DE1237127B - Verfahren zur Herstellung eines neuen Nonapeptidamids - Google Patents

Description

UNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. Cl:

C O7c

Deutsche Kl.:. 12 q-6/01

Nummer: 1 237 127

Aktenzeichen: G 37388 IV b/12 q

Anmeldetag: 29. März 1963

Auslegetag: 23. März 1967

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung eines neuen cyclischen Nonapeptidamids, nämlich des SeH-He⁸-oxytocins (S^'-Dehydro-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-seryl-L-asparaginyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamid). Dieses Nonapeptidarnid unterscheidet sich vom bekannten Oxytocin durch die Anwesenheit des Serinrestes an Stelle des L-Glutaminrestes an vierter Stelle und die Anwesenheit des L-Isoleucinrestes an Stelle des L-Leucinrestes an achter Stelle.

Verfahren zur Herstellung eines neuen
Nonapeptidamids

Anmelder:

J. R. Geigy A.G., Basel (Schweiz)

Vertreter:

Dr. F. Zumstein, Dr. E. Assmann

und Dr. R. Koenigsberger, Patentanwälte,

München 2, Bräuhausstr. 4

Als Erfinder benannt:
Dr. Albert Jöhl, Basel (Schweiz);
Dr. Albert Hartmann, Grenzach;
Hans Rink, Basel (Schweiz)

Beanspruchte Priorität:

Schweiz vom 30. März 1962 (3863),

vom 12. Oktober 1962 (12 010)

Demzufolge besitzt es die nachstehende Formel

CH₂ HiN-CH-CO-

L-Cysteinyl-

CH, CH₂

CL

H-CH,

NH-CH-CO-JNH-CH-CO -Tyrosyl- L-Isoleucyl-

OH

CH₂

NU—CH-CO-

L-Seryl-

CONH₂

NH-CH-CO-L-Asparaginyl-

CH₂ NH-CH-CO-

L-Cyslemyl-

CH₃
CH₂

CH-CHi NH-CH-CO-

1

L-Prolyl- L-Isoleucyl-

NH-CH₂-CONH₂ Glycinamid

Das cyclische Nonapeptidamid der obigen Formel zeigt eine ähnliche oxytocische Wirksamkeit wie das Oxytocin. Dagegen fehlt ihm die Blutdruckwirkung des Oxytocins weitgehend, weshalb seine Anwendung bei verschiedenen Indikationen des letzteren von besonderem Interesse erscheint.

Während beim Oxytocin das Verhältnis der oxytocischen Aktivität am isolierten Rattenuterus zum blutdrucksteigernden Effekt an der Ratte etwa 90 : 1 beträgt, liegt es beim erfindungsgemäß hergestellten Ser⁴-Ile⁸-oxytocin um 2000 : 1 (Bestimmung der oxytocischen Wirkung am isolierten Rattenuterus nach P. H ο I t ο η , Brit. J. Pharmacol.. 3, S. 328 [1948], und der Pressor-Aktivität an der Ratte nach J. Dekanski. Brit. J. Pharmacol., 7,

S. 567 [1952]), wobei die Aktivitäten in internationalen Einheiten angegeben werden; 1 IE entspricht der Wirkung von 0,5 mg des vom National Institute for Medical Research, Mill Hill, London gelieferten, aus Hypophysen-Hinterlappen gewonnenen dritten internationalen Standards.

Eine erfindungsgemäße Reaktionsfolge zur Herstellung des neuen Nonapeptides der Formel I besteht beispielsweise in der stufenweisen Synthese eines C-terminalen Pentapeptidderivates und eines S,N-geschützten Tetrapeptidderivates und Verknüpfung derselben zum gewünschten Nonapeptid.

Zur Herstellung des S,N-geschützten Tetrapeptidderivates (Schema I) setzt man. ein reaktionsfähiges funktionelles Derivat des bekannten N-Carbobenzyl-

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oxy-L-isoleucins, ζ. Β. das gemischte Anhydrid mil einer niederen Alkoxy-ameisensäure, mit einem L-Serin-alkylester, z. B. dem L-Serin-methylester, zu einem N -Carbobenzyloxy-L-isoleucyl-L- serin -ester, um. Dieser Ester wird mit katalytisch aktiviertem Wasserstoff behandelt und der entstandene l-Isoleucyl-L-serin-ester mit dem bekannten S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosin mittels eines Carbodiimide, z. B. dem N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid, zu einem S - Benzyl - N - tosyl - L - cysteinyl - L - tyrosyl-L-isoleucyl-L-serin-ester, kondensiert. Durch Behandlung mit Hydrazin wird der vorgenannte Ester in das S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L - isoleucyl - L - serin - hydrazid übergeführt dieses durch Einwirkung von salpetriger Säure in das S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-serin-azid umgewandelt.

Zur Herstellung des C-terminalen Pentapeptidderivates (Schema II) setzt man den bekannten N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinmethylester mit Hydrazin zum N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cystein-hydrazid um und führt dieses durch Behandlung mit salpetriger Säure in das N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cystein-azid über. Dieses S,N-geschützte Dipeptidazid wird mit dem bekannten L-Prolyl-L-isoleucylglycinamid umgesetzt und das erhaltene N-Carbobenzyloxy - L - asparaginyl - S - benzyl - L - cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamid durch Behandlung mit Bromwasserstoffsäure in Eisessig oder mit heißer Trifluoressigsäure in das L-Asparaginyl-S-benzyl -L - cysteinyl -L- prolyl -L- isoleucyl - glycinamid übergeführt.

Das gewünschte Nonapeptid der Formel I erhält man, indem man (Schema III) das oben beschriebene N-terminale S,N-geschützte Tetrapeptidazid mit dem obenerwähnten C-terminalen S-geschützten Pentapeptidamid zum S - Benzyl - N - tosyl - L - cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-seryl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamid umsetzt, in diesem die beiden S-Benzylreste und den N-Tosylrest reduktiv, z. B. durch Behandlung mit einem Alkalimetall in flüssigem Ammoniak, abspaltet und das erhaltene L - Cysteinyl - L - tyrosyl - L - isoleucyl-L-seryl-L-asparaginyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucylglycinamid durch Oxydation, z. B. mittels Sauerstoff oder Kaliumferricyanid, in die S,S'-Dehydroverbindung der Formel I überführt.

