NL8403888A

NL8403888A - Nieuwe gonadoliberinederivaten en werkwijze voor de bereiding ervan.

Info

Publication number: NL8403888A
Application number: NL8403888A
Authority: NL
Original assignee: Koezponti Valto Hitelbank
Priority date: 1983-12-23
Filing date: 1984-12-21
Publication date: 1985-07-16
Also published as: CZ1021084A3; FR2557114B1; IL73902A; FI82255C; IL73902A0; GB2152059A; ES538988A0; SE8406554D0; ES8702439A1; DD255164A5; DE3446997C2; DK625084D0; FI845051A0; DE3446997A1; DK625084A; FR2557114A1; ES550009A0; NO166449C; US4647553A; NO166449B

Description

NL 32556-Kp/vD - 1 - *

Nieuwe gonadoliberinederivaten en werkwijze voor de bereiding ervan.

De uitvinding heeft betrekking op nieuwe gonadoliberinederivaten alsmede op een werkwijze voor de bereiding ervan.

Meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking 5 op nieuwe gonadoliberinederivaten met de algemene formule 1

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X1-X2-X3-Pro-X4 1) alsmede op de additiezouten, gevormd met therapeutisch bruikbare zuren en complexen ervan, alsmede op farmaceutische preparaten met dergelijke derivaten erin. In de alge-- 10 mene formulé 1 X^ = een glycylgroep of een D-isomeer van elk natuurlijke of synthetische aminozuurgroep, X2 = een L-aminozuurgroep met 1-4 koolstofatomen in de zijketen, L-fenyl-alanyl of L-tryptofylgroep, 15 X3 = een L-aminozuurgroep met een Cj^alkyl of C2_4alkanoylamidezijketen, en X4 = een glycylamide of een C^_4 alkylamidegroep, onder voorbehoud dat wanneer X^ een groep anders dan gly-cyl voorstelt en X2 een tryptofylgroep is X3 geen leu-20 cyl mag zijn.

De in de formule gebruikte afkortingen zijn identiek met de nomenclatuur, die geaccepteerd is in de peptideche-mie, zoals beschreven bijv. in J. Biol. Chern., A 3372-3892-PT (241, 527 / 1966/).

25 Het is een algemene eigenschap van gonadoliberine (in de literatuur zijn er andere namen bekend: gonadotroop vrijmakend hormoon, GnRH, luteïniserend*en folliculus stimulerend hormoon, LH/FSH) en van zijn bekende derivaten, dat zij in staat zijn het luteïniserende hormoon (LH) en het folli-30 culus stimulerende hormoon (FSH) vrij te maken.

Vanaf het begin van de tachtiger jaren was het uit de literatuur bekend, dat gonadoliberine van bepaalde vissen en vogels qua structuur verschilde van gonadoliberine van mammalia /j.A. King en R.P. Millar, J. Biol. Chern. 257, 10722-35 28 (1982)? South African Journal of Science,78.' 124 (1982); N. Sherwood et al., Proc. Natl, Acad. Sci. 8l0, 2794-2798 8403888 4 - 2 - (1983)7. Deze verschillen zijn te vinden in de aminozuren op plaatsen 7 en/of 8.

üit de literatuur is bovendien bekend, dat die derivaten van gonadoliberine, die op plaats 6 bepaalde D-aminozu-5 ren, in plaats van glycine, bevatten, een verhoogde biologi-1 sche werking vertoonden vergeleken met de natuurlijke gonadoliberine (J. Sandow et al., Control of Ovulation, Butter-worth, London, 1978, biz. 49-70).

Bekend is verder, dat de substitutie van de glycine-10 amiderest op plaats 10 door amidegroepenimet alifatische koolstofketen /M.Fujino et al., J. Med. Chem. 16, 1144-1147 (1973)7 de biologische werking zelfs tot een hoger niveau verhoogt.

De uitvinding beoogt de bereiding van nieuwe gonadoli-15 berinederivaten, die effectief te gebruiken zijn voor het reproductieproces van vissen, vogels en mammalia.

Bovendien verschaft de uitvinding verder derivaten met verhoogde biologische werking in verhouding tot de natuurlijke derivaten.

20 De uitvinding is gebaseerd op de erkenning, dat het uitwisselen van aminozuren op plaatsen 7 en 8 in het gonado-liberinemolecuul door andere aminozuren dan wel door bepaalde combinaties van deze uitwisselingen resulteert in gonado-liberine-analogen, die geschikt zijn voor reproductie van 25 vissen, vogels en mammalia.

Voorts is de uitvinding gebaseerd op da erkenning, dat de effectiviteit van gonadoliberinederivaten , bereid door uitwisseling van de aminozuren op plaatsen 7 en 8 bevorderd kan worden door opnemen van bepaalde D-aminozuren op 30 plaats 6, alsmede alkyl-amidegroepen op plaats 10, in plaats van respectievelijk glycine en glycine-amide.

De nonapeptide-C^_jj-alkylamiden en decapeptide-ami-den met algemene formule 1

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X1-X2-X3-Pro-X4 1) 35 waarin de betekenis van X^, X2, X^ en X4 dezelfde is als boven, alsmede de zouten en complexen ervan volgens de uitvinding als volgt kunnen worden bereid: a) onder gebruikmaking van de methode van vaste fase peptidesynthese worden de op de juiste wijze beschermde 8403888 *. 4 * - 3 - aminozuren gekoppeld volgens de vereiste volgorde aan een vaste polymeerdrager met behulp van. carbodiimide of actieve ester, waarna op een gegeven moment de gerede peptide door middel van acidolyse of aminolyse wordt afgesplitst van de 5 drager en desgewenst de beschermende groepen van de aminozuren tegelijkertijd van de peptide worden verwijderd vóör of na de afsplitsing van de peptide uit de polymeerdrager, of b} het beoogde eindprodukt wordt opgebouwd uit de op geschikte wijze beschermde aminozuren onder gebruikmaking 10 van een geëigende combinatie van fragmentcondensatie en trapsgewijze synthese, afhankelijk van het chemische karakter van de variabele aminozuurcomponenten.

Het is voordelig gebruik te maken van benzhydrylamine of Boc-prolinehars als vaste drager.

15 Het is geschikt de beschermde peptide te verwijderen van de drager door behandeling met waterstoffluoride en/of door ethylammonolyse.

Volgens variant b) verdient het de voorkeur de nieuwe nona- of decapeptidederivaten te bereiden door condensatie 20 van een pentapeptide-azide met formule 2

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N3 2) met een tetra- of pentapeptide met de algemene formule 3

Xl-WPr°"X4 3) of door condensatie van een hexapeptide-acide met de algeme- 25 ne formule 4

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X^-N^ 4} met een tri- of tetrapeptide met de algemene formule 5 X2-X3-Pro-X4 5) of door condensatie van een heptapeptide-azide met de alge - 30 mene formule 6

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X^-X2-X2“N3 6) met een di-of tripeptide met de algemene formule 7 X3-Pro-X4 7) waarin X,, X„, X- en X. de boven vermelde betekenis-1 2 3 4 35 sen hebben.

