DE2830629A1

DE2830629A1 - Arzneimittel auf peptidbasis

Info

Publication number: DE2830629A1
Application number: DE19782830629
Authority: DE
Inventors: Catherine Laure Rivier; Jean Edouard Frederic Rivier; Jun Wylie Walker Vale
Original assignee: Salk Institute for Biological Studies
Current assignee: Salk Institute for Biological Studies
Priority date: 1977-07-14
Filing date: 1978-07-12
Publication date: 1979-02-22
Also published as: SE7807816L; CH639362A5; CA1110232A; NL7807612A; NZ187806A; AU3792978A; GB2001077B; US4218439A; FR2397192A1; GB2001077A; AU519687B2

Description

8 MÜNCHEN 86, BEN g L Q^t. 1978

POSTFACH 860 820 * ι «"■ ■

MÖHLSTRASSE 22, POUFNUMMER 98 39 21/22 P 28 30 629.8

THE SALK INSTITUTE FOR FIOLOGICAL STUDIES, 10OTO" North Torrey Pines Road, La Jolla, Calif., USA

Arzneimittel auf Peptidbasis

Die Erfindung betrifft ein Arzneimittel, welches als Wirkstoff ein Peptid mit Einfluß auf die Ausschüttung von Gonadotropinen von der Hypophysendrüse bei männlichen und weiblichen Säugetieren einschließlich Menschen enthält. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Arzneimittel, das die Geschlechtsdrüsenfunktion und die Ausschüttung von männlichen und weiblichen Steroxdhormonen inhibiert.

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ORIGINAL INSPECTED

Die Hypophysendrüse ist mit einem Stiel an dem Bereich in der Basis des Gehirns angebracht, der als Hypothalamus bekannt ist, Die Hypophysendrüse enthält zwei Lappen, die Vorder- und Hinterlappen. Der Hinterlappen der Hypophyse speichert und leitet in den allgemeinen Kreislauf zwei Hormone, die in dem Hypothalamus erzeugt werden. Diese sind Vasopressin und Oxytoein. Der Vorderlappen der Hypophysendrüse scheidet eine Reihe von Hormonen ab, die komplexe Protein- oder Glycoprotexnmoleküle sind und die durch den Blutstrom an verschiedene Organe wan-.dern und die ihrerseits die Sekretion im Blutstrom anderer
Hormone aus den peripheren Organen stimulieren. Insbesondere werden von der Hypophyse follikelanregendes Hormon und luteinisierendes Hormon ausgeschüttet. Diese Hormone regulieren in Kombination die Funktion der "Gonaden bzw. Geschlechtsdrüsen bei der Bildung von Testosteron in den Hoden und Progesteron und östrogen in den Ovarien und weiterhin regulieren -sie die Bildung und Reifung der Gameten bzw. Geschlechtszellen. Diese Hormone werden manchmal als Gonadotropine oder gonadotropische Hormone bezeichnet.

Die Ausschüttung bzw. Freisetzung von Hormon durch den Vorderlappen der Hypophyse erfordert im allgemeinen eine vorherige Ausschüttung einer anderen Klasse von Hormonen, die von dem Hypotha-lamus gebildet werden. Eins der hypothalamischen Hormone wirkt als Faktor, der die Ausschüttung der gonadotropen Hormone,,insbesondere des luteinisierehden Hormons, triggert. Der Einfachheit, halber wird im folgenden das luteinisierende Hormon als "LH" bezeichnet. Das hypothalamisehe Hormon, das als Ausschüttungsfaktor für LH wirkt, wird im folgenden als "LRF" bezeichnet, worin RF für "Releasing Faktor" bzw. "Ausschuß zungs faktor" steht und L angibt, daß das Hormon LH ausschüttet. LRF wurde isoliert und identifiziert.

Es wurde gezeigt, daß einige weibliche Säugetiere, die keinen Ovulationszyklus aufweisen und die keine Hypophysen-oder Ovarienkrankheit bzw. Mangel aufweisen, normale Mengen an

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V*«

Gonadotropinen, LH und FSH (follikelstimulierendes Hormon) abzuscheiden beginnen nach der Verabreichung von LRF. Die Verabreichung von LRF ist für die Behandlung von solchen Fällen von Unfruchtbarkeit geeignet, wo der funktionelle Fehler bzw. Mangel in dem Hypothalamus liegt. Die Ovulation kann in weiblichen Säugetieren durch die Verabreichung von LRF induziert werden. Jedoch muß der Dosisgehalt an LRF, der für den Einfluß der Ovulation erforderlich ist, manchmal sehr hoch sein. In kürzlichen Veröffentlichungen wurde angegeben, daß die Verabreichung von -großen und häufigen Mengen von LRF tatsächlich die Geschlechtsdrüsenfunktion bei weiblichen Ratten inhibiert. Aus diesem Grund wurde LRF als potentielles Contraceptivum geprüft. Der Hauptnachteil bei der Verwendung von LRF als potentielles Contraceptivum ist natürlich, daß große und häufige Dosen erforderlich sind.

