DD241909A5

DD241909A5 - Gnrh-antagonisten. vii

Info

Publication number: DD241909A5
Application number: DD85276513A
Authority: DD
Inventors: Jean E F Rivier; Wylie W Vale
Original assignee: The Salk Institute For Biological Studies,Us
Priority date: 1984-05-21
Filing date: 1985-05-20
Publication date: 1987-01-07
Also published as: ZA852450B

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden mit antagonistischen Eigenschaften gegenueber gonadotropen Hormonen. Die Peptide sollen die Eigenschaft besitzen, die Freisetzung von Steroiden durch die Keimdruesen bei Saeugetieren zu verhindern. Die erfindungsgemaess hergestellten Peptide haben die Struktur XR1(W)DPheR3R4R5R6R7ArgProR10,worin X ein Wasserstoffatom oder eine Acylgruppe mit maximal 7 KohlenstoffatomenR1 DehydroPro, DpGlu, DPhe, 4ClDPhe, DTrp, Pro oder bDNAL; W Cl, F, NO2, CaMe/4Cl, Cl2 oder BrR3 D3PAL, bDNAL oder (Y)DTrp mit YH, NO2, NH2, OCH3, F, Cl, Br, CH3, NinHCO oder NinAcR4 Ser, Orn, AAL oder aBu; R5 Tyr, Arg, (3F)Phe, (2F)Phe, (3I)Tyr, (3CH3)Phe, (2CH3)Phe, (3Cl)Phe oder (2Cl)Phe; oder (2Cl)Phe; R6 ein D-Isomer einer lipophilen Aminosaeure oder 4NH2DPhe, DLys, DOrn, DHar, DHis, 4guaDPhe, DPAL oder DArg R7 Nle, Leu, NML, Phe, Met, Nva, Tyr, Trp, Cys, PAL oder 4FDPhe und R10 GlyNH2, DAlaNH2, NHY mit Y niederes Alkyl, Cycloalkyl, fluorsubstituiertes niederes Alkyl oder NHCONHQ mit Q H oder niederes Alkyl bedeuten, bedeutet R3 DPAL, so ist R5 Arg, und wenn R3 bDNAL oder DTrp darstellt, ist R7 Tyr, PAL, Phe oder 4FDPhe. Die erfindungsgemaess hergestellten Peptide inhibieren die Sekretion von Gonadotropinen durch die Hypophyse und die Freisetzung von Steroiden durch die Keimdruesen. Bei Verabreichung einer entsprechenden Dosis wird die Ovulation von weiblichen Saeugetiereiern und/oder die Freisetzung von Steroiden durch die Keimdruesen verhindert.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden, die die Freisetzung von Gonadotropinen durch die Hypophyse bei Säugetieren einschließlich den Menschen inhibieren, sowie die Ovulation verhindern und/oder die Freisetzung von Steroiden inhibieren.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die Hypophyse ist mit einem Stiel an der als Hypothalamus bekannten Region der Hirnbasis befestigt. Speziell werden von der Hypophyse das follikolotrope Hormon (FSH) und das luteogene Hormon (LH), die beide auch als Gonadotropine oder gonadotrope Hormone bezeichnet werden, freigesetzt. Diese Hormone regulieren die Funktion der Keimdrüsen bei der Produktion von Testosteron in den Hoden und Progesteron und Estrogen in den Ovarien und regulieren auch die Bildung und Reifung von Keimzellen.

Die Freisetzung eines Hormons durch den Hypophysenvorderlappen erfordert gewöhnlich die vorherige Freisetzung einer anderen Hormonklasse, die durch den Hypothalamus produziert wird. Eines der Hypothalamushormone wirkt als Faktor, der die Freisetzung der gonadotropen Hormone, speziell LH, auslöst. Dieses Hormon wird im folgenden als GnRH bezeichnet. In der Literatur wird es auch als LH-RH und als LRF bezeichnet. GnRH wurde isoliert und als Decapeptid mit der folgenden Struktur analysiert: p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂. Peptide sind Verbindungen, die zwei oder mehr Aminosäuren enthalten, wobei die Carboxygruppe der einen Säure an die Äminogruppe der anderen Säure gebunden ist. Die oben angegebene Formel von GnRH entspricht der üblichen Darstellung von Peptidformeln, bei denen sich das Amino-Ende links und das Carboxy-Ende rechts befindet. Die Position eines jeden Aminosäurerestes wird durch Numerierung der Aminosäurereste von links nach rechts angegeben. Im Falle von GnRH ist die Hydroxygruppe des Glycins durch eine Äminogruppe (NH₂) ersetzt. Die genannten Abkürzungen für die einzelnen Aminosäurereste sind allgemein bekannt und bedeuten:

p-Glu-Pyroglutaminsäure,

His-Histidin,

Trp Tryptophan,

Ser Serin,

Typ Tyrosin,

GIy Gylcin,

Leu Leucin,

Orn Ornithin,

Arg Arginin,

Pro Prolin, - .

SarSarcosin,

Phe Phenylalanin,

und AIa Alanin.

Die Aminosäuren, sowie Valin, Isoleucin, Threonin, Lysin, Asparaginsäure, Asparagin, Glutamin, Cystein, Methionin, Phenylalanin und Prolin werden als gewöhnliche, natürliche oder von Peptiden abgeleitete Aminosäuren bezeichnet.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es_%verbesserte Peptide zu erhalten, die starke Antagonisten der endogenen GnRH sind und die Sekretion von luteogenen Hormonen und die Freisetzung von Steroiden durch die Keimdrüsen bei Säugetieren verhindern.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden, die starke antagonistische Eigenschaften gegenüber endogenen GnRH zeigen, zu schaffen.

Die Peptide der vorliegenden Erfindung werden durch die Formel I X-RrlWlD-Phe-Rs-R^Rs-Re-Ry-Arg-Pro-Rio repräsentiert, worin X Wasserstoff oder eine Acylgruppe mit maximal 7 Kohlenstoffatomen, R₁ Dehydro-Pro^-pGlu.D-Phe^CI-D-Phe, D-Trp, Pro oder ß-D-NAL, WCI, F, NO₂, C^aMe/4CI, Cl₂ oder Br, R₃ D-3PAL, ß-D-NAL oder (Y)D-Trp mit Y = H, NO₂, NH₂, OCH₃, F, Cl, Br, CH₃, NⁱⁿHCO oder N_inAc, R₄ Ser, Orn, AAL oder aBu, R₅ Tyr, Arg, (3F)Phe, (2F)Phe, (3l)Tyr, (3CH₃)Phe, (2CH₃)Phe, (3CI)Phe oder (2CI)Phe, R₆ ein D-Isomer einer lipophilen Aminosäure oder 4-NH₂-D-Phe, D-Lys, D-Orn, D-Har, D-His, 4-gua-D-Phe, D-PAL oder D-Arg, R₇ Nie, Leu, NML, Phe, Met, Nva, Tyr, Trp, Cys, PAL oder 4F-D-Phe und R¹⁰ GIy-NH₂, D-AIa-NH₂ oder NH-Y' mit Y' = niederes Alkyl, Cycloalkyl, fluorsubstituiertes niederes Alkyl oder NHCONH-Q mit Q = H oder niederes Alkyl bedeuten. Wenn R₃ D-3PAL ist, ist R₅ Arg; wenn R₃ ß-D-NAL oder D-Trp ist, ist R₇Tyr, PAL, Phe oder 4F-D-Phe; wenn R₁ ß-D-NAI und R₅ nicht Arg ist, ist R₆ vorzugsweise 4-NH₂-D-Phe, D-Lys, D-Orn, D-Har, D-His, 4-gua-D-Phe, D-PaI oder D-Arg. Mit ß-D-NAL wird D-Alanin bezeichnet, daß am ß-Kohlenstoffatom durch Naphthyl substituiert ist, d. h. also 3-D-NAL. Vorzugsweise wird ß-D-2NAL verwendet, bei dem das Naphthalen über die 2-Stellung der Ringstruktur gebunden ist, jedoch kann auch ß-D-1 NAL verwendet werden. PAL bezeichnet Alanin, daß am ß-Kohlenstoffatom durch Pyridyl substituiert ist, vorzugsweise erfolgt die Bindung über die 3-Stellung des Pyridinringes. Bei D-Trp in der 3-Position kann ein Wasserstoffatom in 5- oder 6-Stellung durch Chlor, Fluor, Brom, Methyl. Amino, Methoxy oder Nitro substituiert sein, wobei Chlor, Fluor und Nitro bevorzugt werden. Alternativ kann das Indol-Stickstoffatom acyliert sein, z. B. durch Formyl (N'ⁿHC0- oder 1HCO-) oder Acetyl. Die bevorzugten substituierten Reste sind N'ⁿHCO-D-Trp und 6NO₂-D-Trp. Wenn in 3-Position unsubstituiertes D-Trp verwendet wird, wird in 7-Position ein spezieller Rest eingeführt, nämlich Phe oder 4F-D-Phe oder vorzugsweise Tyr oder PAL. NML bezeichnet N°CH₃-L-Leu. AAL bezeichnet ß-Amino-Ala, aBu bezeichnet α, γ-Diamino-buttersäure. Diese beiden oder Orn können sich in 4-Position befinden. Wenn sich in 4-Position nicht Ser befindet, ist in 1-Position vorzugsweise Dehydro-Pro vorhanden. 4-gua-D-Phe bedeutet den in p-Stellung mit Guanidino substituierten D-Phe-Rest.

