DE1418599A1 - Verfahren zum voruebergehenden Schutz von Aminogruppen in Aminocarbonsaeuren und ihren Derivaten - Google Patents

Description

Homburg 3 ö

CIBA AKTIENGESELLSCHAFT, BASEL (SCHWEIZ)

Dr. Expl.

Case 4351/1-3 Itefnbura 36, den ι K Allfi

Deutschland

Verfsferen zum vorübergehenden Schuts von Aminogruppen in MXnvcarbonsäureri und ihren Derivaten.

Gagenet and der vorliogsztclen Erfindung ist ©in Verfahren aum Yorüb ergehend en Schutz der Aaiinogruppe des Amino-

In a-CAminoall^lJ-araminoeeßigsäurön und ihren tf.n mittels* des tQrti-Butyloxycarbonyli-eßteö. a~(Amin.oaikyl)«a-aminoeBßigsät)reii Bind bei£3pielavieiB9 α,γ-Diamino» " Ornithin, Hydroxy lysin lind vor aXlemi Lyain.

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BAOORfGlNAL

UI859-9 ■

Als Derivate der genannten ά-( Aminoalkyl )-a-aminoessigsäuren kommen solche der Säuregruppe, der a-Aminogruppe oder beider Gruppen in Betracht. So kann die Säuregruppe verestert, oder in form eines Anhydrids, Hydrazide oder Azide vorliegen oder, wie im .Tall von Peptiden, als Säureamidgruppierung vorhanden sein. Die a-Aminogruppe kann z.B. durch eine der in der ieptidchemie üblichen Schutzgruppen, vor allem solcher, die durch Hydrogenolyse entfernbar sind, wie die Carbobenzoxygruppe (im folgenden mit"Z abgekürzt), die p-(Phenylazo)-benzyloxy-earbonylgruppe (PZ) oder die p-ip'-MethoxyphenylazoJ-benzyl·= oxy-carbonylgruppe (MZ) blockiert sein, Die a-Aminogmppe kann aber auch Teil einer üäireamidgruppe, wie in einem Peptid, sein.

Viele biologisch wichtige Polypeptide enthalten Keste von a-Aminoallcyl-a-aminoeesigsäuren, vor allem von Lysin, so aum Beispiel Lysin-Vaso pressin, die Melanophoren stimulierenden Hormone, Corticotropin und Insulin. Daher sind Methoden, welche die Synthese von Peptiden ermöglichen, die Reste von a-Aminoalkyl-a-aminoesslgsäuren, besonders Lysin, enthalten, von grosser Bedeutung.

Der Erfolg einer derartigen Synthese hängt weitgehend von der Wahl geeigneter Schutzgruppen zur Blockierung der nicht α-ständigen Aminogruppen dieser Aminosäuren, z.B. der £-Aminogruppe des Lysins, ab.

Die bisher verwendeten, in der Peptidchemie üblichen Schutzgruppen lassen ei^h in manchen Fällen nicht ohne Ver-

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änderung dee Moleküls abspalten, wodurch ihre Anwendbarkeit nachteilig eingeschränkt ist» teils stehen sie einer selektiven Abspaltung gleichzeitig vorhandener Schutzgruppen, sei es einer Amino- oder Carboxylgruppe im Wege.

Die Carbobenzoxygruppe oder entsprechende Gruppen, z.B. die p-(Phenylazo)-benzyloxy-carbony!gruppe oder die p-(p'-Methoxyphenylato)-bennyloxy-carbony!gruppe haben in gewissen Peptidsynthesen den Kachteil, dass sie sowohl reduktiv als auch hydrolytisch abspaltbar sind und daher einer selektiven Freisetzung der a-Aminogruppe, welche mit auf die gleiche Art abepaltbaren Bohutzgruppen blockiert ist, im Wege stehen. Weiter versagt von den gebräuchlichen Methoden zur Abspaltung dieser Gruppen die kataiytlsche Hydrierung bei schwele!haltigen Peptiden. Abspaltung mit Halogenwasserstoff in organischen Lösungsmitteln kann vielfach nicht angewendet werden, weil das dabei gebildete Benzy!halogenid benzylierend wirkt (zum Beispiel wird das 8-Atom im Methionin benzyllert). Die Reduktion mit HatriuB in flüssigem Ammoniak echliesslich wird von vielen störenden Hebenreaktionen begleitet. Ferner 1st auch die selektive hydrogenolytische Freisetzung vorhandener Benzylestergrup^en bei Vorhandensein solcher Carbobenzoxyreste unmöglich.

Die Tritylgruppe kann zwar durch milde saure Hydrolyse entfernt werden, sie wird aber auch durch katalytische Hydrierung angegriffen. Deshalb ist auch hler die Verwendung von hydrogenolytisch abspaltbaren Gruppen, wie Z, PZ oder MZ, an

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der α-Aminogruppe nicht mehr möglich, wenn die andere Aminogruppe durch Tritylierung blockiert iste

Der Jrifluoracetylrest endlich wird zwar durch Alkali unter relativ milden Bedingungen abgespalten. Dabei werden aber auch durch Veresterung geschützte Carboxylgruppen angegriffen; auch der Trifluoracetylrest lässt sich somit nicht allgemein verwenden.

Es wurde nun gefunden, dass der tert.-Butyloxycarbonylrest in vortrefflicher Weise allgemein und ohne die genannten Machteile zum Schutz der Aminogruppe des Aminoalkylrestes in α-Aminoalkyl-a-äminoessigsäuren und ihren Derivatengeeignet 1st. Die t-Butyloxycarbonylgruppe wird durch katalytisehe Hydrierung nicht angegriffen; sie erlaubt daher die Verwendung von hydrogenolytisch abspaltbaren Resten, wie Z₁ PZ, HZ, Irityl und ähnlichen zum selektiven Schutz und Freisetzen der α-Aminogruppen und lässt sich darüber hinaus durch äusserst milde saure Hydrolyse entfernen, ohne dass dabei vorhandene Estergruppen entfernt oder sonstige störende Nebenreaktionen eintreten würden. Anderseits lässt sich eine Estergruppe durch alkalische Verseifung leicht abspalten, ohne dass die tert„-Butyloxy-carbonylgruppe entfernt wird.

Die Verfahrensprodukte,a-(tert.-Butyloxycarbonylamino)-a-aminoesBigsäuren und ihre Derivate, sind neu. Sie stellen wertvolle Zwischenprodukte in der Jfeptidsyntheee dar. Dabei kann man z.B. so vorgehen, dass man in oc-(tert.-Butyl-

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oxycarbony1-aminoalkyl)-a-aminoesBigsäuren, z.B. in N^- terto-Eutyloxyearbonyl-lysin, die a-Aminogruppe in bekannter Weise mittels eines durch Hydrierung abspaltbaren Restes, z.B. Z, PZ oder MZ,schützt und die freie Carboxylgruppe, gegebenenfalls nach Ueberführung in ein reaktionsfähiges Derivat zur Bildung einer neuen Peptidbindung heranzieht,, Hydrogenolytische Abspaltung der Schutzgruppe in α-Stellung liefert dann ein Derivat mit freier Aminogruppen welches zur weitern Peptidsynthese geeignet ist. Zum Schluss der Synthese kann die t-Butyloxycarbonylgruppe durch milde saure Hydrolyse, ζ.B₃ durch Salzsäuregas in organischen Lösungsmitteln oder durch verdünnte, wässrige Mineralsäure abgespalten werden.

Man kann aber auch, wenn Peptide hergestellt werden sollen, in denen die Verknüpfung nicht über die a-Aminogruppe sondern über die andere Aminogruppe erfolgt, zunächst die aiuainogruppe, wie angegeben, blockieren, dann den terto-Butylosycarbonylrest durch milde, saure Hydrolyse selektiv entfernen und die freie Aminogruppe zur Bildung einer neuen Peptidbindung benützen. Zum Schluss wird die Schutzgruppe an der a-Aininogruppe nach bekannten Methoden entfernt.

In Peptidestern mit einer terte-Butyloxycarbonylaminogruppe und einer hydrogenolytisöh abspaltbaren Schutzgruppe an der a-Aminogruppe kann man die Carboxylgruppe durch alkalische Verseifung freisetzen und sie, gegebenenfalls nach ueberführung in ein reaktionsfähiges derivat, zur Bildung einer weiteren Peptidbindung heranziehen.

