DD248365A5

DD248365A5 - Gnrh-antagonisten vi

Info

Publication number: DD248365A5
Application number: DD85280402A
Authority: DD
Inventors: Wylie W Vale Jr; Jean E F Rivier
Original assignee: The Salk Institute For Biological Studies,Us
Priority date: 1984-09-07
Filing date: 1985-09-06
Publication date: 1987-08-05
Also published as: ES8900167A1; ZA856449B; US4565804A; AU4687985A; DK407985D0; HUT40144A; KR860002528A; ES546761A0; GR852148B; JPS6187695A; EP0175506A2; DK407985A; PH21284A; EP0175506A3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids fuer die Anwendung als Arzneimittel. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von neuartigen Peptiden, die die Abgabe von Gonadotropinen durch die Hirnanhangdruese und die Abgabe von Steroiden durch die Gonaden inhibieren, so dass die Verabreichung einer wirksamen Menge die Ovulation in weiblichen Saeugetieren und/oder die Abgabe von Steroiden durch die Gonaden verhindern. Die erfindungsgemaess hergestellten Peptide haben die Struktur: XR1(W)DPheR3R4R5R6(V)R7ArgProR10,worin X Wasserstoff oder eine Acylgruppe mit bis zu 7 Kohlenstoffatomen, R1 Dehydro-Pro, Pro, DpGlu, DTrp, DPhe oder bDNAL, W F, Cl, Cl2Br, NO2 oder CaMeCl, R3 DTrp, (NinFor)DTrp oder durch NO2, NH2, OCH3, F, Cl, Br oder CH3 in der 5- oder 6-Stellung substituiertes DTrp, R4 Ser, Orn, AAL oder aBu, R5 Tyr, (3F)Phe, (2F)Phe, (3I)Tyr, (3CH3)Phe, (2CH3)Phe, (3Cl)Phe oder (2Cl)Phe, R6 DLys, DOrn oder DDap, V (argR,R)n(X), wobei n eine Zahl zwischen 1 und 5 und R und R Wasserstoff, eine Methyl-, Ethyl-, Propyl- oder Butylgruppe sind, R7 Leu, NML, Nle oder Nva und R10 GlyNH2, DAlaNH2 oder NHY bedeuten, wobei Y eine niedere Alkyl-, Cycloalkyl- oder eine niedere Fluoralkylgruppe oder eine NHCONHQ-Gruppierung ist, in der Q Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe bedeutet.

Description

X¹-R_r(W)D-Phe-R₃(X²)-R₄(X³)-R₅(X⁴)-R₆(V)-R₇-Arg(X⁵)-Pro-X⁶

hergestellt wird, (b) eine oder mehrere der Gruppen X¹ bis X⁵ abgespalten werden und/oder gegebenenfalls von einem beliebigen Kunstharzträger, der in X⁶ eingeschlossen ist, gespalten werden, und (c) ein so hergestelltes Peptid in ein nichttoxisches Salz davon umgesetzt wird.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß R₃ (6NO₂)D-Trp und R₆D-LyS bedeuten.

3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß R₁ /3-D-2 NAL bedeutet.

4. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß V Arg₃(Ac) ist.

5. Verfahren nach Punkt 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß X Ac ist.

6. Verfahren nach Punkt 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß R₁₀ D-AIa-NH₂ bedeutet.

7. Verfahren nach Punkt 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß R₁₀ GIy-NH₂ bedeutet.

8. Verfahren nach Punkt V, gekennzeichnet dadurch, daß R₆D-LyS und V Arg₃(Ac) bedeuten.

9. Verfahren nach Punkt 8, gekennzeichnet dadurch, daß X Ac und R₁ Dehydro-Pro bedeuten. 10. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Produkt die Formel aufweist:

Ac-^-D-2NAL-(4F)D-Phe-(6NO₂)D-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-(Arg₃-Ac)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids, das die Freisetzung von Gonadotropinen durch die Hirnanhangdrüse in Säugetieren, einschließlich Menschen, inhibieren sowie auf Methoden zur Verhinderung der Ovulation und/oder der Inhibierung der Abgabe von Steroiden. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Peptide, die die gonadale Funktion und die Abgabe von Steroidhormonen, des Progesterons und des Testosterons, inhibieren.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Hirnanhangdrüse ist mit einem Stiel an den Bereich in der Grundfläche des Hirns verbunden, der als Hypothalamus bekannt ist. Insbesondere werden durch die Hirnanhangdrüse das Follikel stimulierende Hormon (FSH) und das luteinisierende Hormon (LH), die manchmal auch als Gonadotropine oder gonatropine Hormone bezeichnet werden, abgegeben. Diese Hormone regulieren im Zusammenwirken die Funktion der Gonaden, die Testosteron in den Testes und Progesteron und Estrogen in den Ovarien produzieren. Weiterhin regulieren sie die Produktion und den Reifeprozeß der Gameten. Die Abgabe eines Hormons durch den Vorderlappen der Hirnanhangdrüse setzt im allgemeinen die vorherige Abgabe einer anderen Klasse von Hormonen voraus, die durch den Hypothalamus erzeugt werden. Eines der durch den Hypothalamus erzeugten Hormone wirkt als auslösender Faktor für die Abgabe der gonadotropen Hormone, insbesondere von LH, und dieses Hormon wird hierin als GnRH bezeichnet, obwohl es auch als LH-RH und als LRF bezeichnet worden ist. GnRH ist isoliert worden und wurde als ein Decapeptid der folgenden Struktur charakterisiert:

p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NHz.

Peptide sind Verbindungen, die zwei oder mehr Aminosäuren enthalten, bei denen die Carboxylgruppe der einen Säure mit der Aminogruppe der anderen Säure verbunden ist. Die Formel für GnRH, wie sie weiter oben angegeben wurde, steht in Übereinstimmung mit der üblichen Schreibweise für Peptide, bei der der Aminterm auf der linken Seite und die Carbonsäuregruppe auf der rechten Seite steht. Die Stellung des Aminosäurenrestes wird dadurch identifiziert, daß die Aminosäurenreste von links nach rechts gezählt werden. Im Falle des GnRH wurde der Hydroxylteil der Carbonsäuregruppe des Glycins durch eine Aminogruppe (NH₂) ersetzt. Die Abkürzungen für die einzelnen Aminosäurenreste sind die üblicherweise verwendeten und basieren auf den Trivialnamen der Aminosäuren, z. B. ist p-Glu Pyroglutaminsäure, His Histidin, Trp Tryptophan, ser Serin, Tyr Tyrosin, GIy Glycin, Leu Leucin, Om Ornithin, Arg Arginin, Pro Prolin, Phe Phenylalanin und AIa Alanin. Die Aminosäuren der erfindungsgemäßen Peptide, außer Glycin, sind die der L-Konfiguration, wenn es nicht anders beschrieben wird. DerTerm „arg" wird hierin verwendet, um sowohl L-Arg als auch D-Arg zu bezeichnen. Die Substitution einer D-Aminosäure für GIy in der 6-Stellung des GnRH-Decapeptides oder-Nonapeptides führt zu einem GnRH-Analogen, das wesentlich größere Bindungsaffinität aufweist und folglich verwendet werden kann, um sowohl Agonisten als auch Antagonisten mit einer höheren Wirksamkeit herzustellen. Andere Substitutionen in dem gesamten GnRH-Decapeptid sind bekannt. Dadurch erhält man Antagonisten, die eine hemmende Wirkung auf die Abgabe von LH und anderen Gonadotropinen durch die Hirnanhangdrüse von Säugetieren ausüben. Eine solche freisetzende oder inhibierende Wirkung wird dann erreicht, wenn das GnRH-Analoge dem Säugetier intravenös, subcutan, intramuskulär, oral, percutan, z. B. intranasal oder intravaginal verabreicht wird.

