatform) beschickte Säule der Abmessungen 2,7 x 30 cm aufgesetzt. Sodann wird mit Wasser eluiert.
Die wäßrigen Lösungen werden vereinigt, unter vermindertem Druck auf ein geringes Volumen eingeengt und lyophilisiert. Ausbeute 5,45 g (93 % d. Th.)> [α]23D -28,0+0,7° (c=1,0, Dimethylformamid).
C34H42N1208.3/2H20: C H N ber.: 51,85 5,92 20,16 gef.: 52,24 5,77 19,97.
4. Benzyloxycarbonyl-Y-tert-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-1-phenylalanyl-L-nitroarginyl-L-tryptophyl-glycin (IV) Eine Lösung von 0,42 g der Verbindung III in 5 ml Dimethylformamid wird mit 0,23 g Benzyloxycarbonyl-y-tert.-butyl-L-glutaminsäure-p-nitrophenylester versetzt. Das Gemisch wird über Nacht bei 4°C stehengelassen und sodann in etwa 50 ml Essigsäureäthylester eingetropft. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert, mit Essigsäureäthylester und Diäthyläther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Das auf diese Weise erhaltene Rohprodukt (0,47 g) wird in 10 ml Methanol gelöst und mit etwa 10 ml Wasser versetzt. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem-Druck zu einer gelatinösen Masse eingeengt. Sodann werden etwa 10 ml 0,5 m Essigsäure zugesetzt. Der Niederschlag wird abfiltriert, gründlich mit 0,5 m Essigsäure gewaschen und über Natriumhydroxidplätzchen und Phosphorpentoxid getrocknet. Man erhält 0,41 g (76 % d. Th.) reines Produkt. [α]23 D -24,8+0,7° (c=1,0, SOprozentige Essigsäure).
C51H63N13O13.H2O: C H N ber.: 56,50 6,04 16,80 gef.: 56,81 6,50 16,98.
5. y-tert. -Butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl L-tryptophyl-glycin (V) -0,70 g-der Verbindung IV werden 8 Stunden in Gegenwart von Palladium in Essigsäure hydriert. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat unter vermindertem Druck abgedampft.
Der erhaltene sirupöse Rückstand wird aus Wasser lyophilisiert und über Natriumhydroxidplätz chen und Phosphorpentoxid getrocknet. Ausbeute 0,60 g. [α]23,5D -13,3+0,5° (c=1,0, Dimethylformamid.
C43H58N1209.2CH3COOH.2H20: C H N ber.: 54,12 6,76 16,11 gef.: 54,29 6,99 16,05.
6. p-Methyoxybenzyloxycarbonyl-y-benzyl-L-glutaminsäure-p nitrophenylester (VI) Eine L8sung von 4,01 g p-Methoxybenzyloxycarbonyl-y-benzyl-L-glutaminsäure und 1,39 g p-Nitrophenol in 30 ml Essigsäureäthyl ester wird in einem Eisbad gekühlt und mit einer Lösung von 2,06 g N, N'-Dicyclohexylcarbodiimid in einer geringen menge Essigsäureäthylester versetzt. Anschließend wird das Gemisch 2 Stunden bei 4°C stehengelassen. Der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene kristalline Rückstand wird aus Äthanol umkristallisiert. Ausbeute 4,67 g (89 % d. Th.) vom F. 125 bis 126°C. [α]23,5D -15,9+0,6 (c=1,0, Essigsäureäthylester) C27H26N2O9: C H N ber.: 62,06 5,02 5,36 gef.: 62,66 4,98 5,36.
7. p-Methoxybenzyloxycarbonyl-γ-benzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-nitroarginyl-L-tryptophyl-glycin (VII) Eine Lösung von 1,17 g der Verbindung III und 0,42 ml Triäthylamin in 8 ml Dimethylformamid wird mit 1,18 g der Verbindung VI versetzt. Das Gemisch wird 24 Stunden bei 4°C stehengelassen.
Sodann wird es in 80 ml Essigsäureäthylester eingetropft. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert, mit Essigsäureäthylester und Diäthyläther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 1,77 g Rohprodukt, das in Methanol suspendiert, einige Minuten gekocht und anschließend über Nacht stehengelassen wird. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert, mit kaltem Methanol und Diäthyläther gewaschen und unter vermindertem Druck über Natriumhydroxidplätzchen und Phosphorpentoxid bei 60°C getrocknet. Ausbeute 1,84 g (87 5' d.