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Beispielsweise kann nach dem erfindungsgemässen Verfahren das Dipeptid-L-lysyl-L-lysin nach folgendem Schema hergestellt werden, wobei gleichzeitig für die weitere Peptidsynthese brauchbare Derivate als Zwischenprodukte erhalten werden:

H-	, Lye
	BOC
H-	iys ]

-OH

-OH

BOC

PZ-

PZ-

Ly ι

s -OH

BOC

iys

BOC

H-

T-

iys

3OC

uys

BOC iys

Iys

H-

H-

Lys j-OH

3OC

s -OH

BOC

Z-[ tys

BOC

-OH

-OCH.

H-I Lys J-OCH^

BOC

BOC

tys

Iys

BOC

•ys

BOC tys

Lys

-OCH,

-OCH-

-OCH₃

-OH

-OH

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mm j «·

BOC bedoutat den tert.-Butyloxycarbonylrest, T den TrItyl-(Tri phenylethyl)-rest.

Der Pentaps pt icliöGt l-Lysyl-L-lyeyl-L-arginyl-L-arginyl-Ii-prolyl, eine Teiieequensi der adrenocorticotropen Hormone, kann nach folgendem Schema erhalten werden:

BOC BOC ^

H-|irg"-0H

HO«

I 2

!A!

H*—"1 Τ"» 1

T-}Arg]-OH T-j Arg I-OH

KO,

T- Arg

H-! Pro]-OH H-IPro

-OC₄H₉

Pro

BOC 300

C-fiys tye

H-j Ly a Ly s

lys

Ϊ0,.

rg

wo«

NO,

Arg

NO,

Arg

Arg

SJ: Arg

rg

Arg

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Pro

-OC₄H

₄H₉

Pro

Pro

-OC₄H₉

-OC₄H₉

Pro j-

Pro -OH

Proj-OH

SAD

H18599

Eine weitere Teilsequenz des ACTH, das L-Lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycin_r kann beispielsweise nach folgendem Schema hergestellt werden:

PZ-

IyJT]-OH Z-[~PrcTj-OR &»]" VaI tfly

H-f VaI QIy

-OC

-OCL

Z-

Pro

YaI Sly J

H-] Pro

VaI Sly

OC

Pro

raj.

BOC

Die Kinfüiirung der tort. ButyloXyoftrbonylirupp* ge-

.- -' ßchieht vorteilhaft durch Acylienlng ahii

vorzugaweiae eines Kupferkoaplexee, der ifrtitn AminoBäure, oder durch AcylierunJ solcher Derivate, ifi denen die α-Aminogrufjpe geschützt oder in einer Peptidbindung vorliegt. Zur

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ÖAD ORlGJNAL

Acylierung nimmt man zweckmässig reaktionsfähige Säurederivate des Kohlensäure-tert.-butylhalbesters, wie das Chlorid, Cyanid, Anhydrid oder einen aktivierten Phenyleeter. Es wurde gefunden, dass die Acylierung besondere vorteilhaft mit dem Azid durchgeführt wird. Unerwarteterwelse wurde festgestellt, dass die Acylierung besonders gut verläuft, wenn man den Kupferkomplex der Säure in wässriger Lösung mit dem Azid zur Reaktion bringt. Der Kupferkomplex lässt sich daraufhin in üblicher Weise zersetzen«

Zn den erhaltenen tert.-Butyloxyearbonyl-Verbindungen können freie a-Aminogruppen oder Carboxylgruppen in üblicher Weise abgewandelt oder funktionell abgewandelte a-Aminogruppon oder Carboxylgruppen auf beliebiger Stufe freigesetzt werden.

So kann man die α-Aminogruppen acylieren, z.B. durch die oben genannten hydrogenolytiach abspaltbaren Sciftitzgruppan oder die Reste weiterer Aminosäuren oder Peptid© substituieren, Freie Oarboiieäuregruppen können ebenfalls geschützt, z.B. verestert werden, insbesondere mittels niederer Alkanole, wie Methanol, Aethanol, Prcpanol, Butanol, oder in reaktionsfähige Derivats, wie reaktive üoter, Anhydride, oder Aside übergeführt oder in Amidgruppen, s*B. solche von Aminosäuren oder Peptiden umgewandelt werden.

Weiter lassen sich es,B. auf beliebiger Stufe die genannten üchutzgruppsn der a-Aminogrupps durch Hydrogenolyse abspalten und/oder Betergruppen unter Beibohaltung der tert.-Butyloxycarbonyl-tächutsgruppe hydrolysieren.

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141859a - ίο -

Die genannten Reaktionen werden in üblicher bei tiefer, gewöhnlicher oder erhöhter Temperatur, in An- oder Abwesenheit von Verdünnungs- und/oder Kondensationsmitteln oder Katalysatoren, im offenen oder geschlossenen Gefäes unter Druck durchgeführt.

Die Erfindung betrifft auch diejenigen Ausführung»» formen des /erfahrene, bei denen nan auf irgendeiner utuf· als Zwischenprodukte erhältlich· Verbindungen ale Ausgangsatoff· ▼erwendet und die fehlenden Verfahrenusohritt© durchführt, oder das Verfahren auf irgendeiner Stufe abbricht.

Je nach der Arbeitsweise erhält man Verbindungen mit freien .!Imino- und/oder Carboxylgruppen in Form ihrer Salze mit Satiren und/oder Basen. Diese lassen sich in Üblicher Weise ineinander überführen.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen näher beschrieben» A*ie Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben»

BAD ORIGINAL

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Beispiel Ij

a) Kupferfco&plexi 15 g L-iiysin-monohyärochlorid »erden in 150 cnr Wasser gelöst, 15 g basisches Kupfcroarbonat sugegeben und das Reaktionsgemisch 1 Stunde lang zum Sieden erhitzt. Hierauf wird vom ungelösten Kupferkarbonat abgenutscht und mit etwas tfasser nachge^aschenc Nach Abkühlen wird die tiefblaue Kupfer-Lysin*Lösung (Volumen 180 cnr) alt 5 »4 g Magoeeiuffioxyd und einer'Lösung von 20,8 g t-Butyloxy-aaidoformat in 260 smr Methanol versetzt und unter inteneirera Rühr«n 18 Stunden bei 45° gehalten. Dabei scheidet sich der Kupferkomplex dee & ~tert»-Butyloxycarbo« nyl-L-lyeina ale hellblauer Hiederschlag ab. Des Reaktionagemiech wird eur Entfernung dee überschüssigen Magnooiuaoxyda unter EiekÜhlung mit 200 ca⁵ eiskalter 2-n. Eoetgeäurelöeung versetzt und 1 Stunde bei 5° gerührt. Bann wird 4aö hellblaue H^-tert^-Butyloxyeiirbon^yl-Ii-lysin-Kupfer abgenutöoht, gründlich mit Wuaeer und Methanol gewaeohon und g·trocknet. Auabtute 14 g (62 ^C)₁ f. oa. 220 - 240° (Zer-

b) fj^iet Jl^ te:rt»~Btt$yXt^0ajrfc0^^ au· KupferltoÄplext Der unter a) erhaltene Kupfericomplex von N^-tert.-^^tyioxycaibonyl-li-lyein (14 g) *ix?d euependiert in 3100 cm* Wasser und 50 cm⁵ 2-nο AßnoniaklöBung sugegeben, wotjei teilweiee Lösung eintritt* Bann wird unter intensivem Rühren ein kräftiger Schwefelwasserstoffstrom eingeleitet (während ca« 5 Stunden)* Hierauf wird das ausgefallene eulfid durch ein Koiaefliter ebgenutscht» dan klare filtrat

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~ 12 - *

unter Eiskühlung nit 75 cnr 2-n. Eaeigsäure versetzt und solange Luft durohgeleitet, bis der Geruoh nach Sohwefel-WRsaerstaff verschwunden iat«, Die Lösung wird bei 40° am Vakuum eingeengt, wobei eich ein erster Anteil H^-tert·- Butyloxyoarbonyl-L-lyein in mikrokristalliner Form absobeidtt. Durch wiederholtes Einengen der Mutterlauge werden inegt· eent 11,5 g rolle β H^-tert.-Butyloxyoarbonyl-L-l.yein rom I. 235 - 255° erhalten (92 Ji d.Theorie). Zur weitern Reinigung kann dae Rohprodukt aus Waeaer unkrietallisiert werden, F. 245 - 251°.

