DE3446997A1

DE3446997A1 - Gonadoliberinderivate, verfahren zu ihrer herstellung und diese verbindungen enthaltende arzneimittel beziehungsweise pharmazeutische praeparate

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Publication number: DE3446997A1
Application number: DE3446997A
Authority: DE
Inventors: Tamás Dipl.-Agr.-Ing. Szekszárd Gulyás; Anikó Dipl.-Chem. Dr. Horváth; György Dipl.-Chem. Dr. Kéri; Károly Dipl.-Chem. Dr. Nikolics; Balázs Dipl.-Chem. Dr. Szöke; István Dipl.-Chem. Dr. Budapest Teplán
Original assignee: KOEZPONTI VALTO HITELBANK
Current assignee: KOEZPONTI VALTO HITELBANK
Priority date: 1983-12-23
Filing date: 1984-12-21
Publication date: 1985-07-11
Also published as: FI82255B; BE901307A; ATA404284A; NO166449B; DK164875C; DK164875B; NO845193L; FR2557114A1; ZA849985B; DK625084A; GB2152059A; CH664968A5; GB2152059B; ES550009A0; AU3709884A; SU1396970A3; SE469032B; IT8424183A0; IT8424183A1; GB8432495D0

Description

DR. STEPHAN G. BESZiDES .7· 8060 DACHAU BEI MÖNCHEN PATENTANWALT postfach ii₆₈

VNR: 101265

ZUGELASSENER VERTRETER MDNCHENER STRASSE 8OA AUCH BEIM EUROPÄISCHEN PATENTAMT

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P 2 106

Patentansprüche und Beschreibung zur Patentanmeldung

KÖZFONTI VALTO- ES HITELBANK RT,

Budapest, Ungarn

betreffend

Gonadoliberinderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel beziehungsweise pharmazeutische Präparate

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Beschreibung

Lie Erfindung betrifft neue Gonadoliberinderivate einschließlich ihrer Salze und Komplexe, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel, beziehungsweise pharmazeutische Präparate, insbesondere Sexualhormone, beispielsweise zur Verwendung bei der Vermehrung von Fischen.

Das Gonadoliberin @.m Fachschrifttum auch als gonadotropes Hormon [gonadotropin releasing hormon]_; Gn-EH, Iuteinisierendes und follikelstimulierendes Hormon, freisetzendes Hormon [releasing hormon] und LH/FSH-RH bezeichnet) und seine bekannten Derivate haben die allgemeine Eigenschaft, das luteinisierende und follikelstimulierende Hormon (LH und FSH) freisetzen zu können.

Zu Beginn der achtziger Jahre wurde bekannt, daß sich die Struktur des Gonadoliberins mancher Fische von der Struktur des Gonadoliberines der Säugetiere unterscheidet (J. A. King und R. P. Millar, J. Biol. Chem. 2J>7 [1982], 10 722 bis 10 728; South-African Journal of Science 78 [1982], 124; N. Sherwood und Mitarbeiter, Proc. Natl. Acad Sei. 80 [1983], 2 794 bis 2 798). Dieser Unterschied wird von der in der 7- beziehungsweise 8-Stellung befindlichen Aminosäure verursacht.

ii'erner ist es aus dem Schrifttum bekannt, daß die statt des Restes von Glykokoll in der 6-^tellung Reste von bestimmten D-Aminosäuren aufweisenden Gonadoliberinderivate eine stärkere Wirkung als das Gonadoliberin selbst haben (J. Sandow und Mitarbeiter: Control of Ovulation, Butterworth, London 1978, Seiten 49 bis 70).

Weiterhin ist es bekannt, daß durch Austausch des Glycin amidrestes in der 10-Stellung gegen Amidreste mit aliphatischen Ketten die biologische Wirksamkeit des Gonadoliberines weiter erhöht werden kann (M. Fujino und Mitarbeiter, J. Med. Chem. 16 [1975], 1 144 bis 1 147).

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Gonadoliberinderivate mit überlegenen pharmakologischen Wirkungen, insbesondere Sexualhormonwirkungen, und dabei auch Derivate der Grundverbindungen mit noch vorteilhafteren biologischen Wirkungen, ein Verfahren zur Herstellung derselben und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel zu schaffen.

Das Obige wurde überraschenderweise durch die Erfindung erreicht.

Die Erfindung beruht auf der überraschenden Feststellung, daß durch Austausch der in der beziehungsweise den 7- und/oder 8-Stellung(en) befindlichen Aminosäurereste des Gonadoliberines beziehungsweise durch Kombinationen dieses Austausches sich Gonadoliberinderivate mit überlegenen pharmakologischen Wirkungen, insbesondere Sexualhormonwirkungen, beispielsweise die Vermehrung von Fischen betreffend, ergeben. Ferner beruht die Erfindung auf der überraschenden Feststellung, daß die biologische Wirksamkeit der durch Austausch der in der beziehungsweise den 7- und/oder 8-Stellung(en) befindlichen Reste von Aminosäuren des Gonadoliberines sich ergebenden Gonadoliberinderivate durch Austausch des Restes von Glykokoll in der 6-Stellung gegen bestimmte D-Aminosäuren und/oder des Glycinamidrestes in der 10-Stellung gegen Alkylamidreste noch erhöht werden kann.

- 10 GOPY

- 3448997

Gegenstand der Erfindung sind daher Gonadoliberinderivate der allgemeinen Formel

2 3 4 5678 9 10 <Glu-His-Trp-Ser-Tyr-X₁-X₂-X₅-PrO-X₄

<(Glu für einen Rest von L-Pyroglutaminsäure steht,

His einen Rest von L-Histidin bedeutet,

Trp einen Rest von L-Tryptophan darstellt,

Ser für einen Rest von L-Serin steht, Tyr einen Rest von L-Tyrosin bedeutet,

X. einen Rest von Glykokoll(Glycin) oder einer natürlichen oder synthetischen D-Aminosäure darstellt,

Xp für einen Rest von L-Phenylalanin

oder L-Tryptophan oder einer L-Aminosäure mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen) in der Seitenkette steht,

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einen als Seitenkette einen Alkylrest mit.1 bis 4 Kohlenstoffatom (on) oder einen Carboxy alkyl amid- oder Carboxamidoalkylrest mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen aufweisenden Rest einer L-Aminosäure bedeutet,

Pro

für einen Rest von L-Prolin steht und

einen Rest von Glycinamid oder einen Alkylamidrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen) bedeutet,

mit der weiteren Maßgabe, daß im Falle daß

Iy. für einen Rest einer natürlichen
oder

synthetischen D-Aminosäure
steht und

Tp einen Rest von L-Tryptophan
bedeutet,

X, von einem Rest von L-Leucin verschieden ist,

sowie ihre Säureadditionssalze und Komplexe.

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Bei den erfindimgsgemäßen Gonadoliberinderivaten handelt es sich also um Nonapeptid-C. , . .-alkylamide beziehungsweise Decapeptidamide.

Die in diesem Text verwendeten Symbole entsprechen der in der Peptidchemie üblichen Nomenklatur (siehe zum Beispiel J. Biol. Chem. 241 [1966], 527).

Vorzugsweise ist der Rest einer natürlichen oder synthetischen D-Aminosäure, für den X- stehen kann, einer von D-Phenylalanin, D-Tyrosin oder D-Dijodtyrosin, ganz besonders des ersteren, oder von einer solchen mit einer Seitenkette mit 1 bis 4, insbesondere 3 oder 4, Kohlenstoffatom(en).

Ferner ist es bevorzugt, daß der Rest einer L-Aminosäure, für den Xp stehen kann, ein solcher mit 3 oder 4, insbesondere 4, Kohlenstoffatomen iff der Seitenkette ist. Dabei ist es besonders bevorzugt, daß'der Rest einer L-Aminosäure, für den X^ stehen kann, einer von L-Leucin, L-Isoleucin, L-Norleucin, L-Norvalin, L-Valin oder L-Methionin, ganz besonders des ersteren, ist.

Weiterhin ist es bevorzugt, daß der Rest einer als Seitenkette einen Alkyl-, Carboxyalk^amid- oder Carboxamidoalkylrest aufweisenden L-Aminosäure, für welchen X, stehen kann, ein solcher, dessen Seitenkette 3 oder 4 Kohlenstoffatome aufweist, ist. Dabei ist besonders bevorzugt der Rest einer als Seitenkette einen Alkyl-, Carbaxyalksäamid- oder Carboxamidoalkylrest aufweisenden L-Aminosäure, für welchen X₅. stehen kann, ein Rest von L-Leucin, L-Glutamin, L-GIutaminsäure, L-Isoleucin, L-Norleucin, L-Norvalin oder L-Valin, ganz besonders eines der ersten beiden. Weitere Beispiele sind Reste von L-Asparagin und L-Asparaginsäure.