Es gibt Gründe dafür, daß es erwünscht ist, die Ovulation in weiblichen Säugetieren zu verhindern und durch die Verabreichung von GnRH-Analogen, die hinsichtlich der normalen Funktion des GnRH Antagonisten sind, wurde die Ovulation unterdrückt oder verzögert. Aus diesem Grunde wurden GnRH-Analoge, die Antagonisten von RnRH sind, im Hinblick auf ihre mögliche Verwendung als Kontrazeptiva oder als Regulatoren der Konzeptionsperiode untersucht. GnRH-Antagonisten können auch zur Behandlung frühzeitig einsetzender Pubertät und von Endometritis sowie zur Förderung des Wachstums weiblicher Säugetiere Verwendet werden, Es wurde weiterhin festgestellt, daß solche Antagonisten zur Regulation der Abgabe von Gonadotropinen in männlichen Säugetieren verwendet werden können. Fernerhin kann durch sie die Samenbildung gehemmt werden, so daß sie z. B. als männliche Kontrazeptiva, aber auch zur Behandlung der Hypertrophie der Prostata angewendet werden können.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung verbesserter Peptide, die gegenüber dem endogenen GnRH stark antagonistisch wirken und die die Abgabe von LH sowie die Freisetzung von Steroiden durch die Gonaden von Säugetieren verhindern.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Peptide mit den gewünschten Eigenschaften und Verfahren zu ihrer Herstellung aufzufinden.

Durch die vorliegende Erfindung werden Peptide zur Verfügung gestellt, die die Abgabe von Gonadotropinen in Säugetieren inhibieren und weiterhin Methoden zur Inhibierung der Abgabe von Steroiden durch die Gonaden von männlichen und weiblichen Säugetieren. Die verbesserten GnRH-Analogen sind gegenüber GnRH stark antagonistisch und haben eine hemmende Wirkung auf die Reproduktionsprozesse der Säugetiere. Diese Analogen können zur Inhibierung der Produktion von Gonadotropinen und Sexualhormonen unter verschiedenen Bedingungen einschließlich frühzeitiger Pupertät, hormonabhängiger Neoplasie, Dysmenorrhoe oder Endometritis verwenden werden. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wurden im allgemeinen Peptide hergestellt, die die Abgabe von Gonadotropinen durch die Hirnanhangdrüse von Säugetieren, einschließlich von Menschen, stark inhibieren und/oder die Abgabe von Steroiden durch die Gonaden hemmen. Diese Peptide sind Analoge des GnRH, in denen ein D-Isomer-Rest einer alpha-Aminosäure mit einer aminhaltigen Seitenkette, z. B. D-Lys, D-Orn und D-Dap, in die 6-Stellung eingeführt wird, wobei die Aminogruppe der Seitenkette über eine Peptid-(Amid-)bindung an einen Argininrest gebunden ist, der nun wiederum über Peptidbindunge an bis zu vier weitere Argininreste gebunden sein kann. Die Argininreste/der Argininrest können entweder L-Arg oder D-Arg sein, die Guanidingruppe der Seitenkette eines jeden Restes kann unsubstituiert oder durch eine Methyl-(Me), Ethyl-(Et), Propyi-(Pr) oder Butyl-(Bu)gruppe mono- oder disubstituiert sein. Wenn im nachfolgenden Text eine solche Disubstitution angezeigt wird, soll diese so verstanden werden, daß jede der Alkylgruppen an beide Stickstoffatome der Guanidingruppe gebunden ist. Die alpha-Aminogruppe des letzten Argininrestes in diesem Seitenketten-Peptid ist vorzugsweise durch eine Acylgruppe mit 7 oder weniger Kohlenstoffatomen, vorzugsweise durch eine Acetylgruppe (Ac) acyliert. Weiterhin sind Substitutionen in der 1-Stellung, z. B. Dehydro-Pro, Pro, D-pGlu, D-Phe, D-Trp oder ß-(2-Naphthyl)-D-alanin (im weiteren als /3-D-2-NAL bezeichnet), in der 2-Stellung,z. B. ein substituiertes, z.B. halogeniertes D-Phe, in der 3-Stellung, gegebenenfalls in der 4-Stellung durch eine Diaminosäure mit bis zu fünf Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls in der 5-Stellung in Form eines halogenierten L-Phe oder eines L-Tyr und gegebenenfalls in den 7- und 10-Stellungen möglich. Der Substituent in der 1-Stellung kann modifiziert sein, so daß seine alpha-Aminogruppe eine Acylgruppe, z. B. eine Formyl-, Acetyl-, Acrylyl-, Vinylacetyl-(Vac) oder Benzoyl-(Bz)gruppe enthält, wobei die Acetyl-(Ac) und die Acrylyl-(Acr)gruppen bevorzugt werden.

Ein modifiziertes D-Trp in der 3-Stellung führt zu einer erhöhten antagonistischen Aktivität als Ergebnis der speziellen Modifikationen im Indolring. Einfache Substitutionen der Wasserstoffatome sind in der 5- oder 6-Stellung möglich. Die Substituenten sind z. B. Chlor, Fluor, Brom, eine Methyl- Amino-, Methoxy- oder Nitrogruppe, wobei Chlor, Fluor und die Nitrogruppe bevorzugt werden. Dielndolstickstoff kann auch acyliert werden, z.B. durch eine Formylgruppe{NⁱⁿFor-oder 1 For-) oder durch eine Acetylgruppe. Wie bereits oben erwähnt worden ist, werden die Substitutionen in den 4-, 7- und 10-Stellungen als Möglichkeiten betrachtet.

