DE3686099T2

DE3686099T2 - Analoga von cyclischen hexapeptiden von somatostatin, deren verfahren zur herstellung und sie enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen.

Info

Publication number: DE3686099T2
Application number: DE8686107957T
Authority: DE
Inventors: Ruth F Nutt
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1985-06-17
Filing date: 1986-06-11
Publication date: 1993-01-21
Anticipated expiration: 2006-06-12
Also published as: EP0206118A3; EP0206118A2; US4612366A; CA1268899A; DE3686099D1; EP0206118B1; JPS61291599A

Description

Hintergrund der Erfindung

Somatostatin ist ein Tetradecapeptid, das ein cyclisches Dodecapeptid beinhaltet, mit der Struktur:
und die Eigenschaften hat, die Freisetzung von Wachstumshormon zu inhibieren, die Freisetzung von Insulin und Glucagon zu inhibieren und die Magensekretion zu vermindern. Somatostatin selbst hat eine kurze Wirkungsdauer, weil es, unter anderem, von in vivo vorhandenen Aminopeptidasen und Carboxypeptidasen inaktiviert wird. Dieses Problem der kurzen Wirkungsdauer wurde im Stand der Technik teilweise durch die Erzeugung von Somatostatinderivaten gelöst, die eine geringe Löslichkeit aufweisen und somit einer langsamen Freisetzung bei subkutaner Injektion unterliegen. Einmal gelöst sind die Derivate jedoch gegenüber der Inaktivierung durch Aminopeptidasen und Carboxypeptidasen nicht stabiler als Somatostatin selbst.

Beschreibung des Standes der Technik

Im veröffentlichen europäischen Patent 0 117 447 werden cyclische Hexapeptide beschrieben, die eine Aminosäure enthalten, in der die Aminogruppe eine sekundäre Aminogruppe ist, die Teil eines heterocyclischen Rings mit insgesamt 5 oder 6 Gliedern ist. Dieser heterocyclische Ring muß mit zwei Alkylgruppen mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen substituiert sein, die an angrenzende Kohlenstoffatome des heterocyclischen Rings gebunden sind, oder der heterocyclische Ring muß mit wenigstens einem weiteren Ring, der gesättigt, ungesättigt oder aromatisch sein kann, kondensiert sein. Diese heterocyclische Struktur ergibt das entsprechende Hexapeptid mit lipophileren Eigenschaften als ein entsprechendes Hexapeptid, in dem die heterocyclische Aminosäure Prolin ist, und es wird in dem veröffentlichten europäischen Patent erläutert, daß durch diese liophileren Eigenschaften die Somatostatinwirksamkeit der Verbindungen verbessert war. Es werden jedoch keine Testergebnisse in dieser Veröffentlichung angegeben, in denen die Aktivität der darin beschriebenen Verbindungen mit der Aktivität von Somatostatin verglichen wird.
Im veröffentlichen europäischen Patent 0 104 348 von Merck werden fluotierte cyclische Hexapeptide beschrieben, in denen eine Aminosäure des Hexapeptids Lysin ist, das in der γ-Stellung oder in der δ-Stellung der Alpha-Aminosäure monofluoriert ist. Gegebenenfalls ist eine weitere Aminosäure des Hexapeptids eine cyclische Aminosäure, in der die Alpha-Aminogruppe ein Stickstoffatom eines entsprechenden ungesättigten Heterocyclus ist, der 4, 5 oder 6 Glieder aufweist und der die heterocyclische Gruppe einer entsprechenden Prolineinheit des cyclischen Hexapeptids sein kann.
In dem veröffentlichen europäischen Patent wurde die Aktivität der entsprechenden fluorierten Hexapeptide, in denen eine der Aminosäuren der Hexapeptide Prolin war, getestet, wobei die fluorierten Hexapeptide mit Somatostatin verglichen wurden, soweit die Inhibierung der Freisetzung von Wachstumshormonen, die Inhibierung von Insulin und die Inhibierung von Glucagon betroffen ist. Hinsichtlich der getesteten Aktivität hatten die cyclischen Hexapeptide die 1,6-fache bis etwa 2,8-fache Wirksamkeit im Vergleich zu entsprechenden Werten, die beim Test von Somatostatin gefunden wurden. (Siehe Seite 27 der Veröffentlichung).
Es war das Ziel der Erfindung, neue Somatostatinanaloga bereitzustellen, die Hexapeptide sind und die eine deutlich höhere Aktivität aufweisen, was die Inhibierung der Freisetzung von Insulin und Glucagon anbetrifft, wenn mit Somatostatin verglichen, als die entsprechende Aktivität der im veröffentlichten europäischen Patent 0 104 348 beschriebene Verbindungen. Es war weiterhin Ziel der Erfindung, cyclische Hexapeptide bereitzustellen, die eine längere Wirkungsdauer haben als Somatostatin und eine selektivere biologische Wirksamkeit als Somatostatin.

