DE3446997A1 - Gonadoliberinderivate, verfahren zu ihrer herstellung und diese verbindungen enthaltende arzneimittel beziehungsweise pharmazeutische praeparate - Google Patents
Gonadoliberinderivate, verfahren zu ihrer herstellung und diese verbindungen enthaltende arzneimittel beziehungsweise pharmazeutische praeparateInfo
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(BLZ 700 515 40)
(VIA Bayerische Landesbank
P 2 106
Patentansprüche und Beschreibung zur Patentanmeldung
KÖZFONTI VALTO- ES HITELBANK RT,
Budapest, Ungarn
betreffend
Gonadoliberinderivate, Verfahren zu ihrer
Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel beziehungsweise pharmazeutische Präparate
COPY
Lie Erfindung betrifft neue Gonadoliberinderivate einschließlich ihrer Salze und Komplexe, ein Verfahren zu
ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel, beziehungsweise pharmazeutische Präparate, insbesondere
Sexualhormone, beispielsweise zur Verwendung bei der Vermehrung von Fischen.
Das Gonadoliberin @.m Fachschrifttum auch als gonadotropes
Hormon [gonadotropin releasing hormon]; Gn-EH, Iuteinisierendes
und follikelstimulierendes Hormon, freisetzendes Hormon [releasing hormon] und LH/FSH-RH bezeichnet)
und seine bekannten Derivate haben die allgemeine Eigenschaft, das luteinisierende und follikelstimulierende
Hormon (LH und FSH) freisetzen zu können.
Zu Beginn der achtziger Jahre wurde bekannt, daß sich die Struktur des Gonadoliberins mancher Fische von der
Struktur des Gonadoliberines der Säugetiere unterscheidet (J. A. King und R. P. Millar, J. Biol. Chem. 2J>7 [1982],
10 722 bis 10 728; South-African Journal of Science 78 [1982], 124; N. Sherwood und Mitarbeiter, Proc. Natl. Acad
Sei. 80 [1983], 2 794 bis 2 798). Dieser Unterschied wird
von der in der 7- beziehungsweise 8-Stellung befindlichen
Aminosäure verursacht.
ii'erner ist es aus dem Schrifttum bekannt, daß die statt
des Restes von Glykokoll in der 6-^tellung Reste von bestimmten
D-Aminosäuren aufweisenden Gonadoliberinderivate eine stärkere Wirkung als das Gonadoliberin selbst haben
(J. Sandow und Mitarbeiter: Control of Ovulation, Butterworth, London 1978, Seiten 49 bis 70).
Weiterhin ist es bekannt, daß durch Austausch des Glycin
amidrestes in der 10-Stellung gegen Amidreste mit aliphatischen
Ketten die biologische Wirksamkeit des Gonadoliberines
weiter erhöht werden kann (M. Fujino und Mitarbeiter,
J. Med. Chem. 16 [1975], 1 144 bis 1 147).
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Gonadoliberinderivate
mit überlegenen pharmakologischen Wirkungen, insbesondere Sexualhormonwirkungen, und dabei auch
Derivate der Grundverbindungen mit noch vorteilhafteren
biologischen Wirkungen, ein Verfahren zur Herstellung derselben und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel zu
schaffen.
Das Obige wurde überraschenderweise durch die Erfindung erreicht.
Die Erfindung beruht auf der überraschenden Feststellung,
daß durch Austausch der in der beziehungsweise den 7- und/oder 8-Stellung(en) befindlichen Aminosäurereste des
Gonadoliberines beziehungsweise durch Kombinationen dieses Austausches sich Gonadoliberinderivate mit überlegenen pharmakologischen
Wirkungen, insbesondere Sexualhormonwirkungen, beispielsweise die Vermehrung von Fischen betreffend, ergeben.
Ferner beruht die Erfindung auf der überraschenden Feststellung, daß die biologische Wirksamkeit der durch
Austausch der in der beziehungsweise den 7- und/oder 8-Stellung(en)
befindlichen Reste von Aminosäuren des Gonadoliberines sich ergebenden Gonadoliberinderivate durch Austausch
des Restes von Glykokoll in der 6-Stellung gegen bestimmte D-Aminosäuren und/oder des Glycinamidrestes in der
10-Stellung gegen Alkylamidreste noch erhöht werden kann.
- 10 GOPY
- 3448997
Gegenstand der Erfindung sind daher Gonadoliberinderivate der allgemeinen Formel
2 3 4 5678 9 10 <Glu-His-Trp-Ser-Tyr-X1-X2-X5-PrO-X4
<(Glu für einen Rest von L-Pyroglutaminsäure
steht,
His einen Rest von L-Histidin bedeutet,
Trp einen Rest von L-Tryptophan darstellt,
Ser für einen Rest von L-Serin steht, Tyr einen Rest von L-Tyrosin bedeutet,
X. einen Rest von Glykokoll(Glycin) oder einer
natürlichen oder synthetischen D-Aminosäure darstellt,
Xp für einen Rest von L-Phenylalanin
oder L-Tryptophan oder einer L-Aminosäure
mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen) in der Seitenkette steht,
- 11 -
einen als Seitenkette einen Alkylrest mit.1 bis 4 Kohlenstoffatom (on)
oder einen Carboxy alkyl amid- oder Carboxamidoalkylrest mit 2 bis 4
Kohlenstoffatomen aufweisenden Rest einer L-Aminosäure bedeutet,
Pro
für einen Rest von L-Prolin steht und
einen Rest von Glycinamid oder einen Alkylamidrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen)
bedeutet,
mit der weiteren Maßgabe, daß im Falle daß
Iy. für einen Rest
einer natürlichen
oder
oder
synthetischen D-Aminosäure
steht und
steht und
Tp einen Rest von L-Tryptophan
bedeutet,
bedeutet,
X, von einem Rest von L-Leucin verschieden
ist,
sowie ihre Säureadditionssalze und Komplexe.
- 12 -
Bei den erfindimgsgemäßen Gonadoliberinderivaten handelt
es sich also um Nonapeptid-C. , . .-alkylamide beziehungsweise
Decapeptidamide.
Die in diesem Text verwendeten Symbole entsprechen der in der Peptidchemie üblichen Nomenklatur (siehe zum Beispiel
J. Biol. Chem. 241 [1966], 527).
Vorzugsweise ist der Rest einer natürlichen oder synthetischen D-Aminosäure, für den X- stehen kann, einer von
D-Phenylalanin, D-Tyrosin oder D-Dijodtyrosin, ganz besonders
des ersteren, oder von einer solchen mit einer Seitenkette mit 1 bis 4, insbesondere 3 oder 4, Kohlenstoffatom(en).
Ferner ist es bevorzugt, daß der Rest einer L-Aminosäure,
für den Xp stehen kann, ein solcher mit 3 oder 4, insbesondere 4, Kohlenstoffatomen iff der Seitenkette ist.
Dabei ist es besonders bevorzugt, daß'der Rest einer L-Aminosäure,
für den X^ stehen kann, einer von L-Leucin, L-Isoleucin,
L-Norleucin, L-Norvalin, L-Valin oder L-Methionin,
ganz besonders des ersteren, ist.
Weiterhin ist es bevorzugt, daß der Rest einer als Seitenkette einen Alkyl-, Carboxyalk^amid- oder Carboxamidoalkylrest
aufweisenden L-Aminosäure, für welchen X, stehen
kann, ein solcher, dessen Seitenkette 3 oder 4 Kohlenstoffatome
aufweist, ist. Dabei ist besonders bevorzugt der Rest einer als Seitenkette einen Alkyl-, Carbaxyalksäamid- oder Carboxamidoalkylrest
aufweisenden L-Aminosäure, für welchen X5. stehen kann, ein Rest von L-Leucin, L-Glutamin, L-GIutaminsäure,
L-Isoleucin, L-Norleucin, L-Norvalin oder L-Valin,
ganz besonders eines der ersten beiden. Weitere Beispiele sind Reste von L-Asparagin und L-Asparaginsäure.
- 13 -
Außerdem ist es bevorzugt, daß der Alkylamidrest, für
den X^ stehen kann, ein solcher mit 1 oder 2, insbesondere 2,
Kohlenstoffatom(en) ist.
Zweckmäßig sind die Säureadditionssalze der erfindungsgemäßen Gonadoliberinderivate solche mit pharmazeutisch beziehungsweise
physiologisch brauchbaren Säuren.
Vorteilhaft sind die Komplexe der erfindungsgemäßen
Gonadoliberinderivate Metallkomplexe.
Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Gonadoliberinderivate sind ^Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-Gly-irr^ ,
<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Gln-Pr0-GIy-NH2 ,
^lu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Leu-Pro-NHC^^ ,
<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-RIe-GIn-FrO-GIy-NH2 ,
</GIu-Hi s-Trp-Ser-Tyr-Gly-Phe-Leu-Pro-Gly-NH2 ,
^Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-^TiC^c, und
^Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Gln-Pr0-NHC2H^ sowie ihre
Säureadditionssalze und Komplexe.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen, welches
dadurch gekennzeichnet ist, daß
a) unter Anwendung der Peptidsynthese in der festen
Phase die entsprechend geschützten Aminosäuren schrittweise in der gewünschten Reihenfolge durch
Kuppeln mit Carbodiimid oder über einen aktiven Ester an einem festen Träger fixiert werden und
gegebenenfalls das Peptidprodukt durch saures oder basisches Abspalten vom Träger abgelöst und
gegebenenfalls außerdem die Schutzgruppe(n) vor,
COPY
während oder nach dem Abspalten vom Träger ebenfalls
abgespalten wird beziehungsweise werden
oder
b) $e nach dem chemischen Charakter der variablen
Aminosäureteile in der herzustellenden Verbindung das Endprodukt aus in gewünschtem Maße geschützten
Aminosäuren durch entsprechende Kombinationen von schrittweiser Kondensation und Fragmentkondensation
aufgebaut wird,
vrorauf gegebenenfalls ±l ai sih bekannter Weis© die erhaltenen Gonado
liberinderivate der allgemeinen Formel I in Säureadditions salze oder Komplexe überführt beziehungsweise aus den erhaltenen
Säureadditionssalzen die freien Gonadoliberinderi vatbasen freigesetzt und/oder sie in andere Salze überführt
werden.
Zweckmäßig wird bei der Variante a) des erfindungsgemäßen
Verfahrens als fester Träger ein Benzhydrylaminharz
oder ein Polystyrol/Divinylbenzol-Harz mit angekuppeltem
BOC-Prolin verwendet.
Ferner ist es bei der Variante a) des erfindungsgemäßen
Verfahrens vorteilhaft, das Ablösen des geschützten Peptidproduktes vom Träger durch Behandeln mit Fluorwasserstoff
und/oder durch ithylammonolyse durchzuführen.
Nach einer vorteilhaften Ausführungsform der Variante
b) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Pentapeptidazid
der Formel
<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-N3 II
- 15 -
mit einem Tetra- oder Pentapeptid der allgemeinen Formel
X1-X2-X5-PrO-X4 III ,
worin X1 , Xp , X* und X4 die oben angegebenen Bedeutungen
haben, kondensiert.
Nach einer anderen vorteilhaften AusführungBfοrm der
Variante b) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Hexapeptidazid der allgemeinen Formel
<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-X1-N5 IV ,
worin X1 die oben angegebenen Bedeutungen hat, mit einem
Tri- oder Tetrapeptid der allgemeinen Formel
X2-X5-PrO-X4 V ,
worin X2 , X, und X4 die oben angegebenen Bedeutungen hat,
kondensiert.
Nach einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Variante b) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Heptapeptidazid
der allgemeinen Formel
Glu-His-Trp-Ser-Tyr^-X2-N5 VI ,
worin X und X2 die oben angegebenen Bedeutungen haben,
mit einem Di- oder Tripeptid der allgemeinen Formel
X5-PrO-X4 VII ,
worin X, und X4 die oben angegebenen Bedeutungen haben,
kondensiert.
- 16 -
COPY
Das Überführen der erhaltenen Gonadoliberinderivate der allgemeinen Formel I in ihre Säureadditionssalze kann
durch Umsetzen derselben mit Säuren in an sich bekannter V/eise bewerkstelligt werden. Umgekehrt kann das Freisetzen
der freien Gonadoliberinderivatbasen durch Umsetzen ihrer Säureadditionssalze mit Basen durchgeführt werden.
Die Variante a) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann
nach allgemein üblichen Verfahrensweisen der Peptidsynthese in der festen Phase (Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc.
8£ [1965], 2 149 bis 2 151) durchgeführt werden. Zweckmäßig
wird je nach der Struktur der herzustellenden Verbindung die Art des Ausgangsmateriales gewählt, und zwar im Falle von
Peptidalkylamiden chlormethylierte Polystyrol/Divinylbenzol-Harze
und im Falle von Peptidsäureamiden Benzhydrylaminharze. Die einzelnen Aminosäuren können mit Hilfe von
Diisopropylcarbodiimid (DIG) beziehungsweise Dicyclohexylcarbodiimid
(DCC) in Form ihrer mit -tert.-Butoxycarbonylgruppen
(BOC) geschützten Derivate beziehungsweise nach der Verfahrensweise der aktiven Ester schrittweise an das Harz
gekuppelt werden.
Der Verlauf der Kupplungsreaktion kann mit dem Ninhydrin-Prüfversuch
(Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I., Anal. Biochem. J54 [1970], 595 bis
598 verfolgt werden. Im Falle der Anzeige freier Aminogruppen ist die Acylierung zu wiederholen. Die Zeitdauer der
Kupplungsreaktionen kann je nach den Aminosäuren 1 bis
16 Stunden betragen.
Das Abspalten der Schutzgruppen und das Abspalten des Peptides vom Harz kann mit flüssigem wasserfreiem Fluorwasserstoff
in einem Schritt erfolgen (Sakakibara S., Shimonishi Y., Kishida Y., Okada M., Sugikara H., Bull
Soc. Japan 40 [1967], 2 164 bis 2 167- Vorteilhaft wird
- 17 -
das geschützte Peptidharz in propylaminhaltigem Dimethylformamid
verrührt und nach der Entfernung des Lösungsmittels in der üblichen Weise mit Fluorwasserstoff behandelt.
' Bei Verwendung der Nlm-Dinitrophenylschutzgruppe wird die
Entfernung derselben zweckmäßig noch vor der mit Fluorwasserstoff vorgenommenen Abspaltung durchgeführt. Im
Falle von Peptidalkylamiden werden diese vorteilhaft durch Alkylammonolyse vom Harz abgetrennt und dann je nach dem
Charakter der Schutzgruppen katalytisch hydriert und/oder sauer hydrolysiert.
Das Rohprodukt kann nach dem mit Fluorwasserstoff vorgenommenen Abtrennen durch Gelfiltration gereinigt werden.
Dazu kann eine Säule aus Sephadex G25 dienen, wobei vorzugsweise mit essigsauren Lösungen eluiert wird.
Zur weiteren Reinigung können Hochdruckflüssigkeitschromatographiersäulen
(HPLC-Säulen). -und/oder die SiIicagelchromatographie
herangezogen werden.
Die Reinheit der Peptide kann durch Aminosäureanalyse und mittels Dünnschichtchromatographie untersucht werden.
Ferner sind Gegenstand der Erfindung Arzneimittel beziehungsweise pharmazeutische Präparate, welche 1 oder
mehr erfindungsgemäße Verbindung(en) als Wirkstoff(e),
gegebenenfalls zusammen mit 1 oder mehr üblichen pharmazeutischen Konfektionierungsmittel(n), enthalten.
Die erfindungsgemäßeη Arzneimittel können in Form von
Arzneimittelpräparaten vorliegen. Beispiele für Arzneimittelpräparate
beziehungsweise pharmazeutische Präparate sind Tabletten, Dragees, Kapseln, Suppositorien, Ingektions-,
lösungen und Nasensprys. Diese können als pharmazeutische
- 18 -COPY
Konfektionierungsmittel in der pharmazeutischen Industrie übliche Träger- und/oder Hilfsstoffe enthalten. Ihre Herstellung
kann nach in der pharmazeutischen Technik üblichen Verfahrensweisen erfolgen.
Die erfindungsgemäßen Gonadoliberinderivate können
vorteilhaft Fischen durch intramuskuläre oder subkutane Injektion verabrecht werden. Ihre zweckmäßige Dosis beträgt
0,1 μg bis 5 mg/Tier.
Der Hauptvorteil der erfindungsgemäßen Gonadoliberinderivate besteht darin, daß sie in den 7- und 8-Stellungen
für Fische charakteristische Aminosäurekombinationen aufweisen und deshalb zur Vermehrung dieser Tiergattung erfolgreich
eingesetzt werden können.
