CS246162B1 - Peptid s aktivitou hormonu uvolňujícího luteinizační a folikuly stimulující hormon - Google Patents

Abstract

Peptid s aktivitou hormonu uvolňujícího luteinizační a folikuly stimulující hormon (LH/RH) obecného vzorce < Glu-Hi a-Trp-Se r-Ty r-D-p-Et-Phe-Leu-Arg'2 3 4 5 6 7 8 -Pro-Gly-NHg 9 10 a jeho farmaceuticky použitelné adiční soli s organickými kyselinami. Tento peptid s aktivitou LH/RH se používá jako prostředek k synchronizaci říje při průmyslovém chovu noépodářskýoh zvířat a taká k diagnostickým a terapeutickým účelům. Je mnohem účinnější a déle působící než původní hormon uvolňující luteinizační a folikuly stimulující hormon, luliberin.

Description

(54) Peptid s aktivitou hormonu uvolňujícího luteinizační a folikuly stimulující hormon

Peptid s aktivitou hormonu uvolňujícího luteinizační a folikuly stimulující hormon (LH/RH) obecného vzorce < Glu-Hi a-Trp-Se r-Ty r-D-p-Et-Phe-Leu-Arg'2 3 4 5 6 7 8

-Pro-Gly-NHg

10 a jeho farmaceuticky použitelné adiční soli s organickými kyselinami.

Tento peptid s aktivitou LH/RH se používá jako prostředek k synchronizaci říje při průmyslovém chovu noépodářskýoh zvířat a taká k diagnostickým a terapeutickým účelům. Je mnohem účinnější a déle působící než původní hormon uvolňující luteinizační a folikuly stimulující hormon, luliberin.

Vynález se týká peptidů s aktivitou hormonu uvolňujícího luteinizační a folikuly stimulující hormon (LH/HH) obecného vzorce I ^Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-p-Et-Phe-Leu-Arg-Pro-Gly-NHg 12 345 6789 10 a jeho farmaceuticky použitelné adiční soli s organickými kyselinami.

Peptid vzorce I je analog přírodního hormonu uvolňujícího luteinizační a folikuly stimulující hormon, tzv. luliberinu: předčí jej vyšší účinností na tvorbu a uvolňování luteinizačního hormonu (LH) a folikuly stimulujícího hormonu (FSH) s prodlouženou dobou působení. Peptid obecného vzorce I podle vynálezu je určen k synchronizaci oestru (říje) hospodářských zvířat a rovněž k diagnostickým a terapeutickým účelům v humánní medicíně,

K praktickému použití v uvedených indikacích jsou žádoucí látky účinnější, v organismu stálejSí a tedy protrahovaně působící. Strukturní obměny luliberinu sice zpravidla vedly k látkám méně účinným, nicméně se podařilo náhradou glycinu v poloze 6 aminokyselinového sledu luliberinu některými D-aminokyselinami dosáhnout zvýšení účinností. /A. Arimura a sp.: Endocrinology 95. ’ *74 (1974), J. A. Vilchez - Martinez a sp.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 59. 1 226 (1974), DE DOS č. 2 625 843 j D. H, Coy, A. V. Schally: Aniraals of Clinical Res. ia, 139 (1978)/.

Požadavkům na vySSí aktivitu a delší působení než má přírodní hormon vyhovuje peptid s aktivitou LH/RH podle vynálezu, výše uvedeného obecného vzorce I.

Aktivita a prodloužený účinek látky podle yynálezu byly srovnávány s farmakologiokými standardy /A. Arimura a sp.: Endocrinology 22» ' '14 (1974)/. Testování hladiny LH bylo provedeno pomocí techniky RIA s ovčími protilátkami, kde jako referenční sloučenina sloužil standard amerického ústavu National Institute of Artritis, Metabolism and vDigestion Diseases - krysí LH/RP,. Statistická kontrola výsledku dosaženého pomooí t-testu byla provedena podle Studenta, popř, podle Welcha a výpočet koeficientu aktivity podle Borth a sp.: Arch. Gynac. 188. 497 (1957).

Podle výše popsaných pokusných stanovení na krysách, jimž bylo subkutánně podáno 50 ng, popřípadě 250 ng sloučeniny, byl prokázán silný účinek na uvolňování LH s maximem mezi 1 a 2 hodinou, přičemž ještě po 6 hodinách byla pozorovatelná značná aktivita Naproti tomu stejné dávce peptidů s aktivitou LH/RH podle vynálezu (50 ng, 250 ng, subkutánně) bylo dosaženo maxima účinku po 20 minutách a po 1 hodině už nebyla registrována žádná aktivita proti srovnávací skupině. Pro různé skupiny bylo vypočítáno, že poměr účinnosti standardu (LH/RH) a peptidů s aktivitou LH/RH podle vynálezu během 6 hodin od doby podání odpovídá při dávce 50 ng asi 31 násobnému zvýěení, při dávce 250 ng asi 43násobnému zvýšení.