Beschreibung der Erfindung

Ein Ziel der Erfindung sind neue Hexapeptide, die der allgemeinen Formel I entsprechen
worin
Z (CH&sub2;)n ist und n 1 oder 2 ist;
R&sub1; und R&sub2; unabhängig Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen sind, das gegebenenfalls mit einem 5- oder 6-gliedrigen heterocyclischen Ring, Benzyl, Naphthylmethyl, Indolylmethyl, substituiertem Benzyl, das einen oder zwei Substituenten umfaßt, die aus der aus Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Halogen, Hydroxy, Amino, Nitro und Alkoxy mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen bestehenden Gruppe ausgewählt sind, substituiert ist,
R&sub3; 3-Indolylmethyl, Naphthylmethyl oder substituiertes 3-Indolylmethyl ist, worin der Substituent aus der Gruppe ausgewählt ist, die Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen und Halogen umfaßt,
R&sub4; Alkyl, Hydroxyalkyl, Carboxyalkyl und Aminoalkyl ist, worin die Gruppen der Alkyleinheiten Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatamen sind oder
R&sub4; Benzyl oder substituiertes Benzyl ist, worin der Substituent aus der Gruppe ausgewählt ist, die Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Halogen, Amino und Nitro umfaßt,
R&sub5; und R&sub6; unabhängig Wasserstoff oder Methyl sind,
R&sub7; Aminocyclohexylmethyl, Aminomethylbenzyl oder
ist,
worin
Y (CH&sub2;)m ist und m 0, 1 oder 2 ist, oder Schwefel ist, so daß der Schwefel in beliebiger Position entlang der Kette sein kann,
R&sub8; und R&sub9; unabhängig Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Heteroalkyl, worin das Heteroatom aus Sauerstoff, Schwefel, Stickstoff ausgewählt ist, Hydroxy, Mercapto, Amino oder eine Alkanoylgruppe mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen wie auch Derivate der Hydroxygruppen, der Mercaptogruppen und der Aminogruppen sind, vorzugsweise entsprechende Alkanoyloxy-, Alkanoylthio- und Alkanoylaminogruppen, mit der Maßgabe, daß R&sub8; und R&sub9; nicht gleichzeitig Wasserstoff sind,
sowie Salze der Verbindungen der Formel I.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Inhibierung der Freisetzung von Insulin, Glucagon und Wachstumshormonen, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie als pharmazeutischen Wirkstoff wenigstens ein erfindungsgemäßes cyclisches Hexapeptid der Formel I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz solcher Verbindung der Formel I enthält.
Die cyclischen Hexapeptide der Formel I haben Somatostatinaktivität und entsprechend umfaßt die Formel I entsprechende cyclische Hexapeptide, die die Freisetzung von Glucagon, Wachstumshormonen und Insulin inhibieren, wie auch die Freisetzung von Magensäure. Im einzelnen können die Verbindungen in erster Linie die Freisetzung von Wachstumshormonen inhibieren, ohne das Ausmaß der Magensekretion zu beeinflussen oder ohne das Ausmaß der Sekretion von Magensäure, Insulin und Glucagon zu beeinflussen, oder aber die Verbindungen können die Freisetzung von Magensäure inhibieren.
Dementsprechend haben die Verbindungen eine selektivere biologische Wirksamkeit als Somatostatin. Die cyclische Hexapeptidstruktur der erfindungsgemäßen Verbindungen gibt auch eine längere Wirksamkeitsdauer als bei Somatostatin.
Wegen dieser Wirksamkeit können die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die die entsprechenden Hexapeptide als Wirkstoff enthalten, geeignet für die Behandlung von Akromegalie, Diabetes, diabetischer Retinopathie und Magengeschwüren sein.
In den Verbindungen der Formel I umfassen die Alkylgruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen entsprechende geradkettige oder verzweigte Ketten, wobei Beispiele solcher Alkylgruppen Methyl, Ethyl, Propyl, iso-Propyl, Butyl, sec-Butyl und Pentyl sind.
Der Begriff "Alkoxy mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen" schließt geradkettige und verzweigte Alkoxygruppen ein, wobei Beispiele solcher Alkoxygruppen Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy, Butoxy, tert-Butyloxy und Pentoxy sind.
Der Begriff "5- oder 6-gliedriger heterocyclischer Ring" soll solche 5- und 6-gliedrigen Heterocyclen mit 1 oder 2 Heteroatomen einschließen, die aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel ausgewählt sind. Beispielhaft für solche Heterocyclen sind Imidazol, Furan, Diazol, Pyrazol, Pyridin.
In den Verbindungen der Formel I gibt es verschiedene Asymmetriezentren, die alle zur Existenz von optischen Isomeren solcher Verbindungen führen. Erfindungsgemäß sollen für jedes der asymmetrischen Zentren der verschiedenen Aminosäuren, die die erfindungsgemäßen cyclischen Hexapeptide ausmachen, sowohl die D- als auch die L-Konfiguration einbezogen sein.
Der Fachmann wird erkennen, daß wenn R&sub1; und R&sub2; Benzyl sind, R&sub3; Indolylmethyl ist, R&sub4; 1-Hydroxyethyl ist, R&sub5; und R&sub6; Wasserstoff sind und R&sub7; CH&sub2;- CH&sub2;-CH&sub2;CH&sub2;NH&sub2; ist, die 7-, 8-, 9-, 10- und 11-Aminosäuren von Somatostatin (-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-) repräsentiert sind und die sekundäre Aminosäure, wiedergegeben von Hydroxyprolin, wenn Z Methylen ist, R&sub8; Wasserstoff ist und R&sub9; Hydroxy ist, den Platz der verbleibenden Somatostatinaminosäuren eingenommen hat. Somit wird bei Verwendung der vorstehenden Definitionen der substituierenden Gruppen das folgende repräsentative cyclische Hexapeptidanalogon von Somatostatin in Struktur I gebildet:
Die bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen cyclischen Hexapeptide werden in der vorgenannten Strukturformel I realisiert, worin Z (CH&sub2;)n ist und n 1 oder 2 ist,
R&sub1; und R&sub2; wie vorstehend definiert sind,
R&sub3; 3-Indolylmethyl oder substituiertes Indolylmethyl ist, worin der Substituent Methoxy oder Fluor ist,
R&sub4; Methyl, Ethyl, Hydroxymethyl oder Hydroxyethyl ist,
R&sub5; und R&sub6; Wasserstoff sind,
R&sub7; CH&sub2;-CH&sub2;-CH&sub2;CH&sub2;NH&sub2; ist,
R&sub8; Wasserstoff ist und
R&sub9; Hydroxy oder Acetoxy ist.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen sind realisiert, wenn Z Methylen ist,
R&sub1; und R&sub2; wie vorstehend definiert sind,
R&sub3; 3-Indolylmethyl ist,
R&sub4; Hydroxyethyl ist und
R&sub5; und R&sub6; Wasserstoff sind,
R&sub7; -CH&sub2;CH&sub2;-CH&sub2;CH&sub2;NH&sub2; ist,
R&sub8; Wasserstoff ist und
R&sub9; Hydroxy oder Acetoxy ist.
Die bevorzugten Gruppen R&sub1; und R&sub2; sind Niederalkyl, Benzyl oder substituiertes Benzyl, worin der Substituent Niederalkyl, Halogen, Hydroxy, Amino, Nitro oder Alkoxy ist.
In diese bevorzugten Verbindungen einbezogen sind
Cyclo-(Pro(γ-cis-OH)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe)
Cyclo-(Pro(γ-cis-OH)-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe)
Cyclo-(Pro(γ-cis-OH)-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe)
Cyclo-(Pro(γ-cis-OH)-Phe-L-Trp-Lys-Thr-Phe)
Cyclo-(Pro(γ-cis-OH)-Pbe-D-Trp-Lys-Thr-p-Cl-Phe)