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Außerdem ist es bevorzugt, daß der Alkylamidrest, für den X^ stehen kann, ein solcher mit 1 oder 2, insbesondere 2, Kohlenstoffatom(en) ist.

Zweckmäßig sind die Säureadditionssalze der erfindungsgemäßen Gonadoliberinderivate solche mit pharmazeutisch beziehungsweise physiologisch brauchbaren Säuren.

Vorteilhaft sind die Komplexe der erfindungsgemäßen Gonadoliberinderivate Metallkomplexe.

Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Gonadoliberinderivate sind ^Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-Gly-irr^ , <Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Gln-Pr0-GIy-NH₂ , ^lu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Leu-Pro-NHC^^ , <Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-RIe-GIn-FrO-GIy-NH₂ ,

</GIu-Hi s-Trp-Ser-Tyr-Gly-Phe-Leu-Pro-Gly-NH₂ , ^Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-^TiC^c, und ^Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Gln-Pr0-NHC₂H^ sowie ihre Säureadditionssalze und Komplexe.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß

a) unter Anwendung der Peptidsynthese in der festen Phase die entsprechend geschützten Aminosäuren schrittweise in der gewünschten Reihenfolge durch Kuppeln mit Carbodiimid oder über einen aktiven Ester an einem festen Träger fixiert werden und gegebenenfalls das Peptidprodukt durch saures oder basisches Abspalten vom Träger abgelöst und gegebenenfalls außerdem die Schutzgruppe(n) vor,

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während oder nach dem Abspalten vom Träger ebenfalls abgespalten wird beziehungsweise werden

oder

b) $e nach dem chemischen Charakter der variablen Aminosäureteile in der herzustellenden Verbindung das Endprodukt aus in gewünschtem Maße geschützten Aminosäuren durch entsprechende Kombinationen von schrittweiser Kondensation und Fragmentkondensation aufgebaut wird,

vrorauf gegebenenfalls ±l ai sih bekannter Weis© die erhaltenen Gonado liberinderivate der allgemeinen Formel I in Säureadditions salze oder Komplexe überführt beziehungsweise aus den erhaltenen Säureadditionssalzen die freien Gonadoliberinderi vatbasen freigesetzt und/oder sie in andere Salze überführt werden.

Zweckmäßig wird bei der Variante a) des erfindungsgemäßen Verfahrens als fester Träger ein Benzhydrylaminharz oder ein Polystyrol/Divinylbenzol-Harz mit angekuppeltem BOC-Prolin verwendet.

Ferner ist es bei der Variante a) des erfindungsgemäßen Verfahrens vorteilhaft, das Ablösen des geschützten Peptidproduktes vom Träger durch Behandeln mit Fluorwasserstoff und/oder durch ithylammonolyse durchzuführen.

Nach einer vorteilhaften Ausführungsform der Variante b) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Pentapeptidazid der Formel

<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-N₃ II

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mit einem Tetra- oder Pentapeptid der allgemeinen Formel

X₁-X₂-X₅-PrO-X₄ III ,

worin X₁ , Xp , X* und X₄ die oben angegebenen Bedeutungen haben, kondensiert.

Nach einer anderen vorteilhaften AusführungBfοrm der Variante b) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Hexapeptidazid der allgemeinen Formel

<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-X₁-N₅ IV ,

worin X₁ die oben angegebenen Bedeutungen hat, mit einem Tri- oder Tetrapeptid der allgemeinen Formel

X₂-X₅-PrO-X₄ V ,

worin X₂ , X, und X₄ die oben angegebenen Bedeutungen hat, kondensiert.

Nach einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Variante b) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Heptapeptidazid der allgemeinen Formel

Glu-His-Trp-Ser-Tyr^-X₂-N₅ VI ,

worin X und X₂ die oben angegebenen Bedeutungen haben, mit einem Di- oder Tripeptid der allgemeinen Formel

X₅-PrO-X₄ VII ,

worin X, und X₄ die oben angegebenen Bedeutungen haben, kondensiert.

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Das Überführen der erhaltenen Gonadoliberinderivate der allgemeinen Formel I in ihre Säureadditionssalze kann durch Umsetzen derselben mit Säuren in an sich bekannter V/eise bewerkstelligt werden. Umgekehrt kann das Freisetzen der freien Gonadoliberinderivatbasen durch Umsetzen ihrer Säureadditionssalze mit Basen durchgeführt werden.

Die Variante a) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann nach allgemein üblichen Verfahrensweisen der Peptidsynthese in der festen Phase (Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc. 8£ [1965], 2 149 bis 2 151) durchgeführt werden. Zweckmäßig wird je nach der Struktur der herzustellenden Verbindung die Art des Ausgangsmateriales gewählt, und zwar im Falle von Peptidalkylamiden chlormethylierte Polystyrol/Divinylbenzol-Harze und im Falle von Peptidsäureamiden Benzhydrylaminharze. Die einzelnen Aminosäuren können mit Hilfe von Diisopropylcarbodiimid (DIG) beziehungsweise Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in Form ihrer mit -tert.-Butoxycarbonylgruppen (BOC) geschützten Derivate beziehungsweise nach der Verfahrensweise der aktiven Ester schrittweise an das Harz gekuppelt werden.

Der Verlauf der Kupplungsreaktion kann mit dem Ninhydrin-Prüfversuch (Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I., Anal. Biochem. J54 [1970], 595 bis 598 verfolgt werden. Im Falle der Anzeige freier Aminogruppen ist die Acylierung zu wiederholen. Die Zeitdauer der Kupplungsreaktionen kann je nach den Aminosäuren 1 bis 16 Stunden betragen.

Das Abspalten der Schutzgruppen und das Abspalten des Peptides vom Harz kann mit flüssigem wasserfreiem Fluorwasserstoff in einem Schritt erfolgen (Sakakibara S., Shimonishi Y., Kishida Y., Okada M., Sugikara H., Bull Soc. Japan 40 [1967], 2 164 bis 2 167- Vorteilhaft wird

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das geschützte Peptidharz in propylaminhaltigem Dimethylformamid verrührt und nach der Entfernung des Lösungsmittels in der üblichen Weise mit Fluorwasserstoff behandelt. ' Bei Verwendung der N^lm-Dinitrophenylschutzgruppe wird die Entfernung derselben zweckmäßig noch vor der mit Fluorwasserstoff vorgenommenen Abspaltung durchgeführt. Im Falle von Peptidalkylamiden werden diese vorteilhaft durch Alkylammonolyse vom Harz abgetrennt und dann je nach dem Charakter der Schutzgruppen katalytisch hydriert und/oder sauer hydrolysiert.

Das Rohprodukt kann nach dem mit Fluorwasserstoff vorgenommenen Abtrennen durch Gelfiltration gereinigt werden. Dazu kann eine Säule aus Sephadex G25 dienen, wobei vorzugsweise mit essigsauren Lösungen eluiert wird.

Zur weiteren Reinigung können Hochdruckflüssigkeitschromatographiersäulen (HPLC-Säulen). -und/oder die SiIicagelchromatographie herangezogen werden.

Die Reinheit der Peptide kann durch Aminosäureanalyse und mittels Dünnschichtchromatographie untersucht werden.

Ferner sind Gegenstand der Erfindung Arzneimittel beziehungsweise pharmazeutische Präparate, welche 1 oder mehr erfindungsgemäße Verbindung(en) als Wirkstoff(e), gegebenenfalls zusammen mit 1 oder mehr üblichen pharmazeutischen Konfektionierungsmittel(n), enthalten.

Die erfindungsgemäßeη Arzneimittel können in Form von Arzneimittelpräparaten vorliegen. Beispiele für Arzneimittelpräparate beziehungsweise pharmazeutische Präparate sind Tabletten, Dragees, Kapseln, Suppositorien, Ingektions-, lösungen und Nasensprys. Diese können als pharmazeutische

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Konfektionierungsmittel in der pharmazeutischen Industrie übliche Träger- und/oder Hilfsstoffe enthalten. Ihre Herstellung kann nach in der pharmazeutischen Technik üblichen Verfahrensweisen erfolgen.