Schema I
(Herstellung des S,N-geschützten Tetrapeptides)

Ζ—He-OH H — Ser - ORi

Tos —

Cys — Tyr

-OH

Z—I lie —Ser|—ORi

He — Ser

-ORi

BzI

Tos-

Cys — Tyr — He — Ser

-ORi

BzI

Tos —

Cys — Tyr — He — Ser - NH — NH₂

BzI

Tos —

Cys — Tyr — He — SeTj- N₃

BzI

Schema II
(Herstellung des C-terminalen Pentapeptidamids)

NH₂

Z —

Asp — Cys — ORi

BzI

NH₂

Z-Pro - ONP

H —

He — GIy — OR₂

Z —I Pro — He — GIy |— OR₂

Asp — Cys — NH — NH>

Z —I Pro — He — GIy |— NH₂

BzI

NH₂

Ζ—I Asp — Cys[— N₃ Γ

H -j Pro — He — GIy |- NH₂

BzI

NH₂

Z —[Asp — Cys — Pro — He — GIy |— NH₂

BzI NH₂

H —

Asp — Cys — Pro — lie — GIy — NH₂

BzI

Schema III (Verknüpfung des S,N-geschützten Tetrapeptides mit dem C-terminalen Pentapeptidamid)

NH₂

Tos -j Cys — Tyr — lie — Serf- N₃ H —| Asp — Cys — Pro — He — GIy]- NH₂

I I

BzI BzI

NH-.

Tos —j Cys — Tyr — lie — Ser — Asp — Cys — Pro — He — GIy]- NH₂

BzI

BzI

NH₂

H —[Cys — Tyr — He — Ser — Asp — Cys — Pro — He — GIy |— NH₂

Folgende Abkürzungen werden verwendet:

Z = Cafbobenzoxy BzI = Benzyl
Tos = Tosyl

Ri und R₂ = niedere Alkylreste ONP = p-Nitrophenylester BOC = tert.Butyloxycarbonyl H — Ik — OH =■ L-Isoleucin H — Ser — OH == L-Serin
H — Cys — OH = L-Cystein
H — Tyr — OH = L-Tyrosin
NH₂

H — Asp — OH = L-Asparagin H — GIy — OH = Glycin
H — Pro — OH - L-Prolin

Ein abgeändertes Verfahren zur Herstellung des gewünschten Nonapeptides der Formel Ser⁴-Ile⁸-oxytocin besteht darin (Schema IV), daß man zur Herstellung des N-terminalen Tetrapeptidderivates ein reaktionsfähiges funktionelles Derivat des N-Carbobenzyloxy-L-isoleucins mit einem N²-geschützten Serin-hydrazid zum entsprechenden N-Carbobenzyloxy-isoleucyl-L-serin-hydrazid-N²-derivat umsetzt. dieses mit katalytisch aktiviertem Wasserstoff be-

handelt, das enstandene L-Isoleucyl-L-serin-hydrazid-N²-derivat mit S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosin mittels eines Carbodiimids zum entsprechenden Tetrapeptid-hydrazid-N'²-derivat kondensiert, durch säurekatalysierte Solvolyse in das S-Benzyl-

N- tosyl -L - cysteinyl -l - tyrosyl -L - isoleucyl -L - serinhydrazid überführt, dieses durch Einwirkung von salpetriger Säure in das S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteiny!- L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-serinazid umwandelt, dieses N-terminale S,N-geschützte Tetrapeptidazid mit dem

weiter oben beschriebenen C-terminalen S-geschützten Pentapeptidamid der Formel L-Asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamid zum S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-i.-isoleucyl - L - seryl - L - asparaginyl - S - benzyl - L - cysteinyl-

6c L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamid umsetzt, in diesem die beiden S-Benzylreste und den N-Tosylrest reduktiv abspaltet und das erhaltene L-Cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucyl-L-seryl-L-asparaginyl-L-cysteinyl-L-prolylisoleucyl-glycinamid mittels Sauerstoff oder Kalium-

ferricyanid in das gewünschte Nonapeptid der Formel S^'-Dehydro-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-seryl-L-asparaginyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamid übergeführt.

Schema IV

(Herstellung des S,N-geschützten Tetrapeptid-hydrazids über das S,N- und N²-geschützte Tetrapeptid-hydrazid)

Z —

Ser - OH H₂N — NH — BOC

Ser — NH — NH — BOC

z —

He [-ONP

H —

Ser - NH — NH — BOC

Z —! He — Ser I— NH — NH — BOC

Tos — Cys — Tyr — OH

H — He — Ser - NH — NH — BOC

BzI

Tos — Cys — He — Ser — NH — NH — BOC

BzI

Tos — Cys — Tyr — He — Ser - NH — NH₂

BzI

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die erfindungsgemäße Herstellung des Ser⁴-Ile⁸-oxytocins. Alle Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben, und die Schmelzpunkte sind korrigiert. Die spezifischen Drehungen wurden in einem Rohr von 10cm Länge mit Hilfe des Polarimeters nach L i ρ ρ i c h der Firma Schmidt und Haensch bestimmt.

Die zur Prüfung der Einheitlichkeit der Reaktionsprodukte verwendeten Dünnschichtchromatogramme erfolgen nach E. Stahl, Chemiker-Zeitung, 82, S. 323 (1958) [vgl. auch M. Brenner und A. Niederwieser, Expertentia, 16, S. 378 (I960)], auf Kieselgel G »Merck«. Die Lösungsmittelsysteme wurden durch Mischen der Komponenten in den angegebenen Volumenverhältnissen bereitet. Als Nachweismethoden für die Reaktionsprodukte dienten
i) Ninhydrinmethode: wie üblich;

b) Chlormethode: nach H. N. Rydon und P. W. G. Smith, Nature (London), 169,

S. 922 (1952), modifiziert nach F. R e i η d e 1 und W. Hoppe, Chem. Ber., 87, S. 1103 (1954);

c) Folin-Metnode:nachO. FoI in und V. Cioc a 11 e u , J. biol. Chem., 73, S. 629 (1927).