Cyclo-(Pro(γ-cis-OH)-Phe-D-5-F-Trp-Lys-Thr-Phe)
Cyclo-(Pro(γ-cis-OH)-Pbe-L-5-F-Trp-Lys-Thr-Phe)
Cyclo-(Pro(γ-cis-OH)-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe)
Cyclo-(Pro(γ-cis-OH)-His-D-Trp-Lys-Ser-Phe)
Cyclo-(Pro(γ-cis-OH)-Phe-D-5-F-Trp-AChxAla-Thr-Phe
Cyclo-(Pro(γ-cis-OAc)-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe)
Cyclo-(Pro(γ-cis-OAc)-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Pbe)
Cyclo-(Pro(γ-cis-OAc)-Phe-L-Trp-Lys-Thr-Pbe)
Cyclo-(Pro(γ-cis-OAc)-Phe-D-Trp-Lys-Tbr-p-Cl-Phe)
Cyclo-(Pro(γ-cis-OAc)-Phe-D-5-F-Trp-Lys-Thr-Phe)
Cyclo-(Pro(γ-cis-OAc)-Phe-L-5-F-Trp-Lys-Thr-Pbe)
Cyclo-(Pro(γ-cis-OAc)-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe)
Cyclo-(Pro(γ-t-OH)-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe)
Cyclo-(Pro(γ-t-OH)-Phe-L-Trp-Lys-Thr-Phe)
Cyclo-(Pro(γ-t-OAc)-Pbe-D-Trp-Lys-Tbr-Phe)
Cyclo-(Pro(γ-t-OAc)-Phe-L-Trp-Lys-Thr-Phe)
In der Anmeldung werden mehrere abgekürzte Bezeichnungen für die Aminosäurekomponenten, bestimmte bevorzugte Schutzgruppen, Reagentien und Lösungsmittel verwandt. Die Bedeutungen solcher abgekürzter Bezeichnungen sind in Tabelle I angegeben. Tabelle I abgekürzte Bezeichnung Aminosäure L-Lysin L-Phenylalanin L-Tryptophan D-Tryptophan L-Threonin L-Tyrosin L-Valin L-Serin L-Asparagin L-Prolin L-Cystein Aminocyclohexylalanin Aminomethylphenylalanin trans-Hydroxyprolin(hydroxyprolin) cis-Hydroxyprolin(Allohydroxyprolin) Schutzgruppen Isonicotinyloxycarbonyl tert-Butyloxycarbonyl Methylester tert-Butyl Benzyloxycarbonyl Benzyl 2-Chlorbenzyloxycarbonyl Acetamidomethyl Methyl Acetat Tosyl abgekürzte Bezeichnung Aktivierungsgruppen p-Nitrophenylester N-Hydroxysuccinimidester 1-Hydroxybenzotriazol Kondensierungsmittel Dicyclohexylcarbodiimid Reagentien Trifluoressigsäure Triethylamin Diisopropylethylamin Dimethylaminopyridin Lösungsmittel Ethylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser Butanol-Essigsäure-Wasser Chloroform-Methanol-Wasser Dimethylformamid Tetrahydrofuran
Erfindungsgemäß werden die neuen cyclischen Hexapeptid-Somatostatinanaloga durch Cyclisierung entsprechender linearer Peptide hergestellt. Die linearen Peptide werden unter Verwendung der sequentiellen Festphasen-Synthesetechnik erzeugt. Entsprechend umfaßt das Verfahren zur Herstellung der cyclischen Hexapeptid-Somatostatinanaloga gemäß der Erfindung a) die Herstellung eines entsprechenden blockierten linearen Peptids, das an ein Festphasenharz gebunden ist, b) das selektive Blockieren der N-terminalen Aminogruppe, c) das Entfernen des linearen Peptids vom Harz, d) das Behandeln des linearen Peptids mit einem Cyclisierungsmittel unter Erhalt des cyclischen Hexapeptids durch Bildung einer Amidbindung und e) das Entfernen etwaiger Seitenketten-Blockierungsgruppen.
Wenn das lineare Peptid am Harz hergestellt wird, ist es im allgemeinen nicht kritisch, welche Aminosäure für die C-terminale Position ausgewählt wird, vorausgesetzt nur, daß die Aminosäurensequenz im linearen Peptid der im erwünschten Somatostatinanalogon entspricht. Sobald ein lineares Peptid cyclisiert wurde, kann man nicht länger bestimmen, welche Aminosäure am C-Ende des linearen Peptids vorgelegen hat.
Obwohl im allgemeinen die Auswahl der ersten Aminosäure zum Start der Kette nicht kritisch ist, da das lineare Peptid cyclisiert wird, können andere Faktoren vorliegen, die eine Ausgangsaminosäure gegenüber anderen mit Vorzügen versehen. Beispielsweise kann D-Trp mit t-Butylcarboniumionen reagieren, die gebildet werden, wenn BOC-Gruppen entfernt werden. Somit führt die Auswahl einer Reaktionssequenz, die D-Trp an das N-terminale Ende des linearen Peptids setzt, dazu, daß D-Trp zuletzt hinzugefügt wird und folglich den geringsten Kontakt mit t-Butylcarboniumionen hat. Diese Art von Auswahl mag nicht immer möglich sein, so wenn zwei indolhaltige Einheiten im Peptid vorhanden sind. Jedoch sollten solche Reaktionsempfindlichkeiten bei der Planung einer Peptidreaktionssequenz berücksichtigt werden.
Die Synthese von linearen Peptiden durch die Festphasentechnik wird in schrittweiser Manier auf chlormethyliertem Harz durchgeführt. Das Harz ist aus feinen Perlen (20 bis 70 um im Durchmesser) aus einem synthetischen Harz zusammengesetzt, das durch Copolymerisation von Styrol mit 1 bis 2 % Divinylbenzol hergestellt wurde. Die Benzolringe im Harz werden in einer Friedel- Crafts-Reaktion mit Chlormethylmethylether und Zinn-IV-chlorid chlormethyliert. Die Friedel-Crafts-Reaktion wird fortgesetzt, bis das Harz 0,5 bis 5 mMol Chlor pro Gramm Harz enthält.
Die als C-terminale Aminosäure des linearen Peptids ausgewählte Aminosäure wird in ihr aminogeschütztes Derivat umgewandelt. Die Carboxylgruppe der ausgewählten C-terminalen Aminosäure wird kovalent an das unlösliche polymere Trägerharz gebunden, beispielsweise als Carbonsäureester des harzgebundenen Benzylchlorids, das im chlormethylsubstituierten Polystyrol-Divinylbenzolharz vorhanden ist. Nach Entfernung der Aminoschutzgruppe wird das aminogeschützte Derivat der nächsten Aminosäure in der Sequenz zusammen mit einem Kupplungsmittel, etwa Dicyclohexylcarbodiimid, hinzugefügt. Das Aminosäurenreagens kann in Form einer carboxylaktivierten Aminosäure, etwa einem ONp-Ester, einem Aminosäureazid und dergleichen, eingesetzt werden. Die Abspaltung der Schutzgruppe und Zugabe folgender Aminosäuren wird durchgeführt, bis das erwünschte lineare Peptid gebildet ist.
Die Auswahl von Schutzgruppen ist einerseits von den jeweiligen Kupplungsbedingungen diktiert, andererseits von den an der Reaktion beteiligten Aminosäure- und Peptidkomponenten.
Gewöhnlich verwandte Aminoschutzgruppen schließen solche ein, die auf dem Gebiet bekannt sind, beispielsweise Urethan-Schutzsubstituenten, wie Benzyloxycarbonyl (Carbobenzoxy), p-Methoxycarbobenzoxy, p-Nitrocarbobenzoxy, t-Butyloxycarbonyl und dergleichen. Es ist bevorzugt, t-Butyloxycarbonyl (BOC) einzusetzen, um die α-Aminogruppe in den die Reaktion am Carboxylende der Aminosäure eingehenden Aminosäuren zu schützen. Die BOC- Schutzgruppe wird im Anschluß an solche Kupplungsreaktion und vor dem anschließenden Schritt durch relativ milde Einwirkung von Säuren (das heißt Trifluoressigsäure oder Chlorwasserstoffsäure in Ethylacetat) einfach entfernt.
Die OH-Gruppe von Thr und Ser kann durch die Bzl-Gruppe geschützt werden und die &epsi;-Aminogruppe von Lys durch die INOC- Gruppe oder die 2-Chlorbenzyloxycarbonylgruppe (2-Cl-CBZ). Im Fall von Lys ist es bevorzugt, die &epsi;-Aminogruppe mit der 2-Cl- CBZ-Gruppe zu schützen, da diese Gruppe zusammen mit den Bzl- Gruppen durch Behandlung mit HF nach der Cyclisierung des linearen Peptids entfernt wird. Die INOC-Gruppe wird durch HF nicht entfernt und benötigt eine zusätzliche Behandlung mit Zn. Keine der Gruppen wird durch TFA, das zur Entfernung der BOC-Schutzgruppen verwandt wird, angegriffen. Nach der Cycliisierung des linearen Peptids werden die Schutzgruppen, etwa 2-Cl-CBZ und Bzl, durch Behandlung mit HF entfernt.
