DE1418599B2

DE1418599B2 - alpha-(Omega-tert.-Butyloxycarbonyl)-alphaamino-essigsäuren, diese enthaltende Peptide und Derivate dieser Verbindungen sowie Verfahren zur Einführung der tert-Butyloxycarbonylschutzgruppe

Info

Publication number: DE1418599B2
Application number: DE1418599A
Authority: DE
Inventors: Werner Dr. Basel Rittel; Robert Prof. Dr. Riehen Schwyzer
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1959-08-24
Filing date: 1960-08-16
Publication date: 1974-10-24
Also published as: GB957892A; DE1418599A1; DE1418599C3; US3264279A; CH427841A

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind η - (ω - tert. - Butyloxycarbonyl) - α - aminoessigsäuren und diese enthaltende Peptide und Derivate dieser Verbindungen, worin die a-Aminogruppe durch die ρ - (Phenylazo - benzyloxy) - carbonylgruppe, die p-(p'-Methoxyphenylazo-benzyloxycarbonyl)-gruppe, die Carbobenzoxygruppe oder die Triphenylmethylgruppe geschützt ist und worin die Carboxylgruppe in Form der freien Carboxylgruppe, einer Niederalkylestergruppe, der Hydrazid- oder der Amidgruppe vorliegt.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Einführung der tert.-Butyloxycarbonylschutzgruppe bei a-(w-Aminoalkyl)-a-aminoessigsäuren und ihren Derivaten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die genannte ω-Aminogruppe mit tert.-Butyloxycarbonylazid acyliert. .

Es ist zwar aus J. Arner. Chem. Soc. 79,1957, S. 4686ff, und S. 6180, bereits bekannt, zum Schutz von Aminogruppen bei der Peptidsynthese die' tert.-Butyloxycarbonylgruppe zu verwenden. Dieses Verfahren ist aber, wenn man das schwierig herzustellende und leicht zersetzliche tert.-Butyloxycarbonylchlorid verwendet, in der Praxis nicht durchführbar. Auch die Umsetzung von Aminosäureestern mit Phosgen zu Isocyanaten und die Reaktion der Isocyanate mit tert.-Butanol ist sehr kompliziert und im allgemeinen technisch nicht durchführbar. Als weiteres Verfahren, zu tert.-Butyloxycarbonyl-aminosäüren zu gelangen, wird die Umsetzung mit tert.-Butyloxycarbonylphenylester oder -p-nitrophenylester genannt. Dieses Verfahren liefert aber schlechte^ Ausbeuten (vgl. auch deutsche Auslegeschrift 1 136 710, Beispiele 3, 6, 13).

In J. Amer. Chem. Soc. 79, 1957, S.4427ff., ist ferner die Acylierung von Aminen mit tert.-Butyloxycarbonylazid beschrieben. Die Acylierung von Aminosäuren wurde dagegen nicht untersucht. Da angegeben ist, daß beispielsweise die Acylierung von Anilin schwieriger ist als die der stärker basischen Verbindungen und Acetamid sich nicht acylieren ließ, erschien die Verwendung dieses Acylierungsmittels Tür Aminosäuren wenig erfolgversprechend.

Erfindungsgemäß verwendbare a-(a>-Aminoalkyla-aminoessigsäuren sind beispielsweise a,y-Diaminobuttersäure, Ornithin, Hydroxylysin und vor allem Lysin.

Als Derivate der genannten a-(w-Aminoalkyl)-a-aminoessigsäuren kommen solche der Carboxylgruppe, der a-Aminogruppe oder beider Gruppen in Betracht. So kann die Carboxylgruppe durch eine Niederalkylestergruppe verestert oder in Form eine Hydrazid- oder der Amidgruppe vorliegen oder, wi im Fall von Peptiden, als Säureamidgruppierun vorhanden sein. Die zum Schutz der a-Aminogrupp dienenden Gruppen, wie die Carbobenzoxygruppe (ir folgenden mit Z abgekürzt), die p-(Phenylazo-benzyj oxy)-carbonylgruppe (PZ) oder die p-(p'-Methox> phenylazobenzyloxy)-carbonylgruppe (MZ) sind durc Hydrogenolyse entfernbar. Die a-Aminogruppe kan: aber auch Teil einer Säureamidgruppe, wie in einer Peptid, sein.

Viele biologisch wichtige Polypeptide enthalte Reste von α-Aminoalkyl-a-aminoessigsäuren, vor aller von Lysin, so z. B. Lysin-Vasopressin, die Melanophc ren stimulierenden Hormone, Corticotropin und Insi lin. Daher sind Methoden, welche die Synthese vo Peptiden ermöglichen, die Reste von a-(co-Aminoalkyl a-aminoessigsäuren, besonders Lysin, enthalten, vo großer Bedeutung.

Der Erfolg einer derartigen Synthese hängt wei: gehend von der Wahl geeigneter Schutzgruppen zi Blockierung der ω-Aminogruppe ab.

Die bisher verwendeten, in der Peptidchemie übl chen Schutzgruppen lassen sich in manchen Fälle nicht ohne Veränderung des Moleküls abspaltei wodurch ihre Anwendbarkeit nachteilig eingeschränlj

ist, teils stehen sie einer selektiven Abspaltung gleicl zeitig vorhandener Schutzgruppen, sei es einer Amin<j, oder Carboxylgruppe, im Wege.

Die Carbobenzoxygruppe oder entsprechende Gru pen, ζ. B. die p-(Phenylazo)-benzyloxy-carbonylgrupt oder die p-(p'-Methoxyphenylazo)-benzyloxy-carb nylgruppe, haben in gewissen Peptidsynthesen d Nachteil, daß sie sowohl reduktiv als auch hydrolytis abspaltbar sind und daher einer selektiven Fre setzung der a-Aminogruppe, welche mit auf die gleic

Art abspaltbaren Schutzgruppen blockiert ist, im Wej stehen. Weiter versagt von den gebräuchlichen M thoden zur Abspaltung dieser Gruppen die katalytisc! Hydrierung bei schwefelhaltigen Peptiden, Abspaltui mit Halogenwasserstoff in organischen Lösungsmitte

kann vielfach nicht angewendet werden, weil d; dabei gebildete Benzylhalogenid benzylierend wir (zum Beispiel wird das S-Atorri im Methionin benz liert). Die Reduktion mit Natrium in flüssigem An moniak schließlich wird von vielen störenden Nebe;

reaktionen begleitet. Ferner ist auch die selektr hydrogenolytische Freisetzung vorhandener Benzj estergruppen bei Vorhandensein solcher Carboben oxyreste unmöglich.

Η —

PZ-

Die Tritylgruppe kann zwar durch milde saure

Hydrolyse entfernt werden, sie wird aber auch durch katalytische Hydrierung angegriffen. Deshalb ist auch ) hier die Verwendung von hydrogenolytisch abspalt-I baren Gruppen, wie Z, PZ oder MZ, an der «-Amino-) gruppe nicht mehr möglich, wenn die andere Aminogruppe durch Tritylierung blockiert ist.
/ Der Trifluoracetylrest schließlich wird zwar durch Alkali unter relativ milden Bedingungen abgespalten, ι Dabei werden aber auch durch Veresterung geschützte .ι Carboxylgruppen angegriffen; auch der Trifluor-■ acetylrest läßt sich somit nicht allgemein verwenden. r Dagegen ist der erfindungsgemäß vorgeschlagene tert.-Butyloxycarbonylrest in vortrefflicher Weise allgemein und ohne die genannten Nachteile zum Schutz der Aminogruppe des Aminoalkylrestes in «-Aminoalkyl-H-aminoessigsäuren und ihren Derivaten geeignet. Die tert.-Butyloxycarbonylgruppe wird durch - katalytische Hydrierung nicht angegriffen; sie erlaubt i daher die Verwendung von hydrogenolytisch abspalt-1 baren Resten, wie Z, PZ, MZ, Trityl und ähnlichen ) zum selektiven Schutz und Freisetzen der a-Aminor gruppen und läßt sich darüber hinaus durch äußerst ί milde saure Hydrolyse entfernen, ohne daß dabei ) vorhandene Estergruppen entfernt oder sonstige stö- '- rende Nebenreaktionen eintreten würden. Anderseits ι läßt sich eine Estergruppe durch alkalische Verseifung r leicht abspalten, ohne daß die tert.-Butyloxy-carbonylgruppe entfernt wird.