Die erfindungsgemäßen Gonadoliberinderivate können vorteilhaft Fischen durch intramuskuläre oder subkutane Injektion verabrecht werden. Ihre zweckmäßige Dosis beträgt 0,1 μg bis 5 mg/Tier.

Der Hauptvorteil der erfindungsgemäßen Gonadoliberinderivate besteht darin, daß sie in den 7- und 8-Stellungen für Fische charakteristische Aminosäurekombinationen aufweisen und deshalb zur Vermehrung dieser Tiergattung erfolgreich eingesetzt werden können.

Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert. Gemäß den Beispielen 1 bis 5 wurden die Verbindungen.nach allgemein übliches. Verfahrensweisen der Peptidsynthese in der festen Phase hergestellt. Die in den Beispielen angegebenen R~-Werte der Dünnschichtchromatographie wurden an Kieselgel (DC, Alufolie, Merck) mit den Lösungsmittelgemischen aus den folgenden Bestandteilen in den folgenden Volumverhältnissen bestimmt:

1. ithylacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser $0 : 20 : 6 : 11

2. Ithylacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser 60 : 20 : 6 : 11

3. Ithylacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser 120 : 20 : 6 : 11

4. Äthylacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser 240 : 20 : 6 : 11

5. n-Butanol/Essigsäure/Wasser/Äthylacetat 1:1:1:1

6. n-Butanol/Essigsäure/Wasser 4:1:1

7. Isopropanol/m Essigsäure 2:1

8. Äthylacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser 5:5:1:3

9« n-Butanol/Essigsäure/Ammoniak (konzentriertes Ammoniak und Wasser im Volumverhältnis von 1 : 4)/Wasser 6:1:1:2

.10. Methyläthylketon/Essigsäure/Wasser 125 : 15 : 20

Beispiel 1

D-Phe⁶, Gln⁸-Gonadoliberin

beziehungsweise M: 1243

<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Fhe-Leu-Gln-Pr 0-GIy-NH₂

a) Synthese

1,25 g (l mMol) Benzhydrylaminhydrochlondharz [0,8 mM/g , Pierce] werden 2 Stunden lang in Dichlormethan gequollen. Bei der Acylierung mit den Aminosäuren wird jeweils der folgende Zyklus wiederholt: Schritt -Reagens, Arbeitsgang Eühraauer , min

1 CH₂Cl₂, Waschen 3x !

2 33Vol.-% Trifluoressigsäure im

Gemisch mit 67 Vol.-% CH_?C1_?, Waschen 3x ^X

3 _ ■■ _ 25

4 CH₂Cl₂, Waschen 3x !

5 CHCl₃₁ Waschen 2x 1

6 Gemisch aus 10 Vol.-% Triäthylamin und

90 Vol.-% CHCl₃, Waschen 2x ²

7 CHCl,, Waschen 2x !

at O

8 . Äthanol, Waschen 2x 1

9 CH₂Cl₂, Waschen 2x 1 '

10 3 mMol BOC-Aminosäure, in $0 ml 6O(oder mehr Dichlormethan gelöst⁺ , und [tos 24 Stunden]) 3 mMol DCC oder DIC, in 5 ml CH₂Cl₂

gelöst

11 CH₂Cl₂ Waschen 2x 1

12 Äthanol, Waschen 2x 1

⁺ ' Bein Kuppeln von Gin wird mit der Methode des aktiven Esters über BOC-Gln-ONP gekuppelt; im Falle von Pyroglutaminsäure wurde ohne Schutzgruppe gearbeitet.

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Nach dem letzten Schritt beträgt das Gewicht des Iu-His(Tos)-Trp-Ser(OBzI)-Tyr(OBzI)-D-Phe-Leu-GIn-Pro-Gly—PepticLharzes 2,28 g.
Ausbeute [ ^W] : 1,05 g (66%).

^(Mgesch.Peptid= ^l57?)·

b) Abspalten mit HF

Zu dem Harz werden 3 ml Anisol und 100 mg Dithiothreit zugegeben, dann werden in dem Gemisch 30 ml HF kondensiert. Das Gemisch wird bei 0 ⁰C eine Stunde lang gerührt. Anschließend wird der Fluorwasserstoff im Stickstoffstrom entfernt, der Rückstand wird in absolutem Äther suspendiert und dann filtriert. Der feste Rückstand wild in 50 vol.-%-ϊ^Έ5 s ig säure gewaschen. Das Filtrat wird bei 37 C eingedampft. Der Rückstand wurde unmittelbar der Gelchromatographie zugeführt (s.-folgenden Punkt).

c) Gelchromatographie

Die gemäß dem vorhergehenden Punkt erhaltene Substanz wurde an einer Säule aus Sephadex G25 (2,5x100 cm) mit 50 vol.-%-Jger Essigsäure als Elitionsflüssigkeit gereinigt. Die Elution wurde mittels der Absorption von UV-Licht der Wellenlänge 280 nm sowie mittels Dünnschichtchromatographie verfolgt. Die Elutionsgeschwindigkeit beträgt 15 ml/h. Die Fraktionen zwischen 300 ml und 350 ml werden gesammelt und lyophilisiert« Gewicht: 690 mg (55 %).

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d*) Praparative Hochdruck flüssigkeit sch roma t ο : r irn if: Es wurde eine präparative HPLC-Säule der Maße 2.5 χ 45 cm (c,„-Silikagel LRP-I, 13-24,Um; VVhstmon"» verwendet. Diese wurde mit einem Gsnisch ate 25 VoL-% Methanol und 75 Toli-96 30 volr-%-d^r Essigsäure äqrölfhrisrt. Nach Einstellen des Gleichgewichtes werden 230 mg der gelchromatisch gereinigten Substanz, gelöst in dem gleichen Losungsmittelgemisch, auf die Säule aufgebracht. Eluiert wurde mit einem Methanol/Essigsäure-Gradienten, dessen Zusammersetzung sich zwischen 25 Vol.-% Metiianal/75 VdL.-% 30 völliger Essigsäire und 40 VoI,-% Mebhanol/60VaL.-% 30 vol*-%-ige Essigsäure linear ändert.

Die Elutior.sgeschwindigkeit betragt 2 ml/min, der Druck 3,5_el0 Pa_e Die Fraktionen werden mit UV-Licht der Wellenlänge 280 ηm nachgewiesen, ihr Gehalt wird dünnschichtchromatographisch kontrolliert. Das Gewicht des reinen Endproduktes D-Phe , Gin -GnRH beträgt nach dem Lyophilisieren 133 mg. Das entspricht, auf die Gesamtmenge der Substanz bezogen, 399 mg (32 %) an gereinigtem Endprodukt, R^ = 0,75; R^ = 0,68 R^ = 0,33 Rf-=Ό.93 R^ = 0,33 Aminosäureanalyse:

GIy: 1,02, Pro: 0,95, Leu: 1,00, Phe: 1,02, Tyr: 1.01, Ser: 0,93, His: 0,99, Glu: 1,96.

Schmp.: 175-178 ⁰C; CocIq² = -68° (c = 0,1, 0,1m AcOH), Beispiel 2

J Q

Trp ,GIn -Gonadoliberin

beziehungsweise M: 1226

^Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Gln-Pro-Gly-N^

a) Synthese

Ausgehend von 2,5 g (l mM) Benzhydrylaminhydrochloridharz [0,4 mAqu./g]' wird auf die im Beispiel 1 unter Punkt a) beschriebene Weise das Peptidha.rz (Glu-His(DNP)-Trp-Ser(0Bzl)-Tyr-Gly-Trp-Gln-Ero-G3y-Harz hergestellt. Das Gewicht des Peptidharzes beträgt 3 62 q Ausbeute [^_-W]: 1,12 g (76%).

^CMgesch_e Peptid= ^ΐ468)* Ä,

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b) Entfernun	vom	.1	der	'.- chu t	eny	1	ppen	Ur-.d	Abr.pa	L t ο η d ..>;.
Peptides	de		Harz
Abspalten	r	Dini	t rogh		-Sch	UtZ^	rugpe	(DNP^I

Das Peptidharz wird'in dem Gemisch aus 20 ml Dimethylformamid und 1 ml Propylamin bei Raumtemperatur eine Stunde lang gerührt_u Anschließend wird das Harz abfil-

41

triert und mit Dichlormethan, dann mit Äthanol gewa3chen.

