AT250585B

AT250585B - Verfahren zur Herstellung eines neuen Nonapeptidamids

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Publication number: AT250585B
Application number: AT257163A
Authority: AT
Original assignee: Geigy Ag J R
Priority date: 1962-03-30
Filing date: 1963-03-29
Publication date: 1966-11-25

Description

Verfahren zur Herstellung eines neuen Nonapeptidamids
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sitzt es die nachstehende Formel
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Das cyclische Nonapeptidamid der obigen Formel zeigt eine ähnliche oxytocische Wirksamkeit wie das Oxytocin. Dagegen fehlt ihm die Blutdruckwirkung des Oxytocins weitgehend, weshalb seine Anwendung bei verschiedenen Indikationen des letzteren von besonderem Interesse erscheint.

Während beim Oxytocin das Verhältnis der oxytocischen Aktivität am isolierten Rattenuterus zum blutdrucksteigernden Effekt an der Ratte zirka 90 : 1 beträgt, liegt es beim erfindungsgemäss hergestellten Ser4-Il8-oxytocin um 2000 : 1 (Bestimmung der oxytocischen Wirkung am isolierten Ratten-Uterus nach P. Holton, Brit. J. Pharmacol. 3 [1948], S. 328, und der Pressor-Aktivität an der Ratte nach J. De- kanski, Brit. J. Pharmacol. 7 [1952], S. 567, wobei die Aktivitäten in internationalen Einheiten angege-

ben werden ; 1 IE entspricht der Wirkung von 0, 5 mg des vom National Institute for Medical Research,
Mill Hill, London, gelieferten, aus Hypophysen-Hinterlappen gewonnenen 3. internationalen Standards.

Zur Herstellung des neuen cyclischen Nonapeptids der Formel I kondensiert man L-Cystein, dessen
Mercaptogruppe geschützt ist, L-Tyrosin, L-Isoleucin, L-Serin, L-Asparagin, L-Prolin, deren Aminogruppen und Carboxylgruppen nötigenfalls geschützt sind, und einen niederen Alkylester, Benzylester
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2 3 4 5 6 7 8 9gespalten werden und das erhaltene Nonapeptid durch Oxydation ringgeschlossen wird.

Als Schutzgruppen für Aminogruppen kommen durch saure oder alkalische Hydrolyse abspaltbare Re- ste wie der Carbotertiärbutoxyrest und der Tritylrest (Triphenylmethylrest) bzw. der Trifluoracetylrest, durch Säure katalysierte Solvolyse, z. B. Behandlung mit Bromwasserstoffsäure in Eisessig oder Behandlung mit Trifluoressigsäure, abspaltbare Reste wie niedere Carbalkoxyreste, der Carbobenzylrest bzw. wieder der Carbotertiärbutoxyrest ; durch Reduktion, z. B. Behandlung mit einem Alkalimetall in Ammoniak, ab- spaltbare Reste wie der Tosylrest (p-Toluolsulfonylrest) oder Carbobenzyloxyrest ; oder, in cysteinfreien
Komponenten, durch Hydrierung abspaltbare Reste wie wieder der Carbobenzyloxyrest, in Betracht. Als
Schutzgruppe der Mercaptogruppe kommt insbesondere der reduktiv, z.

B. mittels Natrium und flüssigem
Ammoniak, entfernbare Benzylrest und ferner z. B. der mittels Natrium und flüssigem Ammoniak, Brom- wasserstoffsäure in Eisessig, siedender Trifluoressigsäure oder am vorteilhaftesten mittels eines Silber- oder Quecksilbersalzes und Pyridin in einem niederen Alkanol abspaltbare Tritylrest in Betracht.

N-geschützte bzw. S, N-geschützte Aminocarbonsäuren oder Peptide werden z. B. mit Aminosäure- derivaten oder Peptidderivate mit freier Aminogruppe und gebundener, z. B. veresterter Carboxylgruppe mittels eines Carbodiimids, z. B. mittels N. N'-Dicyclohexylcarbodiimid in Dimethylformamid und/oder
Acetonitril, kondensiert. Als reaktionsfähige funktionelle Derivate von Aminosäuren und insbesondere von
Peptiden mit geschützter Aminogruppe eignen sich beispielsweise deren Azide, die z. B. durch Umsetzung der entsprechenden Ester, z. B. Methylester, mit Hydrazin und Behandlung der Hydrazide mit salpetriger
Säure leicht zugänglich sind.

