DE2537071A1

DE2537071A1 - Amid

Info

Publication number: DE2537071A1
Application number: DE19752537071
Authority: DE
Inventors: Dieter Dr Gillessen; Rolf Dr Studer
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1974-08-28
Filing date: 1975-08-20
Publication date: 1976-03-18
Also published as: LU73258A1; GB1478553A; FR2282907A1; NO752947L; AU8356775A; SE7509532L; NL7509958A; ZA754724B; BE832783A; IL47796A0; IE41605L; DD123314A5; IE41605B1; FI752409A; JPS5148662A; DK386275A

Description

Patentanwalt 2 O. Aug. 1975

DR. FRANZ LEDERER

RAN 4105/14

F. Hoffmann-La Rochc & Co. Aktiengesellschaft, Basel/Schweiz

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Tetrapeptid amid der Formel

pGlu—His—Pro—NH—CH„—CH₂—CO—NH _ I

worin alle Aminosäuren mit einem Asymmetriezentrum L-Konfiguration aufweisen,

und dessen Säureadditionssalze, sowie Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen.

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Abkürzungen für die einzelnen Aminosäuren und ihre Schutzgruppen sind die in der Peptidchemie bisher gebräuchlichen und dem Fachmann allgemein bekannten [Literatur: Schröder E. und Lübke, K.; The Peptides, Academic Press, New York & London, Bd I (1965) und Bd. II (1966) und IUPAC-IUB-Regeln]; sie bedürfen daher hier keiner weiteren Definition, mit

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Ausnahme von "pGlu" was Pyroglutaminsäure bedeuten soll.

Beispiele von Säureadditionssalzen der Verbindung der Formel I sind Salze mit anorganischen Säuren wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure, Perchlorsäure und dgl. oder mit organischen Säuren wie Essig-, Oxal-, Malein-, Aepfel-, Wein- oder Citronensäure und dgl. Besonders bevorzugt sind die pharmazeutisch verwendbaren, nicht-toxischen Säureadditionssalze.

Der Ausdruck "niederes Alkyl" bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffreste mit 1-6 Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Aetiiyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Pentyl, Hexyl usw. Der Ausdruck "Aryl" bedeutet insbesondere den Phenylrest, welcher substituiert oder unsubstituiert sein kann. Als Substituenten des Phenylrestes kommen insbesondere in Frage: niederes Alkoxy, Nitro, Halogene wie Fluor, Chlor, Brom und Jod. Beispiele von substituierten Phenylresten sind p-Nitrophenyl, Tri- oder Pentachlorphenyl und dgl. "Niederes Alkoxy" bedeutet eine niedere Alkyloxygruppe, worin der niedere Alkylrest die obige Bedeutung hat, wie z.B. Methoxy, Aethoxy, Propoxy, Butoxy usw.

Das neue Tetrapeptidamid der Formel I und dessen Säureadditionssalze können in an sich bekannter Weise dadurch hergestellt werden, dass man

a) das Dipeptid der Formel

Pro—NH CH₂ CH₂—CO—NH₂ II

mit einem Dipeptid der allgemeinen Formel

pGlu—His—R, III

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worin R. Hydroxy oder einen die Carboxylgruppe aktivierenden Rest darstellt, umsetzt oder, dass man

b) ein Tripeptid der allgemeinen Formel

pGlu—His—Pro—R₁ IV

worin R, die obige Bedeutung hat, mit dem Amid der Formel

CH₂—CH₂ CO—NH₂ V

umsetzt oder, dass man

c) das Tripeptid der Formel

HiS—Pro—NH—CH₂—CH₂—CO—NH₃ VI

pGlu—R₁ VII

worin R- die obige Bedeutung hat, umsetzt oder, dass man

d) von einem Tetrapeptid der allgemeinen Formel R₂—pGlu—His (R₃) —Pro—NH—CH₃—CH₃—CO—NH—R₄ VIII

worin R„ Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe, R₃ Wasserstoff oder eine die Imidazolfunktion schützende Gruppe und R. Wasserstoff oder eine Amidschutzgruppe darstellen, wobei wenigstens einer der Reste R₃, R₃ und R. von Wasserstoff