Th.). [α]23D -24,5#0,7°(c=1,0, Dimethylformamid)und [α]21D -21,6#1,2° (c=0,5, 50prozentige Essigsäure), c55H63N13014.1/2H20: C H N ber.: 57,99 5,66 15,98.
gef.: 57,90 5,83 16,07. I 8. tert. -Butyloxycarbonyl-γ-benzyl-L-glutamyl-L-histdyl-L-phenylalanyl-L-nitroarginyl-L-tryptophyl-glycin (VIII) Eine Lösung von 3,96 g der Verbindung III und 1,45 ml Triäthylamin in 25 ml Dimethylformamid wird mit 3,44 g tert.-Butyloxycarbonyl-y-benzyl-L-glutaminsäure-p-nitrophenylester versetzt.
Das Gemisch wird über Nacht bei 4°C stehengelassen. Sodann wird es in 250 ml Essigsäureäthylester eingetropft. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert, mit Essigsäureäthylester und Diäthyläther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet.
Man erhält 5,52 g Rohprodukt, das aus einer Mischung von Essigsäure und Methanol umgefällt wird. Ausbeute 4,92 g (90 % d. Th.).
g D4 -24,3+0,70 (c=1,0, Dimethylformamid) und fiaaD4 19,2+0,60 (c=1,0, 50prozentige Essigsäure).
C51H63N13013.H20: C H N ber. 56,50 6,04 16,80 gef.: 56,56 6,00 16,47.
9.γ-Benzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-nitroarginyl-L-tryptophyl-glycin-ditrifluoracetzt (IX) 4,90 g der Verbindung VIII und 4,9 ml 2-Mercaptoäthanol werden gründlich vermischt und in einem Eisbad gekühlt. Dieses Gemisch wird mit 50 ml Trifluoressigsäure versetzt und sodann unter gelegentlichem Schütteln 45 Minuten bei 0°C stehengelassen. Der nach Zusatz von Diäthyläther gebildete Niederschlag wird abfiltriert,mit Diäthyläther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 5,83 g. [α]23D +13,1+0,50 (c=1,0, Dimethylformamid).
C46H55N13011N2cF3coOH.2H20 C H N F ber.: 48,82 5,00 14,80 9,27 gef.: 49,65 5,32 14,60 8,81.
10. Benzyloxvcarbonvl-a-aminoisobutvrvl-L-tvrosvl-L-servl-L-methioninhvdrazid (X) Eine Lösung von 2,28 g Benzyloxycarbonyl-a-aminoisobutyryl-L-tyrosinhydrazid in 15ml im Salzsäure wird in einem Eisbad gekühlt. Die Lösung wird sodann tropfenweise mit 3,0 ml einer eiskalten 2 m Natriumnitritlösung versetzt. Das erhaltene Gemisch wird 4 Minuten gerührt. Das ausgefallene Azid wird mit eiskaltem Essigsäureäthylester extrahiert. Der organische Extrakt wird mit eiskalter 1 m Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat bei OOC getrocknet und anschließend mit einer Lösung von 1,25 g L-Seryl-L-methionin-methylester (freie Base) in 5 ml Dimethylformamid vereinigt. Das Gemisch wird 65 Stunden bei 4 0C stehen gelassen, anschließend mit 1 m Salzsäure und 1 m Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Eindampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhält man einen schaumartigen Rückstand, der wiederholt aus Essigsäureäthylester umgefällt wird. Man erhält schließlich 2,81 g des Tetrapeptidesters als amorphen Feststoff. Dieser wird sodann in 25 ml Äthanol gelöst und mit 2,4 ml Hydrazinhydrat versetzt. Nach 17stündigem Stehen bei Raumtemperatur wird der Großteil des Lösungsmittels unter vermindertem Druck abgedampft. Der erhaltene Rückstand wird in einem Gemisch aus 10 ml Wasser und 20 ml Essigsäureäthylester gelöst und die organische Phase mit zusätzlichem Wasser gewaschen. Aus dieser Lösung erhält man nach Einengen unter vermin- dertem Druck das gewünschte Hydrazid als gelatinösen Niederschlag, der durch Umfällung aus einer Mischung von Äthanol und Essigsäureäthylester gereinigt wird. Ausbeute 1,86 g (59 % d.