Die Peptide der vorliegenden Erfindung können durch klassische Synthese in Lösung oder durch ein Festphasenverfahren an einem chlormethylierten Harz, einem Methyl benzhydrylaminharz (MBHA), einem Benzhydrylaminharz (BHA) oder an einem anderen geeigneten üblichen Harz dargestellt werden. Die Festphasensynthese erfolgt durch stufenweise Anknüpfung der Aminosäuren in der Kette in der Weise, die detailliert in der US-Patentschrift 4211693 beschrieben wird. Seitenketten-Schutzgruppen werden in der üblichen Art vorzugsweise bei vorhandenem Ser, Tyr und Arg sowie bei bestimmten Substituenten angebracht und können auch bei Trp angebracht werden, bevor diese Aminosäuren an die auf dem Harz aufgebaute Kette angeknüpft werden. Bei dieser Methode erhält man das voll geschützte Peptidharz-Zwischenprodukt. Die Zwischenprodukte des erfindungsgemäßen Verfahrens können durch folgende Formel wiedergegeben werden: Xi-R^Wl-D-Phe-RafX^-RifX^-RsiX⁴ oder X⁵)-R₆(X⁵)-R₇(X⁶)-Arg(X⁶)-Pro-X⁷,

worin X¹ eine für die stufenweise Synthese von Polypeptiden geeignete a-Amino-Schutzgruppe ist. Wenn X in der gewünschten Peptidzusammensetzung eine bestimmte Acylgruppe ist, kann diese Gruppe als Schutzgruppe verwendet werden. Als a-Amino-Schutzgruppen X¹ können folgende Verbindungsklassen verwendet werden:

1. Acyl-Gruppen, wie Formyl, Trifluoracetyl, Phthalyl, p-Toluensulfonyl (Tos), Benzoyl (Bz), Benzensulfonyl, o-Nitrophenylsulfenyl(Nps),Tritylsulfenyl,o-Nitro-phenoxyacetyl,Acryloyl(Acr),Chloracetyl, Acetyl (Ac) und γ-Chlorbutyryl;

2. aromatische Urethan-Schutzgruppe, z. B. Benzyl-oxycarbonyl (Z) und substituiertes Benzyloxycarbonyl, wie p-Chlorbenzyloxycarbonyl (CIZ), p-Nitro-benzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl und p-Methoxy-benzyloxycarbonyl;

3. aliphatische Urethan-Schutzgruppen, wie tert-Butoxycarbonyl (Boc), Diisopropylmethoxycarbonyl, Isopropoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl und Allyloxycarbonyl;

4. Cycloalkylurethan-Schutzgruppen, wie Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und Cyclohexyloxycarbonyl;

5. Thiourethan-Schutzgruppen, wie (Phenylthio)-carbonyl;

6. Alkyl-Schutzgmppen, wie Allyl (AIy), Triphenylmethyl (trityl) und Benzyl (BzI);

7. Trialkylsilan-Schutzgruppen, wieTrimethylsilan.

Wenn X Wasserstoff ist, ist die bevorzugte a-Amino-Schutzgruppe Boc.

X₂ ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für den Indol-StickstoffvonTrp, wie Benzyl. Bei vielen Synthesen muß jedoch Trp nicht geschützt werden.

X³ ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die alkoholische Hydroxygruppe von Ser, wie Acetyl/Benzoyl, Tetrahydropyranyl, tert-Butyl, Trityl, Benzyl oder 2,6-Dichlor-benzyl, wobei Benzyl bevorzugt wird. Wenn Ser durch eine andere Aminosäure substituiert ist, kann X³,eine Schutzgruppe für eine Aminogruppe in der Seitenkette sein, wie Tos, Z oder CIZ.

X⁴ ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die phenolische Hydroxygruppe von Tyr (wenn dieses vorhanden ist), und zwar Tetrahydropyranyl, tert,-Butyl, Trityl, Benzyl, Benzyloxycarbonyl, 4-Brom-benzyloxycarbonyl oder 2,6-Dichlor-benzyl, wobei 2,6-Dichlor-benzyl (DCB) bevorzugt wird.

X⁶ ist eine Schutzgruppe für die Guanidinogruppe bzw. die Seitenketten-Aminogruppe bzw. die Imidazolgruppe von Arg, Lys, His usw., wie Nitro, Tos, Trityl, Benzyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, Z und Boc, eine Schutzgruppe für Tyr, wie X⁴, oder eine Schutzgruppe für Trp wie X², oder H, d. h. daß sich an den Atomen der Seitenkette keine Schutzgruppe befindet, wobei Tos allgemein bevorzugt wird.

X⁶ ist Wasserstoff, eine Schutzgruppe für Tyr, wie X⁴, oder eine Schutzgruppe für Cys, und zwar vorzugsweise p-Methoxybenzyl (MeOBzI), p-Methyl-benzyl,Acetylaminomethyl, Trityl und BzI. Die am meisten bevorzugte Schutzgruppe ist p-Methoxybenzyl.

X⁷ steht für ein Gly-O-CH₂-(Trägerharz), O-CH₂-(Trägerharz), D-Ala-O-CH₂-(Trägerharz), Gly-NH-(Trägerharz) oder D-AIa-NH-(Trägerharz), kann aber auch OH, Ester, Amid oder Hydrazid von GIy oder D-AIa darstellen oder direkt an Pro gebunden sein.

Das Kriterium für die Wahl der Seitenkettenschutzgruppe X²-X₆ besteht darin, daß die Schutzgruppe gegen das Reagenz stabil sein muß, das unter den jeweiligen Reaktionsbedingungen zur Abspaltung der a-Amono-Schutzgruppe bei jeder Stufe der Synthese gewählt wird. Die Schutzgruppe sollte unter den Kupplungsbedingungen nicht abgepalten werden, sollte jedoch nach Abschluß der Synthese der gewünschten Aminosäuresequenz unter Reaktionsbedingungen abspaltbar sein, unter denen die Peptidkette nicht verändert wird.