Nach Bildung des linearen Peptids auf dem Festphasenharz kann es mit einer Anzahl von Methoden vom Harz entfernt werden, die dem Fachmann wohl bekannt sind. Beispielsweise kann das Peptid vom Harz mit Hydrazin abgespalten werden und so direkt das Peptidhydrazid bilden, das anschließend über das Azid zum erwünschten cyclischen Peptid cyclisiert werden kann. Das Hydrazid wird durch Reaktion mit einem Reagens in das entsprechende Azid überführt, das salpetrige Säure in situ ergibt. Geeignete Reagentien für diesen Zweck schließen Niederalkylnitrite (beispielsweise t-Butylnitrit, Isoamylnitrit) oder ein Alkalimetallnitritsalz (beispielsweise Natriumnitrit, Kaliumnitrit) in Gegenwart einer starken Säure, wie Chlorwasserstoff-, Phosphorsäure etc., ein. Diese Reaktion wird in Gegenwart von entweder Wasser und/oder einem nicht wässrigen Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Tetrahydrofuran, Dioxan, Chloroform, Methylenchlorid, etc., bei einer Temperatur zwischen etwa -40ºC und +20ºC durchgeführt. Alternativ kann das Peptid vom Harz durch Behandlung mit einem niederen Alkohol, wie Methanol, in Gegenwart einer organischen Base, wie Triethylamin, entfernt werden, was zur Bildung des entsprechenden Esters des niederen Alkohols des linearen Peptids führt. Der resultierende Ester kann in das Hydrazid überführt werden, das dann über das Azid zum erwünschten cyclischen Peptid cyclisiert werden kann. Die bevorzugte Methode zur Abspaltung des Peptids vom Harz gemäß der Erfindung ist die Verwendung von Hydrazin.
Diese Verbindungen, worin R&sub8; und R&sub9; Niederalkanoyloxy ist, werden aus der Verbindung hergestellt, in der diese Gruppe Hydroxy ist, in dem die Hydroxylgruppe acyliert wird. Im allgemeinen ist die Niederalkanoyloxygruppe anfangs am Aminosäurereagens nicht vorhanden, um die Entfernung dieser Gruppe durch Hydrolyse zu vermeiden. Das Hydroxy an der Hydroxyprolinaminosäure ist ausreichend unreaktiv, so daß dort im allgemeinen kein Bedarf besteht, diese Gruppe während der Herstellung des linearen Peptids und dessen Cyclisierung zu schützen. Die beste Zeit zur Herstellung der acylierten Hydroxyprolinverbindung ist nach der Cyclisierung des linearen Peptids und vor der Entfernung der Schutzgruppen.
Die Acylierung wird in gewöhnlichen Acylierungsmedien, wie Niederalkanoylanhydrid, vorzugsweise Essigsäureanhydrid, und mit einem basischen Katalysator, wie tertiärem oder aromatischem Amin, durchgeführt. Im allgemeinen sind Trialkylamine und Pyridin zufriedenstellend, jedoch ist Dimethylaminopyridin bevorzugt. Die Reaktion wird im allgemeinen bei etwa 0 bis 50ºC über 30 Minuten bis 24 Stunden durchgeführt, vorzugsweise bei Raumtemperatur über etwa eine Stunde. Ein Überschuß an Anhydrid oder Acylierungsmittel kann verwandt werden, so daß kein separates Lösungsmittel benötigt wird, jedoch wird im allgemeinen ein inertes Lösungsmittel, wie ein chlorierter Kohlenwasserstoff, verwandt. Das Produkt wird unter Verwendung bekannter Techniken gewonnen. Es ist beabsichtigt, alle strukturellen und optischen Isomere in die Erfindung einzubeziehen, weil solche Verbindungen unter Verwendung des strukturell oder optisch reinen Isomers der Ausgangsaminosäure hergestellt werden können. In einem besonderen Fall ist die cis-Hydroxyprolinverbindung als optisch reines Ausgangsmaterial cis- oder Allohydroxyprolin verfügbar. Jedoch ist diese Verbindung sehr teuer, und es wurde entdeckt, daß eine Variante der vorstehenden Acylierungstechnik die reinen cis-Hydroxy- und Alkanoyloxyprolinverbindungen aus der entsprechenden trans-Verbindung ergibt. Unter den Verwendung des cyclisierten und geschützten Peptids, wie im Acylierungsverfahren, wird das Hydroxy des Hydroxyprolins mit Tosylchlorid zur Herstellung des Tosylatderivats behandelt. Die Reaktion wird unter Verwendung der gleichen Reaktionsbedingungen durchgeführt, wie bei der vorstehenden Acylierungsreaktion. Das Tosylat wird dann mit einem acylierenden Caesiumreagens, etwa Caesiumacetat, in einem Lösungsmittel, wie N,N-Dimethylformamid, bei 25 bis 100ºC über 1 bis 30 Stunden umgesetzt. Die Reaktion invertiert die Struktur am die Acylgruppe aufweisenden Kohlenstoff, wenn das Tosylat ersetzt wird. Die Reaktion ergibt das cis-Niederalkanoylderivat wie auch die cis-Hydroxyverbindung. Die Produkte werden unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Techniken getrennt und isoliert.
Wie die Referenztabelle II zeigt, beinhaltet ein bevorzugtes Gesamtverfahren zur Herstellung der erwünschten cyclischen Peptide der Erfindung die schrittweise Synthese des linearen Peptids an einem Festphasenharz. Genauer gesagt, wird in dem Verfahren zur Herstellung von
das Carboxylende der N-blockierten Aminosäure Threonin kovalent an einen unlöslichen polymeren Harzträger als Carbonsäureester von harzgebundenem Benzylchlorid gebunden. Die Aminogruppe von Thr wird durch die BOC-Gruppe geschützt und das OH des Thr mit einer Benzylgruppe. Nach Beendigung der Anheftung des (BOC)Thr(BZL) an das Harz wird die BOC-Schutzgruppe durch Behandlung mit TFA in CH&sub2;Cl&sub2; entfernt. Die folgenden Aminosäuren werden in Form der BOC-Aminosäure unter Verwendung von DCCI als Kondensationsmittel oder eines aktiven Esters, wie ONp, angefügt. Nach Herstellung des erwünschten linearen Peptids wird die N-terminale Aminogruppe selektiv deblockiert und das Peptid vom Harz durch Behandlung mit Hydrazin entfernt. Das resultierende lineare Peptidhydrazid mit der deblockierten N-terminalen Aininogruppe und der Aminosäurensequenz
wird mit Isoamylnitrit unter sauren PH-Bedingungen unter Bildung des entsprechenden Azids behandelt. Die Azidlösung wird mit Lösungsmittel verdünnt und mit einer organischen Base neutralisiert. Das lineare Peptid cyclisiert unter Bildung von
Während der Cyclisierung wird der "pH"-Wert geprüft und durch Zugabe von organischer Base neutral gehalten. Der "pH"-Wert im organischen Lösungsmittel wird durch Anwendung eines Aliquots der Lösung auf angefeuchtetes pH-Papier enger Bandbreite bestimmt.
Nach Cyclisierung des linearen Peptids werden die Schutzgruppen, 2-Cl-CBZ und OBzl, durch Behandlung mit HF in Gegenwart von Anisol entfernt. Das erhaltene rohe cyclische Peptid wird chromatographisch gereinigt, vorzugsweise durch Säulenchromatographie an Kieselgel. Das Lösungsmittel zur Elution ist im allgemeinen ein organisches Lösungsmittel oder eine solche Mischung, das durch Analyse von aliquoten Teilen des Materials unter Verwendung von Dünnschichtchromatographie ausgewählt wird. TABELLE II Reaktionsschema zur Herstellung von: Festphasenmethode Isoamylnitrit DMF/Triethylamin HF/Anisol
Die folgenden Beispiele sollen die zur Durchführung der Erfindung verwandten Verfahren erläutern. Es versteht sich, daß diese Beispiele nur zum Zweck der Erläuterung gegeben werden und nicht beschränken sollen.