Spaltung mit HF

Nach der Entfernung der Dmit rophenyl-Schutzg ruppe werden auf die im Beispiel 1 unter Pun!:t b) beschriebene Weise das Peptid vom Harz beziehungsweise die Schutzgruppen vom Peptid abgespalten. Nach Abschlu.: der beiden Schritte verbleiben 0,8 g (65 ^) Substanz.

c) Gelchromatographie

Man arbeitet auf die im Beispiel 1 unter Punkt c) angegebene Weise. Das Gewicht der gesammelten und lyophilisierten Fraktionen betragt 520 mg (42 %).

d) Praparative Hochdruckflüssigkeitschromatographie Man arbeitet auf die im Beispiel I unter Punkr cj)

Il

angegebene Weise tut dem Unterschied, da- die Äquilibrierung mit einem Gemisch aus 18 Vol.-% Meihanolund 82 Vol*-% 50 vol.-%-iger Essigsäure vorgenommen wird. Die gelchromatographisch gereinigte Substanz wird mit einem Methanol/ /Essigsäure-Gemisch, dessen Zusammensetzung sich zwischen 18 Vol.-% Me&aKÜ/82Vol.-% 3Q vol.-^ige Essigsäure und 35Vol.-% Methanol/ 65 VaU-ffo $0vQL-%-:3ge Essigsäure ."linear., ändert, von der Säule eluiert. Die Fraktionierung sowie die sonstigen Bedingungen stimmen mit dener in Beispiel ^Id) überein» Das Gewicht des lyophilisierten Endproduktes beträgt 380 mg (31 %).

Rf = 0,66; R^ = 0,57; R^ = 0,78.

Aminosäureanalyse:

GIu: 1,93, GIy: 2,04, Pro: 1,00, Tyr: 0,98, Ser: 0,93, Trp: 1,86, His: 1,03.

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BAD ORIGINAL

Beispiel 3

Trp'.Leu ,de5GlyNH₂ -Gonadolibenn-athy lamid

beziehungsweise M=1198

<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Leu-Ero-NHC₂H₅

a) Synthese

Als erster Schritt der Synthese wird BOC-Pro ir literaturbekannter Weise ,Merrifield, R.B., 0. Am. Chen. Soc. j36_, 304 /1964/) an ein chlornethyliertes P_oly5tyrolharz gekuppelt, 2 g des auf diese Weise erhaltenen BOC-Pro-Harzes [0,5 mAqui./gJ w_erden zwei Stunden lang in Dichlormethan gequoLlen und dann w_erde_n auf die unter Punkt a) in Beispiel 1 beschriebene Weise schrittweise die entsprechenden geschürzten Aminosäuren an das Harz gekuppelt. Nach dem letzten Zyklus erhält man 3,02 g des Peptidharzes <Glu-His(DNP)-Trp-Ser(OBzl)-Tyr(OBzl)-Gly-Trp-Leu-Pro.
Ausbeute [^₁W]: 1,02g (8$%).

^(pWh. Peptid/ ¹⁴⁸⁵⁾·

b) Entfernung der Schutzgruppen und Abspalten des

Peptids von Harz

Zuerst wird gemäß Punkt b' des Beispiels 2 die Dinitropheny1-Schutzgruppe von dem Histidin abgetrennt» Anschließend wird das Peptid in Form des Athylamids vom Harz abgespalten (Coy, D.H. et al., Biochemistry 13, 323-326 /1974/). Zu diesem Zweck werden auf das ge-

it

schützte Peptidharz 15 ml Athylamin aufkondensiert, und das Gemisch wird bei O ⁰C 3 Stunden lang gerührt. Der Überschuß des Amins wird mittels Stickstoff ausgetrieben. Dann wird mit Methanol, anschließend mit Dimethylformamid gewaschen. Die DMF-Lösung wird eingedampft und das als Eindampfrückstand erhaltene öl mit Äther verrieben. Der Niederschlag wird abfiltriert,,

Die auf diese Weise erhaltene Festsubstanz wird gemä.3 Punkt b) des Beispiels 1 zwecks Entfernung der Schutzgruppen mit gasförmigem Fluorwasserstoff behandelt. M_an erhält 710 mg (59 %) Nonapeptidäthylamid.

BAD ORIGINAL

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) 3

Man arbeitet auf die unter Punkt c) des Beirpielj 1 beschriebene Weise mit einer Säule 3us Sephadex G25 und verwendet als Elutionsmitt el 30 vol.-%-Jge Essigsäure. Das Gewicht der gesammelten und lyoph 111 ■:, ier t en Fraktionen beträgt 490 mg (41 %).

Das rohr; Peptid v\i rd an emrr Gäule aus Kieselgel 60 (0,3 bös 0,4 ran [230-400 mesh], Merck) da? JVaße 2x100 cm weiter

It

gereinigt. Eluiert wird mit einem Gemisch aus Athylacetat, Pyridin, Essigsäure urd Wasser in VoluweihaLtrrisvcn 30:20:6:11. Die Durch fluggeschwindigkeit beträgt 8 ml/h. Fraktionen zu je 4 ml werden aufgefangen, und die Elution wird dünnschichtchromstographisch verfolgt.

Die dem Gonadoliberinäthylamid Trp ,Leu .desGlyNH^⁰ entsprechenden Fraktionen werden auf Grund der Aminosäureanalyse bestimmt. Man erhält 320 mg (26 %) lyophilisiertes Material«

Rf = 0,61; R^ = 0,42; R^ = 0,75*." Aminosaureanalyse:

alu: 0,96, GIy: 0,97, Pro: 0,95, Leu: 1,00, Ser: 0,89, Tyr: 1,02, Trp: 1,88, His: 1,03.

Beispiel 4

Phe ,Gin -Gonadoliberin

beziehungsweise
<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-PiIe-GIn-PrO-GIy-NH₂ M = 1187

a) Synthese

1,25 g (l mMol) Benzhydrylaminhydrochloridkarz (0,8 mAqu./g) lä.:t man zwei Stunden lang in Dichlormethan quellen. Daraus werden auf die im Beispiel la beschriebene Weise 2,9 g des Peptidharzes<£lu-His(Tos )- -Trp-Ser(OBzl)-Tyr(OBzl)-Gly-Phe-Gln-B?o-Gay-Harz hergestellt.

Ausbeute [^W]: 1,2? _S (83%) _; M_gesch#peptid = 1521.

- 25 -

b^N| Abspalten der Schutzgruppen

Das geschützte Peptid wird auf die im Beispiel Ib) beschriebere Weise mit wasserfreiem HF behandelt. 9SO mg (82 %) ungeschütztes Peptid werden erhalten.

c) Gelfilt ration

Das rohe Decapeptidamid wird auf die im Beispiel Ic) beschriebene Weise an einer nit Sephadex G-25 gefüllten Säule mit 2m Essigsäure gereinigt. Ausbeute: 576 mg (49 %).

d) Präparative HPL-Chromatographie

Man arbeitet auf die im Beispiel Id) beschriebene Weise mit dem Unterschied, daß das Gel LRP-I mit einer 10MoL-% ifetlaanol und 20 VoL-% Essigsäure enthaltenden wä.irigen Lösung äquilibriert wird. Eluiert wird mit einem linearen Gradienten , der in 20TOl.--%-:i@er Essigsäure von 10 Ίοί,-ψο aus anstedgaad bis zu 2^ Völ.-% Methanol enthält (2x150 ml). Dann wird die Elution mit einem zwischen 25 VqLi-% und 4OVoL-% ansteigend Methanol enthaltenden linearen Gradienten (2x150 ml) fortgesetzt. Die das reine Peptid enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und eingedampft. Ausbeute: 448 mg (38 %)

R* = 0,12$ R^ = 0,7; R^ = 0,24; R^ = 0,87.

Aminosäureanalyse:

Ser 0,87, GIu 2,05, Pro 1.03, GIy 2,13,

Tyr 0,92, Phe 1,00, His 0,95 Trp 0,8l.