Die Verfahrensprodukte, a-(cu-tert.-Butyloxycarbor nylamino)-a-aminoessigsäuren und ihre Derivate, sind '. neu. Sie stellen wertvolle Zwischenprodukte in der L Peptidsynthese dar. Dabei kann man z. B. so vorgehen, .) daß man in a-(to-tert.-Butyloxycarbonyl-aminoalkyl)-

I α-aminoessigsäuren, z. B. in N^e-tert.-Butyloxycarbo- 35 pz

■> nyl-lysin, die a-Aminogruppe in bekannter Weise mittels eines durch Hydrierung abspaltbaren Restes, i z. B. Z, PZ oder MZ, schützt und die freie Carboxylgruppe, gegebenenfalls nach überführung in ein reaktionsfähiges Derivat, zur Bildung einer neuen 1 Peptidbindung heranzieht. Hydrogenolytische Abe spaltung der Schutzgruppe in α-Stellung liefert dann "'ein Derivat mit freier Aminogruppe, welches zur 1 !weiteren Peptidsynthese geeignet ist. Zum Schluß :lder Synthese kann die tert.-Butyloxycarbonylgruppe κ durch milde saure Hydrolyse, z. B. durch Salzsäuregas in organischen Lösungsmitteln oder durch verdünnte, ί] wäßrige Mineralsäure abgespalten werden.
T Man kann aber auch, wenn Peptide hergestellt κ werden sollen, in denen die Verknüpfung nicht über ie die a-Aminogruppe, sondern über die andere Aminoic gruppe erfolgt, zunächst die a-Aminogruppe, wie ane gegeben, blockieren, dann den tert.-Butyloxycarbonyl- Λ rest durch milde, saure Hydrolyse selektiv entfernen ;£und die freie Aminogruppe zur Bildung einer neuen Ί Peptidbindung benutzen. Zum Schluß wird die Schutz- Λ gruppe an der a-Aminogruppe nach bekannten Mein thoden entfernt: ^:
e! In Peptidestern mit einer tert.-Bütyloxycärbonyl-Ji aminogruppe und einer hydrogenolytisch abspaltrl baren Schutzgruppe an der a-Aminogruppe kann ζ man die Carboxygruppe durch alkalische Verseifung nfreisetzen und sie, gegebenenfalls nach überführung ei in ein reaktionsfähiges Derivat, zur Bildung einer ^weiteren Peptidbindung heranziehen. i> Beispielsweise kann nach dem erfiridungsgemäßen η Verfahren das Dipeptid L-Lysyl-L-lysin nach folgendem Schema hergestellt werden, wobei gleichzeitig für die weitere Peptidsynthese brauchbare Derivate als Zwischenprodukte erhalten werden:

Lys

— OH H

BOC

Lys

BOC

Lys

H —	Lys
H —	BOC
7	Lys
	BOC
7	Lys
	BOC
H —	Lys
BOC
Lys

— OH

-OH

— OH

-OCH₃

OCH,

BOC

Lys

— OCH,

BOC

H —

Lys

— OCH,

BOC

T —

Lys

— OCH,

BOC

Τ

Lys

— OH

-OH

BOC bedeutet den tert.-Butyloxycarbonylrest, T den Trityl-(Triphenylmethyl)-rest.

Der Pentapeptidrest L - Lysyl - L - lysyl - L - arginyl-L-arginyl-L-propyl, eine Teilsequenz der adrenocorticotropen Hormone, kann nach folgendem Schema erhalten werden:

BOC BOC Lys Lys

	NO₂
OH Η —	Arg
	NO₂
•τ	Arg

NO,

OH Η —

— OH T

Arg

NO,

Arg

OH Η —

— OH Η —

Pro

-OH

Pro

OC₄H₉

NO,

Arg

Pro

OC₄H₉

NO,

Arg

Pro

— OC₄H₉

	NO₂	NO₂
TP	Arg	Arg Pro
	NO₂	NO₂
TT	Arg	Arg Pro

!in ihi

— OC₄H₉ al K ar

OC₄H₉

OH

Eine weitere Teilsequenz des ACTH, das L-Lysyl-L-propyl-L-valyl-glycin, kann beispielsweise nach folgendem Schema hergestellt werden:

BOC

	BOC	BOC	NO₂	NO₂	Pro
ηρ	Lys	Lys	Arg	Arg
			NO₂	NO₂	Pro
TT	Lys	Lys	, Arg	Arg
					Pro
[T	Lys	Lys	Arg	Arg

PZ-

Lys

OH

— OH

VaI GIy

-OC₇H

2¹¹S

H —

VaI GIy

— OC,H

2¹¹S

z —	Pro	VaI	GIy

H —	Pro	VaI	GIy

	BOC	PZ-	Lys	Pro	VaI	GIy
PZ-	Lys
BOC	Pro	VaI	GIy

OC? H<

— OC₂H₅

— OH

gr at ai.

na H} Be

or ti ls

Fortsetzung

	BOC	Pro	VaI	GIy
Η —	Lys
		Pro	VaI	GIy
LJ	Lys

OH

Die Einführung der tert.-Butyloxycarbonylgruppe geschieht vorteilhaft durch Acylierung eines Metallkomplexes, vorzugsweise eines Kupferkomplexes der freien Aminosäure oder durch Acylierung solcher Derivate, in denen die «-Aminogruppe geschützt oder in einer Peptidbindung vorliegt. Vorzugsweise wird hierbei das tert.-Butyloxycarbonylazid in wäßriger Lösung mit einem Kupferkomplex der «-(ω-Aminojalkyl)-a-aminoessigsäuren umgesetzt. Der erhaltene Kupferkomplex von « -(ω - tert. - Butyloxycarbonyl- |aminoalkyl)-«-aminoessigsäuren ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

j In den erhaltenen tert.-Butyloxycarbonyl-Verbin- !düngen können freie «-Aminogruppen oder Carboxylgruppen in üblicher Weise abgewandelt oder funktionell abgewandelte «-Aminogruppen oder Carboxylgruppen auf beliebiger Stufe freigesetzt werden.

So kann man die «-Aminogruppen acylieren, ζ. Β. durch die obengenannten hydrogenolytisch abspaltbaren Schutzgruppen, oder die Reste weiterer Aminosäuren oder Peptide substituieren. Freie Carboxylgruppen können ebenfalls geschützt, z. B. mittels niederer Alkohole, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, verestert werden, oder in reaktionsfähige Derivate, wie reaktive Ester, Anhydride, oder Azide übergeführt oder in Amidgruppen, z. B. solche von Aminosäuren oder Peptiden, umgewandelt werden.