Desgewenst kan de verkregen nona- of decapeptide-amide worden omgezet in een zuur zout door reactie met een farmaceutisch geschikt zuur of, desgewenst, kan de vrije base worden vrijgemaakt uit een zuur additiezout met behulp 84 0 3 S S 8 I i - 4 - van een base en desgewenst kan een verkregen nona- of deca-peptide-amide worden omgezet in een metaalcomplex.

Bovendien heeft de uitvinding ook betrekking op farmaceutische preparaten met daarin als werkzame componenten 5 verbindingen met de algemene formula 1 en hun zouten en complexen.

De farmaceutische preparaten worden in het algemeen bereid door mengen van ten minste één verbinding met formule \ 1 of een farmaceutisch aanvaardbaar zout of complex ervan 10 met dragers en/o;f toevoegsels, die gewoonlijk bij de bereiding van farmaceutische preparaten worden gebruikt, gevolgd door verwerken van de verkregen preparaten tot bijv. tabletten, dragees, capsules, suppositoria, injecteerbare oplossingen, neussprays etc.

15 De gonadoliberinederivaten met formule 1 kunnen ef fectief worden gebruikt in vissen, vogels en mammalia bij intramusculaire of subcutane toediening in een dosis van 0,1 ug - 5 mg.

Het voornaamste voordeel van de verbindingen volgens 20 de uitvinding is, dat de nieuwe gonadoliberinederivaten met algemene formule 1 aminozuurcombinaties op plaatsen 7 en 8 bevatten, die karakteristiek zijn voor vissen en vogels, waarbij zij bovendien bij voorkeur kunnen worden gebruikt voor het reproductieproces van deze diersoorten.

25 Andere bijzonderheden van de uitvinding worden geïl lustreerd aan de hand van de volgende niet limitatieve voorbeelden.

In de voorbeelden I-V worden verbindingen bereid volgens de vaste fasetechniek /Merrifield, R.B., J.Am.Chem. 30 Soc. 85^, 2149-2151 (1953)_/, onder gebruikmaking van chloor gemethyleerde polystyreendivinylbenzeenhars in het geval van peptide-alkylamiden, of benzhydrylaminehars in geval van peptide-amiden. De afzonderlijke aminozuren worden gekoppeld aan de hars als hun N-a-tert-butyloxy-carbonyl (Boe) deriva-35 ten onder gebruikmaing van dicyclohexylcarbodiimide (DCC), Ν,Ν'-diisopropylcarbodiimide (DIC) of actieve estermethode. Desgewenst worden de reactieve zijketengroepen van het aminozuur beschermd met behulp van geschikte beschermingsgroe- 8403888 « * - 5 - pen.

De voltooiing van de koppelingsreactie wordt vastge-gesteld met behulp van ninhydrineproef /Kaiser, E.,Colescott, R.L., Bossinger, C.D., and Cook, P.I., Anal.

5 Biochem. 34, 595-598 (19701/. Indien de proef positief is wordt de koppeling herhaald. De duur van de koppeling varieert tussen 1 en 16 uur afhankelijk van het aminozuur.

Deprotectie van de peptide alsmede de afsplitsing van de peptide van de hars worden bij voorkeur uitgevoerd in éën 10 stap met behulp van vloeibaar fluorwaterstofzuur (HF) /Sakakibara, S., Shimonishi, Y., Kishida, y., Okada, M., and Sugikara, H., Buil. Soc. Japan 40, 2164-2167 (196717*

Wanneer Nim-dinitrofenyl (DNP) beschermende groep wordt gebruikt wordt deze van de zijketen van histidine ver-15 wijderd voorafgaande aan de HF afsplitsing. De beschermde peptidehars wordt in dimethylformamide (DMF) met daarin enkele druppels propylamine geroerd. Na verwijdering van het oplosmiddel wordt de peptidehars behandeld met waterstoffluoride op de gebruikelijke manier. Wanneer een verbinding van 20 het peptide-alkylamidetype wordt bereid, wordt de peptide van de hars afgezonderd via alkylammonolyse, gevolgd door hydrogenolyse en/of acidolyse, afhankelijk van de aard van de beschermende groepen.

Het na de HF afsplitsing verkregen ruwe produkt wordt 25 onderworpen aan een gelfiltratie via een kolom gepakt met Sephadex G-25/ onder gebruikmaking van een az.ijnzuuroplos-sing als eluens.

Verdere zuivering wordt uitgevoerd onder gebruikmaking van preparatieve hoge prestatie vloeistofchro-30 matografie (HPLC) en/of silicagelchromatografie. De zuiverheid van de peptiden wordt bepaald via aminozuuranalyse en dunne laag chromatografie (TLC). De TLC Rf-waarden worden bepaald op Kieselgel (DC, Alufoline, Merck) platen onder gebruikmaking van de volgende oplosmiddelmengsels: 35 1. ethyl-acetaat/pyridine/azijnzuur/water 30 : -20 : 6 : 11 2. ethylacetaat/pyridine/azijnzuur/water 60 : 20 : 6 : 11 3. ethylacetaat/pyridine/azijnzuur/water 120 : 20 : 6 : 11 4. ethylacetaat/pyridine/azijnzuur/water 240 : 20 : 6 : 11 5. n-butanol/azijnzuur/water/ethylacetaat 1 : 1:1: 1 34 0 3388 '* * - 6 - 6. n-butanol/azijnzuur/water 4:1:1 7. i-propanol/ 1 M azijnzuur 2 : 1 8. ethylacetaat/pyridine/azijnzuur/water 5:5:1:3 9. n-butanol/azijnzuur/ammonia 5 (1 cc NH3 : 4 H20)/water 6:1:1:2

10. methyl-ethyl-keton/azijnzuur/water 120 : 15 : 20 VOORBEELD I

--- ' " " g Q

Bereiding van D-Phe ., Gin -gonadoliberine M : 1243 t 10 a) Synthese 1,25 g (1 mmol) benzhydrylarainehars.HCl ^0,8 meq/qj (Pierce) liet men gedurende twee uren in CE^C^ opzwellen, gevolgd door het volgende schema voor de koppeling van de aminozuurresten: 15 ____

Stap reagentia en bewerkingen mengtijden __(min) 1 CH2C12, wassen 3 keer 1 2 33% trifluoro azijnzuur (TFA) inCH2C12 1 20 3 '33% TFA in Ch2Cl2 25 4 CH2C12, wassen 3 keer 1 5 CHC13, wassen 2 keer 1 6 10% triethylamine (TEA) in CHC13, 2 keer 2 25 7 CHC13, wassen 2 keer 1 8 ethanol, wassen 2 keer . 1 9’ CH2C12, wassen 2 keer 1 10 Boc-aminozuur (3 mmol.) in CH2C12 en desgewenst DMF plus DIC of DCC (3 mmol.) in 30 CH2C12* 60 - variabel 11 CH2C12, wassen 2 keer 1 12 ethanol, wassen 2 keer 1 35 * Gin werd gekoppeld als zijn Boc-Gln-ONP (p-nitrofenyl)-derivaat via actieve estermethode; in het geval van Glp werd de a-aminogroep niet beschermd.