Es besteht daher Bedarf an einem Peptid, das die Sekretion von Steroiden in wesentlich geringeren Gehalten inhibiert als LRF, und bei dem eine weniger häufige·Verabreichung erforderlich ist. Es besteht weiterhin ein Bedarf an einem Peptid, das entweder männlichen oder weiblichen Säugetieren zur Verhinderung der Vermehrung verabreicht werden kann. In diesem Zusammenhang ist es wichtig zu erkennen, daß die pharmazeutische Industrie zahlreiche Bemühungen unternommen hat, ein Verfahren zur Behandlung von männlichen Säugetieren zu entwickeln, um die Vermehrung zu ..verhindern, daß aber .bis jetzt noch kein solches geeignetes Verfahren gefunden wurde. Es'ist überraschend wegen der vollständig unterschiedlichen Hormonsysteme von männlichen und weiblichen Säugetieren, daß das gleiche Peptid entweder zur Behandlung von männlichen oder weiblichen Säugetieren verwendet werden kann,um eine Vermehrung bzw. Fortpflanzung zu verhindern.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eire Peptidbehandlung zur Verfügung zu stellen, gemäß der die Ausschüttung von Steroiden durch die Gonaden von männlichen und weib-

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lichen Säugetieren,, insbesondere Menschen, inhibiert wird. Erfindungsgemäß soll eine Peptidbehandlung zur Verfügung gestellt werden, die eine verbesserte Inhibitorwirkung bei den Vermehrungsverfahren von Säugetieren einschließlich Menschen ermöglicht. Erfindungsgemäß soll ein Verfahren zur Verhinderung der Fortpflanzung von Säugetieren zur Verfügung gestellt werden, gemäß dem eine wirksame Menge eines besonderen Peptids entweder männlichen oder weiblichen Säugetieren verabreicht wird.

Erfindungsgemäß wurde ein Peptid synthetisiert, das direkt oder indirekt die Sekretion von Gonadotropinen von der Hypophysendrüse von Säugetieren.einschließlich Menschen inhibiertund das die Ausschüttung von Steroiden von den Geschlechtsdrüsen inhibiert. Das Peptid inhibiert die Ausschüttung von Gonadotropinen bei wesentlich niedrigeren Dosisgehalten, verglichen mit bekannten Peptiden, die die Freigäbe von Gonadotropinen inhibieren. Das Peptid kann als Contraceptivum für männliche Säugetiere verwendet werden. Das Peptid kann nach irgendeinem geeigneten und zweckdienlichen Verfahren, wie oral, durch-Injektion oder subkutan, verabreicht werden. Das Peptid kann mit geeigneten, pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln, wie Pflanzenölen, Zucker, Polysacchariden und Gummis, kombiniert werden.

LRF wurde als Decapeptid der folgenden Struktur p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ charakterisiert.

Peptide sind Verbindungen, die zwei oder mehrere Aminosäuren enthalten, worin die Carboxylgruppe der einen Säure an die Aminogruppe der anderen Säure gebunden ist. Die Formel für LRF, wie oben dargestellt, entspricht der üblichen Darstellung von

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Peptiden, worin die Aminogruppe links· und die Carboxylgruppe rechts erscheint. Die Stellung der Aminogruppen wird durch Bezeichnung der Aminogruppen von links nach rechts indentifiziert. Im Fall von LRF wurde der Hydroxy!teil der Carboxylgruppe mit einer Aminogruppe (NH₂) ersetzt. Die Abkürzungen für die einzelnen Aminosäuregruppen oben sind üblich und beruhen auf dem Trivialnamen der Aminosäure, worin pGlu Pyroglutaminsäure, His Histidin, Trp Tryptophan, Ser Serin, Tyr Tyrosin, GIy Glycin, Leu Leucin, Arg Arginin-und Pro Prolin bedeuten. Ausgenommen von Glycin besitzen die Aminosäuren, sofern nicht' anders "angegeben _? dieiL-Konfiguration.

Es ist bekannt, daß die Substitution von D-AIa oder D-Lys für GIy in -der 6-Stellung von LRF-Decapeptid ein Peptidmaterial ergibt, das eine'3~ bis 10-fache größere Potenz besitzt als LRF bei der Ausschüttung von luteinisierenden Hormonen und anderen Gonadotropinen von der Hypophyse von Säugetieren. Die Ausschüttungswirkung wird erhalten, wenn das substituierte Peptid in den Blutstrom von Säugetieren eingeführt wird.

Es ist bekannt, daß die Substitution verschiedener Aminosäuren für His (oder das Weglassen von His) in der 2-Stellung des LRF-Decapeptids Peptidmaterialien mit einer Inhibitorwirkung auf die Ausschüttung von luteinisierendem Hormon und anderen Gonadotropinen von der Hypophyse von Säugetieren bewirkt. Insbesondere werden unterschiedliche Grade an Inhibierung bei der Ausschüttung von luteinisierendem Hormon erhalten, wenn His weggelassen wird, oder durch Asp, Cys, D-AIa, D-Phe und GIy ersetzt wird. Es wurde weiterhin gefunden,daß die Inhibitorwirkung 'dieser Peptide, die in der 2-Stellung modifiziert sind, stark verbessert werden kann, wenn D-AIa oder D-Lys für GIy in der 6-Stellung der Decapeptide substituiert wird. Beispielsweise ist das Peptid

p-Glu^Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ .

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um das 3-fache wirkungsvoller als Inhibitor für die Ausschüttung von Gonadotropin, als das gleiche Peptid, wenn GIy in der 6-Stellung anstelle von D-AIa vorhanden ist.

Erfindungsgemäß wurde ein Peptid synthetisiert, das um das etwa 150-fache wirksamer ist als LRF. Es wurde gefunden,daß dieses Peptid bei der Verhinderung der Fortpflanzung wirksam ist, wenn es periodisch männlichen oder weiblichen Säugetieren bei sehr niedrigen Dosismengen verabreicht wird. Es wurde gefun-.den, daß dieses Peptid wirksam ist, um die Implantation _von befruchteten weiblichen Säugetiereiern bei sehr niedrigen- Dosisgehalten zu verhindern, verglichen mit LRF. Das Peptid ist ebenfalls sehr wirksam und verursacht eine Resorption der befruchteten Eier, wenn es kurz nach der Konzeption verabreicht wird.

Das bei dem erfindung-s gemäß en Verfahren verwendete Peptid wird durch die folgende Formel darstellt:

p-Gly-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NH-C^-CH,.

Das erfindungsgemäße Peptid wird nach einem Verfahren mit fester Phase synthetisiert. Die Synthese wird stufenweise an chlormethyliertem Harz durchgeführt. Das Harz enthält feine Perlen (mit einem' Durchmesser von 20 bis 70 μπι) eines synthetischen Harzes, das durch Copolymerisation von Styrol mit 1 bis 2% Divinylbenzol"hergestellt wird. Der Benzolring in dem Harz wird in einer Friedel-Craft-Reaktion mit Chlormethyläther und Zinn(IV)chlorid chlormethyliert. Das so eingeführte Chlor zeigt eine reaktive Bindung vom Benzylchloridtyp. Die Friedel-Craft-Reaktion wird weitergeführt, bis das Harz"0,5 bis 2 mMol Chlor pro Gramm Harz enthält.

Wie im folgenden beschrieben, werden die verwendeten Reagentien zuerst mit ihrem chemischen Namen und dann mit ihrer üblichen Abkürzung aufgeführt, Im folgenden werden dann die Rea-

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gentien manchmal mit ihren üblichen Abkürzungen bezeichnet.

Das Triäthylammoniumsalz von N^Boc-geschütztem Pro wird an dem chlormethylierten Harz durch Erhitzen am Rückfluß in Äthanol während etwa 48 Std. verestert. Es ist weiterhin möglich, das Harz oder Kaliumsalze in Dimethylformamid (DMP) oder Dimethylsulfoxid (DMS) bei Temperaturen im Bereich von 40 bis 80°C zu verwenden. Nach der Schutzgruppenabspaltung und Neutralisation wird das N^Boc-Derivat der nächsten Aminosäure -Arg zusammen· mit dem Kupplungsmittel angefügt, das Dicyclo¹-hexylcarbodiimid (DCC) ist. Die Seitenkette von Arg wird mit Tosyl (Tos) geschützt." Die Schutzgruppenabspaltung, die Neutralisation und die Addition von den folgenden Aminosäuren wird entsprechend dem folgenden Schema durchgeführt:

Schema für-die Kupplung von Aminosäuren bei der Synthese in ^; fester Phase von p-Glu-His-Trp-Ser-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NH-C^- CH^ an 10 g Harz:

Stufe. .Reagentien und Verfahren Misch

. ^: . ■*" · zeit

1 CH₂Cl₂ waschen 80 ml (2-mal) 3

2 Methanol (MeOH) waschen 30 ml (2-mal) 3

3 ■ CH₂Cl₂ waschen 80 ml (3-mal> 3

4 5oi Trifluoressigsäure (TPA) + 5% 1,2-

Ät handithiol in CH₂Cl₂ 70 ml (2-mal) ·- 10

5 CH₂Cl₂ waschen 80 ml (2-mal) . ■ 3

6 Triäthylamin (Et,N) 12,5/^ in Dimethylformamid (DMF) 70 ml-⁾(2-mal) - 5

7 MeOH waschen 40 ml (2-mal) 2 ■8 -OH₂Cl₂ waschen 80 ml (3-mal) 3

9 Bpc-Aminosäure (10 mMol) in 30 ml'DMP- (1-mal)

- + Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (10 mMol) in DMP 30

10 MeOH waschen 40 ml (2-mal) 3

11 Et₃N .1235% in DMP 70 ml (1-mal) - . 3 12- MeOH waschen 30 ml (2-mal) ■ ' 3 13 CH₂Cl₂ waschen 80 ml (2-mal) 3

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Nach Stufe 13 wird ein aliquoter Teil für den Ninhydrintest entnommen. Wenn der Test negativ ist, wird zur Stufe 1 für die Kupplung der nächsten Aminosäure zurückgegangen. Wenn der Test positiv oder etwas positiv ist, werden die Stufen 9 bis 13 wiederholt.

