DE2055141A1 - Polypeptidverbindungen und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents
Polypeptidverbindungen und Verfahren zu ihrer HerstellungInfo
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Description
DR.-ING. VON KREJSLER DR.-i NG. SCHÖ N WALD
DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL-CHEM. ALEK VON KREISLER DIPL-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLÖPSCH
KÖLN 1, DEICHMANNHAUS
Köln, den 5.11.1970 Kl/Ax
27t Doshomachi 2-chome, Higashi-ku, Osaka (Japan).
und Verfahren zu ihrer Herstellung
Die Erfindung betrifft neue Polypeptide und ein Verfahren zu ihrer Herateilung, insbesondere Polypeptide, die
mit dem adenokrotikotropen Hormon verwandt sindi sowie
ein großtechnisch durchführbares Verfahren zu ihrer Herstellung.
Im Schema und in der vorliegenden Beschreibung bedeuten Sar, Albu, Tyr, Ser, Met, GIu, His, Phe, Arg, Try, GIy,
Lys, Pro und VaI jeweils den Rest von Sarcosin, a-Aminoisobuttersäure,
L-Tyrosin, L-Serin, L-Methionin, L-Glutaminsäure,
L-Histidin, !-Phenylalanin, L-Arginin, L-Tryp- M
tophan, Glycin, L-Lysin, L-Prolin und L-Valin. Der oben
genannte Ausdruck "Rest" bezeichnet einen Rest, der von der entsprechenden α-Aminosäure durch Eliminierung der
-OH-Gruppe der Carboxylgruppe und des Wasserstoffs der a-Aminogruppe abgeleitet ist. Geht man beispielsweise von
L-Lysin (CH2(NH2)(CIi5)CHNH2COOH) aus und stellt L-Lysin
durch die Formel NH2-A-COGH dar (wobei NH2 ein a-Aminorest
ist), so wird der Rest -NH-A-CO- als "Rest von L-LysinM
bezeichnet und als "Ly3" abgekürzt. Die Abkürzungen für die anderen oben genannten α-Aminosäuren haben die gleiche
Bedeutung, wie vorstehend an Hand von L-Lysin erläutert,
109821/2242
Die Erfindung ist auf Polypeptidverbindungen der folgenden allgemeinen Formel (I) gerichtet:
X-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-P
(worin X für Sarcosyl oder oc-Aminoisobutyryl und P für
ProOH, Pro-ValOH, Pro-Val-IysOH, Pro-Val-Lys-ValOH,
Pro-Val-Lys-Val-TyrOH oder Pro-Val-Lys-Val-Tyr-ProOH steht.
Die Erfindung umfaßt ferner die nicht substituierten Amide, die physiologisch unbedenklichen Säureadditionssalze
und Schwermetallkomplexe dieser Polypeptidverbindungen, Der Ausdruck "nicht substituiertes Amid" bezeichnet
im Rahmen dieser Beschreibung, Beispiele und Ansprüche "ein Polypeptid, dessen C-endständige Carboxylgruppe
aminiert, d.h. in -CONH2 umgewandelt ist1*.
Die Endprodukte gemäß der Erfindung sind neue Polypeptide, die'; sich durch ihre adrenokortikotropen Wirkung überaus
gut als Medikamente oder Arzneimittel in der Veterinärmedizin eignen. Insbesondere sind die Metallkomplexverbindungen
der Peptide herausragend in Bezug auf die Wirkungsdauer und die geringe Löslichkeit. Die Verbindungen gemäß
der Erfindung eignen sich ferner als Zwischenprodukte für die Herstellung von Arzneimitteln, die eine längere Kette
von Aminosäuren enthalten.
Die neuen Polypeptide werden nach dem für die Herstellung bekannten Verfahren hergestellt. Zu diesem Zweck können
die Aminosäuren in der oben genannten Reihenfolge verknüpft werden. Die neuen Polypeptide werden somit hergestellt,
indem man Sarcosin, oc-Aminoisobuttersäure oder
ein Peptidfragment, das X enthält, in der oben genannten Reihenfolge (wobei die C-endständige Carboxylgruppe aktiviert
ist) mit einem Polypeptidfragment umsetzt, das dem Rest der oben genannten Arainosäurefolge entspricht, während
etwaige funktioneile Gruppen, die an der Reaktion nicht teilnehmen, zweckmäßig geschützt werden.
1/2242
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Die C-endständige Carboxylgruppe von Sarcosin, oc-Aminoisobuttersäure
oder einem X enthaltenden Peptidfragment kann beispielsweise durch Bildung eines Säureanhydrids, durch
Bildung eines gemischten Anhydrids durch Umsetzung mit einem Derivat einer sterisch gehinderten organischen Säure,
z.B. Pivaloylchlorid, oder mit einem Kohlensäurederivat, z.B. Äthylchlorformiat, oder durch Bildung eines aktiven
Esters, z.B. eines Nitrophenylesters, z.B. des p-Nitrophenylesters,
oder eines chlorierten Phenylesters, z.B.
des Pentachlorphenylesters und 2,4,5-Trichlorphenylesters,
oder durch Bildung eines Azids oder durch Verwendung eines g
Kondensationsmittels, z.B. NjN'-Dicyclohexylcarbodiimid
oder Ν,Ν'-Carbonyl-bis-imidazol, aktiviert werden.
Etwaige freie funktioneile Gruppen, die an der Reaktion nicht teilnehmen, werden zweckmäßig geschützt, insbesondere
durch Radikale, die sich durch Hydrolyse-oder Reduktion
leicht entfernen lassen.
Beispielsweise sind für die N-endständige a-Aminogruppe
von L-Sarcosin oder a-Amino-isobuttersäure schützende Substituenten wie die Benzyloxycarbonylgruppe, die tertiäre
Butoxycarbonylgruppe, die tertiäre Amyloxycarbonylgruppe und p-Methoxyphenylsulfonyl zu empfehlen. Hiervon
werden die Benzyloxycarbonylgruppe und die tertiäre "
Butoxycarbonylgruppe besonders bevorzugt.
Als schützender Substituent für die £-Aminogruppe von
L-Lysin eignen sich beispielsweise Benzyloxycarbonyl, tert.-Butoxycarbonyl und Chlorbenzyloxycarbonyl. Besonders
bevorzugt hiervon werden Benzyloxycarbonyl und tert.-Butoxycarbonyl.
Die C-endständige Carboxylgruppe des oben genannten "Polypeptidfragments, das dem Rest der Aminosäurefolge
entspricht", kann mit an sich bekannten schützenden Substituenten
geschützt werden, z.B. durch einen niederen Alkylrcst (z.B. Methyl··und tert.-Butyl) und einen Aralkyl-
1 Γ)
BAD ORIGINAL
2055H1
rest (iz.B. Benzyl).
Als schützender Substituent zum Schutz der Guanidingruppe
von L-Arginin eignen sich beispielsweise die Nitrogruppe und Torylgruppe, wobei die Nitrogruppe besonders bevorzugt
wird. Die Guanidingruppe von L-Arginin kann durch Anlagerung von Chlorwasserstoff an die Guanidingruppe
geschützt werden.
Zum Schutz der γ-Aminogruppe von L-Glutaminsäure eignen
sich schützende Substituenten wie tert.-Butyl, Benzyl u.dgl., jedoch kann die γ-Carboxylgruppe von L-Glutaminsäure
oder die Guanidingruppe von L-Arginin während der Reaktion ungeschützt bleiben.
Die durch die Kondensationsreaktion erhaltenen Polypeptide enthalten in ihrem Molekül im allgemeinen geschützte Aminogruppen
und geschützte Carboxylgruppen. Die Umwandlung einer geschützten Aminogruppe in eine freie Gruppe und
die Umwandlung einer geschützten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe erfolgt in bekannter Weise durch
Behandlung mit einem hydrolysierenden Mittel (z.B. Fluorwasserstoff und Trifluoressigsäure) oder mit einem Reduktionsmittel
(z.B. Natriummetall in Gegenwart von flüssigem Ammoniak).
Zur Bildung von Peptidbindungen gemäß der Erfindung sind alle vorstehend genannten Verfahren geeignet, jedoch sind
die in den Beispielen beschriebenen Verfahren besonders vorteilhaft.