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert. Gemäß den Beispielen 1 bis 5 wurden die
Verbindungen.nach allgemein übliches. Verfahrensweisen der
Peptidsynthese in der festen Phase hergestellt. Die in den
Beispielen angegebenen R~-Werte der Dünnschichtchromatographie wurden an Kieselgel (DC, Alufolie, Merck) mit den
Lösungsmittelgemischen aus den folgenden Bestandteilen in den folgenden Volumverhältnissen bestimmt:
1. ithylacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser $0 : 20 : 6 : 11
2. Ithylacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser 60 : 20 : 6 : 11
3. Ithylacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser 120 : 20 : 6 : 11
4. Äthylacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser 240 : 20 : 6 : 11
5. n-Butanol/Essigsäure/Wasser/Äthylacetat 1:1:1:1
6. n-Butanol/Essigsäure/Wasser 4:1:1
7. Isopropanol/m Essigsäure 2:1
8. Äthylacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser 5:5:1:3
9« n-Butanol/Essigsäure/Ammoniak (konzentriertes
Ammoniak und Wasser im Volumverhältnis von 1 : 4)/Wasser 6:1:1:2
.10. Methyläthylketon/Essigsäure/Wasser 125 : 15 : 20
D-Phe6, Gln8-Gonadoliberin
beziehungsweise M: 1243
<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Fhe-Leu-Gln-Pr 0-GIy-NH2
a) Synthese
1,25 g (l mMol) Benzhydrylaminhydrochlondharz
[0,8 mM/g , Pierce] werden 2 Stunden lang in Dichlormethan gequollen. Bei der Acylierung mit den Aminosäuren
wird jeweils der folgende Zyklus wiederholt: Schritt -Reagens, Arbeitsgang Eühraauer , min
1 CH2Cl2, Waschen 3x !
2 33Vol.-% Trifluoressigsäure im
Gemisch mit 67 Vol.-% CH?C1?, Waschen 3x X
3 _ ■■ _ 25
4 CH2Cl2, Waschen 3x !
5 CHCl31 Waschen 2x 1
6 Gemisch aus 10 Vol.-% Triäthylamin und
90 Vol.-% CHCl3, Waschen 2x 2
7 CHCl,, Waschen 2x !
at O
8 . Äthanol, Waschen 2x 1
9 CH2Cl2, Waschen 2x 1 '
10 3 mMol BOC-Aminosäure, in $0 ml 6O(oder mehr
Dichlormethan gelöst+ , und [tos 24 Stunden])
3 mMol DCC oder DIC, in 5 ml CH2Cl2
gelöst
11 CH2Cl2 Waschen 2x 1
12 Äthanol, Waschen 2x 1
+ ' Bein Kuppeln von Gin wird mit der Methode des aktiven
Esters über BOC-Gln-ONP gekuppelt; im Falle von Pyroglutaminsäure wurde ohne Schutzgruppe gearbeitet.
- 20 COPY
Nach dem letzten Schritt beträgt das Gewicht des Iu-His(Tos)-Trp-Ser(OBzI)-Tyr(OBzI)-D-Phe-Leu-GIn-Pro-Gly—PepticLharzes
2,28 g.
Ausbeute [ ^W] : 1,05 g (66%).
Ausbeute [ ^W] : 1,05 g (66%).
(Mgesch.Peptid= l57?)·
b) Abspalten mit HF
Zu dem Harz werden 3 ml Anisol und 100 mg Dithiothreit
zugegeben, dann werden in dem Gemisch 30 ml HF kondensiert. Das Gemisch wird bei 0 0C eine Stunde lang
gerührt. Anschließend wird der Fluorwasserstoff im Stickstoffstrom
entfernt, der Rückstand wird in absolutem Äther suspendiert und dann filtriert. Der feste Rückstand
wild in 50 vol.-%-ϊ^Έ5 s ig säure gewaschen. Das Filtrat wird
bei 37 C eingedampft. Der Rückstand wurde unmittelbar der Gelchromatographie zugeführt (s.-folgenden Punkt).
c) Gelchromatographie
Die gemäß dem vorhergehenden Punkt erhaltene Substanz wurde an einer Säule aus Sephadex G25 (2,5x100 cm) mit
50 vol.-%-Jger Essigsäure als Elitionsflüssigkeit gereinigt.
Die Elution wurde mittels der Absorption von UV-Licht der
Wellenlänge 280 nm sowie mittels Dünnschichtchromatographie verfolgt. Die Elutionsgeschwindigkeit beträgt 15 ml/h.
Die Fraktionen zwischen 300 ml und 350 ml werden gesammelt und lyophilisiert« Gewicht: 690 mg (55 %).
- 21 -
d*) Praparative Hochdruck flüssigkeit sch roma t ο : r irn if:
Es wurde eine präparative HPLC-Säule der Maße 2.5 χ 45 cm (c,„-Silikagel LRP-I, 13-24,Um; VVhstmon"»
verwendet. Diese wurde mit einem Gsnisch ate 25 VoL-% Methanol
und 75 Toli-96 30 volr-%-d^r Essigsäure äqrölfhrisrt. Nach Einstellen
des Gleichgewichtes werden 230 mg der gelchromatisch
gereinigten Substanz, gelöst in dem gleichen Losungsmittelgemisch,
auf die Säule aufgebracht. Eluiert wurde mit einem Methanol/Essigsäure-Gradienten, dessen Zusammersetzung
sich zwischen 25 Vol.-% Metiianal/75 VdL.-% 30 völliger Essigsäire und
40 VoI,-% Mebhanol/60VaL.-% 30 vol*-%-ige Essigsäure linear ändert.
Die Elutior.sgeschwindigkeit betragt 2 ml/min, der Druck
3,5el0 Pae Die Fraktionen werden mit UV-Licht der Wellenlänge
280 ηm nachgewiesen, ihr Gehalt wird dünnschichtchromatographisch
kontrolliert. Das Gewicht des reinen Endproduktes D-Phe , Gin -GnRH beträgt nach dem Lyophilisieren
133 mg. Das entspricht, auf die Gesamtmenge der Substanz bezogen, 399 mg (32 %) an gereinigtem Endprodukt,
R^ = 0,75; R^ = 0,68 R^ = 0,33 Rf-=Ό.93 R^ = 0,33
Aminosäureanalyse:
GIy: 1,02, Pro: 0,95, Leu: 1,00, Phe: 1,02,
Tyr: 1.01, Ser: 0,93, His: 0,99, Glu: 1,96.
Schmp.: 175-178 0C; CocIq2 = -68° (c = 0,1, 0,1m AcOH),
Beispiel 2
J
Q
Trp ,GIn -Gonadoliberin
beziehungsweise M: 1226
^Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Gln-Pro-Gly-N^
a) Synthese
Ausgehend von 2,5 g (l mM) Benzhydrylaminhydrochloridharz
[0,4 mAqu./g]' wird auf die im Beispiel 1 unter Punkt a) beschriebene Weise das Peptidha.rz (Glu-His(DNP)-Trp-Ser(0Bzl)-Tyr-Gly-Trp-Gln-Ero-G3y-Harz
hergestellt. Das Gewicht des Peptidharzes beträgt 3 62 q
Ausbeute [^-W]: 1,12 g (76%).
CMgesche Peptid= ΐ468)* Ä,
- COPY - 22 -
b) Entfernun | vom | .1 | der | '.- chu t | eny | 1 | ppen | Ur-.d | Abr.pa | L t ο η d ..>;. |
Peptides | de | Harz | ||||||||
Abspalten | r | Dini | t rogh | -Sch | UtZ^ | rugpe | (DNP^I | |||
Das Peptidharz wird'in dem Gemisch aus 20 ml Dimethylformamid
und 1 ml Propylamin bei Raumtemperatur eine
Stunde lang gerührtu Anschließend wird das Harz abfil-
41
triert und mit Dichlormethan, dann mit Äthanol gewa3chen.
Spaltung mit HF
Nach der Entfernung der Dmit rophenyl-Schutzg ruppe
werden auf die im Beispiel 1 unter Pun!:t b) beschriebene
Weise das Peptid vom Harz beziehungsweise die Schutzgruppen vom Peptid abgespalten. Nach Abschlu.: der beiden
Schritte verbleiben 0,8 g (65 ^) Substanz.
c) Gelchromatographie
Man arbeitet auf die im Beispiel 1 unter Punkt c) angegebene Weise. Das Gewicht der gesammelten und lyophilisierten
Fraktionen betragt 520 mg (42 %).
d) Praparative Hochdruckflüssigkeitschromatographie
Man arbeitet auf die im Beispiel I unter Punkr cj)
Il
angegebene Weise tut dem Unterschied, da- die Äquilibrierung
mit einem Gemisch aus 18 Vol.-% Meihanolund 82 Vol*-%
50 vol.-%-iger Essigsäure vorgenommen wird. Die gelchromatographisch
gereinigte Substanz wird mit einem Methanol/ /Essigsäure-Gemisch, dessen Zusammensetzung sich zwischen
18 Vol.-% Me&aKÜ/82Vol.-% 3Q vol.-^ige Essigsäure und 35Vol.-% Methanol/
65 VaU-ffo $0vQL-%-:3ge Essigsäure ."linear., ändert, von der Säule
eluiert. Die Fraktionierung sowie die sonstigen Bedingungen stimmen mit dener in Beispiel ^Id) überein» Das Gewicht
des lyophilisierten Endproduktes beträgt 380 mg (31 %).