Da diese Peptide eine hohe Wirksamkeit in bezug auf die Inhibierung der Abgabe von LH aufweisen, werden sie oftmals als GnRH-Antagonisten bezeichnet. Die Peptide inhibieren die Ovulation weiblicher Säugetiere, wenn sie in sehr geringen Dosen beim Proestrus verabreicht werden, und sie sind auch wirksam im Hinblick auf die Resorption befruchteter Eizellen, wenn sie kurze Zeit nach der Befruchtung verabreicht werden. Diese Peptide sind weiterhin wirksam zur kontrazeptiven Behandlung männlicher Säugetiere.

Genaue Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die Peptide des erfindungsgemäßen Verfahrens werden, genauer ausgedrückt, durch die folgende Formel I dargestellt:

X-R_r(W)D-Phe-R3-R₄-R₅-Re(V)-R7-Arg-Pro-Rio · (D,

worin X Wasserstoff oder eine Acy !gruppe mit bis zu sieben Kohlenstoffatomen, R-) Dehydro-Pro, Pro, D-pGlu, D-Phe, D-Trp, oder /3-D-NAL, W F, Cl, Cl₂, Br, NO₂ oder C^aMe-CI, R₃ D-Trp, (NⁱⁿFor)D-Trp oder D-Trp mit Substitution in der 5- oder 6-Stellung durch NO₂ NH₂, OCH₃, F, Cl, Br oder CH₃, R₄ Ser, Orn, AAL oder aBu, R₅ Tyr, (3 F)Phe, (2 F)Phe, (31) Tyr, (3CH₃)Phe, (2CH₃)Phe, (3CI)Phe oder (2 CI)Phe, R₆ D-Lys, D-Om oder D-Dap, V (arg-R', R")n(X), wobei η eine Zahl zwischen 1 und 5, R' und R" Wasserstoff, Methyl-, Ethyl-, Propyl- oder Butylgruppen sind, R₇ Leu, NML, Nie oder Nva und R₁₀ GIy-NH₂, D-AIa-NH₂ oder NH-Y ist, wobei Y eine niedere Alkyl- oder eine NH-CONH-Q-gruppe ist, in der Q Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe bedeutet. Durch /3-D-NAL wird das D-Isomere des Alanins bezeichnet, das am ^-Kohlenstoffatom durch eine Naphthylgruppe substituiert ist, und das auch als 3-D-NAL bezeichnet werden kann. Vorzugsweise wird /3-D-2NAL verwendet, was bedeutet, daß das/3-Kohlenstoffatom an das Naphthalinsystem an der 2-Stellung der Ringstruktur gebunden ist. Jedoch kann auch /3-D-1 NAL verwendet werden. Durch NML wird N^aCH₃-L-Leu bezeichnet. Dap bezeichnet a,/3-Diaminopropionsäure, die auch als/3-Aminoalanin bezeichnet wird, und aBu bedeutet a,y-Diaminobuttersäure, von denen jede oder Orn in der 4-Stellung anwesend sein kann. Falls Ser in der 4-Stellung nicht vorhanden ist, ist DehydroPro vorzugsweise in der 1-Stellung eingebaut. Der Term „R₆(arg-R',R")_n(X)" wird dazu verwendet, um den D-Aminosäurerest in der Peptidhauptkette zu beschreiben, der durch seine Seitenkettenaminogruppe auch einen Teil der Arginin enthaltenden Seitenkette bildet. Vorzugsweise ist der Rest in der Hauptkette D-Lys, es kann jedoch an dessen Stelle auch D-Om oder D-Dap stehen. Der Argininrest oder der Rest, der das Seitenkettenpeptid darstellt, kann entweder in der Form des D-Isomeren oder des L-Isomeren vorliegen. Allgemein gilt, wenn mehr als ein Argininrest in dem Seitenkettenpeptid vorkommt, daß diese dann die gleiche isomere Form aufweisen. Das ist jedoch nichteine notwendige Voraussetzung, denn es kann ein Gemisch der D-und L-Isomeren in einem Seitenkettenpeptid aus mehreren Resten verwendet werden. Wie bereits hier dargestellt, kann die Guanidin-Seitenkette an jedem der Argininreste nicht " substituiert oder durch niedere Alkylgruppen mono- oder disubstituiert sein. Wiederum, wenn zwei oder mehr substituierte Argininreste in der Peptidseitenkette vorhanden sind, werden sie deti gleichen Substituenten aufweisen. Das ist jedoch nicht notwendigerweise so und, wenn es erwünscht ist, können in dergleichen Peptidseitenkette verschiedene niedere Alkylgruppen als Substituenten verwendet werden. X wird dazu verwendet, eine mögliche Acylierung der endständigen alpha-Aminogruppe im Seitenkettenpeptid darzustellen. Es kann ebenso verwendet werden wie in der Acylierung der endständigen Aminfunktion der Peptidhauptkette des GnRH-Analogen.

Die Peptide nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können nach der Methode der klassischen Lösungssynthese oder durch eine Festphasentechnik unter Verwendung chlormethylierter Kunstharze, von Methylbenzhydrylaminharzen (MBHA), Benzhydrylaminharzen (BHA) oder anderen, nach dem Stand der Technik bekannten und geeigneten Kunstharzen hergestellt werden. Die Synthese nach der Festphasentechnik wird in der Art und Weise ausgeführt, daß die Aminosäuren in der Kette schrittweise addiert werden, wie es in der US-PS 4.211.693 im Detail beschrieben worden ist. Schutzgruppen für die Seitenketten, die nach dem Stand der Technik gut bekannt sind, werden vorzugsweise an Ser, Tyr und Arg gebunden, wenn diese vorhanden sind, sowie auch an bestimmte andere Substituenten, und können gegebenenfalls an Trp gebunden werden (wenn es nicht acyliert ist), bevor diese Aminosäuren an die Kette addiert werden, die auf dem Kunstharz aufgebaut wird. Mit dieser Methode wird ein vollständig geschütztes Zwischenprodukt, ein Peptidkunstharz, zur Verfügung gestellt. Die erfindungsgemäßen Zwischenprodukte können durch die Formel Il wiedergegeben werden:

X¹-R₁-(W)D-Phe-R₃(X²)-R₄(X³)-R₆(X⁴)-R₆(V)-R₇-Arg(X⁵)-Pro-X⁶ ₎ (II)

worin bedeuten:

X¹ eine alpha-Amino-Schutzgruppe der Art, die bekannterweise geeignet ist bei der schrittweisen Synthese von Polypeptiden. Wenn X in der gewünschten Peptidzusammensetzung eine spezielle Acylgruppe sein soll, kann diese Gruppe als Schutzgruppe verwendet werden. Unter den verschiedenen Klassen von Schutzgruppen für alpha-Aminogruppen, die durch X¹ definiert werden, sind (1) Schutzgruppen vom Acyltyp wie Formyl (For), Trifluoracetyl, Phthalyl, p-Toluensulfonyl (Tos), Benzoyl (Bz), Benzensulfonyl, o-Nitrophenylsulfonyl (Nps), Tritylsulfenyl, o-Nitrophenoxy-acetyl, Acrylyl (Acr), Chloracetyl, Acetyl (Ac) und γ-Chlorbutyryl; (2) aromatische Schutzgruppen vom Urethantyp, z.B. Benzyloxycarbonyl (Z), Fluorenylmethyloxycarbonyl (FMOC) und substituierte Benzyloxycarbonylgruppen wie p-Chlorbenzyloxycarbonyl (CIZ), p-Nitrobenzyloxycarbonyi, p-Brombenzyloxycarbonyl und m-Methoxybenzyloxycarbonyi; (3) aliphatische Schutzgruppen vom Urethantyp wie tert-Butyloxycarbonyl (Boc), Diisopropylmethoxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl; (4) Cycloaliphatische Schutzgruppen vom Urethantyp wie Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und Cyclohexyloxycarbonyl; (5) Schutzgruppen vom Thiourethantyp wie Phenylthiocarbonyl; (6) Schutzgruppen vom Alkyltyp wie Allyl (AIy), Triphenylmethyl (Trityl) und Benzyl (BzI); (7) Trialkylsilangruppen wie Trimethylsilan. Die bevorzugte Schutzgruppe für die alpha-Aminogruppe ist Boc, wenn X Wasserstoff bedeutet;

X² Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für den Indolstickstoff, z.B. Formyl oder Benzyl. Bei vielen Synthesen ist es indes nicht nötig, die NH-Gruppe im Indol desTrpzu schützen. X² ist jedoch Formyl, wenn R₃ (N'"For)D-Trp bedeutet; X³ Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die alkoholische Hydroxylgruppe von Ser, z.B. eine Acetyl-, Benzoyl-, Tetrahydropyranyl-, tert-Butyl-, Trityl-, Benzyl- oder 2,6-Dichlorbenzylgruppe, wobei eine Benzylgruppe bevorzugt wird. Wenn andererseits für Ser eine Substitution durchgeführt wird, kann X³ eine Schutzgruppe für eine Seitenkettenaminogruppe sein, z. B. Tos, Z oder CIZ;

X⁴ Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die phenolische Hydroxylgruppe von Tyr, wenn Tyr anwesend ist, die unter den Gruppen Tetrahydropyranyl, tert-Butyl, Benzyl, Z, 4-Brombenzyloxycarbonyl und 2,6-Dichlorbenzyl ausgewählt werden kann. Eine 2,6-Dichlorbenzylgruppe wird bevorzugt;

X⁵ eine Schutzgruppe für die seitenständige Guanidingruppe des Arg, z. B. eine Nitro-, Tos-, Trityl-, Benzyloxycarbonyl-, Adamantyloxycarbonyl-, Z- oder Boc-gruppe, oder X⁵ bedeutet Wasserstoff, was bedeutet, daß es an den Atomen der Seitenkettengruppe keine Schutzfunktionen gibt. Im allgemeinen wird Tos bevorzugt; .

X⁶ eine Gruppierung der Art Gly-O-CH₂-(Kunstharzträger), O-CH₂-(Kunstharzträger), D-Ala-O-CH₂-(Kunstharzträger), GIy-NH-(Kunstharzträger) oder D-AIa-NH-(Kunstharzträger) und es kann sein: eine OH-, Ester-, Amid- oder Hydrazidgruppe entweder von GIy oder von D-AIa oder direkt an Pro gebunden.

Das Kriterium für die Auswahl der Seitenketten-Schutzgruppen ist für X² bis X⁵ folgendes: die Schutzgruppe sollte gegenüber dem Reagens unter den Reaktionsbedingungen, die für die Entfernung der alpha-Amino-Schutzgruppe bei jedem Schritt der Synthese gewählt werden, stabil sein. Die Schutzgruppe soll unter den Bedingungen der schrittweisen Addition nicht abspalten, aber die Schutzgruppe soll nach Beendigung der Synthese der gewünschten Aminosäurensequenz unter solchen Reaktionsbedingungen abspaltbar sein, die die Peptidkette nicht verändern.

Wenn die X⁸-Gruppierung folgendermaßen aufbebaut ist: Gly-O-OH₂-(Kunstharzträger), D-Ala-O-CH₂-{Kunstharzträger) oder O-CH₂-(Kunstharzträger), dann wird eine Estergruppe einer der vielen funktioneilen Gruppen des Polystyren-Kunstharzträgers dargestellt. Wenn die X⁶-Gruppierung folgendermaßen aufgebaut ist: Gly-NH-(Kunstharzträger) oder D-AIa-NH-(Kunstharzträger), dann verbindet eine Amidbindung GIy oder D-AIa mit dem BHA-Kunstharz oder mit einem MBHA-Harz. Wenn X z. B. eine Acetylgruppe an der endständigen Aminfunktion im Endprodukt ist, ist es möglich, sie als eine X¹-Schutzgruppe für diealpha-Aminogruppe von D-NAL oder einer beliebigen anderen Aminosäure in der 1-Stellung verwendet werden, indem man sie zugibt, bevor diese letzte Aminosäure an die Peptidkette addiert wird. Jedoch wird eine Reaktion vorzugsweise mit dem Peptid, das an das Kunstharz gebunden ist, durchgeführt (nach der Deblockierung der alpha-Aminogruppe, wobei die Seitenkettengruppen geschützt bleiben), z.B. durch Umsetzung mit Essigsäure in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder vorzugsweise mit Essigsäureanhydrid oder durch eine andere geeignete Reaktion, die nach dem Stand der Technik bekannt ist. Die gleichen Überlegungen sind für die alpha-Aminogruppe am Ende der Peptidseitenkette gültig. Das vollständig geschützte Peptid kann durch Ammonolyse von dem chlormethylierten Kunstharzträger abgespalten werden, wie nach dem Stand der Technik bekannt ist, und ergibt so das vollständig geschützte Amid-Zwischenprodukt. Die Deblockierung des Peptids sowie die Abspaltung des Peptids vom Benzhydrylaminharz können bei O⁰C mittels Fluorwasserstoffsäure (HF) durchgeführt werden. Vor der Umsetzung mit HF wird dem Peptid vorzugsweise Anisol zugesetzt. Nach der Entfernung von HF unter vermindertem Druck wird das abgespaltene, von Schutzgruppen befreite Peptid üblicherweise mit Ether versetzt, dekantiert, in verdünnter Essigsäure aufgenommen und lyophilisiert. Zu diesem Zeitpuntk kann das Peptid, wenn es erwünscht ist, in ein nichttoxisches Salz umgewandelt werden, z. B. durch Umsetzung mit 1 N Essigsäure. Diese Erfindung stellt also auch ' ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids der Formel I oder eines seiner ungiftigen Salze zur Verfügung. Das Verfahren besteht darin, (a) ein Zwischenprodukt der Formel Il herzustellen:

X¹-R_l-(W)D-Phe-R₃(X²)-R4(X³)-R₅(X⁴)-Re(V)-R7-Arg(X⁵)-Pro-X⁶,

wobei X¹ Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für alpha-Aminogruppen, X² Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für den Idolstickstoff, X³ Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die alkoholische Hydroxylgruppe des Ser oder für eine Aminogruppe der Seitenkette, X⁴ Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die phenolische Hydroxylgruppe des Tyr, X^s Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für eine Aminogruppe der Seitenkette bedeuten und X⁶ aus Gruppe Gly-O-CH₂-(Kunstharzträger), 0-CH₂-(Kunstharzträger), D-Ala-O-CH₂-(Kunstharzträger), Gly-NH-(Kunstharzträger), D-Ala-NH-(Kunstharzträger), GIy-NH₂, Estern* Amiden und Hydraziden ausgewählt wurde, (b) eine oder mehrere der Gruppen X¹ bis X⁵ abzuspalten und/oder von einem Kunstharzträger, wie er für X⁶ dargestellt wurde, abzuspalten und, wenn es erwünscht ist, (c) das so hergestellte Peptid in ein ungiftiges Salz davon umzusetzen.

Die Reinigung des Peptids wird durch lonenaustauschchromatographie an einer CMC-Säule durchgeführt und anschließend daran durch Verteilungschromatographie unter Verwendung des folgenden Elutionssystems: n-Butanol:0,1 N Essigsäure im Volumenverhältnis 1:1 an einer mit Sephadex G-25 gefüllten Säule oder durch HLPC, wie es durch die Beschreibung von J. Rivier et al. in J. Chromatography 288, 303-328 (1984) bekannt ist.

Die erfindungsgemäßen Peptide sind zur Verhinderung der Ovulation von weiblichen Ratten bei Dosierungen von weniger als 100 Mikrogramm je Kilogramm Körpergewicht wirksam, wenn sie ungefähr zu Mittag des Tages des Proestrus verabreicht werden. Um die Ovulation über längere Zeiträume zu unterdrücken, kann es notwendig werden, die Dosierung zu erhöhen und zwischen etwa 0,1 und 2,5mg je Kilogramm Körpergewicht zu verwenden.

Diese Antagonisten sind darüber hinaus zur Unterdrückung der Samenbildung wirksam, wenn sie männlichen Säugetieren regelmäßig verabreicht werden. Sie können folglich als Kontrazeptiva verwendet werden.

Da diese Verbindungen die Testosteron-Konzentration vermindern (im normalen, sexuell aktiven männlichen Tier eine unerwünschte Folge), kann es sich als wünschenswert erweisen, zusammen mit dem GnRH-Antagonisten Ersatzdosierungen von Testosteron zu verarbreichen.

Diese Antagonisten können außerdem zur Regulierung der Produktion von Gonadotropinen und Sexualsteroiden zu anderen Zwecken, als sie hier beschrieben worden sind verwendet werden.

Ausführungsbeispiele

Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Peptide, die in Tabelle 1 dargestellt sind und die Formel

Ac-R_r(4F)D-Phe-R3-Ser-Tyr-D-Lys(V)-Leu-Arg-Pro-R₁₀ aufweisen, werden nach der Methode der Festphasenreaktion hergestellt, wie sie weiter oben beschrieben wurde.

Tabelle 1	Ri	R₃	V	Rio
Nr.	/3-D-2 NAL	D-Trp	Arg₃(Ac)	GIy-NH₂
1	/3-D-2 NAL	D-Trp	Arg₃(AC)	D-AIa-NH₂
2	DehydroPro	(6NO₂)D-Trp	Arg₃(Ac)	GIy-NH₂
3	/3-D-2 NAL	(6NH₂)D-Trp	D-Arg₂(Ac)	GIy-NH₂
4	β-Ό-2 NAL	(5OCH₃)D-Trp	(Et)D-Arg(Ac)	GIy-NH₂
CJl	/3-D-2 NAL	(5 Br)D-Trp	(Et₂)D-Arg(Ac)	GIy-NH₂
6	/3-D-2NAL	(5 F)D-Trp	(MeMEt)Arg(Ac)	GIy-NH₂
7	/3-D-2NAL	(5CI)D-Trp	(Pr)Arg₂(Ac)	GIy-NH₂
8	Pro	(5CH₃)D-Trp	(Et₂)Arg₄(Ac)	GIy-NH₂
9	/3-D-2 NAL	(NⁱⁿFor)D-Trp	(Et)D-Arg₃(Ac)	GIy-NH₂
10	/3-2 NAL	(5 F)D-Trp	D-Arg(Ac)	GIy-NH₂
11	Pro	(5CI)D-Trp	(Et₂)Arg₃	GIy-NH₂
12	DehydroPro	(6NO₂)D-Trp	(Me)Arg₄	NHCH₂CH₃
13	D-Trp	(5 F)D-Trp	D-Arg₂(Acr)	NHCH₂CH₃
14	D-PGIu	(5F)D-Trp	(Bu)Arg(Ac)	D-AIa-NH₂
15	D-Phe	(6NO₂)D-Trp	(Pr)D-Arg(Bz)	NHCH₂CH₂CH₃
16

Um ein Beispiel zu geben, wird eine typische Festphasen-Synthese des oben genannten Peptids 1, das als (Ac-/3-D-2NAL\ (4F)D-Phe², D-Trp³, D-Lys⁶(Arg₃-Ac)-GnRH bezeichnet wird, im folgenden beschrieben. Dieses Peptid hat die folgende Formel:

Ac-/8-D-2NAL-(4F)D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Arg₃-Ac)-Leu-Arg-Pro-GlyNH₂

Die anderen Peptide werden ebenso hergestellt und gereinigt. Es wird ein BHA-Kunstharz verwendet. An dieses wird ein Boc-geschütztes GIy unter Verwendung eines dreifachen Überschusses des Boc-Derivates und DCC als Aktivator gekoppelt. Der Glycinrest bindet sich an das BHA-Harz über eine Amidbindung.

Nach der Kopplung eines jeden Aminosaurerestes wird gewaschen, deblockiert und der nächste Aminosäurerest gekoppelt unter Beachtung des folgenden Reaktionsschemas unter Verwendung eines Automaten. Es wird mit etwa 5g des Kunstharzes begonnen.

