CZ1021084A3

CZ1021084A3 - Gonadoliberin derivatives and process for preparing thereof

Info

Publication number: CZ1021084A3
Application number: CS8410210A
Authority: CZ
Inventors: Tamas Ing Guylas; Aniko Dr Horvath; Gyorgy Dr Keri; Karoly Dr Nikolics; Balasz Dr Szoke; Istvan Dr Teplan
Original assignee: Koezponti Valto Hitelbank
Priority date: 1983-12-23
Filing date: 1984-12-21
Publication date: 1994-02-16
Also published as: FI82255B; BE901307A; ATA404284A; NO166449B; DK164875C; DK164875B; NO845193L; FR2557114A1; ZA849985B; DK625084A; GB2152059A; CH664968A5; GB2152059B; ES550009A0; AU3709884A; SU1396970A3; SE469032B; IT8424183A0; IT8424183A1; GB8432495D0

Description

GonaiSoliberinové deriváty a způsob jejich výroby

Oblast techniky

Vynález se týká nových gonadoliberinových derivátů a způsobu jejich výroby

Dosavadní stav techniky

Obecnou vlastností gonadoliberinu /jiná jména známá z literatury: hormon uvolňující gonadotropiny, GnRH, luteionizační a folikuly stimulující hormon, LH/FSH/ a jeho známých derivátů je, že jsou schopny uvolnit luteinizační hormon /LH/ a folikuly stimulující hormon FSH.

Od počátku 80. let je známo z literatury, že gonadoliberin některých ryb a ptáků se strukturálně liší od savčího gonadoliberinu /J.A.King a R.P.Millar, J. Biol. Chem.

257, 10722-28 (1982); South-African Journal of Science 78,

124 (1982); N. Shewood et al., Proč. Nati. Acad. Sci 80, *

ί

2794-2798 /1983)/. Tyto rozdíly byly nalezeny u aminokyselin ΐ v polohách 7 a/nebo 8.

Z literatury je také známo, že tyto deriváty gonadoliberinu, které obsahující v pozici.6 určité D-aminokyseliny místo glycinu, vykazují zvýšenou biologickou účinnost

- 3 ve srovnání s přírodním gonadoliberinem (J. Sandow a kol. Control of Ovulation, Butterworth, London, 1978, str.49-70).

Dále je známo, že substituce glycinámidového zbytku v poloze 10 amidovými skupinami s alifatickým uhlíkovým řetězcem (M. Fujino a kol. J. Med. Chem. J_6, 1144-1147 /1973/ má za následek růst. biologické účinnosti ještě více.

Předložený vynález má za cíl vytvořit nové gonadoliberinové deriváty, které jsou účinně použitelné pro reprodukční proces ryb, ptáků a savců. Kromě toho vynález vytváří další deriváty, které mají zvýšenou biologickou účinnost ve vztahu k přírodním derivátům.

Podstata vynálezu

Podstata vynálezu spočívá v gonadoliberinových derivátech obecného vzorce I

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X₁-Xg-X^-Pro-X^ /1/ ve kterém představuje glycylovou skupinu nebo D-fenylalanin nebo D-tyrosin,

X₂ představuje L-alanýL, L-valyl, L-leucyl, L-isoleucyl, L-fenylanyl nebo L-triptofyl,

- 4 X^ představuje L-alanjl, L-valyl, L-leucyl, L-isoleucyl, L-glutaminyl nebo L-asparaginyl a

X₄ představuje glycin nebo ethylamid, za podmínky, že když X₁ představuje skupinu jinou než glycylovou skupinu a X^ představuje tryptofylovou skupinu, pak X^ nemůže být leucyl, a jejich adičních solíd)s terapeuticky použitelnými kyselinami a jejich komplexech.

Výhodně jsou gonadoliberinové deriváty vybrány ze sku piny zahrnující

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-Gly-NHg

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Gln-Pro-Gly-NHg

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Leu-Pro-EA

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Phe-Gln-Pro-Gly-NHg

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Phe-Leu-Pro-Gly-NHg

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-EA . ,_Glp-His=Trp^Ser.^Tyr.-Gly---Trp-Gl-n-Pr0-SA- - ........

a jejich terapeuticky využitelné soli a komplexy.

- - Dále podstata- vynálezu spočívá 've' žpůšobii výroby gonacoliberinových derivátů obecného vzorce I, který je vyznačen tím, že postupem syntézy peptidu v tuhé fázi se příslušně chráněné aminokyseliny navážnu v požadovaném pořadí na tuhý polymerní nosič pomocí karbodiimidu něho aktivního esteru a v daném případě se hotový peptid odštěpí

- 5 z nosiče acidolýzou nebo aminolýzou a v případě potřeby se současně odstraní z peptidu ochranné skupiny aminokyselin před nebo po odštěpení peptidu z polymerního nosiče.

Výhodně se jako tuhý nosič použije benzhydrylaminová nebo Boc-prolinová pryskyřice. Chráněný peptid se z pryskyřice výhodně eliminuje pomocí hydrogenfluoridu a/nebo ethylaminolýzjíou.

Vynález je založen na poznatku, že změna aminokyselin v polohách 7 a 8 a v molekule gonadoliberinu na .jiné aminokyseliny a určité kombinace.těchto změn vedou k.gonadoliberinovým analogům vhodným pro reprodukci ryb, ptáků a savců.

Dále je vynález založen na poznatku, že účinnost gonadoliberinových derivátů připravených změnou aminokyselin v polohách 7 a 8 může být zvýšena zavedením určitých D-aminokyselin do polohy 6 a alkylamidových skupin do polohy 10 místo glycinu a glycinamidu.

Jestliže je to požadováno, získaný nonapeptidamid nebo dekapeptidamid může být převeden na sůl s kyselinou reakci tohoto amidu s farmaceuticky vhodnou kyselinou nebo je-li třeba, může být volná báze uvolněna z adiční soli s kyselinou pomocí zásady a když je třeba, může být získaný nonapeptidamid nebo dekapeptidamid převeden a na komplex s kovem.

- 6 slohou být také získány farmaceutické směsi obsahující jako aktivní složky sloučeniny obecného vzorce I a jejich soli a komplexy.