Rf = 0,66; R^ = 0,57; R^ = 0,78.
Aminosäureanalyse:
GIu: 1,93, GIy: 2,04, Pro: 1,00, Tyr: 0,98,
Ser: 0,93, Trp: 1,86, His: 1,03.
- 23 -
BAD ORIGINAL
Trp'.Leu ,de5GlyNH2 -Gonadolibenn-athy lamid
beziehungsweise M=1198
<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Leu-Ero-NHC2H5
a) Synthese
Als erster Schritt der Synthese wird BOC-Pro ir literaturbekannter Weise ,Merrifield, R.B., 0. Am. Chen.
Soc. j36_, 304 /1964/) an ein chlornethyliertes Poly5tyrolharz
gekuppelt, 2 g des auf diese Weise erhaltenen BOC-Pro-Harzes
[0,5 mAqui./gJ werden zwei Stunden lang in
Dichlormethan gequoLlen und dann werden auf die unter
Punkt a) in Beispiel 1 beschriebene Weise schrittweise die entsprechenden geschürzten Aminosäuren an das Harz
gekuppelt. Nach dem letzten Zyklus erhält man 3,02 g des Peptidharzes <Glu-His(DNP)-Trp-Ser(OBzl)-Tyr(OBzl)-Gly-Trp-Leu-Pro.
Ausbeute [^1W]: 1,02g (8$%).
Ausbeute [^1W]: 1,02g (8$%).
(pWh. Peptid/ 1485)·
b) Entfernung der Schutzgruppen und Abspalten des
Zuerst wird gemäß Punkt b' des Beispiels 2 die
Dinitropheny1-Schutzgruppe von dem Histidin abgetrennt»
Anschließend wird das Peptid in Form des Athylamids vom Harz abgespalten (Coy, D.H. et al., Biochemistry 13,
323-326 /1974/). Zu diesem Zweck werden auf das ge-
it
schützte Peptidharz 15 ml Athylamin aufkondensiert,
und das Gemisch wird bei O 0C 3 Stunden lang gerührt.
Der Überschuß des Amins wird mittels Stickstoff ausgetrieben.
Dann wird mit Methanol, anschließend mit Dimethylformamid gewaschen. Die DMF-Lösung wird eingedampft
und das als Eindampfrückstand erhaltene öl mit Äther verrieben.
Der Niederschlag wird abfiltriert,,
Die auf diese Weise erhaltene Festsubstanz wird gemä.3 Punkt b) des Beispiels 1 zwecks Entfernung der
Schutzgruppen mit gasförmigem Fluorwasserstoff behandelt.
Man erhält 710 mg (59 %) Nonapeptidäthylamid.
BAD ORIGINAL
- 24 - 3U6997
) 3
Man arbeitet auf die unter Punkt c) des Beirpielj 1
beschriebene Weise mit einer Säule 3us Sephadex G25 und
verwendet als Elutionsmitt el 30 vol.-%-Jge Essigsäure. Das
Gewicht der gesammelten und lyoph 111 ■:, ier t en Fraktionen
beträgt 490 mg (41 %).
Das rohr; Peptid v\i rd an emrr Gäule aus Kieselgel
60 (0,3 bös 0,4 ran [230-400 mesh], Merck) da? JVaße 2x100 cm weiter
It
gereinigt. Eluiert wird mit einem Gemisch aus Athylacetat,
Pyridin, Essigsäure urd Wasser in VoluweihaLtrrisvcn
30:20:6:11. Die Durch fluggeschwindigkeit beträgt 8 ml/h.
Fraktionen zu je 4 ml werden aufgefangen, und die Elution
wird dünnschichtchromstographisch verfolgt.
Die dem Gonadoliberinäthylamid Trp ,Leu .desGlyNH^0 entsprechenden
Fraktionen werden auf Grund der Aminosäureanalyse bestimmt. Man erhält 320 mg (26 %) lyophilisiertes
Material«
Rf = 0,61; R^ = 0,42; R^ = 0,75*."
Aminosaureanalyse:
alu: 0,96, GIy: 0,97, Pro: 0,95, Leu: 1,00,
Ser: 0,89, Tyr: 1,02, Trp: 1,88, His: 1,03.
Phe ,Gin -Gonadoliberin
beziehungsweise
<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-PiIe-GIn-PrO-GIy-NH2 M = 1187
<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-PiIe-GIn-PrO-GIy-NH2 M = 1187
a) Synthese
1,25 g (l mMol) Benzhydrylaminhydrochloridkarz
(0,8 mAqu./g) lä.:t man zwei Stunden lang in Dichlormethan
quellen. Daraus werden auf die im Beispiel la beschriebene Weise 2,9 g des Peptidharzes<£lu-His(Tos )-
-Trp-Ser(OBzl)-Tyr(OBzl)-Gly-Phe-Gln-B?o-Gay-Harz hergestellt.
Ausbeute [^W]: 1,2? S (83%) ; Mgesch#peptid = 1521.
- 25 -
bN| Abspalten der Schutzgruppen
Das geschützte Peptid wird auf die im Beispiel Ib) beschriebere Weise mit wasserfreiem HF behandelt.
9SO mg (82 %) ungeschütztes Peptid werden erhalten.
c) Gelfilt ration
Das rohe Decapeptidamid wird auf die im Beispiel Ic) beschriebene Weise an einer nit Sephadex G-25 gefüllten
Säule mit 2m Essigsäure gereinigt. Ausbeute: 576 mg (49 %).
d) Präparative HPL-Chromatographie
Man arbeitet auf die im Beispiel Id) beschriebene Weise mit dem Unterschied, daß das Gel LRP-I mit
einer 10MoL-% ifetlaanol und 20 VoL-% Essigsäure enthaltenden
wä.irigen Lösung äquilibriert wird. Eluiert wird mit
einem linearen Gradienten , der in 20TOl.--%-:i@er Essigsäure
von 10 Ίοί,-ψο aus anstedgaad bis zu 2^ Völ.-% Methanol enthält
(2x150 ml). Dann wird die Elution mit einem zwischen 25 VqLi-% und 4OVoL-% ansteigend Methanol enthaltenden linearen
Gradienten (2x150 ml) fortgesetzt. Die das reine Peptid enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und eingedampft.
Ausbeute: 448 mg (38 %)
R* = 0,12$ R^ = 0,7; R^ = 0,24; R^ = 0,87.
Aminosäureanalyse:
Ser 0,87, GIu 2,05, Pro 1.03, GIy 2,13,
Tyr 0,92, Phe 1,00, His 0,95 Trp 0,8l.
Schmp.: 182 0C ·
Phe ,Leu -Gonadoliberin
beziehungsweise M = 1172
^Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Phe-Leu-Pro-Gly-NHg
a) Synthese
0,62 g (0,5 mMol) Benzhydrylaminhydrochloridharz Il
(0,8 mAqu./g) lälit man zwei Stunden lang in Dichlormethan
quellen« Dann wird auf die im Beispiel la) beschriebene Weise das Peptidharz ^Glu-His(Tos)-Trp-
- 26 -
BAD ORIGINAL
-.; e r ν GBz 1Ί -Ty r ( C3z 1 v>
-C-Iv - --h ο-L c-u-B?o-G]y-Har ζ hergestellt.
Ausbeute: 1,33 g
Ausbeute [/^W]: 695 mg (92%), ^escht peptid) = 15°6'
Ausbeute [/^W]: 695 mg (92%), ^escht peptid) = 15°6'
b'
3 oh a nc-;? In mit HF
Das geschützte Peptid wird auf die im Beispiel Ib'1 beschriebene Weise mit wasserfreiem HF behandelt,
'■'an erhalt 510 mg .'87 '^) rohes Decapeptid.
c'' Gelfiltration
Das gernä.": Schritt b) erhaltene rohe Decapeptidamid
wird auf die im Beispiel Ic) beschriebene Weise an einer Säule aus Sephadex G-25 mit 2 m Essigsäure
gereinigt. Ausbeute: 363 mg (62 %).
d) Chromatographie an Silikagel Zur weiteren Reinigung des Peptids dient eine
mit Kieselgel 60 gefüllte Säule der Mai:e 2x100 cm,
die mit einem in Volumveiiiältnis 1:1:1:1 bereiteten Gemisch
ti
aus n-Butanol, Essigsäure, Wasser und- Athylacetat
eluiert wird. Der Gehalt der Fraktionen wird UV-spektroskopisch sowie mittels Dünnschichtchromatographie
kontrolliert. Man erhält 299 mg (51 %) des reinen
Decapeptidamids.