Schmp.: 182 ⁰C ·

Beispiel 5

Phe ,Leu -Gonadoliberin

beziehungsweise M = 1172

^Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Phe-Leu-Pro-Gly-NHg

a) Synthese

0,62 g (0,5 mMol) Benzhydrylaminhydrochloridharz Il

(0,8 mAqu./g) lälit man zwei Stunden lang in Dichlormethan quellen« Dann wird auf die im Beispiel la) beschriebene Weise das Peptidharz ^Glu-His(Tos)-Trp-

- 26 -

BAD ORIGINAL

-.^; e r ν GBz 1Ί -Ty r ( C3z 1 ^v> -C-Iv - --h ο-L c-u-B?o-G]y-Har ζ hergestellt. Ausbeute: 1,33 g
Ausbeute [/^W]: 695 mg (92%), ^_escht p_eptid) ^{= 15}°⁶'

b' 3 oh a nc-;? In mit HF

Das geschützte Peptid wird auf die im Beispiel Ib'¹ beschriebene Weise mit wasserfreiem HF behandelt, '■'an erhalt 510 mg .'87 '^) rohes Decapeptid.

c'' Gelfiltration

Das gernä.": Schritt b) erhaltene rohe Decapeptidamid wird auf die im Beispiel Ic) beschriebene Weise an einer Säule aus Sephadex G-25 mit 2 m Essigsäure gereinigt. Ausbeute: 363 mg (62 %).

d) Chromatographie an Silikagel Zur weiteren Reinigung des Peptids dient eine mit Kieselgel 60 gefüllte Säule der Mai:e 2x100 cm, die mit einem in Volumveiiiältnis 1:1:1:1 bereiteten Gemisch

ti

aus n-Butanol, Essigsäure, Wasser und- Athylacetat eluiert wird. Der Gehalt der Fraktionen wird UV-spektroskopisch sowie mittels Dünnschichtchromatographie kontrolliert. M_an erhält 299 mg (51 %) des reinen Decapeptidamids.

R^ = 0,55; R^ =0,39; R^ = 0,62; R^ = 0,73 .

Aminosäureanalyse

Ser 0,91, Glu 0,97, Pro 1,07, Gly 2,12,

Leu 1,00, Tyr 1,03, Phe 0,94, His 1,05.

Beispiel 6
D-Phe⁶,Gln⁸,desGlYMH2°-Gon,3doliberin-athylanid

beziehungsweise (M = 1198)

<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Plie-Leu-Gln-Pro-NHC₂Hc

a) BOC-His(DNP)-Trp-CMe (m = 622,52)

21,12 g (50 mMol'i BOC-His ,'DNP)-CH werden in 100 ml Dimethylformamid gelobt« Die Lösung wird auf 0 C gekühlt und unter Rühren mit 10,32 g (50 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid und 7,66 g (50 mMol) N-Hydroxybenztriazol versetzt. Das Gemisch wird bei 0 °C 10 Minuten lang gerührt, dann wird der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert.

12,74 g (50 mMol·) H-Trp-OMe.HCl werden in 70 ml Dimethylformamid gelöst, und die Lösung wird auf O C gekühlt. Man gibt 6,94 ml (50 mMol) Triathylamin zu der Lösung und filtriert nach 5minütigem Rühren das ausgeschiedene Triäthylamin-hydrochlorid ab.

Die beiden Lösungen werden vereinigt und über Nacht bei O C gerührt. Anderntags wird der ausgeschiedene DicycÜD— faggylhR-mstoEC [DCU] abfiltrjsrt mn. das !"Abrät zur (Bro&kne eingedampft. Das zurückbleibende öl wird in 500 ml Athylacetat gelöst. Die Lösung wird zuerst mit 3x100 ml eiskalter m KHSO- -Lösung, dann mit 5x100 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung und schließlich mit 2x100 ml 10 gew.-%-iger NaCl-Lösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und nach dem Filtrieren zur Trockne eingedampft. Der ölige Rückstand wird mit Petroläther verrieben, filtriert und dann getrocknet. Die erhaltene kristalline Substanz wurde in Athylacetat gelöst und mit Petroläther ausgefällt.

Ausbeute: 27,70 g (89 %).

Schmp_#: 119-122 ⁰C .

-. = +14,1 (c = 1, in Dimethylformamid).

= 0,62; R^ = 0,41 .

^f - 28 -

BAD ORIGINAL

b) H-Hio-, D\P)-Trp-Ütte.2HC1

M = 522,49 {freie Base) 595,41 (.2HCl)

24,9 g (40 mMol) des Dipeptide BOC-His(DNP)-Trp-OMe werden in 100 ml Methanol gelost. Zu der Losung werden 100 ml 4n methanolische Salzsäure zugegeben- Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 30 Minuten lang stehen gelasser,. Das in dieser Zeit auskristallisierende Dipeptidesterhydrochlorid wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und dann getrocknet,

Ausbeute: 21,91 g (92 %),

Schmp.: 198-202 ⁰C.

[cd_n = 0,49 (c = 1, in Dimethylformamid) · R^ = 0,46 ; R^ = 0,18.

c) (Glu-His(DNP) -Trp-OMe
M = 533,50

4,85 g (35,8 mMol) L-Pyroglutaminsäure, 7,58 g Dicyclohexylcarbodiimid und 5,53 g N-Hydroxybenztriazol werden in 100 ml Dimethylformamid gelost. Das Gemisch wird bei 5-10 C 10 Minuten lang gerührt und dann der ausgefallene Dicyclohexy!harnstoff [DQU] abfiltriert.

20,84 g (35 mMol) H-His(D.\P)-Trp-OMe.2HCl werden in 100 ml Dimethylformamid gelöst "und zu der Lösung werden 9,72 ml . (70 mMol) Triäthylarnin zugegebai. Nach 5rninütigem Rühren wird das ausgeschiedene Triäthylaminhydrochlorid abfiltriert. Die beiden Lösungen werden vereinigt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anderntags wird das Gemisch mit 90 ml Aceton versetzt, die sich ausscheidende unlösliche Substanz wird abfiltriert. Das Filtrat wird eingedampft. Das zurückbleibende öl wird mit Athylacetat verrieben und dann getrocknet. Die trockene kristalline Substanz wird mit 3x25 ml Wasser gewaschen und erneut getrocknet« Die Substanz kann durch kochendes Il

Lösen in Athylacetat und Abkühlen der Lösung umkristallisiert werden.

Ausbeute: 18,42 g (83,1%)·
Schmp.: 148-151 ⁰C.

pj = *5,2 (c = 1, in Dimethylformamid) .

= 0,53; R^ = 0,38. - 29 -

d) <Glu-His-Trp-OMe
M = 466 ,50

15,84 g des geschützten Tnpep tids (Glu-His(DNP) Trp-OMe werden in einem Genisch aus 100 ml Dimethylformamid und 40 ml W_asser gelöst. Die Lösung wird mit 4 ml Mercaptoäthanol versetzt und dann mit Triethylamin auf pH 8 eingestellt» Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 30 Minuten lang stehengelassen und dann im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der ölige Rückstand Il

wird mit Äther verrieben, filtriert und getrocknet. Die erhaltene Substanz wird in wenig Methanol gelöst

■ I

und durch Zusatz von Äther ausgefällt. Die Kristalle werden abfiltriert und getrocknet.

Ausbeute: 10,92 g (93,6 %)

Schmp_e : 228-232 °C

Ccd_n = +4,04 (c = 0,42, in Dimethylformamid)

2
R^ = 0,30

e) <fGlu-His-Trp-N ₂H₃

M = 466,51 .. ~ .

9,33 g (20 mMol) des Tripeptide (Glu-His-Trp-OMe werden in 250 ml Methanol gelöst und zu der Lösung werden 2OmL 98vol.r-i&äges Ifrdrazinhj&iiat zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 3 Stunden lang bei 40 C, dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anderntags wird die ausgeschiedene Substanz abfiltriert, nit kaltem Methanol gewaschen und dann getrocknet.

Ausbeute: 7,58 g (81,2 %)
" Schmp.: 166-169 °C

[cd_D = -22,3° (c = 0,5, in Dimethylformamid)

R* = 0,50 ; Rj _s 0,14.

f) (Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OMe

M = 716,8

7,0 g (15 mMol)<Glu-His-TTp-N₂H₃ (Produkt des Schrittes e) werden in 50 ml Dimethylformamid gelöst· Die Lösung wird auf O C gekühlt und unter Rühren mit 7,5 ml (45 mMol) 6n HCl versetzt. Dann tropft man langsam die gesättigte wäßrige Lösung von

- 30 -

BAD

1,035 g (l5 mMol) N3NO- zu den Gemisch und rührt weitere 15 Minuten bei O C. Dann versetzt man das Gemisch mit der Lösung von 4,78 g (15 mMol) H-Ser-Tyr-OMe .HCl in 15 ml Dimethylformamid und stellt den pH-Wert mit 6,25 ml (45 mMol) Triethylamin auf neut rai.eiü* Das Gemisch wird über Nacht bei 0-4 C gerührt, anderntags im Vakuum zur Trockne eingedampft und der ölige Rückstand wird mit Äther verrieben«

Das Gewicht des pulverförmigen Produktes betragt 12,1 g (lOO %). ^Das Chromatogramm zeigt Flecken von zwei geringfügigen Verunreinigungen, jedoch kann das Produkt ohne zwischenzeitliche Reinigung zum Hydrazid umgesetzt werden, welches gut kristallisiert. Physikalische Daten der zur Kontrolle aus Methanol umkristallisierten Substanz:

Schmp. : 188-190 ⁰C .