Th.). [α]21D -33,0#0,8° (c=1,0, 50 prozentige Essigsäure).
C29H40N6°8 C H N ber.: 55,05 6,37 13,28 gef.: 55,28 6,58 12,81.
11. Benzvloxycarbonvl-L-servl-L-norleucin-methvlester (XI) Eine Lösung von 1,00 g L-Norleucin-methylester-hydrochlorid in 2 ml Wasser wird mit 10 ml Dichlormethan und 2 ml eiskalter 50prozentiger Kaliumcarbonatlösung versetzt. Anschließend wird das Gemisch geschüttelt. Sodann wird die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet und bei einer Badtemperatur von 25 0C eingedampft. Der Rückstand wird in Dichlormethan gelöst. Die Lösung wird mit 1,20 g Benzyloxycarbonyl-L-serin und 1,03 g Dicyclohexylcarbodiimid in einer kleinen Menge Dichlormethan versetzt. Sodann wird das Reaktionsgemisch über Nacht bei 40C stehengelassen. Der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft.
Der erhaltene Rückstand wird in Essigsäureäthylester gelöst. Die Lösung wird mit 1 m Salzsäure und Sprozentiger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Nach dem Umfällen aus einer Mischung von Essigsäureäthylester und Petroläther erhält man das gewünschte Dipeptid in reiner Form. Ausbeute 1,56 g (85 5' d. Th.) vom F. 70 bis 720C. fia2D1 -19,9+0,6° (c=1,0, Methanol).
C18H26N206: C H N ber.: 59,00 7,15 7,65 gef.: 59,31 6,99 7,86.
12. Benzyloxycarbonvl-a-aminoisobutyrvl-L-tyrosvl-L-seryl-L-norleucinhydrazid (XII) 1,10 g der Verbindung XI werden in einem Gemisch aus 15 ml Methanol und 5 ml Essigsäure 90 Minuten in Gegenwart von Palladium als Katalysator hydriert. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft. Der erhaltene Rückstand wird mit Diäthyläther behandelt und abfiltriert. Man erhält 0,98 g L-Seryl-L-norleucin-methylester-acetat. 0,73 g des Dipeptidesters und 0,35 ml Triäthylamin werden in 5 ml Dimethylformamid gelöst und mit einer Lösung von Benzyloxycarbonyl-a-aminoisobutyryl-L-tyrosinazid (auf die vorstehend de Weise aus 1,24 g des Hydrazids erhalten) in Essigsäureäthylester vereinigt. Das Reaktionsgemisch wird 2 Tage bei 40C zur Umset7ung gebracht. Anschließend wird mit 1 m Salzsäure und 1 m Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene Tetrapeptidester in Form eines Sirups wird in 15 ml Äthanol gelöst und mit 1,5 ml Hydrazinhydrat versetzt. Nach 2-tägigem Stehenlassen bei Raumtemperatur wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wird in Essigsäureäthylester gelöst. Die Lösung wird mit Wasser gewaschen und sorgfältig über Magnesiumsulfat getrocknet. Der rasch ausgefallene gelatinöse Niederschlag wird abfiltriert, mit Essigsäureäthylester und Diäthyläther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 0,93 g Produkt, das nach dem Um- kristallisieren aus Äthanol 0,73 g (47 % d. Th.) des gewünschten Tetrapeptidhydrazids in reiner Form vom F. 134 bis 136°C ergibt.
[α]21D -37,9+0,8° (c=1,0, Dimethylformamid).
C30H42N6°8 C H N ber.: 58,62 6,89 13,67 gef.: 58,00 6,88 13,58.