Im weiteren kommen besonders als Derivate von einzelnen N-geschützten
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B.2-Carbotertiärbutoxyhydraziden, von Peptiden oder Aminosäuren, deren geschützte Hydrazidgruppe sich. ihrerseits nach der Umsetzung z. B. durch Säure katalysierte Solvolyse mittels Trifluoressigsäure oder mittels alkanolischer Salzsäure in die freie Hydrazidgruppe umwandeln lässt, als Derivate bezüglich der Carboxylgruppe von Peptiden bzw. Aminosäuren umgesetzt.

Eine erfindungsgemässe Reaktionsfolge besteht beispielsweise darin, dass man einerseits zur Herstellung des C-terminalen Pentapeptidderivates einen N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cystein- - alkylester oder-aralkylester, z. B. den bekannten Methylester durch Behandlung mit Hydrazin in das N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cystein-hydrazid überführt und letzteres mittels salpetriger Säure in das entsprechende S, N-geschützte Dipeptidazid umwandelt, dieses mit dem bekannten L-Prolyl-L-isoleucyl-glycinamid umsetzt, oder das bekannte N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cystein mit dem genannten Tripeptidamid mittels eines Carbodiimids, z. B.

N, N'-Dicyclohexyl- carbodiimid, kondensiert, und das in beiden Fällen erhaltene N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-S-ben-

zyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamid durch Behandlung mit Bromwasserstoffsäure in Eisessig oder mit heisser Trifluoressigsäure in das L-Asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamid überführt, anderseits zur Herstellung des N-terminalen Tetrapeptiddenvates ein reaktionsfähiges funktionelles Derivat des N-Carbobenzyloxy-L-isoleucin, z. B. das gemischte Anhydrid mit einer niederen Alkoxyameisensäure oder den N -Carbobenzyloxy-L-isoleucin-p-nitrophenylester, mit einem L-Serin- - alkylester oder-aralkylester, z. B. dem L-Serin-methylester zu einem N-Carbobenzyloxy-L-isoleucyl-
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L-serin-ester, z.

B.drazid-N2-derivat umsetzt, dieses oder den vorgenannten Ester mit katalytisch aktiviertem Wasserstoff behandelt, den entstandenen L-Isoleucyl-L-serin-ester, z. B. den Methylester, bzw. das entstandene L-Isoleucyl-L-serin-hydrazid-N-derivat mit dem bekannten S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosin mittels eines Carbodiimids, z. B. N, N'-Dicyclohexylcarbodiimid, zu einem S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-serin-ester, z.

B. zum Methylester, bzw. zu dem entsprechenden S, Ngeschützten Tetrapeptid-hydrazid-N2-derivat kondensiert, ersteren durch Behandlung mit Hydrazin bzw. letzteres durch Säure katalysierte Solvolyse in das S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl- - L-serin-hydrazid überführt, dieses durch Einwirkung von salpetriger Säure in das S-Benzyl-N-tosyl- - L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-serin-azid umwandelt, dieses N-terminale S, N-geschützte Tetrapeptidazid mit dem oben erhaltenen C-terminalen S-geschützten Pentapeptidamid zum S-Benzyl-N-to- syl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-seryl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucyl- - glycinamid umsetzt, in diesem die beiden S-Benzylreste und den N-Tosylrest reduktiv, z.

B. durch Behandlung mit einem Alkalimetall in Ammoniak, abspaltet und das erhaltene L-Cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-seryl-L-asparaginyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamid durch Oxydation, z. B. mittels Sauerstoff oder Kaliumferricyanid, in die S, S'-Dehydroverbindung, das Ser4-Ile8-oxytocin, überführt.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die erfindungsgemässe Herstellung des Ser4-Ile8-oxytocin, stel- len jedoch keineswegs die einzige mögliche Ausführungsform derselben dar. Alle Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben und die Schmelzpunkte sind korrigiert. Die spezifischen Drehungen wurden in einem Rohr von 10 cm Länge mit Hilfe des Polarimeters nach Lippich der Firma Schmidt und Haensch bestimmt.

Die zur Prüfung der Einheitlichkeit der Reaktionsprodukte verwendeten Dünnschichtchromatogramme erfolgten nach E. Stahl, Chemiker-Zeitung 82 [1958], S. 323, vgl. auch M. Brenner und A. Niederwieser, Experientia 16 [1960], S. 378, auf Kieselgel G (Merck). Die Lösungsmittelsysteme wurden durch Mischen der Komponenten in den angegebenen Volumenverhältnissen bereitet. Als Nachweismethoden für die Reaktionsprodukte dienten a) Ninhydrinmethode : wie üblich, b) Chlormethode : nach H. N. Rydon und P. W. G. Smith, Nature (London) 169 [1952], S. 922, modifi-
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Reindel- 100 12, 1 ml (0,126 M) Chlorameisensäureäthylester.