R^ = 0,55; R^ =0,39; R^ = 0,62; R^ = 0,73 .
Aminosäureanalyse
Ser 0,91, Glu 0,97, Pro 1,07, Gly 2,12,
Leu 1,00, Tyr 1,03, Phe 0,94, His 1,05.
Beispiel 6
D-Phe6,Gln8,desGlYMH2°-Gon,3doliberin-athylanid
D-Phe6,Gln8,desGlYMH2°-Gon,3doliberin-athylanid
beziehungsweise (M = 1198)
<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Plie-Leu-Gln-Pro-NHC2Hc
a) BOC-His(DNP)-Trp-CMe (m = 622,52)
21,12 g (50 mMol'i BOC-His ,'DNP)-CH werden in 100 ml
Dimethylformamid gelobt« Die Lösung wird auf 0 C gekühlt
und unter Rühren mit 10,32 g (50 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid
und 7,66 g (50 mMol) N-Hydroxybenztriazol versetzt. Das Gemisch wird bei 0 °C 10 Minuten
lang gerührt, dann wird der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff
abfiltriert.
12,74 g (50 mMol·) H-Trp-OMe.HCl werden in 70 ml Dimethylformamid
gelöst, und die Lösung wird auf O C gekühlt. Man gibt 6,94 ml (50 mMol) Triathylamin zu der
Lösung und filtriert nach 5minütigem Rühren das ausgeschiedene Triäthylamin-hydrochlorid ab.
Die beiden Lösungen werden vereinigt und über Nacht bei O C gerührt. Anderntags wird der ausgeschiedene DicycÜD—
faggylhR-mstoEC [DCU] abfiltrjsrt mn. das !"Abrät zur (Bro&kne eingedampft.
Das zurückbleibende öl wird in 500 ml Athylacetat gelöst. Die Lösung wird zuerst mit 3x100 ml eiskalter m KHSO-
-Lösung, dann mit 5x100 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung und schließlich mit 2x100 ml 10 gew.-%-iger
NaCl-Lösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wird
über Magnesiumsulfat getrocknet und nach dem Filtrieren
zur Trockne eingedampft. Der ölige Rückstand wird mit Petroläther verrieben, filtriert und dann getrocknet.
Die erhaltene kristalline Substanz wurde in Athylacetat gelöst und mit Petroläther ausgefällt.
Ausbeute: 27,70 g (89 %).
Schmp#: 119-122 0C .
-. = +14,1 (c = 1, in Dimethylformamid).
= 0,62; R^ = 0,41 .
f - 28 -
BAD ORIGINAL
b) H-Hio-, D\P)-Trp-Ütte.2HC1
M = 522,49 {freie Base) 595,41 (.2HCl)
24,9 g (40 mMol) des Dipeptide BOC-His(DNP)-Trp-OMe
werden in 100 ml Methanol gelost. Zu der Losung werden
100 ml 4n methanolische Salzsäure zugegeben- Das Gemisch
wird bei Raumtemperatur 30 Minuten lang stehen gelasser,.
Das in dieser Zeit auskristallisierende Dipeptidesterhydrochlorid
wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und dann getrocknet,
Ausbeute: 21,91 g (92 %),
Schmp.: 198-202 0C.
[cdn = 0,49 (c = 1, in Dimethylformamid) ·
R^ = 0,46 ; R^ = 0,18.
c) (Glu-His(DNP) -Trp-OMe
M = 533,50
M = 533,50
4,85 g (35,8 mMol) L-Pyroglutaminsäure, 7,58 g
Dicyclohexylcarbodiimid und 5,53 g N-Hydroxybenztriazol
werden in 100 ml Dimethylformamid gelost. Das Gemisch wird bei 5-10 C 10 Minuten lang gerührt und dann der
ausgefallene Dicyclohexy!harnstoff [DQU] abfiltriert.
20,84 g (35 mMol) H-His(D.\P)-Trp-OMe.2HCl werden in
100 ml Dimethylformamid gelöst "und zu der Lösung werden 9,72 ml .
(70 mMol) Triäthylarnin zugegebai. Nach 5rninütigem Rühren
wird das ausgeschiedene Triäthylaminhydrochlorid abfiltriert. Die beiden Lösungen werden vereinigt und
über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anderntags wird
das Gemisch mit 90 ml Aceton versetzt, die sich ausscheidende unlösliche Substanz wird abfiltriert. Das Filtrat
wird eingedampft. Das zurückbleibende öl wird mit Athylacetat
verrieben und dann getrocknet. Die trockene kristalline Substanz wird mit 3x25 ml Wasser gewaschen und
erneut getrocknet« Die Substanz kann durch kochendes Il
Lösen in Athylacetat und Abkühlen der Lösung umkristallisiert werden.
Ausbeute: 18,42 g (83,1%)·
Schmp.: 148-151 0C.
Schmp.: 148-151 0C.
pj = *5,2 (c = 1, in Dimethylformamid) .
= 0,53; R^ = 0,38. - 29 -
d) <Glu-His-Trp-OMe
M = 466 ,50
M = 466 ,50
15,84 g des geschützten Tnpep tids (Glu-His(DNP) Trp-OMe
werden in einem Genisch aus 100 ml Dimethylformamid und 40 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird mit
4 ml Mercaptoäthanol versetzt und dann mit Triethylamin
auf pH 8 eingestellt» Das Gemisch wird bei Raumtemperatur
30 Minuten lang stehengelassen und dann im
Vakuum zur Trockne eingedampft. Der ölige Rückstand Il
wird mit Äther verrieben, filtriert und getrocknet.
Die erhaltene Substanz wird in wenig Methanol gelöst
■ I
und durch Zusatz von Äther ausgefällt. Die Kristalle
werden abfiltriert und getrocknet.
Ausbeute: 10,92 g (93,6 %)
Schmpe : 228-232 °C
Ccdn = +4,04 (c = 0,42, in Dimethylformamid)
2
R^ = 0,30
R^ = 0,30
e) <fGlu-His-Trp-N 2H3
M = 466,51 .. ~ .
9,33 g (20 mMol) des Tripeptide (Glu-His-Trp-OMe
werden in 250 ml Methanol gelöst und zu der Lösung werden 2OmL 98vol.r-i&äges Ifrdrazinhj&iiat zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 3 Stunden lang bei 40 C, dann über Nacht
bei Raumtemperatur gerührt. Anderntags wird die ausgeschiedene Substanz abfiltriert, nit kaltem Methanol gewaschen
und dann getrocknet.
Ausbeute: 7,58 g (81,2 %)
" Schmp.: 166-169 °C
" Schmp.: 166-169 °C
[cdD = -22,3° (c = 0,5, in Dimethylformamid)
R* = 0,50 ; Rj s 0,14.
f) (Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OMe
M = 716,8
7,0 g (15 mMol)<Glu-His-TTp-N2H3 (Produkt des
Schrittes e) werden in 50 ml Dimethylformamid gelöst· Die Lösung wird auf O C gekühlt und
unter Rühren mit 7,5 ml (45 mMol) 6n HCl versetzt. Dann
tropft man langsam die gesättigte wäßrige Lösung von
- 30 -
BAD
1,035 g (l5 mMol) N3NO- zu den Gemisch und rührt weitere
15 Minuten bei O C. Dann versetzt man das Gemisch
mit der Lösung von 4,78 g (15 mMol) H-Ser-Tyr-OMe .HCl in
15 ml Dimethylformamid und stellt den pH-Wert mit 6,25 ml (45 mMol) Triethylamin auf neut rai.eiü* Das Gemisch
wird über Nacht bei 0-4 C gerührt, anderntags im Vakuum
zur Trockne eingedampft und der ölige Rückstand wird
mit Äther verrieben«
Das Gewicht des pulverförmigen Produktes betragt
12,1 g (lOO %). Das Chromatogramm zeigt Flecken von
zwei geringfügigen Verunreinigungen, jedoch kann das
Produkt ohne zwischenzeitliche Reinigung zum Hydrazid umgesetzt werden, welches gut kristallisiert. Physikalische
Daten der zur Kontrolle aus Methanol umkristallisierten Substanz:
Schmp. : 188-190 0C .
CcdQ = -3,48 (c = 1, Dimethylformamid).