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verschieden ist,
die Schutzgruppe(n) abspaltet oder, dass man

e) ein Tetrapeptid der allgemeinen Formel

pGlu—His—Pro—NH—CH₃—CH₃—COX IX

worin X Hydroxy, einen die Carbxylgruppe aktivierenden Rest oder den Rest -OR₅ darstellt, worin R₁. niederes Alkyl, Aryl, Aryl-niederes Alkyl oder den Rest eines polymeren Trägermaterials bedeutet, amidiert oder, dass man

f) in einem Tetrapeptid der allgemeinen Formel

R_c—His—Pro—NH—CH₀—CH₀—COY X

D ZZ

worin R_g den gegebenenfalls geschützten Glutamin- oder Glutaminsäurerest, Y einen die Carboxylgruppe aktivierenden Rest, den Rest -NHR., worin R₄ die obige Bedeutung hat, oder den Rest -OR₅, worin R₅ die obige Bedeutung hat, darstellen,

unter gleichzeitiger oder vorhergehender Abspaltung gegebenenfalls vorhandener Schutzgruppen den Pyroglutaminring schliesst, und, dass man, gewünschtenfalls, eine erhaltene Verbindung der Formel I in ein Säureadditionssalz überführt, wobei in den Formeln II bis X alle Aminosäuren mit einem Asymmetriezentrum L-Konfiguration aufweisen.

Beispiele für die Carboxylgruppe aktivierende Gruppen sind Ester wie Cyanomethyl-, p-Cyanophenyl-, p-Nitrophenyl-, 2,4,5-Trichlorphenyl-, Pentachlorphenyl-, Thiophenyl-, p-Nitrothiophenyl-, 1-Benztriazolyl-, Phthalimidyl-, 1-Succinimidyl-,

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l-Piperidyl-, 8-Chinolyl-, S-Chlor-e-chinolyl-, 2-Pyridyl-, 2-Thiopyridylester, Azide und Halogenide.

Es können alle im Zusammenhang mit Peptidsynthesen bekannten Schutzgruppen verwendet werden.

Beispiele für Aminoschut ", · _t pen sind solche vom Acyl-Typ (wie Formyl, Benzoyl, Phthalyl, Trifluoracetyl, p-Tosyl, Aryl- und Alkylphosphoryl, Phenyl- und Benzylsulfonyl, Tritylsulfenyl, o-Nitrophenylsulfenyl, γ-Chlorbutyryl oder o-Nitrophenoxyacetyl), vom Alkyl-Typ (wie Trityl, Benzyl, Alkyliden) oder vom ürethan-Typ (wie Carbobenzoxy, p-Brom-, p-Chlor- oder p-Methoxycarbobenzoxy, ToIyloxy-, Allyloxy-, Cyclopentyloxy-, Cyclohexyloxy-, t-Butyloxy- oder 1,1-Dimethylpropyloxy-, 2-(p-Biphenylyl)-2-propyloxy-carbonyl oder Benzylthiocarbonyl), usw.

Beispiele für Amidschutzgruppen sind Xanthenyl, 2,4-Dimethoxybenzyl, 2,4,6-Trimethoxybenzyl und 4,4·-Dimethoxybenzhydryl und dgl.

Beispiele für Carboxylschutzgruppen sind O- und S-Ester (wie Methyl-, Aethyl-, t-Butyl-, Benzyl-, Cyanomethyl-, Phthalimidomethyl-, 4-Picolyl-, 2-p-Tosyläthyl-, Phenyl-, p-Nitrophenyl-, Thiophenyl- oder p-Nitrobenzy!ester), Amide oder Hydrazide (wie Trityl-, Phenyl-, Carbobenzoxy- oder t-Butoxycarbonylhydrazide). Ferner kann die Carboxylgruppe durch Salzbildung geschützt werden. Auch der Rest eines polymeren Trägers kann als Carboxylschutzgruppe betrachtet werden.

Als spezielle Schutzgruppen für den Histidinrest seien beispielsweise genannt: Benzyl, p-Nitrobenzy1, tert. Butoxycarbonyl, Dinitrophenyl, Trityl, Benzyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, Tosyl, Piperidinocarbonyl und dgl.

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_ Ci _M

Die Umsetzung sowohl des Dipeptides der Formel II mit einem Dipeptid der Formel III, als auch diejenige eines Tripeptides der Formel IV mit dem Amid der Formel V sowie diejenige des Tripeptides der Formel VI mit einer Verbindung der Formel VII, kann in an sich bekannter Weise durchgeführt werden. Zweckmässig erfolgen diese Umsetzungen in \ einem inerten organischen Lösungsmittel, vorzugsweise in einem polaren organischen Lösungsmittel, wie etwa Dimethylformamid, Dimethylsulfoxyd, Acetonitril, halogenierten Kohlenwasserstoffen, wie Dichlormethan, Chloroform und dgl. Die Umsetzung erfolgt auch zweckmässig bei einer Temperatur unterhalb Raumtemperatur. Falls der Rest R, in dem Dipeptid der Formel III oder in einem Tripeptid der Formel IV die Hydroxygruppe darstellt, erfolgt die Umsetzung zweckmässig in Gegenwart eines Kondensationsmittels, wie etwa Dicyclohexylcarbodiimid, Carbonyl-diimidazol und dgl. oder auch nach der gemischten Anhydridmethode.