Nach 15 min wird innerhalb 5 min eine auf-50 abgekühlte Lösung von 18,67 g (0,12 M) L-Serin-methylester-hydrochlorid (z.B. hergestellt nach St. Guttmann und R. A. Boissonnas, Helv. Chim. Acta 41 [1958], S. 1852) und 16,9 ml (0,122 M) Triäthylamin in absolutem Chloroform zugegeben. Nach vierstündigem Rühren bei 00 wird das Reaktionsgemisch im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand in 1200 ml Äthylacetat und 200 ml Wasser aufgenommen. Die Äthylacetatlösung wird sorgfältig mit Wasser, dann mit ln-Salzsäure, mit Wasser, mit 5% luger Natriumhydrogencarbonatlösung und wieder mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet.

Nach Einengen der Lösung und Zugabe von Petroläther kristallisiert der rohe Dipeptidester aus ; Smp. 179 bis 1800.
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nach M. Bodanszky und V.DuVigneaud, J.Am.Chem.Soc. 81 [1959], S.5688) werden in 250 ml Dimethylformamid gelöst, auf 00 abgekühlt und mit 7, 3 ml Hydrazinhydrat (150 mM) versetzt. Die Reak- tionslösung wird für 55h bei 00 stehen gelassen.

Zur Isolierung des Hydrazids wird die Lösung mit 1800 ml
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Zu einer Lösung von 7, 103 g (15 mM) N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cystein-hydrazid in 135 ml Dimethylformamid und 45 ml In-Salzsäure werden bei-100 unter Rühren tropfenweise 3,6 ml (18 mM) einer vorgekühlten 5n-Natriumnitritlösung zugefügt. Das Azid scheidet sich nach zirka 2 min in kristalliner Form ab.Nach 15minutigem Rühren bei -10 wird zur vollständigen Abscheidung des Azids vorsichtig mit 80 ml Wasser versetzt. Der Niederschlag wird abfiltriert, zunächst mit kaltem Wasser, dann mit kalter piger Natriumhydrogencarbonatlösung und nochmals mit Wasser gewaschen und während 26 h bei 00 im Hochvakuum getrocknet.

Smp. 1240 (Zersetzung), Kontrolle im IR-Spektrum : scharfe Bande bei X 4,75 li (-CO. N,) ; selbst nach 10tägigem Stehen bei Raumtemperatur noch frei von Isocyanat (À = 4, 5 li h) L-Isoleucyl-glycin-äthylester-hydrochlorid :
15,3 g (44 mM) N-Carbobenzyloxy-L-isoleucyl-glycin-äthylester, hergestellt nach P. A. Jaquenoud und R. A. Boissonnas, Helv. 44 [1961], S. 113, gelöst in 200 ml Eisessig, werden in Gegenwart von 1, 1 Äquivalent konz. Salzsäure und 5 g Pd-Kohle (lOgo Pd) bei Raumtemperatur während 7 1/2 h mit Wasserstoff behandelt. Die Reaktionslösung wird von den leichtflüchtigen Anteilen befreit ; das verbleibende Öl kristallisiert nach mehrmaligem Verreiben mit trockenem Äther.

Das Reaktionsprodukt schmilzt
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absolutem Äthanol).

Es ist dünnschichtchromatographisch einheitlich im System : n-Butanol/Eisessig/Wasser 3 : 1 : 1, Nachweis : Ninhydrinmethode. i) N-Carbobenzyloxy-L-propyl-L-isoleucyl-glycin-äthylester: 12, 15 g (48 mM) L-Isoleucyl-glycin-äthylester-hydrochlorid werden in 120 ml absolutem Chloroform gelöst, auf 0 abgekühlt und bei 00 mit 7,4 ml (52,8 mM) Triäthylamin und einer Lösung von 22,2 g (60 mM) N-Carbobenzyloxy-L-prolin-p-nitrophenylester (hergestellt nach M. Bodanszky und V. DuVigneaud, J. Am. Chem. Soc. 81 [1959], S. 5688) in 40 ml absolutem Chloroform versetzt. Die gelbe Reaktionslösung wird während 20 h bei Raumtemperatur gerrührt.