Das Produkt ist in den gebräuchlichen organieehen Lösungsmitteln schwer löslich| etwas löslich in Wasser, leicht löelich in verdünnten ilkalien. In verdünnter Salzsäure lb*·- lioh unter Ga»«ntwloklung (Zereetrung» rgl. unten).

Bei PtpierchroDatographi» ia System t-Butanola-Butanol-Waeeer (4Oi50i3O) 2y Wert · O,75| Ul 8yste» eeo«-Butanol-Iaopropanol-Monoohlore aeignäure-Waeeer (7OtIOi3*40) fiy-fert * 0,80.

Die tert.-Butyloxyoarbonyl-gruppe kann nach bekannt ea Methoden durch Halogenwasserstoff in organieoa^n liSaungaaitteln oder vorteilhaft in rerdünnter, wäeeriger Säure abgespalten werden. Eine Probe N^-tert.-Butyloxycarbonyl-Xflyein corset st sich beim Auflösen in 2-n. SaIi-Bäuro unter (>uaentwioklung bei Ziamerteaperatur. laoh 30 Minuten ist papierohrotaatogr^phisoh nur noch Lysin, kein Au9gaagsmater,ial

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!SAD

Beispiel 21

^-butyloxyoarbopyl-Ir-lyain *

2,46 g dta in Belapiel 1 erhalteneη, rohen S^- terte-Butyloxycarbony1-L-Iysine werden unter Biekühlung gelöst in 5»5 onr 2-n· Natronlauge und dann unter Rühren innerhalb von 30 Minuten gleichzeitig 6,0 onr 2-n. natronlauge sowie eine Lösung von 1,90 g Carbobenzoxychlorid in 3 oar Toluol eingetropft. Das Reaktionegeiaisch wird weitere 2 Stunden bei 5 - 10° gerührt und sodann .die Toluolphaae abgetrennt. Die wäsarlge Lösung wird mit etwas Aether nachgewaeohen und unter Slakühlung durch Zugabe von 10 J( Citronensäuxelöeung auf p^ « 2 gebracht> Das auegeaohiedene OeI wird in Aether aufgenommen, die Aetherlösung mit etwas Wasser gewaeohen und mit Natriunaulfat getrocknet· Eindampfen der Loading gibt jr^a«Oarboben»yloxy-N «t©rt«-butylo%yoarboayl· L-lyein äla 0©l_? das ohne Reinigung waiter wmgesetst werden kanne

Beispiel 31

a)

Xp-'lysin-methyleeteri 0_f88 g des in Beispisl 2 erhalt«ao& jßohi>Ä"odiiktt3 werden in 30 vet Aether gelöst \mä 5 ©21 ö» I?iaac-me-fch«n in Aethsr swgegeben* Die gelbe 'äöeuag wird

909847MOS2" bad original

15 Minuten bei Raumtemperatur belassen· Nach Entfernen dee überschüssigen Diazomethane im Vakuum wird die Aetherlösung mit Natriumbikarbonat lösung und V/aaaor gewaschen _t mit Natriumsulfatlöaung getrocknet und eingedampft· Der ölige Rückstand wird rar weitern Reinigung an dtr 50 faohen lfengo Silikagtl ("Davison", Mesh 200) ohromatographlert· Die alt Btnsoli Chlorofora-öeaisehen (Ii4) aluierten Anteile geben den analysenreinen ^-CarbobenByloxy-B^-tort.-butyloiyoarbonyl-L-lysin-methy!ester ale OeI·

b) N^-terto-Butyloxycarbonyl-L-'lyein-methylesteri 265 ng dea unter a) erhaltenen, chromatoßraphisch gereinigten Produkts «erden in 20 cm' Methanol gelöst und in Gegenwart von Palladiuokohle (10^ Fd) hydriert (das entstehend· COg wird· durch Aeteoatron gebunden)» Nach Aufnähme τοη etwas aehr als der berechneten Menge Wasserstoff komnfcdie Hydrierung frua Stillstand· Abnutüchen dee Katalysators und Eindampfen des Filtrate gibt H^-tert.-Butyloxyoarbonyl-Irlysin-methylester ale Oel« Das Rohprodukt ist für weitere Uffisetsungen genügend rein. £β kann auch sur Charakterisierung in das jScristalllna Hydroohlorid übergeführt Werdens Eine Probe des öligen Estera wird in wenig Methanol gelöst, die Lösung auf -15⁰ gekühlt und mit der genau berechneten Menge Salzsäure in Methanol versetst. Sindempfen der Lösung gibt Jcriatftllinea N^-t®rt ·-Butyloxycarbonyl-L-lysin-iaethy!ester ricU Nach Zerreiben nit Aether lt_t (13Ö³) 135-140V

BAD ORJGiMAL

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Umkristaliisation aus Methanol-Aether gibt analyßenreines Material vom Ϊ. 148-151° (Nadeln).

Beispiel 4s

oarboavl-Ii-lyain«

2,46 g'des in Beispiel 1 erhaltenen Rohprodukte werden fein pulverisiert, dann suspendiert in 30 enr Wasser, 1,00 g Magensiumoxyd zugegeben und das Gemisch 1 Stunde bei 5^e gerührt. Hierauf werden 30 cn Dioxan zugefügt und eine !lösung von 3,30 g p-Pheaylazo-banzyl-kohlensäurechlorid in 30 cm Bioxan unter intensivem HÜhren im Verlauf von 30 Minuten zugetropft. Das Heaktionsgemlsoh wird über Naoht bei Zimmertemperatur intensiv gerührt, sodann 200 onr Waostr «ugegttoen und das Dloxan durch Einengen am Vakuum entfernt, wobei viel amorphes, oran&s-rotee liaterinl auafällt (Geaieoh von p-Ihenyla2o-benzylalkohol und den MagnesiuMsale des

carbonyl-L-lyein· · Mach Zugabe ron viel Essigeeter und Kühlen auf 5* wird die nfcgerlg* Phae· mit eiskalter, 10 + Citroneneäur·lösung auf P_n « Z gebracht, wobei sieh nach ÜMChüfcteln da· geeaate gefärbte Material i» Eaaigeetor löst· Pie Reaig»sterlöeung wird hierauf mit< "etwas Waeaer und dann so viel «al mit verdünnter Ammoniumhydrorydlöeung gewaschen» bis diese nur noch schwach gelb gefärbt ist«

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BAD

1418-593

~ 16 -

(Die organische Phase ist Immer noch stark orange-rot gefärbt und gibt beim Eindampfen 1,5 g rohen p-Phenylasobenzy!alkohol)ι·

Die stark orange-gelb gefärbten Aomoniuiahydroxyd-ftueRüg« verden Tereinigt, mit TieI Aether über-Eohiohtet und unter Kühlen auf 5° mit 10 i Oltrmttneinr·· lueung auf p_H « 2 gebracht. Daß dabei auegefallen·, gelbe OeI wird in Aether aufgenommen, die Aetherlöeung unter Eiekühlung mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampfte Der Rückstand (3,0 g 'oranges Uarx) wird eur «eitern Reinigung an der 50 fachen Menge Silikagel ohrooatographiert· Die mit Chloroform elulerten Anteile geben aus Aether-Fetrolütber krietallielertea K^a-(p-Biienylaio -benayloxyoarbony^Ii^-tert.-Butyloxyoarbonyl-L-lyiin in orange-gelben Mädeln, '· 102 - 104*« Umkrletallisatlon aus Asetcm-Aetb«? gibt analyeeuroinee Materiel tob ». 105 - 106·.

Die Subatane iet löelich in den meieten ergmnleohe& Löuungemittelß, schwer löelich in Wasser und Petroläther_e löslich in TerdUnnten Alkallen«

SAD ORiGiMAi.

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- 17 ~
Beispiel 5: .