Wie bereits erwähnt, gibt es verschiedene Möglichkeiten zur Synthetisierung der Polypeptide gemäß der Erfindung.
Bei einem dieser Verfahren wird beispielsweise ein geschütztes Derivat eines Tripeptids der Formel
X-Tyr-SerOH (worin X die oben genannte Bedeutung hat, die
C-endständige Carboxylgruppe von L-3erin aktiviert und
die nicht an der Reaktion teilnehmende freie f unktior.elle Gruppe geschützt ist) mit einem geschützten Derivat eineu
109R21/22A?
Polypeptids der Formel
H-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-P'-NH2
(worin P1 für ProOH, Pro-ValOH, Pro-Val-LysOH,
Pro-Val-Lys-ValOH, Pro-Val-Lys-Val-TyrOH und
Pro-Val-Lys-Val-Tyr-ProOH steht und etwaige funktioneile
Gruppen, die nicht an der Reaktion teilnehmen, geschützt sind), seinem nicht substituierten Amid oder einem entsprechenden
Säureadditionssalz kondensiert, worauf die schützenden Substituenten entfernt werden.
Bei diesem Verfahren wird die C-endständige Carboxylgruppe ä
von L-Serin vorzugsweise durch Bildung eines aktiven Esters, durch Bildung eines Azids oder durch Verwendung
eines Kondensationsmittels aktiviert, und nach der Kondensationsreaktion werden die geschützten Amino- und Carboxylgruppen
des so gebildeten Kondensats durch Verwendung von Fluorwasserstoff freigesetzt.
Bei diesem Verfahren wird ein erfindungsgemäßes Tricosapeptid
gemäß der folgenden Tabelle 1 gebildet. In dieser Beschreibung bezeichnet die Abkürzung "Z" die Carbobenzyloxygruppe
und die Abkürzung 11BOC" die tertiäre Butoxycarbonylgruppe,
*und OtBu stellt die durch eine tertiäre Butylgruppe geschützte γ-Carboxylgruppe von L-Glutamin- ^j
säure dar.
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Z-Sar-Tyr-Ser-N +
I 2 I I
H^et-Glu-Hia-Phe^-Arg-Try-Gly-Lys-Prc-Val-Gly-Lys-Z
N02N02 Z
1 l r ' »
lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-VaI-Tyr-HH2
I ?02 Z
> .... I 2 I
^Sar-Tyr-Ser-'Met-Glü-Hie-ihe-Al'g-Try-Gly-Lys-Pror-
2 3 NO5 NO9 ζ
III I
III I
Val-Gly-Lys—Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-VaI-Tyr-NH
HP
H-Sar-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val
Gly-Lye-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-VaI-Tyr'
Hierin hat X die oben genannte Bedeutung. Das in Tabelle 1 genannte Tripeptidderivat kann beispielsweise durch die
in Tabelle 2 dargestellte Synthese hergestellt werden, und ♦.das Heneicosapeptid kann beispielsweise nach dem Verfahren
hergestellt werden,das Gegenstand der holländischen Patentanmeldung
18 811/1968 ist.
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Tabelle 2
Z-Sar-N + TyrOCH
Z-Sar-N + TyrOCH
Z-Sar-TyrOOH
+ H-Ser-OGH
Z-Sar-Tyr-SerOCH
H-Sar-Tyr-Ser-N
Die Herstellung der Polypeptidverbindungen gemäß der Erfindung
ist auch möglich durch Kondensationsreaktion zwischen einem geschützten Derivat eines Tetrapeptids
der Formel X-Tyn-Ser-Met (worin X die oben genannte Bedeutung hat, die nicht an der Reaktion teilnehmende
funktioneile Gruppe geschützt und die C-endständige Carboxylgruppe von L-Methionin aktiviert ist) und einem geschützten
Derivat eines Polypeptids von H-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-P1
(worin P1 die oben genannte Bedeutung hat und etwaige nicht an der
Reaktion teilnehmende funktionelle Gruppen geschützt sind^
seinem nicht substituierten Amid oder einem entsprechenden Säureadditionssalz dieses Derivats und anschließende
Freisetzung der geschützten Amino- und Carboxylgruppen. Natürlich kann das erhaltene freie Polypeptid in ein
physiologisch verträgliches Säureadditionssalz oder einen Schwermetailkomplex umgewandelt werden.
Bei diesem Verfahren wird die C-endständige Carboxylgruppe von L-Methionin vorzugsweise durch Bildung eines aktiven
Esters, durch Bildung des Azids oder durch Verwendung eines Kcnden.;ationsir;ittels aktiviert, und nach der Kondensationsreaktion
werden die geschützten Amino- und Carboxylgruppen des so hergestellten Polypeptids durch Ver-
1fir-, , . . ,t , , „ BAD ORIGINAL
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Wendung von Trifluoressigsaure oder Fluorwasserstoff freigesetzt.
Bei diesem Verfahren wird ein Tetracosapeptid gemäß der Erfindung auf die in Tabelle 3 dargestellte
Weise gebildet.
BOC-X-Tyr-Ser-Met-N, +
OtBu BOC BOC
I Il
H-ßlu-His-Phe-Arg-Tyr-Grly-Ly s-Pr o~Val-Gly-Ly s-Ly s-
BOC
Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OtBu
OtBu BOC
b-Glu-I
BOC-X-Tyr-Met-Glu-His-Phe-Arg-Tyr-Gly-Lys-Pro-Val-
BOC BOC BOC
I I I
GrIy-Ly s-Lys-Arg-Arg^Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pr o-OtBu
CP3COOH
X-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lya-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Ärg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Iyr-ProOH
(In der vorstehenden Tabelle bedeutet Pro-OtBu, daß die
Carboxylgruppe durch eine tertiäre Butylgruppe verestert ist.)
Nach dem Verfahren gemäß der Erfindung können Polypeptide auch hergestellt werden durch Umsetzung eines geschützten
Derivats eines Decapeptids der Formel X-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-GlyOH
(worin X die oben genannte Bedeutung hat, die nicht an der Reaktion teilnehmenden freien funktionellen
Gruppen durch schützende Substituenten geschützt sind und die C-endständige Carboxylgruppe von Glycin aktiviert
ist) mit einem geschützten Derivat eines Polypeptids
der Formel H-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-P1 (worin P1
für ProOH, Pro-ValOH, Pro-Val-LysOH, Pro-Val-Iys-ValOH,
Pro-Val-Lys-Val-TyrOH und Pro-Val-Lys-Val-Tyr-ProOH steht
und etwaige nicht an der Reaktion teilnehmende funktionelle
Gruppen durch schützende Substituenten geschützt sind), einem nicht substituierten Amid oder einem entsprechenden
Säureadditionssalz dieses Derivats und durch Entfernung der schützenden Gruppen von dem so gebildeten
Polypeptid.
Bei diesem Verfahren wird die C-endständige Carboxylgruppe
von Glycin vorzugsweise durch Bildung eines aktiven Esters, ™
durch Bildung des Azids, durch Verwendung eines Kondensationsmittels, durch Bildung eines aktiven Säureanhydrids
oder eines gemischten Anhydrids aktiviert. Nach der Kondensationsreaktion
werden die geschützten Amino- und Carboxylgruppen des so gebildeten Kondensats durch Verwendung
von Trifluoressigsäure oder Fluorwasserstoff freigesetzt.
Bei diesem Verfahren werden die Polypeptide gemäß der Erfindung auf die in Tabelle 5 dargestellte Weise
gebildet.
OtBu H HCl
I- I θ
BOC-Sar-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Tyr-Gly-O φ
Z BOC BOC BOC
ΘΘ I Il I
Cl H2-L·ys-Pro-Val-(rly-Ly^-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-VaI-NH2
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Tabelle 5 (Forts.)
OtBu H φ BOC
BOG-Sar-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-irg-Tyr-Gly-Lys-Pro-
ci eci θ
BOC BOC H e H φ BOC
!ill i
VaI-GIy-LyS-LyS-ATg-ATg-PrO-VaI-LyS-VaI-IiH2
CP-COOH
H-Sar-Tyr-Ser-^iet-Glu-His-Phe-Arg-Tyr-Gly-Lys-Pro-
Beispiele des oben genannten "entsprechenden Säureadditionssalzes"
sind die anorganischen Säureadditionssalze (z.B. das Hydrochlorid und Sulfat) und die organischen
Säureadditionssalze (z.B. das Acetat und Fqrtniat).