Wenn X⁷ Gly-O-CH₂-(Trägerharz), D-Ala-O-CH₂-(Trägerharz) oder O-CH₂-(Trägerharz) ist, ist die Esterkomponente als eine der vielen funktioneilen Gruppen des Polystyren-Trägerharzes dargestellt. Wenn X⁷ Gly-NH-(Trägerharz) oder D-AIa-NH-(Trägerharz) ist, ist GIy oder D-AIa über eine Amiolbindung an ein BHA-Harz oder MBHA-Harz gebunden.

Wenn X in der endgültigen Formel z. B. Acetyl ist, kann dieses als Schutzgruppe X¹ für die a-Aminogruppe von D-NAL oder jeder anderen in 1-Position verwendeten Aminosäure verwendbar sein, indem es vor der Kupplung dieser letzten Aminosäure an die Peptidkette eingeführt wird. Vorzugsweise wird jedoch eine Reaktion mit dem Peptid an dem Harz (nach Entblockung der a-Aminogruppe, wobei die Gruppen in der Seitenkette geschützt bleiben) durchgeführt, z. B. durch Umsetzung mit Essigsäure in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder vorzugsweise mit Acetanhydrid oder durch eine andere bekannte geeignete Reaktion.

Wie aus der Literatur bekannt ist, kann das voll geschützte Peptid von einem chlormethylierten Trägerharz durch Ammonolyse abgespalten werden und liefert dann das voll geschützte Amid-Zwischenprodukt. Die Abspaltung der Schutzgruppen von dem.

Peptid sowie die Abspaltung des Peptids von einem Benzhydrylaminharz kann bei 0°C mit Fluorwasserstoffsäure (HF) erfolgen.

Vor der Behandlung mit HF wird dem Peptid vorzugsweise Anisol zugesetzt. Nach der Entfernung von HF im Vakuum wird das abgespaltene, ungeschützte Peptid am besten mit Ether behandelt, dekantiert, in verdünnter Essigsäure aufgenommen und lyophilisiert.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhält man ein Peptid der Formel X-Ri-(W)D-Phe-R3-R₄-R₅-R6-R7-Arg-Pro-R₁₀, oder ein nicht toxisches Salz davon, worin X ein Wasserstoffatom oder eine Acylgruppe mit maximal 7 Kohlenstoffatomen, R₁ Dehydro-Pro, D-pGlu, D-Phe, 4CI-D-Phe, D-Trp, Pro, oder ß-D-NAL, WCI, F, NO₂, C^aMe/4CI, Cl₂ oder Br, R₃ D-3-PAL, ß-D-NAL oder (Y)D-Trp mit Y = H, NO₂, NH₂, OCH₃, F, Cl, Br, CH₃, NⁱⁿHCO oder NⁱⁿAc, R₄ Ser, Orn, AAL oder aBu,

R₅ Tyr, Arg, (3F)Phe, (2F)Phe, (3l)Tyr, (3CH₃)Phe, (2CH₃)Phe, (3CI)Phe oder (2CI)Phe, R₆ ein D-Isomer einer lipophilen Aminosäure oder 4-NH₂-D-Phe, D-Lys, D-Om, D-Har, D-His, 4-gua-D-Phe, D-PAL oder D-Arg, R₇ NLe, Leu, NML, Phe, Met, Nva, Tyr, Trp, Cys, PAL oder 4F-D-Phe und

R₁₀ GIy-NH₂, D-AIa-NH₂ oder NH-Y' mit Y' = niederes Alkyl, Cycloalkyl, fluorsubstituiertes niederes Alkyl oder NHCONH-Q mit Q=H oder niederes Alkyl darstellen, wobei jedoch, wenn R₃ D-3PAL, R₅ Arg ist, und wenn R₃ ß-D-NAL oder D-Trp, R₇ Tyr, PAL, Phe oder 4F-D-Phe ist; unter Bildung einer Zwischenverbindung der Formel X¹-R_r(W)D-Phe-R₃(X²)-R₄(X³)-R₅(X⁴ oder X⁵I-R₆(X⁵)-R₇(X⁶)-Arg(X⁵):Pro-X⁷,

worin X¹ ein Wasserstoffatom oder eine a-Amino-Schutzgruppe,

X² ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe für den Indolstickstoff,

X³ Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die alkoholische Hydroxygruppe von Ser oder für eine Aminogruppe in der Seitenkette,

X⁴ ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe für die phenolische Hydroxygruppe von Tyr, X⁵ und X⁶ jeweils entweder ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe für eine jeweils vorhandene Seitenkette, und R⁷ Gly-O-CH₂-(Trägerharz), O-CH₂-(Trägerharz), D-Ala-O-CH₂-(Trägerharz), Gly-NH-(Trägerharz), D-Ala-NH-(Trägerharz), GIy-NH₂ oder ein Ester, Amid oder Hydrazid darstellt, durch

Abspaltung einer oder mehrerer der Gruppen X¹ bis X⁶ und oder die Abspaltung von einem in X⁷ enthaltenen Trägerharz, und wenn gewünscht, durch Umwandlung des entstehenden Peptids in ein nicht toxisches Salz.

Die Reinigung des Peptids erfolgt durch lonenaustauschchromatographie an einer Carboxymethylcellulosesäule und anschließende Verteilungschromatographie mit dem Elutionssystem Butan-i-ol/0,1 N Essigsäure (Volumenverhältnis 1:1) auf einer mit Sephadex G-25 gefüllten Säule oder durch Hochdruck-Chromatographie, wie in der Literatur bekannt und speziell in J.Rivier et al., J. Chromatography, 288 (1984), S.303-328 beschrieben. Außer Glycin besitzen die Aminosäuren der erfindungsgemäß hergestellten Peptide die L-Konfiguration, wenn nicht anders angegeben.

Die erfindungsgemäß erhaltenen Peptide weisen eine Substitution der 1-Position, vorzugsweise durch Dehydropolin oder ß-(Naphth-1- oder -2-yl)-D-analin, im folgenden als ß-D-1 NAL oder ß-D-2NAL bezeichnet, der 2-Position in Form eines modifizierten D-Phe, der 3-Position vorzugsweise in Form von substituiertem D-Trp, D-3PAL oder ß-D-NAL, einer möglichen Substitution durch eine Diaminosäure mit nicht mehr als 5 Kohlenstoffatomen in 4-Position, einer möglichen Substitution in 5-Position in Form (a) eines halogenierten oder methylierten L-Phe oder L-Tyr oder (b) Arg, einer Substitution der 6-Position und einer möglichen Substitution der 7-Position durch Nie, NML, Phe, Nva, Met, Tyr, Trp, Cys, PAL, 4F-D-Phe usw. auf. Ein modifiziertes D-Phe in 2-Position liefert durch spezifische Modifizierungen im Benzenring eine erhöhte antagonistische Wirkung.

Einfachsubstitution im Ring erfolgt in para-oder4-Stellung durch Chlor, Fluor, Brom und Nitro, wobei Chlor, Fluor und Nitro bevorzugt werden. Dichlorsubstitution erfolgt in der 2,4-oder 3,4-Stellung des Ringes. Das α-Kohlenstoff atom kann gleichzeitig methyliert sein, z. B. (C^aMe/4CI)Phe. Wenn in 3-Position D-Trp oder ß-D-NAL vorliegt, ist R₇ vorzugsweise Tyr, PAL, Phe oder 4F-D-Phe; liegt in 3-PositionD-3PAL vor, ist R₅ Arg. Der Substituent in 1-Position kann in der Weise modifiziert werden, daß seine a-Aminogruppe eine Acylgruppe wie Formyl (HCO), Acetyl, Acryloyl, But-3-enyl (Vinylacetyl, Vac) oder Benzoyl (Bz) enthält, wobei Acetyl (Ac) und Acryloyl (Acr) bevorzugt werden. Die Symbole PAL und D-PAL bedeuten das L- bzw. D-Isomere von Pyridylalanin, wobei vorzugsweise die 3-Stellung des Pyridinringes an das ß-Kohlenstoffatom des Alanins gebunden ist. Wenn in 1-Position ß-D-NAL vorliegt und R₆ nicht Arg ist, ist in 6-Position vorzugsweise ein hydrophiler D-Aminosäurerest, wie 4-NH₂-D-Phe, 4-Guanidino-D-Phe, D-His, D-Lys, D-Om, D-Arg, D-Har (D-Homoarginin) oder D-PAL vorhanden. Wenn in 1-Position Dehydro-Pro vorliegt, ist in 6-Stellung vorzugsweise ein D-Isomer einer lipophilen Aminosäure, wie D-Trp, D-Phe, HCO-D-Trp, NO₂-D-Trp, D-Leu, D-IIe, D-NIe, D-Tyr, D-VaI, D-AIa, D-Ser(OtBu), ß-D-NAL oder (^imBzl) D-His vorhanden, es kann jedoch auch D-PAL verwendet werden. Zusätzlich kann auch noch eine Substitution von GIy durch D-AIa in 10-Position erfolgen, sowie andere erwähnte Substitutionen.