55 Beispiel 1

a) N-Carbobenzyloxy-L-isoleucyl-L-serinmethylester

32,4 g (0,122 Mol) N-Carbobenzyloxy-L-isoleucin <>o (z. B. hergestellt nach P.-A. Jaquenoud und R. A. Boissonnas, HeIv. Chim. Acta, 44, S. 113 (1961), werden in 320 ml absolutem Tetrahydrofuran gelöst, mit 17,2 ml (0,124 Mol) Triethylamin versetzt und auf —10° abgekühlt. Zu dieser Lösung tropft man bei -10^cC 12,1 ml (0,126MoI) Chlorameisensäureäthylester. Nach 15 Minuten wird innerhalb 5 Minuten eine auf - 5⁰C abgekühlte Lösung von 18,67 g (0,12 Mol) L-Serin-methylesterhydrochlorid(z. B. hergestellt nach St. Guttmann und R. A. Boissonnas, HeIv. Chim. Acta, 41, S. 1852 [1958]) und 16,9 ml (0,122 Mol) Triäthylamin in absolutem Chloroform zugegeben. Nach 4stündigem Rühren bei 0°C wird das Reaktionsgemisch im Vakuum zur Trockene eingedampft und der Rückstand in 1200 ml Äthylacetat und 200 ml Wasser aufgenommen. Die Äthylacetatlösung wird sorgfältig mit Wasser, dann mit 1 η-Salzsäure, mit Wasser, mit 5°/o Natriumhydrogencarbonat und wiederum mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Einengen der Lösung und Zugabe von Petroläther kristallisiert der rohe Dipeptidester aus; Schmp. 179 bis 180°C.

Zur Reinigung wird das Produkt zweimal aus Essigester—Petroläther kristallisiert; Schmp. 180,5 bis 181,5°C; [a]l⁴° = 4-3,9° (c = 5 in Dimethylformamid). Das Produkt ist dünnschichtenchromatographisch einheitlich im System Benzol—Aceton 7:3; Nachweis: Chlormethode.

b) L-Isoleucyl-L-serin-methylester-hydrochlorid

26,0 g (71 mMol) N-Carbobenzyloxy-L-isoIeucyl-L-serin-methylester werden in 380 ml Methanol und 6,25 ml konzentrierter Salzsäure gelöst und in Gegenwart von 5 g Pd-Kohle (10% Pd) im Wasserstoffstrom hydriert, bis kein Kohlendioxyd mehr entwickelt wird. Nach Entfernung des Katalysators wird die Reaktionslösung im Vakuum zur Trockene eingedampft und der Rückstand zweimal aus Methanol—Äther und einmal aus Methanol—Aceton— Äther kristallisiert. Zersetzungspunkt: 203 bis 204⁰C, [a]i⁴⁰ = +12,6° (c = 3,01 in Methanol).

Das Produkt ist dünnschichtenchromatographisch einheitlich in den Systemen n-Butanol—Eisessig— Wasser 3:1:1 und Methyläthylketon—Pyridin— Wasser 65 : 5 : 20. Nachweis: Chlormethode, Ninhydrinmethode.

c) S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-serin-methylester

3,55 g (13,2 mMol) L-Isoleucyl-L-serin-methylester-hydrochlorid werden bei Raumtemperatur in 30 ml Dimethylformamid gelöst, auf OC abgekühlt, mit 1,85 ml (13,2 mMol) Triäthylamin versetzt und für 10 Minuten unter häufigem Umschütteln stehengelassen. Darauf wird das abgeschiedene Triäthylamin-hydrochlorid abfiltnert und mit 5 ml Dimethylformamid gewaschen. Die Lösung des freien Dipeptidesters wird mit einer Lösung von 6,98 g (13,2 mMol) S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosin (hergestellt nach V. DuVigneaud, M. F. Bartlett und A. J ö h 1 . J Am Chem. Soc, 79, S. 5572 [1957]) in 35 ml Acetonitril versetzt. Die klare Reaktionslösung wird auf 10 C abgekühlt. Nach Zugabe von 2,72 g (13,2 mMol) Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid beginnen sich nach kurzer Zeil Ν,Ν'-Dicyclohexyl-harnstoff und der Tetrapeptidester abzuscheiden. Nach 55stündigem Rühren bei -10 C werden die ausgefallenen Produkte abfillriert und mit wenig kaltem Dimethylformamid—Acetonitril (1:1) und mit Acetonitril gewaschen. Zur Entfernung des N.N'-Dicyclohexyl-harnstoffes wird das Rohprodukt in 80 ml Dimethylformamid aufgenommen und für 2 Stunden bei 0 C gehalten. Der Harnstoff wird abfiltriert und das Reaktionsprodukt aus dem Filtrat durch Zugabe von 700 ml warmem Äthylacetat ausgefällt. Nach dreimaliger Kristallisation aus Methanol ist der S,N-geschüt/te Tetrapeptidester dünnschichtenchroniatographisch einheitlich in den Systemen Benzol—Aceton 1:1, Chloroform—Methanol—Ammoniak 17% 2:2:1, n-Butanol—Eisessig—Wasser 3:1:1. Nachweis: Chlorrnethode und Folin-Methode. Schmp. 219 bis 221 C; sintert bei 210 C. [u]f - 59,5 (c 0,99 in Ameisensäure), [<i]'o - -16,2 (c - 0,98 in Pyridin).

d) S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-serin-hydrazid

5,57 g (7,5 mMol) S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-serin-methylester werden in 154 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf OC abgekühlt, mit 4,5 ml Hydrazinhydrat (92,2 mMol) versetzt und für 45 Stunden bei OC stehengelassen. Die Reaktionslosung wird darauf unter guter Eiskühlung mit 400 ml Eiswasser versetzt. Das Reaktionsprodukt scheidet sich dabei als gallertiger Niederschlag ab. Nach 2stündigem Stehen im Eisschrank wird das rohe Hydrazid abfiltriert, gut mit Wasser ausgewaschen und im Vakuum über Phosphorpentoxyd getrocknet. Das Rohprodukt wird durch zweimalige Kristallisation aus Dimethylformamid—Acetonitril gereinigt. Das erhaltene Produkt sintert bei 222⁰C und schmilzt unter Zersetzung bei 226 bis 229' C, [a]i⁴ =- --69,2^C (c = 1,79 in Ameisensäure), [a]l³ ■-■- -' 7,2 ic - 1,99 in Dimethylformamid).