Säureadditionssalze (z.B. das Acetat und Fqrtniat).
Die Kondensationsreaktion wird im allgemeinen in Gegenwart eines Lösungsmittels durchgeführt. Als Lösungsmittel eignen
sich beispielsweise Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxyd, die wasserfrei oder hydratisiert sein können,
und Gemische dieser Lösungsmittel beispielsweise mit
Chloroform, Dioxan, Diehlormethan oder Tetrahydrofuran. Die Reaktionstemperatur liegt im allgemeinen im Bereich von etwa -20° bis 300C, jedoch kann während der Reaktion auch erhitzt oder gekühlt werden.
Chloroform, Dioxan, Diehlormethan oder Tetrahydrofuran. Die Reaktionstemperatur liegt im allgemeinen im Bereich von etwa -20° bis 300C, jedoch kann während der Reaktion auch erhitzt oder gekühlt werden.
Die beiden Materialien, die zwischen sich eine Amidobindung bilden sollen, werden im allgemeinen in stöehiometrischen
Mengen verwendet, jedoch können die Mengenverhältnisse nach Belieben verändert werden. Im allgemeinen
werden in Fällen, in denen das Peptidfragment auf der
N-endständigen Seite verhältnismäßig klein ist, bessere Ausbeuten und Ergebnisse erhalten, wenn dieses Fragment im überschuss verwendet wird.
N-endständigen Seite verhältnismäßig klein ist, bessere Ausbeuten und Ergebnisse erhalten, wenn dieses Fragment im überschuss verwendet wird.
Nach beendeter Reaktion' kann das Endprodukt nach an sieh
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2055ΗΊ
bekannten Verfahren isoliert werden.
Je nach den Reaktionsbedingungen werden die neuen Verbindungen in Form einer Base oder eines Salzes erhalten.
Aus diesem Salz kann die Base in üblicher Weise gebildet werden, und die Basen können mit therapeutisch unbedenklichen
Säuren zur Bildung der entsprechenden Salze umgesetzt werden. Als Säuren eignen sich anorganische
Säuren, z.B. Halogenwasserstoffsäuren (z.B. Salzsäure und Bromwasserstoffsäure), Perchlorsäure, Salpetersäure,
Thiocyansäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure),und anorganische Säuren, z.B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure,
Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure,
Anthranilsäure, Zimtsäure, Naphthalinsulfοnsäure
und Sulfanilsäure.
Das auf diese Weise erhaltene Endprodukt kann nach an sich bekannten Verfahren in Metallkomplexverbindungen
umgewandelt werden. Beispielsweise wird eine wässrige Lösung des in der oben .beschriebenen Weise hergestellten
Polypeptids mit einem Salz oder dem Hydroxyd oder Oxyd eines oder mehrerer der Metalle Kupfer, Nickel, Kobalt
und Eisen umgesetzt. Das erhaltene Gemisch wird auf einen Pjj-Wert von etwa 6 bis 8 eingestellt, worauf eine schwerlösliche
Schwermetallkomplexverbindung zwischen der Trägermetallverbindung und dem oben beschriebenen Peptid
gebildet wird. Von den auf diese V/eise herstellbaren verschiedenen Metallkomplexverbindungen ist die Zinkkomplexverbindung
in Bezug auf die lange Wirkungsdauer herausragend.
Die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung hergestellten Polypeptide können in Form verschiedener pharmazeutischer
Zubereitungen verabreicht werden, die Gemische der Polypeptide mit geeigneten, pharmakologx3ch unbedenklichen
organischen oder anorganischen Träger- und Hilfsstoffen
109821/2J4?
enthalten. Geeignet sind Träger- und Hilfsstoffe, die mit
den Polypeptiden nicht reagieren, z.B. Gelatine, Lactose, Glucose, Natriumchlorid, Stärke, Magnesiumstearat, Talkum,
Pflanzenöle, Benzylalkohol, Gummen, Polyalkylenglykole, weiße Vaseline und Cholesterin sowie andere übliche Hilfsstoffe
für Arneimittelzubereitungen.
Als pharmazeutische Zubereitungen kommen beispielsweise Tabletten, mit Zucker umhüllte Tabletten, Salben, Pulver,
Cremes, Suppositorien, Lösungen, Suspensionen und Emulsionen in Frage. Diese neuen Zubereitungen können sterilisiert
werden und/oder Hilfsstoffe wie Konservierungsmittel, Stabilisierungsmittel, Netzmittel und Emulgatoren
enthalten. Ferner können die neuen Zubereitungen andere therapeutisch wirksame Substanzen enthalten.
Die Verbindungen gemäß der Erfindung können oral oder parenteral verabreicht werden, jedoch werden bessere
therapeutische Ergebnisse erzielt, wenn sie als Ersatz für das adrenokortikotrope Hormon parenteral, z.B. intramuskulär,
intravenös und hypodermal injiziert werden. Die Dosis ist unterschiedlich, jedoch werden gewöhnlich etwa
0,01 bis 1 mg Polypeptid einmal oder mehrmals täglich
verabreicht. Im Falle der Zinkkomplexverbindung werden etwa 0,1 bis 1 mg der Verbindung einmal oder zweimal täglich
verabreicht.
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2055U1
BeisOJel 1
1) Z-Sar-Tyr-OCEL
1) Z-Sar-Tyr-OCEL
In 400 ml Acetonitril werden 28 g Tyr-OCBL-hydrochlorid
suspendiert. Zur Suspension werden unter Kühlung mit Eis 16,8 ml Triäthylamin gegeben. Nach 30 Minuten werden
22,4 g Z-SarOH und dann 24,8 g Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden gerührt, während mit
Eis gekühlt wird. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht in einem Kühlschrank stehengelassen. Am nächsten Morgen
werden 1 bis 2 Tropfen Essigsäure zugesetzt.
Der hierbei gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfil- ™
triert. Vom Piltrat wird das Acetonitril abdestilliert. Zum Rückstand werden 500 ml Äthylacetat gegeben. Die unlöslichen
Bestandteile werden abfiltriert. Das Filtrat wird mit 1n-Salzsäure und dann mit 5%ige** wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung
gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Äthylacetat wird unter vermindertem
Druck abdestilliert und der kristalline Rückstand aus Äthanol-Äther umkristallisiert. Ausbeute 28 g
(70%). Schmelzpunkt 155-157°C ^7^'5"+4ι8 (c=1,0, in
Dimethylformamid).
Elementaranalyse: C H N ^
Berechnet für Ο^Η^Ο^Ν,,: 62,99 6,04 7,00 '
Gefunden: 63,14 6,12 6,85
2) Z-Sar-Tyr-NHNH2
In einem Gemisch von 100 ml Methanol und 20 ml Dimethylformamid werden 20 g Z-Sar-Tyr.OCH, gelöst, worauf 12,5 ml
Hydrazinhydrat zugesetzt werden. Das Gemisch wird 50 Stunden stehengelassen. Die gebildeten Kristalle werden abfiltriert
und in 200 ml Methanol suspendiert. Die Suspension wird gekocht. Nach der Abkühlung werden die Kristalle
abfiltriert. Ausbeute 18,8 g (94#). Schmelzpunkt £21°C
(Zero.), /ά 7ß2>2»+7»4 (c-1,0, in Dimethylformamid).
1 09ß2 1/2242
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Elementaranalyse: CHN
Berechnet für C20H24O5N4: 59,99 6,04 15,99
Gefunden: 59,86 6,08 15,96
5) Z-Sar-Tyr-Ser.OCH,
8,0 g Z-Sar-Tyr.NHNH2 werden in einem Gemisch von 15 ml
Dimethylformamid und 100 ml Methanol gelöst. Zur Lösung werden 2,5 ml Hydrazinhydrat gegeben. Das Gemisch wird
10 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach dieser Zeit wird das gebildete Gel abfiltriert. Die Fällung wird
erneut der Gelierung aus einem Gemisch von Dimethylformamid und Methanol überlassen. Das Gel wird abfiltriert und getrocknet.