Beispiel 1

Herstellung von Phe-Pro(γ-t-OH)-Phe-D-Trp-Lys(&epsi;-2-Cl-CBZ)- Thr(BZl)-OCH&sub2; ∅-Harz

Chlormethylharz (2 % vernetztes Merrifield-Harz), 862,0 g (2,37 Mol) mit 2,75 mÄq. Chlor/g, und 732,3 g (2,37 Mol, 1 Äquivalent) BOC-Thr(Bzl) wurden in 4320 ml peroxidfreies Tetrahydrofuran gegeben. Die Mischung wurde im Ölbad bei 80ºC Badtemperatur 45 Minuten gerührt. 310,0 ml Triethylamin wurden hinzugefügt und die Mischung bei 80ºC Badtemperatur 70 Stunden gerührt, auf 25ºC abgekühlt und in eine gerührte Festphasenreaktionssäule mit 2000 ml Tetrahydrofuran transferiert. Nach Entfernung des Lösungsmittels wurde das Harz gewaschen, wobei die gerührte Kolonne zusammen mit
3 x 2000 ml Tetrahydrofuran
4 x 5170 ml Ethanol
1 x 5170 ml Essigsäure
3 x 5170 ml Wasser
3 x 5710 ml Methanol
3 x 5170 ml Chloroform
verwandt wurde. Das BOC-Thr-(Bzl)-O-CH&sub2; ∅-Harz wurde im Vakuum bei 25ºC 16 Stunden getrocknet, wobei 1203 g BOC-Thr- (Bzl)-O-CH&sub2; ∅-Harz mit 1,2 mMol Threonin/g Harz erhalten wurde.
BOC-Thr(Bzl)-O-CH&sub2; ∅-Harz (2,13 g, 2,0 mMol) wurde durch die Verfahren in den Tabellen III und IV unter Verwendung von zwei Schutzgruppenabspaltungen (2 Minuten und 25 Minuten) mit 25 % TFA in Methylenchlorid und 2,5 Äquivalenten BOC-Aminosäure in der dazu nötigen Sequenz geführt, bis das erwünschte BOC-Hexapeptid-O-CH&sub2; ∅-Harz erhalten wurde.
DCCI wurde als alleiniges Kupplungsmittel in jedem Schritt verwandt.
Die Kupplung einer jeden Aminosäure verlief glatt. Die besten Ausbeuten wurden erzielt, wenn die Kupplung in jedem Schritt wiederholt wurde. Wenn die Kupplung wiederholt wurde, wurden die anfänglichen beiden Wäschen mit Chloroform, der Deblockierungsschritt und die anschließenden drei Wäschen mit Chloroform alle ausgelassen und durch eine einzige Chloroformwäsche ersetzt.
Die Kupplungsreaktionen wurden in Methylenchlorid, frisch entgastem DMF oder einer Mischung dieser beiden Lösungsmittel durchgeführt. Die N-terminale Aminogruppe wurde in jedem Fall mit einer BOC-Gruppe blockiert; die Hydroxygruppe des Thr wurde mit Bzl blockiert und die &epsi;-Aminogruppe von Lys mit 2-Cl-CBZ.
Nachdem das erwünschte BOC-Hexapeptid-O-CH&sub2; ∅-Harz erhalten worden war, wurde die N-terminale BOC-Gruppe durch die in Tabelle V angeführte terminale Deblockierungsprozedur entfernt. TABELLE III Lösungsmittel oder Reagens (Zahl der Behandlungen oder Wäschen) Vol. in ml Zeit in Min. DMF oder eine Mischung von beiden Kupplung TABELLE IV geschützte Aminosäure Lösungsmittel ml Kupplung TABELLE V Terminales Deblockierungsprogramm Lösungsmittel oder Reagens (Zahl der Behandlungen oder Wäschen) Vol. in ml Zeit in Minuten Ethandithiol
Nach Beendigung der Prozeduren der Tabellen III, IV und V wurde das blockierte Hexapeptid-OCH&sub2;∅-Harz über Nacht getrocknet und ergab 3,5 g.