Na elke cyclus (na stap 12 werd een portie afgenomen voor de ninhydrineproef; indien de proef negatief was werd 8403888 • *

V

- 7 - de volgende cyclus gestart bij stap 1# en wanneer de proef positief was werd een andere koppeling (stappen 5-12) gein-troducerd.

Aan het eind van de synthese werd 2,28 g Glp-His- 5 (Tos)-Trp-Ser(OBzl)-Tyr(OBzl)-D-Phe-Leu-Gln-Pro-Gly-peptide- hars verkregen. AW: 1,05 g (66%) ^beschermde peptide* 1577) b) HF afsplitsing

De beschermde peptide (2,28 g) werd behandeld met 10 opnieuw gedestilleerd HF (30 ml) in aanwezigheid van anisol (3 ml) en dithiothreitol (100 mg) gedurende 60 min. bij 0°C. Het HF werd in watervrije stikstofgasstroom geëlimineerd, waarna de hars werd gesuspendeerd in absolute ether en tenslotte gefiltreerd. Het vaste residu werd gewassen 15 met 50% azijnzuur, waarna de oplossing onder vacuum bij 37°C werd ingedampt. Het ingedampte materiaal werd meteen onderworpen aan gelfiltratie (zie stap c) beneden).

c) Gelfiltratie

De ruwe peptide (verkregen in stap b) werd gezuiverd 20 via een Sephadex G-25 kolom (2,5 x 100 cm) in 50% azijnzuur bij een stroomsnelheid van 15 ml/h. De scheiding wferd gevolgd via UV-absorptie bij 280 nm en TLC. Fracties (300-350 ml) werden verzameld en gelyofiliseerd. Opbrengst: 690 mg (55%).

25 d) Preparatieve HPLC

Verdere zuivering werd uitgevoerd onder, gebruikmaking van een reverse-fase C18 -gebonden silicagel LRP-1 (13-24 yum) (Whatman) preparatieve HPLC kolom (2,5 x 45 cm) die in evenwicht was gebracht met een oplossing van 25% 30 methanol in 30% azijnzuur. Na het bereiken van evenwicht werd 230 mg gel gefiltreerd materiaal op de kolom gebracht.

Het eluëren werd uitgevoerd met behulp van een lineair gra-dientsysteem van methanol - 30% azijnzuur (25 - 40% methanol) bij een stromingssnelheid van 2 ml/min. en een druk 35 van 3,5 x 10^ Pa. De i-nhoud van de fracties werd gemeten bij 280 nm en gevolgd via TLC. Verzamelen en lyofiliseren van 6 8 het produkt leverde 133 mg D-Phe , Gin -GnRH op. Absolute hoeveelheid diende te worden vermenigvuldigd met 3 voor normalisatie tot 690 mg gel-gefiltreerd materiaal (399 mg, 8403358 4 % - 8 - • 32%). " R*= 0,76? r|- 0,68? R^= 0,33? rJ= 0,93? R®= 0,83.

Aminozuuranalyse:

Ser 0,93, Glu 1,96, Pro 0,95, Gly 1,02, Leu 1,00, Tyr 1,01, 5 Phe 1,02, His 0,99.

Smeltpunt: 175-178°C;/a7^2 = " 68,0° (c = 0,1, 0,1 M AcOH).

VOORBEELD II

Bereiding van TrP .Gin8-gonadoliberine 10 M: 1226 a) Synthese 2,5 g (1 mmol) benzhydrylaminehars.HCl (0,4 meq/g) liet men opzwellen in CH2C12, gevolgd door de bereiding van 3,62 g Glp-His(DNP)-Trp-Ser(OBzl)-Tyr-Gly-Trp-Gln-Pro-15 Gly-peptidehars volgens voorbeeld Ia.

AWs 1,12 g (76%)^beschermde peptide* * b) Deprotectie en afsplitsing van de peptide van de hars_______

Afsplitsing van de DNP groep 20 -

De beschermde decapeptidehars (3,62 g) werd geroerd in 20 ml DMF en 1 ml propylamine gedurende 60 min. bij kamertemperatuur, waarna de partieel beschermde peptidehars werd afgefiltreerd, gewassen met CH2Cl2 en ethanol en 25 tenslotte onder vacuum gedroogd.

HF afsplitsing

Na verwijdering van de DNP-beschermde groep werd de peptide behandeld met HF volgens voorbeeld I/b. Op die ma-30 nier werd 0,8 g (65%) van de ruwe decapeptide-amide verkregen.

c) Gelfiltratie

De gelfiltratie werd uitgevoerd volgens voorbeeld I/c. Opbrengst: 520 mg (42%).

35 d) Preparatieve HPLC

Het proces werd uitgevoerd volgens voorbeeld I/d, met Uien verstande, dat het LRP-1 gel in evenwicht werd gebracht met een oplossing van 18% methanol in 30% azijnzuur. Het ruwe gel-gefiltreerde materiaal werd uit de 8403888 * * - 9 - kolom geëlueerd met behulp van een lineair gradiëntsysteem van methanol - 30% azijnzuur (18-35% methanol). Op die manier werd 380 mg (31%) van de zuivere peptide verkregen.

r3 = 0,66; R? = 0,57; R^ = 0,78. fff 5 Aminozuuranalyse:

Ser 0,93, Glu 1,93, Pro 1,00, Gly 2,04, Tyr 0,98, Trp 1,86, His 1,03.

VOORBEELD III

Bereiding van Trp?, Leu^, desGly^O -gonadoliberine-10 ethylamide_ Mï 1198 a) Synthese

Eerst werd Boc-Pro-hars bereid volgens de methode van Merrifield /Merrifield, R.B., J. Am. Chem. Soc. 86, 304 15 (1964)7· 2,0 g (1 mmol) Boc-Pro-hars (0,5 meq/g) liet men gedurende 2 uur opzwellen, gevolgd door de koppeling van de geschikte aminozuren aan de hars een na de ander volgens voorbeeld I/a» Na de laatste cyclus werd 3,02 g Glp-His(DNP) -Trp-Ser(OB zl)-Tyr(OBzl)-Gly-Trp-Leu-Pro-nonapeptidehars 20 verkregen.

Δ»: 1,02 g (83%) (MbescherInde peptlde= I486).

b) Deprotectie en afsplitsing van de peptide van de hars__

Eerst werd de DNP beschermde groep verwijderd 25 volgens de methode van voorbeeld ΙΙ/b. Dan werd de partieel beschermde peptide van de hars afgesplitst in de.vorm van zijn ethylamide /Coy, D.H. et al., Biochemistry 13, 323-326 (1974)7 Voor <3it doel werd de peptidehars geroerd met 15 ml gecondenseerd ethylamine bij 0°C gedurende 3 uur. De over-30 maat van het ethylamine werd in een stikstofgasstroom geëlimineerd. Het residu werd gewassen met ethanol en DMF en vervolgens gefiltreerd. Het filtraat werd onder vacuum ingedampt, waar het residu werd behandeld met ether en het vaste materiaal werd afgefiltreerd.