Schritt Reagenzien und Operationen Mischzeit (m)

1 CH₂CI₂Waschungmit80ml,2mal 3

2 Methanol-Waschung (MeOH) mit30 ml, 2mal » 3

3 CH₂CI₂Waschung mit80ml,3mal 3 • 4 50%TFAplus5%1,2-EthandithiolinCH₂CI₂70ml,2mal 10

5 Isopropanol +1 %Ethandithiol Waschung, 80 ml, 2mal ' 3

6 TEA 12,5% in CH₂CI₂,70 ml, 2mal 5

7 ' MeOH-Waschung,40ml,2mal 2 ·'

8 CH₂CI₂Waschung,40ml, 2mal 3

9 Boc-Aminosäure(10mMol)in30mlentwederDMFoder CH₂CI₂ in Abhängigkeit von der Löslichkeit der speziellen geschützten Aminosäure, dazu 1OmMoI DCC in CH₂CI₂,1 mal 30-300

10 Methanol-Waschung, 40 ml, 2mal 3

11 TEA 12,5% in CH₂CI₂,70 ml, 1 mal 3

12 Methanol-Waschung, 30 ml, 2mal 3

13 CH₂CI₂-WaSChUiIg, 80 ml, 2mal 3

Nach Durchführung des Schrittes 13 kann eine aliquote Menge zum Ninhydrin-Test entnommen werden: Fällt der Test negativ aus, wird zu Stufe 1 zurückgegangen zur Kopplung der nächsten Aminosäure, fällt der Test positiv öder etwas positiv aus, wird zu Schritt 9 zurückgegangen und die Schritte 9 bis 13 wiederholt. Das oben beschriebene Reaktionsschema wird allgemein angewendet zur Kopplung jeder Aminosäure für die erfindungsgemäßen Peptide, nachdem die erste Aminosäure gebunden worden ist, einschließlich der Aminosäuren, die die Seitenketten-Peptide bilden. Der Schutz durch N^aBoc wird für jede der verbleibenden Aminosäuren während der gesamten Synthese verwendet, ausgenommen im Falle des D-Lys, wo eine andere Schutzgruppe, z. B. eine basenlabile Gruppe wie FMOC, verwendet wird, um die Peptidseitenkette aufzubauen. N^aBoc-/3-D-2 NAL wird nach einer bekannten Methode hergestellt, z.B. nach der, wie sie im US-PS 4.234.571 genau beschrieben worden ist (Ausgabetag: 18.11.1980). Die Seitenkette von Arg wird durch Tos geschützt. Für die Hydroxylgruppe des Ser wird OBzI als Schutzgruppe der Seitenkette verwendet. D-Trp wird ungeschützt verwendet.

N^aBoc-/3-D-2 NAL wird als endständige Aminosäure zuletzt eingeführt. Boc-Arg(Tos) und Boc-D-Trp werden in Gemischen aus DMF und Dichlormethan gekoppelt, da sie eine schlechte Löslichkeit in Dichlormethan aufweisen.

Boc-D-Lys mit einem acetylierten Arginin-Tripeptid, das durch eine Amidbindung an seine Seitenketten-Aminogruppe gebunden ist, kann separat hergestellt werden und dann in die Stellung zum Leu-Rest am Kunstharz-Peptid gebunden werden, wie es im obigen Reaktionsschema im allgemeinen beschrieben worden ist. Die Peptidseitenkette wird jedoch vorzugsweise auf dem Harz auf eine solche Art und Weise aufgebaut, daß die alpha-Aminogruppe des D-Lys mit der säurestabilen FMOC-Schutzgruppe selektiv blockiert wird, während die Seitenketten-e-Aminogruppe mit Boc geschützt wird. Abspaltung der Schutzgruppen nach dem oben beschriebenen Reaktionsschema entfernt die Schutzgruppe Boc, so daß bei der folgenden Umsetzung mit Arginin (das mit Tos oder Boc blockiert ist) die Reaktion an der $-Aminogruppe des Lys stattfindet und damit der Aufbau des Seitenkettenpeptids beginnt. Danach wird an der alpha-Aminogruppe des Arginins deblockiert und das folgende, geschützte Argininmolekü I koppelt an dieser Stellung, wie es in dem obigen Reaktionsschema beschrieben worden ist, bis das Seitenketten-Peptid vollständig aufgebaut ist. Nachdem der letzte Argininrest deblockiert ist, wird seine alpha-Aminogruppe mit Essigsäureanhydrid in Dichlormethan acetyliert. Zu diesem Zeitpunkt wird die FMOC-Schutzgruppe der alpha-Aminogruppe des Lysins unter Verwendung üblicher Methoden entfernt, z. B. durch die Behandlung mit einer geeigneten Base, d. h. Piperidin mit einer Konzentration von 5 bis 10Vol.-% in DMF. Danach wird der Aufbau der Peptidhauptkette fortgesetzt. Nach der Deblockierung der alpha-Aminogruppe am N-Terminal wird diese durch Verwendung eines großen Überschusses an Essigsäureanhydrid in Dichlormethan acetyliert. Die Abspaltung des Peptids vom Kunstharz und die vollständige Abspaltung der Schutzgruppen der Seitenketten wird sehr schnell bei 0⁰C in HF durchgeführt.

Vor der Reaktion mit HF wird Anisol als Fänger zugesetzt. Nachdem HF im Vakuum entfernt worden ist, wird das Kunstharz mit 50%iger Essigsäure extrahiert und die Waschlösungen lyophilisiert, wodurch ein rohes Peptidpulver erhalten wird. Die Reinigung des Peptids geschieht dann in folgender Weise:

Zunächst wird durch lonenaustauschchromatographie an CMC (Whatman CM 32 unter Verwendung eines Gradienten von 0,05 bis 0,3M Ammoniumacetat in 50/50 Methanol/Wasser) und danach durch Verteilungschromatographie über eine Gelfiltrationssäule mit dem Elutionssystem n-Butanol:0,1 η Essigsäure im Volumenverhältnis 1:1 gereinigt. Die Einheitlichkeit des Peptids wird mittels Dünnschichtchromatographie und verschiedenen Lösungsmittelsystemen sowie durch Verwendung von Revers-Phasen-Hochdruckflüssigchromatographie mit einer wäßrigen Triethylammoniumphosphatlösung plus Acetonitril beurteilt.

Die Aminosäurenanalyse des so erhaltenen, gereinigten Peptids stimmt mit der Formel für die herzustellende Struktur überein und weist im wesentlichen ganze Zahlen für die Aminosäuren in der Kette auf. Die optische Drehung wird in einem photoelektrischen Polarimeter gemessen und beträgt [aju² = -28,0° ±-1 (c = 1, 50% Essigsäure).