R* = 0,58; R^ = 0,26.
g) <Glu-His-Trp-5er-Tyr-N2 H
M = 716,8
12 g des rohen, pulverisierten Pentapeptidesters
(Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OMe werden in 200 ml Methanol gelöst
und zu der Lösung 10 ml 98 Tol«-%-iges Efräraziiihyclrat zugegeben.
Das Gemisch wird bei 40 C drei Stunden lang und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, die
ausgefallenen Kristalle werden abfiltriert und im Exsikkator über konzentrierter Schwefelsäure getrocknet.
Die getrocknete kristalline Substanz wird in 250 ml 0,5 η HCl gelöst, die Lösung mit konzentrierter Sodalösung
auf pH 8 eingestellt υη& bei 0 0C zwei Stunden
lang stehen gelassen. Die ausgefallenen Kristalle werden abfiltriert, mit eiskaltem Wasser gewaschen
und dann getrocknet.
Ausbeute: 6,12 g (auf beide Schritte bezogen 56,9 %)-Schmp.
: 205-206 0C .
[cd!:2 =-21,51° (c = 1, Dimethylformamid).
- 51 -
_ 31 -
R-J = O , 39 ; R^ = O , 14 .
Hydrazinstickstoff: berechnet: 3,91 %
gefunden: .3,79 %, 3,76 %.
h) Z-G] η-Pro-!
M = 4-05,4
3,242 g Prolinathylamid (hergestellt aus 22,8 mMol
3,242 g Prolinathylamid (hergestellt aus 22,8 mMol
pHf- durch Hydrieren) werden in 70 rnl Tetrahydrofuran
gelöst und zu der Lösung 5,60 g (20 mMol) Z-Gln-OH und 1,034 g N-HydroxybenztPiazol zugegeben. Bas
Reaktionsgemisch wird auf dem Eisbad gekühlt und unter Rühren mit der Lösung von 5,34 g (25,9 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid
in 50 ml Tetrahydrofuran versetzt. °as
Reaktionsgemisch wird auf dem Eisbad 5 Stunden lang,
dann bei Raumtemperatur noch 20 Stunden lang gerührt,
filtriert und das Filter mit Tetrahydrofuran nachge-*·
waschen. Das Filtrat wird im Vakuum eingedampft und der Rückstand in Chloroform gelöst. Die Lösung wird mit
3x35 ml mit der fünffachen Menge Was~ser verdünntem
Ammoniak, dann mit 2x20 ml Wasser , anschließend mit
3x35 ml Salzsäure und schliei31ich erneut mit 2x20 ml Wasser gewaschen. Dann wird die organische Phase über
wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert.
Das Filter wird mit Chloroform nachgewaschen. Dann wird die Lösung zur Trockne eingedampft. Der ölige Rückstand
wird in einem Gemisch aus 35 ml Tetrahydrofuran und 50 ml
Athylacetat gelöst und die Lösung filtriert. Nach Abdampfen des Lösungsmittels bleibt ein Ol zurück, das
mit 100 ml Äther kristallisiert wird. Die feste Sub-
•ι
stanz wird auf dem Filter mit Äther gewaschen und dann
im Vakuum getrocknet. Man erhält 7,68 g (95 %) Produkt. R^ = 0,45 ; R* = 0,73.
l) Z-Leu-Gln-PrQ-
M = 518,57
4,5 g (il mMol) des geschützten Dipeptidamids Z-GIn-PrO-NHC2H5werden in 30 ml Eisessig gelöst. Zu der
BAD ORIGINAL
Lösung werden 55 ml 4n eisesäigsaure Bromwassers to f f s aure zugegeben. Das ReaktionsgoniGch wird bei Raumtemperatur
li Stunden lang stehen gelassen, dann mit 250 ml Äther
versetzt und wieder eine Gt undo stehen gelassen. Die
über dem Niederschlag jtehends Flüssigkeit wird dekantiert,
der Ruckstand nit 100 "1 Äther aufgeschlammt , noch
15 Minuten abfiltriert und reichlich mit Äther gewaschen. Die hygroskopische feste Substanz wird im Vakuum über
Phosphorpentoxyd und Natriumhydroxyd getrocknet. Ausbeute:
4,9 g (hygroskopisch).
3,8 g (11 mMol) des erhaltenen Dipeptidäthylamidhydrobromids
werden in 150 ml Chloroform suspendiert. Zu der Suspension werden 7,0 ml Triäthylamin zugegeben.
Dann wird das Reaktionsgemisch mit der Lösung von 6,4 g Z-Leu-pentachlorphenylester in 65 ml Chloroform versetzt
und über Nacht gerührt. Anderntags wird das Reaktionsgemisch mit η Salzsaure, gesättigter Kochsalzlösung,
2n Ammoniak und schließlich wieder mit"gesättigter Kochsalzlösung
extrahiert. Die organische 'Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann im Vakuum
Il
eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther verrieben, die
It
Festsubstanz abfiltriert, mit Äther gewaschen und dann
im Vakuum getrocknet. Man erhält 4,6 g (si %) Rohprodukt.
j) H-Leu-Gln-Pro-flHCpH^.HBr
M = 465,5
Von dem auf die unter Punkt i) beschriebene Weise
hergestellten Tripeptid Z-Leu-Gln-Pro-NHGpH,- wird die
Schutzgruppe ohne zwischenzeitliche Reinigung entfernt. Zu diesem Zweck wird das Produkt in 10 ml 4 η eise S3 ig saurer
Bromwasserstofflösung gelöst. Die Lösung wird bei Raumtemperatur eine Stunde lang gerührt und dann das Produkt
If
durch Zusatz von 100 ml wasserfreiem Äther ausgefällt«
Die Substanz wird abfiltriert und im Exsikkator getrocknet. Das Produkt ist ein gelbes hygroskopisches Pulver.
- 33 -
BAD ORIGINAL
Ausbeute: 3,54 g C 75 /,)
R^ = 0,42; R^ = C, 13; ^- = C . 55 ; R* = 0 ,1 .
_k) BOC-D-Phe-Leu-Gln-Pro-
M = 631,74
2,33 g (5 mMol^ des Tripeptldhydr^chlorids H-Leu-Gln-
•Pro-NHCpHc.HBriserden in 5 ml Dimethylformamid gelöst. Die
Lösung wird auf 0 C gekühlt und zuerst mit 0,70 ml (0,5 mMol) Triäthylamin und dann mit der Lösung von 2,57 ml
(5 mMol) BOC-D-Phe-pentachlorphenylester in 10 ml Dimethylformamid
versetzt. Der pH-Wert der Lösung wird mit Trimethylamin auf 7 bis 8 gestellt. Das
Gemisch wird bei Raumtemperatur 48 Stunden lang gerührt. Während dieser Zeit wird der pH-Wert mit Triäthylamin
auf dem angegebenen Wert gehalten. Dann wird die Lösung im Vakuum eingedampft, der Rückstand wird in 100 ml
Chloroform gelöst und die Lösung mit ICxIO ml 0,1m
Ammoniak gewaschen. Dann wird die orgarische Phase über Natriumsulfat getrocknet, abfiltriert und eingedampft.
Der ölige Rückstand kann durch Behandeln mit Äther in ein Pulver überführt werden. Das getrocknete Rohprodukt wiegt
2,81 g (89 %). Die Schutzgruppe wird ohne weitere Reinigung entfernt.
1) H-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NH
M = 64-5,65
1,26 g (2 mMol) des Tetrapeptids BOC-D-Phe-Leu-Gln-
NHC2H^ wen&m in 10 ml Trifluoressigsäire (TFA) gelöst. Die
Lösung wird bei Raumtemperatur 20 Minuten lang gerührt.
Die Trifluoressigsäure wird dann im Vakuum schnell entfernt.
Der Rückstand wird an einer Silikagelsäule mit einem im Volumverhältnis 4:1:1 bereiteten Gemisch aus n-Butanol.
Essigsäure und Wasser chromatographiert. Die Produktfraktionen
werden gesammelt und im vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in wenig Wasser gelöst und dann lyophilisiert.
Ausbeute: 880 mg (68 %)
R2 f = 0,25; R^ = 0,35.
Schmp. : 142 °C; Coc]^° = -66° (c = 0,1, Dimethylformamid).