•3'5 Volledige deprotectie van de peptide werd uitgevoerd door een behandeling met watervrij HP volgens voorbeeld I/b. Opbrengst: 710 mg (59%).

c) Gelfiltratie

Het nonapeptide-ethylamide werd door een Sephadex 8403388 ___^ - ---——- - ΙΟ - G-25 kolom in 30% azijnzuur geleid volgens voorbeeld I/c. Opbrengst: 490 mg (41%).

d) Silicagelchromatografie

De ruwe peptide werd gezuiverd op een kolom van 5 Kieselgel 60, 2 x 100 cm (230-400 mesh, Merck) in een 30:20:6:11 mengsel van ethylacetaat, pyridine, azijnzuur, water bij een stroomsnelheid van 8 ml/h. 4 ml fracties werden verzameld en het ontwijken werd gevolgd via TLC. De zuivere stof bevattende fracties werden ingedampt en gelyo-10 filiseerd. Opbrengst: 320 mg (26%). = 0,61;

Rf = 0,42; Rf = 0,75.

Aminozuuranalyse:

Ser 0,89, Glu 0,96, Pro 0,95, Gly 0,97, Leu 1,00,

Tyr 1,02, Trp 1,88, His 1,03.

15 VOORBEELD IV

Bereiding van Phe?, Gln^-gonadoliberine M: 1187 a) Synthese 1,25 g (1 mmol) benzhydrylamine.HCl hars (0,8 meq/g) 20 liet men opzwellen gedurende 2 uur in waarna volgens voorbeeld I/a 2,9 g Glp-His(Tos)-Trp-Ser-(OBzl)-Tyr-(OBzl-Gly-Phe-Gln-Pro-Gly-peptidehars werd bereid.

AW: 1,27 g (83%) <Mbesohermde peptide= 1521) b) HF afsplitsing 25 De beschermde peptide werd behandeld met watervrij HF volgens voorbeeld I/b. Op die manier werd .980.mg (82%) van het deprotected materiaal verkregen.

c) Gelfiltratie

Het ruwe decapeptide-amide werd gezuiverd via een 30 kolom van Sephadex G-25 in 2 M azijnzuur, volgens voorbeeld l/c. Opbrengst: 576 mg (49%).

d) Preparatieve HPLC

De werkwijze werd uitgevoerd volgens voorbeeld I/d, met dien verstande, dat het LRP-1 gel in evenwicht werd 35 gebracht met een oplossing van 10% methanol in 20% azijnzuur. Het eluëren werd uitgevoerd met behulp van een lineair gradiëntsysteem van methanol - 20% azijnzuur (10-25% methanol, 150-150 ml), daarna werd het voortgezet met een 25-40% methanol bevattend lineair gradiëntsysteem (150-150 3403388 - 11 - ml elk). Fracties met de zuivere peptide erin werden verzameld en ingedampt. Opbrengst: 448 mg, (38%).

Rf = 0,12, r| = 0,7, r| = 0,24, R7f = 0,87. Aminozuuranalyse: 5 Ser 0,87, Glu 2,05, Pro 1,03, Gly 2,13, Tyr 0,92,

Phe 1,00, Ris 0,95, Trp 0,81.

Smeltpunt: 182°C.

VOORBEELD V

7 8

Bereiding van Phe , Leu -gonadoliberine 10 M: 1172 a) Synthese 0,62 g (0,5 mmol) benzhydrylami'ne.HCl hars (0,8 meq/g) liet men opzwellen gedurende 2 uur in vol gens voorbeeld I/a. Er werd 1,33 g Glp-His(Tos)-Trp-Ser-15 (OBzl)-Tyr(QBzl)-Gly-Phe-Leu-Pro-Gly-peptidehars bereid.

AW: 695 mg (92%) (Mbeschermde peptide= 1506).

b) HF afsplitsing

De beschermde peptide werd behandeld met HF volgens voorbeeld I/b. Op die manier werd 510 mg (87%) van de ruwe 20 decapeptide verkregen.

c) Gelfiltratie

De in stap b) verkregen ruwe decapeptide-amide werd overgebracht op een kolom van Sephadex G-25 in 2M azijnzuur en vervolgens gezuiverd volgens voorbeeld I/c. Opbrengst: 25 363 mg (62%).

d) Silicagelchromatografie

De peptide werd verder gezuived op een kolom van Kieselgel 60 (2 x 100 cm) in een 1:1:1:1 mengsel van n-buta-nol, azijnzuur, water en ethylacetaat. De inhoud van de 30 fracties werd onderzocht bij 280 nm en via TLC. Hierbij werd 299 mg (51%) van de zuivere decapeptide-amide verkregen.

R^ = 0,55; R^ =* 0,39; R^ = 0,62; R^ * 0,73.

Aminozuuranalyse: 35 Ser 0,91, Glu 0,97, Pro 1,07, Gly 2,12, Leu 1,00, Tyr 1,03, Phe 0,94, His 1,05.

VOORBEELD VI

Bereiding van D-Phe , Gin , desGly1 gonadoliberine-ethylamide_ 8403888 f * - 12 - Μ: 1198 a) Boc-His(DNP)-Trp-OMe M: 623 21,12 g (50 mmol) Boc-His(DNP)-OH werd opgelost in 5 100 ml DMF, waarna de oplossing werd afgekoeld op 0°C.

Daarna werden onder roeren 10,32 g (50 mmol) DCCI en 7,66 g (50 mmol) N-hydroxy-benztriazool toegevoegd. Het mengsel werd gedurende 10 min. bij 0°C geroerd, waarna de neergeslagen dicyclohexylureum werd afgefiltreerd.

10 Er werd 12,74 g (50 mmol) H-Trp-OMe.HCl opgelost in 70 ml DMF, waarna de oplossing werd afgekoeld tot 0°C.

Dan werd 693 ml (50 mmol) triethylamine toegevoegd en daarna na 5 min. roeren werd het neergeslagen triethylaminehy-drochloride afgefiltreerd.

15 De twee oplossingen werden verenigd en vervolgens bij

0°C gedurende de nacht geroerd. Daarna werd het neergeslagen DCU afgefiltreerd en de oplossing tot droog ingedampt. Het olieachtige residu werd opgelost in 500 ml ethylacetaat en vervolgens geschud met drie 100 ml porties ijskoude 1M

20 KHSO^ oplossing, vervolgens met vijf 100 ml porties van een verzadigde NaHC03 oplossing en tenslotte met twee 100 ml porties van een 10% NaCl oplossing. De organische fase werd boven magnesiumsulfaat gedroogd, gefiltreerd en tot droog ingedampt. De olieachtige stof werd met petroleumether 25 gepoederd, gefiltreerd en gedroogd. Het aldus verkregen kristallijne produkt kan worden omgekristalliseerd uit ethylacetaat met petroleumether. Opbrengst: 27,7 g (89%).