13. Benzvloxycarbonvl-a-aminoisobutyrvl-L-tvrosvl-L-servl-L-norleucyl-γ-benzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-nitroarginsl-L-tryptophvl-glvcin (XIII) 0,46 g der Verbindung XII werden in 1,9 ml 1 m Salzsäure gelöst und mit 1 ml Tetrahydrofuran versetzt. Die Lösung wird in einem Eisbad gekühlt und tropfenweise mit 0,42. ml einer eiskalten 2 m Natriumnitritlösung versetzt. Das Gemisch wird -4 Minuten. gerührt und sodann mit eiskaltem Essigsäureäthylester extrahiert.
Der organische Extrakt wird mit eiskalter 1 m Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und bei einer Badtemperatur von 100C unter vermindertem Druck eingedampft. Das erhaltene Tetrapeptidazid wird mit einer eiskalten Lösung von 0,62 g der Verbindung IX und 0,21 ml Triäthylamin in Dimethylformamid versetzt. Das Gemisch wird sodann über Nacht bei 40C stehengelassen und anschließend in 80 ml Essigsäureäthylester eingetropft. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert, mit Essigsäureäthylester und Diäthyläther gewaschen und aus Essigsäure lyophilisiert. Man erhält 0,77 g Decapeptid.
[α]23D -33,9#0,7° (c=1,0. Dimethylformanid).
C76H93N17019.2H20: C H N ber.: 57,06 6,17 15,03 gef.: 57,70 6,30 14,70.
14. N@-tert. -Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-NE-tert.-butyloxvearbonyl-L-lysyl-Nt-tert.-butyloxycarbonyl L-lysyl-L-arginyl-L-argininamid-dihydrochlorid (XIV) 0,48 g Nα-Benzyloxycrbonyl-N@-tert. -butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N@-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N@-tert. -butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-argininamid-acetat (hergestellt gemäß Bull. Chem. Soc. Japan, Bd. 39 (1966), S. 882) werden 2 1/2 Stunden in Gegenwart von Palladium in Methanol hydriert. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in 5 ml Wasser gelöst und mit 0,17 ml Triäthylamin versetzt. Die erhaltene Lösung wird in Eis gekühlt und nach Zugabe von 0,6 ml 1 m Salzsäure zum gewünschten Hydrochlorid lyophilisiert. Das erhaltene Produkt wird unter vermindertem Druck über Natriumhydroxidplätzchen und Phosphorpentoxid 2 Stunden bei 60°C getrocknet. Man erhält 0,52 g Produkt.
15. a-Aminoisobutvrvl-L-tvrosvl-L-servl-L-norleucvl-L-lutamvl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-argininamid (XV). /Ibu1. Nle4J-ACTHC1-18)-NH2 Eine Lösung von 158 mg der Verbindung XIII und 46 mg N-Hydroxysuccinimid in 2 ml Dimethylformamid wird mit 83 mg N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Das erhaltene Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Sodann wird eine Lösung von 141 mg der Verbindung XIV und 0,028 ml Triäthylamin in 2 ml Dimethylformamid zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 3 Tage bei 40C stehengelassen und sodann in ein Gemisch aus Essigsäureäthylester und Diäthyläther (1 : 1 Volum- teile) gegeben. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert, mit Essigsäureäthylester und Diäthyläther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 242 mg des geschützten Octadecapeptids als Rohprodukt.
412 mg des rohen geschützten Peptids werden in 20 ml flüssigem Fluorwasserstoff zusammen mit 100 mg Methionin und 0,4 ml Anisol gelöst. Sodann wird das Gemisch 75 Minuten bei 0 0C gerührt und unter vermindertem Druck bei 0 0C eingedampft. Der Rückstand wird in 15 ml eiskaltem Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit Essigsäureäthylester gewaschen und sodann auf eine mit Amberlite CG-400 (Acetatform) beschickte Säule der Abmessungen 1,7 x 20 cm aufgesetzt. Die Säule wird mit Wasser eluiert. Die wäßrigen Lösungen werden vereinigt und bei einer Badtemperatur von 50 bis 600C unter vermindertem Druck eingedampft. Nach dem Lyophilisieren des Rückstands erhält man 507 mg des Octadecapeptids, von dem die Schutzgruppen entfernt sind.