Die Abspaltung der Schutzgruppe(η) aus einem Peptid der Formel VIII oder X kann ebenfalls in allgemein bekannter Weise und unter den für die einzelnen Gruppen geltenden Reaktionsbedingungen erfolgen. So kann z.B. die Abspaltung einer Benzyloxycarbonylgruppe durch Hydrieren in Gegenwart eines Katalysators, beispielsweise eines Palladium/Kohle-Katalysators erfolgen. Die tert. Butyloxycarbonylgruppe kann z.B. durch Behandlung mit Trifluoressigsäure oder mit HCl in Eisessig entfernt werden.

Die Amidierung eines Tetrapeptides der allgemeinen Formel IX kann ebenfalls in an sich bekannter Weise, vorzugsweise durch Umsatz mit Ammoniak bei Raumtemperatur und in einem geeigneten inerten organischen Lösungsmittel, erfolgen.

Die Schliessung des Pyroglutaminringes in einem Tetrapeptid der Formel X kann ebenfalls in an sich bekannter Weise durchgeführt werden. So kann, beispielsweise, die Ring-

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Schliessung in einer Verbindung der Formel X, worin R_fi einen mit einer Estergruppe geschützten Glutaminsäurerest und Y den Rest -OR₁- darstellen, unter gleichzeitiger Abspaltung der Schutzgruppen, durch Behandlung mit Ammoniak erfolgen.

Die als Ausgangsmaterial verwendeten Verbindungen der Formeln II, VI, VIII, IX und X sind neue Verbindungen und als solche ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Die Herstellung der neuen Ausgangsverbindungen kann in an sich bekannter Weise unter Verwendung der üblichen, insbesondere der obengenannten Schutzgruppen erfolgen.

Die erfindungsgemässe Verbindung der Formel I und deren pharmazeutisch verwendbare Säureadditionssalze haben antidepressive Wirksamkeit und können zur Behandlung von depressiven Syndromen verwendet werden.

Die Wirkung von Antidepressiva kann damit erklärt werden, dass diese Pharmaka die Aktivität noradrenerger Neuronen des Gehirns normalisieren, welche bei depressiven Erkrankungen verändert ist. Aenderungen der Aktivität noradrenerger Neurone können durch Messung der Noradrenalin (NA)-Freisetzung erfasst werden, z.B. durch Bestimmung der Konzentration von endogenem NA im Gehirn nach Blockierung der NA-Synthese durch den Dopamin-ß-hydroxylase-Inhibitor bis(4-Methyl-l-homopiperazinyl-thiocarbonyl) -disulfid (FLA 63). Hat eine Testsubstanz NA-freisetzende Wirkung, so zeigt sich dies in einer Verstärkung der FLA 63-induzierten NA-Senkung.

Zur Bestimmung der antidepressiven Wirkung der erfindungsgemässen Verbindung wurde die Senkung von NA im Gesamthirn von Mäuse-Männchen äO Minuten nach i.p. Injektion von FLA 63 (5 mg/kg) bestimmt. Der nach FLA 63 allein gefundene Wert ist in der Tabelle als relative 100% angegeben. Gleichzeitige Injektion von L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolyl-ßalaninamid (Testsubstanz) führte zu einer signifikanten Beschleunig ~j der FLA-63 induzierten NA-Senkung.

fiÜ981?/10n7

Tabelle Noradrenalin

FLA 63 allein (= Kontrolle) 100,0 +1,2 FLA 63 plus Testsubstanz 82,2 + 2,6

Demnach erhöht die erfindungsgemässe Verbindung die Freisetzung von NA im Mäusegehirn. Dieser Befund und die an diesen Mäusen beobachtete Steigerung der lokomotorischen Aktivität sind ein Nachweis für die antidepressive Wirkung des Präparates.

Das L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolyl-ß-alaninamid hat eine LD 10 von über 8 g/kg p.o. sowie eine LD 50 von über 4 g/kg i.v. bei der Maus.

Die Dosierung soll nach dem individuellen Bedarf geregelt werden und kann zwischen 100 \xq/ bis 1 mg i.v. oder von 10 bis 100 mg p.o. pro Einzeldosis, ein- bis mehrmals pro Tag verabreicht, variieren.