Smeltpunt: 119-122°C?/p.7^2 = +14,1° (c = 1, DMF).

30 = 0,62.

b) H-His(DNP)-Trp-OMe.2HC1 M: 522,5 (vrije base)? 595 (.2HC1) 24,9 g (40 mmol) Boc-His(DNP)-OMe dipeptide werd opgelost in 100 ml methanol, gevolgd door toevoeging van 100 35 ml van een 4 n methanolisch zoutzuuroplossing. Het mengsel liet men gedurende 30 min. bij kamertemperatuur staan, waarbij het dipeptidehydrochloride uitkristalliseerde. De kristallen werden afgefiltreerd, met ether gewassen en gedroogd. Opbrengst: 21,91 g (92%).

» 8403888 5 ï - 13 -

Smeltpunt: 198-202°C? - 0,49° (c = 1, DMF).

r| * 0,46, r| * 0,18.

c) Glp-His(DNP)-Trp-OMe M: 634 5 4,85 g (36,8 mmol) L-pyroglutaminezuur, 7,58 g dicy- clohexylcarbodiimide en 5,63 g N-hydroxybenztriazool werden opgelost in 100 ml DMF. Het mengsel werd gedurende 10 min. bij 5-10°C geroerd, waarna het neergeslagen DCU werd afgefiltreerd.

10 Er werd 20,84 g (35 mmol) H-His(DNP)-Trp-OMe.2HC1 opgelost in 100 ml dimethylformamide, gevolgd door toevoeging aan de oplossing van 9,72 ml (70 mmol) triethylamine.

Na roeren gedurende 5 min. werd het neergeslagen triethyl-aminehydrochloride afgefiltreerd. De twee oplossingen werden 15 gecombineerd en bij kamertemperatuur gedurende de nacht geroerd. Dan werd 90 ml aceton aan het mengsel toegevoegd, waarna het neergeslagen onoplosbare materiaal werd afgefiltreerd. Na indampen van de oplossing werd een olieachtig materiaal verkregen, dat vervolgens met ethylacetaat werd 20 behandeld, gefiltreerd en gedroogd. Het droge kristallijne materiaal werd drie keer gewassen met telkens 25 ml water en daarna werd gedroogd. Het verkregen produkt kon worden omgekristalliseerd door oplossen in heet ethylacetaat, gevolgd door afkoelen. Opbrengst 18,42 g (83,1%).

25 Smeltpunt: 148-151°C; faj33 = +5,2 (c = 1, DMF).

3 4 D

R^ = 0,53, Rj = 0,38.

d) Glp-His-Trp-OMe M: 466 15,84 g (25 mmol) Glp-His(DNP)-Trp-OMe beschermde 30 tripeptide werd opgelost in een mengsel van 100 ml DMF en 40 ml water. Dan werd 4 ml mercapto-ethanol toegevoegd, waarna de pH van de oplossing werd afgesteld op een waarde van 8 met behulp van triethylamine. De oplossing liet men vervolgens gedurende 30 min. bij kamertemperatuur staan, 35 waarna men de oplossing onder vacuum tot droog indampte. Het olieachtige materiaal werd behandeld met ether, gevolgd door filtratie en drogen. Het aldus verkregen produkt werd opgelost in een kleine hoeveelheid methanol, gevolgd door omkristalliseren door toevoeging van ether. De neergeslagen 8403888 - 14 - kristallen werden afgefiltreerd en gedroogd. Opbrengst: 10,92 g (93,6%). Smeltpunt: 228-232°C;/«Jp2 = +4,04° (c * 0,42, DMF).

r| = 0,30.

5 e) Glp-His-Trp-N

M: 466,5 9,33 g (20 mmol) Glp-His-Trp-OMe tripeptide werd opgelost in 250 ml methanol. Dan werd aan de oplossing 20 ml 98% hydrazinehydraat toegevoegd. Het reactiemengsel werd 10 gedurende 3 uur bij 40°C geroerd en vervolgens gedurende de nacht bij kamertemperatuur. Het neergeslagen materiaal werd vervolgens afgefiltreerd, met koud methanol gewassen en gedroogd. Opbrengst: 7,58 g (81,2 %).

Smeltpunt: 166-169°C; /"aj^2 = -22,3 (c = 0,5, 15 DMF).

= 0,50, = 0,14.

f f f) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-OMe Mï 717 7,0 g (15 mmol) Glp-His-Trp-^H^ verkregen in 20 stap e) werd opgelost in 60 ml DMF. De oplossing werd afgekoeld tot 0°C, gevolgd door toevoeging van 7,5 ml (45 mmol) van een 6 n HC1 oplossing onder roeren. Daarna werd 1,035 g (15 mmol) NaNC>2 druppelsgewijs aan het mengsel toegevoegd in de vorm van een geconcentreerde waterige op-25 lossing, waarna het mengsel nog eens 15 min. bij 0°C werd geroerd. Aan het reactiemengsel werd een oplossing van 4,78 g (15 mmol) H-Ser-Tyr-OMe.HCl in 15 ml DMF toegevoegd. De pH werd op een neutrale waarde ingesteld met behulp van 6,25 ml (45 mmol) triethylamine, waarna het mengsel gedurende de 30 nacht bij 0-4°C werd geroerd. De volgende dag werd het mengsel onder vacuum tot droog ingedampt, waarna het olieachtige produkt met ether werd behandeld.

12,1 g (100%) van de beoogde verbinding met daarin een kleine hoeveelheid onzuiverheid werd verkregen. Dit pro-35 dukt kon worden omgezet in het hydrazide zonder zuivering, waarna het verkregen hydrazide gemakkelijk kon worden gekristalliseerd.

Physische eigenschappen van een controlemonster, omgekristalliseerd uit methanol zijn: 8 4 0 3 S 8 8 - 15 - smeltpunt: 18 8-19 0^/¾¾2 = “3,48° (c = 1, DMF) ? R1 = 0,58, R2 = 0,26. f . f

g) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N H

M: 717 5 Van de ruwe gepoederde Glp-His-Trp-Ser-Tyr-OMe penta- peptide-ester werd 12 g opgelost in 200 ml methanol, gevolgd door toevoeging van 10 ml 98% hydrazinehydraat. Het mengsel werd gedurende 3 uur bij 40°C geroerd, waarna het roeren gedurende de nacht bij kamertemperatuur werd 10 voortgezet. De daarbij neergeslagen kristallen werden afge-filtreerd en in een exsiccator boven geconcentreerd zwavelzuur gedroogd. Het droge kristallijne materiaal werd opgelost in 250 ml van een 0,5 n zoutzuuroplossing. De pH van de oplossing werd afgesteld op een waarde van 8 met behulp van 15 een verzadigde natriumcarbonaatoplossing. Na 2 uur laten staan bij 0°C werden de neergeslagen kristallen gefiltreerd, met ijskoud water gewassen en gedroogd. Opbrengst: 6,12 g (56,9%, berekend voor de twee stappen).