Die Peptide der Erfindung werden oft in Form pharmazeutisch akzeptabler nicht toxischer Salze verabreicht, wie z. B. Salze mit Säuren oder Metallkomplexe, z. B. mit Zink, Barium, Calcium, Magnesium, Aluminium usw. (diese werden in der Erfindung gemäßen Lehre als Additionssalze angesehen), oder als Kombination beider Typen. Beispiele für solche Salze mit Säuren sind Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Phosphat, Nitrat, Oxalat, Fumarat, Gluconat, Tannat, Meleat, Acetat, Citrat, Benzoat, Succinat, Alginat, Malat, Ascorbat, Tartrat usw. Beispielsweise kann eine wäßrige Lösung des Peptids mehrfach mit 1 N Essigsäure behandelt und dann lyophilisiert werden, wobei das Acetat des Peptids erhalten wird. Wenn die Wirksubstanz in Tablettenform verabreicht werden soll, kann die Tablette einen pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsstoff, der auch ein Bindemittel sein oder enthalten kann, enthalten, wie z. B. Tragant, Maisstärke oder Geiantine; ein Trennungsmittel wie Alginsäure und ein Gleitmittel wie Magnesiumstearat. Wird die Verabreichung in flüssiger Form gewünscht, kann ein Süßstoff und/oder Geschmacksstoff in dem pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel enthalten sein; intravenöse Verabreichung kann in isotonischer Salzlösung, Phosphatpufferlösung usw. erfolgen.

Die pharmazeutische Zubereitung soll üblicherweise das Peptid in Verbindung mit einem konventionellen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthalten. Üblicherweise soll bei intravenöser Verabreichung die Dosis von etwa 1 bis 10C^g Peptid je kg Körpergewicht betragen; orale Dosen können höher sein. Allgemein erfolgt die Behandlung mit diesen Peptiden in der gleichen Weise wie die klinische Behandlung mit anderen GnRH-Antagonisten.

Diese Peptide können Säugetiere intravenös, subkutan, intramuskulär, oral, perkutan (z. B. intranasal oder intravaginal) verabreicht werden, um eine Inhibierung und/oder Kontrolle der Fruchtbarkeit zu erreichen, sowie zur reversiblen Unterdrückung der Gonadentätigkeit, z. B. zur Behandlung von Frühreife oder während einer Radio- oder Chemotherapie. Die wirksamen Dosen variieren mit der Verabreichungsform und der Art des behandelten Säugetieres. Ein Beispiel einer typischen Dosierung ist eine das Peptid enthaltende bakteriostatische wäßrige Lösung, die so verabreicht wird, daß eine Dosis von 0,1 bis 2,5 mg/kg Körpergewicht erreicht wird. Orale Verabreichung des Peptids kann sowohl in fester Form als auch in flüssiger Form erfolgen.

Obwohl die Erfindung in Hinblick auf ihre bevorzugten Verkörperungen beschrieben wurde, sind auch Veränderungen und Modifizierungen einbegriffen. Beispielsweise können andere in der Literatur bekannte Substituenten, die die Wirksamkeit der Peptide nicht wesentlich beeinflussen, bei den Peptiden der Erfindung verwendet werden. Die Substitution im Phenyl ring des D-Phe²-Restes kann auch in 3-Stellung oder in 2,4-Stellung erfolgen, die als äquivalent angesehen werden; ähnlich werden D-2PAL und D-4PAL als Äquivalent von D-3PALangesehen. Am C-Ende kann Pro⁹ an eine der folgencen Strukturen gebunden sein, die allgemein als dessen Äquivalente angesehen werden: GIy-OCH₃, GIy-OCH₂CH₃, Sar-NH₂ oder NH-Y' mit Y' = niederes Alkyl, speziell Ethyl, Cycloalkyl, fluorsubstituiertes niederes Alkyl oder NHCONHQ mit Q = H oder niederes Alkyl. Sar bedeutet S'arcosin.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Peptide inhibieren stark die Sekretion von Gonadotropinen durch die Hypophyse von Säugetieren einschließlich Menschen und/oder die Freisetzung von Steroiden durch die Keimdrüsen. Es gibt Gründe, die Ovulation weiblicher Säugetiere verhindern zu wollen. Die Verabreichung von GnRH-Analogen, die Antagonisten der normalen GnRH-Funktion sind, können zur Unterdrückung oder Verzögerung der Ovulation benutzt werden. Aus diesem Grunde werden GnRH-Analoge, die GnRH-Antagonisten sind, als Kontrazeptiva oder zur Regulierung der Konzeptionsperioden benutzt. GnRH-Antagonisten können auch zur Behandlung von Frühreife und Endometriosis verwendet werden. Diese Antagonisten erwiesen sich auch als brauchbar zur Regulierung der Freisetzung von Gonadotropinen bei männlichen Säugetieren und können zur Einstellung der Spermatogenese, d. h. als männliche Kontrazeptiva, und zur Behandlung von Prostata-Hypertrophie verwendet werden.

Die Peptide sind sehr wirksam zur Inhibierung der LH-Freisetzung und werden daher oft als GnRH-Antagonisten bezeichnet. Bei Verabreichung in sehr niedrigen Dosen während des Proöstrus inhibieren die Peptide die Ovulation weiblicher Säugetiere, außerdem bewirken sie bei Verabreichung kurz nach der Empfängnis die Resorption befruchteter EierdJiass Peptide sind auch -.: bei der kontrazeptiven Behandlung männlicher Säugetiere wirksam.

Bei Verabreichung gegen Mittag des Tages des Proöstrus sind die Peptide der Erfindung in Dosen von unter 100μg je kg Körpergewicht wirksam zur Verhinderung der Ovulation weiblicher Ratten. Zur längeren Unterdrückung der Ovulation kann es erforderlich sein, Dosierungen von etwa 0,1 bis etwa 2,5 mg je kg Körpergewicht zu verwenden. Diese Antagonisten bewirken auch eine Unterbrechung der Spermatogenese, wenn sie in regulärer Weise männlichen Säugetieren verabreicht werden, und können daher als Kontrazeptiva verwendet werden. Da diese Verbindungen den Testosteronspiegel erniedrigen (eine unerwünschte Folge beim normalen, sexuell aktiven Männchen), ist es vorteilhaft, Ersatzdosen von Testosteron zusammen mit dem GnRH-Antagonisten zu verabreichen. Diese Antagonisten können auch zur Regulierung der Produktion von Gonadotropinen und Sexualsteroiden für andere Zwecke als oben angegeben verwendet werden.

Ausführungsbeispiel Beispiel 1

Peptide, wie in Tabelle 1 angegeben, mit der Formel Ac-Ri-(4F)D-Phe-R₃-Ser-Tyr-R₆-Leu-Arg-Pro-Ri₀ werden nach dem oben angegebenen Festphasenverfahren dargestellt.