Das obige Schema wird zum.Kuppeln von jeder der Aminosäuren des erfindungsgemäßen Peptids verwendet. Der N*Boc-Schutz wird für jede der restlichen Aminosäuren innerhalb der Synthese ver-.wendet.OBzl wird als Seitenkettenschutzgruppe für Ser und Tyr verwendet. 2,6-Dichlorbenzyl kann als Seitenkettenschutzgruppe für Tyr verwendet werden. Tos, Dinitrophenyl (Dnp) oder Boc kann als Seitenkettenschutzgruppe für His verwendet werden, p-GIu wird als Benzyloxycarbonal (Z)-geschützte Aminosäure eingeführt .

Die Spaltung des Pept-ids von dem Harz erfolgt durch Rühren des Harzes über Nacht in destilliertem Äthy.lamin bei O⁰C in einem Druckbehälter. Nach der Entfernung von überschüssigem A'thylamin durch Destillation unter Stickstoff oder im "Vakuum wird das in Methanol suspendierte Harz von der Aufschlämmung durch Filtration entfernt. Das" Harz wird weiter nacheinander mit DMP₁ Methanol _? DMP und Methanol gewaschen. Die wiedergewonnene Lösung aus gespaltenem, geschützten Peptid wird zur Trockne an einem Rotationsvakuumverdampfer bei Zimmertemperatur eingedampft. Das Peptid wird in einer minimalen Menge an Methanol zum Auflösen des Peptids aufgenommen. Die Lösung wird tropfenweise in einem 50-fachen Überschuß an trockenem Äther unter"Rühren gegeben. Ein ausgeflockter Niederschlag tritt auf, der durch Filtration oder Zentrifugieren abgetrennt wird. Der wiedergewonnene Niederschlag wird getrocknet und die Schutzgruppen werden abgespalten.

Die Schutzgruppenabspaltung des Peptids findet bei 0⁰C mit Chlorwasserstoffsäure (HF) statt. Anisol wird zu dem Peptid

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vor der Behandlung mit HF zugegeben. Nach der Entfernung von HF im Vakuum wird das Peptid mit Äther behandelt, abdekantiert, in "verdünnter Essigsäure aufgenommen und lyophilisiert.

Die Reinigung des Peptids erfolgt durch Ionenaustauschchromatographie an einer CMC-Säule, gefolgt von einer Verteilungschromatographie unter Verwendung des Elutionssystems: n-Butanol; Essigsäure; Wasser ( 4:1:5; VoI,Verhältnis), Die für die Trennungschromatographiesäule ist Sephadex G 25·

Das Peptid wird in einer Menge bzw. einem Gehalt verwendet,der wirksam ist, die Implantation der befruchteten weiblichen Säugetiereier; bei weiblichen Säugetieren zu verhindern oder die Befruchtung durch männliches Sperma zu verhindern. Es wurde festgestellt, daß das erfindungsgemäße Peptid bei Mengen wirksam ist, die so niedrig sind wie 0,5 Mikrogramm/kg Körpergewicht/Tag bei der Verzögerung der Pubertät, der Verhinderung der Implantation von befruchteten weiblichen Säugetiereiern während der Dauer der Behandlung, zur Verringerung der Gewichte von Hoden und Spermabläschen nach einer 7-tägigen Verabreichung" bei männlichen Ratten. Die Testosterongehalte bei männlichen Ratten sind vergleichbar mit denen der Vergleichstiere innerhalb von einer Woche nach der Beendigung der Behandlung wahrend 7 Tagen, Die Prostatagewichte der männlichen Ratten stellen sich in 2 Wochen wieder ein und die' Spermabläschengewichte in 4 Wochen. Es ist bevorzugt, Dosisgehalte im Bereich von etwa 0,5 bis etwa 50 Mikrogramm/kg Körpergewicht/ Tag zu verwenden. Höhere Gehalte können verwendet werden, aber man erhält bei der Verwendung höherer Gehalte keinen wesentlichen Vorteil.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

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Es wurde festgestellt, daß bei der Behandlung männlicher Ratten mit 10 Mikrogramm des Peptids einmal am Tag während 7 Tagen eine Verminderung im Hoden und Samenbläschengewicht einer Spermatogenese und Plasmaandrogengehalt auftreten. Die immunoreaktiven Gonadotropxngehalte in den behandelten männlichen Tieren werden, bezogen auf Vergleichstiere, bestimmt und sind in der folgenden Tabelle I aufgeführt.

Tabelle I - Männliche Ratten

Gew. g Ng/Ml Plasma

Hoden Samenbläs- LH FSH Test, DHT . chen

Behandlung

Vergleich 8 2,09 0,41 58 718 4724 756

Peptid

15 Tg. 8 1,33 0,18 561 1582 ' 229 151

Die histologische Prüfung der Hoden nach der 7-tägigen Behandlung zeigt tubulare Schäden, eine gehemmte Spermatogenese und degenerierte Sertoli-Zellen während einer Zeit bis zu mehreren Wochen -nach Beendigung der täglichen Injektion. Die Ratten können einen Coitus nach Beendigung der Injektionen eingehen, sie sind jedoch unfähig, eine Befruchtung zu verursachen.