Das Produkt ist dünnschichtenchromatographisch einheitlich in den Systemen n-Butanol—Eisessig— Wasser 3:1:1, Methyläthylketon — Pyridin — Wasser 65 : 5 : 20, Nachweis: Chlormethode und Folin-Methode.

e) N-terminales Tetrapeptid-azid:

S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-

L-isoleucyl-L-serin-azid

0,966 g (1,3 mMol) S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleueyl-L-serin-methylester werden in 35 ml Dimethylformamid und 3.9 ml 1 n-Salzsäure gelöst, auf 10'C abgekühlt und langsam mit 0,29 ml 5 n-Natriumnitrit versetzt. Man läßt für

ίο 10 Minuten rühren und fallt darauf das Azid bei einer Temperatur von 8 bis 5 C mit 45 ml Eiswasser aus. Das gallertige Produkt wird abgenutscht, gut mit kaltem Wasser, dann mit 3%iger Natriumhydrogencarbonatlösung und wiederum mit kaltem

is Wasser gewaschen und 4 Stunden im Hochvakuum bei 0 C getrocknet. Schmp. 244 bis 246 C (Zersetzung): IR-Spektrum: ausgeprägte Bande bei /. 4,75 μ (— CO · Η,).

0 N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cystein-hydrazid

14,2 g (30 mMol) N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cystein-methylester (z. B. hergestellt nach M. Bodansky und V. D u V i g η e a u d , J. Am.

Chem. Soc, 81, S. 5688 [1959]) werden in 250 ml Dimethylformamid gelöst, auf 0 C abgekühlt und mit 7,3 ml Hydrazinhydrat (15OmMoI) versetzt. Die Reaktiorislösung wird für 55 Stunden bei 0 C stehengelassen. Zur Isolierung des Hydrazides wird die Lösung mit 1800 ml Äthanol versetzt, dabei scheidet sich dieses als Rohprodukt mit dem Schmp. 213 bis 215 C (Zersetzung) ab. Nach zweimaliger Kristallisation aus Dimethylformamid--Acetonitril erhöht sich der Schmp auf 214,5 bis 215,5 C (Zcrsetzung), [«]? - 33.9 (c 2,01 in Ameisensäure), [<_t]i⁵ - - 29,7 (c -- 0,52 in Dimethylformamid).

Dünnschichtenchromatographisch ist das Produkt

im System n-Butanol- Eisessig—Wasser 3:1:1 einheitlich; Nachweis: Chlormethode.

g) N-Carbobetizyloxy-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cystein-azid

Zu einer Lösung von 7,103 g (15 mMol) N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cystein-hydrazid in 135 ml Dimethylformamid und 45 ml 1 n-Salzsäure werden bei -10 C unter Rühren tropfenweise 3,6 ml (18 mMol) einer vorgekühlten 5 n-Natriumnitntlösung zugefügt. Das Azid scheidet sich nach etwa 2 Minuten in kristalliner Form ab. Nach 15minutigem Rühren bei 10 C wird zur vollständigen Abscheidung des Azids vorsichtig mit 80 ml Wasser versetzt. Der Niederschlag wird abfiltriert, zunächst mit kaltem Wasser, dann mit kalter 2%iger Natriumhydrogencarbonatlösung und nochmais mit Wasser gewaschen und während 26 Stunden bei 0 C im Hochvakuum getrocknet. Schmp. 124 C (Zersetzung), Kontrolle im IR-Spektrum: scharfe Bande bei λ --- 4,75 μ (-CO-N₃); selbst nach lOtägigem Stehen bei Raumtemperatur noch frei von Isocyanat (/. =■ 4,5 μ).

h) L-Isoleucyl-glycin-äthylester-hydrochlond

15,3 g (44 mMol) N-Carbobenzyloxy-L-isoleucylglycin-äthylester (hergestellt nach P.-A. Jaquenoud und R. A. Boissonnas, HeIv. Chim. Acta, 44, S. 113 [1961]), gelöst in 200 ml Eisessig, werden in Gegenwart von 1,1 Äquivalenten konzentrierter Salzsäure und 5 g Pd-Kohle (10% Pd) bei Raumtempera-

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tür während 7^lk Stunden mit Wasserstoff behandelt. Die Reaktionslösung wird von den leichtflüchtigen Anteilen befreit: das verbleibende öl kristallisiert nach mehrmaligem Verreiben mit trockenem Äther. Das Reaktionsprodukt schmilzt nach zweimaligem Umkristallisieren aus Äthanol—Äther 1 : 5 bei 136 bis 137°C, [α)ϊ° =■ +13,9° (C = 3,0 in absolutem Äthanol).

Es ist dünnschichtenchromatographisch einheitlich im System n-Butanol—Eisessig—Wasser 3 : 1 : 1, Nachweis: Ninhydrinmethode.

i) N-Carbobenzyloxy-L-prolyl-L-isoleucyl-glycinäthylester

15

12,15 g (48 mMol) L-Isoleucyl-glycin-äthylesterhydrochlorid werden in 120 ml absolutem Chloroform gelöst, auf 0⁰C abgekühlt und bei O⁰C mit 7,4 ml (52,8 mMol) Triäthylamin und einer Lösung von 22,2 g (60 mMol) N-Carbobenzyloxy-L-prolinp-nitrophenylester (hergestellt nach M.Bodanszky und V. DuVigneaud.J. Am. Chem. Soc, 81, S. 5688 [1959]) in 40 ml absolutem Chloroform versetzt. Die gelbe Reaktionslösung wird während 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Zur Aufarbeitung wird sie mit 400 ml Chloroform verdünnt, dreimal mit je 90 ml 1 η-Salzsäure, viermal mit je 90 ml 1 η-Ammoniak und dreimal mit je 90 ml Wasser extrahiert und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt und der kristalline Rückstand zweimal aus Äthylacetat umkristallisiert, Schmp. 159 bis 16O⁰C, [«]!"" = -86,4^C (c = 1,99 in Methanol).

Das Produkt ist dünnschichtenchromatographisch einheitlich in den Systemen Benzol—Aceton 7:3 und n-Butanol—Eisessig—Wasser 3:1:1, Nachweis: Chlormethode.

j) N-Carbobenzyloxy-L-prolyl-L-isoleucyl-

glycinamid

Man löst 15,5 g (35,7 mMol) N-Carbobenzyloxy-L-prolyl-L-isoleucyl-glycin-äthylester in 400 ml Methanol und leitet bei O⁰C bis zur Sättigung trockenes Ammoniakgas ein. Nach 30stündigem Stehen bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung im Vakuum bei 3O⁰C zur Trockne eingedampft und der kristalline Rückstand aus Methanol—Wasser 1 : 3 kristallisiert. Das Produkt schmilzt bei 183 bis 184,5^CC, [a]l'° --= -65,7° (c = 1,90 in Methanol).