Tabelle I

Ri R₃ R6 Rio

1	ß-D-2NAL	(6NO₂)D-Trp	D-Arg	GIy-NH₂
2	ß-D-2NAL	(6NO₂)D-Trp	D-Arg	D-AIa-NH₂
3	Dehydro-Pro	(6NO₂)D-Trp	ß-D-2NAL	GIy-NH₂
4	ß-D-2NAL	(6NH₂)D-Trp	D-Arg	GIy-NH₂
5	ß-D-2NAL	(5OCH₃)D-Trp	D-Arg	GIy-NH₂
6	ß-D-2NAL	(5Br)D-Trp	D-Arg	GIy-NH₂
7	ß-D-2NAL	(5F)D-Trp	D-Arg	GIy-NH₂
8	ß-D-2NAL	(5Cl) D-Trp	D-Arg	GIy-NH₂
9	ß-D-2NAL	(5CH₃)D-Trp	D-Arg	GIy-NH₂
10	ß-D-2NAL	(NⁱⁿHCO)D-Trp	D-Arg	GIy-NH₂
11	ß-D-2NAL	(5F)-D-Trp	(4-gua)D-Phe	GIy-NH₂
12	ß-D-2NAL	(5CI)D-Trp	D-His	GIy-NH₂
13	Dehydro-Pro	(6NO₂)D-Trp	D-Leu	NHCH₂CH₃
14	D-Trp	(5F)D-Trp	D-Phe	NHCH₂CH₃
15	D-pGlu	(5F)D-Trp	D-IIe	D-AIa-NH₂
16	D-Phe	(6NO₂)D-Trp	D-VaI	NHNHCONH₂

Als Beispiel wird im folgenden eine repräsentative Festphasensynthese des obigen Peptids Nr. 1, [Ac-ß-D-2NAL¹, (4F)D-Phe²,

(6NO₂)D-Trp³, D-Arg⁶]-GnRH beschrieben. Dieses Peptid hat die folgende Formel:

Ac-ß-D-2-NAL-(4F)D-Phe-(6NO₂)D-Trp-Ser-Tyr-D-Arg-Leu-Arg-Pro-GIy-NH₂. Die anderen Peptide werden auf gleiche Weise

dargestellt und gereinigt.

Boc-geschütztes GIy wird unter Verwendung eines dreifachen Überschusses in CH₂CI₂ und in Gegenwart von DCC als Aktivierungsreagenz innerhalb von 2 h an ein BHA-Harz gekuppelt. Der Glycinrest wird über eine Aminbindung an den BHA-Rest

gebunden.

Die nachfolgende Ankupplung jedes Aminosäurerestes, Waschen, Deblockieren und Kupplung des nächsten Aminosäurerestes erfolgt nach dem folgenden Plan mit einer automatischen Maschine und beginnt mit etwa 5g Harz.

Schritt

Reagenzien und Operationen

Mischzeit in Min.

Waschen mit 80 ml CH₂CI₂ (2 χ)

Waschen mit 30 ml Methanol (2 χ)

Waschen mit 80 ml CH₂CI₂ (3 χ)

70 ml 50%ig. TFA mit 5% Ethan-1,2-dithiol in CH₂CI₂ (2 χ)

Waschen mit 80 ml Isopropylalkohol mit 1 % Ethan-1,2-dithiol (2 χ)

70 ml 12,5%ig.TEAinCH₂CI₂(2 x)

Waschen mit40 ml MeOH (2 x)

Waschen mit 80 ml CH₂CI₂ (3 x)

Boc-Aminosäure(1 OmMoI) in 30 ml DMF oder CH₂CI₂, je nach Löslichkeit der

entsprechenden geschützten Aminosäure,

und DCC(1OmMoI)inCH₂CI₂(I x)

Waschen mit 40 ml MeOH (2 x)

70 ml 12,5%ig. TEA in CH₂CI₂(I x)

Waschen mit 30 ml MeOH (2 x)

Waschen mit 80 ml CH₂CL₂ (2 χ)

3 3 3 10 3 5 2 3

30-300 3 3 3 3

Nach Schritt 13 kann an einer Probe ein Ninhydrintest durchgeführt werden. Wenn die Probe negativ ist, kann mit Stufe 1 zur Kupplung der nächsten Aminosäure fortgefahren werden; ist die Probe positiv, oder leicht negativ, werden die Stufen 9 bis 13

wiederholt.

Der obige Plan wird für die Kupplung jeder Aminosäure des erfindungsgemäß hergestellten Peptids benutzt, nachdem die erste Aminosäure angeknüpft wurde. Im Verlaufe der gesamten Synthese wird N^a-Boc als Schutzgruppe für alle verbleibenden Aminosäuren verwendet. N^a-Boc-ß-D-2NAL wird in bekannter Weise dargestellt, z. B. nach der Lehre der US-Patentschrift

4234571. Die Seitenkette von Arg wird mit Tos geschützt. Als Schutzgruppe für die Hydroxygruppe von Ser dient OBzI. (6NO₂)D-Trp bleibt ungeschützt. Als letzte Aminosäure wird N Boc-ß-D-NAL eingeführt. Boc-Arg(Tos) und Boc-(6N0₂)D-Trp, die geringe

Löslichkeit in CH₂CI₂ haben, werden in DMF-CH₂CI₂-Gemischen gekuppelt.

NachDeblockierungdera-Aminogruppeam N-Ende gelingt die Acetylierung mit einem großen Überschuß von Acetanhydrid in Dichlormethan. Die Abspaltung des Peptids vom Harz und die vollständige Abspaltung der Schutzgruppen an den Seitenketten erfolgt sehr leicht bei 0°C mit HF. Vor der Behandlung mit HF wird Anisol als Spülmittel zugesetzt. Nach der Entfernung des HF im Vakuum wird das Harz mit 50%iger Essigsäure extrahiert, und die Waschflüssigkeit wird lyophilisiert und liefert ein rohes

Peptidpulver.

Die Reinigung des Peptids erfolgt dann durch lonenaustauschchromatographie an Carboxymethylcellulose (Whatman CM mit einem Gradienten von 0,05 bis 0,3 Mol NH₄OAc in einem 50:50 Methanol-Wasser-Gemisch) und anschließende Verteiiungschromatographie in einer Gelfiltrationssäule mit dem Elutionssystem Butan-i-ol/0,1 N Essigsäure (Volumenverhältnis 1:1).

Das Peptid wird gemäß Dünnschichtchromatographie mit verschiedenen Lösungsmittelsystemen und Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit umgekehrten Phasen und einer wäßrigen Triethylammoniumphosphatlösung plus Acetonitril als homogen angesehen. Die Aminosäureanalyse des entstandenen gereinigten Peptids entspricht der Formel für die dargestellten Strukturen und liefert ganzzahlige Werte für jede Aminosäure in der Kette. Die optische Drehung wird an einem photoelektrischen Polarimeter mit

[α]" = -31,8⁰C ± 1⁰C (c = 1,50%ig. Essigsäure) gemessen.