Beispiel 2

Herstellung von Phe-Pro-(γ-t-OH)Phe-D-Trp-Lys(&epsi;-2-Cl-CBZ)- Thr(Bzl)-NHNH&sub2;

Das Harz aus Beispiel 1 wird mit 30 ml einer 2:1-Mischung von Methanol und Hydrazin vereinigt und 0,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das unlösliche Harz wird durch Filtration abgetrennt und die Lösung zur Entfernung von Methanol und Hydrazin eingedampft. Der Rückstand wird mit Wasser trituriert, filtriert und über Nacht zur Entfernung aller flüchtigen Bestandteile in ein Hochvakuum gestellt. Aus der Auflösung des Rückstands in Methanol, dem Filtrieren und dem Eindampfen zur Trockne resultierte ein Schaum, 2,0 g.

Beispiel 3

Herstellung von Phe-Pro-(γ-t-OH)Phe-D-Trp-Lys(&epsi;-2-Cl-CBZ)- Thr(Bzl)-N&sub3;

Der Feststoff aus Beispiel 2 wird mit 15 ml entgastem Dimethylformamid unter einem Stickstoffkissen vereinigt und auf -10ºC abgekühlt, wonach 5 Äquivalente 5,8 M Salzsäure in Tetrahydrofuran (1,7 ml) zugegeben werden. Die Lösung wird auf -25ºC abgekühlt und mit einer 1:19-Mischung von Isoamylnitrit in Dimethylformamid versetzt. Der Fortschritt der Reaktion wird dünnschichtchromatographisch verfolgt wie auch das Verschwinden des Hydrazid-Ausgangsmaterials.

Beispiel 4

Herstellung von Cyclo(Phe-Pro-(γ-t-OH)Phe-D-Trp-Lys-(&epsi;-2-Cl- CBZ)-Thr(Bzl)

Die Azidverbindung aus Beispiel 3 wird zu 600 ml entgastem Dimethylformamid gegeben, auf -25ºC vorgekühlt, der pH-Wert auf 8 eingestellt und die Reaktionsmischung über Nacht in den Tiefkühlschrank gestellt. Der pH-Wert wird erneut auf 8 eingestellt, falls nach etwa 14 Stunden notwendig, und die Mischung 16 Stunden bei -20ºC und 16 Stunden bei 5ºC aufbewahrt. Die Dünnschichtchromatographie zeigt an, daß die Reaktion beendet ist. Die Mischung wird zur Trockne konzentriert, in 150 ml einer 3:1-Dimethylformamid/Wasser-Mischung gelöst und 2 Stunden mit einem Anionen-Kationen-Austauscherharz im Mischbett behandelt. Die Mischung wird filtriert und im Vakuum zur Trockne konzentriert und der Rückstand mit Wasser unter Erhalt von 2,1 g Produkt trituriert. Dieses Produkt wurde durch Chromatographie an Kieselgel unter Verwendung von 96:4 Chloroform/Methanol zur Elution des Produkts chromatographiert. Die Vereinigung der Fraktionen mit reinem Produkt ergab 1,67 g Produkt.

Beispiel 5

Herstellung von Cyclo (D-Trp-Lys-Thr-Phe-Pro-(γ-t-OH)Phe)

2,13 g (2 mMol) des geschützten Hexapeptids aus Beispiel 4 wird in einer teflonausgekleideten Kammer mit 2 ml Anisol vereinigt. Die Kammer wird dann evakuiert und bei der Temperatur des Trockeneis/Acetonbads mit flüssigem Fluorwasserstoff gefüllt. Die Temperatur wird auf 0ºC erhöht, und es wird eine weitere Stunde gerührt. Der Fluorwasserstoff wird abdampfen gelassen und der Rückstand ins Vakuum gegeben, bis eine Aufschlämmung gebildet ist. Die Aufschlämmung wird mit Ethylacetat behandelt und filtriert und ergibt 1,19 g feines Pulver. 360 mg dieses Pulvers wurden durch Chromatographie an Sephadex G-25-F unter Verwendung von 2N Essigsäure als Elutionsmittel und an Kieselgel unter Verwendung der Lösungsmittelmischung Chloroform/Methanol/konzentrierter Ammoniumhydroxid 80:20:2 als Elutionsmittel gereinigt. Reines Produkt enthaltende Fraktionen wurden eingedampft und aus verdünnter Essigsäure unter Erhalt von 0,18 g Produkt gefriergetrocknet.

Beispiel 6

Cyclo[Phe-Pro(γ-t-OAC)-Phe-D-Trp-Lys(2-Cl-CBZ)-Thr-(Bzl)]

Zu einer Lösung von Cyclo[Phe-Pro(γ-t-OH)-Phe-D-Trp-Lys(2- Cl-CBZ)-Thr(Bzl)] (299 mg) in 4 ml CH&sub2;Cl&sub2; wurden 120 mg Dimethylaminopyridin (DMAP) und 0,5 ml Essigsäureanhydrid gegeben. Nach einer Stunde bei 25ºC wurden 10 ml CH&sub2;Cl&sub2; hinzugefügt, und die Lösung wurde mit zwei Portionen 10 %igem Natriumbicarbonat extrahiert. Die organische Schicht wurde mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel wurde abgedampft. Der Rückstand wurde mit kaltem Wasser trituriert und über Kaliumhydroxid unter Erhalt von 282 mg Cyclo[Phe-Pro(γ-t-OAC)-Phe-D-Trp-Lys(2-Cl-CBZ)-Thr(Bzl)] getrocknet. Das Produkt war 90 % rein, gemessen durch HPLC.
Zu einer Mischung des Produkts aus Beispiel 6 (255 mg) und Anisol (1 ml) wurden bei -40ºC 10 bis 15 ml HF gegeben und die Lösung wurde 25 Minuten bei -10ºC gehalten. Das HF wurde im Vakuum abgedampft und der Rückstand mit Ethylacetat/Petrolether (4:1) trituriert.
Der Feststoff wurde abfiltriert und im Vakuum über Kaliumhydroxidpellets unter Erhalt von 0,17 g Rohprodukt getrocknet. Chromatographie an Kieselgel 60 (230 bis 400 mesh) (35 g) unter Verwendung von Chloroform/Methanol/konzentriertem Ammoniumhydroxid als Lösungsmittelmischung (80/20/2) zur Elution resultierte in der Isolation von reinem Produkt (77 mg) und Produkt mit geringen Verunreinigungen (46 mg). Das Produkt war zu 97 % rein, gemessen durch HPLC, und zeigte Rf 0,25 und 0,45 in Chloroform/Methanol/konzentriertem Ammoniumhydroxid (80/20/2 bzw. 70/30/3).