Peptid s aktivitou LH/RH podle vynálezu lze syntetizovat známými metodami, například kondenzací na polymerních nosičích, jak bylo popsáno v NDR patentovém spise číslo 135 078 nebo v čs. AO č. 230 614.

Peptidy s aktivitou LH/RH podle vynálezu byly připraveny metodou v pevné fázi. Tripeptid ζ Glu-His-Trp byl připraven postupnou výstavbou na vhodném nosiči, odštěpem z pryskyřice a kondenzován na pryskyřici obsahující heptapeptid Ser-Tyr-D-p-Et-Phe-Leu-Arg-Pro-Gly, případně hexapeptid Ser-Tyr-D-p-Et-Phe-Leu-Arg-Pro, připravený též postupnou výstavbou na vhodném nosiči. Po odštěpení peptidů z nosiče a odštěpení chránících skupin působením kapalného fluorovodíku se získá relativně čistý produkt ve vysokém výtěžku.

Výstavba peptidů s aktivitou LH/RH probíhá na polymerních nosičích známého typu, jejichž základní skelet sestává ze sesílovaných polystyrénových uhlovodíků. Vhodnými metodami se zavádějí do polymeru aktivní centra, na nichž je navázána C-terminální chráněná aminokyselina nebo odpovídající di- nebo tripeptid, který představuje základ pro dalěí výstavbu peptidu. Jako reaktivních center se výhodně používá benzhydrylaminonebo chlormetylskupiny. Příprava peptidů s aktivitou LH/RH podle vynálezu sestává z několika dílčích stupňů.

Na benzhydrylaminovou pryskyřici se zakotví aminokyselina glycin ve vhodně chráněné formě s použitím známých kondenzačních metod, s výhodou dicyklohexylkarbodiimidové metody nebo metody symetrických anhydridů a postupně se stejnou metodou připojí vhodně chráněné aminokyseliny Pro, Arg, Leu, D-p-Et-Phe, Tyr a Ser nebo odpovídající fragmenty peptidů ve vhodně chráněné formě.

Při výstavbě zkrácené sekvence

Ser-Tyr-D-p-Et-Phe-Leu-Arg-Pro se naváže vhodně chráněný. Pro známými způsoby na chlormetylovanou pryskyřici a ostatní deriváty aminokyselin nebo odpovídající peptidové fragmenty se postupně připojí ve vhodně chráněné formě.

Tripeptid < Glu-His-Trp se vystaví na chlormetylované pryskyřici, přičemž Trp se ve vhodně chráněné formě připojí např. metodou česné soli apod. Ostatní aminokyseliny His a < Glu se postupně připojí v chráněné formě s použitím výěe uvedených kondenzačních metod. Tripeptid se uvolní z nosiče a kondenzuje s chráněným heptapeptidem, vázaným na benzhydrylaminovou pryskyřici, popřípadě s hexapeptidem, vázaným na chlormetylované pryskyřice. Peptidy s aktivitou LH/RH podle vynálezu se odětěpí z nosiče za současného odštěpení chránících skupin pomocí kapalného fluorovodíku nebo odštěpením peptidu známým způsobem, s výhodou amonolýzou a závěrečným odštěpením skupin, chránících postranní řetězce, s výhodou kapalným fluorovodíkem.

Takto získané peptidy s aktivitou LH/RH mají již obsah 70 až 80 % hmot.. Pro použití ve veterinární praxi stačí jedna čistící operace, například srážení ve formě rozpustné adiční soli s kyselinami a závěrečné uvolnění pomocí iontoměniče. Získá se tak biologicky vysoce aktivní preparát.

Pro diagnostické a terapeutické účely se pak provádí další čisticí operace, například čištění sloupcovou chromatografii.

V následujícím schématu je blíže objasněna syntéze peptidů a aktivitou LH/RH podle vynálezu:

+ Boc-His * Glu

Gly-NH- (?) + Boc-Pro + Boc-ArgdíOg) <Qlu-Hi₃-Trp-(F) (Glu-His-Trp-OH

+ Boc-Leu + Boc-D-pEt-Phe + Boc-Tyr(Bzl) + Boc-Ser(Bzl)

Se r(Bzl)-Ty r(Bzl)-D-pEt-Phe-Leu-Arg(NOg)-Pro-Oly-NH-(Ť)

7. Glu-Hi s-T rp-Se r(Bzl)-Ty r(Bzl)-D-pEt-Phe-Leu-Arg(NOg) -Pro-Gly-NH-/Pj + HF

V

LH/RH analog

Aminokyseliny obsahující funkční skupinu v postranním řetězci se při syntéze vhodně chrání, zejména pomocí skupin, které lze snadno odštěpit hydrolýzou, redukcí nebo pomocí kapalného fluorovodíku, přičemž se používá skupin známých při syntéze peptidů, jako je například benzyl-, ρ-chlorbenzyl-, 2,6-dichlorbenzyl-, ρ-nitrobenzyl-, p-metoxybenzyl-, benzhydryl-, terč.butyl.-, tosyl-, dinitrofenyl- a nitroskupina.