Es ist dünnschichtenchromatographisch einheitlich in den Systemen Benzol—Aceton 3 : 7 und n-Butanol—Eisessig—Wasser 3:1:1, Nachweis: Chlormethode.

k) L-Prolyl-L-isoleucyl-glycinamid

55

9,35 g (22,3 mMol) N-Carbobenzyloxy-L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamid werden in 200 ml Methanol gelöst, mit 1,1 Äquivalenten wäßriger Salzsäure versetzt und während 5 Stunden in Gegenwart von Pd-Kohle (10% Pd) mit Wasserstoff behandelt. Der Katalysator wird abfiltriert und die Reaktionslösung bei 35°C im Vakuum eingedampft. Der farblose, schaumartige Rückstand wird einmal aus Methanol—Chloroform und zweimal aus Methanol— Äthylacetat kristallisiert. Das so erhaltene Hydro-Chlorid des Tripeptidamids schmilzt, nach Sintern bei 214°C, bei 215,5 bis 218°C unter Zersetzung, [e]«° = -42,4° (c = 2,1 in 95% Äthanol).

Zur Freisetzung der Base wird das obige Hydrochlorid in 50 ml Methanol gelöst und die Lösung durch eine mit Methanol vorbehandelte Ionenaustauschersäule von 100 g Dowex-21 K »DOW«, USA. (Handelsname) (OH-Form) filtriert. Die Säule wird mit insgesamt 400 ml Methanol nachgewaschen und das chlorfreie Eluat im Vakuum bei 30⁰C zur Trockne eingedampft. Das Tripeptidamid bleibt in Form von Nadelbüscheln vom Schmp. 171,5 bis 163⁰C zurück, [α]ϊ° = -65,5° (c =■= 2,02 in Eisessig).

Es ist dünnschichtenchromatographisch einheitlich in den Systemen η - Butanol—Eisessig—Wasser 3:1:1, Methyläthylketon — Pyridin — Wasser 65 : 5 : 20, Nachweis: Ninhydrinmethode.

Das obige Tripeptidamid wurde bereits von P.-A. Jaquenoud und R. A. Boissonnas, HeIv. Chim. Acta, 44, S. 113 (1961), hergestellt nach einer ähnlichen, von der vorstehend angegebenen Synthese durch die Abspaltung der Carbobenzyloxygruppen mittels Bromwasserstoffsäure in Eisessig und die Verwendung des gemischten N-Carbobenzyloxy-prolin-äthoxyameisensäure-anhydrids an Stelle des N - Carbobenzyloxy - prolin - ρ - nitro - phenylesters abweichenden Reaktionsfolge, wobei das erhaltene Tripeptidamid den Schmp. 118⁰C und die spezifische Drehung [α]ί'° = — 63 ± 1° (c =■■ 2 in Eisessig) zeigte.

1) N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cystein-L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamid

Das unter g) hergestellte N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cystein-azid wird in 150 ml kaltem Dimethylformamid gelöst und zu einer Lösung von 4,264 g (15 mMol) L-Prolyl-L-isoleucyl-glycinamid [vgl. k)] und 2,1ml (15 mMol) Triäthylamin in 50 ml Dimethylformamid gegeben. Man rührt die Reaktionslösung während 56 Stunden bei 0 bis + 3^C'C. Nach dieser Zeit ist im IR-Spektrum die Azidbande bei 4,75 μ nicht mehr erkennbar.

Zur Isolierung des Reaktionsproduktes wird die Reaktionslösung auf -1O⁰C abgekühlt und das Reaktionsprodukt durch vorsichtige Zugabe von 750 ml eiskaltem Wasser als gallertige Masse ausgefällt. Der Niederschlag wird abgenutscht, mit kaltem Wasser gut gewaschen und über Phosphorpentoxyd im Vakuum getrocknet. Zur Entfernung von Verunreinigungen wird das feingepulverte Rohprodukt dreimal mit je 40 ml Acetonitril—Methanol 4 : 1 innig verrieben und abfiltriert. Nach zweimaliger Kristallisation aus Dimethylformamid— Acetonitril 1 : 4 erhält man das S,N-geschützte Pentapeptidamid mit dem Schmp. 233 bis 235°C (Zersetzung), [α]ί?° = -51,3 (c = 1,03 in Dimethylformamid), [«JS⁵⁰ = -79,3° (c = 1,03 in Eisessig).

Das Produkt ist dünnschichtenchromatographisch einheitlich in den Systemen n-Butanol—Eisessig— Wasser 3:1:1, Methyläthylketon—Pyridin—Wasser 65 : 5 : 20, Methanol—Chloroform 2:1, Nachweis: Chlormethode.

Dasselbe geschützte Pentapeptidamid kann auch durch Kondensation von N - Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cystein (hergestellt z. B. nach RA. Boissonnas, St. Guttmann, P.-A. Jaquenoud und J.-P. Waller, HeIv. Chim. Acta, 38, S. 1491 [1955]) mit L-Prolyl-L-isoleucyl-glycinamid in Dimethylformamid—Acetonitril (1 : 4,4) mit Hilfe von N.N'-Dicyclohexyl-carbodiimid erhalten werden.

m) C-terminales Pentapeptidamid:

L-Asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-

L-isoleucyl-glycinamid

2,01 g (2,78 mMol) N - Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamid werden mit 12 ml 2 n-Bromwasserstoffsäure in Eisessig versetzt. Die Carbobenzyloxyverbindung ist nach 40 Minuten vollständig gelöst. Nach 2'/2Stündigem Rühren bei 20'C wird zur tief- ίο gelben Lösung 35 ml absoluter Äther gegeben, wobei das Hydrobromid des S-geschützten Pentapeptidarnids als harzige Masse ausfällt. Der Niederschlag wird nach wiederholtem Verreiben mit absolutem Äther körnig. Er wird abfiltriert und zweimal aus Äihanol—Äther umgefällt.

Das gleiche Hydrobromid wird bei Verwendung von Brom wasserstoffsäure in Trifluoressigsäure erhalten, während man bei alleiniger Verwendung von Trifluoressigsäure bei Rückflußtemperalur das entsprechende Trifluoracetat erhält.