CcdQ = -3,48 (c = 1, Dimethylformamid).

R* = 0,58; R^ = 0,26.

g) <Glu-His-Trp-5er-Tyr-N₂ H

M = 716,8

12 g des rohen, pulverisierten Pentapeptidesters (Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OMe werden in 200 ml Methanol gelöst und zu der Lösung 10 ml 98 Tol«-%-iges Efräraziiihyclrat zugegeben. Das Gemisch wird bei 40 C drei Stunden lang und dann über N_acht bei Raumtemperatur gerührt, die ausgefallenen Kristalle werden abfiltriert und im Exsikkator über konzentrierter Schwefelsäure getrocknet. Die getrocknete kristalline Substanz wird in 250 ml 0,5 η HCl gelöst, die Lösung mit konzentrierter Sodalösung auf pH 8 eingestellt υη& bei 0 ⁰C zwei Stunden lang stehen gelassen. Die ausgefallenen Kristalle werden abfiltriert, mit eiskaltem W_asser gewaschen und dann getrocknet.

Ausbeute: 6,12 g (auf beide Schritte bezogen 56,9 %)-Schmp. : 205-206 ⁰C .

[cd!:² =-21,51° (c = 1, Dimethylformamid).

- 51 -

_ 31 -

R-J = O , 39 ; R^ = O , 14 .

Hydrazinstickstoff: berechnet: 3,91 %

gefunden: .3,79 %, 3,76 %.

h) Z-G] η-Pro-!

M = 4-05,4
3,242 g Prolinathylamid (hergestellt aus 22,8 mMol

pHf- durch Hydrieren) werden in 70 rnl Tetrahydrofuran gelöst und zu der Lösung 5,60 g (20 mMol) Z-Gln-OH und 1,034 g N-Hydroxybenzt_Piazol zugegeben. Bas Reaktionsgemisch wird auf dem Eisbad gekühlt und unter Rühren mit der Lösung von 5,34 g (25,9 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in 50 ml Tetrahydrofuran versetzt. °a^s Reaktionsgemisch wird auf dem Eisbad 5 Stunden lang, dann bei R_aumtemperatur noch 20 Stunden lang gerührt, filtriert und das Filter mit Tetrahydrofuran nachge-*· waschen. Das Filtrat wird im Vakuum eingedampft und der Rückstand in Chloroform gelöst. Die Lösung wird mit 3x35 ml mit der fünffachen Menge W_as~ser verdünntem Ammoniak, dann mit 2x20 ml Wasser , anschließend mit 3x35 ml Salzsäure und schliei31ich erneut mit 2x20 ml Wasser gewaschen. Dann wird die organische Phase über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filter wird mit Chloroform nachgewaschen. Dann wird die Lösung zur Trockne eingedampft. Der ölige Rückstand wird in einem Gemisch aus 35 ml Tetrahydrofuran und 50 ml

Athylacetat gelöst und die Lösung filtriert. Nach Abdampfen des Lösungsmittels bleibt ein Ol zurück, das mit 100 ml Äther kristallisiert wird. Die feste Sub-

•ι

stanz wird auf dem Filter mit Äther gewaschen und dann im Vakuum getrocknet. Man erhält 7,68 g (95 %) Produkt. R^ = 0,45 ; R* = 0,73.

l) Z-Leu-Gln-PrQ-

M = 518,57

4,5 g (il mMol) des geschützten Dipeptidamids Z-GIn-PrO-NHC₂H₅werden in 30 ml Eisessig gelöst. Zu der

BAD ORIGINAL

Lösung werden 55 ml 4n eisesäigsaure Bromwassers to f f s aure zugegeben. Das ReaktionsgoniGch wird bei Raumtemperatur li Stunden lang stehen gelassen, dann mit 250 ml Äther versetzt und wieder eine Gt undo stehen gelassen. Die über dem Niederschlag jtehends Flüssigkeit wird dekantiert, der Ruckstand nit 100 "1 Äther aufgeschlammt , noch 15 Minuten abfiltriert und reichlich mit Äther gewaschen. Die hygroskopische feste Substanz wird im Vakuum über Phosphorpentoxyd und Natriumhydroxyd getrocknet. Ausbeute: 4,9 g (hygroskopisch).

3,8 g (11 mMol) des erhaltenen Dipeptidäthylamidhydrobromids werden in 150 ml Chloroform suspendiert. Zu der Suspension werden 7,0 ml Triäthylamin zugegeben. Dann wird das Reaktionsgemisch mit der Lösung von 6,4 g Z-Leu-pentachlorphenylester in 65 ml Chloroform versetzt und über N_acht gerührt. Anderntags wird das Reaktionsgemisch mit η Salzsaure, gesättigter Kochsalzlösung, 2n Ammoniak und schließlich wieder mit"gesättigter Kochsalzlösung extrahiert. Die organische 'Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann im Vakuum

Il

eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther verrieben, die

It

Festsubstanz abfiltriert, mit Äther gewaschen und dann im Vakuum getrocknet. Man erhält 4,6 g (si %) Rohprodukt.

j) H-Leu-Gln-Pro-flHCpH^.HBr

M = 465,5

Von dem auf die unter Punkt i) beschriebene Weise

hergestellten Tripeptid Z-Leu-Gln-Pro-NHGpH,- wird die Schutzgruppe ohne zwischenzeitliche Reinigung entfernt. Zu diesem Zweck wird das Produkt in 10 ml 4 η eise S3 ig saurer Bromwasserstofflösung gelöst. Die Lösung wird bei Raumtemperatur eine Stunde lang gerührt und dann das Produkt

If

durch Zusatz von 100 ml wasserfreiem Äther ausgefällt« Die Substanz wird abfiltriert und im Exsikkator getrocknet. Das Produkt ist ein gelbes hygroskopisches Pulver.

- 33 -

BAD ORIGINAL

Ausbeute: 3,54 g C 75 /,)

R^ = 0,42; R^ = C, 13; ^- = C . 55 ; R* = 0 ,1 .

_k) BOC-D-Phe-Leu-Gln-Pro-

M = 631,74

2,33 g (5 mMol^ des Tripeptldhydr^chlorids H-Leu-Gln-

•Pro-NHCpHc.HBriserden in 5 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 0 C gekühlt und zuerst mit 0,70 ml (0,5 mMol) Triäthylamin und dann mit der Lösung von 2,57 ml (5 mMol) BOC-D-Phe-pentachlorphenylester in 10 ml Dimethylformamid versetzt. Der pH-Wert der Lösung wird mit Trimethylamin auf 7 bis 8 gestellt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 48 Stunden lang gerührt. Während dieser Zeit wird der pH-Wert mit Triäthylamin auf dem angegebenen Wert gehalten. Dann wird die Lösung im Vakuum eingedampft, der Rückstand wird in 100 ml Chloroform gelöst und die Lösung mit ICxIO ml 0,1m Ammoniak gewaschen. Dann wird die orgarische Phase über Natriumsulfat getrocknet, abfiltriert und eingedampft. Der ölige Rückstand kann durch Behandeln mit Äther in ein Pulver überführt werden. Das getrocknete Rohprodukt wiegt 2,81 g (89 %). Die Schutzgruppe wird ohne weitere Reinigung entfernt.

1) H-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NH

M = 64-5,65

1,26 g (2 mMol) des Tetrapeptids BOC-D-Phe-Leu-Gln-

NHC₂H^ wen&m in 10 ml Trifluoressigsäire (TFA) gelöst. Die Lösung wird bei Raumtemperatur 20 Minuten lang gerührt. Die Trifluoressigsäure wird dann im Vakuum schnell entfernt. Der Rückstand wird an einer Silikagelsäule mit einem im Volumverhältnis 4:1:1 bereiteten Gemisch aus n-Butanol. Essigsäure und Wasser chromatographiert. Die Produktfraktionen werden gesammelt und im vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in wenig Wasser gelöst und dann lyophilisiert.