- 34 BAD ORIGINAL
m^ <Glu-His-Trp-ber-Ty r-D-Phe-Lcu--.:'ln-Pro-';HC0Hc
i d~^
M = 1199
286 g (0,4 mMol) des gema.: Schriet g hergestellten
Pentapeptidhydrazids <(Glu-His-Trp-Ser-Ty r-N^H
werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Die Losung
wird auf -10 0C gekühlt und unter Rühren mit 0,27 ml 6n Salzsäure und dann mit der gesattigten wäßrigen
Lösung von 30,2 mg NaTJO9 versetzt. Nach 5 Minuten gibt nan die mit einem Gemisch aus 1 nl Dimethylformamid und 0,27 ml Triathylamin bereitete und auf -10 °C
gekühlte Lösung vor. 258 mg (0,4 mMol) H-D-Phe-Leu-Gln- -Pro-NHG-,Η,-. TPA zu dem Gemisch zu. Das ReakticsiBgemiscli wird eine Stunde lang bei -5 C, dann eine weitere Stunde
lang bei O C gerührt, wobei der pH-Wert erforderlbhenfeHs durch Zusatz von Triathylamin neutral
werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Die Losung
wird auf -10 0C gekühlt und unter Rühren mit 0,27 ml 6n Salzsäure und dann mit der gesattigten wäßrigen
Lösung von 30,2 mg NaTJO9 versetzt. Nach 5 Minuten gibt nan die mit einem Gemisch aus 1 nl Dimethylformamid und 0,27 ml Triathylamin bereitete und auf -10 °C
gekühlte Lösung vor. 258 mg (0,4 mMol) H-D-Phe-Leu-Gln- -Pro-NHG-,Η,-. TPA zu dem Gemisch zu. Das ReakticsiBgemiscli wird eine Stunde lang bei -5 C, dann eine weitere Stunde
lang bei O C gerührt, wobei der pH-Wert erforderlbhenfeHs durch Zusatz von Triathylamin neutral
gehalten wird. Schließlich läßt man die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen und dampft das Reaktiorsgemisch
im Vakuum ein.
Das nach dem Verdampfen erhaltene-01- wird in 5 ml
0,2n Essigsaure gelöst Und an einer Säule aus Sepradex
G25 (2x95 cm) mit 0,2n Essigsäure chromatographiert. Die
entsprechenden Fraktionen werden gesammelt und lyophili sia?b.
R* = 0,74; R^ = 0,65; R^ = 0,37; R ^ = O , 80 .
Aminosäurenanalyse
Ser 0,89, Pro 0,97, Leu 1,00, Phe 0,99,
GIu 1,98, His 1.01, Tyr 1,03, Trp 0.91.
Trp ,Gin ,desGly -Gonadoliberinäthylamid
beziehungsweise
(GIu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Gln-Prο-NHC2Hc
(GIu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Gln-Prο-NHC2Hc
M = 1220
a) BOC-GIn-PrO-NK^H1-M
= 370
1,0 g (7 mMol) Prolinäthylamid wird in 15 ml Dimethylformamid gelöst. Der pH-Wert der Lösung wird mit
- 35 -
Triäthylamin auf 8 eingestellt. Zu der Lösung wird die
Lösung von 3,2 g (8,4 mMol^ tert.-Butoxycarbonyl-glutaminyl-p-nitrophenylester
in 15 ml Dimethylformamid zugegeben. DL.3 Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 48
Stunden lang gerührt. Wahrend dieser Zeit wird der pH-Wert mit Triäthylamin auf 8 gehalten. Der nach dem
Eindampfen des Reaktionsgemisches verbleibende ölige Ruckstand wird in Wasser gelöst, die Lösung mit Äther
gewaschen und die wä.:rige Phase im Vakuum eingedampft.
Ausbeute: 1,93 g (74.5 %) .
R^ = 0,76.
R^ = 0,76.
b) H-GIn-Pro-NHCpHn·TFA
M -- 270 (freie Base) M = 367 (TFA-SaIz)
1,9 g (7,2 mMol) BOC-GIn-PrO-NHG2Hc weiden. Jn 1OmI
Trifluoressigsäure gelöst. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 20 Minuten lang gerührt und dann im Vakuum
Il
eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther verrieben,
abfiltriert und in Vakuum getrocknet. Ausbeute: 1.52 g
(58 56) .
R* = 0,45; R^ = 0,45; R^ = 0,25; ' R^° = 0,30.
Die Substanz ist hygroskopisch.
0 = -34,8° (c = 1, Methanol).
0 = -34,8° (c = 1, Methanol).
M = 557
500 mg (1,85 mMol) H-GIn-PrO-NHC2H5. TFA warden Jn 10 ml
Dimethylformamid gelöst. Der pH-Wert wird mit Triathylmin auf 8 eingestellt. Zu dem Reaktionsgemisch gibt man
608 g (2 mMol) tert.-Butoxycarbonyl-tryptophan in 10 ml
Dimethylformamid und 620/ul (4 mMol) N,N'-DiisopropylcarbodiMd.zu«
Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 48 Stunden lang gerührt und dann im Vakuum eingedampft.
Der Rückstand wird in Athylacetat gelöst und mit
Äther ausgefällt. Das ausgefallene Produkt wird abfil-
It
triert, mit Äther gewaschen und dann getrocknet.
Ausbeute: 740 mg (72 %).
Rf = 0,75; R^ = 0,38. - 36 -
BAD ORIGINAL
dl H-Trp-Gln-Pro^HCgHg.TFA
M = 456,5 (freie Base)' M = 554 (TFA-SaIz)
700 mg (1,25 mMol) OOC-Trp-Gln-Pro-^jHCpH,- werden in
15mleine3 im Volucwerhältnis 1:1 bereiteten Gemisches aus
Trifluoressigsäure und Oichlormethan gelöst. Die Lösung
wird' bei Raumtemperatur 20 Minuten lang gerührt und
anschließend im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird
mit Äther verrieben, abfiltriert und getrocknet. Das
Rohprodukt (500 mg") /vird an einer "ilikagelsäule mit einem
im Volumverhältnis 47:20:6:11 bereiteten Gemisch aus Athylacetat, Pyridin, Essigsäure und Wasser chromatographisch
gereinigt. Die Produktfraktionen werden gesammelt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand
wird mit Äther verrieben. Man erhält 360 mg (52 %) eines weißen Pulvers.
R^ = 0,46; R? = 0,18.
Schmp.: 119-123 C; Ccd^0 = -4,8° (c = 0,1, 0,ln HCl).
R^ = 0,46; R? = 0,18.
Schmp.: 119-123 C; Ccd^0 = -4,8° (c = 0,1, 0,ln HCl).
e) BOC-Gly-Trp-Gln-Pro-NHCgHc;
M = 613,7
350 mg (0,76 mMol) H-Trp-Gln-Pro-'-HCpH,-.TFA werden in
Dimethylformamid gelöst und mit 104 mg ■>
0,8 mMol) BOC-Gly auf die im Schritt c) beschriebene Weise gekuppelt.
Man erhält 375 mg (81 %) einer kristallinen Substanz.
Rf = 0.88; R^ = 0,82; R^ = 0,61.
f) H-Gly-Trp-Gln-Pro-NHC 2Hc;.TFA
R = 609,6
375 mg (0,6 mMol) BOC-Gly-Trp-Gln-Pro-NHCgH^ werden
auf die im Schritt d) beschriebene Weise von der Schutzgruppe befreit und gereinigt. Man erhält 285 mg (76,6 %)
eines weißen Pulvers.
Rf = 0,08; R^ = 0,16; Rf = 0.67; Rf = 0,28.
Rf = 0,08; R^ = 0,16; Rf = 0.67; Rf = 0,28.
g)<G Iu-His-T rp-Ser-Ty T-GIy-TrP-GIn-PrO-NHC 0Hc;
M = 1216,4
286 g (0,4 mMol) des wie im Beispiel 6, Schritt g, hergestellten Pentapeptidhydrazids <Glu-His-Trp-
- 37 -
BAD ORIGINAL
-Ser-TyΓ-'JpH werden mit 243,3 mg (0,4 "Mol1 des gemäß
Schritt m) des Beispiels 6 erhaltenen H-Gly-Trp-Gln-Pro-
-NHC2H^.TFA gekuppelt. Man erhält 252,9 mg (52%)
Reinsubstanz.
R^ = 0,26; R^ = 0,32.
Aminosäurenanalyse'
Ser 0,87, GIu 2,02, fro 0,91. Clv 1,CO ,
Tyr 1,12, His 1,05, ~rp I1SC.
Bereiten von Inoektionslösungen für intramuskuläre, subkutane oder intravenöse Verabreichung.
a) Das Gonadoliberinderivat der allgemeinen Formel I, beispielsweise das des Beispieles 1, wird in einer
Konzentration von 1 bis 10 mg/ml in destilliertem Wasser, physiologischer Natriumchloridlösung oder
gepufferter wäßriger Lösung gelöst. Die Lösung wird steril filtriert und dann in 50 bis 500 ug Wirkstoff
enthaltenden Volumina in Ampullen gefüllt und lyophilisiert,
worauf die Ampullen verschlossen werden.