Ausbeute 4,1 g (87,5%). Schmelzpunkt 2150C (Zers.).(Sinterung bei 185°C). /ö/q2'8»^,^0 (c»1,0, in
Dimethylformamid)·
Elementaranalyse: CHN
Berechnet für C25H50O7N5: 56,54 6,19 14,55
Gefunden: 55,94 6,05 14,44
4) Z-Sar-Tyr-Ser-NH.NH2
4,68 g Z-Sar-Tyr-Ser-OCH, werden in einem Gemisch von
15 ml Dimethylformamid und 100 ml Methanol gelöst. Zur
Lösung werden 2,5 ml Hydrazinhydrat gegeben. Das Gemisch wird 70 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Die
erhaltene gelartige Fällung wird abfiltriert. Die Fällung wird erneut der Geliej?ung aus einem Gemisch von Dimethylformamid
und Methanol überlassen. Das Gel wird abfiltriert und getrocknet. Ausbeute 4,1 g (87,5%)· Schmelzpunkt 2150C
(Zers.). (Sinterung bei 185°C). lcfJ^%Q=-^^° (c=1,0, in
Dimethylformamid).
Elementaranalyse: C H ü
Berechnet für C25H50O7N5: 56,54 6,19 14,55
Gefunden: 55,14 6,05 14,44
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2055U1
OtBu NO0 Z
! ι
I ! ι
Z-Sar-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-
Z Z NO0 NO0 Z
III2]2 I
VaI-GIy-Ly s-Ly s-Arg-i\rg-Pr o-Val-Ly s-Val-Tyr-Pro-OH
7,5 ml Trifluoressigsaure, die Λ% Thioglykolsäure enthält,
wird zu 998 ml
OtBu NO9 Z
I I 2 !
BOC-Me t-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-
Z Z NO0 NO0 Z
III2!2 I ■
Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OH
gegeben. (Die Herstellung dieses Peptide ist beispielsweise in der holländischen Patentanmeldung 18811/1968
beschrieben.)
Das Peptid wird gelöst, indem das Gemisch 20 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt wird. Nach dieser Zeit wird ungefähr
die Hälfte der Trifluoressigsaure unter vermindertem Druck abdestilliert. Trockener Äther (50 ml) wird zugesetzt
und die hierbei gebildete farblose Fällung abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet. Das erhaltene
Pulver wird in 9 nil Dimethylformamid gelöst. Die Lösung
wird mit 1,28 ml einer 10%igen Lösung von Triethylamin in
Dimethylformamid neutralisiert, während sie mit Eis gekühlt wird.
211 mg Z-Sar-Tyr-Ser-NHNHO werden in 9 ml Dimethylformamid
C.
gelöst. Zur Lösung werden 0,3 ml 6n-HCl gegeben. Das Gemisch
wird auf -100C gekühlt, worauf 0,15 ml einer wässrigen
4n-Natriumnitritlösung unter kräftigem Rühren zugetropft
v/ird. Nach 20 Minuten wird das Gemisch mit 2,55 ml einer 10/oigen Lösung von Triethylamin in Diinethylformanid
neutralisiert und über wasserfreiem natriumsulfat getrocknet.
Diene Lösung wird bei -5°C zu der in der oben beschrie benen Weise hergor.tellten Lösung des Heneisocapeptid-
109S21/Z?4? BA0ORIGINAL
2055U1
derivats gegeben. Dae Gemisch wird 4· Stunden bei -5°C und
dann 20 Stunden bei 5°C gerührt. Zum Reaktionsgemisch werden I50 ml Äthylacetat gegeben, das 0,1% Thioglykolsäure
enthält. Die gebildete Fällung wird abfiltriert. Diese pulverförmige Fällung wird in einem Gemisch von
Äthylacetat, Pyridin, Essigsäure, Wasser und Thioglykolsäure (60:20:6:11:0,1) gelöst. Die Lösung wird auf eine
Kieselgelsäule (2x21 cm) gegossen und das Chromatogramm mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch entwickelt.
Die Fraktionen von 90 bis 300 ml werden vereinigt und das
Äthylacetat abdestilliert, worauf kaltes Wasser zugesetzt wird. Die gebildete Fällung wird isoliert und mit 1%iger
wässriger Essigsäurelösung, die 0,1% Thioglykolsäure enthält, und dann mit Wasser gewaschen und getrocknet.
Ausbeute 582 mg (56%). Schmelzpunkt 190-1940C (Zers.).
(Sinterung bei 1560C). /^Jj6'5-32,4° (c-1,0, Dimethylformamid)
.
Elementaranalyse: C H N S
Berechnet für G^6^2^°H6^^3"
S.6H2O: . 55,40 6,51 15,64 0,83
Gefunden: 55,15 6,34 15,85 0,82
6) H-Sar-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OH
In 3 ml Trifluoressigsäure, die 2 ml Anisol und 0,2 ml
Thioglykolsäure enthält, werden 700 mg
OtBu NO- Z
1 c- ι
-Glu-His-
Z-Sar-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gay-Lys-Pro-Val-Gly-Z
Z NO0 NO0 Z
I I I 2 I 2 i
Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OH
gelöst. Nach Zugabe von 25 ml Fluorwasserstoff wird das Gemisch 50 Minuten bei 3 G gerührt. Dor Fluorwasserstoff
wird unter vermindertem Druck abdentilliort und der Rückstand
unter vermindertem. Druck in einem ]ixsiccator getrocknet,
dar Nntriumhydroxyd in Grnnulatforn onthält.
109021/2242- ' BAD ORIGINAL
2055ΗΊ
Der getrocknete Rückstand wird in 30 ml Wasser gelöst und die Lösung auf eine Säule (2 χ 30 cm) des Harzes "Amberlite
IRA-400H(Acetatform) gegossen. Die ablaufende Flüssigkeit
wird mit der Waschflüssigkeit vereinigt und auf etwa 20 ml eingeengt, worauf 0,2 ml Thioglykolsäure zugesetzt
werden. Das Gemisch wird 12 Stunden bei 50 C gehalten und
die Lösung mit Wasser auf 200 ml aufgefüllt. Die Lösung wird auf eine Säule (2 χ 40 cm) von Carboxymethylcellulose
gegeben, die zuerst mit 0,1-molarem Ammoniumacetat gewaschen und dann nach der Stufenmethode eluiert wird,
bei der die Salzkonzentration von 0,1-molar bis 0,5-molar
steigt. Das. gewünschte Polypeptid wird in den 0,2- bis etwa .0,3-molaren Fraktionen erhalten. Diese Fraktionen
werden zusammengegeben und lyophilisiert. Hierbei werden
350 mg (Sarcosin )ß(1-24)kortikotropin erhalten, /q/^'^=-77,2° (Konz. 0,5%, 1% Essigsäure). Papierelektrophorese
(pg 1,9) 9,3 cm. i
Ratten, denen dieses Produkt injiziert wird, zeigen eine
starke Abgabe von Steroiden.
Beispiel 2
λ \ Tim *7
λ \ Tim *7
I I
Z-Sar-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-
ZZ NO0 NO0 Z
ItI2I2 I
GIy-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-NH2
Zu einer Lösung von Z-Sar-Tyr-Ser-NHNH2 (140 mg, 0,3 mMol)
in einem Gemisch von 6n-HGl (0,2 ml) und Dimethylformamid wird 4n-Natriumnitrit (0,1 Mol) bei -100C gegeben. Das Gemisch
wird 30 Minuten bei -100C gerührt. Das Reaktionsgemisch
wird mit Triethylamin (0,17 ml) neutralisiert und über wasserfreiem NapSO^, getrocknet.
Die AzidlöGung wird filtriert und das Filtrat zu einer kalten Dimethylformamidlösung von
NOp Z Z Z NO0 NO0
I 2 I 11I2I^
His-Phe-Arg-Try-Gly-Lya-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-
109821/2242
-ie. 2055H1
VaI-Lys-Val-Tyr-HH2 gegeben, das aus 665 mg (0,2 mMol)
OtBu NO0 Z ZZ
I I 2 I I '
BOC-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-
NO0 NO0 Z
Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-NHg
unter Verwendung von Trifluoressigsäure nach dem bekannten Verfahren hergestellt worden ist. Das Gemisch wird 6 Stunden
bei -100C und dann weitere 10 Stunden bei O0C gerührt.