Weiter lassen sich z. B. auf beliebiger Stufe die genannten Schutzgruppen der «-Aminogruppe durch Hydrogenolyse abspalten und/oder Estergruppen unter Beibehaltung der tert. - Butyloxycarbonyl - Schutzgruppe hydrolysieren.

Die genannten Reaktionen werden in üblicher Weise bei tiefer, gewöhnlicher oder erhöhter Temperatur, in An- oder Abwesenheit von Verdünnungs- und/oder IKondensationsmitteln oder Katalysatoren, im offenen bder geschlossenen Gefäß unter Druck durchgeführt. ! Die Erfindung betrifft auch diejenigen Ausführungsformen des Verfahrens, bei denen man auf irgendeiner Stufe als Zwischenprodukte erhältliche Verbindungen als Ausgangsstoffe verwendet und die fehlenden Verfahrensschritte durchführt, oder das Verfahren auf irgendeiner Stufe abbricht.

! Je nach der Arbeitsweise erhält man Verbindungen mit freien Amino- und/oder Carboxylgruppen in Form ihrer Salze mit Säuren und/oder Basen. Diese lassen sich in üblicher Weise ineinander überführen.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen näher beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

Beispiel 1
NMert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin ⁶'

a) Kupferkomplex: 15 g L- Lysin - monohydro- :hlorid werden in 150 cm³ Wasser gelöst, 15 g basisches Kupfercarbonat zugegeben und das Reaktionsgemisch 1 Stunde lang zum Sieden erhitzt. Hierauf wird vom ungelösten Kupfercarbonat abgenutscht und mit etwas Wasser nahgewaschen. Nach Abkühlen wird die tiefblaue Kupfer-Lysin-Lösung (Volumen 180 cm³) mit 5,4 g Magnesiumoxyd und einer Lösung von 20,8 g tert.-Butyloxy-azidoformiat in 260 cm³ Methanol versetzt und unter intensivem Rühren 18 Stunden bei 45° gehalten. Dabei scheidet sich der Kupferkomplex der N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysins als hellblauer Niederschlag ab. Das Reaktionsgemisch wird zur Entfernung des überschüssigen Magnesiumoxyds unter Eiskühlung mit 200 cm³ eiskalter 2 n-Essigsäurelösung versetzt und 1 Stunde bei 5° gerührt. Dann wird das hellblaue N^£-tert.-Butyloxycarbaonyl-L-lysin-Kupfer abgenutscht, gründlich mit Wasser und Methanol gewaschen und getrocknet. Ausbeute 14 g (62%), F. etwa 220 bis 240° (Zersetzung).

b) Freies N'-tert.-Butyloxycarbonyl-L -lysin aus dem Kupferkomplex: Der unter a) erhaltenene Kupferkomplex von N^c-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin (14 g) wird suspendiert in 300 cm³ Wasser und 50 cm³ 2 η-Ammoniaklösung zugegeben, wobei teilweise Lösung eintritt. Dann wird unter intensivem Rühren ein kräftiger Schwefelwasserstoffstrom eingeleitet (während etwa 3 Stunden). Hierauf wird das ausgefallene Kupfersulfid durch ein Kohlefilter abgenutscht, das klare Filtrat unter Eiskühlung mit 75 cm³ 2 n-Essigsäure versetzt und so lange Luft durchgeleitet, bis der Geruch nach Schwefelwasserstoff verschwunden ist. Die Lösung wird bei 40° am Vakuum eingeengt, wobei sich ein ersten Anteil N^£-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin in mikrokristalliner Form abscheidet. Durch wiederholtes Einengen der Mutterlauge werden insgesamt 11,5 g rohes N^£-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin vom F. 235 bis 255° erhalten (92% der Theorie). Zur weiteren Reinigung kann das Rohprodukt aus Wasser umkristallisiert werden; F. 245 bis 25Γ.

Das Produkt ist in den gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln schwer löslich; etwas löslich in Wasser, leicht löslich in verdünnten Alkalien. In verdünnter Salzsäure löslich unter Gasentwicklung (Zersetzung, vgl. unten).

Bei Papierchromatographie im System tert.-Butanol—n-Butanol—Wasser (40:30: 30), R_rWert = 0,73; im System sek.-Butanol—Isopropanol—Monochloressigsäure—Wasser (70:10:3 :40), R_f-Wert = 0,80.

Die tert.-Butyloxycarbonyl-gruppe kann nach bekannten Methoden durch Halogenwasserstoff in organischen Lösungsmitteln oder vorteilhaft in verdünnter, wäßriger Säure abgespalten werden. Eine Probe NMert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin zersetzt sich beim Auflösen in 2 η-Salzsäure unter Gasentwicklung bei Zimmertemperatur. Nach 30 Minuten ist papierchromatographisch nur noch Lysin, kein Ausgangsmaterial nachweisbar.

409 543/349

Beispiel 2

N'-Carbobenzyloxy-NMert.-butyloxycarbonyl-L-lysin

2,46 g des im Beispiel 1 erhaltenen, rohen N'-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysins werden unter Eiskühlung gelöst in 5,5 cm³ 2 η-Natronlauge und dann unter Rühren innerhalb von 30 Minuten gleichzeitig 6,0 cm³ 2 η-Natronlauge sowie eine Lösung von 1,90 g Carbobenzoxychlorid in 3 cm³ Toluol eingetropft. Das Reaktionsgemisch wird weitere 2 Stunden bei 5 bis 10° gerührt und sodann die Toluolphase abgetrennt. Die wässerige Lösung wird mit etwas Äther nachgewaschen und unter Eiskühlung durch Zugabe von 10% Zitronensäurelösung auf pH 2 gebracht. Das ausgeschiedene öl wird in Äther aufgenommen, die Ätherlösung mit etwas Wasser gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet. Eindampfen der Lösung gibt N^a-Carbobenzyloxy-N^c-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin als öl, das ohne Reinigung weiter umgesetzt werden kann. Gemisch 1 Stunde bei 5° gerührt. Hierauf werden in 30 cm³ Dioxan zugefügt und eine Lösung von 3,30 gj [«] ρ - Phenylazo-benzyl-kohlensäurechlorid in 30 cm³ / Dioxan unter intensivem Rühren im Verlauf von an 30 Minuten zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird

über Nacht bei Zimmertemperatur intensiv gerührt,

sodann 200 cm³ Wasser zugegeben und das Dioxanjerh durch Einengen im Vakuum entfernt, wobei viel amorphes, orangerotes Material ausfällt (Gemisch von p-Phenylazo-benzylalkohol und dem Magnesiumsal^ des N^a-(p-Phenylazo-benzyloxy-carbonyl)-N^E-tert.-! butyloxycarbonyl-L-lysins). Nach Zugabe von viel Essigester und Kühlen auf 5° wird die wässerige Phase mit eiskalter, 10%iger Zitronensäurelösung au pH 2 gebracht, wobei sich nach Umschütteln das

gesamte gefärbte Material im Essigester löst. Die Pal Essigesterlösung wird hierauf mit etwas Wasser uncJKo dann so viel mal mit verdünnter Ammoniumhydroxyd^gefi lösung gewaschen, bis diese nur noch schwach gelt