Farmaceutické směsi se obvykle připravují smísením alespoň jedné sloučeniny vzorce I nebo farmaceuticky vhodné soli této sloučeniny nebo komplexu této sloučeniny s nosiči a/nebo aditívy, které se běžně používají při výrobě farmaceutických směsí a formulací získaných směsí například ve formě tabletek, dražé, tobolek, supositorií, injekčních roztoků, nasálních sprejů atd.

Gonadoliberinové deriváty vzorce I mohou být účinně použity u rab, ptáků a savců, když se podávají intramuskulárně nebo subkutánně v dávce 0,1 mikrogramů až 5 miligramů.

Hlavní výhodnou sloučenin podle vynálezu je to£ Že nové gonadoliberinové deriváty obecného vzorce I obsahují -kombinace aminokyselin” v-polohách' 7 ‘ar ’3, které”’ jsou' charakteristické pro ryby a ptáky, čímž mohou být také výhodně použity pro reprodukční proces u těchto živočichů.

- 7 Příklady provedení vynálezu

Další podrobnosti vynálezu jsou uvedeny v následujících neomezujících příkladech provedení.

Použitá nomenklatura je identická s nomenklaturou vymezenou v Neuropeptides £, 231-235 (1981).

V příkladech 1 až 5 se sloučeniny syntetizují technikou tuhé fáze (Merrifield, R.B., J.Am.Chem.Soc. 65. 21492151)(1953)) za použití chlormethylované a polystyrendivinylbenzenové pryskyřice v případě peptidalkylamidů nebo benzhydrylaminové pryskyřice v případě peptidamidů. Jednotlivé aminokyseliny jsou navazovány na pryskyřici ve formě jejich N-alfa-terc.butyloxykarbonyl(Boc)derivátů za použití dicyklo4 hexylkarbodiimidu (DCC), N,N’-diisopropylkarbodiimidu (DIC) nebo způsobem aktivního esteru. Reaktivní skupiny postranního řetězce aminokyselin jsou chráněny, když je třeba, vhodnými ochrannými skupinami.

Úplnost vazební reakce se měří ninhydrinovým testem /Kaiser, E., Colescott, R1.L., Bossinger, C.D.,

- 8 Hlavní výhodou sloučenin podle vynálezu je to, že nové gonadoliberihové deriváty obecného vzorce I obsahují kombinace aminokyselin v polohách 7 a 8, které jsou charakteristické pro ryby a ptáky, čímž mohou být také gýhodně použity pro reprodukční proces u těchto živočišných druhů.

Další podrobnosti vynálezu jsou znázorněny pomocí následujících neomezujících příkladů provedení.

V příkladech 1 až 5 se sloučeniny syntetizují) technikou tuhé fáze /Merrifield, R, B., J. Am. Chem.

Soc. 85, 2149-2151 /1953/ za použití chlormethylované polystyrendivinylbenzenové pryskyřide v případě peptidalkylamidů nebo benzhydrylaminové pryskyřice v případě ^i;lpeptidamidů. Jednotlivé aminokyseliny jsou navazovány na pryskyřici ve formě jejich N-alfa-terc.butyloxykarbonyl /Boc/ derivátů za použití dicyklohexylkarbodiimidu /DCC/, ří,N’-ďiisópřopylkář&odi'imidu /ĎŤČ/ nebo 2působu aktivního esteru. Reaktivní skupiny postranního řetězce aminokyseliny jsou chráněny, když je potřeba, vhodnými ochrannými skupinami........ .. . . . . ......

Úplnost vazební reakce se měří ninhydrihovým testem /Kaiser, E., Colescott, Rl.L., Bossinger, C.D.,

- 9 a Cook, Ρ. I., Anal. Biochem. 34. 595-598 /1970/.

Když je test pozitivní, tak se navazování opakuje. Trvání navazování kolísá mezi 1 až 16 hodinami v závislosti na té které aminokyselině.

Deprotekee peptidu stejně jako odštěpení peptidu od pryskyřice se výhodně provádí v jednom stupni pomocí fluorovodíkové kyseliny /HF/ /Sakakibara, S., Shimonishi, Y., Kishida, Y., Okada, tt,, a Sugikara, H.,

Bull, Soc. Japan ^0, 2164-2167 /1967//.

Když se použije H^im-dinitrofenyl /DNP/ ochranná skupina, pak se odstraní z postranního řetězce histidinu před štěpením pomocí HF. Chráněná peptidová pryskyřice se zamíchá va £e dimethylformamidu /QMF/, který obsahuje několik kapek propylaminu. Po odstranění rozpouštědla se peptidová pryskyřice upraví hydrogenfluoridem obvyklým způsobem. Když se má připravit alkylamid peptidu, tak se peptid oddělí od pryskyřice alkylamonolýzou, která je následována hydrogenolýbou a/nebo acidolýzou,' v. závislosti na původu ochranných skupin.

....... Suř-ov-ý- -produkt- získaný po_; štěpení .HF. ,se..p.odr.o^ bí gelové filtraci na sloupci naplněném Sephadexem G-25 za použití kyseliny octové v roztoku jako eluentu. _:

- 10 Další čištění se provádí pomocí preparativní vysokovýkonnostní kapalinové chromatografie /HPLC/ a/nebo silikagelové chromatografie.

Čistota peptidů se zkouší aminokyselinovou analýzou a tenkovrstvou chromatografií /TLC/. Hodnoty TLC se určují na Kieselgelových /DC, Alufolien, Merck/ deskách pomocí následujících rozpouštědlových směsí:

1. ethylacetát/pyridin/kyselina octová/voda v poměru 30 : 20 : 6 : 11 '

2. ethylacetát/pyridin/kyselina octová/voda v poměru 60 : 20 : 6 : 11

3. ethylacetát/pyridin/kyselina octová/voda v poměru 120 : 20 : 6 : 11 , '

4. ethylacetát/pyridin/kyselina octová/voda v poměřú 240 : 20 : 6 : 11

5. n-butanol/kyselina octová/voda/ethylacetát v poměru 1:1:1:1

6. n-butanol/kyselina octová/voda v poměru 4:1:1

7. ji-propanol/lM kyselina octová v poměru 2 : 1

- 11 8. ethylacetát/pyridín/kyselina octová/voda v poměru ' ΐ

5:5:1:3

9. n-butanol/kyselina octová/amoniak /1 cnr NH^: 4 HgO/ /voda v poměru 6:1:1:2

10. methylethylketon/kyselina octová/voda v poměru 120 : 15 : 20.