Die Peptide werden in vivo erprobt und können auch in vitro getestet werden. In-vitro-Tests werden mit dissoziierten Ratten-Hypophysenzellen durchgeführt, die4 Tage vor dem Test in Kultur gehalten werden. Der als Reaktion auf die Verabreichung der Peptide erhaltene LH-Spiegel wird durch spezielle Radioimmunbestimmung für Ratten-LH bestimmt. Die Vergleichsschalen von Zellen erhalten nur eine Dosis, die 3 nanomolar an GnRH ist; die Versuchsschalen erhalten eine 3nanomolare Dosis GnRH' und entweder eine Dosis des derzeitige Standard-Antagonisten [Ac-Dehydro-Pro¹, (4F)D-Phe², D-Trp^3l6]-GnRH zu Vergleichszwecken oder das Testpeptid in Konzentrationen von 0,01 bis 10 nanomolar. Die freigesetzte LH-Menge in den nur mit GnRH behandelten Proben wird mit der in den mit Peptid und GnRH behandelten Proben verglichen. Die Wirksamkeit des Testpeptids zur Verminderung derf reigesetzten LH-Menge durch 3nanomolares GnRH wird mit der des derzeitigen Standard-Peptids verglichen. Bei den in-vivo-Tests wird die Wirksamkeit zur Verhinderung der Ovulation an weiblichen Ratten bestimmt. Bei diesem Test wird einer bestimmten Anzahl reifer weiblicher Sprague-Dawley-Ratten, nämlich 6, jede mit einem Körpergewicht von 225 bis 250g, eine bestimmte Mikrogramm-Dosierung des Peptids in Maisöl am Mittag des Tages des Proöstrus injiziert. Der Proöstrus ist der Nachmittag der Ovulation. Eine weitere Gruppe weiblicher Ratten, denen das Peptid nicht verabreicht wird, dient als Kontrollgruppe. Bei jeder der weiblichen Kontrollratten trat Ovulation am Abend des Proöstrus auf; bei den behandelten Ratten wird die Zahl der Ovulationen registriert. Jedes der Peptide wird als deutlich wirksam zur Verhinderung der Ovulation weiblicher Ratten bei sehr niedriger Dosis angesehen, und jedes Peptid wird als absolut wirksam bei einer Dosis von etwa 5μ9 angesehen. Die Ergebnisse weiterer Testungen bei niedrigeren Dosierungen sind in der nachfolgenden Tabelle A angeführt.

Tabelle A

Peptid Nr. in vivo

Dosis ^g) Anzahl Ovulationen

1.1 0/5

C 0,5 4/14

2 1 1/10

3 2,5 2/10 2 0/6

4 1 5/14

5 1 7/10

6 2 > 0/10 1 6/18

7 5 2/10 1 3/9

8 1 7/14 0,5 2/7

9 2,5 0/10 1 10716

10 1 0/10

0,5 9/17

Alle in Tabelle I aufgeführten Peptide werden in vitro bei einer angemessenen Konzentration als wirksam zur Blockierung der GnRH-induzierten LH-Freisetzung angesehen. Viele der Peptide sind in vivo viel wirksamer als der derzeitiger Standard. Alle Peptide werden als wirksam zur Verhinderung der Ovulation bei weiblichen Säugetieren bei sehr niedrigen Dosen angesehen, und einige ausgewählte Peptide werden als mindestens doppelt so wirksam wie alle bisher bekannten und getesteten GnRH-Antagonisten angesehen.

Beispiel Il

Nach dem oben beschriebenen Festphasenverfahren werden die in Tabelle Il angegebenen Peptide mit der Formel Ac-ß-D-2NAL-(W)D-Phe-R₃-R4-R5-D-Arg-R₇-Arg-Pro-D-Ala-NH2 dargestellt.

Tabelle II	W	R₃	R₄	R₅	R₇
	4Br	(6 NO₂)D-Trp	Ser	Typ	Nie
17	4Br	(6 NO₂)D-Trp	Ser	(2F)Phe	Leu
18	4Cl	(1 HCO)D-Trp	Ser	Tyr	Nva
19	4Cl	(1 HC0)D-Trp	Ser	Tyr	Leu
20	4Cl	(1 HCOID-Trp	Ser	Tyr	Nie
21	4CI	(1 HCO)D-Trp	Ser	(2CH₃)Phe	Leu
22	4Cl	(1 HCO)-D-Trp_x	Ser	Tyr-	NML
23	4Cl'	(1 HCO)D-Trp	Ser	Tyr	NML(AIa⁹)
24	4Cl	(1 HCO)D-Trp	Ser	(2CI)Phe	NML
25	4NO₂	(5CH₃)D-Trp	Ser	(3CH₃)Phe	NML
?6	4NO₂	(5 F)D-Trp	Orn	-Tyr	Nie
27	2,4Cl₂	(5CI)D-Trp	Ser	(3F)Phe	Nie (Acetat)
28	2,4Cl₂	(6NO₂)D-Trp	AAL	(3F)Phe	Nva
29	CMe/4CI	(5 F)D-Trp	aBu	(3l)Tyr	NML
30	3,4Cl₂	(5 F)D-Trp	Orn	(3CI)Phe	Leu
31

Testung in vitro und/oder in vivo der in Tabelle II aufgeführten Peptide zeigt, daß die Peptidebei angemessener Konzentration als wirksam zur Blockierung der GnRH-induzierten LH-Freisetzung angesehen werden. Viele dieser Peptide sind in vivo wirksamer als der derzeitige Standard. Alle Peptide werden als wirksam zur Verhinderung der Ovulation bei weiblichen Säugetieren bei sehr niedrigen Dosen angesehen. .

Beispiel III

Nach dem oben beschriebenen Festphasenverfahren werden die in Tabelle III angegebenen Pepride mit der Formel X-ß-D-2NAL-(4 CI)D-Phe-(6 NO₂)D-Trp-Ser-R₅-R₆-NML-Arg-Pro-R₁₀ dargestellt.

Tabelle III	X	-	R₅	R₆	Rio
	Ac	Tyr	D-Arg	GIy-NH₂
32	Acr	Arg	D-Tyr	D-AIa-NH₂
33	HCO	Arg	D-Tyr	NHCH₂CH₃
34	Bz	(3F)Phe	D-Arg	NHCH₃
35	Ac	(2F)Phe	D-Lys	NHCF₃
36	Vac	(2CI)Phe	D-Har	NHCH₂CH₂CH₃
37	Acr	(3CI)Phe	(4gua)D-Phe	NHCF₂CF₃
38	Ac	(3F)Phe	D-Orn	D-AIa-NH₂
39	Acr	(3 »Tyr	D-His	D-AIa-NH₂
40	Ac	Tyr	D-Arg	D-AIa-NH₂ (Pro⁸, Arg⁹)
41	Ac	(3CI)Phe	D-Arg	GIy-NH₂
42	Vac	(3CI)Phe	(4NH₂)D-Phe	NHNHCONH₂
43	Bz	(3CI)Phe	(4NH₂)D-Phe	NHNHCONHCh₃
44

Die Testung der in Tabelle III angegebenen Peptide in vivo und/oder in vitro zeigt, daß diese Peptide bei angemessener Konzentration als wirksam zur Blockierung der GnRH-induzierten LH-Freisetzung angesehen werden. Viele dieser Peptide sind in vivo wirksamer als der derzeitige Standard. Alle Peptide werden als wirksam zur Verhinderung der Ovulation bei weiblichen Säugetieren bei sehr niedrigen Dosen angesehen.

Beispiel IV

Nach dem oben beschriebenen Festphasenverfahren werden die in Tabelle IV angegebenen Peptide mit der Formel Ac-R_r4CI-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-R₆-R7-Arg-Pro-R₁₀-NH₂ dargestellt.

Tabelle IV

45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59

ß-D-2 NAL ß-D-2 NAL ß-D-2 NAL ß-D-2 NAL ß-D-2 NAL ß-D-2 NAL ß-D-2 NAL ß-D-2 NAL ß-D-2 NAL Dehydro-Pro ß-D-2 NAL ß-D-2 NAL ß-D-2 NAL ß-D-2 NAL Dehydro-Pro

D-Arg D-Arg D-Arg D-Arg D-Arg D-Arg D-Arg D-Arg D-Arg D-Trp D-Arg D-Har D-Lys D-Arg D-Leu

Nie Met Tyr Nie Met Tyr Phe 4F-D-Phe Cys Nie Trp Cys Nva 3PAL Tyr

D-AIa

GIy

D-AIa

NHCH₂CH₃ ¹'

¹¹ R₁₀-NH₂

Das Peptid Nr.45, das als [Ac-ß-D-2 NAL¹,4CI-D-Phe², D-Trp³, D-Arg⁶, Nie⁷, D-AIa¹⁰J-GnRH bezeichnet wird, hat die folgende

Formel:

Ac-ß-D-2 NAL-^CI-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Arg-Nle-Arg-Pro-D-Ala-NHz.