507 mg des rohen Peptids werden in 10 ml Wasser gelöst und säulenchromatographisch (1,7 x 40 cm) an Carboxymethylcellulose (Trockengewicht 11,25 g, Serva 0,63 inÄq/g) gereinigt, wobei insgesamt 2000 ml Ammoniumacetatpuffer vom pH-Wert 6,0 als Elutionsmittel verwendet werden. Dieser Puffer wird in einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 0,6 m eingesetzt. Fraktionen von jeweils 10 ml Volumen 1xerden gesammelt, wobei die Absorption bei 280 nm spektrophotometrisch gemessen wird. Die maximum Fraktionen, die einem Haupt/ entsprechen, werden vereinigt und bei einer Badtemperatur von 50 bis 600C eingedampft. Der Rückstand wird lyophilisiert und unter vermindertem Druck über Natriumhydroxidplätzchen und Phosphorpentoxid getrocknet. Man erhält 221 mg Produkt.
Das partiell gereinigte Octadecapeptid (221 mg)wird anschließend säulenchromatographisch (2,3 x 46 cm) an Sephadex G-25 (medium, Trockengewicht 50 g) gereinigt. Als Elutionsmittel wird dabei ein Gemisch aus 1~Butanol/Essigsäure/Pyridin/Wasser (12 : 3 : 4 : 6 Volumteile) verwendet. Fraktionen von jeweils 6 ml werden aufgefangen und nach dem Folin-C1ocalteu-Verfahren auf ihren Peptidgehalt untersucht.
Die Fraktionen 12 bis 15 und 16 bis 40 werden gesondert verjeweils einigtitmter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 45 bis 50C eingedampft und lyophilisiert. Man erhält 43 mg F-1 und 91 mg F-2. F-1 wird auf die vorstehend beschriebene VEeise an Sephadex rechromatographiert, wobei die Fraktionen 16 bis 30 vereinigt werden und 13 mg F-1-2 ergeben. F-2 und F-1-2 wel den vereinigt und genau auf die vorstehend beschriebene Weise chromatographiert. Die Fraktionen 16 bis 40 werden vereinigt, unter vermindertem Druck eingedampft und zu 89 mg Produkt lyophilisiert.
Das so erhaltene Peptid wird schließlich auf eine mit Carboxymethylcellulose (Merck CM-52) beschickte Säule der Abmessungen 1,7 x 35 cm aufgesetzt und mit insgesamt 1200 ml Ammoniumacetatpuffer vom pH-Wert 6,0 eluiert, wobei ein linearer Konzenrationsgradient von 0,1 bis 0,6 m eingehalten wird. Es werden jeweils Fraktionen von 8 ml Volumen gesammelt. Die Fraktionen, die einem Hauptmaximum entsprechen (Fraktionen 139 bis 160) werden vereinigt, eingedampft, lyophilisiert und über Natriumhydroxidplätzchen und Phosphorpentoxid unter vermindertem Druck getrocknet, Man erhält 62-mg des gewünschten Octadecapeptids.
[α]22D -57,2+1,8° (c=0,55, 0,1 m Essigsäure). Dieses Produkt ergibt bei der Dünnschichtchromatographie an Cellulose F (erz) mit 1-Butanol/Esigsäure/Pyridin/Wasser (15 : 3 : 10 : 15 Volumteile) als. Laufmittel einen einzigen Flecken.
Beispiel C α-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-Ll-seryl-L-norleucyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanvl-L-arginsl-L-tryptophyl-glyCyl-L L-prolyl-L-yalyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysinamid [Ibu1.Nle4,Lys 17,18]-ACTH(1-18)-NH2 155 mg Na-BenzylOxyearbonyl-Nf-tert.-butyloxyearbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-tri(N@-tert-butyloxycarbonyl-L-lysyl)-N@-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysinamid werden 3 Stunden in Methanol in Gegenwart von Palladium als Katalysator hydriert. Der nach dem Eindampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhaltene Rückstand wird über Natriumhydroxidplätzchen und Phosphorpentoxid unter vermindertem Druck getrocknet. 143 mg des erhaltenen Na -ungeschützten Octapeptids werden zusammen mit 158 mg der gemäß Beispiel B erhaltenen Verbindung XIII und 54 mg 1-Hydroxybenzotriazol in 2 ml Dimethylformamid gelöst. Das Gemisch wird in einem Eisbad gekühlt ud mit einer Lösung von 82,5 mg Dicyclohexylcarbodiimid in 1 ml Dimethylformamid versetzt. Das erhaltene Gemisch wird 3 Tage bei 4°C stehengelas sen und sodann-in 100 ml eines Gemisches aus Essigsäureäthylester und Diäthyläther (1 : 1) gegeben. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert, mit Essigsäureäthylester und Diäthyläther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 259mg geschütztes Octadecapeptid in Form eines Rohproduktes.