Zur Freisetzung des S-geschützten Pentapeptidamids werden 2,46 g (3,66 mMol) L-Asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamidhydrobromid in 30 ml Methanol gelöst und durch eine mit Methanol vorbehandelte lonenaustauschersäule von 60 g Dowex-21 K »DOW«, USA. (Handelsname) (OH-Form) filtriert. Das freie Pentapeptidamid wird mit 250 ml Methanol eluiert und das bromfreie Eluat bei 30^eC im Vakuum unter Feuchtigkeitsausschluß zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird einmal aus absolutem Äthanol— absolutem Äther und einmal aus Aceton—Äthylacetat—Äther umgefällt. Man erhält das S-geschützte Pentapeptidamid als farbloses, hygroskopisches Pulver, welches direkt zur Kupplung mit dem gemäß e) erhaltenen S,N-geschützten Tetrapeptid-azid verwendet wird.

n) S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-seryl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamid

40

Das unter e) hergestellte S,N-geschützte Tetrapeptid-azid wird in 35 ml auf —10'C abgekühltem Dimethylformamid gelöst, mit einer auf - 10°C abgekühlten Lösung von 0,769 g (1,3 mMol) L-Asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamid [hergestellt unter m)] und 0,18 ml (1,3 mMol) Triäthylamin in 5 ml Dimethylformamid versetzt. Man läßt die Temperatur auf - 7 bis - 5' C steigen und rührt die Reaktionslösung bei dieser Temperatur während 22 Stunden. Nach dieser Zeit fehlt im IR-Spektrum die charakteristische Azidbande bei 4,75 μ.

Das N,S,S'-geschützte Nonapeptidamid wird durch sorgfältige Zugabe von 130 ml Eiswasser ausgefällt, abfiltriert, mit kaltem Wasser, 0,5 η-Salzsäure, Wasser. 3⁽⁾/oiger Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen und über Phosphorpentoxyd im Vakuum getrocknet. Das Produkt sintert bei 205³C und schmilzt bei 211 bis 217"C. Zur Reinigung wird es viermal aus Dimethylformamid—Acetonitril 1 : 6 umgefällt und jeweils mit Dimethylformamid— Acetonitril 1 : 7, Methanol—Acetonitril 1 : 5, Acetonitril, Äthylacetat und Äther gewaschen. Schmp. nach Sintern bei 21TC; 225,5 bis 228,5°C (Zersetzung), [a]V^c .= -22,7° (C= 1,44 in Dimethylformamid).

ο) S^'-Dehydro-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-

L-seryl-L-asparaginyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucyl-

glycinamid --= SerMle⁸-oxytocin

100 mg (0,767 mMol) N-Tosyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-seryl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamid werden in 150 ml flüssigem Ammoniak (über Natrium destilliert) gelöst und die Lösung so lange mit Natrium versetzt, bis die blaue Farbe während 5 Minuten bestehenbleibt. Das überschüssige Natrium wird mit Ammoniumchlorid beseitigt, das Ammoniak abgedampft und der Rückstand im Vakuumexsikkator über konzentrierter Schwefelsäure von den letzten Resten Ammoniak befreit. Der Rückstand wird in 200 ml Eiswasser gelöst, die Lösung mit 2 n-Essigsäure auf pH 6,6 bis 6,8 gebracht und so lange ein Luftstrom durchgeleitet, bis die Reaktion mit Natriumnitroprussiat negativ ausfällt. Die Reaktionslösung wird darauf mit 2 η-Essigsäure auf pH 4 gestellt, durch einen Hyflofilter filtriert und lyophilisiert. Das Rohprodukt wird durch Gegenstromverteilung nach Craig (L. C. Craig, Analytic. Chemistry, 22, S. 1346 [1950]) im System sek.-Butanol—0,017 η-Essigsäure gereinigt. Die Haupttraktion mit einem Verteilungskoeffizienten K von 0,53 bei 25°C besitzt am isolierten Rattenuterus eine oxytocische Aktivität von etwa 130 lE/mg.

Beispiel 2

a) !-(N-Carbobenzyloxy-L-seryD^-itert.-butoxycarbonyl)-hydrazin

3,59 g (15 mMol) N-Carbobenzyloxy-L-serin (z.B. hergestellt nach Vorschriften von St. Guttmann und R. A. Boissonnas, HeIv. Chim. Acta, 41, S. 1852 [1958], oder E. B a e r und J. M a u r u k a s , J. biol. ehem., 212, S. 25 [1955]) und 2,18 g (16,5 mMol) tert.-Butoxycarbonyl-hydrazin (z. B. erhalten nach den Angaben von L. A. C a r ρ i η ο . J. Am. Chem. Soc, 79, S. 98 und 4427 [1957], und L. A. C a r ρ i η ο, C. A. C i ζ a und B. A. C a r ρ i η ο . a. a. Ο., 81, S. 955 [1959]) werden in 35 ml Methanol gelöst und bei 0⁰C innerhalb einer Stunde mit einer Lösung von 6,99 g (16,5 mMol) 1 - Cyclohexyl-3 - (2 - morpholinyl - (4) - äthyl) - carbodiimidmethylp-toluolsulfonat in 15 ml Methanol versetzt. Nach 20stündigem Stehen bei O⁰C wird das Methanol im Vakuum abdestilliert und das zurückbleibende öl in Essigester—Wasser aufgenommen. Die Essigesterlösung wird sorgfältig mit Wasser, 2 n-Zitronensätire, Wasser, 5%iger Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Entfernung des Essigesters im Vakuum bleibt das Produkt als öl zurück, welches beim Verreiben mit Äther kristallisiert. Das Rohprodukt wird aus Essigester—Hexan kristallisiert Schmp. 99 bis 101 C oder 112 bis 113 C (Polymorphie; Identität der IR-Spektren in Lösung, gleiche optische Aktivität; gleiches dünnschichtenchromatographisches Verhalten. [α]έ⁵⁰ -- -25,9' (c -2,Ii in Methanol). Ausbeute: 2,95 g (56%).

Das Produkt ist im Dünnschichtenchromatogramm in den Systemen Benzol—Aceton 6 : 4. Methyläthylketon — Pyridin — Wasser 65 : 5 : 20. n-Butanol—Eisessig—Wasser 3:1:1 einheitlich. Nachweis: Chlormethode.