··

- 12 Příklad 1

Příprava |b-Phe^, Gln^gonadoliberinu M: 1243 a/ Syntéza

1,25 g /1 mmol/ hydrochloridu benzylhydr^laminové pryskyřice /0,8 mekv/g/ /Pierce/ se nechá botnat v CHgClg po dobu 2 hodin, pak se použije následující postup pro navazování zbytků aminokyselin:

stupeň	reagencie a operace	doby styku /min/
1	CHgClg, promýt 3 krát	1
2	33 % trifluoroctové kyseliny /TFA/ v CH₂C1₂	1
3	33 % TFA v®i₂ C±₂	25
4	CH₂C1₂, promýt 3krát	' 1
5	CHClp promýt 2krát	1
6	10 % triethylaminu /TEA/ v CHCly 2krát	. 2
7	CHCl^, promýt 2krát	1
8	ethanol, promýt 2krút	1
9	CH₂C1₂, promýt 2krát	1

- 13 stunen reagencie a operace doby styku min

Boc-aminokyselina /3mmoly/ v CHgC^ a je-li třeba DMF + DIC nebo DCC /3mmoly/ v CHgClg* 60 - proměnná

CH₂C1_2> promýt 2krát ethanol, promýt 2krát x Gin se naváže jako Boc-Gln-ONP /p-nitrofenyl/ derivát způsobem aktivního esteru, v případě Glp není alfa-aminoskupina chráněna.

Po každém cyklu /po stupni 12/ se odebere alikvotní část pro ninhydrinový test; když je test negativní, započne další cyklus ve stupni 1, a když je pozitivní, provede se další znovunavazování /stupně 5 až 12/.

Na konci syntézy se získá 2,28 g Glp-His/Tos/Trp-Ser/OBzl/-Tyr/OBzl/-DrPhe-Leu-Cln-Pro-Gly-peptidové pryskyřice.

Λ W: 1,05 g /66 %/, •^chráněného-pepti-du’ 5.557* ..... ., ......

- 14 b/ HF štěpení

Na chráněný peptid /2,28 g/ se působí redestilovanou HF /30 ml/ v přítomnosti anisolu /3 mí/ a dithiothreitolu /100 mg/ po dobu 60 minut při teplotě O °C.

HF se odstraní v proudu bezvodého plynného dusíku, pryskyřice se pak suspenduje v absolutním etheru a filtruje. Tuhý zbytek se promyje 50%ní kyselinou octovou, pak se roztok odpaří za vakua při 37 °C.

Odpařený materiál se přímo podrobí gelové filtraci /viz dále stupeň c/.

* '' ·Ή'·>

c/ Gelová filtrace

Surový peptid /získaný ve stupni b/ se vyčistí na sloupci Sephadexu G-25 /2,5 x 100 cm/ v 5OS6ní kyselině octové při rychlosti proudění 15 ml/h. Oddělování se kontroluje UV absorpcí při 280 nm a pomocí TLC.

Frakce /300 - 350 ml/ se spojí a lýofilizují.

Výtěžek: 690 mg /55 %/.

* t| d/ Vysokovýkonnostní preparativní kapalinová chromatografie

Další čištění se provádí za použití zpětné vazby C_1O - vázaného silikagelu LRP-1 /13 až 24 mikrometrů/ /Whatman/ v preparativním HPLC sloupci /2,5 x 45 cm/ který je uveden do rovnováhy roztokem 25%nfho methanolu v 30%ní kyselině octové. Po vyrovnání se na sloupci

- 15 nasadí 230 mg gelem filtrovaného materiálu. Eluce se provádí lineárním gradientovým systémem methanol-30%ní kyselina octová /25 až 40 % methanolu/ při rychlosti 5 proudění 2 ml/min a tlaku 3,5 x 10 Pa. Obsahy frakcí se měří při 280 nm a kontrolují se tenkovrstvou chromatografií TLC.

Spojením a lyofilizaci produktu se získá 133 mg 6 8

D-Phe , Gin -GnRH. Absolutní množství by mělo být násobeno 3 pro normalizaci na 690 mg gelem filtrovaného materiálu /399 mg, 32 %/.

R* = 0,76; r| = o,68; · 0,33; rJ = 0,93; δθ = 0,83.

Analýza aminokyselin:

Ser 0,93, Glu 1,96, Pro 0,95, G^.y 1,02, Leu 1,00, Tyr 1,01, Phe 1,02, His 0,99.

Teplota tání:

175 až 178 °C; [oO] Jj² = -68,0° /c = 0,1, 0,1 H AcOH/.

Příklad 2

Příprava ^Trp?, Gln^gonadoliberinu Μ:. 1 226

- 16 a/ Syntéza

2,5 g /1 mmol/ benzylhydrijlaminové pryskyřice. HC1 /0,4 mekv/g/ se nechá nabotnat v CH^Clg, pak se připraví 3,62 g Glp-His/DNP/-Trp-Ser/OBzl/-Tyr-Gly-Trp-Gln-Pro-Gly-peptidové pryskyřice podle příkladu 1 a/.

1,12 g /76 %/ ^chráněného peptidu* ⁴^θ* b/ Deprotekce a odštěpení peptidu z pryskyřice

Odštěpení DNP skupiny '^!Chráněná dekapeptidová pryskyřice /3,62 g/ se míchá ve 20 ml dimethylformamidu a 1 ml propylaminu po dobu 60 minut při teplotě- místnosti, pak se zčásti chráněná peptidová pryskyřice odfiltruje, promyje C^Clg a etha nolem, načež se vysuší za vakua.

HF štěpení

Po odstranění DNP ochranné skupiny se na peptid působí HF podle příkladu 1 b/. Tímto způsobem se získá 0,8 g /65 %/ surového dekapeptidamidu.

v c/ Gelová filtrace

Gelová filtrace se provádí podle příkladu 1 c/. Výtěžek: 520 mg /42 %/.