Beispiel 3
N^c-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester gefärbt ist. (Die organische Phaseist immer noch star orangerot gefärbt und gibt beim Eindampfen 1,5 rohen p-Phenylazobenzylalkohol.) Die stark orangegelb gefärbten Ammoniumhy

a) N^a-Carbobenzyloxy-N^£-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester: 0,88 g des im Beispiel 2 erhaltenen Rohprodukts werden in 30 cm³ Äther gelöst und 5 cm³ 0,6 n-Diazomethan in Äther zugegeben. Die gelbe Lösung wird 15 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Nach Entfernen des überschüssigen Diazomethans im Vakuum wird die Ätherlösung mit Natriumbikarbonatlösung und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfatlösung getrocknet und eingedampft. Der ölige Rückstand wird zur weiteren Reinigung an der 50fachen Menge Silicagel (»Davison«, Mesh 200) chromatographiert. Die mit Benzol-Chloroform-Gemischen (1:4) eluierten Anteile geben den analysenreinen N" - Carbobenzyloxy - Ν^ε - tert. - butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester als öl.

b) N^£-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester: 265 mg des unter a) erhaltenen, chromatographisch gereinigten Produkts werden in 20 cm³ Methanol gelöst und in Gegenwart von Palladiumkohle (10% Pd) hydriert (das entstehende CO₂ wird durch Ätznatron gebunden). Nach Aufnahme von etwas mehr als der berechneten Menge Wasserstoff kommt die Hydrierung zum Stillstand. Abnutschen des Katalysators und Eindampfen des Filtrats gibt NMert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester als öl. Das Rohprodukt ist für weitere Umsetzungen genügend rein. Es kann auch zur Charakterisierung in das kristalline Hydrochlorid übergeführt werden: Eine Probe des öligen Esters wird in wenig Methanol gelöst, die Lösung auf —15° gekühlt und mit der genau berechneten Menge Salzsäure in Methanol versetzt. Eindampfen der Lösung gibt kristallines N^£-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester-hydrochlorid. Nach Zerreiben mit Äther ist der Schmp. 135 bis 148°. Umkristallisation aus Methanol—Äther gibt analysenreines Material vom F. 148 bis 151 ° (Nadeln). droxydauszüge werden vereinigt, mit viel Äther über schichtet und unter Kühlen auf 5° mit 10%iger Zitro nensäurelösung auf pH 2 gebracht. Das hierbei aus gefallene, gelbe öl wird in Äther aufgenommen, di Ätherlösung unter Eiskühlung mit Wasser gewaschen über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Dei Rückstand (3,0 g oranges Harz) wird zur weiterer n-B Reinigung an der 50fachen Menge Silicagel chromato graphiert. Die mit Chloroform eluierten Anteil geben aus Äther—Petroläther kristallisierte N^-(P-Phenylazo-benzyloxycarbonyl)-N^E-tert.-butyl· oxycarbonyl-L-lysin in orangegelben Nadeln, F. bis 104°. Umkristallisation aus Aceton—Äther gib analysenreines Material vom F. 105 bis 106°.

Die Substanz ist löslich in den meisten organischer Lösungsmitteln, schwer löslich in Wasser und Petrol äther, löslich in verdünnten Alkalien.

Beispiel 5

N"-(p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl)-

N^E-tert.--butyloxycarbonyl-L-lysyl-NMert.-butyloxy-carbonyl-L-lysin-methylester

der dric gen ölig sau eine Äth sau: verc Rüc küh

wen ;ege ,Or

Beispiel 4

N"-(p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl)-N^E-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin

2,46 g des im Beispiel 1 erhaltenen Rohproduktes werden feinpulverisiert, dann suspendiert in 30 cm³ Wasser, 1,00 g Magnesiumoxyd zugegeben und das Eine Lösung von 5,19 g N^£-tert.-Butyloxycarbonyl Lösi L-lysin-methylester und 9,70 g N"-(p-Phenylazo etwa benzyloxycarbonyl) - Ν^ε - tert. - butyloxycarbonyl züge L-lysin in 120 cm³ Acetonitril wird auf —15° gekühlentft und 4,35 g Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Nacldurc kurzer Zeit ist die Reaktionsmasse gallertig erstarr! unte Nach 30 Minuten bei — 15° und 2 Tagen bei 2° win Der mit viel Essigester versetzt, wobei das orange, gallertigJmit Material in Lösung geht und der DicyclohexylharnÄusl stoff ungelöst zurückbleibt. Er wird abgenutschjbis ! (4,14 g, Schmp. 224 bis 226°) und das Filtrat untegenii Kühlung mit Eis, mit 5%iger Zitronensäurelösunj Wasser, Natriumbikarbonat-Lösung und Wasser ge waschen, mit Natriumsulfat getrocknet und einge dampft. Der Rückstand (16,3 g) wird mit 100 cm , Äther durchgerieben, wobei er kristallisiert. Es werde] 10,9 g Dipeptid-derivat vom Schmp. 119 bis 12 erhalten. Die Kristalle enthalten noch etwas Dicyclcpepti hexylharnstoff. Zu dessen Abtrennung wird mit wenichloi Aceton versetzt, wobei 175 mg Harnstoff ungelösmeth bleiben. Nach Abnutschen wird das Filtrat mit vi Äther versetzt, wobei 9,14 g reines Dipeptidderivamit

in Nadeln, Schmp. 124 bis 128°, erhalten werden; [«]? = -2,0° ± 0,8° (c = 1,00 in Methanol).

Aus den Mutterlaugen werden durch Adsorption an Silikagel (»Davison«, Mesh 200, mit Zusatz von 10% Wasser) und Elution mit Benzol-Chloroform-Gemischen (1:4) noch 300 mg reines Dipeptidderivat erhalten.

Beispiel 6

NMert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-N^£-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester

N'-ip-Phenylazo-benzyloxycarbanoyl)-N^£-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-NMert.-butyloxycarbonyl-L-lysin

IO

1,29 g des im Beispiel 5 erhaltenen Produktes wer- : den in 80 cm³ Methanol gelöst, 3 cm³ 1 n-wässerige Essigsäurelösung zugegeben und in Gegenwart von Palladiumkohle (10% Pd) hydriert (das entstehende Kohlendioxyd wird in einem zweiten, mit Natronlauge gefüllten Hydriergefäß aufgefangen). Nach Aufnahme der berechneten Menge Wasserstoff kommt die Hydrierung zum Stillstand. Der Katalysator wird abgenutscht und das Filtrat zur Trockne verdampft. Der ölige Rückstand wird verteilt zwischen 10 cm³ ln-Essigsäure und 50 cm³ Äther, die Essigsäurelösung passiert einen weiteren Scheidetrichter mit weiteren 30 cm³ Äther. Beide Ätherphasen werden mit wenig Essigsäurelösung nachgewaschen, die wässerigen Phasen vereinigt, zur Trockne verdampft und der ölige Rückstand zur Entfernung der Essigsäure unter Eisr kühlung verteilt zwischen 20 cm³ Wasser-gesättigtem m-Butanol und 5 cm³ gesättigter Pottaschelösung. Die Butanollösung gibt nach Trocknen und Eindampfen 805 mg farblosen Firn (93% der Theorie). :Das Produkt ist nach Papierchromatographie einheitlich; im System η - Propanol—Äthanol—Wasser ;(7 : 1: 2) R_rWert = 0,88, im System n-Butanol—Ätha-1 nol—Wasser (2:2:1) R_f-Wert = 0,91.