Η^α-( p-Phenylago-bensyloxycarbonyl)-N ^«-tert. -buty lox.ycarbonyl-

Bins Lösung von 5,19 g N^-terto-ButylOxycarbonyl-L--lysin-taethyleöter und 9,70 g N^a-(p-Phetiylazo-bensyloxycarbonyl}-N^-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin in 120 cnf* Acetonitril wird auf -15° geküiilt und 4,35 (c Dicyclohexylcarbodiimld zugegeben. Nach kurzer Zeit ist die Reaktionsmae.se gallertig erstarrt. Bach 30 Minuten bei -15° und 2 Tagen bei 2° wird mit vjLel BsBigeater versetzt, wobei das orange,gallerfeige Material in Lösung geht raid der Dicyclohexyiliarnstoff -ungelöst zurückbleibt. Ar wird abganutecht (4,14 g« Smp. 224 - 226°) und daa filtrat loiter Eüttlung mit Ms, mit 5% Zitronensäurelösung» Wasser, Hatriui&bikarbonat-Iiösung und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingodarapft. Dar Rückstand (16,3 g) wird mit 100 cn³ Aether durchgerieben, wobei er kristallisiert. Ss werden 10,9 g Dipeptid-derlvat vom Smp. (111°) 119 ~ 127° erhalten. Die Kristalle enthalten noch etwas JDicyclohexylhamstoff. Zu dessen Abtrennung wird Kit wenig Aceton versetzt, wobei 175 ag Harnstoff ungelöst bleiben» Hach Abnutsehen wird das Piltrat mit viel Aether versetzt, wobei 9,14 g reines Bipeptidderivat in iiedela^ Sap. 124 - 128° erhalten werden; UjJ⁶'. - -2,0° + 0,8° (c 9 1,00 in Methanol).

Aus den Mutterlaugen werden durch Adsorption an SiIifcagel ("Bavison", Mesh 200 , mit Znsatz von ID^ Wasser) und

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BAD ORIGUMAL

U18599

Elution mit Benaol-Chloroform-Gemischen (1:4) noch 300 mg reines Dipeptidderivat erhalten_o

Beispiel 6:

N^-tert > -But ylo:tycarboiayl«»L--lyeyl--Nk--tert. -butyloxycarbonyl-Ii-ly sin-me tt y lest er „

1/29 g des in Beispiel 5 erhaltenen Produkts werden

3 3

in 80 ora Methanol gelöst, 3 cm 1-n. wässrige ßssigsäurelösung augegeben urd in Gegenwart von Palladiumkohle (10$ Pd) hydriert {das entstehende Kohlendioxyd wird in einem zweiten, mit Natronlauge gefüllten Hydriergefäss aufgefangen). Nach Aufnahme der berechneten Menge Wasserstoff kommt die Hydrierung zum Stillstand.

Der Katalysator wird abgenutscht und das Piltrat zur Trockne

verdampft» Ler ölige Rückstand wird verteilt zwischen 10 cm 1-n* Essigsäure und 50 cm Aether, die Bssigsäurelösung pas-

siert einen weitem Scheidetriohter mit weitern 30 cm Aether.

Beide Asthei'phaaen werden mit wenig Essigsäurelösung nachgewaschen j die wässrigen Phasen vereinigt, zur Trockne verdampft und der ölige Rückstand zur Entfernung der Essigsäure unter

3
Eiskühl'jng verteilt zwischen 20 cm Wasser - gesättigtem n-Bu-

3
tanol und 5 cm gesättigter Pottaschelösung. Die Butanollösung gibt na3h Tiocknen und Eindampfen 805 mg farblosen Pirn, (93?S der Theorie). Das Produkt ist nach Papierchromatographie einheitlich; im System n-Propanol-Aethanol-Wasser (7:1:2) R_f-

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Wert «= O5,88, im System n-Butanol-Aethanol-Wasser (2;2:1) R_f-Wert β 0,91.

Beispiel 7:
H^g-( p-Phenylaao~bengylogyearbonyl ^-S^-tert .butyloxy carbonyl-

^u — — : - -

-»H^->tert. -»

145 mg des in BeiBpiel 5 erhaltenen Prodiikts werden

, in 3 cm³ Dioxan gelöst* 1 cm Wasser zugegeben, die Lösung auf j 5° gekühlt und alt 0,22"em³ 1,0-n. Satronlauge (1,1 Ae^uivalenvereeUt. Die Klare Xößung nird 90 Minuten bei 5° belassen, , hierauf alt etwa« festem Kohlendioxid neutralisiert, viel Waeeer BUgegeban und das Dioxan im Vakuum vollständig entfernt* Di· schwach trübe, wässrige Lösung wird durch Waschen mit etwas Aether geklärt und dann unter Sieklihlung mit verdünnter SaIssäur« angeeäuert. Der orange, flockige ϊί leder schlag wird abgeritiiiöht, »it viel Waeeer neutral gewaschen und getrocknet. lusbeute 1Ö3 ig oranifefarbenee Harz, Bmp. ca. 60 - 80°. Das frödukt ist für wettere Umsetzungen genügend rein.

e Λ-* '■"

SAD OBSGiMAL

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H18599

- 20 «.._■.■■ Beispiel 8:

~N^~t ert. -butyloxycarbonyl-L-lysyl-N^-tert. -butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester.

800 mg des in Beispiel 6 erhaltenen, öligen Dipeptid-

3
esters werden in 12 cm trockenem Methylenchlorid gelöst und 500 mg reines Triphenylchlormethan sowie 0,28 cm absolutes Triäthylamin zugegeben« Nach 22 stunden bei 20° wird die Lösung mit Essigester verdünnt und unter Eiskühlung mit verdünnter Zitronensäurelösung und Wasser gewaschen» Trocknen der Lösung mit Natriumsulfat und Eindampfen gibt 1,21 g Harz. Nach mehr« maligem Umfallen aus Aether-Petroläther tritt Kristallisation ein. Bs werden 1,10 g Trityl-dipeptid-derivat vom Smp. 132 135° erhalten. Zur Analyse wird aus Aether-Petroläther uakri-Btallisiert, Sap. 134 - 137°, [α}^^Α * +3,7° ± 0,8° (c · 1,09 in Methanol].

Das Produkt kann wie in Beispiel 10, (4) bsschrieben_eauf milde Weise selektiv enttrityliert werden, ohne gase die üutyloxyearbonylgruppen angegriffen werden« per erhaltene t ert. -Buty loxy carbonyl-L-ly syl-N^-t ert · -butyloiycarbonyl-Ii«-' lysin-methylester ist nach lapierchroffiatographie in mehreren Systemen einheitlich und identisch mit dem in Beispiel. 6 beschriebenen Produkt.

BAD

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1418589

Beispiel 9s

carb ony l«*Ir>ly ein ο

If47 g de© in Beispiel'8 eriialtQn§s Produkts wie in-Beispiel 7 bs§eteieb§n» verseif-fe· Analoge gibt 1,18 g N^

ale Pulver vom Smp, 73 - 100° \

Lft]|⁴ w +1,0° % O₁?⁰' (q - 0p98 in Metbanoi) für weitere UfflBQtaungeR genügend rein,

Beispiel iQi

b\v|ylQ

mg H^ft

l-'I^lyainf 13 mg utyl©§t§i^t wj4

worden bsi -.T₅S⁰ »it 33 ag DieycloheiylQupbodiiroid, v©?s©t&fe «nä g 30 tunttten bet —i&^Q im4 4 ^§

(16 mg, ßaip, 224 « 286^§) vm& 4aa Filtiwfe iü

PtP iinäanp^pttolcetand

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viel Petroläther zerrieben und das ungelöste Pulver in ßssigester aufgenommen» wobei weitere 2 mg Dicyelohexy!harnstoff ungelöst bleiben. Pie. Bssigesterlösung wird unter fiiskühlung wie üblich neutral gewaschen, mit Kaliumsulfat getrocknet und eingedampft» Der .Rückstand (105 mg Harz) wird zur weitern Reinigung mit Aether zerrieben und aus Acetonlösung mit Aether ausgefällt» Das erhaltene Pentapeptidderivat zeigt Smp· 125 160°. Es stellt eine geschützte leilseguenz der Adrenocorticotropen Hormone darρ

Zur weitern Charakterisierung wird eine Probe mit konzentrierter Salzsäure hydrolysiert (90 Minuten bei 40°); das dabei erhaltene l-iysyl-Ii-lysyl-nitro-L-arginyl-nitro-I»- arginyl«!r»prQlin zeigt im Papierchromatogramm im System n-^utanol"3# Ammoniaklösung (100:44) eine A<aufstrecke von 6 cm (26 Stunden -^ufgeit). Bei Hochspannungselektrophorese (45 Volt/cm j pH s 1,9) bei 45 Minuten ^ufzeit eine Laufstrecke von 15 3m (i. Vgl, Lysin; 1? s»i I.ysyl«lysin 24 am),

s milde iänttritylierung wie unter 4) be«

schrieben, gibt I^w»tert „ -Butyloxycarbonyl-L^lysyl-ii^-tert ,«

Die bubstanz zeigt im Papierchromatoim Bysteffl n-Sutanol-Aetbanol-Wasser (2;2;1) einen B^- Wert von 0,87$ im System n«Butanol-3^ Ammoniaklösung (100;44)