Alle in Tabelle IV angegebenen Peptide werden bei angemessener Konzentration in vitro als wirksam zur Blockierung der GnRH-in-duzierten LH-Freisetzung angesehen. Viele dieser Peptide sind in vivo viel wirksamer als der derzeitige Standard.

Alle Peptide werden als wirksam zur Verhinderung der Ovulation bei weiblichen Säugetieren bei sehr niedrigen Dosen angesehen, und einige werden als mindestens so wirksam wie alle bisher bekannten und getesteten GnRH-Antagonisten

angesehen.

Beispiel V

Nach dem oben beschriebenen Festphasenverfahren werden die in Tabelle V angegebenen Peptide mit der Formel Ac-R₁-(W)D-Phe-R₃-Ser-Tyr-R₆-R₇-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ dargestellt.

Tabelle V

Ri

R₆

R₇

60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75

ß-D-2 NAL ß-D-2 NAL ß-D-2 NAL Dehydro-Pro Dehydro-Pro ß-D-2 NAL ß-D-2 NAL Dehydro-Pro Dehydro-Pro Dehydro-Pro Dehydro-Pro Dehydro-Pro ß-D-2 NAL ß-D-2 NAL ß-D-2 NAL ß-D-2 NAL

4Br

4F

4NO₂

4Cl

4Br

C°Me/4CI

C^aMe/4CI

4Cl

4NO₂

3,4Cl₂

4Cl

(6NO₂)D-Trp	D-Arg	Nie
(6NO₂)D-Trp	D-His	Tyr
D-Trp	4-gua-D-Phe	Tyr
D-Trp	D-Trp	Phe
ß-D-1 NAL	D-VaI	Met
NⁱⁿHCO-D-Trp	D-Arg	Nie
N_inHCO-D-Trp	D-Arg	Nva
ß-D-2 NAL	D-Tyr	4F-D-Phe
ß-D-2 NAL	D-NIe	Trp
ß-D-2 NAL	D-Phe	Nie
D-PAL	ß-D-2 NAL	Phe
D-PAL	ß-D-2 NAL	Leu
D-PAL	D-O rn	4F-D-Phe
P-PAL	4NH₂-D-Phe	Met
D-Trp	4NH₂-D-Phe	Tyr
D-PAL	D-PAL	Leu

Testung der in Tabelle V angegebenen Peptide in vitro und/oder in vivo zeigt, daß diese bei angemessener Konzentration in vitro als wirksam zur Blockierung der GnRH-induzierten Freisetzung von LH wirksam sind. Viele dieser Peptide sind in vivo wirksamer als der derzeitige Standard. Alle Peptide werden als wirksam zur Verhinderung der Ovulation bei weiblichen Säugetieren bei sehr niedrigen Dosen angesehen. .

Beispiel Vl

Nach dem oben beschriebenen Festphasenverfahren werden die in Tabelle Vl angegebenen Peptide der Formel X-R_r4F-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-R₆-R₇-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ dargestellt. .

Tabelle VI	X
	Acr
76	Acr
77	Acr
78	Acr
79	H
80	Bz
81	Bz
82	HCO
83	HCO
84	Vac
85	Vac
86	H
87

Dehydro-Pro	D-Trp	Tyr
Dehydro-Pro	D-IIe	PAL
Dehydro-Pro	D-VaI	Nle(3F-Phe⁵)
Pro	D-Ser (OtBu)	Phe
Dehydro-Pro	(imBzl)D-His	Cys(0rn⁴)
D-Phe	D-Trp	Met
D-pGlu	D-Trp	Nle(3l-Tyr⁵)
ß-D-1 NAL	D-Arg	Phe (Acetat)
Dehydro-Pro	D-Har	Tyr(aBu⁴)
ß-D-2NAL	D-Lys	Nva (Acetat)
D-Phe	D-NIe	Cys
Dehydro-Pro	D-AIa	Trp

Testung der in Tabelle Vl angegebenen Peptide in vitro und/oder in vivo zeigt, daß diese Peptide bei angemessener Konzentration in vitro als wirksam zur Blockierung der GnRH-induzierten LH-Freisetzung angesehen werden. Viele dieser Peptide sind in vivo wirksamer als der derzeitige Standard. Alle Peptide werden als wirksam zur Verhinderung der Ovulation bei weiblichen Säugetieren bei sehr niedrigen Dosen angesehen.

Beispiel VII

Nach dem oben beschriebenen Festphasenverfahren werden die in Tabelle VII angegebenen Peptide der Formel Ac-Ri-(W)D-Phe-R₃-R₄-Tyr-R₆-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ dargestellt.

Tabelle VII	Ri	W	R₃	R₄	R₆
	Dehydro-Pro	4Cl	(6NO₂)D-Trp	Orn	ß-D-2 NAL
88	Dehydro-Pro	4F	(6N0₂)D-Trp	Orn	D-VaI
89	Dehydro-Pro	4F	(6 F)D-Trp	AAL	4gua-D-Phe
90	Dehydro-Pro	4F	(6 F)D-Trp	AAL	D-Orn
91	Dehydro-Pro	4NO₂	(5OCH₃)D-Trp	AAL	D-Lys
92	Dehydro-Pro	4NO₂	(5OCH₃)D-Trp	AAL	D-PAL
93	ß-D-2 NAL	4NO₂	1 Ac-D-Trp	Ser	D-Har
94	ß-D-2 NAL	4NO₂	1 HCO-D-Trp	Ser	D-Trp
95	Dehydro-Pro	4NO₂	(6Br)-D-Trp	aBu	D-NIe
96	Dehydro-Pro	C^aMe/4CI	(6 Br)D-Trp	aBu	D-Leu
97	Dehydro-Pro	C^aMe/4CI	(6CH₃)D-Trp	aBu	ß-D-2 NAL
98	Dehydro-Pro	4Br	(6NH₂)D-Trp	Orn	4NH₂-D-Phe
99	Dehydro-Pro	3,4Cl₂	(5 NH₂)D-Trp	Om	D-Lys
100

Testung der in Tabelle VII angegebenen Peptide in vitro und/oder in vivo zeigt, daß diese Peptide bei angemessener Konzentration in vitro als wirksam zur Blockierung der GnRH-induzierten LH-Freisetzung angesehen werden. Viele dieser Peptide sind in vivo wirksamer als der derzeitiger Standard. Alle Peptide werden als wirksam zur Verhinderung der Ovulation bei weiblichen Säugetieren bei sehr niedrigen Dosen angesehen.

Die Testung in vivo erfolgt bei verschiedenen Peptiden mit variablen Dosen. Die Testergebnisse sind in Tabelle B enthalten. Die optische Rotation der hergestellten Peptide wird mit einem photoelektrischen Polarimeter in 50% Essigsäure (c = 1) gemessen und in Tabelle B angegeben.

Tabelle B

Peptid Nr.

[a]g² Dosis ^g)

Anzahl Ovulationen in vivo

17 19 20 21 22 23 25 25 45

46 47 51

52

53 55 58

88

-28,O⁰C -22,4°C -18,8⁰C -22,5⁰C

-23,8

-22,0 -17,2

1/10

2/7

6/7

4/11

7/9

1/5

5/6

1/5

3/16

9/10

2/15

3/9

0/10

4/7

0/8

6/15

2/3

0/10

4/7

6/8

0/8

0/10

2/10~

0/10

6/9

Beispiel VIII

Nach dem oben beschriebenen Festphasenverfahren werden die in Tabelle VIII angegebenen Peptide der Formel Ac-RrR2-D-3PAL-Ser-Arg-R₆-R7-Arg-Pro-Rio dargestellt.