Die Anwendung kann wie folgt erfolgen.
Vor der Anwendung wird die in der Ampulle enthaltene Substanz in 1 bis 10 ml destilliertem V/asser
gelöst und von der Lösung wird eine der notwendigen Dosis entsprechende Menge injiziert.
b) Aus dem Gonadoliberinderivat der allgemeinen Formel I, beispielsweise dem des Beispieles 1, wird
mit einer 0,9 Gew.-% NaGl und 0,9 Gew.-% Benzylalkohol enthaltenden wäßrigen Lösung eine Lösung mit
einer Konzentration von 20 bis 500 ug/ml bereitet
und diese wird in Ampullen gefüllt. Die Ampullen
- 38 -
BAD ORIGINAL
-ίο-
werden verschlossen. Die auf diese Weise hergestellten Präparate sind zur unmittelbaren Verabreichung
geeignet.
Zusammenfassung
Claims (1)
- Patentansprüche
Λ,^ Gonadoliberinderivate der allgemeinen Formel2 3 4 5678 9 10 <Glu-His-Trp-Ser-Tyr-X1-X2-X5-worinfür einen Rest von L-Pyroglutaminsäure steht,His einen Rest von L-Histidin bedeutet, . 'Trp einen Rest von L-Tryptophan darstellt,Ser für einen Rest von L-Serin steht, Tyr einen Rest von L-Tyrosin bedeutet,Xx. einen Rest von Glykokoll oder einer natürlichen oder synthetischen D-Aminosäure darstellt,Xo für einen Rest von L-Phenylalaninoder L-Tryptophan oder einer L-Aminosäure mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen) in der Seitenkette steht,Proeinen als Seitenkette einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatom(en) oder einen CarboxyäLkylamid- oder Carboxamidoalkylrest mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen aufweisenden Rest einer L-Aminosäure bedeutet,für einen Rest von L-Prolin steht undeinen Rest von Glycinamid oder einen Alkylamidrest mit 1 bis 4 Kohlenstoff atom(en) bedeutet,mit der weiteren Maßgabe,im Falle daßfür einen Rest
einer natürlichen
odersynthetischen
D-Aminosäure
steht undeinen Rest vonL-Tryptophanbedeutet,von einem Rest von L-Leucin verschieden ist,sowie ihre Säureadditionssalze und Komplexe.2.) Gonadoliberinderivate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Rest einer natürlichen oder synthetischen D-Aminosäure, für den X^ stehen kann, einer von D-Phenylalanin, D-Tyrosin oder D-DiJodtyrosin oder von einer solchen mit einer Seitenkette mit 1 bis 4 Kohlenstoffatom(en) ist.3.) Gonadoliberinderivate nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Rest einer L-Aminosäure, für den X2 stehen kann, ein solcher mit 3 oder 4, insbesondere 4, Kohlenstoffatomen in der Seitenkette ist.4.) Gonadoliberinderivate nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Rest einer L-Aminosäure, für den Xp stehen kann, einer von L-Leucin, L-Isoleucin, L-Norleucin, L-Norvalin, L-Valin oder L-Methionin ist.5.) Gonadoliberinderivate nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Rest einer als Seitenkette einen Alkyl-, Carbaxyalkylanid.-- oder Carboxamidoalkylrest aufweisenden L-Aminosäure, für welchen X, stehen kann, ein solcher, dessen Seitenkette 3 oder 4 Kohlenstoffatome aufweist, ist.6.) Gonadoliberinderivate nach Anspruch 1 bis 5i dadurch gekennzeichnet, daß der Rest einer als Seitenkette einen Alkyl-, Carbcoyalkylamid- oder Carboxamidoalkylrest aufweisenden L-Aminosäure, für welchen X, stehen kann, ein Rest von L-Leucin, L-Glutamin, L-Glutaminsäure, L-Isoleucin, L-Norleucin, L-Norvalin oder L-Valin ist.7.) Gonadoliberinderivate nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkylamidrest, für den X^ stehen kann, ein solcher mit 1 oder 2, insbesondere 2,Kohlenstoffatom(en) ist.copy !8.) <Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-Gly-NH2 sowie seine Säureadditionssalze und Komplexe.9.) <Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Gln-Pro-Gly-NH2 sowie seine Säureadditionssalze und Komplexe.10.) <Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Leu-Pro-NHC2H5 sowie seine Säureadditionssalze und Komplexe.11.) <(Glu-His-Trp-Ser~Tyr-Gly-Phe-Gln-Pro-Gly-NH2 sowie seine Säureadditionssalze und Komplexe.12.) </GIu-Hi s-Trp-Ser-Tyr-Gly-Phe-Leu-Pr 0-GIy-NH2 sowie seine Säureadditionssalze und Komplexe.15.) <'Glu-His-Trp-Ser-Tyr~D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHC2H5 sowie seine Säureadditionssalze und Komplexe.14.) (Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Gln-Pr0-5 sowie seine Säureadditionssalze und Komplexe.15.) Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß mana) unter Anwendung der Peptidsynthese in der festen Phase die entsprechend geschützten Aminosäuren schrittweise in der gewünschten Reihenfolge durch Kuppeln mit Carbodiimid oder über einen aktiven Ester an einem festen Träger fixiert und gegebenenfalls das Peptidprodukt durch saures oder basisches Abspalten vom Träger ablöst und gegebenenfalls außerdem die Schutzgruppe(n) vor, während oder nach dem Abspalten vom Träger ebenfalls abspaltet oderb) je nach dem chemischen Charakter der variablen Aminosäureteile in der herzustellenden Verbindung das Endprodukt aus in gewünschtem Maße geschützten Aminosäuren durch entsprechende Kombinationen von schrittweiser Kondensation und Fragmentkondensation aufbaut,worauf man gegebenenfalls in an sirh bekannter Weise die erhalterm Gonadoliberinderivate der allgemeinen !Formel I in Säureadditionssalze oder Komplexe überführt beziehungsweise . aus den erhaltenen Säureadditionssalzen die freien Gonadoliberinderivatbasen freisetzt und/oder sie in andere Salze überführt.16.) Verfahren nach Anspruch 14a), dadurch gekennzeichnet, daß man als festen Träger ein Benzhydrylaminharz oder ein Polystyrol/Divinylbenzol-Harz mit angekuppeltem BOC-Prolin verwendet.17.) Verfahren nach Anspruch 14a) oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß man das Ablösen des geschützten Peptidproduktes vom Träger durch Behandeln mit Fluorwasserstoff und/oder durch Äthylammonolyse durchführt.18.) Verfahren nach Anspruch 14b), dadurch gekennzeichnet, daß man das Pentapeptidazid der Formel<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-N5mit einem Tetra- oder Pentapeptid der allgemeinen FormelX1-X2-X5-PrO-X4 IIICOPYworin Xxj , Xp » Χχ und Χ4 cLie in den Ansprüchen 1 bis 7 angegebenen Bedeutungen haben, kondensiert.19·) Verfahren nach Anspruch 14b), dadurch gekennzeichnet, daß man ein Hexapeptidazid der allgemeinen Formel^Glu-His-Trp-Ser-Tyr-X^-N, IV ,worin X,- die im Anspruch 1 oder 2 angegebenen Bedeutungen hat, mit einem Tri- oder Tetrapeptid der allgemeinen FormelX2-X3-PrO-X4 V ,worin X^ , X? und X4 die in den Ansprüchen 1 oder 5 bis 7 angegebenen Bedeutungen hat, kondensiert.20.) Verfahren nach Anspruch 14b), dadurch gekennzeichnet, daß man ein Heptapeptidazid-der" allgemeinen Formel<Glu-Hi s-Trp-Ser-OSjrr-X,, -X5-N5 VI ,worin Xx, und Xp die in den Ansprüchen 1 bis 4 angegebenen Bedeutungen haben, mit einem Di- oder Tripeptid der allgemeinen FormelX5-PrO-X4 VTI ,worin X, und X4 die in den Ansprüchen 1 oder 5 bis 7 angegebenen Bedeutungen haben, kondensiert.21.) Arzneimittel beziehungsweise pharmazeutische Präparate, gekennzeichnet durch einen Gehalt an 1 oder mehr Verbindung(en) nach Anspruch 1 bis 14 als Wirkstoff (en), gegebenenfalls zusammen mit 1 oder mehr üblichen pharmazeutischen Konfektionierungsmittel(n).Beschreibung
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