Die zusätzliche Azidlösung, die in der oben beschriebenen Weise aus 60 mg des entsprechenden Hydrazide hergestellt
worden ist, wird dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Das Gemisch wird 24 Stunden bei 0°0 stehengelassen, worauf das
gewünschte Produkt durch Zusatz von eiskaltem Äther (50 ml) ausgefällt wird. Hierbei wird ein feines Pulver erhalten.
Das Pulver wird abfiltriert und dann durch Säulenchromatographie an Kieselgel in üblicher Weise gereinigt. Ausbeute
630 mg (85&). Schmelzpunkt 2O5-21O°G (Zers.).
(Sinterung bei 170-180°). &?ψ—31° (c-0,5 in Dimethylformamid).
Rf2-0,6-, Ef5-0,74j Hf4»0,90.
Elementarnalyse: C H N S Berechnet für
C176H237°46N43Se4H20: 55»6 6'5 16»5 °»8?
Gefunden? 55,4 6,5 16,0 0,78
2) H-Sar-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-
Gly-Lys-Lys-Δrg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-l·1H2
500 mg des gemäß Beispiel 2 (1) hergestellten geschützten Tricosapeptid3, 0,75 ml Anisol, 0,05 ml Thioglykolsäure,
1500 mg Methionin, 750 mg Tryptophan und 2 ml CP,COOH
* ο
werden gemischt. Das Gemisch wird 60 Minuten bei 0 C gerührt. Restlicher Fluorwasserstoff und CF^COOH werden
unter vermindertem Druck entfernt.
. ■■" T09821/22U
Der Rückstand wird in 25 ml Wasser aufgenommen und die Lösung dreimal mit je 20 ml Wasser gewaschen. Die wässrige
Schicht wird durch eine Säule von 75 ml "Amberlite IRA-400" ·
(Acetatform) geleitet. Die Säule wird mit einer wässrigen Lösung, die 0,1 Vol.-% Essigsäure enthält, gewaschen. Der
gesamte Ablauf wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in 10 ml einer wässrigen
Lösung von 1 Gew.-% Thioglykolsäure gelöst. Die Lösung wird 12 Stunden unter strömendem Stickstoff bei 50°G gehalten.
Die erhaltene Lösung wird mit 400 ml Wasser verdünnt und auf eine Säule von Carboxymethylcellulose
(2,5 x 20 cm) gegeben. Die Säule wird nacheinander mit "
500 ml 0,1-molarem Ammoniumacetatpuffer (p™ 6,5), 500 ml
0,1-molarem Ammoniumacetatpuffer (pH 6,5) und 500 ml
0,15-molarem Ammoniumacetatpuffer in dieser Reihenfolge
eluiert. Das gewünschte (Sarcosin )ß(1-23NH2)kortikotropin
wird mit 300 ml 0,4-molarem Ammoniumacetatpuffer (p™ 6,5)
eluiert. Das Eluat wird gefriergetrocknet, wobei 310 mg
eines farblosen flockigen Pulvers erhalten werden.
-74,0° (c«0,5 in 1%iger wässriger Essgisäure).
JjIn-NaOH ^ (E 1#^ 2Q3^ (25,0), 290 (25,8);
Rf «0,54. Papierelektrophorese: Pyridin-Ac0H-H20 (Volumenverhältnis
1:1O:89)*a1*"25NH2-ACTH.
Die chemische Struktur des hierbei erhaltenen Polypeptids wird außerdem durch Analyse auf Aminosäure bestätigt.
Beispiel ?
1) Z-AIbU-TyT-NMH2
1) Z-AIbU-TyT-NMH2
Zu einer Lösung von 23 g H-Tyr-OCH^, 14 ml Triäthylamin
und 400 ml Acetonitril werden 19 g Z-AlbuOH und 20 g Dicyclohexylcarbodiimd
bei O0G gegeben. Die Lösung wird 24 Stunden bei O0C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird filtriert
und das Filtrat zur Trockene eingedampft. Der Rückstand
wird in 400 ml iith;/lacetat gelöst. Die Lösunr wird
mit 1n—Snlsnäure, einer ^f/oir^on wnnsrif^en Natriumbicarbanatlößunp;
und V/asser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet
BAD ORIGINAL
1 (j <j ■/■ i /:■;/.? ~~
H | 1 | N | 52 | |
6 | ,32 | 1 | 3, | 58 |
6 | ,58 | 3, | ||
und unter vermindertem Druck eingedampft, wobei ein sirupartiger Rückstand erhalten wird (Ausbeute 32 g). Dieser
Rückstand wird in 200 ml Methanol gelöst und die Lösung mit 14 ml Hydrazinhydrat versetzt. Das Gemisch wird über
Nacht bei Raumtemperatur gehalten, worauf das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft wird, wobei ein kristalliner
Feststoff erhalten wird. Dieser Feststoff wird aus wässrigem Methanol umkristallisiert, wobei 27 g des
gewünschten Hydrazide vom Schmelzpunkt 144-149 C (Zers.)
erhalten werden. Rf »0,61.
Elementaranalyse: C
Berechnet für Ορ/ΐΗρ,-Ο,-Ν^,: 60,85
Gefunden: 60,66
2) Z-Albu-Tyr-SerOGH,
In einem Gemisch von 100 ml Dimethylformamid und 60 ml 2n-Salzsäure werden 12,42 g Z-Albu-Tyr-NHNH2 gelöst. Zur
Lösung werden 8 ml 2n-Natriumnitrat innerhalb von 5 Minuten bei einer Temperatur von -5°C bis - 10°C gegeben. Das Reaktionsgemisch
wird dann mit 300 ml eiskalter gesättigter wässriger Natriumchloridlösung verdünnt. Die gebildete
Azidverbindung wird zweimal mit je 200 ml eiskaltem Äthylacetat
extrahiert. Das Äthylacetat wird mit eiskalter 5%iger wässriger Natriumbicarbonatlösung und gesättigter
wässriger Natriumchloridlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet.
Die Azidlösung wird zu einem Gemisch von 80 ml Äthylacetat,
20 ml Dimethylformamid, 4,7 g H-Ser-OCH^.HCl und 4,2 ml
Triethylamin gegeben. Das Gemisch wird 46 Stunden bei 0 C
gerührt. Das Re akt ions ge mi sch wird mit einer 4%ip;en wässrigen
Natriumbicarbonatlösung, In-SaIzsäure und Wasser gewaschen.
Die organische Phase v/ird über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter verminderten Druck
abgedampft. Der Rückstand wird aus Äthylacetat-Petrolöther
kristallisiert, wobei 9»7 g der gewünschten Verbindung vom Schmelzpunkt 169,5-170,5°C (Zers.) erhalten werden.
109 8 21/2242
- 21 - 2055H1
Rf1=0,54. [oj^ -43,0 (c=1,0, in Methanol).
C | 87 | H | N |
59, | 83 | 6,23 | 8,38 |
59, | 6,13 | 8,61 | |
Elementaranalyse: Berechnet für C0CH^OgN,:
Gefunden:
3) Z-Albu-Tyr-Ser-NHNH2
Zu einer Lösung von 9 g Z-Albu-Tyr-Ser-OCH, in 100 ml
Methanol werden 10 ml Hydrazinhydrat gegeben. Das Gemisch wird 10 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Das Lösungsmittel
wird unter vermindertem Druck abgedampft und der Rückstand aus Äther kristallisiert. Ausbeute 8,2 g. "
Schmelzpunkt 149,5 - 1510C (Zers.). Rf1»0,18. /a/2^ -48,0°
(c=1,0 in Dimethylformamid).
Elementaranalyse: Berechnet für Cp^HoqCI1J^T1-:
C 56,66%, H 6,00%, N 14,73%.
4) f>2 f
Z-Albu-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-
Z Z NO0 NO0 Z
I)I2I2 I
Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-ProOH
,, λ\ , OtBu NO0 Z
(4-1) 3Λ g j j 2 ,
BOC-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-
Z Z NO0 NO0 Z
ItI2I2 I
Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-ProOH
werden in 30 ml eiskalter Trifluoressigsäure gelöst, die
0,1 ml Thioglykolsäure enthält. Die Lösung wird 25 Minuten bei 15°C gerührt. Die Lösung wird unter vermindertem Druck
auf etv/a 10 ml eingeengt. Durch Zusatz von 100 ml Äther wird ein Produkt ausgefällt. Die Fällung wird abfiltriert
und über Natriumhydroxyd unter vermindertem Druck getrocknet. Das getrocknete Pulver wird in 20 ml Dimethylformamid
gelöst. Die Lösung wird mit 0,5 ml Triäthylomin vernetzt
und dnnn auf -200C gekühlt.