Das Verfahrensprodukt der Formel I sowie dessen pharmazeutisch verwendbaren Säureadditionssalze können als Heilmittel in Form pharmazeutischer Präparate Verwendung finden, welche diese Produkte in Mischung mit einem für die enterale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen, organischen oder anorganischen inerten Trägermaterial, wie z.B. Wasser, Gelatine, Gummi arabicum, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, TaIk^ pflanzliche OeIe, Polyalkylenglykol, Vaseline usw. enthalten. Die pharmazeutischen Präparate können in fester Form, z.B. als Tabletten, Dragees, Suppositorien, Kapseln; oder in flüssiger Form, z.B. als Lösungen, Suspensionen, Sirupen oder Emulsionen, vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe wie Konservierungs-, Stabilisierungs'-, Netz- oder Emulgiermittel, Salze zur Veränderung des osmotischen Druckes

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oder Puffer. Bevorzugte Verabreichungsformen sind Lösungen (Ampullen), Tabletten und intranasale Sprühlösungen.

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Beispiel 1

a) ß-Alanin-methylester-hydrochlorid

22 g /3-Alanin wurden in 4 η HCl in Methanol während , 1 Stunde am Rückfluss erhitzt und anschliessend im Vakuum zur Trockene eingeengt. Diese Behandlung wurde noch zweimal wiederholt und das zurückbleibende OeI aus Methanol/Aether kristallisiert. Ausbeute: 27,5 g, Fp 92°C.

b) t-Butyloxycarbonyl-L-prolyl-ß-alanin-methylester

17,2 g t-Butyloxycarbonyl-L-prolin wurden in 160 ml Tetrahydrofuran gelöst, auf -20°C gekühlt und mit 11,1 ml Triäthylamin und 7,7 ml Chlorameisensäureäthylester versetzt. Die Suspension wurde noch 5 Minuten bei -20°C gerührt und mit einer auf -20 C vorgekühlten Suspension, hergestellt aus 13,4 g ß-Alaninmethylester-hydrochlorid und 13,4 ml Triäthylamin in 160 ml einer Mischung aus Dimethylformamid und Tetrahydrofuran (1:1), versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde unterhalb -10 C und eine weitere Stunde bei Raumtemperatur gerührt, filtriert, und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der ölige Rückstand wurde in 200 ml Aethylacetat gelöst und je dreimal mit 5%iger KHSO.-Lösung, Wasser, 5%iger NaHCO--Lösung und Wasser gewaschen und über Na„S0. getrocknet. Die organische Phase wurde im Vakuum eingeengt und der ölige Rückstand aus Aether/Petroläther kristallisiert. Ausbeute: 19,2 g; Fp 70°C; [a]p = -39,2° (c = 1, Dimethylformamid).

c) t-Butyloxycarbonyl-L-prolyl-ß-alaninamid

Eine Lösung von 11 g t-Butyloxycarbonyl-L-prolyl-ßalaninmethylester in 80 ml Methanol wurde bei 0 C mit Ammoniakgas gesättigt und 2 Tage bei Raumtemperatur auf-

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bewahrt. Die Lösung wurde im Vakuum konzentriert und der Rückstand aus Methanol/Wasser kristallisiert. Ausbeute:

9,8 g; Fp 175-177°Cf [a]^⁵ = -44,5° (c = 1, Dimethylformamid)

d) L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolyl-ß-alaninamid-acetat

Durch eine Lösung von 9 g t-Butyloxycarbonyl-L-prolylß-alaninamid in 50 ml Eisessig wurde während 1 Stunde HCl-Gas geleitet, die Lösung im Vakuum konzentriert und das resultierende L-Prolyl-ß-alaninamid-hydrochlorid am Vakuum über Nacht getrocknet.

Eine Suspension von 7,64 g L-Pyroglutamyl-L-histidinhydrazid, in einer Mischung aus 95 ml Dimethylsulfoxyd und 125 ml Dimethylformamid, wurde bei -20°C mit 104 ml 1,64 η HCl in Tetrahydrofuran versetzt. Zu dieser Lösung wurden 5 ml Isoamylnitrit gegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei -20°C gerührt, auf -30°C gekühlt und bei dieser Temperatur mit 23,7 ml Triäthylamin neutralisiert. 7,7 g L-Prolyl-ßalaninamid-hydrochlorid wurden in einer Mischung aus 20 ml Dimethylsulfoxyd und 15 ml Dimethylformamid gelöst, auf -10 C abgekühlt, mit 4,9 ml Triäthylamin neutralisiert und der vorher beschriebenen Reaktionsmischung zugesetzt. Das so erhaltene Gemisch wurde 1 Stunde bei -20 C gerührt, während 24 Stunden bei 4°C aufbewahrt und filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt, der Rückstanc in 350 ml Wasser aufgenommen und fünfmal mit je 70 ml Aethylacetat extrahiert. Die wässrige Phase wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Gegenstromverteilung im System 1-Butanol: Eisessig: Wasser (4:1:5) gereinigt. L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolyl-0-alaninamid-acetat wurde durch Konzentrieren der entsprechenden Fraktionen im Vakuum und anschliessende Lyophil,

säure).