413 mg des rohen, geschützt-en Peptids werden zusammen mit 100 mg Methionin und 0,4 ml Anisol in etwa 2Q ml flüssigem Fluorwasserstoff gelöst. Das Gemisch wird 75 Minuten bei 0°C gerührt und anschließend bei 0 0C unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in 15 ml eiskaltem-Wasser gelöst.
Die erhaltene Lösung wird mit Essigsäureäthylester gewaschen und sodann auf eine mit Amberlite CG-400 (Acetatform) beschickte Säule der Abmessungen 1,7 x 20 cm aufgesetzt, welche mit Wasser eluiert wird. Die wäßrigen Lösungen werden vereinigt und unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von .50 bis 600C eingedampft. Nach dem Lyophilisieren des Rückstands erhält man 512 mg des von der Schutzgruppe befreiten Octadecapeptids in Form eines Rohprodukts.
Dieses rohe Peptid (512 mg) wird anschließend in 10 ml Wasser an gelöst und/einer mit Carboxymethylcellulose vom Trockengewicht 11,25 g (Serva 0,63 mÄq/g) beschickten Säule der Abmessungen 1,7 x etwa 40 cm chromatographiert, wobei insgesamt 2000 ml Ammoniumacetatpuffer vom pH-Wert 6,0 zur Elution in Form eines linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 0,6 m verwendet werden. Fraktionen von jeweils 10 ml Volumen werden gesammelt, wobei die Extinktion bei 280 nm gemessen wird. Die Fraktionen, die einem Hauptmaximum entsprechen, werden vereinigt und bei einer Badtemperatur von 50 bis 600C unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird lyophilisiert und unter vermindertem Druck über Natriumhydroxidplätz chen und Phosphorpentoxid getrocknet.
Die erhaltenen 242 mg des teilweise gereinigten Octadecapeptids werden anschließend der Verteilungschromatographie an einer mit Sephadex G-25 (medium, Trockengewicht 50 g) beschickten Säule der Abmessungen 2,7 x 30 cm unterworfen, wobei 1-Butanol/Essigsäure/Pyridin/Wasser (12:3:4:6 Volumteile) als Lösungsmittel verwendet wird. Fraktionen von jeweils 6 ml Volumen werden gesammelt und gemäß dem Folin-Ciocalteu- Verfahren untersucht. Die Fraktionen 12 bis 18 und 19 bis 60, die zwei Maxima entsirechen, werden gesondert vereinigt, unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 45 bis 50 0c eingedampft und lyophilisiert. Man erhält 64 mg F-1 und 170 mg F-2. F-2 wird genau auf die vorstehend beschriebene Weise an Sephadex rechromatographiert. Die Fraktionen 19 bis 60 werden vereinigt, eingedampft und lyophilisiert.
Die 120 mg des auf diese WeIse erhaltenen Peptids werden schließlich an einer mit Carboxymethylcellulose (Merok CM-52) beschickten Säule der Abmessungen 1,7 x 35 cm gereinigt, wobei insgesamt 1200 ml Ammoniumacetatpuffer vom pH-Wert 6,0 unter Einhaltung eines linearen Konzentrationsgradienten von 0,1 bis 0,6 m verwendet werden. Fraktionen von jeweils 8 ml Volumen xTerden gesammelt. Die einem Hauptmaximum entsprechenden Fraktionen 131 bis 165 werden vereinigt, eingedampft und lyophilisiert. Man erhält 106 mg des gewünschten Octadecapeptids in reiner Form. EaJ22 -68, 2+2, 1° (c=0,5, 0,1 m Essigsäure). Bei der Dünnschichtchromatographie an Cellulose F, (Merck) unter Verwendung von 1-Butanol/Essigsäure/Pyridin/Wasser (15 zu 5 : 3 : 10 : 15 Volumteile) als Laufmittel verhält sich das Produkt bei Ent:wicklung mit Ninhydrinreagens und Ehrlich-Reagens einheitlich.