An Stelle von Methanol kann auch Acetonitril als Lösungsmittel verwendet werden, und 1-Cyclo-

hexyl-3-(2-morpholinyl-(4)-äthyl)-carbodiirnid kann durch !^,N'-Dicyclohexyl-carbodiimid ersetzt werden.

b) 1 -(L-Seryl)-2-(tert.-butoxycarbonyl)-hydrazinbenzolsulfonat

14,8 g (41,9 mMol) l-(N-Carbobenzyloxy-L-seryl)-2-(tert.-butoxycarbonyl)-hydrazin werden in 250 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von Pd-Kohle (10% Pd) im Wasserstoffstrom hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und die Reaktionslösung im Vakuum eingeengt. Das zurückbleibende öl wird zweimal mit absolutem Äther extrahiert und im Vakuum getrocknet. Das Produkt, welches als fester Schaum anfällt, wird direkt weiterverarbeitet.

Zur Charakterisierung wird das Rohprodukt wie folgt in das kristalline Benzolsulfonat übergeführt: 2,8 g Benzolsulfonsäure werden in 6 ml Methanol gelöst, auf O⁰C abgekühlt und zu einer eiskalten Lösung von 3 g (13,7 mMol) l-(L-Seryl)-2-(tert.-butoxycarbonyO-hydrazin in 6 ml Methanol gegeben. Das Benzolsulfonat scheidet sich nach Zugabe von 150 ml trockenem Äther als öl ab, welches durch Kratzen zur Kristallisation gebracht wird. Das Produkt wird abfiltriert, mit Methanol—Äther gewaschen und zur Reinigung zweimal aus Äthanol— Äther kristallisiert. Schmp. 151.5 bis 153,5⁰C (Zersetzung); [<t]l^y ■■= +14,4" (c -- 1,96 in Methanol). Im Dünnschichtenchromatogramm liefert das Produkt in den Systemen Benzol—Äthanol 7 : 3, Methanol—Chloroform —17% NH₃ 2:2:1 und n-Butanol—Pyridin—Eisessig—Wasser 90:60:18:72 nur einen Fleck, Nachweis: Ninhydrinrnethode.

c) l-(N-Carbobenzyloxy-L-isoleucyl-L-seryl)-2-(tert.-butoxycarbonyl)-hydrazin

Eine Lösung von 2,7 g (12,35 mMol) l-(L-Seryl)-2 - (tert. - butoxycarbonyl) - hydrazin und 4,77 g (12,35 mMol) N-Carbobenzyloxy-L-isoleucyl-p-nitrophenylester (hergestellt z. B. nach M.Bodanszky und V. DuVigneaud, J. Am. Chetn Soc, 81, S. 5688 [1959]) in 24 ml Essigester wird für 48 Stunden bei 13 bis 14^DC gerührt. Nach etwa 7 Stunden beginnt das geschützte Dipeptid sich abzuscheiden. Zum Schluß wird das Reaktionsgemisch auf 0⁰C abgekühlt, das Produkt abfiltriert und sorgfältig mit kaltem Essigester gewaschen. Nach zweimaliger Kristallisation aus heißem Essigester schmilzt es bei 187 bis 188°C unter Zersetzung. [«]?" ■-= - 36" (c --■= 2,01 in Methanol).

Es ist dünnschichtenchromatographisch einheitlich im System Benzol—Äthanol 7.: 3, Nachweis: Chlormethode.

d) l-(L-Isoleucyl-L-seryl)-2-(tert.-butoxycarbonyl)-hydrazin

13,4 g (28,8 mMol) l-(N-Carbobenzyloxy-L-isoleucyl-L-seryl)-2-(tert.-butoxycarbonyl)-hydrazin werden in 300 ml Methanol in Gegenwart von Pd-Kohle (10% Pd) hydriert. Nach Entfernung des Katalysators wird das Methanol im Vakuum abgedampft. Der ölige Rückstand wird mehrmals mit Äther und Äther—Petroläther behandelt und die Lösungsmittel jeweils abdestilliert. Der resultierende pulvrige Rückstand wird darauf mit Essigester verrieben und abfiltriert. Zur Reinigung wird das Produkt zweimal aus Acetonitril kristallisiert. Schmp. 133 bis 134^DC (Zersetzung ab 134°C), [a)f° = -36,1 (c = 1,99 in Methanol). Dünnschichtenchromatographisch ist das Produkt einheitlich im System Benzol-

8 : 2, Nachweis: Ninhydrinmethode.

-Äthanol

e) l-(S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-

L-isoleucyl-L-seryl)-2-(tert.-butoxycarbonyI)-hydrazin

Eine auf -10°C abgekühlte Lösung von 2,22 g

ίο (4,2 mMol) S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosin (hergestellt nach V. DuVigneaud, M.F. Bartlett und A. J ö h 1 , J. Am. Chem Soc, 79. S. 5572 [1957]) und 1,41 g (4,2 mMol) l-(L-Isoleucyl-L-seryl)-2-(tert.-butoxycarbonyl)-hydrazin in 22 ml Dimethylformamid—Acetonitril 1 : 1 wird mit 0,89 g (4,3 mMol) Ν,Ν'-Dicyclohexyl-carbodiimid versetzt und während 52 Stunden bei ■- \0^c C gerührt. Im Verlauf der Reaktion scheiden sich N,N'-Dicyclohexylharnstoff und das geschützte Tetrapeptidhydrazid ab. Das Reaktionsgemisch wird mit 70 ml eiskaltem Wasser versetzt, der Niederschlag abfiltriert und sorgfältig mit Wasser, 3%iger Natriumhydrogencarbonatlösung und zum Schluß nochmals mit Wasser gewaschen. Zur Entfernung des N,N-Dicyclohexyl-hamstoffes wird das Rohprodukt in 8,3 ml Dimethylformamid aufgenommen. Nach 2stündigem Stehen bei 0 C wird der Harnstoff abfiltriert, mit 1,5 ml Dimethylformamid gewaschen und das Filtrat mit 50 ml Acetonitril versetzt. Dabei fällt das geschützte Tetrapeptidhydrazid als Gallerte aus. Es wird abgenutscht, mit kaltem Acetonitril und Äther gewaschen und zweimal aus Dimethylformamid—Acetonitril kristallisiert. Schmp. 227 bis 229°C (Zersetzung). [n]%^e' = -30,2° (c -= 1,96 in Pyridin).