Lyophilisation gewonnen. Ca] = -83,4° (c = 1, in in Essig-

f ί'Η 1 ? / ι η η 7

Wahlweise wurde der Rückstand der Aethylacetat-Extraktion in 20 ml Eisessig gelöst, mit 30 ml Essigsäureanhydrid versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur aufbewahrt. Dann wurde die Reaktionslösung mit 500 ml Wasser verdünnt und im Vakuum zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde noch dreimal mit je 50 ml Wasser aufgenommen und erneut zur Trockene verdampft. Der so erhaltene Rückstand wurde in 50 ml Wasser gelöst und an Amberlite CG-50 (H⁺-Form) chromatographiert. L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolyl-0-alaninamid wurde mit In Essigsäure eluiert. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert.

Papierelektrophorese: Puffer aus 2 ml Eisessig und 20 ml Pyridin, aufgefüllt mit Wasser auf 1 Liter (pH 6): Rf(Histidin) = 0,73 + 0,05. Puffer aus 37 ml Ameisensäure und 25 ml Eisessig, aufgefüllt mit Wasser auf 1 Liter (pH = 1,7): Rf(Histidin) = 0,43 + 0,05.

Beispiel 2

1,1 g Benzyloxycarbönyl-ß-alaninamid wurden in 25 ml Methanol unter Zusatz von Palladium/Kohle hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in 10 ml Dimethylformamid gelöst, auf 0⁰C gekühlt und mit 1,8 g L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolin, 0,6 g N-Hydroxysuccinimid und 1,1 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Die Reaktionsmischung wurde während 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, filtriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde an Kieselgel im System Chloroform:Methanol:Wasser (60:30:5) chromatographiert. Die dünnschichtchromatographisch einheitlichen Fraktionen wurden vereinigt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in 0,1 η Essigsäure gelöst und lyophilisiert. Man erhielt 1,8 g L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolyl-ßalaninamid-acetat. [a]_ = -81,2° (c = 1, in In Essigsäure).

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Beispiel 3

a) Benzyloxycarbonyl-ß-alaninamid

111,7 g Benzyloxycarbonyl-ß-alanin wurden in 1 Liter Dimethylformamid gelöst, auf -2O°C gekühlt, mit 70 ml Tr iäthylamin und 67 ml Chlorameisensäureisobutylester versetzt und während 3 Minuten bei -20 C gerührt. In diese Reaktionsmischung wurde trockenes Ammoniakgas eingeleitet bis der pH der Mischung auf 11 anstieg, wobei darauf geachtet wurde, dass die Temperatur -10⁰C nicht überstieg. Die Reaktionsmischung wurde noch weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, filtriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde aus Wasser umkristallisiert. Ausbeute: 91 g, Fp 162-165°C.

b) Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-ß-alaninamid

44,5 g Benzyloxycarbonyl-ß-alaninamid wurden in 250 ml Methanol unter Zusatz von Palladium/Kohle hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in 100 ml Dimethylformamid suspendiert und mit 74,2 g Benzyloxycarbonyl-L-prolin-pnitrophenylester versetzt. Die Reaktionsmischung wurde während 24 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt und im Vakuum eingeengt. Der feste Rückstand wurde aus Aethylacetat umkristallisiert. Ausbeute: 57,8 g, Fp 151-152°C, [cc]p⁵ = -51,7° (c = 1, Methanol).

c) Benzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-prolyl-ß-alaninamid

11,3 g Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-ß-alaninamid wurden in 200 ml Methanol gelöst und unter Zusatz von Palladium/Kohle hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in 100 ml Dimethyl-

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formamid gelöst. Eine Suspension von 10,7 g Benzyloxycarbonyl-L-histidinhydrazid in 150 ml Dimethylformamid wurde bei -20°C mit 58,7 ml 3 η HCl in Tetrahydrofuran versetzt. Zu dieser Lösung wurden 6,7 ml Isoamylnitrit gegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei -20 C gerührt, auf -30°C gekühlt und bei dieser Temperatur mit 24,6 ml Triäthylamin ^neutralisiert und mit der auf -20 C vorgekühlten, oben beschriebenen, Lösung von L-Prolyl-0-alaninamid versetzt. Das so erhaltene Gemisch wurde 1 Stunde bei -20 C gerührt und während 24 Stunden bei 4°C aufbewahrt und filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand an Kieselgel im System Chloroform:Methanol (4:1) chromatographiert. Die dünnschichtchromatographisch einheitlichen Fraktionen wurden vereinigt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde aus Aethanol/Aether kristallisiert. Ausbeute: 12,9 g_r Fp. 95-97°C. [cc]" = -40,8° (c-= 1, Methanol).