3 e i 5 p i e 1 1 mg [Ibu1, Lys 17,18]-ACTH (1-18)-NH2-acetat wird in 1 ml einer 20 mg Zinkchlorid enthaltenden wäßrigen Lösung gelöst. Ferner wird eine Lösung von 18 mg Natriumchlorid und 2 ¢g Benzylalkohol in 1 ml einer 40 millimolaren Dinatriumhydrogenphosphatlösung hergestellt. Die beiden Lösungen werden vereinigt, wodurch eine Suspension des Octadecapeptid-Zink-Komplexes erhalten wird.
Beispiel E 0,2 ml einer 20 mg/ml enthaltenden wäßrigen Lösung von [ibu1,Nle4]-ACTH(1-18)-NH2-acetat werden mit 0,8 ml einer 100 millimolaren wäßrigen Zinkchloridlösung und 22 ml einer 1,41 mg/ml enthaltenden wäßrigen Lösung von L-Histidyl-L-histidin versetzt.
Nach Zugabe von 0,04 ml Benzylalkohol und 0,8 ml einer 100 millimolaren Dinatriumhydrogenphosphatlösurig wird das Gemisch zu einer Suspension verrührt. Nach Einstellen des pH-Wertes der Suspension auf etwa 7,0 mit 1 n Natriumhydroxidlösung erhält man das gewünschte Produkt.
Beispiel F 2 mg [Ibu1,Nle4,Lys 17,18]-ACTH (1-18)-NH2-acetat werden in 0,2 ml destilliertem Wasser gelöst. Diese Lösung wird mit 0,3 ml einer wäßrigen, 2 mg Poly-L-asparaginsäure (Molekulargewicht etwa 3000) enthaltenden Lösung, die vorher mit 0,1 n Natriumhydroxidlösung neutralisiert worden ist, versetzt, wodurch eine Suspension entsteht. Anschließend wird die Suspension mit 9 mg Natriumchlorid und 0,5 ml eines 1/15 m Natriiimd'ihydrogenphosphat/ Kaliun0dihydrogenphösphatpuffers vom ph-Wert 6,8 versetzt, wodurch der gewünschte Komplex erhalten wird.

Claims

Patentanst>rüche

1. α-Aminoisobuttersäure-corticotropinpeptide nach Hauptpatent , (Patentanmeldung P 21 12 553.1-42) der allgemeinen Formel α-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-sertyl-X-L-glutamyul-L-histidyl L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophylWglycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-Y in der (a) X die L-Methionylgruppe und Y die L-Lysyl-L-lysinamidgruppe bedeutet oder (b) X die L-Norleucylgruppe und Y die L-Lysyl-L-lysinamidgruppe oder L-Arginyl-L-argininamidgruppe bedeutet, sowie deren Salze mit Säuren und Komplexe.

2. a-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-gluta myl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptóphyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysin amid.

3. a-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutamyl L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginin amid.

4, α-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-sertyl-L-norleucyl-L-glutamyl L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysinamid.

5. Verfahren zur Herstellung der 1-a-Aminoisobuttersäurecorticotropinpeptide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein geschütztes Decapeptid der allgemeinen Formel R1 -a-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-X-y-R2-L-glutamyl L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin und in der R1 eine Aminoschutzgruppe/ R2 eine Carboxylschutzgruppe bedeutet und X die gleiche Bedeutung wie in Anspruch 1 hat, mit einem geschützten Octapeptid der allgemeinen Formel N R3-L-Lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N-R4-L-lysyl-N-R5-L-lysyl-Y' in der R3, R4 und R5 jeweils eine Aminoschutzgruppe und Y' den Rest N6-R6-L-Lysyl-N-R7-L-lysinamid oder-L-Arginyl-L-argininamid bedeutet, umsetzt, die Schutzgruppen vom erhaltenen Octadecapeptid der allgemeinen Formel R1-a-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-X-y-R2-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-N@-R3-L-lysyl-L-rolyl-L-valyl-glycyl-N@-R4-L-lysyl-N@-R5-L-lysyl-Y' in der die einzelnen Symbole die vorstehend angegebene Bedeutung haben, entfernt, und gegebenenfalls das erhaltene, von Schutzgruppen befreite Octadecapeptid in an sich bekannter Weise in Salze mit Säuren oder Komplexe überführt.