Beispiel 7

40

145 mg des im Beispiel 5 erhaltenen Produkts werden in 3 cm³ Dioxan gelöst, 1 cm³ Wasser zugegeben, die Lösung auf 5° gekühlt und mit 0,22 cm³ 1,0 n-Natronlauge(l,l Äquivalente) versetzt. Die klare 1 Lösung wird 90 Minuten bei 5° belassen, hierauf mit 'etwas festem Kohlendioxyd neutralisiert, viel Wasser !zugegeben und das Dioxan im Vakuum vollständig !entfernt. Die schwach trübe, wässerige Lösung wird !durch Waschen mit etwas Äther geklärt und dann tunter Eiskühlung mit verdünnter Salzsäure angesäuert. (Der orange, flockige Niederschlag wird abgenutscht, ;imit viel Wasser neutral gewaschen und getrocknet. lAusbeute 108 mg orangefarbiges Harz, Schmp. etwa 60 Hbis 80°. Das Produkt ist für weitere Umsetzungen ^genügend rein.

d Beispiele

N"-Trityl-N^£-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N^e-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester

7 800 mg des im Beispiel 6 erhaltenen, öligen Di^ dpeptidesters werden in 12 cm³ trockenem Methyleniehlorid gelöst und 500 mg reines Triphenylchlor-'^methan sowie 0,28 cm³ absolutes Triäthylamin zuif gegeben. Nach 22 Stunden bei 20° wird die Lösung ζ mit Essigester verdünnt und unter Eiskühlung mit verdünnter Zitronensäurelösung und Wasser gewaschen. Trocknen der Lösung mit Natriumsulfat und Eindampfen gibt 1,21 g Harz. Nach mehrmaligem Umfallen aus Äther—Petroläther tritt Kristallisation ein. Es werden 1,10 Trityl - dipeptid - derivat vom Schmp. 132 bis 135° erhalten. Zur Analyse wird aus Äther—Petroläther umkristallisiert, Schmp. 134 bis 137°, [α] Ό⁴ = +3,7° ±0,8° (c = 1,09 in Methanol).

Das Produkt kann wie im Beispiel 10,4., beschrieben, auf milde Weise selektiv enttrityliert werden, ohne daß die tert.-Butyloxycarbonylgruppen angegriffen werden. Der erhaltene Ν^ε - tert. - Butyloxycarbonyl -L- lysyl-Ν^ε - tert. - butyloxycarbonyl -L- lysin - methylester ist nach Papierchromatographie in mehreren Systemen einheitlich und identisch mit dem im Beispiel 6 beschriebenen Produkt.

Beispiel 9

N^-Trityl-N^tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N^£-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin

1,47 g des im Beispiel 8 erhaltenen Produkts werden, wie im Beispiel 7 beschrieben, verseift. Analoge Aufarbeitung gibt 1,18 g N"-Trityl-N^E-tert.-butyloxycarbonyl -L- lysyl - Ν^ε - tert. - butyloxycarbonyl -L- lysin als Pulver vom Schmp. 73 bis 100°; [α]?= +1,0 ±0,7° (c = 0,98 in Methanol). Das Produkt ist für weitere Umsetzungen genügend rein.

Beispiel 10

N^a-Trityl-N^£-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-

NMert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-nitro-L-arginylnitro-L-arginyl-L-prolin-tert.-butylester

102 mg Ν^α - Trityl - Ν^ε - tert. - butyloxycarbonyl-L - lysyl - Ν^ε - tert. - butyloxycarbonyl - L - lysin, 82 mg Nitro-L-arginyl-nitro-L-arginyl-L-prolin-tert.-butylester und 3 cm³ Dimethylformamid werden bei —15° mit 33 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und die klare Lösung 30 Minuten bei -15° und 4 Tage bei 2° belassen. Hierauf wird vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff abgenutscht (16 mg, Schmp. 224 bis 226°) und das Filtrat im Hochvakuum von Dimethylformamid befreit. Der Eindampfrückstand wird mit viel Petroläther zerrieben und das ungelöste Pulver in Essigester aufgenommen, wobei weitere 2 mg Dicyclohexylharnstoff ungelöst bleiben. Die Essigesterlösung wird unter Eiskühlung wie üblich neutral gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand (105 mg Harz) wird zur weiteren Reinigung mit Äther zerrieben und aus Acetonlösung mit Äther ausgefällt. Das erhaltene Pentapeptidderivat zeigt Schmp. 125 bis 160°. Es stellt eine geschützte Teilsequenz der adrenocorticotropen Hormone dar.

Zur weiteren Charakterisierung wird eine Probe mit konzentrierter Salzsäure hydrolysiert (90 Minuten bei 40°); das dabei erhaltene L-Lysyl-L-lysyl-nitro-L-arginyl-nitro-L-arginyl-L-prolin zeigt im Papierchromatogramm im System n-Butanol—3% Ammoniaklösung (100:44) eine Laufstrecke von 6 cm (26 Stunden Laufzeit). Bei Hochspannungselektrophorese (45 Volt/cm; pH 1,9) bei 45 Minuten Laufzeit eine Laufstrecke von 15 cm (im Vergleich Lysin: 17 cm; Lysyl-lysin: 24 cm).

Selektive, milde Enttritylierung wie unter 4. beschrieben, gibt Ν^ε - tert. - Butyloxycarbonyl - L - lysyl-Ν^ε - tert. - butyloxycarbonyl - L - lysyl - nitro - L - arginyl-

nitro-L-arginyl-L-prolin-ten.-butylester. Die Substanz zeigt im Papierchromatogramm im System n-Butanol—Äthanol—Wasser (2:2:1) einen R_rWert von 0,87; im System n-Butanol—3% Ammoniaklösung (100:44) 0,95.

Der als Ausgangsmaterial verwendete Nitro-L-arginyl-nitro-L-arginyl-L-prolin-tert.-butylester kann wie folgt hergestellt werden:

1. N^a-Trityl-nitro-L-arginin

IO

20 g Nitro-L-arginin werden in 100 cm³ 1 n-Natronlauge gelöst und 20 cm³ Diäthylamin sowie 220 cm³ Isopropanol zugegeben. Hierauf werden im Verlauf von 15 Minuten 36 gTriphenylchlormethan zugegeben und 2 Stunden bei Zimmertemperatur intensiv ge- i$ rührt. Das ungelöste Material wird abgenutscht, mit 10% wässeriger Diäthylaminlösung nachgewaschen und das Filtrat im Vakuum vom Isopropanol befreit. Der dabei entstehende Niederschlag wird wiederum abgenutscht, das Filtrat mit etwas Äther gewaschen und dann unter Eiskühlung bei höchstens 5° mit fester Zitronensäure auf pH 2 gebracht. Das dabei ausfallende ölige Trityl-nitro-L-arginin wird unter Eiskühlung in viel Essigester aufgenommen, die Essigesterlösung mit Eiswasser neutral gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und bei 30° Badtemperatur im Vakuum zur Trockne verdampft. Das verbleibende Harz (16,2 g) wird unter Eiskühlung mit wenig Methanol versetzt und dann sofort viel Äther zugegeben. Der zuerst flockige Niederschlag kristallisiert bei 2° langsam durch. Erhalten werden 13,2 g kristallines Trityl-nitro-L-arginin, Schmp. 150 bis 156°.