- 17 d/ Preparativní vysokovýkonnostní kapalinová chromatografie

Postup se provádí podle příkladu 1 d/ s tou výjimkou, že se LRP-lgel uvede do rovnovážného 3tavu roztokem 18#ního methanolu v 3O#ní kyselině octové. Surový, gelem filtrovaný materiál se eluuje ze sloupce lineárním gradientním systémem methanol-30#ní kyselina octová /18 - 35 # methanolu/. Takto ae získá 380 mg /31 %/ čistého peptidu.

R^ « 0,66; r| = 0,57; R® = 0,78.

Analýza aminokyselin:

Ser 0,93, Glu 1,93, Pro 1,00, Gly 2,04, Tyr 0,98,

Trp 1,86, His 1,03.

Příklad 3

Příprava^Trp^, Leu⁸, desofa^gonadoliberinethylamidu M: 1198 a/ Syntéza

Nejdříve se připraví Soc-Pro-pryskyřice způsobem podle Merrifielda /Merrifield, R. Β., J. Am. Chem. Soc 86,

304 /1964./ 2,0 g /1 mmol/ Boc-Pro-pryskyřice /0,5 . mekv/g/ se nechá botnat po dobu 2 hodin, pak se navážou na pryskyřice příslušné aminokyseliny jedna za druhou podle příkladu 1 a/. Po posledním cyklu se získá 3^02 g Glp-His/ĎNP/-Trp-Ser/OBzl/-Tyr/OBzl/-Gly-TrpLeu-Pro-nonapeptidové pryskyřice.

Δ W: 1,02 g /83 %/ ^chráněného peptidu’ 1486, * b/ Deprotekce a odštěpení peptidu z pryskyřice

Nejdříve se odstraní DUP ochranná skupina jako v příkladu 2 b/, Pak se zčásti chráněný peptid odštěpí z pryskyřice jako ethylamid /Goy, D. H. a kol., Biochemistry 13. 323-326 /1974/. Pro tento účel se peptidová pryskyřice míchá s 15 ml kondenzovaného ethylamihu při teplotě 0 °C po dobu 3 hodin. Přebytek ethylaminu se odstraní v proudu plynného dusíku.

Zbytek se promyje ethanolem a dimethylformamidem, pak se zfiltruje. Filtrát se odpaří za vakua, zbytek se upraví etherem a tuhý materiál se odfiltruje.

Úplné odstranění _ochranyx peptidu...se. provede., působením. bezvodého HP podle příkladu 1 b/.

Výtěžek: 710 mg /59 %/.

- 19 c/ Gelové filtrace

Nonapeptidethylamid se vede sloupcem Sephadexu G-25 v 30%ní kyselině octové podle příkladu 1 c/.

Výtěžek: 490 mg /41 %/.

d/ Silikagelová chromatografie

Surový peptid se vyčistí na sloupci a Kieselgelu 60, x 100 cm /230 - 400 mesh, Merck/ ve směsi ethylacetát, pyridin, kyselina octová, voda v poměru 30 : 20 : 6 : 11 při rychlosti proudění 8 ml/h. 4ml frakce se spojí a eluce se kontroluje tenkovrstvou chromatografií. Frakce obsahující čistou látku se odpaří a lyofilizují.

Výtěžek: 320 mg /26

R* = 0,61; r| = 0,42; Ηθ = 0,75.

Analýza aminokyselin

Ser 0,89, Glu 0,96, Pro 0,95, Gly 0,97, Leu 1,00,

Tyr 1,02, Trp 1,88, His 1,03.

Příklad 4

Příprava ^Phe?, Gln^|gonadollberinu M: 1187 a/ Syntéza

1,25 g /1 mmol/ hydrochloridu benzhydrjlaminové pryskyři ce /0,8 mekv/g/ se nechá botnat v CSjC^ po dobu 2 hodin, pak se připraví podle příkladu 1 a/ 2,9 g Glp-His /Tos/-Trp-Ser-/OBzl/-Tyr/OBzl/-Gly-Phe-Gln-Pro-Gly-peptidové pryskyřice.

1,27 g /83 %/ ^chráněného peptidu* ^521.

b/ HF štěpení :»

Chráněný peptid se upraví působením pomocí bezvodého HF podle příkladu 1 b/. Tak se získá 980 mg /82 %/ nechráněného materiálu.

c/ Gelová filtrace

Surový dekapeptidamid se vyčistí na sloupci SephadexuG-25 ve.2M kyselině octové podle příkladu 1 c/.

Výtěžek: 576 mg /49 %/.

d/ Preparativní vysokovýkonnostní kapalinová chromatografie

Postup se provádí podlé příkladu 1 d/ s tou výjimkou, že LSP-1 gel se uvede do rovnovážného stavu roztokem lO^ního methanolu v 20&ní kyselině octové. Eluce se provádí lineárním gradientním systémem methanol-20%ní kyselina octová /10 - 25 % methanolu, 150 - 150 ml/,

- 21 pak se pokračuje lineárním gradientním systémem obsahujícím 25 až 40%ní methanol. /150 - 150 ml každého/

Frakce obsahující čistý peptid se spojí a odpaří. Výtěžek: 448 mg /38 %/ r! = 0,12, r| χ 0,7, Rf = 0,24, rJ * 0,87

Analýza aminokyselin:

Ser 0,87, Glu 2,05, Pro 1,03, Gly 2,13, Tyr 0,92,

Phe 1,00, His 0,95, Trp 0,81.

Teplota tání: 182 °C.

Příklad 5

Příprava ^Phe⁷, Leu⁸J gonadoliberinu M: 1172 a/ Syntéza

0,62 g /0,5 mmol/ benzhydrylamin.HCl pryskyřice /0,8 mekv/g/ se nechá botnat v CH₂C1₂ po dobu 2 hodin, pak se podle příkladu 1 a/ syntetizuje 1,33 g, Glp-His/Tos/-Trp-Ser/OBzl/-Tyr/OBzl/-Gly-Phe-Leu-Pro-Gly-peptidové pryskyřice.