Es ist somit erkennbar, daß das erfindungsgemäße Peptid bei der Behandlung zur Verhinderung der Fortpflanzung von männlichen Säugetieren nützlich ist.

Beispiel 2

Ausgewachsene weibliche Sprague-Dawley-Ratten werden bei kontrollierten Lichtbedingungen (14 Std. Licht, 10 Std. Dunkelheit)

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gehalten und erhalten Futter und Wasser ad lib. Tägliche Vaginalabstriche werden jeden Morgen entnommen. Nur die Ratten mit zwei oder mehreren aufeinanderfolgenden 4-tägigen östruszyklen werden verwendet. Luteinisierendes Hormon (LH) und Prolactin (PRL) werden nach dem doppelten Antikörperverfahren unter Verwendung der folgenden Reagentien gemessen: LH-RP-I als Standard, LH-I als Tracer und-Kaninchen-Antiratten-LH; PRL-RP-I als Standard, hochgereinigtes Ratten-PRL als Tracer und Kaninchen- Antiratten-PRL. Die statistischen Analysen werden un- -ter Verwendung von Duncan-Mult!Vergleichsversuchen durchgeführt ... '

Bei der Untersuchung werden vier Behandlungsgruppen verwendet:

Gruppe 1. Acht weiblichen Ratten wird das erfindungsgemäße Peptid während des Alters vom Tag 27 bis zum Tag 45 injiziert. 20 Mikrogramm des PeptidB, dispergiert in 0,5 ml Salzlösung, die 0,1% Gelatine enthält, werden für die Injektion verwendet. Das Peptid wird subkutan 2-mal täglich um 9 "Uhr morgens und um 5 Uhr nachmittags verabreicht. Der .Tag der vaginalen öffnung (VO) wird .aufgezeichnet und mit dem Tag der vaginalen öffnung bei 8 Kontrollratten gleichen Alters verglichen. Beide Gruppen werden am 53. Tag (Alter) getötet.

Gruppe 2. Sechs weiblichen Ratten wird das Peptid (20 Mikrogramm/ .0,5 ml Salzlösung _? die 0,1% Gelatine enthält), beginnend am Diöstrus-I, injiziert. Während der Tage 6 bis 13 werden 2-mal täglich um 9 Uhr morgens und 5 Uhr abends Injektionen durchgeführt. Danach werden die Tiere beim Diöstrus-II getötet.

Gruppe 3. Verschiedene! Gruppen von trächtigen weiblichen Ratten (das Auftreten von Sperma in der Vagina wird als Tag 1 der Trächtigkeit genommen) wird das Peptid in drei unterschiedlichen Mengen (2, 10 und 20 Mikrogramm) injiziert. Das Peptid ist entweder in .0,5 ml Salzlösung, die 0,1% Gelatine enthält, oder in 0,5 ml Mais-

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öl dispergiert. Die Injektionen werden subkutan entweder 1-mal oder 2-mal täglich vom Tag 1 bis Tag 7; Tag 1 bis Tag 4; oder Tag 2 bis Tag 7 der Trächtigkeit verabreicht. Ein Versuchsbauchschnitt wird am Tag 8 und/oder Tag 14 durchgeführt. Die meisten Ratten können sich wieder erholen und werden 30 Tage nach der letzten Injektion getötet. Bei den Ratten, denen 2-mal täglich vom Tag 1 bis-zum Tag 7 20 Mg verabreicht wurden, werden zwei Ratten am Tag 7 und am Tag 14 getötet. Ihre Ovarien werden entfernt, in 10$ Formalin fixiert und in Paraffin •eingebettet. Reihenteile werden mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt.

Gruppe 4. Eine Dosisansprechstudie wird mit 5 Gruppen von zehn trächtigen'Ratten durchgeführt, die 0,25, 0,5₃ I₃O und 2,5 Mg des Peptids einmal täglich während 7 Tagen erhalten. Das Peptid wird in 0,5 ml Maisöl suspendiert und subkutan verabreicht. Als Vergleich verabreicht man einer Gruppe von Ratten nur Maisöl ohne Peptid.

Ergebnisse

Gruppe 1. Die Ergebnisse der Behandlung, die für die Gruppe beschrieben wurde, sind-in Tabelle II aufgeführt. Der Tag der vaginalen öffnung war der 36,6. bei den Vergleichstieren und der 52,2. bei den behandelten Tieren. Diese Verzögerung ist signifikant. Am letzten Tag der Behandlung (Tag 45) sind die Plasma-PRL-Gehalte wesentlich bei den behandelten Tieren (19₅9 pg/ml) erniedrigt, verglichen mit den Vergleichstieren (269,0 pg/ml). 8 Tage nach Beendigung der Behandlung besitzen beide Gruppen vergleichbare PRL-Plasmagehalte, Im Gegensatz zeigen jedoch die behandelten Ratten höhere LH-Plasmagehalte einen Tag nach Beendigung der Behandlung (128,3 Mg/ml für die behandelte Gruppe gegenüber 60,1 pg/ml der nichtbehandelten Gruppe) und 9 Tage nach Beendigung der Behandlung (98,5 gegenüber 55,3 Mg/ml).