Das Peptid wird in vivo zur Bestimmung seiner Wirksamkeit bei der Verhinderung der Ovulation in weiblichen Ratten getestet. Bei diesem Test wird einer festgelegten Anzahl erwachsener, weiblicher Sprague-Dawley-Ratten, in diesem Falle sieben, mit einem Körpergewicht zwischen 225 bis 250g am Tage des Proestrus eine festgelegte Menge des Peptids in Maisöl ungefähr zu Mittag subcutan injiziert. Proestrus ist der Nachmittag der Ovulation. Eine weitere, davon getrennte Gruppe weiblicher Ratten wird als Kontrolle verwendet; dieser wird das Peptid nicht verabreicht. Jede der weiblichen Ratten der Kontrollgruppe hat am Abend des Proestrus eine Ovulation. Von der Gruppe der behandelten Ratten wird die Anzahl aufgezeichnet, bei denen eine Ovulation eintritt. Bei einer Dosis von 1 ^g tritt bei keiner von sieben Ratten eine Ovulation auf, bei einer Dosis von 0,5 μg tritt bei 9 Ratten von 10 eine Ovulation ein. Es wird eingeschätzt, daß jedes der Peptide aus Tabelle 1 signifikant wirksam ist im Hinblick auf die Verhinderung der Ovulation weiblicher Ratten bei sehr niedriger Dosierung. Es wird weiterhin eingeschätzt, daß jedes dieser Peptide bei einer Dosierung von etwa 5 Mikrogramm vollkommen wirksam ist. Viele dieser Peptide sind wesentlich wirksamer in vivo als die gegenwärtigen Standardprodukte.

Beispiel 2

Es werden die Peptide in der Tabelle Il mit folgender Formel:

Ac-/3-D-2NAL-(W)D-Phe-R₃-R4-R5-D-Lys(Arg3-Ac)-R₇-Arg-Pro-D-Ala-NH₂

nach der Methode der Festphasensynthese, wie sie oben beschrieben worden ist, hergestellt.

Tabelle Il	W	R₃	R₄	R₅	R₇
Nr.	4Br	(6NO₂)D-Trp	Ser	Tyr	Nie
17	4Br	(6NO₂)D-Trp	Ser	(2F)Phe	Leu
18	4Br	(6NO₂)D-Trp	Dap	Tyr	Nva
19	4Cl	(6NO₂)D-Trp	aBu	Tyr	Nie
20	4Cl	(1 For)D-Trp	Ser	Tyr	Nie
21	4Cl	(1 For)D-Trp	Ser	(2CH₃)Phe	Nva
22	4F	(1 For)D-Trp	Ser	(2CH₃)Phe	NML
23

Tabelle II (Fortsetzung)

24	4F	(5CI)D-Trp	Ser	(3CH₃)Phe	NML
25	4F	(5CH₃)D-Trp	Ser	(2CI)Phe	NML
26	4NO₂	(5CH₃)D-Trp	Ser	(2CI)Phe	NML
27	4NO₂	(5 F)D-Trp	Orn	Tyr	Nie
28	2,4Cl₂	(5CI)D-Trp	Ser	(3F)Phe	Nie
29	2,4Cl₂	(6NO₂)D-Trp	Dap	(3F)Phe	Nva
30	C^aMe-4CI	(5F)D-Trp	Ser	(3l)Tyr	NML
31	3,4Cl₂	(5 F)D-Trp	Om	(3CI)Phe	Leu
					(Acetat)

Die Untersuchung der in Tabelle Il aufgelisteten Peptide in vitro und/oder in vivo hat gezeigt, daß die in Tabelle Il aufgeführten Peptide als wirksam eingeschätzt werden, bei geeigneter Konzentration die durch GnRH hervorgerufene Abgabe von LH in vitro zu blockieren. Viele der Peptide sind in vivo wirksamer als der gegenwärtige Standard. Es wird eingeschätzt, daß alle diese Peptide die Ovulation weiblicher Säugetiere bei sehr kleinen Dosierungen verhindern.

Beispiel 3

Es werden die Peptide in der Tabelle III mit folgender Formel:

X-i3-D-2NAL-(4CI)D-Phe-(1For)D-Trp-Ser-R₅-D-Lys(V)-NML-Arg-Pro-R_l0 nach der Methode der Festphasensynthese, wie sie oben beschrieben worden ist, hergestellt:

Tabelle Il	Nr.	X	R₅	V	*	Rio
32	Ac	Tyr	D-Arg₃(Ac)	GIy-NH₂
33	Ac r	"Tyr	D-Arg₃(Ac)	D-AIa-NH₂
34	For	Tyr	Arg (Ac)	NHCH₂CH₃
35	Bz	(3F)Phe	(Et)D-Arg(Acr)	NHCH₃
36	Ac	(2F)Phe	(Et)Arg₂	NHCF₃
37	Vac	(2CI)Phe	(Me)D-Arg(Ac)	NHCH₂CH₂CH₃
38	Ac r	(3CI)Phe	(Et)Arg	NHCF₂CF₃
39 .	Ac	(3F)Phe	(Et)D-Arg₅(Ac)	D-AIa-NH₂
40	Acr	(3l)Tyr	(Bü)D-Arg(Ac)	D-AIa-NH₂
41	Ac	Tyr	(Et₂)D-Arg₅	D-AIa-NH₂
42	Ac	(3CI)Phe	(Et)Arg₃Ac	GIy-NH₂
43	Vac	(3CI)Phe	(Me)Arg₂Ac	NHNHCONH₂
44	Bz	(3CI)Phe	(Pr)Arg₃(Acr)	NHNHCONHCh₃

Die Untersuchung der in Tabelle III aufgelisteten Peptide in vitro und/oder in vivo hat gezeigt, daß die in Tabelle III aufgeführten Peptide als wirksam eingeschätzt werden, bei geeigneter Konzentration die durch GnRH hervorgerufene Abgabe von LH in vitro zu blockieren. Viele dieser Peptide sind in vivo wirksamer als der gegenwärtige Standard. Es wird eingeschätzt, daß alle diese Peptide die Ovulation weiblicher Säugetiere bei sehr kleinen Dosierungen verhindern. »

Beispiel 4

Es werden die Peptide in der Tabelle IV mit folgender Formel:

Ac-R₁-(4F)D-Phe-(6NO₂)D-Trp-Ser-Tyr-R₆(V)-Leu-Arg-Pro-NHCH₂CH₃ nach der Methode der Festphasensynthese, wie sie oben beschrieben worden ist, hergestellt:

Tabelle IV

Ri

45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56

dehydro-Pro

/3-D-1 NAL

Pro

D-Trp

D-Phe

Pro

D-pGlu

D-Om D-Dap D-Dap D-Om D-Ly s D-Dap D-Dap D-Dap D-Om D-Om D-Orn D-Lys

D-Arg₃(Acr) D-Arg₃(Acr) (Pr)Arg(Ac) (Me)Arg(Ac) (Et)D-Arg₂-Acetat (Me)D-Arg(Acr) (Et)Arg(Vac) (Pr)D-Arg₂(Ac) (Bu)Arg₃(Acr) (Et₂)D-Arg„(For) (Et₂)Arg₃(Ac) (Me)Arg₂(Ac)-Acetat

Die Untersuchung der in Tabelle IV aufgelisteten Peptide in vitro und/oder in vivo hat gezeigt, daß die in Tabelle IV aufgeführten Peptide als wirksam eingeschätzt werden, bei geeigneter Konzentration, die durch GnRH hervorgerufene Abgabe von LH in vitro zu blockieren. Viele der Peptide sind in vivo wirksamer als der gegenwärtige Standard. Es wird eingeschätzt, daß alle diese Peptide die Ovulation weiblicher Säugetiere bei sehr kleinen Dosierungen verhindern.