d) L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolyl-ß-alaninamid-acetat

1,0 g Benzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-prolyl-ß-alaninamid wurde in 50 ml Methanol gelöst und unter Zusatz von Palladium/ Kohle hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in 10 ml Dimethylformamid gelöst und mit 0,9 g L-Pyroglutaminsäurepenta-chlorphenylester versetzt. Die Reaktionsmischung wurde während 24 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in Wasser gelöst und an einer Dowex 2-Säule (OH-Form) chromatographiert. Die dünnschichtchromatographisch einheitlichen Fraktionen wurden vereinigt, mit Essigsäure angesäuert und lyophilisiert. Ausbeute: 0,8 g. [α] 25 ₌ __82f2° (c = 1, in In Essigsäure).

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Beispiel 4

a) Benzyloxycarbonyl-ß-alaninamid

111,7 g Benzyloxycarbonyl-13-alanin wurden in 1 Liter Dimethylformamid gelöst, auf -2O°C gekühlt, mit 70 ml Triäthylamin und 67 ml Chlorameisensäureisobutylester versetzt und während 3 Minuten bei -20°C gerührt. In diese Reaktionsmischung wurde trockenes Ammoniakgas eingeleitet bis der pH der Mischung auf 11 anstieg, wobei darauf geachtet wurde, dass die Temperatur -1O°C nicht überstieg. Die Reaktionsmischung wurde noch weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, filtriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde aus Wasser umkristallisiert. Ausbeute: 91 g, Fp 162-165°C.

b) Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-ß-alaninamid

44,5 g Benzyloxycarbonyl-ß-alaninamid wurden in 250 ml Methanol unter Zusatz von Palladium/Kohle hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in 100 ml Dimethylformamid suspendiert und mit 14,2 g Benzyloxycarbonyl-L-prolin-p-nitrophenylester versetzt. Die Reaktionsmischung wurde während Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt und im Vakuum eingeengt. Der feste Rückstand wurde aus Aethylacetat umkristalli siert. Ausbeute: 57,8 g, Fp 151-152°C,[a]^⁵ = -51,7° (c = 1, Methanol).

c) Benzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-prolyl-ß-alaninamid

11,3 g Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-j3~alaninamid wurden in 200 ml Methanol gelöst und unter Zusatz von Palladium/ Kohle hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in 100 ml Dimethylformamid gelöst. Eine Suspension von 10,7 g Benzyloxy-

BOR8 1? / 1 HO 7

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carbonyl-L-histidinhydrazid in 150 ml Dimethylformamid wurde bei -20°C mit 58,7 ml 3 η HCl in Tetrahydrofuran versetzt. Zu dieser Lösung wurden 6,7 ml Isoamylnitrit gegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei -20°C gerührt, auf -30⁰C gekühlt und bei dieser Temperatur mit 24,6 ml Triäthylamin neutralisiert und mit der auf -20°C vorgekühlten, oben beschriebenen, Lösung von L-Prolyl-ß-alaninamid versetzt. Das so erhaltene Gemisch wurde 1 Stunde bei -20°C gerührt, während 24 Stunden bei 4°C aufbewahrt und filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand an Kieselgel im System Chloroform:Methanol (4:1) chromatographiert. Die dünnschichtchromatographisch einheitlichen Fraktionen wurden vereinigt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde aus Ae,thanol/Aether kristallisiert.

Ausbeute: 12,9 g, Fp 95-97°C. Ca]^⁵= -40,8° (c = 1, Methanol).

d) Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolylß-alaninamid-hemiacetat

1,0 g Benzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-pyrolyl-ß-alaninamid wurde in 50 ml Methanol gelöst und unter Zusatz von Palladium/Kohle hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in 10 ml Dimethylformamid gelöst, auf O⁰C gekühlt und mit 1 g Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutaminsäure-p-nitrophenylester versetzt. Die ReaktIonslösung wurde während 24 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in einem Gemisch von Chloroform:Methanol Eisessig (95:5:3) gelöst und auf eine Kieselgelsäule gegeben. Zunächst wurde die Säule mit diesem Gemisch nachgewaschen, dann wurde das gewünschte Peptid mit dem System Chloroform: Methanol:Wasser (60:30:5) eluiert. Die dünnschichtchromatographisch einheitlichen Fraktionen wurden vereinigt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in 50 ml Wasser gelöst und lyophilisier
1 η Essigsäure).