2. L-Prolin-tert.-butylester
a) Hydrochlorid

35

In einer Druckflasche werden 5 g trockenes L-Prolin, 150 cm³ trockenes, alkoholfreies Chloroform, 5 cm³ reinste, konzentrierte Schwefelsäure und 150 cm³ flüssiges Isobutylen bei Zimmertemperatur so lange geschüttelt, bis Lösung eintritt (etwa 3 bis 4 Tage). Nach Abkühlen auf —15° wird das Druckgefäß geöffnet und das Isobutylen unter Feuchtigkeitsausschluß im Vakuum abdestilliert. Die verbleibende Chloroformlösung wird unter Eiskühlung mit 200 cm³ 20% Pottaschelösung gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet. Nach Abnutschen des Natriumsulfats wird der Gehalt der Chloroformlösung an L-Prolin-tert.-butylester durch Titration einer Probe mit verdünnter Salzsäure ermittelt. Hierauf wird die restliche Chloroformlösung auf —15° gekühlt und mit der genau berechneten Menge Salzsäure in Alkohol versetzt. Eindampfen und Zerreiben des Rückstandes mit Äther gibt 6,88 g kristallines L-Prolin-tert.-butylester-hydrochlorid (76% der Theorie) vom Schmp. 107 bis 108°. Das Produkt ist äußerst hygroskopisch.

b) freier Ester

Zur überführung in den freien Ester wird das Hydrochlorid in möglichst wenig Wasser gelöst, die Lösung mit viel Äther überschichtet und durch Zugabe von konzentrierter Pottaschelösung stark alkalisch gestellt. Der dabei ausgeschiedene Ester wird in dem Äther aufgenommen; die Ätherlösung gibt nach Trocknen und Eindampfen öligen L-Prolintert.-butylester, der direkt weiterverarbeitet werden kann.

^strc ^mn. ChI

3. Trityl-nitro-L-arginyl-L-proplin-tert.-butylester

9,15 g L-Prolin-tert.-butylester und 24,7 g Tritylnitro-L-arginin werden versetzt mit 250 cm³ Acetonitril und die Lösung auf —15° gekühlt. Hierbei scheidet sich das aus den beiden Aminosäurederivaten gebildete Salz aus. Dessen ungeachtet werden 11,1 g Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben und das Gemisch ι sich 72 Stunden bei 2° gerührt. Dabei geht das Salz in I= ( Lösung, und es scheidet sich ein Gemisch, bestehend: Per aus viel Dicyclohexylharnstoff und etwas Trityl-nitro-;so < L-arginin-anhydrid aus. Es wird abgenutscht (10,4g,^etw Schmp. 222 bis 224°) und das Filtrat im Vakuum zur! in f Trockne verdampft. Der Rückstand wird in Essig- tyle ester aufgenommen, unter Eiskühlung mit verdünnter¹ SaI: Zitronensäurelösung, Wasser, Natriumbikarbonatlö- Nit sung und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat ge- hch trocknet und eingedampft. Die neutralen Anteile (Sy; (30 g Harz) werden mit wenig Methanol bei 2° stehen- sau gelassen, wobei sich 1,2 g Trityl-nitro-L-arginin-anhydrid (Schmp. 180 bis 183°) abscheiden. Das Filtratj wird zur Trockne verdampft und aus Aceton—Äther; kristallisiert. Es werden 15,4 g Trityl-nitro-L-arginin- Γ L-prolin-tert.-butylester vom Schmp. 174 bis 176°i^unt< erhalten. Zur Analyse wird mehrmals aus Aceton—essi Äther kristallisiert, Schmep. 175 bis 178°; [«" = +37,10 ±0,7° (c = 1,24 in Methanol).

4. Nitro-L-arginyl-L-prolin-tert.-butylester

L-a win Eri

1,00 g Trityl-nitro-L-arginyl-L-prolin-tert.-butyl-™ ester werden in 15 cm³ 75%-Essigsäure gelöst und^^er 30 Minuten bei 30° belassen, wobei sich Kristalle von| Triphenylcarbinol abscheiden. Das Reaktionsgemisch| wird hierauf im Vakuum zur Trockne verdampftl und der Rückstand verteilt zwischen Wasser und! Äther. Man wäscht die wässerige Phase mit Ätherj und beide Ätherlösungen mit wenig verdünnter Essig-i säure nach. Die wässerigen Phasen werden vereinigt,! Z auf ein kleines Volumen eingeengt, mit wassergesät-!äth; tigtem n-Butanol überschichtet und unter Eiskühlung bon mit konzentrierter Pottaschelösung alkalisch gestellt. Ace Der ausgeschiedene freie Dipeptidester wird durch carl zweimaliges Extrahieren mit n-Butanol isoliert; die30 I Butanollösungen geben nach Waschen mit verdünnter die Natriumsulfatlösung, Trocknen mit Natriumsulfat;Nac Eindampfen und Trocknung im Hochvakuum 590 mg wo! Nitro-L-arginyl-L-prolin-tert.-butylester (98% der geh Theorie) als farbloses Harz. Das Produkt ist papier+win chromatographisch einheitlich und kann direkt weiter-)rie). verarbeitet werden. |in E

5. Trityl-nitro-L-arginyl-nitro-L-arginyl-L-prolin- i/ij tert.-butylester J^

582 mg Nitro - L - arginyl - L - prolin - tert. - butylesteij roh und 818 mg Trityl-nitro-L-arginin werden suspendierjchn in 20 cm³ Acetonitril und das Gemisch auf — 15jChl gekühlt, wobei sich das Salz aus beiden Komponenter von abscheidet. Nach Zugabe von 322tng Dicyclohexyl·von carbodiimid wird 3 Tage bei 2° gerührt. Sodann wire des das Gemisch von Dicyclohexylharnstoff und Trityl noc anhydronitro-L-arginin abgenutscht (297 mg, Schmp Hie 211 bis 217°) und das Filtrat zur Trockne verdampft rial Der Rückstand wird in Chloroform aufgenommerjgew

und unter Eiskühlung wie üblich gewaschen. Di neutralen Anteile (1,31 g Harz) werden mit Äthe zerrieben und das ungelöste Material (1,21 g) zu Abtrennung von Trityl-anhydro-nitro-L-arginin mi etwas Methanol versetzt. Dabei bleiben 78 mg, Schmp

geb star beil 9,7: vor

180 bis 184°, ungelöst. Das Filtrat wird zur Trockne verdampft und der Rückstand (914 mg) einer Gegen-. stromverteilung (Craig-Grundprozeß mit 42 Vertei-. lungsschritten) unterworfen. (Lösungsmittelsystem: i Chloroform — Tetrachlorkohlenstoff — Methanol — , Wasser = 5:5:8:2).

r Die Hauptmenge des Tripeptidderivates befindet , sich in den Fraktionen 10 bis 20 (Verteilungszahl G ! = 0,69). Diese Fraktionen werden vereinigt und das 1 Peptid aus Acetonlösung mit Äther ausgefällt. Das . so erhaltene Tripeptidderivat ist ein Pulver, Schmp. etwa 125 bis 150°; [α]? = -32,2°±1,1° (c = 1,15 ; in Methanol). Nach Entfernung der Trityl-n-tert.-bu-. tylestergruppe durch Hydrolyse mit konzentrierter _r Salzsäure (1 Stunde bei 40°) erweist sich das erhaltene

- Nitro-L-arginyl-nitro-L-arginyl-L-prolin als einheit-

- Hch im Papierchromatogramm; R_rWert = 0,43

- (System s-Eutanol—Isopropanol—Monochloressig-

- säure—Wasser = 70:10: 30:40).

6. Nitro-L-arginyl-nitro-L-arginyl-L-prolin-
[ tert.-butylester

. Das unter 5. erhaltene Tripeptidderivat wird wie unter 4. beschrieben enttrityliert und das erhaltene essigsäure Salz des Tripeptidesters in genau gleicher Weise in den freien Ester übergeführt. Der freie Nitro-L - arginyl - nitro -L- arginyl -L- prolin - tert. - butylester wird in 80% Ausbeute als farbloses Harz erhalten. Er ist papierchromatographisch rein. R_f-Wert = 0,81 !-im System s-Butanol—Isopropanol—Triäthylamin— d Veronal—Wasser = 100:10:0,2:1,8 g: 60.