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Tabelle II - Einfluß auf die Pubertät bei weiblichen Ratten ,

—Tag^: 46-— -----Tag 54 ■---

Ug Hormon / ml Plasma ug Hormon /ml Plasma

Behandlung N Tag der VO, PRL LH ■.■ , PRL LH ■ Vergleich 8 36,6 269,0 60,1 ' 169,6 55,3

2. χ 20 ug ₊

(Tag 27~46)(a)8 52,2 19 y9- }28,9 213,6 98,6 .

cb , ■ , , '

cx> ■ ' ·

ο (a) Das Peptid wird subkutan in Salzlösung, die 0,1$ Gelatine enthält, verab- V

«v» . reicht ■ . "^₁

(O ' ·■ ' ■■

Gruppe 2. Wenn Ratten mit Zyklus das Peptid injiziert wird, beginnend am Diöstrus-I, wird der östruszyklus gestört und anschließend werden konstante Diöstrusabstriche hauptsächlich leukozytisch solange erhalten, vzie die Behandlung weitergeführt wird. Wach Beendigung der Injektion des Peptids stellen sich die normalen Zyklen nach 4 bis 8 Tagen wieder ein. Plasma PRL- und LH-Gehalte sind in der folgenden Tabelle III aufgeführt. Die Plastma PRL- und LH-Gehalte, die am letzten Tag der Behandlung bestimmt wurden, zeigen erhöhte TRL-Sekretion (von 23 ₃ 5 bei der Vergleichsgruppe gegenüber 62j 1 ug/ml der behandelten Gruppe). Sowohl die Vergleichsals auch die behandelten Gruppen von Tieren zeigen vergleichbare LH-Plasmagehalte (65,5 bzw.72₃8 μg/ml).

Tabelle III - Wirkung bei Ratten mit Zyklus

Behandlung

Kontroll-Diöstrus-I

behandelt (a)

PRL

	Vi	μg/ml	Plasma	65	,3
62				72	,8
23

(a) 20 ug Peptid werden 2-mal täglich, beginnend am Diöstrus-I, ^fahrend 6 bis 13 Tagen verabreicht. . ■

Gruppe 3. Bei einer ersten Reihe von Versuchen wird das Peptid in einer Dosis von 20 ug in 0,5 ml Salzlösung, die 0,1? Gelatine enthält, 2-mal täglich vom Tag 1 bis Tag T₃ vom Tag 1 bis Tag 4 und Tag 2 bis Tag 7 der Trächtigkeit injiziert. Die Injektionen bis zum Tag.7 bewirken ein Nichtauftreten der Implantation und keine lebensfähigen Fötusse werden am Tag 14 festgestellt (vgl. die folgende Tabelle IV). Im Gegensatz zeigt, wenn die Injektionen am Tag 4 beendig-t werden, nur eine von fünf Ratten keine offensichtlichen Implantationsstellen (IS). Die vier restlichen Ratten werfen im normalen Durchschnitt lebensfähige Junge_; aber die Geburt ist um 4 Tage verzögert^ verglichen mit der Vergleichsgruppe.

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, Tabelle IV - Einfluß auf die Aufrechterhaltung.der Trächtigkeit

D 7

D 14

fin	Vergleich	N	Ratten ohne IS	Anz.d. Ratten mit IS (No.IS/ Ratte)	Größe IS	N	Ratten ohne IS	6	1	Ahz.d.Rat ten m. le bensfähig. Stellen (No.Stel len/Ratte)	Durch schnitt!. Größe d. Stellen	6(b)	Anz.d. entbund. Fötusse (Durch schnitt/ Ratte	Durchschh, Länge der Tragzeit
O		14	0	14	0,5 cm	10(a) . 0		■ 5	10	1,2cm,		66
OO	2x2μg Dl- D7 (gel-sal)			(13,9)			ι ■■	(12,0)		6	(H)- '	22,3
08/	lxlOμg Dl-	6 ND	(c)	ND	ND	6		6	—		0	-
ο σ>	Dftgel-sal)						6			5
co		5	2	y	0,2 cm	5	7(d) 7	4	1,1cm		44
	lxlOμg Dl- D7(öl)			(M,3)			5 '	(14,3)		6	(11)	25,0
	2x20μg Dl- D7 (gel-sal)	6	. ND		ND	6		o ;	-	5(e)	0	-
	2x20μg Dl- D4 (gel-sal)	10	10	0	—.'		0	-	4	0
	2x20μg D2- D7 (gel-sal)	5	1	4 (12,5)	0,25cm	4 (11,5)	0,9cm ..		40 (10)	26,8
	5	5	5	0	.5' ,-.	Q	ο,., .' .