Jako chrániči skupiny pro aminoskupiny lze použít alifatické oxykarbonylové skupiny, jako například cyklohexyloxykarbonyl-, adamantyloxykarbonyl- a především terc.butyloxykarbonylovou skupinu (Boc-), nebo karbobenzoxyskupiny substituované v aromatickém jádře (např. karbobenzoxy-, p-brom- nebo chlorkarbobenzoxy-, p-metoxykarbobenzoxyskupina), dále o-nitrofenylsulfenyl- a popřípadě substituované aralkylskupiny (např. di- nebo trifenylmetylskupiny).

K odštěpeni skupin chránících alfa-aminoskupiny v průběhu syntézy se používá přednostně kyselina trifluoroctová, kyselina trifluoroctová v dichlormetanu, chlorovodík v ledové kyselině octové nebo dioxanu. Jiná štěpící činidla a podmínky pro odštěpování specifických chránících skupin jsou popsány v publikaci E. Schroeder a K. Lubke, The Peptides I, Academie Press, '965, str. 72 až 75.

Po provedení syntézy může být peptid odštěpen z pdlymerního nosiče známým způsobem, s výhodou bromovodíljem v ledové kyselině octové, alkoholýzou, hydrazinolýzou, hydrogenolýzou, amonolýzou nebo kapalným fluorovodíkem s přídavkem anisolu nebo merkaptoetanolu.

Následující příklady provedení způsob podle vynálezu pouze dokládají, ale nikterak neomezují.

Příklad 1 g benzhydrylaminové pryskyřice (vyrobené podle I. Rivier a sp., J. Med. Chem. £6,

545 ('973), případně P. Pietta a sp., J. Org. Chem. 22» 44 ('977)) bylo kondenzováno β 5,3 g Boc-Gly v metyleňohloridu pomocí 6,2 g dicyklohexylkarbodiimidu. Obeah Gly činil

0,96 mmol/g pryskyřice. Pro postupnou výstavbu heptapeptidu byly použity následující deriváty aminokyselin! Boc-Pro, Boc-ArgíNOg), Boc-Leu, Βοο-ϋ-pEt-Phe, Boc-Tyr, Boc-Ser(Bzl)

Chráněné aminokyseliny byly kondenzovány v trojnásobném přebytku vzhledem k C-terminálnímu Gly metodou symetrických anhydridů. Postupná výstavba heptapeptidu byla provedena podle následujícího programu:

1. 3 x 80 ml metylenchloridu (po 3 minuty)

2. 3 x 80 ml dioxanu (3 minuty)

3. 1 x 80 ml 4 N roztoku kys. chlorovodíkové v dioxanu (10 minut)

4. 1 x 80 ml 4 N roztoku kys. chlorovodíkové v dioxanu (25 minut)

5. 3 x 60 ml dioxanu (3 minuty)

6. 3 x 80 ml metylenchloridu (3 minuty)

7. 3 x 80 ml směsi chloroform:metanol 2:1 (3 minuty)

8. 3 x 80 ml chloroformu (3 minuty)

9. 2 x 80 ml směsi chloroform:trietylamin 9:1 (5 minut)

10. 3 x 80 ml chloroform (3 minuty)

11. 3 x 80 ml metylenchloridu (3 minuty)

12. 1 x 80 ml symetrického anhydridu přisluSné chráněné aminokyseliny (kondenzační doba do negativního ninhydrinového testu)

13. 3 x 80 ml eměsi metanol:metylenchlorid (3 minuty)

Bylo získáno 18 g Boc-SerfBzD-D-pEt-Phe-Leu-ArgOIC^-Pro-Gly-NH-@

Příklad 2 g Boc-Trp-O- který byl připraven esterifikací chlormetylovaného polymerního nosiče (obsah Cl 7 %) s česnou solí Boe-Trp (obsah Trp 0,91 mmol Trp/g polymeru) byly kondenzovány postupně s BocrHis a Glu metodou symetrických anhydridů podle programu uvedeného v příkladu 1.