Beispiel 11

N"-(p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl)-

NMert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-propyl-

L-valyl-glycin-äthylester

35

t, Zu einer Lösung von 5,47 g L-Prolyl-L-valyl-glycint-äthylester und 8,85 g N^a-(p-Phenylazo-benzyloxycargbonyl)-N^£-tert.-butyloxy-carbonyl-L-lysin in 150 cm³ t.Acetonitril werden bei —15° 4,00 g Dicyclohexylhcarbodiimid zugegeben. Die Mischung wird zuerst ie 30 Minuten bei —15°, dann bei 2° belassen, wobei _>rdie Reaktionsmischung allmählich gallertig erstarrt. , t, Nach 3 Tagen bei 2° wird viel Aceton zugegeben, ig wobei das orangefarbene, gallertige Material in Lösung ergeht und Dicyclohexylharnstoff ungelöst bleibt. Er r-wird abgenutscht (3,2 g, entsprechend 78% der Theory rie), das Filtrat zur Trockne verdampft, der Rückstand in Essigester aufgenommen und unter Eiskühlung wie üblich neutral gewaschen. Die neutralen Anteile i (14,72 g oranges Harz) werden mehrmals mit Äther zerrieben und das ätherunlösliche Material (12,6 g ei rohes Tetrapeptidderivat) zur weiteren Reinigung ;rl chromatographiert. Das Material wird in Benzol-5^C Chloroform-Gemisch = 1:4 gelöst und auf eine Säule en von 600 g Silicagel (»Davison«, Mesh 200, mit Zusatz ylJvon 10% Wasser) gebracht. Elution mit weiteren 3 1 rddes gleichen Gemisches gibt 0,80 g Material, aus dem yljnoch 290 mg Dicyclohexylharnstoff erhalten wird. ipi Hierauf wird der Hauptteil des orangefarbenen Mate-)ft| rials durch Elution mit 4 1 Chloroform aus der Säule eij gewaschen. Die stark orangeroten Chloroform-Eluate )i4 geben beim Eindampfen insgesamt 11,87 g Rückie stand. Er wird in wenig warmem Acetonitril gelöst;

beim langsamen Abkühlen scheiden sich insgesamt 9,72 g kristallines Tetrapeptidderivat in Nadeldrusen vom Schmp. 149 bis 151° ab.

Zur Analyse wird aus Aceton und Acetonitril umkristallisiert, Schmp. 151 bis 152°; [α]!⁶ = -70,5° ± 1,1° (c = 1,02 in Methanol). Das Produkt stellt eine geschützte Teilsequenz der adrenocorticotropen Hormone dar.

Der als Ausgangsmaterial verwendete L-Prolyl-L-valyl-gycinäthylester kann wie folgt hergestellt werden:

1. L-Valyl-glycin-äthylester

25,8 g Carbobenzyloxy - L - valyl - glycin - äthylester werden in 1 1 Äthanol gelöst, 65 cm³ 1,4 n-Salzsäure in Äthanol zugegeben und die Lösung in Gegenwart von Palladiumkohle (10% Pd) hydriert (unter Verwendung eines zweiten, mit Natronlauge gefüllten Hydriergefäßes zum Auffangen des entstehenden Kohlendioxyds). Nach Beendigung der Hydrierung wird vom Katalysator abgenutscht, das Filtrat zur Trockne verdampft und der Rückstand (20,6 g Harz) mit wenig Wasser versetzt, wobei der Hauptteil in Lösung geht. Eine Spur ungelöstes Material wird durch Filtration entfernt, das Filtrat mit 700 cm³ Essigester überschichtet und unter Eiskühlung durch Zugabe von Pottasche alkalisch gestellt. Der dabei ausfallende, ölige Dipeptidester wird in Essigester aufgenommen, die wässerige Phase mit weiteren 700 cm³ Essigester gewaschen, beide Essigesterphasen vereinigt, getrocknet und eingedampft. Es werden 18,5 g L-Valyl-glycinäthylester (öl) erhalten, der sofort weiterverarbeitet werden muß. Der als Ausgangsmaterial verwendete Carbobenzyloxy - L - valyl - glycin - äthylester ist bekannt.

2. Carbobenzyloxy-L-propyl-L-valyl-glycinäthylester

Zu einer auf —15° gekühlten Lösung von 13,6 g L-Valyl-glycin-äthylester und 16,9 g Carbobenzyloxy-L-prolin in 300 cm³ Acetonitril werden 13,9 g Dicyclohexylcarbodiimid gegeben. Nach 30 Minuten Stehen bei -15° und 18 Stunden bei 2° ist das Reaktionsgemisch vollständig durchkristallisiert. Es wird mit wenig kaltem Acetonitril zerrieben und abgenutscht. Das Kristallisat (29,7 g) (Gemisch von Carbobenzyloxy- L- prolyl- L- valyl -glycin-äthylester und Dicyclohexylharnstoff) wird wie unten beschrieben verarbeitet. Das Acetonitrilfiltrat wird "eingedampft und ergibt nach üblicher Aufarbeitung in Essigester 13,0 g Neutralteil.

Das aus dem Reaktionsgemisch direkt erhaltene Kristallisat (29,7 g) wird mit wenig warmem Aceton zerrieben, wobei 13,7 g Dicyclohexylharnstoff ungelöst bleiben. Das Filtrat ergibt 16,0 g Rückstand; er wird vereinigt mit den oben erhaltenen (13,0 g) Neutralteil; Kristallisation aus sehr wenig heißem Acetonitril gibt insgesamt 24,1 g kristallinen Carbobenzyloxy-L-prolyl-L-valyl-glycin-äthylester (85% der Theorie) vom Schmp. 157 bis 160°.

Zur Analyse wird aus Acetonitril· kristallisiert; Schmp. 158bis 160°; [α]ί? = -87,4°±l,2°(c - 0,962 in Methanol).

3. L- Prolyl-L-valyl-glycin-äthylester

8,00 g Carbobenzyloxy - l - prolyl - l - valyl - glycinäthylester wird in 200 cm³ Feinsprit gelöst und in Gegenwart von Palladiumkohle (10% Pd) hydriert. Das entstehende Kohlendioxyd wird in einem zweiten, mit Natronlauge gefüllten Hydriergefäß aufgefangen. Die Hydrierung kommt nach Aufnahme der berech-

409543/349

neten Menge Wasserstoff zum Stillstand. Nach Abnutschen des Katalysators wird die Lösung zur Trockne verdampft und der kristalline Rückstand mit etwas Äther zerrieben. Abnutschen ergibt 4,50 g L-Propyl-L-valyl-glycin-äthylester vom Schmp. 127 bis 129°, die Mutterlauge gibt aus wenig Äther weitere 0,60 g Tripeptidester vom Schmp. 126 bis 128°. Die Ausbeute an kristallisiertem Tripeptidester beträgt 92% der Theorie.

Zur Analyse wird aus Äther umkristallisiert; Schmp. 127 bis 129°; [ap_D ⁵ = -74,8°±0,8° (c = 1,083 in Äthanol).