1 Oj H 2 1 / 2 7 U 7 '
""'— ""
-22- 2055H1
(4-2) 633 mg Z-Albu-Tyr-Ser-NH.NHo werden in einem Gemisch
von 15 ml Dimethylformamid und 1 ml 6n-Salzsäure gelöst.
Zur Lösung werden 0,4 ml 4n-Natriumnitrit bei -5°C gegeben. Las Gemisch wird 20 Minuten bei -5°C gerührt, mit 0,9 ml
eiskaltem Triäthylamin versetzt und dann über Natriumsulfat getrocknet. Die getrocknete Lösung wird filtriert und das
Piltrat zum Lösungsgemisch gegeben, das auf die im Abschnitt
(4-1) beschriebene Weise erhalten wurde. Das Gemisch wird 6 Stunden bei -10°C und weitere 10 Stunden bei
O0C gerührt. Zum Heaktionsgemisch wird eine Azidlösung
gegeben, die aus 320 ng Z-Albu-Tyr-Ser-NHNI^ auf die oben
beschriebene Weise hergestellt worden ist. Das Gemisch wird weitere 24 Stunden bei O0C gerührt. Das Produkt wird
durch Zusatz von eiskaltem Äther ausgefällt und abfiltriert.
Die erhaltene Fällung wird in einem Gemisch von Äthylacetat, Pyridin, Essigsäure und Wasser (60:20:6:11) gelöst. Die
Lösung wird auf eine Kieselgelsäule gegossen, die mit dem gleichen Lösungsmittel eluiert wird. Die Verbindung erscheint
bald. Die Hauptfraktion wird abgenommen und unter vermindertem Druck getrocknet. Zum Rückstand wird Eiswasser
gegeben, wobei ein feines mikrokristallines Pulver gebildet wird, das abfiltriert und mit 1%iger Essigsäure und dann
mit Wasser gewaschen wird. Ausbeute 3»2 g. Schmelzpunkt
1700O (Zers.). (Sinterung bei 1450C). £aJJ® -31,6°
(c»0,5 in Dimethylformamid), Rf1»0,0, Rf^=O,55.
5) H-Albu-Tyr-Ser-Mct-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-ProOH
3 g des Produkts, das auf die im Abschnitt (4-2) beschriebene V/eise erhalten worden ist, werden mit wasserfreiem
Fluorwasserstoff behandelt und ouf die in Beispiel 1 (6) beschriebene Weise gereinigt. Ausbeute 1,7 g. Rf *Ο,55·
Papierelektrophorese: p„ 1,9 (Essigsäure-Ameisensiiure-
Λ Pit - -jP^
Puffer; 500 V, 60 Minuten)» -9,0 cm( »α' "^ACTH), /cx/^
-81,1° (c«1,0, in 1%ir;er Essigsäure). Aminosäure-Analyse
(5,7n-Salzsäure, 1100C, 24 Stunden, Hydrolysat):
BAD
109321/22U
2055U1
Lys 3,9 W, His 1,0 (1), Arg 2,9 (3), Ser I1O (1),
GIu 1,0 (1), Pro 2,9 (3), GIy 2,0 (2), Albu 0,9 (1),
VaI 2,8 (3), Met 0,9 (D, Tyr 1,9 (2), Phe 1,0 (1).
Die Verbindung wird nach an sich bekannten Verfahren in das entsprechende Salz mit Salzsäure oder Essigsäure umgewandelt.
Beispiel M- 1) BOC-Sar-Tyr-Ser-Met-NHNH2
Zu einer Lösung von 4·,13 g H-Tyr-Ser-Met OCH,, 100 ml
Acetonitril und 10 ml Dimethylformamid werden unter Rühren bei O0C 2,3 g BOC-Sar-OH und 2,3 g Dicyclohexylcarbodiimid
gegeben. Das Gemisch wird 24- Stunden bei O0C und
weitere 10 Stunden bei 200C gerührt. Der gebildete Dicyclohexylharnstoff
wird abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand
wird in heißem Äthylacetat gelöst und die Lösung mit 4#iger wässriger Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen.
Die gewaschene Lösung wird auf ein kleines Volumen eingeengt und der Rückstand mit Äther versetzt. Das
ausgefällte Produkt wird abfiltriert und aus Methanol-Äther umkristallisiert, wobei 4,8 g Produkt (Ef =0,3)
erhalten werden.
Das Produkt wird in heißem Methano!-Dimethylformamid gelöst.
Zur Lösung werden 2 ml Hydrazinhydrat gegeben. Das
Gemisch wird abfiltriert und mit Wasser und Äthanol gewaschen, wobei 4-,3 g des Hydrazide erhalten werden. Rf =
o,o; ηΑοι55. OtBu
2) I
BOC-Sar-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly OH
Zu einer Lösung von 900 mg BOC-Sar-Tyr-Ser-Met-NHNH2,
10 ml Dimethylformamid und 4- ml 1n-Salzsäure werden 1,7 ml
1n-Natriumnitrat bei O0C gegeben. Das Gemisch wird 5 Minuten
gerührt. Zum Reaktions^emisch werden dann eine eiskalte
Äthylacetatlösung und eine eiskalte gesättigte wässrige Natriumchloridlösung (50 ml) gegeben. Die wässrige Schicht
wird zweimal mit eiskaltem Äthylacetat extrahiert. Alle
1 0 9 8 2 1i 7 2 7 U 2
2055U1
organischen Phasen werden vereinigt, mit eiskalter 4%iger
wässriger Natriumbicarbonatlösung gewaschen und über Natrium
acetat getrocknet. Die getrocknete Lösung wird zu einem Lösungsgeraisch aus 1 g des Salzes von
OtBu
H-GIu-His-Phe-Arg-Try-Gly OH mit Essigsäure, 0,4 öl Triäthylamin
und JO ml Dimethylformamid gegeben. Das Äthylacetat wird vom Gemisch unter vermindertem Druck bei 10 C
abgedampft. Die erhaltene Lösung wird 12 Stunden bei 3°C
gerührt. Eine weitere Azidlösung (hergestellt aus 500 mg
BOC-Sar-Tyr-Ser-Met-NHNHg in der oben beschriebenen Weise)
wird zugesetzt und das Reaktionsgemisch weitere 24 Stunden bei 5°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit 500 ml
eiskaltem Äthylacetat verdünnt, wobei sich eine amorphe Fällung bildet. Die Fällung wird abfiltriert und aus Dimethylformamid-Methanol
umkristallisiert, wobei das gereinigte Produkt in einer Ausbeute von 1,4 g erhalten wird.
V °° (Cs1 in Dimethylformamid), Rf5=O,3O, Rf4«0,75.
(3) H-Sar-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lya-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-KH2
Zu einer Lösung von 0,74 g BOC-Sar-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly
OH in Dimethylformamid gibt man 0,5 eil eiskalte ln-Salzsäure bei 00C. Das Hydrochlorid fällt man durch Zusatz
von 500 ml eiskaltem Äthylacetat aus. Man isoliert die Fällung durch Zentrifugieren, wäscht mit Äthylacetat und
trocknet unter Vakuum. Das erhaltene Pulver löst man in einem Gemisch von 50 ml Dimethylformamid und 20 ml Pyridin.
Zur Lösung gibt man 1,1 g des Tosylatsalzes von
BOC BOC BOC
T ι ι
H-Lys-Pro-Val-Oly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-NHg und dann ^CO mg
Dicyclohexylcarbodiimid. Das Gemisch rührt man 4 Tage bei 10°C. Die Lösung engt man dann unter vermindertem Druck auf
20 ml ein und mischt sie mit 500 ml Äthylacetat, wobei sich eine amorphe Fällung bildet, cfie man durch Zentrifugieren abtrennt
und mit Pthylacetat und ftther wäscht. Das Material wird
BADORIGfNAL 109821/2242
in 50%igem wässrigem Tetrahydrofuran (Vol./Vol.) gelöst
und die Lösung durch eine Säule von "Amberlite IRA-400" (3 x 30 cm) geleitet. Die Säule wird mit dem gleichen Lösungsmittel
eluiert. Das Lösungsmittel wird abgedampft und die wässrige Lösung gefriergetrocknet, wobei ein flokkiges
Pulver erhalten wird (Ausbeute 1,92 g).