695 mg /92 %/ ' ^chráněného peptidů* ^06

- 22 b/ HF štěpení

I. - . .

Na chráněný peptid se působí HF podle příkladu 1 b/. Takto se získá 510 mg /87 %/ surového dekapeptidu.

c/ Gelová filtrace

Surový dekapeptidamid získaný ve stupni b/ se nasadí na sloupec Sephadexu G-25 ve 2M kyselině octové a vyčistí se podle příkladu 1 c/*

Výtěžek: 363 mg /62 %/ _: d/ Silikagelová chromatografie

Peptid se dále vyčistí na sloupci z Kieselgelu 60 /2 x 100 cm/ ve směsi n-butanol, káyselina octové, voda a ethylacetát v poměru 1:1:1:1. Obsahy frakcí se kontrolují při 280. nm a tenkovrstvou chromatografií Tak se získá 299 mg /51 %/ čistého dekapeptidamidu.

= 0,55; r| = 0,39; h| = 0,62; rJ = 0,73.

Analýza aminokyselin:

Ser 0,91, Glu 0,97, Pro 1,07, Gly 2,12, Leu 1,00, ¹ Tyr 1,03, Phe 0,94, His 1,05.

- 23 Příklad 6

Příprava^D-PheGin®, desGly^Jgonadoliberinethylamidu M: ;·'. 1198 a/ Boc-His/DNP/-Trp-CMe M: 623

21,12 g /50 mmol/ Boc-His/DNP/-OH se rozpustí ve 100 ml dimethylfornamidu a roztok se ochladí na teplotu O °C.

Pak se za míchání přidá 10,32 g /50 mmol/ DCCI a 7,66 g /50 mmol/ N-hydroxybenztriazálu, Směs se míchá při teplotě O °C po dobu 10 minut a sražená dicyklohexylmočovina se odfiltruje.

12,74 g /50 mmol/ H-Trp-OMe.HCl se rozpustí v 70 ml dimethy lformamidu a roztok se ochladí na teplotu O °C.

Přidá se 693 ml /50 mmol/ triethylaminu a po mícháni po dobu 5 minut se odfiltruje sražený triethylaminhydrochlorid.

Tyto dva roztoky se spojí a míchají při teplotě O °C přes noc. Pak se vysrážený DCU odfiltruje a roztok se odpaří do sucha. Olejovitý zbytek se rozpustí v 500 ml ethylacetátu a protřepe se se 3 stomililitrovými dávkami ledově chladného roztoku 1M KHSO^, 5 lOOml dávkami nasy. ceného roztoku NaHCO^ a nakonec 2 lOOml dávkami lO%ního roztoku NaCl,

- 24 Organická f#ze se vysuší nad síranem hořečnatým, zfiltruje a odpaří do sucha. Získaná olejovitá substance se rozmělní s petroletherem, zfiltruje a vysuší. Krystalický produkt, který se získá, může být rekrystalován z ethylacetátu s petroletherem

Výtěžek:. 27,7 g /89 %/.

Teplota tání: 119 - 122 °C; [<χζ « +14,1 /c » 1, DMF/. R⁴ = 0,62.

b/ H-His/DNP/-Trp-OMe.2HC1

M: 522,5 /volná báze/; 595 /x 2HC1/ í

24,9 g /40 mmol/ Sdc-His/DNP/-OMe-dipeptidu se rozpustí ve 100 ml methanolu a přidá se 100 ml 4N methanolického roztoku kyseliny chlorovodíkové. Směs se nechá stát po dobu 30 minut při teplotě místnosti, přičemž krystak luje dipeptidhydrochlorid. Krystaly se odfiltrují, promyjí etherem a vysuší.

Výtěžek: 21,91 g /92 %/. ..............................

‘22

Teplota tání: 198 - 202 °C jcc]_D ³ 0,49° /c = 1, DMF/.

Sf = 0,46, R⁴ = 0,18.

- 25 c/ Glp-His/DNP/-Trp-OMe

Mi 634

4,85 g /36,8 mmol/ L-pyroglutanové kyseliny, 7,58 g dicyklohexylkarbodiimidu a 5,63-g N-hydroxybenztriazolu se rozpustí ve 100 ml dimethylformamidu. Směs se míchá při teplotě 5 až 10 °C po dobu 10 minut, načež se sražený DCU odfiltruje.

20,84 g /35 mmol/ H-His/DNP/-Trp-0me.2HCl se rozpustí ve 100 ml dimethylformamidu a přidá se 9,72 ml /70 mmol/ triethylaminu do tohoto roztoku. Po promíchání po dobu 5 minut se odfiltruje sražený triethylaminhydrochloriá. Tyto dva roztoky se spojí a míchají při teplotě místnosti přes noc. Pak se do směsi přidá 90 ml acetonu a sražená nerozpustná látka se odfiltruje. Odpařením roztoku se získá olejovitý materiál, který se rozetře s ethylacetátem,zfiltruje a vysuší. Suchý krystalický materiál se promyje 3 25ml podíly vody a vysuší. Produkt může být rekrystalován rozpuštěním v horkém ethylacetátu a ochlazením.

Výtěžek: 18,42 g /83,1 %/ Teplota tání: 148 - 151 °C « 0,53, Rf = 0,38;

+5,2 /c = 1, DMF/.

- 26 d/ Glp-His-Trp-OMe

M: 466

15,84 g /25 mmol/ Glp-His/ĎNP/-Trp-OMe chráněného tri peptidu se rozpustí ve směsi 100 ml dimethylformamidu a 40 ml vody. Přidají se 4 ml merkaptoethanolu a pH roztoku se nastaví na hodnotu 8 pomocí triethylaminu.

Nechá se stát při teplotě místnosti po dobu 30 minut a odpaří se do sucha za vakua. Olejovitý materiál se rozetře s etherem, zfiltruje a vysuší. Získaný produkt se rozpustí v malém podílu methanolu. a rekrystálizuje se za přidáni etheru. Vysrážené krystaly se zfiltrují a vysuší.

e/ Glp-His-Trp-N^

M: 466,5

9,33 S /20 mmol/ Glp-His-Trp-OMe tripeptidu se rozpustí ve 25Ο ml methanolu. K roztoku se přidá 20 ml 98#ního hydrazinhydrátu. Reakční směs se míchá při teplotě 40 °C po dobu 3 hodin a pak při teplotě místnosti přes noc. Vysrážený materiál se pak odfiltruje, promyje studeným

- 27 methanolem a vysuší. Výtěžek: 7,58 g /81,2 %/. Teplota tání: 166 - 169 °C R¹ = 0,50, R² = 0.14.