Beispiel 12

15

N^a-(p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl)-

NMert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-propyl-

L-valyl-glycin

Der im Beispiel 11 erhaltene Tetrapeptid-äthylester wird in genau gleicher Weise wie im Beispiel 7 beschrieben verseift. Analoge Aufarbeitung ergibt in 97% Ausbeute N* - (p - Phenylazo - benzyloxycarbonyl)-N^c - tert. - butyloxycarbony 1 - L - lysyl - L - prolyl - L - valylglycin als Pulver vom Schmp. 86 bis 115°; das Produkt ist für weitere Umsetzungen genügend rein. Zur Analyse wird aus Aceton—Äther kristallisiert, Schmp. 127 bisl32°;[a]S' = -64,9°± l,l°(c = 0,80 in Methanol).

Beispiel 13

NMert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valylglycin-äthylester

900 mg des im Beispiel 11 erhaltenen, kristallinen Tetrapeptidderivates werden in 25 cm³ Feinsprit gelöst, 1 cm³ 2 η-wässerige Essigsäure zugegeben und in Gegenwart von Palladiumkohle (10% Pd) hydriert (das entstehende Kohlendioxyd wird in Natronlauge absorbiert). Nach Aufnahme der berechneten Menge Wasserstoff kommt die Hydrierung zum Stillstand. Die Aufarbeitung und Überführung in den freien Ester geschieht in genau gleicher Weise wie im Beispiel 6 beschrieben. Erhalten werden 601 mg (97% der Theorie) Tetrapeptidester als farbloses Harz. Das Produkt ist nach Papierchromatographie rein, R_f-Wert = 0,84 (System η - Butanol — Äthanol — Wasser = 2:2:1).

B e i s ρ i e 1 14

N^a-(p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl)-L-lysyl-L-propyl-L-valyl-glycin-äthylester

Aus dem im Beispiel 11 erhaltenen Produkt kann die tert.-Bütyloxycarbonylgruppe wie folgt selektiv entfernt werden: 4 mg Tetrapeptidderivat werden mit 0,4 cm³ 2 η-Salzsäure in Essigester versetzt und die Lösung bei Zimmertemperatur 1 Stunde belassen. Hierauf wird die klare Lösung zur Trockne verdampft. Das Produkt ist ein oranges Harz. Bei Papierchromatographie in verschiedenen Systemen wird nur ein oranger Fleck erhalten, der zugleich eine positive Ninhydrinreaktion zeigt (N^E-Aminogruppe des Lysylrestes). Rf-Wert = 0,77 (System n-Butanol—Äthanol —Wasser = 2:2:1); = 0,80 (System tert.-Amylalkohol—Isopropanol—Wasser = 100:40:55); = 0,95 (System S - Butanol — 3% Ammoniak = 100:44).

35

Beispiel ) 5 N^-tert.-Butyloxycarbonyl-L-ornithin

3,0 g L-Ornithin-monohydrochlorid in 30 cm³ Wasser werden mit 3 g basischem Kupfercarbonat während IV2 Stunden am Rückfluß gekocht. Das überschüssige Kupfercarbonat wird warm abgenutscht und mit Wasser gewaschen. Die erhaltene dunkelblaue Kupferkomplexlösung des Ornithin wird mit 20 cm³ Dioxan, 3,75 gNatriumhydrogencarbonatund4,9 cm³tert.-Butylcarbonylazid versetzt und 4 Tage bei 10° gerührt. Die entstandene Fällung wird abgenutscht, gut mit Wasser, Alkohol und Äther gewaschen.

Kupferkomplex von N¹⁵ - BOC - Ornithin = 2,5 g = 53% der Theorie. |

Zur Zersetzung werden diese 2,5 g des Kupferkomplexes in 75 cm³ Wasser und 10 cm³ 2 η-Essig- j säure suspendiert und während 30 Minuten mi Schwefelwasserstoff behandelt. Das Kupfersulfid wir abgenutscht, das Filtrat im Vakuum bei 40° eingeengt und die restliche Lösung im Hochvakuum lyophilisiert. Der pulverige Rückstand wird im Hochvakuum bei Zimmertemperatur über Kaliumhydroxyi bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Ausbeute an N* - BOC - Ornithin = 1,83 g = 44% der Theorie. F. 216° (unter Zersetzung, Braunfärbung ab etwa 190°).

Das Produkt ist gut löslich in Wasser, Methanol etwas schwerer in Äthanol, Aus Methanol—Äthei fällt es gallertig aus.

Beispiel 16

N^y-tert.-Butyloxycarbonyl-L-a,y-diaminobuttersäure

a) Kupferkomplex

1,55 g L-a,y-Diaminobuttersäure werden in 30 cm' Wasser gelöst, 2,0 g basisches Kupfercarbonat zu· gegeben und 20 Minuten zum Sieden erhitzt. Hierau:

wird noch heiß vom ungelösten Kupfercarbonat abgenutscht und mit wenig warmem Wasser nachgewaschen. Das tiefblaue Filtrat wird auf ein Volumen von etwa 15 cm³ eingeengt, mit 1 g Magnesiumoxyd sowie einer Lösung von 2,15 g tert.-Butyloxy-azidoformiat in 40 cm³ Methanol versetzt und 18 Stunden bei 40° gerührt. Hierauf wird das Methanol im Vakuum abdestilliert, der hellblaue Niederschlag abgenutscht und mit wenig Wasser und Äther gewaschen. Das Produkt enthält noch etwas Magnesiumoxyd. Es wird daher mit kalter, verdünnter Essigsäurelösung gut zerrieben, abgenutscht und mit Wasser neutral ge waschen. Die Ausbeute beträgt 1,05 g, Schmp. 229 bis 233° (Zersetzung).

b) freie NMert.-Butyloxycarbonyl-L-a.y-diaminobuttersäure aus dem Kupferkomplex

Die Freisetzung des Derivats aus dem Kupferkomplex geschieht in gleicher Weise wie im Beispiel 1 (sub b), beschrieben. Das Produkt wird in Form eines feinen gallertigen Niederschlags (aus Wasser) erhalten. Schmp. 217 bis 229° (Zersetzung). Die Substanz ist löslich in verdünnten Alkalien und verdünnter Essigsäure; löslich in verdünnten Mineralsäuren unter Zersetzung R_f-Wert = 0,65 (System n-Butanol—Äthanol—Wasser = 2: 2:1); = 0,60 (System n-Butanol—3% Ammoniak = 100:44); = 0,74 (System sek.-Butanol—Isopropanol-Monochloressigsäure-Wasser = 70:10:3g:40)

Claims

Patentansprüche:

1. a - (ω - tert. - Butyloxycarbonyl) - α - aminoessigsäuren und diese enthaltende Peptide und Derivate dieser Verbindungen, worin die a-Aminogruppe durch die ρ - (Phenylazo - benzyloxy) - carbonylgruppe, die p-(p'-Methoxyphenylazo-benzyloxycarbonyl)-gruppe, die Carbobenzoxygruppe oder die Triphenylmethylgruppe geschützt ist und worin die Carboxylgruppe in Form der freien Carboxylgruppe, einer Niederalkylestergruppe, der Hydrazid- oder der Amidgruppe vorliegt.

2. Verfahren zur Einführung der tert.-Butyloxy-

carbonylschutzgruppe bei α - (ω - Aminoalkyl) u-aminoessigsäuren und ihren Derivaten, dadurcj gekennzeichnet, daß man die genannte ω-Amino gruppe mit tert.-Butyloxycarbonylazid acyliert.

3. Der Kupferkomplex von a-(w-tert.-Butyloxy carbonylaminoalkyO-a-aminoessigsäuren.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekenn zeichnet, daß man das tert.-Butyloxycarbonylazii in wäßriger Lösung mit einem Kupferkomple der a - (ω - Aminoalkyl) - α - aminoessigsäure urr setzt.