100 mg des so hergestellten Eicosapeptids, in dem freie Aminogruppen und Carboxylgruppen geschützt sind, werden in
2 ml 90%iger Trifluoressigsäure gelöst. Die Lösung wird
1 Stunde bei Raumtemperatur gehalten. Die Trifuoressigsäure wird abgedampft und der Rückstand in Wasser gelöst. f
Die Lösung wird durch eine Säule (0,5 x 20 cm) von "Amberlite IRA-400" (Essigsäureform) geleitet. Das Eluat
wird in 10 ml Wasser gelöst und auf eine Säule von Carboxymethylcellulose (1 χ 20 cm) gegeben, die mit einem Ammoniumacetatpulver
nach der Stufenmethode von 0,1-molar bis 1-molar bei p™ 6,8 eluiert wird. Das reine Sicosapeptid
wird mit dem ungefähr 0,3-niolaren Puffer eluiert. Das
Eluat wird unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen eingeengt und dann bis zur Gewichtskonstanz gefriergetrocknet.
Ausbeute 70 mg. ^öc/D β -61 (c=0,5 in 1%iger
Essigsäure), Rf^»0,0, Rf^=O,5. !■
1) BOC-AIbU-TyT-NHNH2
Zu einer Lösung von H.Tyr-OCH^.HCl (23 g) und Triäthylamin
(14 ml) in 400 ml Acetonitril werden BOC-Albu-OH (20 g)
und Dicyclohexylcarbodiimid (22 g) bei 00C gegeben. Die
Lösung wird 24 Stunden bei O0C gerührt. Das Reaktionsgemisch
wird filtriert und das Piltrat zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in Äthylacetat (400 ml) gelöst
und die Äthylacetatlösung mit In-Salzsäure, 5%iger Natriumbicarbonatlösung
und Y/asser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft, wobei
ein sirupartiger Rückstand erhalten wird (Ausbeute 31 g). Dieser Rückstand wird in 200 ml Methanol gelöst und die
1 0 '-j :'; 2 I / / ;·' A 2
2055U1
C | 82 | H | N | 73 |
56, | 73 | 7,42 | 14, | 76 |
56, | 7,51 | 14, | ||
Lösung mit 14 ml Hydrazinhydrat versetzt. Das Gemisch wird
12 Stunden bei Raumtemperatur gehalten, worauf das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft wird, wobei ein
kristalliner Peststoff erhalten wird. Dieser Peststoff
wird aus wässrigem Methanol umkristallisiert, wobei 28 g des Hydrazids erhalten werden. Rf »0,64.
Elementaranalyse:
Berechnet für 0Λα
ία
Gefunden:
2) BOC-Albu-Tyr-Ser-OCH,
16 g BOC-Albu-Tyr-NHNHg werden in einem Gemisch von 100 ml
Dimethylformamid und 60 ml 2n-HCl gelöst. Zur Lösung werden bei -5 bis 10°C innerhalb von 7 Minuten 6 ml 2n-Natriumnitrit
gegeben.
Das Reaktionsgemisch wird mit 300 ml eiskaltem Wasser, das mit NaCl gesättigt ist, verdünnt. Das sich abscheidende
Azid wird zweimal mit je 200 ml eiskaltem Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatlösung wird mit eiskalter wässriger
5%iger Natriumbicarbonatlösung und dann mit Wasser,
das mit NaCl gesättigt ist, gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Diese Azidlösung wird zu einer Lösung
von 7,8 g H.Ser-OCH, und 7,5 ml Triethylamin in 150 ml
Äthylacetat gegeben. Das Gemisch wird 2 Tage bei OC gerührt.
Das Reaktionsgemisch wird mit 4%iger wässriger Natriumdicarbonatlösung,
1n-Salzsäure und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über Na2SOz, getrocknet und das Lösungsmittel
unter vermindertem Druck entfernt.
Der Rückstand wird aus Äthylacetat-Petroläther kristallisiert, wobei 10,8 g BOC-Albu-Tyr-Ser-OCH, erhalten werden.
Rf1»0,58.
Elementaranalyse:
Elementaranalyse:
Berechnet für C22H33°8N3i
Gefunden:
10982 1/2242
C | H | N |
56,52 | 7,12 | 8,99 |
56,44 | 7,23 | 9,13 |
2055U1
2) BOC-Albü-Tyr-Ser-NMI^
Zu einer Lösung von 10 g BOC-Albu-Tyr-Ser-OCH* in 100 ml
Methanol werden 10 ml Hydrazinhydrat gegeben. Das Gemisch wird 8 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Das Lösungsmittel
wird unter vermindertem Druck abgedampft und der Rückstand aus einem Äther-Petroläther-Gemisch kristallisiert.
Ausbeute 9,3 g. Rf »0,21.
σ | 95 | 7 | H | N | 98 |
53, | 80 | 7 | Ti 2 | 14, | 83 |
53, | ,41 | 14, | |||
Elementaranalyse:
Berechnet für Ο,^λ ''
Gefunden: >5,öö y,*n 1^,05 |
(3) H-Albu-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro
OH
(5-1) Aminkomponente OtBu BOC
600 mg Salz von H-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-
BOC BOC BOG
Il i
GIy-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OtBu
mit Tetraessigsäure und 0,27 ml Triäthylamin werden in
einem Gemisch von 2 ml Dimethylformamid und 1 ml Pyridin
gelöst. Die Lösung wird auf -50C gekühlt. ^
(5-2) Azidlösung
Zu einer Lösung von 2Ö0 mg BOC-Albu-Tyr-Ser-Met-lJH!TH2 und
4 ml Dimethylformamid werden 0,3 ml 4n-Salzsäure unter Rühren bei -100C gegeben. Das Gemisch wird 10 Minuten bei
-10°C gerührt.
(3-5) Kupplung;
Die vorstehend genannte Azidlösung wird zur Dirnethylformamidlösung
der Aminkomponente gegeben. Das Gemisch wird 40 Stunden bei O0C gerührt. Die Lösung wird unter vermindertem
Druck auf ein kleines Volumen eingeengt und dann mit PO ml eiskaltem V/asser verdiJnnt. Die gebildete Fällung
wird durch Zentrifugieren abgetrennt und mit Wasser und
108*321/2242 &® ORlGINAU
2055H1
Äther gewaschen, wobei ein amorphes gelbliches Pulver erhalten wird (Ausbeute 730 mg). Das Pulver wird mit Trifluoressigsäure
auf die in Beispiel 4 (J) beschriebene Weise behandelt. Das erhaltene Produkt wird mit einer Säule
aus Carboxymethylcellulose auf die in Beispiel 4 (3) beschriebene Weise behandelt, wobei das gewünschte Peptid
erhalten wird. Die Struktur des Peptids wird durch Aminosäureanalyse
bestätigt.
——— —— ^,
10 mg des gemäß Beispiel 1 (6) hergestellten (Sarcosin )ß-(1-24)kortikotropine
werden in 5 ^l destilliertem Wasser gelöst. Zur Lösung werden eine Lösung von 74 ing ZnCIp in
2 ml Wasser und eine Lösung von 30 mg NapjfflEKX.^E^O in
2 ml Wasser gegeben. Das Gemisch wird mit Wasser auf 20 ml verdünnt und unter Rühren auf p™ 8,0 bis 8,5 eingestellt.
Das ausgefällte Gel wird durch Zentrifugieren abgetrennt, wobei der (Sarcosin )ß(1-24)kortikotropin-Zink-Komplex
erhalten wird.
BAD QWGINAL
2 1/2242
Claims (22)
- PatentansprücheΛ . Polypeptidverbindungen der allgemeinen Formel X-L-Tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-P (worin X für Sarcosyl oder a-Aminoisobutyryl und P für L-Prolin, L-Prolyl-L-valin, L-Prolyl-L-valyl-L-lysin, L-Prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valin, L-Prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosin oder L-Prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin steht),ihre unsubstituierten , Amide, physiologisch verträglichen Satire additions £3 al ze " und Schwermetallkomplexe.