Ausbeute: 880 mg (68 %) R² _f = 0,25; R^ = 0,35.

Schmp. : 142 °C; Coc]^° = -66° (c = 0,1, Dimethylformamid).

- 34 BAD ORIGINAL

m^ <Glu-His-Trp-ber-Ty r-D-Phe-Lcu--.:'ln-Pro-';HC₀H_c

i d~^

M = 1199

286 g (0,4 mMol) des gema.: Schriet g hergestellten Pentapeptidhydrazids <(Glu-His-Trp-Ser-Ty r-N^H
werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Die Losung
wird auf -10 ⁰C gekühlt und unter Rühren mit 0,27 ml 6n Salzsäure und dann mit der gesattigten wäßrigen
Lösung von 30,2 mg NaTJO₉ versetzt. Nach 5 Minuten gibt nan die mit einem Gemisch aus 1 nl Dimethylformamid und 0,27 ml Triathylamin bereitete und auf -10 °C
gekühlte Lösung vor. 258 mg (0,4 mMol) H-D-Phe-Leu-Gln- -Pro-NHG-,Η,-. TPA zu dem Gemisch zu. Das ReakticsiBgemiscli wird eine Stunde lang bei -5 C, dann eine weitere Stunde
lang bei O C gerührt, wobei der pH-Wert erforderlbhenfeHs durch Zusatz von Triathylamin neutral

gehalten wird. Schließlich läßt man die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen und dampft das Reaktiorsgemisch im Vakuum ein.

Das nach dem Verdampfen erhaltene-01- wird in 5 ml 0,2n Essigsaure gelöst Und an einer Säule aus Sepradex G25 (2x95 cm) mit 0,2n Essigsäure chromatographiert. Die entsprechenden Fraktionen werden gesammelt und lyophili sia?b.

Ausbeute: 298 mg (62 %)

R* = 0,74; R^ = 0,65; R^ = 0,37; R ^ = O , 80 .

Aminosäurenanalyse

Ser 0,89, Pro 0,97, Leu 1,00, Phe 0,99,

GIu 1,98, His 1.01, Tyr 1,03, Trp 0.91.

Beispiel 7

Trp ,Gin ,desGly -Gonadoliberinäthylamid

beziehungsweise
(GIu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Gln-Prο-NHC₂Hc

M = 1220

a) BOC-GIn-PrO-NK^H₁-M = 370

1,0 g (7 mMol) Prolinäthylamid wird in 15 ml Dimethylformamid gelöst. Der pH-Wert der Lösung wird mit

- 35 -

Triäthylamin auf 8 eingestellt. Zu der Lösung wird die Lösung von 3,2 g (8,4 mMol^ tert.-Butoxycarbonyl-glutaminyl-p-nitrophenylester in 15 ml Dimethylformamid zugegeben. DL.3 Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 48 Stunden lang gerührt. Wahrend dieser Zeit wird der pH-Wert mit Triäthylamin auf 8 gehalten. Der nach dem Eindampfen des Reaktionsgemisches verbleibende ölige Ruckstand wird in Wasser gelöst, die Lösung mit Äther gewaschen und die wä.:rige Phase im Vakuum eingedampft. Ausbeute: 1,93 g (74.5 %) .
R^ = 0,76.

b) H-GIn-Pro-NHCpHn·TFA

M -- 270 (freie Base) M = 367 (TFA-SaIz)

1,9 g (7,2 mMol) BOC-GIn-PrO-NHG₂Hc weiden. Jn 1OmI Trifluoressigsäure gelöst. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 20 Minuten lang gerührt und dann im Vakuum

Il

eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther verrieben, abfiltriert und in Vakuum getrocknet. Ausbeute: 1.52 g (58 56) .

R* = 0,45; R^ = 0,45; R^ = 0,25; ' R^° = 0,30. Die Substanz ist hygroskopisch.
⁰ = -34,8° (c = 1, Methanol).

C) BOC-Trp-Gl PrO-N

M = 557

500 mg (1,85 mMol) H-GIn-PrO-NHC₂H₅. TFA warden Jn 10 ml Dimethylformamid gelöst. Der pH-Wert wird mit Triathylmin auf 8 eingestellt. Zu dem Reaktionsgemisch gibt man 608 g (2 mMol) tert.-Butoxycarbonyl-tryptophan in 10 ml Dimethylformamid und 620_/ul (4 mMol) N,N'-DiisopropylcarbodiMd.zu« D_as Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 48 Stunden lang gerührt und dann im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in Athylacetat gelöst und mit

Äther ausgefällt. Das ausgefallene Produkt wird abfil-

It

triert, mit Äther gewaschen und dann getrocknet.

Ausbeute: 740 mg (72 %).

Rf = 0,75; R^ = 0,38. - 36 -

BAD ORIGINAL

dl H-Trp-Gln-Pro^HCgHg.TFA

M = 456,5 (freie Base)' M = 554 (TFA-SaIz) 700 mg (1,25 mMol) OOC-Trp-Gln-Pro-^jHCpH,- werden in 15mleine3 im Volucwerhältnis 1:1 bereiteten Gemisches aus Trifluoressigsäure und Oichlormethan gelöst. Die Lösung wird' bei Raumtemperatur 20 Minuten lang gerührt und anschließend im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird

mit Äther verrieben, abfiltriert und getrocknet. Das Rohprodukt (500 mg") /vird an einer "ilikagelsäule mit einem im Volumverhältnis 47:20:6:11 bereiteten Gemisch aus Athylacetat, Pyridin, Essigsäure und Wasser chromatographisch gereinigt. Die Produktfraktionen werden gesammelt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther verrieben. Man erhält 360 mg (52 %) eines weißen Pulvers.
R^ = 0,46; R? = 0,18.
Schmp.: 119-123 C; Ccd^⁰ = -4,8° (c = 0,1, 0,ln HCl).

e) BOC-Gly-Trp-Gln-Pro-NHCgHc;

M = 613,7

350 mg (0,76 mMol) H-Trp-Gln-Pro-'-HCpH,-.TFA werden in

Dimethylformamid gelöst und mit 104 mg ■> 0,8 mMol) BOC-Gly auf die im Schritt c) beschriebene Weise gekuppelt.

Man erhält 375 mg (81 %) einer kristallinen Substanz.

Rf = 0.88; R^ = 0,82; R^ = 0,61.

f) H-Gly-Trp-Gln-Pro-NHC ₂Hc;.TFA R = 609,6

375 mg (0,6 mMol) BOC-Gly-Trp-Gln-Pro-NHCgH^ werden auf die im Schritt d) beschriebene Weise von der Schutzgruppe befreit und gereinigt. M_an erhält 285 mg (76,6 %) eines weißen Pulvers.
Rf = 0,08; R^ = 0,16; Rf = 0.67; R_f = 0,28.

g)<G Iu-His-T rp-Ser-Ty T-GIy-TrP-GIn-PrO-NHC ₀Hc; M = 1216,4

286 g (0,4 mMol) des wie im Beispiel 6, Schritt g, hergestellten Pentapeptidhydrazids <Glu-His-Trp-

- 37 -

BAD ORIGINAL

-Ser-TyΓ-'JpH werden mit 243,3 mg (0,4 "Mol¹ des gemäß Schritt m) des Beispiels 6 erhaltenen H-Gly-Trp-Gln-Pro- -NHC₂H^.TFA gekuppelt. Man erhält 252,9 mg (52%) Reinsubstanz.

R^ = 0,26; R^ = 0,32.

Aminosäurenanalyse'

Ser 0,87, GIu 2,02, fro 0,91. Clv 1,CO , Tyr 1,12, His 1,05, ~rp I₁SC.

Beispiel 8

Bereiten von Inoektionslösungen für intramuskuläre, subkutane oder intravenöse Verabreichung.

a) Das Gonadoliberinderivat der allgemeinen Formel I, beispielsweise das des Beispieles 1, wird in einer Konzentration von 1 bis 10 mg/ml in destilliertem Wasser, physiologischer Natriumchloridlösung oder gepufferter wäßriger Lösung gelöst. Die Lösung wird steril filtriert und dann in 50 bis 500 ug Wirkstoff enthaltenden Volumina in Ampullen gefüllt und lyophilisiert, worauf die Ampullen verschlossen werden.

Die Anwendung kann wie folgt erfolgen.