und lyophilisiert. Ausbeute: 0,9 g, [al_D = -11,0° (c = 1,

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e) L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolyl-ß-alaninamid-acetat

100 mg Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolyl-ß-alaninamid-hemiacetat wurden in 20 ml 0,5 η Essigsäure gelöst und unter Zusatz von Palladium/Kohle hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat lyophilisiert. Ausbeute: 80 mg. Ca]^S ₌ _₈2,5° (c = 1, in In Essigsäure) .

Beispiel 5
a) Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-ß-alanin-methylester

24,9 g Benzyloxycarbonyl-L-prolin wurden in 200 ml Dimethylformamid gelöst, auf -20°C gekühlt und mit 11,1 ml N-Methylmorpholin und 13,0 ml Chlorameisensäureisobutylester versetzt. Die Suspension wurde noch 2 Minuten bei -20°C gerührt und mit einer auf -20°C vorgekühlten Suspension, hergestellt aus 14,0 g /3-Alanin-methylester-hydrochlorid und 11,1 ml N-Mehylmorpholin in 100 ml Dimethylformamid, versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 30 Minuten unterhalb -10°C und weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, filtriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der ölige Rückstand wurde in 1,2 Liter Aethylacetat gelöst und je dreimal mit 1 η HCl, Wasser, 10%iger Na₂CO₃~Lösung und gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und über Na»S0. getrocknet. Die organische Phase wurde im Vakuum eingeengt und der ölige Rückstand aus Aethylacetat/Hexan kristallisiert. Ausbeute: 22,8 g, Fp 55°C, Ca]^⁵ = -50,7° (c = 1, Methanol).

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b) L-Pyroglutamyl-L-histidy1-L-prolyl-ß-alanin-methylesteracetat

10,Og Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-ß-alanin-methylester wurden in 50 ml Methanol gelöst und unter Zusatz von Palladium/Kohle hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der als Rückstand resultierende L-Prolyl-j3-alanin-methylester wurde in 20 ml Dimethylformamid gelöst und mit L-Pyroglutamyl-L-histidinazid [hergestellt aus 8,4 g L-Pyroglutamyl-L-histidinhydrazid] umgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde bei -20°C gerührt, während 24 Stunden bei 4°C aufbewahrt und filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt, der Rückstand in 250 ml Wasser aufgenommen und fünfmal mit je 100 ml Aethylacetat extrahiert. Die wässrige Phase wurde über eine Dowex 5OW (Η-Form) Säule (3 χ 35 cm) gegeben; es wurde mit 1 Liter Wasser nachgewaschen, und die Substanz mit einem Puffer bestehend aus Pyridin:Eisessig: Wasser (15Oi2O:33O) eluiert. Die substanzenthaltenden Fraktionen wurden mit Wasser verdünnt, mit Essigsäure auf pH 5 gestellt, im Vakuum konzentriert, anschliessend erneut mit Wasser verdünnt und lyophilisiert. Das Lyophilisat wurde an Kieselgel im System Chloroform!Methanol: Wasser (60:30:5) chromatographiert. Die dünnschichtchromatographisch einheitlichen Fraktionen wurden vereinigt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in 200 ml Wasser gelöst und lyophilisiert. Ausbeute: 8,7 g, [a]^⁵ = -82,8° (c =1, In Essigsäure).

c) L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolyl-ß-alaninamid

1,0 g L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolyl-0-alaninmethylester-acetat wurde in 100 ml Methanol gelöst. Diese Lösung wurde bei 0 C mit Ammoniak gesättigt, gasdicht ver-

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schlossen und während 3 Tagen bei Raumtemperatur aufbewahrt. Die Lösung wurde im Vakuum eingeengt, der Rückstand in 50 ml Wasser gelöst und lyophilisiert. Ausbeute: 900 mg. [α]ρ⁵ = -94,9° (c = 1, In Essigsäure).