Smeltpunt: 205-206°C?/>7d2 * -21,51° (c =1, 20 DMF).

Rf = 0,39, R2 = 0,14.

Hydrazinestikstof: gevonden: 3,79%, 3,76% berekend: 3,91%.

h) Z-Gln-Pro-NHEt 25 M: 405 3,242 g proline-ethylamide (verkregen uit 22,8 mmol Z-Pro-NHEt door hydrogenolyse) werd opgelost in 70 ml tetra-hydrofuran (THF), gevolgd door toevoeging aan de oplossing van 5,6 g (20 mmol) Z-Gln-OH en 1,034 g N-hydroxybenztria-30 zool. Het reactiemengsel werd afgekoeld tot 0°C, waarna aan het geroerde reactiemengsel een oplossing van 5,34 g (25,9 mmol) dicyclohexylcarbodiimide in THF werd toegedruppeld. Het roeren werd gedurende 5 uren bij 0°C voortgezet en vervolgens gedurende 20‘uren bij kamertemperatuur. Het 35 neerslag werd afgefiltreerd, met THF gewassen, waarna het filtraat onder vacuum werd ingedampt en het residu in chloroform werd opgelost. De oplossing werd geschud met 3 porties 35 ml van een mengsel van NH^OH en water (1:5), 2 porties 20 ml water, 3 porties 35 ml 0,1 n zoutoplossing en 8403888 - 16 - < * tenslotte 2 porties van 20 ml water. De organische fase werd ~ gedroogd boven watervrij natriumsulfaat, gefiltreerd, met chloroform gewassen en ingedampt. Het verkregen olièachtige residu werd opgelost in een mengsel van 35 ml THF en 50 ml 5 ethylacetaat, gevolgd door filtratie. De oplossing werd ingedampt en het residu· werd met ether behandeld. Het verkregen vaste produkt werd afgefiltreerd, met ether gewassen en vervolgens onder vacuum gedroogd. Opbrengst: 7,68 g (95%).

R* = 0,73, R® = 0,45.

£ f 10 i) Z-Leu-Gln-Pro-NHEt M: 518,6 4,5 g (11 mmol) Z-Gln-Pro-NHEt werd opgelost in 30 ml ijsazijn, gevolgd door toevoeging aan de oplossing van 55 ml 4 n waterstofbromide in ijsazijn. Het reactiemengsel werd 15 gedurende 90 min. bij kamertemperatuur bewaard, gevolgd door toevoeging aan het mengsel van 250 ml watervrije ether, waarna het mengsel gedurende 60 min. bij kamertemperatuur werd bewaard. De bovenstaande vloeistof werd gedecanteerd, waarna aan het residu 100 ml ether werd toegevoegd en na 15 20 min. afgefiltreerd en met ether gewassen. Het vaste residu werd boven fosforpentoxide en natriumhydroxide onder vacuum gedroogd. Opbrengst: 4,9 g (hygroscopisch).

Van het verkregen dipeptide-ethylamide.HBr werd 3,8 g (11 mmol) gesuspendeerd in 150 ml chloroform, waarna aan de 25 suspensie 7 ml triethylamine werd toegevoegd. Dan werd 6,4 g carbobenzoxy-leucyl-pentachloorfenylester in .65 ml chloroform toegevoegd. Het reactiemengsel werd gedurende de nacht bij kamertemperatuur geroerd. De volgende dag werd het mengsel gewassen met 1 n zoutzuur, verzadigd natriumchloride, 2 30 n ammoniumhydroxide en vervolgens herhaaldelijk met verzadigde natriumchloride-oplossing. De chloroformfase werd boven watervrij natriumsulfaat gedroogd en vervolgens onder vacuum ingedampt. Het residu werd behandeld met ether, gevolgd door filtratie, wassen met ether en drogen onder 35 vacuum. Opbrengst: 4,6 g (81%).

j) H-Leu-Gln-Pro-NHEt.HBr M: 465,5

Het onder stap i) bereide ruwe produkt werd opgelost , in 10 ml ijsazijn en vervolgens gedurende 60 min. bij kamer- 8403888 ¥ “ - 17 - temperatuur geroerd* Dan werd de oplossing verdund met 100 ml watervrije ether. Het neerslag werd afgefiltreerd en onder vacuum gedroogd. Opbrengst; 3,54 g (76%)· R1 * 0,1, R5 = 0,55, R6 = 0,13, R® = 0,77.

f. f f f 5 Aminozuuranalyse:

Glu 1,05, Pro 1,19, Leu 1,00.

k) Boc-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt M; 631,7 2,33 g (5 mmol) H-Leu-Gln-Pro-NHEt.HBr werd opgelost 10 in 5 ml DMF, gevolgd door afkoeling tot 0°C, waarna 0,7 ml (5 mmol) triethylamine en 2,57 g (5 mmol) tert.-butyloxycar-bonyl-D-fenylalanyl-pentachloorfenylester in 10 ml DMF aan de oplossing werd toegevoegd. De pH werd afgesteld op een waarde tussen 7 en 8, waarna het reactiemengsel gedurende 48 15 uur bij kamertemperatuur werd geroerd, terwijl de pH-waarde van tijd tot tijd met triethylamine tot neutraal werd ingesteld. Na indamping van het reactiemengsel werd de achtergebleven stof behandeld met ether, gevolgd door filtratie en drogen. Het verkregen ruwe produkt werd blootgesteld aan 20 deprotectie zonder verdere zuivering. Opbrengst: 2,81 g-(89%).

l) H-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt.TFA

M; 645,6 1,26 g (2 mmol) Boc-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt werd opge-25 lost in 10 ml trifluorazijnzuur, gevolgd door 20 min. roeren bij kamertemperatuur. Het trifluorazijnzuur werd.onder vacuum ingedampt, waarna het residu met ether werd behandeld, gefiltreerd en gedroogd. Het residu werd onderworpen aan chromatografie op een silicagelkolom met een 4:1:1 meng-30 sel van n-butanol, azijnzuur en water. De geschikte fracties werden verzameld en vervolgens onder vacuum ingedampt. Het residu werd opgelost in enkele mis water, en vervolgens ge-lyofiliseerd.

Opbrengst: 880 mg (68%).

35 R? = 0,25, R? = 0,35.

* £/"\ — «n 9 Π Π

Smeltpunt: 142 C; /αΛΓ = -66 (c = 0,1, DMF).