Bylo získáno 3,45 g <Glu-His-Trp-O-®. Odštěpení peptidu z pryskyřice bylo provedeno podle Sakakibary; 1 g tripeptidpolymeru byl suspendován v 15 ml fluorovodíku a 1,5 ml anisolu při 0 °C po dobu 30 minut. Po oddestilování fluorovodíku byl odparek promet éterem, rozpuštěn v 1 Sfc kyselině octové a byl převeden na acetát pomocí iontoměniče (Wofatit AD-41 v acetátovém cyklu). Lyofilizaci bylo získáno 220 mg Glu-His-Trp-OH ve formě acetétu.

Příklad 3 ζGlu-His-N₂Hj (vyrobený podle Gillesen a sp., Helv. Chim. Acta £1, 60 (1970)) byl kondenzován azidovou metodou s Trp(OBzl) podle US pat. č. 3 888 838 za vzniku < Glu-His-Trp-OBzl. Produkt byl pak hydrogenován podle Sievertsson a sp.: J. Med. Chem. iž, 222 (1972) za přítomnosti katalyzátoru paladium/síran barnatý.

Příklad 4 g Ser(Bzl)-Tyr-D-p-Et-Phe-Leu-ArgdíOgJ-Pro-Gly-NH-® , získaného podle příkladu 1 byl kondenzován v dimetylformamidu s 2,88 mmol ζ Glu-His-Trp-OH, který byl připraven podle příkladu 2 nebo 3j jako kondenzační činidlo bylo použito 2,88 mmol dicyklohexylkarbodiimidu. Po promytí dimetylformamidem, směsí chloroform:metanol 2:1, metylenchloridem a metanolem bylo získáno 1,2 g produktu.

1,2 g dekapeptidpolymeru bylo suspendováno podle Sakakibary v 15 ml fluorovodíku a 1,5 ml anisolu (nebo merkaptometanolu) 1 hodinu při 0 °C. Po oddestilování fluorovodíku byl zbytek promyt eterem a rozpuštěn v 1% kyselině octové. Iontoměničem (tfofatit AD 41) byl produkt převeden na dekapeptidacetát a lyofilizován. Bylo získáno 334 mg analogu LH/RH uvedeného vzorce I v diacetátové monohydrátované formě.

Příklad 5

250 mg 4, Glu-Hia-Trp-Ser-Tyr-D-p-Et-Phe-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ bylo při čištění rozpuštěno v 10 ml vody β 0,25 ml kyseliny octová a sraženo pomocí 25 ml nasyceného roztoku kyseliny stifnové (1,3-dihydroxy-2,4,6_trinitrobenzen). Sraženina byla promyta roztokem kyseliny stifnové, rozpuštěna ve směsi acetonsvoda 1:' a převedena iontoměničem (Wofatit AD 41, v acetátové formě) na analog LH/RH v diacetétové formě. Po lyofilizaci bylo získáno 188 mg čistého produktu výše uvedeného vzorce.

příklad 6

1,0 g analogu LH/RH získaného podle příkladu 5 pro diagnostické a terapeutické účely, bylo chromatografováno gradientovou elucí s pufrem trietylamin:kyselina octová (0,01/0,4 m pH 4,5) na karboxymetylcelulose (velikost sloupce 2 χ 30 cm). Detekce byla provedena UV měřením při 278 nm a čistota byla sledována tenkovrstvou chromatografií (soustava I : chloroform : metanol ; 30% kyselina octové 60 : 45 : 20; soustava II: n-butanol : kyselina octové : voda 4:1 : 5). Produkt byl získán v diavetátové formě.

Výtěžek: 0,638 g analogu LH/RH,_nnl ⁼ -60,3° -0,5 (c = 1,1, kyselina octové),

Hodnota Rj. při tenkovrstvé chromatografií: Soustava I: 0,49

Soustava II: 0,13.

Aminokyselinová analýza:

Olu-Hi s-Trp-Ser-Tyr-D-p-Et-Phe-Leu-Arg-Pro-Gly teorie: 11111 11111 nalezeno:/1,0/ 1,02 0,97 0,85 0,98 1 ,01 1,0 1,04 1,0 1,02,

Vysvětlivky ke zkratkám použitým v textu:

< Glu	pyroglutamová kyselina
His	histidin
Trp	tryptofan
Ser	serin
Tyr	tyrosin
Et	etyl
Phe	fenylalanin
Leu	leůcin
Arg	arginin
Pro	prolin
Gly	glycin
Boc	terč,butyloxykarbonyl
Bzl	benzyl
HF	fluorovodík

RIA radioimmunoanalýza

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Peptid s aktivitou hormonu uvolňujícího luteinizační a folikuly stimulující hormon vzorce I

   4Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-p-Et-Phe-Leu-Arg-Pro-Gly-NHg (I) a jeho farmaceuticky použitelné adiční soli s organickými kyselinami.