-22,3 /c-0,5,

DMP/.

f/ Glp-His-Trp-Ser-Tyr-OMe

M: 717

7,0 g /15 mmol/ Glp-His-Trp-NgH^ získaného ve stupni e/ se rozpustí v 60 ml dimethylformamidu. Roztok se ochladí na teplotu 0 °C a za míchání se přidá 7,5 ml /45 mmol/ . 6N HC1 roztoku. Pak se ke směsi přidá po kapkách 1,035 g /15 mmol/ NařTOj ve formě koncentrovaného vodného roztoku a směs se míchá při teplotě O °C po dobu dalších 15 min. K reakční směsi se přidá roztok 4,78 g /15 mmol/ H-Ser-Tyr-OMe.HCl v 15 ml dimethylformamidu. pH se nastaví * na neutrální hodnotu 6,25 ml /45 mmol/ triethylaminu a směs se míchá při teplotě 0 až 4 °C přes noc. Příští den se odpaří do sucha za vakua a olejovitý produkt se rozetře s etherem.

Získá se 12,1 g /100 %/ požadované sloučeniny obsahující malé ..množství ..nečistot. Tento -produkt-může být-převedenna hydrazid bez čištění a získaný hydrazid může být snadno vykrystalován.

- 28 Fyzikální vlastnosti kontrolního vzorku rekrystalovaného z methanolu:

g/ Glp-His-Trp-Ser-Tyr-NgH^

M: 717 g surového práškovitého Glp-His-Trp-Ser-Tyr-OMe pentapeptidesteru se rozpustí ve 200 ml methanolu a přidá se 10 ml 98%ního hydrazinhydrátu. Směs se míchá při teplotě 40 °C po dobu 3 hodin, pak se míchá při teplotě místnosti přes noc, načež se vysrážené krystaly odfiltrují a vysují exsikátoru nad koncentrovanou kyselinou sírovou. Suchý krystalický materiál se rozpustí ve _ř;250 ml 0,5N kyselině chlorovodíkové. Roztok se upraví tak, aby jeho pH mělo hodnotu 8 pomocí nasyceného roztoku uhličitanu sodného. Po stání při teplotě O °C po — - -......dobu 2 hodin se vysrážené krystaly odfiltrují, promyjí ledově chladnou vodou a vysuší.

Výtěžek: 6,12 g /56,9 %/ počítáno pro 2 stupně.

Teplota' tání: 205 - 206 °C; [ a]₃ = -21,51 ° /c = 1, DMF/.

^Sf = 0,39, R² = 0,14.

- 29 h/ Z-Gln-Pro-NHEt

M: 405

3,242 g ethylamidu prolinu /získaného z 22,8 mmol Z-ProNHEt hydrogenolýzou/ se rozpustí v 70 ml tetrahydrofuranu /THF/, pak se k roztoku přidá 5,6 g /20 mmol/ Z-Gln-OH a 1,034 & N-hydroxybenztriazolu. Reakční směs se ochaldí na teplotu 0 °C a do míchanéhe ^eateku reakční směsi se nakape roztok 5,34 g /25,9 mmol/ dicyklohexylkarbodiimid v tetrahydrofuranu. Míchání pokračuje po dobu 5 hodin při teplotě 0 °C, pak po dobu 20 hodin při teplotě místnosti. Sraženina se zfiltruje, promyje tetrahydrofuranem, pak se filtrát odpaří za vakua a zbytek se rozpustí v chloroformu. Roztok se protřepá se 3 35ml podíly směsi NH^OH a vody /1 : 5/, 2 20ml podíly vody, 3 35ml podíly O,1N HC1 a nako nec 2 20ml podíly vody. Organická fáze se vysuší nad bezvodým eíranem sodným, zfiltruje, promyje chloroformem a odpaří.

Získaný olejovitý zbytek se rozpustí ve směsi 35 ml tetrahydrofuranu a 50 ml ethylacetátu a pak se zfiltruje.

Roztok se odpaří a zbytek se rozetře s etherem. Získaný tuhý produkt se zfiltruje, promyje etherem a vysuší 2a vakua.

Výtěžek: 7,68 g /95 %/.

Rf » 0,73, Rf = 0,45.

- 30 i/ Z-Leu-Gln-Pro-NHEt • M: 518,6

4,5 g /11 mmol/ 2-Gln-Pro-NHEt se rozpustí ve 30 ml ledové kyseliny octové a 55 ml 4N bromovodíku v ledové kyselině octové se přidá k roztoku. Rekační směs se udržuje po dobu 90 minut při teplotě místnosti, pak se přidá 250 ml bezvodého etheru ke směsi a udržuje se po dobu 60 minut při teplotě místnosti.

Dekantuje se supernatant, přidá se 100 ml etheru ke zbytku a po 15 min se zfiltruje a promyje etherem.

• '** , ··' ,·*>

Tuhý zbytek se vysuší za vakua nad oxidem fosforečným ¹ ;

l* a hydroxidem sodným.

Výtěžek:, 4,9 g Vhygroskopický/; ,·

3,8 g /11 mmol/ získaného dipeptidetbylamidu.HBr se. suspenduje b ve 150 ml chloroformu a k suspenzi se při----- -----dá. 7 ml- triethylaminu. - Dále -se--přidá- 6y4 g karbobenzoxyleucylpentachlorfenylesteru v 65 ml chloroformu.

Reakční směs se míchá přes noc při teplotě místnosti.

Příští den se promyje IN chlorovodíkovou kyselinou nasyceným roztokem chloridu sodného, 2N hydroxidem amonným a znovu nasyceným roztokem chloridu sodného.

Chloroformová fáze se vysuší nad bezvodým síranem sodným a za vakua odpaří. Zbytek se rozetře s etherem,

- 31 zfiltruje, promyje etherem a vysuší za vakua.