Im Dünnschichtenchromatogramm ist das Produkt einheitlich in den Systemen Methyläthylketon— Pyridin—Wasser 65 : 5 : 20. Benzol—Äthanol 8 : 2, n-Butanol—Pyridin—Eisessig—Wasser 90:60:18:72, Nachweis: Chlor- und Folinmethode.

0 S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-serin-hydrazid

0,506 g (0,6 mMol) HS-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-seryl)-2-(tert.-butoxycarbonyl)-hydrazin werden in 10 ml kalter 90%iger Trifluoressigsäure gelöst und F/4 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Darauf wird die Reaktionslösung auf 0^:C abgekühlt und das Produkt mit 65 ml Eiswasser ausgefällt. Es wird abfiltriert, mit Wasser, 3%iger Natriumhydrogencarbonatlösung, Wasser und zum Schluß mit Acetonitril gewaschen. Nach Kristallisation aus Dimethylformamid—Acetonitril oder Dimethylformamid—Methanol zeigt dieses Tetrapeptidhydrazid die gleichen Eigenschaften (Schmp., dünnschichtenchromatographisches Verhalten und optische Aktivität) wie das durch HydrazinolysedesS-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl- L-isoleucyl-L-serin-methylesters gewonnene Hydrazid [vgl. Beispiel 1, d)]. Schmp. 124 bis 128°C, Zersetzung bei 230 bis 231⁰C. [«]?" = +6,3° (c - 2,11 in Dimethylformamid); [a]f'--=■- 69.3° (c = 2,06 in Ameisensäure).

Aus diesem Hydrazid wird wie unter Beispiel 1, e) das Azid hergestellt, und die weitere Synthesefolge zum gewünschten Nonapeptidamid erfolgt wie im Beispiel 1, n) bis o) angegeben.

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung des neuen Nonapeptides der Formel S,S'-Dehydro-L-cysteinyl-L - tyrosyl - L - isoleucyl - L - seryl - L - asparaginyl-L - cysteinyl - l - prolyl - L - isoleucyl - glycinamid, dadurch gekennzeichnet, daß man einerseits zur Herstellung des N-terminalen Tetrapeptidderivates der Formel S-Benzyl-N-tosyl-L - cysteinyl - l - tyrosyl - L - isoleucyl - L - serin - azid ein reaktionsfähiges funktionelles Derivat des bekannten N-Carbobenzyloxy-L-isoleucine mit einem L-Serin-alkylester zu einem N-Carbobenzyloxy - L - isoleucyl - L - serin - ester umsetzt, diesen Ester mit katalytisch aktiviertem Wasserstoff behandelt und den entstandenen L-Isoleucylserin-ester mit dem bekannten S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosin in Gegenwart eines Carbodiimides zu einem S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L - tyrosyl - L - isoleucyl - L - serin - ester kondensiert und durch Behandlung mit Hydrazin in das S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-serin-hydrazid überführt und dieses mittels salpetriger Säure in das Azid umwandelt, andererseits zur Herstellung des C-terminalen Pentapeptidderivates der Formel L-Asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamid den bekannten N - Carbobenzyloxy - L - asparaginyl-S - benzyl - L - cystein - methylester mit Hydrazin zum N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cystein-hydrazid umsetzt, dieses durch Behändlung mit salpetriger Säure in das N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cystein-azid überführt, dieses S,N-geschützte Dipeptidazid mit dem bekannten L-Prolyl-L-isoleucyl-glycinamid umsetzt und das erhaltene N-Carbobenzyloxy-L - asparaginyl - S - benzyl - L - cysteinyl - L - prolyl-L-isoleucyl-glycinamid in dasL-Asparaginyl-S-benzyl - L - cysteinyl - L - prolyl - L - isoleucyl - glycinamid überfuhrt, dieses C-terminale S-geschützte Pentapeptidamid mit dem oben beschriebenen N-terminalen S,N - geschützten Tetrapeptidazid zum S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-seryl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl- L-isoleucyl-glycinamid umsetzt, in diesem die beiden S-Benzylreste und den Tosylrest reduktiv abspaltet und das erhaltene L-Cysteinyl-L-tyrosyl-L - isoleucyl - l - seryl - L - asparaginyl - L - cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamid durch Oxydation in das gewünschte Nonapeptid der Formel S,S' - Dehydro - L - cysteinyl - L - tyrosyl -L- isoleucyl-L - seryl -L- asparaginyl -l - cysteinyl -L- prolyl -L- isoleucyl-glycinamid überführt.

2. Abänderung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung des N-terminalen Tetrapeptidderivates ein reaktionsfähiges funktionelles Derivat des N-Carbobenzyloxy-L-isoleucins mit einem N²-geschützten Serin-hydrazid zum entsprechenden N-Carbobenzyloxy-L-isoleucyl-L-serin-hydrazid-N²-derivat umsetzt, dieses mit katalytisch aktiviertem Wasserstoff behandelt, das entstandene L-Isoleucyl-L-serin-hydrazid-N²-derivat mit S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosin mittels eines Carbodiimids zum entsprechenden Tetrapeptid-hydrazid-N²-deri vat kondensiert, durch säurekatalysierte Solvolyse in das S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-serin-hydrazid überführt, dieses durch Einwirkung von salpetriger Säure in das S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-serinazid umwandelt, dieses N-terminale S,N-geschützte Tetrapeptidazid mit dem im Anspruch 1 beschriebenen C-terminalen S-geschützten Pentapeptidamid der Formel L-Asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamid zum S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L - seryl - L - asparaginyl - S - benzyl - L - cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamid umsetzt, in diesem die beiden S-Benzylreste und den N-Tosylrest reduktiv abspaltet und das erhaltene L-Cysteinyl-L - prolyl - l - isoleucyl - L - seryl - L - asparaginyl-L - cysteinyl - L - prolyl - L - isoleucyl - glycinamid mittels Sauerstoff oder Kaliumferricyanid in das gewünschte Nonapeptid der Formel S,S'-Dehydro -L - cysteinyl -l - tyrosyl - L - isoleucyl -L - seryl-L - asparagin yl - L - cysteinyl - L - prolyl - L - isoleucylglycinamid überführt.

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BiHMlesdnickerei Bertis