Die erfindungsgemäßen Peptide werden oftmals in Form pharmazeutisch geeigneter, nicht giftiger Salze verabreicht, z. B. in Form der Säureadditionsverbindungen, oder in Form von Metailkomplexen, z. B. mit Zink, Barium, Kalzium, Magnesium, Aluminium oder dergleichen (die im Sinne dieser Beschreibung als Additionsverbindungen aufgefaßt werden) oder in Form der Kombination beider Varianten. Beispielhaft fürderartige Säureadditionsverbindungen seien die Hydrochloride, Hydrobromide, Sulfate, Phosphate, Nitrate, Oxalate, Fumarate, Gluconate, Tannate, Maleate, Acetate, Zitrate, Benzoate, Succinate, Alginate, Malonate, Ascorbate, Tartrate und dergleichen genannt. Zur Herstellung dieser Additionsverbindungen wird eine wäßrige Lösung des Peptids z. B. wiederholt mit 1 N Essigsäure behandelt und dann lyophiiisiert, wodurch das Acetat des Peptids erhalten wird. Wenn der aktive Bestandteil in Form von Tabletten verabreicht werden soll, kann die Tablette außerdem noch ein pharmazeutisch geeignetes Verdünnungsmittel enthalten, das wiederum ein Bindemittel wie Tragacanth, Maisstärke oder Gelatine einschließt, sowie ein Gleitmittel, z. B. Magnesiumstearat. Wird die Verabreichung in flüssiger Form gewünscht, können als Bestandteile des pharmazeutisch geeigneten Verdünnungsmittels Süßungsmittel und/oder Geschmacksstoffe verwendet werden. Intravenöse Verabreichung kann in isotonischer Salzlösung, in Phosphatpuffer-Lösungen und dergleichen ausgeführt werden.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten das Peptid üblicherweise zusammen mit einem bekannten, pharmazeutisch geeigneten Trägermittel. Gewöhnlich beträgt die Dosierung zwischen etwa 1 bis etwa 100 Mikrogramm des Peptids je Kilogramm Körpergewicht des zu behandelnden Individuums, wenn das Mittel intravenös angewendet wird. Die orale Dosierung liegt höher. Ganz allgemein wird die Behandlung von Patienten mit diesen Peptiden auf die gleiche Art und Weise durchgeführt, wie es mit anderen Antagonisten von GnRH in der klinischen Praxis geschieht. Diese Peptide können den Säugetieren intravenös, subcutan, intramuskulär, oral, percutan, z. B. intranasal oder intravaginal, verabreicht werden, um die Fruchtbarkeit zu steuern oder zu inhibieren. Sie können weiterhin zur reversiblen Unterdrückung der gonadalen Aktivität angewendet werden, z. B. zur Behandlung frühzeitiger Pubertät oder während Bestrahlung oder Chemotherapie. Die wirksame Dosierung ist abhängig von der Form der Verabreichung und von der speziellen, zu behandelnden Art von Säugetieren und richtet sich nach diesen Kriterien. Ein Beispiel für eine typische Dosierungsform ist eine bakteriostatische, wäßrige Lösung, die das Peptid enthält. Diese Lösung wird verabreicht, so daß eine Dosierung im Bereich von etwa 0,1 bis 2,5 mg/kg Körpergewicht zur Verfügung gestellt wird. Das Peptid kann oral entweder in fester oder in flüssiger Form verabreicht werden. Obwohl die Erfindung im Hinblick auf ihre bevorzugten Ausführungsformen beschrieben worden ist, sollte es klargemacht sein, daß Veränderungen und Modifizierungen, die einem Fachmann offensichtlich sind, von den beschriebenen Verfahren möglich sind, ohen daß der Schutzumfang der Erfindung verlassen wird, der in den folgenden Ansprüchen definiert wird. So können z. B. andere, nach dem Stand der Technik bekannte Substitutionen, die die Wirksamkeit der Peptide nicht wesentlich verändern, bei den erfindungsgemäßen Peptiden angewendet werden. So können z. b. an Stelle der für Ri₀ spezifizierten Reste GIy-OCH₃ oder Gly-OCH2CH3 oder Sar-NH2 (Sar = Sarcosin) verwendet werden, oder es kann eine Gruppierung NH-Y anwesend sein, wobei Y eine niedere Alkyl-, Cycloalkyl- oder niedere Fluoralkylgruppe oder eine NH-CONH-Q-Gruppierung bedeutet, in welcher Q Wasserstoff oder eine nidere Alkylgruppe ist. Dabei werden alle vorstehenden Möglichkeiten als gleichwertig betrachtet.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder eines nichttoxischen Salzes davon mit der allgemeinen Formel:

X-R₁-(W)D-PhB-R₃-R₄-R₅-R₆(V)-R₇-ArG-PrO-R₁₀,

worin X Wasserstoff oder eine Acylgruppe mit bis zu 7 Kohlenstoffatomen; R-i Dehydro-Pro, Pro, D-pGlu, D-Phe, D-Trp oderß-D-NAL; W F, Cl, Cl₂, Br, NO₂oderC⁹MeCI; R₃D-Trp, (NⁱⁿFor)D-Trp oder durch NO₂ NH₂, OCH₃, F, Cl, Br oder CH₃ in der 5- oder 6-Stellung substituiertes.Trp; R₄ Ser, Orn, AAL oder aBu; R₅Tyr, (3F)Phe, (2F)Phe, (3l)Tyr, (3CH₃)Phe, (2CH₃)Phe, (3CI)Phe oder (2Ci)Phe; R₆ D-Lys,D-Orn oder D-Dap; V (arg-R',R")_n(X), wobei η eine ganze Zahl zwischen 1 und 5, R'und R" Wasserstoff, eine Methyl-, Ethyl-, Propyl- oder Butylgruppe sind, R₇ Leu, NML, Nie oder NVa und R₁₀ GIy-NH₂, D-AIa-NH₂ oder HN-Y bedeuten, wobei Y eine niedere Alkyl-, Cycloalkyl-, niedere Fluoralkyl- oder eine NH-CONH-Q-Gruppierung ist, in der Q Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe ist, gekennzeichnet dadurch, daß (a) ein Zwischenprodukt der Formel