Výtěžek: 4,6 g /81 %/.

j/ H-Leu-Gln-Pro-NHEt.HBr

M: 465,5

Surový produkt připravený ve stupni i/ se rozpustí v 10 ml ledové kyseliny octové a míchá po dobu 60 minut při teplotě místnosti, pak se roztok zředí 100 ml bezvodého etheru. Sraženina se odfiltruje a vysuší za vakua. Výtěžek: 3,54 g /76 %/.

R^ = 0,1, R^ = 0,55, 4 ³ °’¹³’ ^Rf ³ °’⁷⁷·

Analýza aminokyselin:

Glu 1,05, Pro 1,19, Leu 1,00.

k/ Boc-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt

Mí 631,7

2,33 g /5 mmol/ H-Leu-Gln-Pro-NHEt.HBr se rozpustí v 5 ml dimethylformamidu a ochladí na teplotu 0 °C a pak se přidá k roztoku 0,7 ml /5 mmol/ triethylaminu a 2,57 g /5 mmol/ terč.butyloxykarbony1-D-fenylalanylpentachlorfenylesteru v 10 ml dimethylformamidu.

- 32 Velikost pH se nastaví na hodnotu mezi 7 a 8, pak se · reakční směs míchá po dobu 48 hodin při teplotě místnosti, zatímco hodnota pH se občas nastavuje na neutrální hodnotu pomocí triethylaminu. Po odpaření reakční směsi se zbývající látka rozetře s etherem, pak se zfiltruje a vysuší. Získaný surový produkt se podrobí deprotekci bez dalšího čištění.

Výtěžek: 2,81 g /89 %/.

1/ H-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt.TFA

M: 645,6

1,26 g /2mmol/ Boc-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt se rozpustí v 10 ml trifluoroctové kyseliny a míchá se po dobu 20 min při teplotě místnosti. Trifluoroctová kyselina se odpaří za vakua a zbytek se rozetře s etherem, zfiltruje a vysuší. Zbytek se podrobí chromatografii na silikagelovém sloupci pomocí'směsi n-bUtanoI,''kyselina octová á voda v poměru 4:1:1. Příslušné frakce se spojí a odpaří za vakua. Zbytek se rozpustí v několika ml vody a pak se lyofilizuje.

Výtěžek: 880 mg /68 %/.

= 0,25, Rj ’ 0,35. Teplota tání: 142 °C; Γα ^lD

- 33 m/ Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro^NHEt

M: 1199

286 mg /0,4 mmol/ pentapeptidhydrazidu Glp-His-Trp-Ser-Tyr-NgH^ připraveného ve stupni g/ se rozpustí v 10 ml dimethylformamidu. Roztok se ochladí na -10 °C pak se po kapkách přidá za míchání 0,27 ml 6N chlorovodíkové kyseliny a pak koncentrovaný vodný roztok 30,2 mg dusitanu sodného. Po 5 minutách se přidá roztok trifluoroctávé soli 258 mg /0,4 mmol/ tetrapeptidu H-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt připraveného v 1 ml dimethylformamidu s 0,27 ml triethylaminu při -10 °C. Kdy je to potřebné, reakční směs se a nastaví na neutrální hodnotu pH pomocí triethylaminu, pak se míchá po dobu 1 hodiny při teplotě -5 °C, po dobu 1 hodiny při teplotě 0 °C a po dobu 12 hodin při teplotě místnosti.

Dimethylformamid se odstraní za vakua, olejový zbytek se rozpustí v 5 ml Q,2N kyseliny octové a roztok se podrobí chromatografii na sloupci βΐ Sephadexu G-25 /2 x 95 cm/ 0,2N kyselinou octovou. Příslušné frakce se spojí a lyofilizují.

Výtěžek: 298 mg·/62 %/.

ϊφ = 0,39, = 0,13, = 0,48, _{3 0)X}4_# · ·· ·

- 34 Analýza aminokyselin;

Ser 0,89, Olu 1,98, Pro.O,97, Leu 1,00, Tyr 1,03, Phe 0,99, His 1,01, Trp 0,91.

Příklad 7

Příprava^Trp^, Gin®, desGly^jonadoliberinethylamidu M: 1220 a/ Boc-Gln-Pro-NHEt ' Mí 370 ·

1,0 g /7 mmol/ prolinethylamidu se rozpustí v 15 ml dimethylformamidu a velikost pH se nastaví na hodnotu 8 pomocí triethylaminu a pak se k roztoku přidájí 3,2 g ·· <

/8,4 mmol/ terc.butyloxykarbonylglutaminy1-p-nitrofenylesteru v 15 ml dimethylformamidu.

Reakční směs se míchá po dobu 48 hodin při teplotě místnosti, přičemž se velikost pH nastaví občas na hodnotu 8 pomocí triethylaminu. Po odpaření reakční směsi se olejovitý zbytek rozpustí ve vodě, promyje etherem a oddělená vodná fáze se odpaří za vakua a vysuší.

Výtěžek: 1,93 g /74,5 %/.

Rj 0,76.

- 35 b/ H-Gln-Pro-NHEt.TFA

M: 270 /volná báze/ M: 367 /TFA sůl/

1,9 g /7,2 mmol/ Boc-Gln-Pro-NHEt se rozpustí v 10 ml trifluoroctové kyseliny a míchá se po dobu 20 minut při teplotě místnosti* Roztok se za vakua odpaří, zbytek se rozetře s etherem, zfiltruje a za vakua vysuší. Výtěžek:, 1,52 g /58,0 %/.

c/ Boc-Trp-Gln-Pro-NHEt

M: 557

500 mg /1,85 mmol/ H-Gln-Pro-NHEt se rozpustí v 10 ml dimethylformamidu. Velikost pH se nastaví na hodnotu 8 pomocí tri ethy laminu, pak se přidá 608 mg /2 mmol/ teie.butyloxykarbonyltryptofanu v 10 ml dimethylformamidu a 620 mikrolitrů /4 mmol/ Ν,Ν’-diisopropylkarbodiimidu. Reakčni směs se míchá po dobu 48 hodin při teplotě místnosti, pak se odpaří za vakua.