Beispiel 7

Cyclo[Phe-Pro(γ-t-OTs)-Phe-D-Trp-Lys(2-Cl-CBZ)-Thr-(Bzl)]

Eine Mischung aus Cyclo[Phe-Pro(γ-t-OH)-Phe-D-Trp-Lys(2-Cl- CBZ)-Thr(Bzl)] (507 mg), Dimethylaminopyridin (153 mg) und Tosylchlorid (146 mg) in Methylenchlorid (3 ml) wurde 20 Stunden bei 25ºC gehalten. Methylenchlorid (20 ml) wurde hinzugefügt und die Lösung mit wässrigem Natriumcarbonat (1 x) extrahiert, wonach die organische Schicht mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet wurde. Verdampfen des Lösungsmittels ergab 0,63 g rohes Produkt, das unter Verwendung von 150 g Kieselgel 60 (230 bis 400 mesh) und Chloroform/Isopropanol (95/5) als Lösungsmittelmischung chromatographiert wurde. Die Vereinigung der Fraktionen, die Produkt mit einem Rf von 0,45 (95/5) enthielten, ergab 370 mg Produkt (98 % rein nach HPLC) und 150 mg Produkt aus Seitenfraktionen.

Beispiel 8

Cyclo[Phe-Pro(γ-cis-OAc)-Phe-D-Trp-Lys(2-Cl-CBZ)-Thr-(Bzl)]

Eine Lösung des Produkts aus Beispiel 7 (360 mg) und Caesiumacetat (375 mg) in 2,5 ml N,N-Dimethylformamid wurde 7 Stunden bei 50ºC gehalten. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand mit kaltem Wasser unter Erhalt von 329 mg Produkt trituriert. Die Dünnschichtchromatographie zeigte, daß das Produkt etwas polarer war, als das trans-Isomer, gemessen durch DSC in CHCl&sub3;/i-PrOH.

Beispiel 9

Cyclo(Phe-Pro(γ-cis-OAc)-Phe-D-Trp-Lys-Thr) und Cyclo(Phe-Pro(γ-cis-OH)-Phe-D-Trp-Lys-Thr)

Das blockierte Produkt aus Beispiel 8 wurde mit HF unter Verwendung von 1,2 ml Anisol und 10 bis 15 ml HF behandelt, wie zuvor beschrieben. Das rohe Produkt war eine Mischung von cis- Hydroxy- und cis-Acetoxyverbindung (Rf 0,25 und 0,45, CHCl&sub3;- MeOH-konzentriertes NH&sub4;OH; 70-30-3), die chromatograpisch unter Verwendung von Kieselgel 60 (230 bis 400 mesh) und Chloroform-Methanol-konzentriertem Ammoniumhydroxid (75-25-2,5) getrennt wurden. Die cis-Acetoxy-Produkte (120 mg) und das cis- Hydroxy-Produkt (30 mg) wurden mit einer Reinheit von 90 % und 94 %, gemessen durch HPLC, isoliert.
Nach dem vorstehenden Verfahren und nach Modifizierung der Auswahl und Reihenfolge der Aminosäuren im Verfahren von Beispiel 1 wurden andere cyclische Hexapeptide der Erfindung hergestellt, etwa Cyclo(Phe-Pro(γ-t-OH)Phe-Trp-Lys-Thr).
Analoga von Somatostatin wurden mit Somatostatin bezüglich ihrer Fähigkeit verglichen, um die Glucagon- und Insulinspiegel in den Portalvenen anästhesierter Ratten zu vermindern. Männliche Sprague-Dawley-Ratten (Charles River CD) mit einem Gewicht von 160 bis 200 g wurden mit Urethan (150 mg/100 g Körpergewicht; Aldrich) anästhesiert. Kochsalzlösung oder Peptide wurden über die externe Jugularvene verabreicht. Nach 5 Minuten wurde die Portalvene freigelegt und Blut mittels einer 3 mg EDTA enthaltenden Spritze entnommen und in gekühlte Röhrchen mit 100 ul Trasylol (FBA Pharmaceuticals) für die anschließende Hormonanalyse gegeben. Die Glucagon-Plasmaspiegel wurden nach dem Verfahren von Faloona und Unger, Methods of Hormone Radioimmunoassay, Jaffe und Behrman (Hrsg.), Academic Press, New York, Band II, S. 257-527 (1976) bestimmt, wobei Glucagonantiseren 30K verwandt wurden, die von R. Unger (Dallas, TX) erhalten worden waren. Die Insulinplasmaspiegel wurden nach einer Modifizierung des Verfahrens von Herbert et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 25, 1375-1384 (1965) bestimmt.
Die Testergebnisse für einige der erfindungsgemäßen Verbindungen sind unten aufgezeichnet, wobei die Ergebnisse für Somatostatin zuerst aufgeführt sind und willkürlich mit dem Wert 1 versehen sind. Die Ergebnisse der erfindungsgemäßen Verbindungen sind als Vielfaches oder Bruchteil der Wirkung von Somatostatin angegeben. Die erste der aufgeführten erfindungsgemäßen Verbindungen ist die in Beispiel 1 bis 5 hergestellte Verbindung. Die Verbindung ist jedoch geringfügig anders wiedergegeben, um der in Somatostatin gefundenen Reihenfolge der Aminosäuren Rechnung zu tragen. Aktivität cyclischer Hexapeptidanaloga von Somatostatin Verbindung Insulin Inhibierung der Freisetzung Glucagon Inhibierung Somatostatin
Aus der Tabelle ist zu ersehen, daß alle getesteten Verbindungen eine sehr hohe Aktivität bei der Inhibierung der Freisetzung von Insulin und Glucagon im Vergleich zu Somatostatin hatten, das heißt ihre Aktivität war das 6-fache bis 95-fache der Aktivität von Somatostatin. Dies war völlig unerwartet, da in dem veröffentlichten europäischen Patent 0 104 348 eng verwandte Verbindungen beschrieben sind, die eine deutlich geringere Aktivität im vorstehenden Test aufwiesen. Im einzelnen wurden in der europäischen Patentanmeldung cyclische Hexapeptide getestet, die eine analoge Struktur zu den in der vorstehenden Tabelle beschriebenen cyclischen Hexapeptiden hatten, worin jedoch das Prolin nicht hydroxy- oder acetoxysubstituiert war, sondern unsubstituiertes Prolin und worin weiterhin das Lysin nicht unsubstituiertes Lysin war, sondern ein Lysin, das in der γ-Stellung und in der δ-Stellung monofluoriert war. Diese fluorsubstituierten cyclischen Hexapeptidanaloga zeigen weniger als die 3-fache Inhibierung, wenn mit Somatostatin verglichen, was die Inhibierung der Freisetzung von Insulin und der Freisetzung von Glucagon anbetrifft.