(a) 4 Ratten werden am Tag D7 getötet

(b) 4 Ratten werden am Tag D14 getötet

(c) ND + nicht bestimmt

(d) 3 Ratten werden am Tag D7 getötet ■

(e> 2 Ratten Werden,·'am ■ Tag:,ΦΧΜ \getötet ■;, ■■'' , ^;C

Tabelle V - Plasmahormongehalte bei den trächtigen Vergleichsratten

und den gepaarten Ratten, die mit Peptid behandelt wurden

Horraonplasmagehalte

Behandlung Vergleich «*» lxlOug Dl-

2 ^D7(a)

oo 2x20μg Dlo D7

v* 2x20μg Dl-

O D4

«Ο 2x20ug

	PRL	D7	Progesteron	■	N	PRL	■D14	Progesteron
	43,8	LH	51,1	7	49,8	LH	43,5 ' '
7	60,8	142,5	ND(b)	5	15,2 .	160,0	' .ND . ■ ■
5	52,3	68,5	2,08	7	64,0	, 58,0	5,25 '
10	22,2	108,5	ND	.5	11,4	25,9	. .ND
5'	47,0	59,2	ND	5	85,0	55,3	ND
Ul	92,0		56,0

(a) Das Peptid wird als

(b) nicht bestimmt

Gelatinesalzlösung allen Tieren verabreicht

CO CO O

Bei einer zweiten Reihe von Versuchen werden die Wirkungen von niedrigeren Dosismengen und die Bedeutung des Trägers, in dem das Peptid verabreicht wird,untersucht. Bei einer so niedrigen Dosis wie 2 μg_s die 2-mal täglich in Salzlösung verabreicht wird, die 0,1% Gelatine enthält, während des Tages 1 bis Tag 7 erhält man eine 100%ige Inhibierung der Trächtigkeit. Bei einer Dosis täglich von 10 μg in Salzlösung., die 0_a 1% Gelatine enthält, wird die Implantation bei einer von fünf Ratten verhindert, xirährend die vier anderen .durchschnittlich 11 Junge pro Ratte am 25- Tag nach der Trächtigkeit werfen, gegenüber dem 22,3- Tag nach der Trächtigkeit bei Vergleichstieren. Bei diesen vier Ratten ist die Größe der implantierten Blastocyten wesentlich kleiner am Tag 7 als bei den Vergleiehstieren (2 gegenüber 0,5 cm), aber am Tag l4 ist der Unterschied in der Größe nicht mehr signifikant. Im Gegensatz dazu zeigt keine der fünf Ratten lebensfähige Implantationssteilen, wenn die gleichen 10 ug Peptid einmal täglich in Maisöl verabreicht werden. Die Messung der Hormonplasmawerte-ergibt folgende Ergebnisse (vgl. Tabelle V): Am Tag 7 der Trächtigkeit sind die Plasma-PRL-Werte niedriger (22,2 μg/ml) bei den vom Tag 1 bis Tag 4 behandelten Ratten, aber die anderen Tiere unterscheiden sich nicht beachtlieh (43,8 - 60,8 yg/ml). Am Tag. 14 zeigt die Gruppe, die mit dem Peptid vom Tag 1 bis Tag 4 behandelt wurde, erniedrigte Plasma-PRL-Gehalte (11,4 ug/ml), verglichen mit der Gruppe, der nur einmal täglich vom Tag bis Tag 7 das Peptid, dispergiert in Salz-l%iger Gelatine (15,2 ug/ml) verabreicht wurde. Die andere Gruppe besitzt ähnliche PRL-Gehalte. Die LH-Plasmägehalte. sind wesentlich niedriger am Tag 7 und Tag 14 bei allen behandelten Ratten, verglichen mit den trächtigen Vergleichsratten.

Bei der Gruppe, die 2-mal täglich mit 20 μg Peptid vom Tag bis Tag 7 behandelt wurde, sind die Plasmaprogesterongehalte wesentlich erniedrigt (Tag 7: 2,08 ug/ml; Tag 14: 5,25 μg/ml), verglichen mit der Vergleiehsgruppe (Tag 7: 51jl ug/ml; Tag 15: 43,5 lg/ml); vgl. die folgende Tabelle VI.

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Gruppe 4: Wie aus Tabelle VI erkennbar ist, ist die Anzahl der resorbierten Fötusse eine Funktion der Dosis des Peptids. Bei der Vergleichsgruppe, die kein Peptid erhält, und bei den Tieren, die 0,25 μg Peptid erhalten, zeigen zehn von zehn Ratten Implantationsstellen (IS). Die Zahl der Ratten mit Implantationsstellen nimmt mit steigenden Dosen des Peptids zu und beträgt 7 von 10 für die Gruppe, der 0,5 μg Peptid verabreicht
werden, 2 von 10 für die Gruppe, die 1,0 μg Peptid erhält, und 0 von 10 für die Gruppe, die 2,5 Hg Peptid erhält. Die Rate
•der Resorption der Fötusse ist ebenfalls eine Funktion der Dosis des Peptids. 26% bei der 0,25 μg-Gruppe, 65% bei der 0,5 μg-Gruppe und 100% bei der 1,0- und der 2,5 μg-Gruppe.