9 3 12/1

Beispiel 6

Es wurden in üblicher Weise Tabletten mit Bruchrille und folgender Zusammensetzung hergestellt:

L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolyl-0-alaninamid-acetat 22,77 mg

Maisstärke 80,00 mg

Milchzucker 67,23 mg

Gefällte Kieselsäure 20,00 mg

Polyvinylpyrrolidon 6,00 mg

Talk 3,60 mg

Magnesiumstearat 0,40 mg

200,00 mg Beispiel 7

Es wurden in üblicher Weise Ampullenlösungen folgender Zusammensetzung hergestellt:

a) L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolylß-alaninamid-acetat 0,227 mg

Mannit 0,1 g

Wasser zu Injektionszwecken ad 2,0 ml

b) L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolyl-(3-alaninamid-acetat 0,569 mg

Mannit 0,1 g

Wasser zu Injektionszwecken ad 2,0 ml

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Claims

Patentansprüche

1.)Verfahren zur Herstellung eines Tetrapeptidamides der Formel

pGlu—His—Pro—NH—CH_—CH-—CO—NH_ I

worin alle Aminosäuren mit einem Asymmetriezentrum L-Konfiguration aufweisen,

sowie von Säureadditionssalzen hiervon, dadurch gekennzeichnet,

dass man

a) das Dipeptid der Formel

Pro—-NH—CH₂—CH₃—CO—NH₃ II

mit einem Dipeptid der allgemeinen Formel

pGlu—His—R₁ III

worin R, Hydroxy oder einen die Carboxylgruppe aktivierenden Rest darstellt, umsetzt oder, dass man

b) ein Tripeptid der allgemeinen Formel

pGlu—His—Pro—R₁ IV

worin R.. die obige Bedeutung hat, mit dem Amid der Formel

CH₂ CH₂ CO—NH₂ V

umsetzt oder, dass man

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c) das Tripeptid der Formel

His—Pro—NH—CH₃—CH₃—CO—NH₃ VI

pGlu—R₁ VII

worin R₁ die obige Bedeutung hat, umsetzt oder, dass man

d) von einem Tetrapeptid der allgemeinen Formel

R₂—pGlu—His (R₃)—Pro—NH—CH₃—CH₃—CO—NH—R₄ VIII

worin R Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe, R₃ Wasserstoff oder eine die Imidazolfunktion schützende Gruppe und R. Wasserstoff oder eine Amidschutzgruppe darstellen, wobei wenigstens einer der Reste R„, R und R. von Wasserstoff verschieden ist,
die Schutzgruppe(n) abspaltet oder, dass man

e) ein Tetrapeptid der allgemeinen Formel pGlu—His—Pro—NH—CH₃—CH₃—COX IX

worin X Hydroxy, einen die Carboxylgruppe aktivierenden Rest oder den Rest -OR₅ darstellt, worin R_ niederes Alkyl, Aryl, Aryl-niederes Alkyl oder den Rest eines polymeren Trägermaterials bedeutet, amidiert oder, dass man

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f) in einem Tetrapeptid der allgemeinen Formel R_c—His—Pro—NH CH- CH_—COY X

worin R_fi den gegebenenfalls geschützten Glutamin- oder Glutaminsäurerest, Y einen die Carboxylgruppe aktivierenden Res.t, den Rest -NHR,, worin R. die obige Bedeutung hat, oder den Rest -OR₅, worin R₅ die obige Bedeutung hat, darstellen,

unter gleichzeitiger oder vorhergehender Abspaltung gegebenenfalls vorhandener Schutzgruppen den Pyroglutaminring schliesst und dass man, gewünschtenfalls, eine erhaltene Verbindung der Formel I in ein Säureadditionssalz überführt, wobei in den Formeln II bis X alle Aminosäuren mit einem Asymmetriezentrum L-Konfiguration aufweisen.

fc Γ H H 1 2 / 1 Π Π 7

2. Verfahren zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten, dadurch gekennzeichnet, dass man die Verbindung der Formel

pGlu—HiS—Pro—NH—CH₂—CH₂—CO—NH₂ I

worin alle Aminosäuren mit einem Asymmetriezentrum L-Konfiguration aufweisen,

oder ein pharmazeutisch verwendbares Säureadditionssalz hiervon, als wirksamen Bestandteil mit zur therapeutischen Verabreichung geeigneten, nicht-toxischen, inerten, an sich in solchen Präparaten üblichen, festen oder flüssigen Trägern und/oder Excipientien vermischt.

B 0 9 8 1 2 / 1 0 0 7

3. Pharmazeutisches Präparat, dadurch gekennzeichnet, dass es die Verbindung der Formel

pGlu—His—Pro—NH—CH₂—CH₃—CO—NH₃ I

worin alle Aminosäuren mit einem Asymmetriezentrum L-Konfiguration aufweisen,

oder ein pharmazeutisch verwendbares Säureadditionssalz hiervon, sowie ein pharmazeutisches Trägermaterial enthält.

4. L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolyl-ß-alaninamid und dessen Säureadditionssalze.

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