Claims

1. Verbindung der Formel I

worin

Z (CH&sub2;)n ist und n 1 oder 2 ist;

R&sub1; und R&sub2; unabhängig Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen sind, das gegebenenfalls mit einem 5- oder 6-gliedrigen heterocyclischen Ring, Benzyl, Naphthylmethyl, Indolylmethyl, substituiertem Benzyl, das einen oder zwei Substituenten umfaßt, die aus der aus Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Halogen, Hydroxy, Amino, Nitro und Alkoxy mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen bestehenden Gruppe ausgewählt sind, substituiert ist,

R&sub3; 3-Indolylmethyl, Naphthylmethyl oder substituiertes 3-Indolylmethyl ist, worin der Substituent aus der Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen und Halogen umfassenden Gruppe ausgewählt ist,

R&sub4; Alkyl, Hydroxyalkyl, Carboxyalkyl und Aminoalkyl ist, worin die Gruppen der Alkyleinheiten Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen sind, oder

R&sub4; Benzyl oder substituiertes Benzyl ist, worin der Substituent aus der Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Halogen, Amino und Nitro umfassenden Gruppe ausgew&hlt ist,

R&sub5; und R&sub6; unabhängig Wasserstoff oder Methyl sind,

R&sub7; Aminocyclohexylmethyl, Aminomethylbenzyl oder

ist, worin

Y (CH&sub2;)m mit m 0, 1 oder 2 oder Schwefel ist, so daß der Schwefel in jeder Stellung entlang der Kette sein kann,

R&sub8; und R&sub9; unabhängig Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Heteroalkyl, worin das Heteroatom aus Sauerstoff, Schwefel, Stickstoff ausgewählt ist, Hydroxy, Mercapto, Amino oder eine Alkanoylgruppe mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen wie auch Derivate der Hydroxygruppen, der Mercaptogruppen und der Aminogruppen, vorzugsweise entsprechende Alkanoyloxy-, Alkanoylthio- und Alkanoylaminogruppen sind, mit der Maßgabe, daß R&sub8; und R&sub9; nicht gleichzeitig Wasserstoff sind,

sowie Salze der Verbindungen der Formel I.

2. Verbindung nach Anspruch 1, worin Z, R&sub1; und R&sub2; wie in Anspruch 1 definiert sind,

R&sub3; 3-Indolylmethyl oder substituiertes Indolylmethyl ist, worin der Substituent Methoxy oder Fluor ist;

R&sub4; Methyl, Ethyl, Hydroxymethyl oder Hydroxyethyl ist; und

R&sub5; und R&sub6; Wasserstoff sind;

R&sub7; CH&sub2;CH&sub2;-CH&sub2;CH&sub2;NH&sub2; ist;

R&sub8; Wasserstoff ist; und

R&sub9; Hydroxy oder Acetoxy ist oder Salze dieser Verbindungen.

3. Verbindung nach Anspruch 2, worin

Z CH&sub2; ist;

R&sub3; 3-Indolylmethyl ist;

R&sub4; Hydroxyethyl ist;

R&sub5; und R&sub6; Wasserstoff sind;

R&sub8; Wasserstoff ist; und

R&sub9; Hydroxy oder Acetoxy ist oder Salze dieser Verbindungen.

4. Verfahren zur Herstellung der cyclischen Hexapeptide der Formel I nach Anspruch 1 oder von Salzen der Verbindungen der Formel I, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren einschließt

a) die Herstellung eines entsprechenden blockierten linearen Peptids, angebunden an ein Harz in fester Phase;

b) selektives Abspalten der blockierenden Gruppe von der N- terminalen Aminogruppe;

c) Entfernen des linearen Peptids vom Harz;

d) Behandeln des linearen Peptids mit einem Cyclisierungsmittel unter Bildung der Amidbindung des erwünschten cyclischen Hexapeptids;

e) Entfernen der Seitenketten-Schutzgruppen; und

f) Isolieren der Verbindung der Formel I oder eines Salzes davon.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt c) das lineare Peptid vom Harz mit Hydrazin unter Bildung des Hydrazids des Peptids entfernt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Cyclisierungsschritt durch Behandlung des linearen Peptidhydrazids mit einem Mittel durchgeführt wird, das salpetrige Säure in situ bildet, um das Azid des linearen Peptids herzustellen, und daß das Azid in Gegenwart eines tertiären Amins unter Bildung des erwünschten cyclischen Hexapeptids der Formel I oder eines Salzes davon cyclisiert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Azid des linearen Hexapeptids durch Behandlung des Hydrazids des linearen Hexapeptids mit einem Alkalimetallnitrit oder mit einem Niederalkylnitrit, vorzugsweise Isoamylnitrit, in Gegenwart einer starken Säure, vorzugsweise Salzsäure, gebildet wird.

8. Verfahren zur Inversion des Hydroxyprolinteils eines Peptids von der trans- in die cis-Konfiguration durch Herstellen seines Tosylatderivats, gefolgt von der Behandlung mit einer acylierenden Cäsiumverbindung.

9. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Inhibierung der Freisetzung von Insulin, Glucagon und Wachstumshormon, dadurch gekennzeichnet, daß sie als pharmazeutischen Wirkstoff wenigstens ein cyclisches Hexapeptid der Formel I nach Anspruch 1 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz der Verbindungen der Formel I enthält.

10. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff die Verbindung der Formel I oder ein nicht toxisches Säureadditionssalz der Verbindung der Formel I und vorzugsweise weiterhin einen pharmazeutisch annehmbaren flüssigen oder festen Träger enthält.