Tabelle VIII

101 102 103 104

105 106 107 108 109 110 111 112 .113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125

ß-D-2 NAL ß-D-2NAL ß-D-2 NAL ß-D-2 NAL

Dehydro-Pro Dehydro-Pro ß-D-2 NAL ß-D-2 NAL ß-D-2 NAL ß-D-2 NAL ß-D-2 NAL ß-D-2 NAL ß-D-2 NAL ß-D-2 NAL Pro

Dehydro-Pro Dehydro-Pro Dehydro-Pro Dehydro-Pro Dehydro-Pro Dehydro-Pro Pro

ß-D-2 NAL ß-D-2 NAL 4CI-D-Phe

4CI-D-Phe	D-Trp	Leu
4CI-D-Phe	D-3PAL	Leu
4-CI-D-Phe	ß-D-2 NAL	Leu
4CI-D-Phe	D-3PAL	Leu
4CI-D-Phe	ß-D-2 NAL	3PAL
4CI-D-Phe	ß-D-2 NAL	Tyr
4CI-D-Phe	D-3PAL	NML
4CI-D-Phe	ß-D-2 NAL	3PAL
4CI-D-Phe	(imBzl)D-His	Leu
4CI-D-Phe	6 NO₂-D-Trp	Leu
4CI-D-Phe	D-Tyr	Leu
4CI-D-Phe	(HCO)D-Trp	Leu
4 NO₂-D-Phe	D-Trp	NML
4Br-D-Phe	D-Tyr	Nie
4Br-D-Phe	(imBzl)D-His	Met
4Br-D-Phe	D-Trp	Nva
C^aMe/4CI-D-Phe	D-Trp	Nva
4F-D-Phe	D-Trp	4F-Phe
4F-D-Phe	D-Trp	NML
4F-D-Phe	D-Trp	Nie
4F-D-Phe	ß-D-2 NAL	Trp
4F-D-Phe	ß-D-2 NAL	Nva
3,4CI₂-D-Phe ..	ß-D-1 NAL	Tyr
3,4CI₂-D-Phe	D-Trp	Met
3,4CI₂-D-Phe	D-Tyr	3PAL

D-AIa-NH₂

(4guaPhe⁵)

D-AIa-NH₂

NHCH₂CH₃

NHCH₂CH₂

NHNHCONH₂

NHCH₂CH₃

D-AIa-NH₂

NHNHCONH₂

NHCH₂CH₃

GIy-NH₂

D-AIa-NH₂

(acetat)

Die in Tabelle VIII beschriebenen Peptide werden in vivo zur Bestimmung ihrer Wirksamkeit zur Verhinderung der Ovulation bei weiblichen Ratten getestet. Alle werden als wirksam zur Verhinderung der Ovulation weiblicher Ratten bei sehr niedriger Dosis angesehen und sind vollständig wirksam bei einer Dosis von etwa 10ug. Einige dieser Peptide wurden auch spezifisch bei niedrigeren Dosen getestet. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle C aufgeführt.

Tabelle C

Peptid Nr. [α]"

101 -30,3⁰C ±1

	in vivo
Dosis (μρ)	Anzahl Ovulationen
1	0/6
0,5	2/10
1	1/16
0,5	5/10
1	0/5
0,5	6/10
0,25	7/10
1	9/10
0,5	0/6
0,5	0/5

Claims

Erfindungsanspruch:

1. Verfahren zur Herstellung eines Peptide oder eines seiner nicht toxischen Salze mit antagonistischen Eigenschaften gegenüber gonadotropen Hormonen, gekennzeichnet dadurch, daß Verbindungen der Formel-X-Ri-(W)-D-Phe-R₃-R₄-R₅-R₆-R₇-Arg-Pro-Rio, worin X ein Wasserstoffatom oder eine Acylgruppe mit maximal 7 Kohlenstoffatomen; Ri Dehydro-Pro, D-pGlu, D-Phe, 4CI-D-Phe, D-Trp, Pro oder ß-D-NAL; W Cl, F, NO₂, C^aMe/4CI, Cl₂ oder Br; R₃ D-3PAL, ß-D-NAL oder (Y)D-Trp mit Y = H, NO₂, NH₂, OCH₃, F, Cl, Br, CH₃, NⁱⁿHC0 oder Nⁱⁿ Ac; R₄Ser, Orn, AAL oder aBu; R₅ Tyr, Arg, (3F)Phe, (2F)Phe, (3l)Tyr, (3CH₃)Phe, (2CH₃) Phe, (3Cl)Phe oder (2CI)Phe; R₆ ein D-Isomer einer lipophilen Aminosäure oder 4-Nh₂-D-Phe, D-Lys, D-Har, D-Orn, D-His, 4-gua-D-Phe, D-PAL oder D-Arg; R₇ Nie, Leu, NML, Phe, Met, Nva, Tyr, Trp, Cys, PAL oder 4F-D-Phe und R₁₀ GIy-NH₂, D-AIa-NH₂, NH-Y'mit Y' = niederesAlky^CycloalkyUiuorsubstituiertesniederesAlkyl.oderNHCONH-QmitQ = H oder niederes Alkyl bedeuten, wenn jedoch R₃ D-3PAL ist, ist R₅ Arg, und wenn R₃ ß-D-NAL oder D-Trp ist, ist R₇ Tyr, PAL, Phe

. oder 4F-D-Phe aus einem Zwischenprodukt der Formel X^RHWJD-Phe-R^l-R^^iX⁴ oder X⁵)-R₆(X⁵)-R₇(X⁶)-Arg(X⁵)-Pro-X⁷, worin X¹ Wasserstoff oder eine a-Amino-Schutzgruppe; X² Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für den Indolstickstoff; X³ Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die alkoholische Hydroxygruppe von Ser oder für eine Äminogruppe der Seitenkette; X⁴ Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die phenolische Hydroxygruppe von Tyr; X⁵ und X⁶ jeweils entweder Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die jeweils vorhandene Seitenkette; und X⁷ GIy-O-CH₂-(Trägerharz), O-CH₂-(Trägerharz), D-Ala-O-CH₂-(Trägerharz), Gly-NH₂-(Trägerharz), D-Ala-NH-(Trägerharz), GIy-NH₂, ein Ester, ein Amid oder ein Hydrazid bedeuten durch Abspaltung eines oder mehrerer der Gruppen X¹ bis X⁶ und/oder Abspaltung von einem in X⁷ enthaltenen Trägerharz mit Fluorwasserstoffsäure bei 0⁰C unter Zusatz von Anisol hergestellt werden, die gewünschtenfalls in eines ihrer nicht toxischen Salze umgewandelt werden.
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß daß W4CL oder 4F bedeutet.
3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß Ri ß-D-2NAL und R₆ 4-NH₂-D-Phe, D-Lys, D-Om, D-Har, D-His, 4-gua-D-Phe, D-PAL oder D-Arg bedeuten.
4. Verfahren nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß R₆ D-Arg bedeutet.
5. Verfahren nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß R₇ Tyr oder 3PAL bedeutet.
6. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß R₃ (Y)D-Trp und Y6NO₂ oder N^lnCH0 bedeuten.
7. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß Ri ß-D-2NAL, R₃ D-PAL und R₅ Arg bedeuten.
8. Verfahren nach Punkt 7, gekennzeichnet dadurch, daß R₆ D-Trp, D-PAL, ß-D-NAL, (im BzI)D-HiS oder (6NO₂)-D-Trp bedeutet.
9. Verfahren nach Punkt 8, gekennzeichnet dadurch, daß R₆ (imbzl)D-His oder (6NO₂)D-Trp und R₇ Leu bedeuten.
10. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 9, gekennzeichnet dadurch, daß R₄ Ser, X Ac oder Acrund Ri₀D-AIa-NH₂GIy-NH₂ bedeuten.