Zur Aufarbeitung wird sie mit 400 ml Chloroform verdünnt, dreimal mit je 90 ml In-Salzsäure, viermal mit je 90 ml1n-Ammoniak und dreimal mit je 90 ml Wasser extrahiert und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt
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159-160- 65, 70 (c = 1, 90 in Methanol).

Es ist dünnschichtchromatographisch einheitlich in den Systemen :
Benzol/Aceton 3 : 7 und n-Butanol/Eisessig/Wasser 3 : 1 : 1.

Nachweis : Chlormethode.

9,35 g (22, 3 mM) N-Carbobenzyloxy-L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamid werden in 200 ml Methanol gelöst, mit 1, 1 Äquivalent wässeriger Salzsäure versetzt und während 5 h in Gegenwart von Pd-Kohle (loto Pd) mit Wasserstoff behandelt. Der Katalysator wird abfiltriert und die Reaktionslösung bei 35 im Vakuum eingedampft. Der farblose, schaumartige Rückstand wird einmal aus Methanol-Chloroform und
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Äthanol).

Zur Freisetzung der Base wird das obige Hydrochlorid in 50 ml Methanol gelöst und die Lösung durch eine mit Methanol vorbehandelte Ionenaustauschersäule von 100 g Dowex-21K (synth. Austauscherharz OH-Form) filtriert. Die Säule wird mit insgesamt 400 ml Methanol nachgewaschen und das chlorfreie
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Es ist dünnschichtenchromatographisch einheitlich in den Systemen : n-Butanol/Eisessig/Wasser 3 : 1 : 1, Methyläthylketon/Pyridin/Wasser 65 : 5 : 20. Nachweis : Ninhydrinmethode.

Das obige Tripeptidamid wurde bereits von P. A. Jaquenoud und R. A. Boissonnas, Helv. Chim. Acta 44 [1961], S. 113, hergestellt nach einer ähnlichen, von der vorstehend angegebenen Synthese durch die Abspaltung der Carbobenzyloxygruppen mittels Bromwasserstoffsäure in Eisessig und die Verwendung des gemischten N-Carbobenzyloxy-prolin-äthoxyameisensäure-anhydrids an Stelle des N-Carbobenzyloxy-
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kaltem Dimethylformamid gelöst und zu einer Lösung von 4, 264 g (15 mM) L-Prolyl-L-isoleucyl-glycinamid (vgl. k) und 2, 1 ml (15 mM) Triäthylamin in 50 ml Dimethylformamid gegeben. Man rührt die Reaktionslösung während 56 h bei 0 bis +30. Nach dieser Zeit ist im IR-Spektrum die Azid-Bande bei 4,75 p nicht mehr erkennbar.

Zur Isolierung des Reaktionsproduktes wird die Reaktionslösung auf -100 abgekühlt und das Reaktionsprodukt durch vorsichtige Zugabe von 750 ml eiskaltem Wasser als gallertige Masse ausgefällt. Der Niederschlag wird abgenutscht, mit kaltem Wasser gut gewaschen und über Phosphorpentoxyd im Vakuum getrocknet. Zur Entfernung von Verunreinigungen wird das feingepulverte Rohprodukt dreimal mit je 40 ml Acetonitril/Methanol 4 : 1 innig verrieben und abfiltriert. Nach zweimaliger Kristallisation aus Dimethylformamid/Acetonitril 1 : 4 erhält man das S. N-geschützte Pentapeptidamid mit dem Smp.
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Eisessig).

Das Produkt ist dünnschichtenchromatographisch einheitlich in den Systemen : n-Butanol/Eisessig/ Wasser 3 : 1 : 1, Methyläthylketon/Pyridin/Wasser 65 : 5 : 20, Methanol/Chloroform 2 : 1. Nachweis : Chlormethode.

Dasselbe geschützte Pentapeptidamid kann auch durch Kondensation von N-Carbobenzyloxy-L-aspa-
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A.cinamid : 2, 01 g (2, 78 mM) N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucyl- - glycinamid werden mit 12 ml 2n-Bromwasserstoffsäure in Eisessig versetzt. Die Carbobenzyloxy-Verbindung ist nach 40 min vollständig gelöst. Nach 2 1/2-stündigem Rühren bei 200 wird zur tiefgelben Lösung 35 ml absoluter Äther gegeben, wobei das Hydrobromid des S-geschützten Pentapeptidamids als harzige Masse ausfällt. Der Niederschlag wird nach wiederholtem Verreiben mit absolutem Äther körnig.