Per als Ausgangsmaterial verv/endete liitro^I^arginyl« nitra«Ic«'g,rgiiiyl«-li«prQlin-»tert»-butyle8ter kann wie f©lit her» gestellt werden;

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20 g Nltro-L-arginin werden in 100 cm 1-n, Natronlauge gelöst und 20 em Diethylamin sowie 220 cia Isopropanol Bugegeben. Hierauf werden im Verlauf von 15 Minuten 36 g IrI-phenylchlormethan zugegeben und 2 Stunden bei Zimmertemperatur intensiv gerührt. Das ungelöste ^terial wird abgenutecht, mit wässriger Dläthylaminlueung nachgewaschen und das Flltrat Vakuum irom Xsopropanol befreit· Der dabei entstehende Niederschlag wird wiederum abgenutseht, das PiItrat mit etwas Aether gewaschen und dann unter Siekühlung bei höchstens 5° alt fester Zitronensäure auf pH · 2 gebracht. Das dabei auefallen* dt ölige ^rityI-nitrc-L-argißin wird unter ßlskuhlung in viel fiialgester aufgenommen, 4ie BßsigeeterlÖsung mit Eiswaeser neutral gewaechen, »it Natriumsulfat getrocknet und bei 30° BadtfWiperatur im Vakuum &wr Trockne verdampft. Das verbleibende fiftr«Cl&92 s) wird unter Siekühlung mit wenig Methanol versttit und dann sofort viel Aether sngegtben. Der »uerst flockige RIedereohlag kristallisiert hai 2° langsam durch» Erhalten werden 13,2 g kristallines Drityl-nitro-I^arginin, Smp. (145 ) 150 -

Ib einer Druokflaeoha werden 5 g trockenes L-Prolin,

'-' ■ ■' ■ ·% ■■■--_"" " . - " . ■ "*" 5 150 cm trookenee, aikoholfreiee Chloroform, 5 cm■ reinste,

■ . . ■ % ■■' ■■ ■ ■

konsentriertö bchwefeleäure und 150 cm flüssiges Isobutylen

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bei Zimmertemperatur solange geschüttelt, bis Lösung eintritt (ca. 3 - 4 Tage). Mach Abkühlen auf -15° wird das Druckgefäas geöffnet und das Isobutylen unter Peuchtigkeitsaueschluss im Vakuum abdestilliert. Sie verbleibende Chloroformlösung wird unter Eiθkühlung mit 200 cm³ 20% Pottaschelösung gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet. Nach Abnutsehen dee ^atriumeulfat· wird der Gehalt der Chloroformlösung an L-Prolin-tert.-butylester durch Titration einer Probe mit verdünnter Salzsäure ermittelt. Hierauf wird die restliche Chloroformlösung auf -15° gekühlt und mit der genau berechneten &enge Salzsäure in Alkohol versetzt. Eindampfen und Zerreiben des Rückstands mit Aether gibt 6,88 g kristallines L-i'rolin-tert.-butylester-hydrochlorid (769& der Theorie) vom Smp. (104°) 107 - 108°. Daa Produkt iat äuaserst hygroskopisch.

b) freier Ester:

Zur UeberfUhrung in den freien fister wird das Hjdrochlorid in möglichst wenig Wasser gelöst, die Lösung mit viel «Aether überschichtet und durch Zugabe von konzentrierter Pottaschelöeung stark alkalisch gestellt. Der dabei ausgeschiedene Ester wird in dem Aether aufgenommen; die Aetherlösung gibt nach Trocknen und Eindampfen öligen L-Prolin-tert.-butylester, der direkt weiter verarbeitet werden kann.

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9,15 g L-Prolin-terto-butylester und 24,7 g Trityl-

nitro-1-arginin werden versetzt mit 250 cm Acetonitril und

die lösung auf -15° gekühlt. Hierbei scheidet sich das aus den beiden Aminosäurederivaten gebildete balz aus. Dessen ungeachtet werden 11,1 g Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben und das Gemisch 72 Stunden bei 2° gerührtο Dabei geht das Salz in Lösung und es scheidet sich ein Gemisch, bestehend aus viel Dicyclohexy!harnstoff und etwas £rityl«nitrQ«I*~argiain-anhydriä auju wird abgenutseht (10,4 g, gmp, 210° / £2.2 « ZZA⁹) und das im Vakuum sur Xrootcne verdampft« Der Rückstand wir4

a^tgenenoaem, ynter lislsühlung mit verdünnter R^naäur©lösung, Wa.§s@^, iatriunibilEarbonatmeunf und

» mit Kaliumsulfat fttraeknet und eingedampft« Die Amteile (30 g Mv&) werde» mit wsnig ifetha&oi, bei

und. au.§ Aeeto.n.«A^%her kristallieieyi** JBa

* Cl?l®) XH · 1?6® eptelte«>, lui> Analyse wird

.?° (o s 1_%24 t»

₃-butylestero

1, QO g Trityl-ni tro-Ir-arginyl-l-prolin-tert.-butylester werden in 15 cm 7556 Essigsäure gelöst und 30 Minuten bei 30° belassen, wobei sich kristalle von Triphenylcarbinol abscheiden ο Das Keaktionsgemisch wird hierauf im Vakuum zur Trockne verdampft und der Rückstand verteilt zwischen Wasser und Aether» Man wäscht die wässrige Phase mit Aether und beide Aetherlösungen mit wenig verdünnter Essigsäure nach. Die wässrigen Phasen werden vereinigt, auf ein kleines Volumen eingeengt, mit waesergüsättigtem n-Butanol überschichtet und unter Eiskühluiig mit konaentriertex^ Pottaschelösung alkalisch gestellt. IiQV ausgeschiedene freie Dipeptidester wird durch zweimaliges Extrahieren mit n«Butanol isolierti die ButanollÖsungen geben nach Waschen mit verdünnter ^atriumsulfatlösung, Trocknen mit _f JSindam^fen und Trocknung im Hochvakuum 590 mg

Ir^prolin^terto^butylester (98^ der Theorie) als farbloses **ara« Das Produkt iat papierchromatographisch einheitlich und kann direkt w©iterverarbeitet werden.

§) Trj.tyl-»nitrQ-»I»»arginyl-nitro-L-arginy 1-Ir-prolin-tert.-

mg Kitro-It-argi»yl-Ir-pr©lia-tert<.-butylöBter und 818 mg TrityJ.-nitrO'-It-aygiiiin werden suspendiert in 20 cm

Acetonitril und das Gemisch auf -15° gekühlt, wobei sich das aus beidea Komponenten abscheidet· Naca Zugabe von 322 mg

wird. 3 Tage bei 2° gerührt. Sodann

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— f. I —

wird das Gemisch von Dicycloliexylharn3tof£ und Trityl-anhydronitro-L-arginin abgenutscht (297 mg, Snip. (170°) 211 - 217°) und dao Filtrat zur Trockne verdampft. Der Rückstand wird in Chloroform aufgenommen und unter EiokUhlung wie üblich gewaschen. Die neutralen Anteile (1,31 g Harz).werden mit Aether zerrieben ur.l das ungelöste Material (1,21 g) zur Abtrennung von Trityl-anhydro-nitro-L-arginin mit etwas Methanol versetzt. Dabei bleiben 78 mg, Smp. 180 - 184° ungelöst. Das Piltrat wird sur Trockne verdampft und der Rückstand (914 mg) einer Segenstromverteilung (Craig-Grundprozess mit 42 Verteilungs-Bchritten) unterworfen. (LÖBungemitteleystem: Chloroform-TetraohlorkohlenE toff-Methanol-Vasser « 5:5 s 8:2).