• ~ D

m) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt M: 1199 286 mg (0,4 mmol) van het in stap g) bereide penta- 8403838

•Λ V

- 18 - peptidehydrazide Glp-His-Trp-Ser-Tyr-^Hg werd opgelost in 10 ml dimethylformamide. De oplossing werd afgekoeld tot -10°C, waarna onder roeren ‘0,27 ml 6 n zoutzuur werd toegevoegd, gevolgd door de toevoeging van een geconcentreerde 5 waterige oplossing van 30,2 mg natriumnitriet en wel druppelsgewijs. Na 5 min. werd de oplossing van het trifluorace-taatzout van 258 mg (0,4 mmol) van het bereide tetrapeptide H-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt in 1 ml dimethylformamide met 0,27 ml triethylamine bij -10°C toegevoegd. Indien noodzakelijk 10 werd het reactiemengsel op een neutrale pH-waarde gebracht met behulp van triethylamine, waarna het reactiemengsel gedurende 1 uur bij een temperatuur van -5°C werd geroerd, en gedurende 1 uur bij 0°C en vervolgens gedurende 12 uren bij kamertemperatuur.

S

15 Het dimethylformamide werd onder vacuum geëlimineerd, waarna het olieachtige residu werd opgelost in 5 ml 0,2 n azijnzuur en de oplossing werd onderworpen aan chromatogra-fie op een Sephadex G-25 kolom (2 x 95 cm) met 0,2 n azijnzuur. De geschikte fracties werden verzameld en gelyofili-20 seerd. Opbrengst? 298 mg (62%).

R* = 0,39, = 0,13, Rjj = 0,48, R^ = 0,14.

Aminozuuranalyset

Ser 0,89, Glu 1,98, Pro 0,97, Leu 1,00, Tyr 1,03, Phe 0,99, His 1,01, Trp 0,91.

25 VOORBEELD VII

Bereiding van Trp7, Gin®, desGly^-gonadoliberine- ethylamide_- _

Mi 1220 a) Boc-Gln-Pro-NHEt 30 M: 370 1,0 g (7 mmol) proline-ethylamide werd opgelost in 15 ml dimethylformamide, waarna de pH werd afgesteld op een waarde van 8 met behulp van triethylamine, gevolgd door toevoeging aan de oplossing van 3,2 g (8,4 mmol) tert.-butyloxy 35 -carbonyl-glutaminyl-p-nitro-fenylester in 15 ml dimethylformamide. Het reactiemengsel werd gedurende 48 uur bij kamertemperatuur geroerd, waarna de pH-waarde van tijd tot tijd werd afgesteld op een waarde van 8 met behulp van triethylamine. Na indampen van het reactiemengsel werd het 8403888 ♦ - 19 - olieachtige residu opgelost in water, met ether gewassen, waarna de afgezonderde waterfase onder vacuum werd ingedampt en gedroogd. Opbrengst: 1,93 g (74,5 %). r| = 0,76.

5 b) H-Gln-Pro-NHEt.TFA

Ms 270 (vrije base) M: 367 (TFA zout) 1,9 g (7,2 mmol) Boc-Gln-Pro-NHEt werd opgelost in 10 ml trifluorazijnzuur en vervolgens gedurende 20 min. bij kamertemperatuur geroerd. De oplossing werd onder vacuum 10 ingedampt, waarna het residu met ether werd behandeld, gefiltreerd en onder vacuum gedroogd. Opbrengst: 1,52 g (58%).

Rf = 0,45, = 0,45, Rf = 0,25, Rf° = 0,30.

Hygroscopisehe stof - -34,8° (c = 1, MeOH).

15 c) Boc-Trp-Gln-Pro-NHEt

Ms 557 500 mg (1,85 mmol) H-Gln-Pro-NHEt werd opgelost in 10 ml dimethylformamide. De pH-waarde werd met triethylamine afgesteld op 8, waarna 608 mg (2 mmol) tert.butyloxy-carbo-20 nyl-tryptofaan in 10 ml dimethylformamide en 620 ^ul. (4 mmol) N ,N'-diisopropylcarbodiimide werden toegevoegd. Het reactiemengsel werd gedurende 48 uur bij kamertemperatuur geroerd en vervolgens onder vacuum ingedampt. Het residu werd opgelost in ethylacetaat en vervolgens met ether ver-25 dund. Het neergeslagen Boc-Trp-Gln-Pro-NHEt werd afgefil-treerd, met ether gewassen en gedroogd. Opbrengst: 740 mg (72%).

r| = 0,75, R^ = 0,38.

d) H—Trp-Gln—Pro-NHEt.TFA 30 Ms 456,5 (vrije base) M: 554 (TFA zout) 700 mg (Ir,25 mmol) Boc-Trp-Gln-Pro-NHEt werd opgelost in 15 ml van een 1:1 mengsel van trifluorazijnzuur en CH Cl 2 2 en vervolgens bij kamertemperatuur gedurende 20 min. geroerd. Dan werd de oplossing onder vacuum ingedampt, 35 waarna het residu met ether werd behandeld. Het vaste residu werd afgefiltreerd en gedroogd. Het aldus verkregen ruwe produkt van ca. 500 mg werd via chromatografie op een sili-cagelkolom gezuiverd onder gebruikmaking van een mengsel van 47:20s6sll van ethylacetaat, pyridine, azijnzuur en water.

8403888 9 - 20 -

De geschikte fracties werden verzameld, onder vacuum tot drogen ingedampt, waarna het residu met ether werd behandeld. Er werd 360 mg (52%) van een wit poeder verkregen.

= 0,46, R* = 0,18.

5 Smeltpunt: 119-123°C;/bj^° = -4,8°(c = 0,1, 0,1 n HC1).

e) Boc-Gly-Trp-Gln-Pro-NHEt M: 613,7 350 mg (0,76 mmol) H-Trp-Gln-Pro-NHEt werd opgelost 10 in dimethylformamide gevolgd door koppelen met 104 mg (0,8 mmol) Boc-Gly volgens stap c) van voorbeeld VII. Hierbij werd 375 mg (81%)van een kristallijne stof verkregen.

R? = 0,88, R* = 0,82, R6 = 0,61. f f f

f) H-Gly-Trp-Gln-Pro-NHEt.TFA

1.5 M: 609,6 375 mg (0,6 mmol) Boc-Gly-Trp-Gln-Pro-NHEt werd gede-protected en gezuiverd volgens stap d) van voorbeeld VII. Hierbij werd 285 mg (76,6%) van een wit poeder verkregen.

R? = 0,08, Rl = 0,16, R? = 0,67, R* = 0,28.

f f f f 20 g) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Gln-Pro-NHEt M: 1216,4 286 mg (0,4 mmol) van het pentapeptidehydrazide Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N^ werd gekoppeld met 243,8 mg (0,4 mmol) H-Gly-Trp-Gln-Pro-NHEt.TFA, zoals verkregen volgens 25 stap m) van voorbeeld VI. Hierbij werd 252,9 mg (52% van een zuivere stof verkregen.

R* = 0,26, R^ = 0,32.

Aminozuuranalyse:

Ser 0,87, Glu 2,02, Pro 0,91, Gly 1,00, Tyr 1,12, His 30 1,05, Trp 1,80.