Er wird abfiltriert und zweimal aus Äthanol/Äther umgefällt.

Das gleiche Hydrobromid wird bei Verwendung von Bromwasserstoffsäure in Trifluoressigsäure erhalten, während man bei alleiniger Verwendung von Trifluoressigsäure bei Rückflusstemperatur das entsprechende Trifluoracetat erhält.

Zur Freisetzung des S-geschützten Pentapeptidamids werden 2, 46 g (3,66 mM) L-Asparaginyl-S- -benzyl-L-cysteinyl-L-propyl-L-isoleucyl-glycinamid-hydrobromid in 30 ml Methanol gelöst und durch eine mit Methanol vorbehandelte Ionenaustauschersäule von 60 g Dowex-21K (OH-Form) filtriert. Das freie Pentapeptidamid wird mit 250 ml Methanol eluiert und das bromfreie Eluat bei 300 im Vakuum un- ! ter Feuchtigkeitsausschluss zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird einmal aus absolutem Äthanol/ absolutem Äther und einmal aus Aceton/Äthylacetat/Äther umgefällt. Man erhält das S-geschützte Pen- tapeptidamid als farbloses, hygroskopisches Pulver, welches direkt zur Kupplung mit dem gemäss e) er- haltenen, S, N -geschützten Tetrapeptidazid verwendet wird.
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)-L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamid.

Das unter e) hergestellte S, N-geschützte Tetrapeptidazid wird in 35 ml auf -100 abgekühltem Di- methylformamid gelöst, mit einer auf -100 abgekühlten Lösung von 0,769 g (1, 3 mM) L-Asparaginyl-S- -benzyl-L-cysteinyl-L-propyl-L-isoleucyl-glycinamid (hergestellt unter m) und 0, 18 ml (1, 3 mM) Tri- äthylamin in 5 ml Dimethylformamid versetzt. Man lässt die Temperatur auf-7 bis-50 steigen und rührt die Reaktionslösung bei dieser Temperatur während 22 h. Nach dieser Zeit fehlt im IR-Spektrum die cha- rakteristische Azid-Bande bei 4, 75 p.

Das N, S, S'-geschützte Nonapeptidamid wird durch sorgfältige Zugabe von 130 ml Eiswasser ausge- fällt, abfiltriert, mit kaltem Wasser, 0, 5n-Salzsäure, Wasser, 3%iger Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen und über Phosphorpentoxyd im Vakuum getrocknet. Das Produkt sintert bei 2050
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- 2170.benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamid werden in 150 ml flüssigem Ammoniak (über Natrium destilliert) gelöst und die Lösung so lange mit Natrium versetzt, bis die blaue Farbe während 5 min bestehen bleibt. Das überschüssige Natrium wird mit Ammoniumchlorid zerstört, das Ammoniak abgedampft und der Rückstand imVakuumexsikkator über konzentrierter Schwefelsäure von den letzten Resten Ammoniak befreit.

Der Rückstand wird in 200 ml Eiswasser gelöst, die Lösung mit 2n-Essigsäure auf PH 6, 6 - 6, 8 gebracht und so lange ein Luftstrom durchgeleitet, bis die Reaktion mit Natriumnitroprussiat negativ ausfällt. Die Reaktionslösung wird darauf mit 2n-Essigsäure auf PH 4 gestellt, durch einen Hyflofilter filtriert und lyophilisiert. Das Rohprodukt wird durch Gegenstrom-Verteilung nach Craig (L. C. Craig, Analytic. Chemistry 11 [1950], S. 1346) im System sek. Butanol/0, 017n-Essigsäure gereinigt. Die Hauptfraktion mit einem Verteilungskoeffizienten K von 0,53 bei 250 besitzt am isolierten Ratten-Uterus eine oxytocische Aktivität von zirka 130 lE/mg.
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Methanol versetzt.

Nach 20stündigem Stehen bei 00 wird das Methanol im Vakuum abdestilliert und das zurückbleibende Öl in Essigester-Wasser aufgenommen. Die Essigesterlösung wird sorgfältig mit Wasser, 2n-Zitronensäure, Wasser, 5% Natriumhydrogencarbonat und Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Entfernung des Essigesters im Vakuum bleibt das Produkt als Öl zurück, welches beim Verreiben mit Äther kristallisiert. Das Rohprodukt wird aus Essigester/Hexan kristallisiert. Smp. 99 bis 101 oder 112 - 1130 (Polymorphie ; Identität der IR-Spektren in Lösung, gleiche optische Aktivität ;
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Das Produkt ist im Dünnschichtenchromatogramm in den Systemen Benzol/Aceton 6 : 4, Methyl- äthylketon/Pyridin/Wasser 65 : 5 : 20, n-Butanol/Eisessig/Wasser 3 : 1 : 1 einheitlich. Nachweis : Chlormethode.