Die Hauptmenge des Tripeptiddorivatqa befindet sich in den Fraktionen 10 - 20 (Verteilungszahl Q ■ 0,69). Diese Fraktionen «erden vereinigt (680 mg) und aus Acetonlösung mit Aether ausgefällt. Das εο erhaltene Tripeptidderivat ist ein Pulver, Smp. ca. 125 - 150°; U]J³ ■ -32,2° + 1,1° (c = 1,15 in Methanol). Nach Entfernung der Trityl-n.tert.-bufcylestergruppe durch "ydrolyce mit konz. Salzsäure (1 Stunda bei 40°) erweist sich das erhaltene Nitro-L-arginyl-nitro-L-arginyl-L-prolin als einheitlich im Papierchromatogramm R--Wert β0,43 (System B-Butanol-Isopropanol-Monochloreseigsäurö-Wasser * 70:10:3g:40)k

8098*7/TQM,. .Λ..,. ΒΑ0ΟΒΒΙΗΛ

6) Nitro^Ii«argiayl-nitro~Ii~ar/j:in./1-Ir-prolia-tert.-but.yleater.

Das unter 5) erhaltene Tripeptidderivat wird wie UAtsi* Ί) beschrieben, enttrityliert und das erhaltene essigsaure Salz des Tripeptidesters in genau gleicher Weise in den freien Ester übergeführt. Der freie Nitro-L-arglnyl-nitro-L-arginyl-L-prolin-terte-butylester wird in 80# Ausbeute als farbloses Harz erhaltene Er ist papierchromatographisch rein. R--Wert «0,81 im System s-Butanol-Isopropanol-Triäthylamin-Veronal-Wasser = 100:10:0,2:1,8g:60.

Beispiel 11:

^-(p-Phenylazo-benz.vloxycarbonylJ-N^-tert.-butylox.ycarbon.yl-It-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycin-athylester.

Zu einer Lösung von 5,47 g L-Prolyl-L-valyl-glycinäthylester und 8,85 g N^a-(p-Phenylazo-benzyloiycarbonyl)-N^- tert.-butyloxy-carbonyl-L-lyeln in 150 cm Acetonitril werden bei -15° 4,00 g Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben* ^ie Mischung wird zuerst 30 Minuten bei -15°, dann bei 2° belassen, wobei die Reaktionsmischung allmählich gallertig erstarrt. Nach 3 Sagen bei 2° wird viel Aceton zugegeben, wobei das orangefarbene, gallertige Material in Lösung geht und Dicyclohexylhara-Btoff ungelöst bleibt. Er wird abgenutscht (3,2 g, entspr. 78$ der !Theorie), das ^i!trat zur Trockne verdampft, der Rückstand

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in Esoigsster aufgenommen und unter Eiskühlung wie üblich neutral gawascher?*· ALe neutralen Anteile '14,72 g oranges Harz) werden mehrmals mit Aether zerrieben und daa Aeeher-unlösliche Material (12₈6 g rohes Tetrapeptidderivat) sur weitern Reinigung chrociatographiert* Dats Material wird in Benaoi-Chloroform- - Gemisch .» 1:4 gelöst und auf eins Säule von SGO g Silikagel ("Davison", Mesh 200, mit Zusatz von 10i$ Wasser) gebrachte Blution mit weitern 3 Liter des gleichen Gemisches gibt 0,80 g Material, aus dem noch 290 rng Dieyclohexy!harnstoff erhalten wird» Hierauf wird der ^auptteil des orangefarbenen ^terials durch Elutlc-xi mit 4 Liter Chloroform auo der Säule gewascben-X)ie stark orange^roten ChloroforzE-Eluato geber«, beim JBindaapfen inBgeaamt 11,87 g Rückstand. Er wird in wertig warmem Acetonitril gelöst; beim langsamen Abkühlen scheiden sich insgesamt 9,?2g kristallines 2etrapeptidderivat in Nadeldrusen vom Smp, (147°) 149 - 151° ab,

. Zur Analyse wird aus Aceton und Acetonitril umkri-BtalliBiijrt, Smp. 151 - 152°; [α]ψ = -70,5° + 1,1° (c = 1,02 in Methanol). Das ^£rodukt stellt eine geschützte Teilsequenz der Adrenocorticotropen Horiaone dar.

Der als Ausgangematerial verwendete L-Prolyl-L-valylglycinäthyloster kann wie folgt hergestellt werden:

BAD ORIGiJNAt.

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1) L-Valyl-glycin-äthylester,

25 ρ8 g Carbobenzyloxy-L-valyl-glycin-äthylester wer-

3 den in 1 Liter Aethanol gelöst» 65 cm 1,4-n. Salzsäure in Aethanol zugegeben und die Lösung in Gegenwart von Palladiumkohle (10$ Pd) hydriert (unter Verwendung eines zweiten, mit Natronlauge gefüllten %driergefässes zum Auffangen des entstehenden .Kohlendioxyds). iJach Beendigung der Hydrierung wird vom katalysator abgenutscht, das Piltrat zur Trockne verdampft und der Rückstand (20,6 g Harz) mit wenig Wasser versetzt, wobei der Hauptteil in Lösung geht. .Bine Spur ungelöstes Material wird durch Filtration entfernt, das Piltrat mit 700 cm Essigester überschichtet und unter Biskühlung durch Zugabe von Pottasche alkalisch gestellt. Der dabei ausfallende, ölige Uipeptidester wird in Essigester aufgenommen, die wässrige Phase mit weitern 700 cm Essigester gewaschen, beide Essigesterphasen vereinigt, getrocknet und eingedampft. Es werden 18,5 g L-Valyl-glycin-äthylester (OeI) erhalten, der sofort weiterverarbeitet werden muss» Der als Ausgangsmaterial verwendete Carbobenzyloxy-L-valyl-glyein-äthylester ist bekannte

2) Carbobenzyloxy-L-prolyl-L-valyl-glycin-äthy!ester.

Zu einer auf -15° gekühlten Lösung von 13,6 g L-Valyl-glycin-ätbylester und 16,9 g Carbobenzyloxy-L-prolin in 300 cm Acetonitril werden 13_s9 g Dicyclohexylcarbodiimid gegeben. Haeh 30 Minuten Stehen bei -15° und 18 Stunden bei 2°

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ist das Reaktionsgemisch vollständig dtirehkrlstallisiert. Es wird mit wenig kaltem Acetonitril verrieben und abgenutschto Das Krlstallieat (29,7 gj (Gemisch von Oarbobenzyloxy-L-prolyl-L-valyl-glyein~äthy !ester und Dicyelohexy!harnstoff) wird wie unten beschrieben» verarbeitet* Dae Aeetonitrilfiltrat wird eingedampft und ergibt naeh üblicher Aufarbeitung in Essigester 13,0 g Neutralteil.

Das aus dsm Reaktionsgemisch direkt erhaltene Kristallisat (29_f7 g) wird mit wenig warmem Aceton aerrieben, wobei 13ι7 β Dieyelohexy!harnstoff ungelöst bleiben. Das Filtrat ergibt 16,0 g Rückstandf er wird vereinigt mit den oben erhaltenen (13,0 g) Heutralteili Kristallisation aus sehr wenig heissem Acetonitril gibt insgesamt 24 _fl g kristallinen Carbobenzyloxy-Ii-prolyl-Ii-vaXyl-glycin-äthyleeter (859& der i'heorie) vom Smp. 157 - 160°.

Zur Analyse wird aus Acetonitril kristallisiert_t Smp. 158 - 160⁰I L«}|⁹ » -87,4^Ö + 1,2° (c «0,962 in Methanol).

8₅00 g CarbobenKyloxy-Irfprolyl^L-valyl-glycin-äthyle £>ter wird in 200 ca Peinsprit gelb* et und in Gegenwart von PalladiAimkohle (!O^ Pd) hydriert» Das entstehende Kohlendioxyd wird in einem zweiten, mit Natronlauge gefüllten Hydriergefäse aufgefangen. Die Hydrierung kommt nach Aufnahme der berechneten Menge Wasserstoff gum Stlllst&nd» *»ach Abnutsehen des ^talysators wird die Lösung aur Trockne verdampft und der kristalline"

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iiückstarid mit etvj^e /ether zerrieben« Abnutsehen ergibt 4_r50 g

I-Prcj^l~I_J-va.7y-'-tⁱ'^!ycln--äthylcster-voni Smp. 12? - 129^(!, die Mut•'.or.lauge g:':i· ai s '''"nig Aather Xireltere 0_f60 g Trlpeptide.ster vom Bn>p_o 126 - 128°, ^{r 5}<? Ausbeute an kristallisiertem Tripeptide"'ir b3tri^:ß⁴. 9i^' -Ur i'h.eorie

Zur Anal*-.:", \~:.νά aus Aether urr'.kristallisiert_t ömp_e 12? - 129°; lc V^ - -7'1.C⁰ φ 0.5° te = 1,083 in .Aettianol).