Tabelle VI - Einfluß gestaffelter Dosen bei der Implantation

Dosis/ μg/Rat- t-e/Tag	Gesamt zahl d. Tiere .	3	Zahl d. Tiere mit IS	Gesamt zahl m. normalem Fötus	Gesamt zahl d, resorb, Fötusse
-	10	10	139 ·	0
0,25	10	10	36	34
0,5	10	7	29 "	55
1,0	10	2 '	0	26 .
2,5	10	0	0	0
Beispiel

Es wurde weiterhin bestimmt, daß die Behandlung von männlichen Ratten mit 10 μg des Peptis 1-mal täglich während 15 Tagen eine Abnahme im Hoden und in dem Samenbläschengewicht, Spermatogene~e und Plasmaantrogengehalte bewirkt. Die immunoreaktiven Gonaootropingehalte in den behandelten männlichen Tieren sind erhöht, bezogen auf die Vergleichstiere (vgl. Fig. VI). Das erfindungsgemäße -Peptid scheint somit ein nützliches Contraceptivum für männliche Säugetiere einschließlich Menschen zu sein.

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Tabelle VII

Männliche Säugetiere

	Behandlung	N	Hoden	Gew. g	LH,	FSH	Mg/ml Plasma	DHT
	Vergleich	8		Samenbläschen			Test
	10Mg Peptid während 15 Tagen	8	2,09		58	718		756
			1,33	0,41	■561	t 1582	4724	151
8606				. 0,18			229
ο OO
O σ)

ZZ

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Behandlung
von männlichen Säugetieren einschließlich Menschen zur Verhinderung der Portpflanzungj gemäß dem man dem männlichen
Säugetier eine wirksame Menge eines Peptids verabreicht,wobei das Peptid die Formel p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-'D-Trp-Leu-Arg-Pro-NH-CH₂-CH₃ aufweist.

Erfindungsgemäß wird das Peptid in einer Menge von etwa 0,5 bis etwa 50 μg/kg Körpergewicht/Tag verabreicht. Das Peptid .kann in einer pharmazeutischen Dosiseinheitsform zusammen
mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln für das Peptid verabreicht werden.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Behandlung von weiblichen Säugetieren einschließlich Menschen zur Verhinderung der Implantation von weiblichen Säugetiereiern, gemäß dem eine wirksame Menge eines Peptis einem weiblichen Säugetier einschließlich Menschen verabreicht wird, wobei das Peptid die Formel p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NH-CH₂-CH, aufweist.

Dem weiblichen Säugetier wird das Peptid in einer Menge von O₃5 bis etwa 50 ug/kg Körpergewicht/Tag verabreicht. Das Peptid kann zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel für das Peptid verabreicht werden.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Behandlung von Säugetieren, gemäß dem die Freigabe bzw. Ausschüttung von Steroiden durch die Gonaden von Säugetieren inhibiert wird, bei dem dem Säugetier eine wirksame Menge eines Peptris der Formel p-Glu-His-Trp-Ser-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NH-CH₂-CH^ verabreicht wird.

Bei diesem Verfahren wird dem Säugetier das Peptid in einer Menge von etwa 0,5 bis etwa 50 μg/kg Körpergewicht/Tag ver-

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ZS

abreicht. Das Peptid kann ebenfalls als pharmazeutische Dosiseinheit zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel für das Peptid verabreicht werden.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines Peptids der Formel p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NH-CE^- CEU zur Verhinderung.der Fortpflanzung bei männlichen und weiblichen Säugetieren einschließlich männlichen und weiblichen Menschen.

Ende der Beschreibung.

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Claims

Patentansprüche

1. Arzneimittel für männliche Säugetiere einschließlich Menschen zur Verhinderung der Fortpflanzung, dadurch g e k e η η zeichnet, daß es eine wirksame Menge eines Peptids der Formel

p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NH-CH^CH, enthält. ' .

2.~- Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es in pharmazeutischer Dosiseinheitsform zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel für das Peptid vorliegt.

3. Arzneimittel für weibliche Säugetiere einschließlich Menschen zur Verhinderung der Implantation von weiblichen Säugetiereiern, dadurch gekennzeichnet, daß""es eine wirksame Menge eines Peptids der Formel

p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NH-CH^CH-, enthält.

4. Arzneimittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es in pharmazeutischer Dosiseinheitsform zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel für das "Peptid vorliegt.

5. Arzneimittel für die Behandlung von Säugetieren einschließlich Menschen zur Inhibierung der Ausschüttung von Steroiden von den Gonaden der Säugetiere, dadurch gekennzeichnet, daß es eine wirksame Menge eines Peptids der Formel

p-Glu-His-Trp-Ser-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NH-CH₂-CH₅ .bzw. P-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leü-Arg-Pro-NH-CH₂-CH^'

enthält. ■ .

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ORIGINAL INSPECTED

6. Arzneimittel nach Anspruch 5₃ dadurch gekennzeichnet, daß es in pharmazeutischer Dosiseinheitsform zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel für das Peptid vorliegt.

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