An Stelle von Methanol kann auch Acetonitril als Lösungsmittel verwendet werden und l-Cyclohe- xyl-3- [2-morpholinyl- (4) -äthylJ-carbodiimid kann durch N, N'-Dicyclohexyl-carbodiimid ersetzt werden.
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wird abfiltriert und die Reaktionslösung im Vakuum eingeengt. Das zurückbleibende Öl wird zweimal mit absolutem Äther extrahiert und im Vakuum getrocknet. Das Produkt, welches als fester Schaum anfällt, wird direkt weiterverarbeitet.

Zur Charakterisierung wird das Rohprodukt wie folgt in das kristalline Benzolsulfonat übergeführt : 2,8 g Benzolsulfonsäure werden in 6 ml Methanol gelöst, auf 00 abgekühlt und zu einer eiskalten Lösung von 3 g (13,7 mM) l- (L-Seryl)-2- (t-butoxycarbonyl)-hydrazin in 6 ml Methanol gegeben. Das Benzolsulfonat scheidet sich nach Zugabe von 150 ml trockenem Äther als Öl ab, welches durch Kratzen zur Kristallisation gebracht wird.

Das Produkt wird abfiltriert, mit Methanol/Äther gewaschen und zur Rei-
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2 : 1 : 1 und n-Butanol/Pyridin/Eisessig/Wasser 90 : 60 : 18 : 72 nur einen Fleck, Nachweis : Ninhydrin- methode. c) l- (N-Carbobenzyloxy-L-isoIeucyl-L-seryl)-2- (t-butoxycarbonyl)-hydrazin :
Eine Lösung von 2, 7 g (12, 35 mM) 1-(L-Seryl)-2-(t-butoxycarbonyl)-hydrazin und 4, 77 g (12, 35 mM) N-Carbobenzyloxy-L-isoleucin-p-nitrophenylester, hergestellt z. B. nach M. BodanszkyundV. DuVigneaud, J. Am. Chem. Soc. 81 [1959], S. 5688, in 25 ml Essigester wird für 48 h bei 13 - 140 gerührt. Nach zirka 7 h beginnt das geschützte Dipeptid sich abzuscheiden.

Zum Schluss wird das Reaktionsgemisch auf 00 abgekühlt, das Produkt abfiltriert und sorgfältig mit kaltem Essigester gewaschen. Nach zweimaliger Kri-
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Methanol).

Es ist dünnschichtenchromatographisch einheitlich im System Benzol/Äthanol 7 : 3, Nachweis : Chlormethode.
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wird das Methanol im Vakuum abgedampft. Der ölige Rückstand wird mehrmals mit Äther und Äther/Petroläther behandelt und die Lösungsmittel jeweils abdestilliert. Der resultierende pulverige Rückstand wird darauf mit Essigester verrieben und abfiltriert. Zur Reinigung wird das Produkt zweimal aus Acetonitril kristallisiert.
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peptidhydrazid ab. Das Reaktionsgemisch wird mit 70 ml eiskaltem Wasser versetzt, der Niederschlag abfiltriert und sorgfältig mit Wasser, 3% figer Natriumhydrogencarbonatlösung und zum Schluss nochmals mit Wasser gewaschen. Zur Entfernung des N, N'-Dicyclohexyl-harnstoffes wird das Rohprodukt in 8, 3 ml Dimethylformamid aufgenommen.

Nach zweistündigem Stehen bei 00 wird der Harnstoff abfiltriert, mit 1, 5 ml Dimethylformamid gewaschen und das Filtrat mit 50 ml Acetonitril versetzt. Dabei fällt das geschützte Tetrapeptidhydrazid als Gallerte aus. Es wird abgenutscht, mit kaltem Acetonitril und Äther ge-

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EMI9.5 <Desc/Clms Page number 10> EMI10.1 - 2290zyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamid umsetzt, in diesem die beiden S-Benzylreste und den N-Tosylrest reduktiv abspaltet und das erhaltene L-Cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-seryl-L-asparagi- nyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamid mittels Sauerstoff oder Kaliumferricyanid in die S, S'- Dehydroverbindung, das Serin-Isoleucin-Oxytocin, überführt.