Zbytek se rozpustí v ethylacetátu a zředí se etherem. Vysrážený Boc-Trp-Gln-Pro-NHEt se zfiltruje, promyje etherem a vysuší.

- 36 Výtěžek: 740 mg /72 %/.

R² = 0,75, R^ = 0,38.

d/ H-Trp-Gln-Pro-NHEt.TFA

M: 456,5 /volná báze/ M: 554 /TFA sůl/

700 mg /1,25 mmol/ Boc-Trp-Gln-Pro-NHEt še rozpustí ve 25 ml směsi trifluoroctové kyseliny a CHgClg ^v poměru 1:1a míchá se po dobu 20 minut při teplotě místnosti. Pak se roztok odpaří za vakua azbytek se rozetře, s etherem. Tuhý zbytek se zfiltruje a vysuší. Takto'získaný surový produkt o hmotnosti asi 500 mg se vyčistí chromatografií na silikagelovém sloupci ve směsi ethylacetátypyridin a kyselina octová a voda v poměru 47 : 20 : 6 : 11. Příslušné frakce se spojí, odpaří do sucha ve vakuu a zbytek se rozetře s etherem. Tak se získá 360 mg /52 %/ bílého prášku.

R^ = 0,46, R² = 0,18.

Teplota tání; 119 až 123 °C; [ oc]_D » -4,8° /c = 0,1,

0,1 n HC1/.

e/ Boc-Gly-Trp-Gln-Pro-NHEt Mi 613,7

- 37 350 mg /0,76 mmol/ H-Trp-Gln-Pro-NHEt se rozpustí v dimethylformamidu a naváže se 104 mg/0,8 mmol/ Boc-Gly podle stupně c/ z příkladu 7. Tak se získá 375 mg /81 %/ krystalické látky.

r| = 0,88, R^ = 0,82, R^ = 0,61 .

f/ H-Gly-Trp-Gln-Pro-NHEt.TFA Mi 609,6

375 mg /0,6 mmol/Boc-Gly-Trp-Gln-Pro-NHEt se zbaví ochrany a vyčistí podle stupně d/ z příkladu ,7.

Tak se získá 285 mg /76,6 95/ bílého prášku.

r| = 0,08, R^ = 0,16,.·= o,67, R^ - 0,28.

z g/ Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Gln-Pro-NHEt M: 1216,4

286 mg /0,4 mmol/ pentapeptidhydrazidu Glp-His-Trp-Ser-Tyr-NgH^ se spojí s 243,8 mg /0,4mmol/ H-Gly-Trp-Gln-Pro-NHEt.TFA získaného podle stupně m/ z příkladu 6. Tak se získá 252,9 mg /52 %/ čisté látky.

= 0,26,. R^-s 0,.32...,. ........

- 38 Analýza aminokyselin:

Ser 0,87, Glu 2,02, Pro 0,91, Gly 1,00, Tyr 1,12, His 1,05, Trp 1,80,

Příklad 8

Příprava injekcí pro intramuskulární, subkutánní nebo intravenosní podání . Sií .

a/ Derivát gonadoliberinu obecného vzorce I se rozpustí i v destilované vodě, fyziologickém solném roztoku nebo pufrovaném vodném roztoku v koncentraci 1 až 10 mg/ml.

Roztok se zfiltruje na sterilní malé podíly obsahující až 500 mikrogramů aktivní složky, která se plní do S ampulí a lyofilizuje a pak se ampula zataví. Obsah těsně aktivní složky v ampulích se před ošetřením rozpustí přídavkem 1 - 10 ml destilované vody a podá se objem odpovídající požadované dávce.

b/ 20 - 500 mikrogramň/ml gonadoliberinového derivátu

.....vzorce I se rozpustí ve -vodném roztoku obsahujícím..... '

0,9 % NaCl a 0,9 % benzylalkoholu.

- 39 Podíly obsahující 20 až 500 mikrogramů/ml aktivní složky se naplní do ampulí, které se pak zataví. Získané roztoky mohou být přímo injektovány.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Gonadoliberinové deriváty obecného vzorce I

Glp-HiS’Trp-Ser-Tyr-X₁-x₂-X₃-Pro-X₄ /X/ ve kterém

X₁ představuje glycylovou skupinu nebo D-fenylaíanin nebo D-tyrosin,

X₂ představuje L-alanyl, L-valyl, L-leucyl, L-isoleucyl, L-fenylanyl nebo L-tryptofyl, představuje L-alanyl, L-valyl, L-leucyl, L-isoleucyl, L-glutaminyl nebo L-asparaginyl a

X^ představuje glycin nebo ethylamid, za podmínky, že když X^ představuje skupinu jinou, než glycylovou skupinu a X₂ představuje tryptofylovou skupinu, pak X^ nemůže být leucyl, a jejich adiční soli s terapeuticky použitelnými_tkyselinami a jejich komplexy.
2.

Gonadoliberihové deriváty podle 1 vybrané ze skupiny zahrnující.

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-Gly-NHg Glp-His-Trp-Ser^Tyr-Gly-Trp-Gln-Pro-Gly-NH2 Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Leu-Pro-EA Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Phe-Gln-Pro-Gly-NH^Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Phe-Leu-Pro-Gly-NH2 Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-EA Glp-His-Třp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Gln-Pro-EA a jejich terapeuticky využitelné soli a komplexy.

OO o

pem syntézy peptidu v tuhé fázi se příslušně chráněné aminokyseliny navážou v požadovaném pořadí na tuhý polymerní nosič pomocí karbodiimidu nebo aktivního esteru a v daném případě se hotový peptid odštěpí z nosiče acidolýzou nebo aminolýzou a v případě potřeby se současně odstraní z peptidu ochranné skupiny aminokyselin před nebo po odštěpení peptidu z polymerního nosiče.
4. Způsob podle bodu 3 vyznačený tím, že se jako tuhý nosič použije benzhydrylaminové nebo Boc-prolinová pryskyřice.
5. Způsob podle -bědu 3 vyznačený tím, že se chráněný paptid eliminuje z pryskyřice pomocí hydrogenfluoridu a/nebo ethylaminolýzou.

Vzorec I pro anotaci

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X₁-Xg-Xj-Pro-X^ (i)