Beispiel 12;

N .-.(.Pr^henylagp-bengyloxycarbonyl -)~N^-tert»-'butyloxycarbonyl- L-Iy sy 1-L- pro Iy l-Ir:yaly_iil-"gl.Y c in ._r

Der in Beispiel 11 erhaltene Tetrapeptid-äthyleßter wird in genau gleicher Weise wie in Beispiel 7 beschrieben, verseift. Analoge Aufarbeitung ergibt in 97% Ausbeute K ~(p-Iiienylazo-benzyloxycarbonyl)-N^c-tert„-butyloxycarbony1-L-lysy1-L-prolyl~L-valyl-glycin als Pulver ¹VOm Smp. 86 - 115°; das Produkt ist für weitere Umsetzungen genügend rein» Zur Analyse viiid aus Aceton-Aüthcr kristallisiert,-Snip. (122°) 127 - 132°; La]p' - -64„9° +.1,1° (c ~ 0,80 in Methanol).

BAD ORIGINAL

9 0 9 8 4 7/105 2

- 33 Beispiel 13;

äthyleiter»

900 mg des it Beispiel Il orhaltenen* kriοtallinen

3

TötrapoptiolfiQrivates wurden in 25 cm I'oinsprii gelöst _s 1 cm 2<-n« wäaorlgo .essigsäure zugegeben und in'Gegenwart von PaIIediuailconle (10fr Pd) hydriert (das entstehende Kohlendioxyd. wird in ljatroniau£;e absorbiert),. Nach. Aufnahme u«?r hereeiimetsn Κθ-ige ■rfaaseratofi' komra^ die iJ.ydrieru.r4g auni titillstand, V4id Ust>erfUb.r»i£ig iß di?n freien ßster ^sjsGhieht in

ps wi^ in Baie^iel ά beeohi'ieben» iärhalte» werde» (9?i· rtex¹ ihöerlg) f^fcrapiäptidiister ala farteloses Kara,, ißt

3,4?

Ave. döto in .Βθα,β{ι1ολ 11 erhaltenen Produkt kann

^lyrfyaarfeariyl^juppii ide folgt selslstiy 4 m&; ^fA'at<i;'ep®ptia:i?fi¥at werii^ii mit i-'^ et er v^rsötiet «i^d d*U Χιϋ&ιιη^ bai H.tu'cj-ca

* 34 -

eine stunde belassen. Hierauf wird die Klare Lösung sur Trockne ■/•irdarapft. Das irrodukt ist ©in oranges Harz. Bei Papierohroma« tc&raphia in verschiedenen Systemen wird nur ein oranger Fleck örnultun, der ssug'i^ieh-eine positive Ninhydrinreaktxon ze ;'υ;.,{.Η deu lysylrest^.i). k .-Wert - 0,77 (ü

n-flutaiioi-4-ötnar.,»i-Wasaer =· 2:2;l)} 0_ρ80 -- (byti hol-Isoprofanol-Wasüer - lüü;<lQ;i>5j s 0,95 - (d/stem s-Bufcanol-3'/» Ammoniak =s 100ί44).

BeispieJ 15;

3,0 β L-ürnithirwmc3nohydi'aohlG.r;.a in 30 3m Wasser

wenden mit 3 g uael^ohera Dapiertiai⁴ raidb während 1 1/2 Btunden im tiUc.k£\u*z '.-'AznnlYi, La₁ .s cbsroühüasi^e Kuptersat-i"^:.»ü«a,t wird v/arm »h^oraifcscht: uxiU ißit v/aeB-ji· -,tr-aneli-sn« IMo erhaltene dunkel

iro

blaue .Kuj; revkoaLplf^clg-ii-iifi uns (iriiithing v/iro n.it .*^if) cm Dioxan, 3 .,75 g i(P.triU!c.iiyärogen^arboaat ana 4,ί* cm bonylafcid vg-rs^txt" und 4 Ta,»·? bei 10° gerührt, Di& .entstandene Fällung wird abgenutseht, gut mit Wasser, Alkohol und Aether gewaschen»

&lsx von ir--B0O*0rnith.ia * 2,5 g ~ 53.i ae-r Theorie, 2ur Zersetzung weraet- v.'.ess- 2,5 g aes

?5 Qra .nasser und 10 au 2-n. 'js*3igöäure suspendiert und

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während 30 Minuten rait üchvefelveeeerstoff behandelt. Das Kiipfereulfid wird abgenutecht, das Filtrat im Vakuum bei 40° eingeengt und die restliche Löavxg im Hochvakuum lyophilieitrt. Dor pulvrige Rucketand wird im Kochvafciium bei Zimmertemperatur übor ^aliurahydroxyd bis zur Gewichtßkonstnns getrocknet. Ausbeute cn N -EOC-Omithin = 1,83 g - 44# der Theorie, P; 216° (unter Zereeteung, Bifiunfürbung ab ca, 190°).

Daß Pi'odukt ist gut löBlich in Vfassor, Methanol, otwae schwerer in Methanol. Aus Methanol-Aethar fällt ee gallertig avie.

Analyoe: ^cio^H2O°4^N2

Bor. N « 12,06 Gef. N «= ll,82?i

Beispiel 16:

α) Kapferkomplex:

1,55 g L-a^Y-Diaminobuttereäure werden in 30 cm Waaoer gelöst, 2/0 g basiechee Kupfercarbonat zugegeben und 20 Minuten euc Sieder, erhitzt. Hierauf wird noch heise vcm ungelbaten Kupfercarbonat abgenutscht und mit wenig waraeo W'aseer nachgwiaachen. Das tieiblaue Filtrat vrird auf ein Voltt^sn von ce» 15 em* eingeengt, ait Γ ; Magnssiumoxyd eowio »trier Lösuttg von 2_fXf» g t<2rt.-ln:.tyloxy-as.1. dt ίο γ»«^ in 40 ep/ Mothancl rersc^Jit und \8 bt-iimon "bei "40^w zoi

U18599

~ 36 -

Hierauf wird das Ksthauol im Vakuum abdestilliert, der hellblaue Niederschlag abgenuischt und mit wenig Wasser und Aether gewaschen* Das. Produkt enthält noch etwas Magnesiumoxid. Ea wird daher mit kalter, verdünnter EöGigsäurelösung gut serrieben, abgenutecht und mit V/aaser neutral gewaschen. Die Ausbeute beträgt 1,05 g, Sn-p. 229 - 233° (Zei-eotzung).

b) freie S^°tert„-Butyl'.f>xyca:rbor)Tl~L-·«.Y-diaminobuttersäure aus dem

Die Freisatr-umg des Perivatc aus dem Kupferkomplex geschieht in gleicher Weise, wie in Beispiel 1 (Sub b) beschrieben. Daß Produkt rird in Porm eines .feinen, gallertigen Nie- ' derschlEgo (aus Wasser) erholten. Smp. 217 - 229° {Zersetzung). Die Substanz ist löslich in verdünnten Alkalien und verdünnter Essigsäure? löslich in verdünnten Mineralsäuren unter Zersetzung» .!L,-Wert = 0,65 (Metern n-Butunol-Aethanol-Wasser = 2:2:1)? = 0,60 (System n-Butanol-3^ Ammoniak = 100:44)\ -Of 74 .(System eec. Butanol-Isopropanol-Mc lochloressigsäure-Wasser = 7O:lO:3g;1O). ·

BAD

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Claims (1)

1. U18599

   Pat entans prU ehe:

   1. Verfahren zum vorübergehenden Schutz dor Aminogruppo dee Amiiioalkylrestes von. α-(Aminoalkyl J-u-aminoeesigsauren und xhran Derivaten, dadurch gekennzeichnet, dass man die gemannte durch den tert,,-Butylo:-cy carboxylrest schütst.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den tert.-Btttyloxycarbonylre3t*in einen Matallkomples d<gr α~ίAminoalkyl)-a«-affiinoessigsUure einführt.