Vor der Anwendung wird die in der Ampulle enthaltene Substanz in 1 bis 10 ml destilliertem V/asser gelöst und von der Lösung wird eine der notwendigen Dosis entsprechende Menge injiziert.

b) Aus dem Gonadoliberinderivat der allgemeinen Formel I, beispielsweise dem des Beispieles 1, wird mit einer 0,9 Gew.-% NaGl und 0,9 Gew.-% Benzylalkohol enthaltenden wäßrigen Lösung eine Lösung mit einer Konzentration von 20 bis 500 ug/ml bereitet und diese wird in Ampullen gefüllt. Die Ampullen

- 38 -

BAD ORIGINAL

-ίο-

werden verschlossen. Die auf diese Weise hergestellten Präparate sind zur unmittelbaren Verabreichung geeignet.

Zusammenfassung

Claims

Patentansprüche
Λ,^ Gonadoliberinderivate der allgemeinen Formel

2 3 4 5678 9 10 <Glu-His-Trp-Ser-Tyr-X₁-X₂-X₅-

worin

für einen Rest von L-Pyroglutaminsäure steht,

His einen Rest von L-Histidin bedeutet, . '

Trp einen Rest von L-Tryptophan darstellt,

Ser für einen Rest von L-Serin steht, Tyr einen Rest von L-Tyrosin bedeutet,

X_x. einen Rest von Glykokoll oder einer natürlichen oder synthetischen D-Aminosäure darstellt,

Xo für einen Rest von L-Phenylalanin

oder L-Tryptophan oder einer L-Aminosäure mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen) in der Seitenkette steht,

Pro

einen als Seitenkette einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatom(en) oder einen CarboxyäLkylamid- oder Carboxamidoalkylrest mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen aufweisenden Rest einer L-Aminosäure bedeutet,

für einen Rest von L-Prolin steht und

einen Rest von Glycinamid oder einen Alkylamidrest mit 1 bis 4 Kohlenstoff atom(en) bedeutet,

mit der weiteren Maßgabe,

im Falle daß

für einen Rest
einer natürlichen
oder

synthetischen
D-Aminosäure
steht und

einen Rest von

L-Tryptophan

bedeutet,

von einem Rest von L-Leucin verschieden ist,

sowie ihre Säureadditionssalze und Komplexe.

2.) Gonadoliberinderivate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Rest einer natürlichen oder synthetischen D-Aminosäure, für den X^ stehen kann, einer von D-Phenylalanin, D-Tyrosin oder D-DiJodtyrosin oder von einer solchen mit einer Seitenkette mit 1 bis 4 Kohlenstoffatom(en) ist.

3.) Gonadoliberinderivate nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Rest einer L-Aminosäure, für den X₂ stehen kann, ein solcher mit 3 oder 4, insbesondere 4, Kohlenstoffatomen in der Seitenkette ist.

4.) Gonadoliberinderivate nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Rest einer L-Aminosäure, für den Xp stehen kann, einer von L-Leucin, L-Isoleucin, L-Norleucin, L-Norvalin, L-Valin oder L-Methionin ist.

5.) Gonadoliberinderivate nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Rest einer als Seitenkette einen Alkyl-, Carbaxyalkylanid.-- oder Carboxamidoalkylrest aufweisenden L-Aminosäure, für welchen X, stehen kann, ein solcher, dessen Seitenkette 3 oder 4 Kohlenstoffatome aufweist, ist.

6.) Gonadoliberinderivate nach Anspruch 1 bis 5i dadurch gekennzeichnet, daß der Rest einer als Seitenkette einen Alkyl-, Carbcoyalkylamid- oder Carboxamidoalkylrest aufweisenden L-Aminosäure, für welchen X, stehen kann, ein Rest von L-Leucin, L-Glutamin, L-Glutaminsäure, L-Isoleucin, L-Norleucin, L-Norvalin oder L-Valin ist.

7.) Gonadoliberinderivate nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkylamidrest, für den X^ stehen kann, ein solcher mit 1 oder 2, insbesondere 2,

Kohlenstoffatom(en) ist.

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8.) <Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-Gly-NH₂ sowie seine Säureadditionssalze und Komplexe.

9.) <Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Gln-Pro-Gly-NH₂ sowie seine Säureadditionssalze und Komplexe.

10.) <Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Leu-Pro-NHC₂H₅ sowie seine Säureadditionssalze und Komplexe.

11.) <(Glu-His-Trp-Ser~Tyr-Gly-Phe-Gln-Pro-Gly-NH₂ sowie seine Säureadditionssalze und Komplexe.

12.) </GIu-Hi s-Trp-Ser-Tyr-Gly-Phe-Leu-Pr 0-GIy-NH₂ sowie seine Säureadditionssalze und Komplexe.

15.) <'Glu-His-Trp-Ser-Tyr~D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHC₂H₅ sowie seine Säureadditionssalze und Komplexe.

14.) (Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Gln-Pr0-₅ sowie seine Säureadditionssalze und Komplexe.

15.) Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) unter Anwendung der Peptidsynthese in der festen Phase die entsprechend geschützten Aminosäuren schrittweise in der gewünschten Reihenfolge durch Kuppeln mit Carbodiimid oder über einen aktiven Ester an einem festen Träger fixiert und gegebenenfalls das Peptidprodukt durch saures oder basisches Abspalten vom Träger ablöst und gegebenenfalls außerdem die Schutzgruppe(n) vor, während oder nach dem Abspalten vom Träger ebenfalls abspaltet oder

b) je nach dem chemischen Charakter der variablen Aminosäureteile in der herzustellenden Verbindung das Endprodukt aus in gewünschtem Maße geschützten Aminosäuren durch entsprechende Kombinationen von schrittweiser Kondensation und Fragmentkondensation aufbaut,

worauf man gegebenenfalls in an sirh bekannter Weise die erhalterm Gonadoliberinderivate der allgemeinen !Formel I in Säureadditionssalze oder Komplexe überführt beziehungsweise . aus den erhaltenen Säureadditionssalzen die freien Gonadoliberinderivatbasen freisetzt und/oder sie in andere Salze überführt.

16.) Verfahren nach Anspruch 14a), dadurch gekennzeichnet, daß man als festen Träger ein Benzhydrylaminharz oder ein Polystyrol/Divinylbenzol-Harz mit angekuppeltem BOC-Prolin verwendet.

17.) Verfahren nach Anspruch 14a) oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß man das Ablösen des geschützten Peptidproduktes vom Träger durch Behandeln mit Fluorwasserstoff und/oder durch Äthylammonolyse durchführt.

18.) Verfahren nach Anspruch 14b), dadurch gekennzeichnet, daß man das Pentapeptidazid der Formel

<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-N₅

mit einem Tetra- oder Pentapeptid der allgemeinen Formel

X₁-X₂-X₅-PrO-X₄ III

COPY

worin Xxj , Xp » Χχ und ^Χ4 cLie in den Ansprüchen 1 bis 7 angegebenen Bedeutungen haben, kondensiert.

19·) Verfahren nach Anspruch 14b), dadurch gekennzeichnet, daß man ein Hexapeptidazid der allgemeinen Formel

^Glu-His-Trp-Ser-Tyr-X^-N, IV ,

worin X,- die im Anspruch 1 oder 2 angegebenen Bedeutungen hat, mit einem Tri- oder Tetrapeptid der allgemeinen Formel

X₂-X₃-PrO-X₄ V ,

worin X^ , X? und X₄ die in den Ansprüchen 1 oder 5 bis 7 angegebenen Bedeutungen hat, kondensiert.

20.) Verfahren nach Anspruch 14b), dadurch gekennzeichnet, daß man ein Heptapeptidazid-der" allgemeinen Formel

<Glu-Hi s-Trp-Ser-OSjrr-X,, -X₅-N₅ VI ,

worin X_x, und Xp die in den Ansprüchen 1 bis 4 angegebenen Bedeutungen haben, mit einem Di- oder Tripeptid der allgemeinen Formel

X₅-PrO-X₄ VTI ,

worin X, und X₄ die in den Ansprüchen 1 oder 5 bis 7 angegebenen Bedeutungen haben, kondensiert.

21.) Arzneimittel beziehungsweise pharmazeutische Präparate, gekennzeichnet durch einen Gehalt an 1 oder mehr Verbindung(en) nach Anspruch 1 bis 14 als Wirkstoff (en), gegebenenfalls zusammen mit 1 oder mehr üblichen pharmazeutischen Konfektionierungsmittel(n).

Beschreibung