- 2. Polypeptid nach Anspruch 1 mit der in Anspruch 1 genannten Formel, in der X für Sarcosyl und P für L-Prolyl-lively l-L-lysyl-L-lysyl-L-valyl-L- tyrosin steht.
- 3. Polypeptid nach Anspruch 1 mit der in Anspruch 1 genannten Formel, in der X für Sarcosyl und P für L-Prolyl-L-valyl-L-Iysyl-L-valy1-L-tyrοsyl-L-pyrolin steht·
- 4. Polypeptid nach Anspruch 1 mit der in Anspruch 1 genannten Formel, in der X für a-Amino-isobutyryl und P für L-Prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosin steht. |
- 5. Polypeptid nach Anspruch 1 mit der in Anspruch 1 genannten Formel, in der X für_a-Amino-isobutyryl und P für L-Prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin steht.
- 6. Polypeptidenach Anspruch 1 in Form ihrer physiologisch verträglichen Salze mit Essigsäure und Salzsäure.
- 7. Polypeptide nach Anspruch 1 in Form ihrer Zinkkomplexe.
- 8. finrcosyl-L-tyror,yl-L~r>nryl-L-methionyl-L-^lutamyl-L-n3/■l-·■:L3^C7L'- jl-L-nrr/u /1-Βθίη<ϊ Halxo mi fc Kiiflir-iiure uni S^i.zsüurG und sein Zink-I 0 ->\ > [ ; > > U / BAD ORIGINAL-30- 2055U1komplex.
- 9· Sarcosyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin, seine Salze mit Essigsäure und Salzsäure und sein Zinkkomplex.
- 10.. a-Amino-isobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosinanid, seine Salze mit Essigsäure und . Salzsäure und sein Zinkkomplex.
- 11. Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden nach Anspruch 1t ihren unsubstituierten Amiden, physiologisch verträglichen Säureadditionssalzen und Schwermetallkomplexen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein geschütztes Derivat eines Tripeptide der Formel X-L-Tyrosyl-L-serin (worin X für Sarcosyl oder ot-Aminoisobutyryl steht, die C-endständige Carboxylgruppe von L-Serin aktiviert und die N-endständige a-Aminogruppe von Sarcosin oder ot-Aminoisobuttersäure durch einen schützenden Substituenten geschützt ist) mit einem geschützten Derivat eines Polypeptide der Formel L-Methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-P1 (worin P1 die gleiche Bedeutung wie P hat, die S-Aminogruppen von L-Lysin durch schützende Substituenten geschützt sind und die Y-Carbox3rl^ruppe von L-Glutaminoäure, die C-endntändi ,«re Carboxylgruppe und die Guanidingruppe von L-Arr^inin jeweils durch einen rchützcnden Subntitucnten gep.chützb nein können), mit seinem unmibstituierton Amid oder .seinem iJäurenddi tionssalz umo<;t?.t und die geschützten Aminogruppen und Carboxylgruppen freisetzt und gegebenenfalls die erhaltenen109821/2242ORIGINAL- 31 - 2055U1freien Peptide in physiologisch verträgliche Säureadditionssalze oder Schwermetallkomplexe umwandelt.
- 12. Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden nach Anspruch 1, seinen unsubstituierten Amiden, physiologisch verträglichen Säureadditionssalzen und Schwermetallkomplexen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein geschütztes Derivat eines Tetrapeptids der allgemeinen Formel X-L-Tyrosyl-L-seryl-L-methionin (worin X für Sarcosyl oder a-Aminoisobutyryl steht, die C-endständige Carboxylgruppe von L-Methionin aktiviert und die N-endständige oc-Aminogruppe von Sarcosin oder a-Amino-isobuttersäure durch einen schützenden Substituenten geschützt ist) mit einem geschützten Derivat der Formel L-Glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-P1 (worin P1 die gleiche Bedeutung wie P hat, die £-Aminogruppen von L-Lysin durch schützende Substituenten geschützt sind und die Ύ-Carboxylgruppe von • L-Glutaminsäure, die C-endständige Carboxylgruppe und die Guanidingruppe von L-Arginin durch einen schützenden Substituenten geschützt sein können), mit seinem unsubstituierten Amid oder seinem Säureadditionssalz umsetzt und die geschützten Aminogruppen und Carboxylgruppen freisetzt und gegebenenfalls die freien Polypeptide in die physiologisch verträglichen Säureadditionssalze oder Schwermetallkomplexe umsetzt.
- 13. Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden nach Anspruch 1, ihren unsubstituierten Amiden, physiologisch verträglichen Säureadditionssalzen und Schwermetallkomplexen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein geschütztes Derivat eines Decapeptids der allgemeinen Formel X-L-Tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutP.myl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-fTlycin (worin X für Sarcosyl oder co-Amino-isobutyryl steht, die C-end;;tändi£e Carboxylgruppe von Glycin aktiviert ist und die N-endständige a-Aminogruppe von Threonin oder α-Απιίηο-inobuttersäure1 0 ': ■! λ 1 / ? 2 4 ? BAD ORIGINALdurch einen schützenden Substituenten geschützt sind und die Ύ-Carboxylgruppe von L-Glutaminsäure durch einen schützenden Substituenten geschützt sein kann) mit einem geschützten Derivat eines Polypeptids der Formel L-Lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-arginyl-L-arginyl-P1 (in der P1 die gleiche Bedeutung wie P hat, die £-Aminogruppen von L-Lysin durch schützende Substituenten geschützt sind und die O-endständige Carboxylgruppe und die Guanidingruppe von L-Arginin jeweils durch einen schützenden Substituenten geschützt sein können), mit seinem unsubstituierten Amid oder einem entsprechenden Säureadditionssalz umsetzt und die geschützten Amino- und Carboxylgruppen freisetzt und gegebenenfalls die freien Peptide in die physiologisch verträglichen Säureadditionssalze oder Schwermetallkomplexe umwandelt.
- 14. Verfahren nach Anspruch 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß X in der allgemeinen Formel für Sarcosyl steht.
- 15. Verfahren nach Anspruch 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß X in der allgemeinen Formel für a-Amino-isobutyryl steht.
- 16. Verfahren nach Anspruch 11 bis 15» dadurch gekennzeichnet, daß P in der allgemeinen Formel für L-ProIyI-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosin steht.
- 17· Verfahren nach Anspruch 11 bis 15» dadurch gekennzeichnet, daß P in der allgemeinen Formel für L-ProIyI-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin steht.
- 18. Verfahren nach Anspruch 11 bis 17» dadurch gekennzeichnet, daß als verträgliche Säureadditionssalze die Salze mit Essigsäure oder Salzsäure hergestellt werden.
- 19· Verfahren nach Anspruch 11 ,bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß der schützende Substituent der N-endständigen a-Aininogruppe von Sarcpsin oder oc-Amino-isobuttersäure109821/2242-33- 2055U1durch eine Benzyloxycarbonylgruppe oder eine tertiäre Butoxycarbonylgruppe, die Ύ-Carboxylgruppe von L-Glutaminsäure durch eine tertiäre Butylgruppe geschützt ist, die Guanidingruppen von L-Arginin durch Nitrogruppen und die έ-Arainogruppen von L-Lysin durch Benzyloxycarbonylgruppen oder tertiäre Butoxycarbonylgruppen geschützt sind.
- 20. Verfahren nach Anspruch 11 bis 13» dadurch gekennzeichnet, daß die G-endständige Carboxylgruppe durch Bildung eines aktiven Esters, durch Bildung des Azids oder durch Verwendung eines Kondensationsmittel geschützt worden " ist·
- 21. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die C-endständige Carboxylgruppe durch Bildung eines Säureanhydrids oder durch Bildung eines gemischten Anhydrids aktiviert worden ist.
- 22. Verfahren nach Anspruch 11 bis 13» dadurch gekennzeichnet, daß die geschützten Amino- und Carboxylgruppen durch Verwendung von Fluorwasserstoff freigesetzt werden.23· Verfahren nach Anspruch 12 und 13» dadurch gekennzeich- :net, daß die geschützten Amino- und Carboxylgruppen ädurch Verwendung von Trifluoressigsäure freigesetzt werden·109821/2242
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