VOORBEELD VIII

Bereiding van injecties voor intramusculaire, subcutane of intraveneuze toediening_ a) Het gonadoliberinederivaat van formule 1 werd op-35 gelost in gedestilleerd water, een fysiologische zoutoplossing of gebufferde waterige oplossing in een concentratie van 1-10 mg/ml. De oplossing werd gefiltreerd tot steriele kleine porties van 50-500 ^ug van het werkzame bestanddeel erin, die vervolgens werden overgebracht in ampullen 8403888 -i. .τ* - 21 - * gevolgd door lyofiliseren, waarna de ampullen werden afgesloten. Het actieve bestanddeelgehalte van de ampullen werd vers opgelost alvorens de behandeling door toevoeging van 1-10 ml gedestilleerd water, waarna een volume, 5 overeenkomend met de gewenste dosis, werd toegediend.

b) 20-500 ^ug/ml van een gonadoliberinederivaat met formule 1 werd opgelost in een waterige oplossing van 0,9%

NaCl en 0,9% benzylalcohol. De porties van 20-500 ^ug/ml werkzaam bestanddeel erin werden overgebracht in ampullen, 10 die vervolgens werden afgesloten. De verkregen oplossingen werden rechtstreeks ingespoten.

8403888

Claims

1. Gonadoliberinederivaten met de algemene formule 1 Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X^-X2“X3-Pro-X4 1) waarin X^ = een glycylgroep of een D-isomeer van elke 5 willekeurige natuurlijke of synthetische aminozuurgroep, X2 = een L-aminozuurgroep met 1-4 koolstofatomen in de zijketen, L-fenylalanyl of L-tryptofylgroep, X^ = een L-aminozuurgroep met een C^_4 alkyl of alkanoylamidezijketen en

2. Glp-Hi s-Trp-Se r-Tyr-Gly-Phe-Gln-Pro-Gly-NH2 Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Phe-Leu-Pro-Gly-NH2 Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-EA Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Gln-Pro-EA alsmede de therapeutisch bruikbare zouten en .complexen er-25 van.

2. Een verbinding gekozen uit de groep: Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-Gly-ïö^ Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Gln-Pro-Gly-NH^ Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Leu-Pro-EA

3. Werkwijze.voor de bereiding van gonadoliberinederivaten met de algemene formule 1 Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X1-X2-X3-Pro-X4 1) waarin

30 Xi - een glycylgroep of een D-isomeer van elk natuurlijk of synthetische aminozuurgroep, ‘ X3 - een L-aminozuurgroep met 1-4 koolstofatomen in de zijketen, L-fenylalanyl of L-tryptofylgroep, X3 = een L-aminozuurgroep met een C^_4 alkyl 35 of C2_4 alkanoylamidezijketen, en X4 = een glycine-amide of een C^_4 alkylamide-groep onder voorbehoud, dat wanneer X^ een andere groep 8403888 « - 23 - dan glycyl is en X2 een tryptofylgroep voorstelt dan mag X3 geen leucyl zijn, alsmede therapeutisch bruikbare zuuradditiezouten en complexen ervan, met het kenmerk, dat 5 a) gebruik wordt gemaakt van de methode van vaste fase peptidesynthese, waarbij de geschikt beschermde aminozuren worden gekoppeld in de vereiste volgorde aan een vaste polymeerdrager en met behulp van carbodiimide of actieve ester en in gegeven geval de gerede peptide wordt afge-10 splitst van de drager door acidolyse of aminolyse en desgewenst de beschermde groepen van de aminozuren worden verwijderd van de peptide simultaan, voor of na afsplitsing van de peptide van de polymeerdrager of b) het gewenste eindprodukt wordt opgebouwd uit de 15 geschikt beschermde aminozuren door gebruikmaking van een geschikte combinatie van fragmentcondensatie en trapsgewijs synthese, afhankelijk van het chemische karakter van de variabele aminozuurcomponenten.

4. Werkwijze volgens conclusie 3/a, met het 20kenmerk, dat benzhydrylamine of Boc-prolinehars wordt gebruikt als vaste drager.

5. Werkwijze volgens conclusie 3/a, met het kenmerk , dat de beschermde peptide wordt geëlimineerd van de hars door behandeling met waterstoffluoride en/of 25 door ethylammonolyse.

6. Werkwijze volgens conclusie 3/b, met .het kenmerk, dat een pentapeptide-azide met formule 2 Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N3 2) wordt gecondenseerd met een tetra- of pentapeptide met de 30 gemene formula 3 X,-Χ,,-Χ,-Pro-X. 3) 12 3 4 waarin X^, X^, X3 en X^ de in conclusie 1 gedefinieerde betekenissen hebben.

7. Werkwijze volgens conclusie 3/b, m e t h e t 35 kenmerk , dat een hexapeptide-azide met de algemene formule 4 Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X^-^ 4) wordt gecondenseerd met een tri- of tetrapeptide met de algemene formule 5 8403038 ·»-/ w - 24 - X2-X3-Pro-X4 5) waarin X^, X2, X3 en X4 de in conclusie 1 gedefinieerde betekenissen hebben.

8. Werkwijze volgens conclusie 3/b, met het 5kenmerk, dat een heptapeptide-azide met de algemene formule 6 Glp“His-Trp-Ser-Tyr-X^-X2-N3 6) wordt gecondenseerd met een di- of tripeptide met de algemene formule 7

9. Farmaceutisch preparaat met daarin als werkzaam bestanddeel ten minste één verbinding met de algemene formu- 15 le 1, waarin X^, X2, X3 en X4 de in conclusie 1 gedefinieerde betekenissen hebben of een farmaceutisch aanvaardbaar zout of complex ervan, te zamen met een drager of verdunningsmiddel.

10. Werkwijze voor de bereiding van een farmaceutisch 20 preparaat, met het kenmerk, dat een verbinding met de algemene formule 1, waarin X^, X2, X3 en X4 de in conclusie 1 gedefiniëerde betekenissen hebben, of een farmaceutisch aanvaardbaar zout of complex ervan wordt gemengd met een gebruikelijke farmaceutische drager of verdun-25 ningsmiddel.

10 X3-Pro-X4 7) waarin X^, X2, X3 en X4 de in conclusie 1 gedefinieerde betekenissen hebben.

10 X4 * een glycine-amide of een C^_4 alkylamide- groep onder voorbehoud, dat wanneer X^ een andere groep dan glycyl voorstelt en X2 een tryptofylgroep dat dan X3 geen leucyl kan zijn, alsmede de zuuradditiezouten, gevormd met therapeutisch 15 bruikbare zuren en complexen daarvan.

11. Verbinding volgens conclusie 1 of 2 .zoals in hoofdzaak hiervoor beschreven, in het bijzonder refererend aan de voorbeelden.

12. Werkwijze volgens in de voorgaande conclusies 3-8 30 zoals in hoofdzaak hiervoor beschreven met bijzondere verwijzing naar de voorbeelden.

13. Preparaat volgens conclusie 9 zoals in hoofdzaak hiervoor beschreven.

14. Werkwijze volgens conclusie 10 zoals in hoofdzaak 35 hiervoor beschreven. 8403888