   3« Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekermsseicfenet, das3 man den tert.-Butylcxycarbonylrest in a-(Aminoalkyl)~α-aminoesBigsäuren einführt, deren a-Aminogrupoe geschützt ißt octer in einer ^epttdbindung; vorliegt.

   4, Verfahren nach den Ansprüchen 1 -3, daduroh gekennzeichntet, daas man den ierto~Butyloxysarbonylrest mittels o reaktionsfähigen Säurederivates des Kohlensäure-tert.-

   einführt»

   5» Verfahren nach den Ansprüchen 1 - 4, dadurch gekonn

   zeichuet, dasa man den tert.-Batyloxycarbonylrest mittels des Asicts des K.ohlanaäurQ~tsrt_s-»butyl~halbestcrß einfuhrt«

   BAD OPJGlWAL

   6. Verfahren nach den AnepiHJchen 2 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass man den. Kupferkomplex einer α-ζ Aminoalkyl)« a-aminoeasigaäure in' faseriger Lösung mit dem Aaid des Kohlensäure- t sr t.-bu ty 1-halbe at er s linse tat und dan Kupferkomplex zersetzt.

   7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 ~ 6» dadurch gekennzeichnet, daes man als «-(Aminoalkyl)-<?-e.miηoqgεigsaure Lysin verwendet.

   S₀ Verfahren nacii den Ansprüchen 1 - ?_t dadurcn gekenniseichnot, dass man in den erhaltenen -fcerto-Bufeyloxjrcarbcnyl-Verbindungen freie a-Aminogruppen oder Carboxylgruppsn in üblicher Weise abwandelt oder funktionell abgewandelte u-Amincgruppen oder Carboxylgruppen auf beliebiger rituie freiset2t.

   9. Verfahren nach Anspruch B, dadurch

   dass m&u in α- (tei*t · -Butyloxyearbonyl-aainoalkyl) -a-ami.notesigcäuren die a-Aminogruppe durch hydrogenolytiach abspaltbar· öchutzgruppen oder durch Acylreste von Atiinoeäuren oder Peptiden substituiert,

   10« Verfahren nach den Ansprücfcsn 8 und 9_t dadurch ge-

   keim.!Köiex_netp dass man in a—(tert₃"But3^rloxj,carbonyl-aiainoalk,3rl)· a-amiiiocarboiiöäuren rait freier oder subytituiei'tar a-.&iainogruppe die Säuregruppe verestert cder in reaktionsfähige Deri-* vafco überführt oder mit Aminosäuren oder -taptlden amidiert*

   9098 47/1052

   BAD OBiGiMAL

   11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 - 10, dadurch gekennseichnet, daes man in a-(tert.-^utyloÄycarbonyl-aminoalkyl)-aaalnoeseigaäuren, in denen die cc-Aminogruppe durch einen hydrogenolytieoh ab» palt car en Äeet geschlitzt let und/oder die Säuregruppe verestert ist, die ο-Aminogruppe und/oder die Estergruppe freie«tat.

   12. Verfahren nach den Ansprüchen 1-11, dadurch gekennzeichnet, dass man in erhaltenen a-(tert_e-ButyloxycarbonyI-aadnoalkyl)-a-amiiioeseig8äure?i und ihren Derivaten den tert,-Butyloxycarboaylreet durch milde, saure Hydrolyse abspaltet.

   13. Verfahren zur Herstellung von £e pt id en, dadurch gt¹-kennseichnetf daee man in a-(tert.-Butyloxycarbonyl-aminoalkyl)-a-aminoeßBigß&uren mit freier a-Aminogruppe diese durch einen hydrogenolytisch abspaltbaren Rest echUtgt, mit einer Aminosäure oder ftinea Peptid alt freier a-Aminogruppe kondensiert und dl· a-ABitto-ächutegruppe hydrogenolytisch abspaltet·

   14. Verfahren nach Anspruch 13; dßdturch gekenneelchiset» daea man die tert.-Butyloxyoarbonylgrujjp» durch Hydrclyee mittels verdünnter Mineralsäure entfernt.

   15. Verfahren zur Herateilung von nicht über die» a-Aainogruppe vcrimÜ£>ften Peptiden, dadurch gefcermBeiohnat, dase man in a-(tert.-Butyloxycarbonyl-aminoaliqrli"a-

   9Q98 47/10S.2-

   U18599

   «. 40 -

   mit freier a-Aminogrup^o diese durch einen hydrogenolytisch abspaltberen Rest schützt, denn don tert.-Butyloxycarbonylrest durch Hydrolyse mittels verdünnter Mineralsäure selektiv entfernt und die freie Aainogruppe ait einer Aminosäure oder eine» Peptid Acyliert.

   16. Verfahren zur Herstellung von Peptiden, dadurch gekennzeichnet, daes jaan einen «-(tert.-Butyloxycarbonyl-aminoalkylj-a-aminoeseigsäureester mit freierV-Aminogruppe mit oixter Aminosäure oder einem Peptid, daeeen ct-Aminogruppi? durch einen hydrogenolytisch atspaltbaren Reot geschützt iot, konden eiert uud in dem erhaltenen Peptid die a-Amlno-öcbutzgruppe hydrcgenolytisch abspaltet.

   17. Verfahren nach Anspruch 7_r dadurch gekennzeichnet, dasB laan in N^-tert«-Butyloxycarbonyl-L-lysin den p-Phenylazobeneyloxycarbonylrest einführt.

   18. Verfaliren nach den Ansprüchen 1-17, dadurch gekennzeichnet, da ε D man von &\xi irgendeiner Vorfahrensetufe alo ZwiEcluanprodukt erhältlichen Verbindungen ausgeht und die fohlenden Verfahr'mseohrltte vornimmt, oder das Verfahren auf ix'geadeinor Stufe c/bbriefct.

   BAD ORIGINAL

   q Π ^f- Ά i- 7 / 1 0 ii 2

   19* Verfahren nach den Ansprüchen 1 - 14 und 16 - 18,

   öh gekennseiehnet, dass man einaa K^&~terfc,-Bütyloxycar-

   lyein-niederalkyleeter mit H^a-(p-Phesyl£;.zo--beszyloxycarbO2Jyl)«K^-tert«-biityloxycarb(myl-Ii-lyaia kondensiert *

   20. Verfahren nach Anspruch 19» dadurch gekennzeichnet»

   dfiua man d©a p»PhönylfiUBO-benzylo3cycarbonylr©st hydroganolytieeh abgpeltat.

   Sl. Verfuhren m\oh JjasprUch 20, d&«.lm*cla

   mn i& «ine» H^-t#rt₀«»Btttylo^c!^i^oivy CÄycί^1!ϊo^l-*I.--l|^r3ia-nilMier»lfegrlβ9tβäⁱ den Triphenylmetbyl«

   Verfahren iutoh Anspruch 21, dadurch gokennseichnet,

   dl» S

   23· Verfahren uach dea Ansprüchen 1-12, dadurch gekenn-

   mit einem Nitro-L-arginyl· kondensiert *

   nach Anspruch 23» daaurcii gek

   arm mit 3l3J?o einer schwachen Stli\re den Sritylrest selektiv at-epalbet.

   9C3847/10 52 ßAD origimal

   141859-8

   « 42 -

   25o Verfahren nach Anspruch 23» dadurch gekennzeichnet,

   dass asan siitteie einer starkem Mineralsäure die Trityl- und tert.-fcutylGxycarboaylgruppen sovrio die Estergruppe abspaltet.

   26. Verfahren nach den Ansprüchen 1-14 und l?_f dadurch gakannzeichnet, daes man iF^a"(p-Phenyla2O"-beii2yloxj^Tcarbonyl)-li^-terfc.^butyiOÄycarbonyl-L-lyisin mit einea Ir-Frolyl~L-va.ly.lglycin-niederalkylostir kondenaiert«

   27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnetdass mau die Estergruppe mit alkalischen Mitteln verssift«.

   28* Verfahren nach Anspruch 26, dadtirch gekennzeichne1₉ daaa man den p-».?henyla^o-bensyioxyiiarbonylreet liydrogsnolytisch

   25 ο Verfahren «ach Aasprucli 26, dadurch dass asan die tert««»*nityloxyearbcnyl;ii*u.ppe mittels verdünnter Mineralsäure abspaltet.

   ßAD

   S098/>7/1052