6. Verfahren zur Herstellung von a-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysinamid sowie dessen Salzen mit Säuren oder Komplexen, dadurch gekenn- zeichnet, daß man ein geschütztes Decapeptid der allgemeinen Formel R1-a-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-y-R2-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophylglycin in der R1 eine Aminoschutzgruppe und R2 eine Carboxylschutzgruppe bedeutet mit einem geschützten Octapeptid der allgemeinen Formel N£- R3 L-Lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N;-R4-L-lysyl-N£-R5-L-lysyl-n@-R6-L-lysyl-N@-R7-L-lysinamid in der R3, R4, R5, R6 und R7 jeweils eine Aminoschutzgruppe bedeuten, umsetzt, und die Schutzgruppen vom erhaltenen Octadecapeptid der allgemeinen Formel R1--Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-y-R2-L-glutamyl-L-hi stidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl glycyl-N@-R3-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N@-R4-L-lysyl-N@-R5-L-lysyl-N@-R6-L-lysyl-N@-R7-L-lysinamid in der die einzelnen Symbole die vorstehend angegebene Bedeutung haben, entfernt und gegebenenfalls das von den Schutzgruppen befreite Octadecapeptid in an sich bekannter Weise in Salze mit Säuren oder Komplexe überführt.

7. Verfahren zur Herstellung von a-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutamyl-L histidyl-L-.phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glyCyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-argininamid sowiedessen Salzen mit Säuren oder Komplexen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein geschütztes Decapeptid der allgemeinen Formel R1 -a-Arninoisobütyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-y-R2-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophylglycin in der R1 eine Aminoschutzgruppe und R2 eine Carboxylschutzgruppe bedeutet, mit einem geschützten Octapeptid der allgemeinen Formel N@-R3-L-Lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N@-R4-L-lysyl-N@-R5-L-lysyl-L-arginyl-L-argininamid in der R3, R4 und R5 jeweils eine Aminoschutzgruppe bedeuten, umsetzt und die Schutzgruppen vom erhaltenen geschUtzten Octadecapeptid der allgemeinen Formel R1 -a-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-y-R2-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl glycyl-N@-R3-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N@-R4-L-lysyl N@-R5-L-lysyl-L-arginyl-L-argininamid in der die einzelnen Symbole die vorstehend angegebene Bedeutung haben, entfernt, und gegebenenfalls das erhalten., von Schutzgruppen befreite Octadecapeptid in an sich bekannter Weise in Salze mit Säuren oder Komplexe überführt.

8. Verfahren zur Herstellung von «-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysinamid sowedessen Salz-mit Säuren oder Komplexen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein geschütztes Decapeptid der allgemeinen Formel R1-a-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-y-R2- L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-trypto phylglycin in der R1 eine Aminoschutzgruppe und R2 eine Carboxylschutzgruppe bedeutet, mit einem geschützten Octapeptid der allgemeinen Formel N@-R3-L-Lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N@-R4-L-lysyl-N@-R5-L-lysyl-N@-R6-L-lysyl-N@-R7-L-lysinamid in der R3, R4, R5, R6 und R7 jeweils eine Aminoschutzgruppe bedeuten, umsetzt, vom erhaltenen geschützten Octadecapeptid der allgemeinen Formel R1 -a-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-y-R2-L glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophylglycyl-N@ R3-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N@-R4-L-lysyl N@-R5-L-lysyl-N@-R6-L-lysyl-N@-R7-L-lysinsmid in der die einzelnen Symbole die vorstehend angegebene Bedeutung haben, die Schutzgruppen entfernt und gegebenenfalls das erhaltene, von Schutzgruppen befreite Octadecapeptid in an sich bekannter Weise in Salze mit Säuren oder Komplexe überführt.

9. Arzneipräparate, bestehend aus einer Verbindung nach Anspruch 1 und üblichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmit- -teln und/oder Hilfsstoffen.