CS232977B1 - Způsob výroby gonadorelínu - Google Patents

Abstract

Vynález se týká výroby gonadorelinu vzorce který se označuje též jako faktor pro uvolňování luteinizačního a folikuly stimulujícího hormonu nebo LH/ρτ, apod. Taktika nové syntézy vychází z nového reakčního schématu 3 + (2+5), který byl vybrán pro zřetelné odliáný charakter tripeptidu 1-3 od zbytku molekuly gonadoree· linu.

Description

Vynález se týká způsobu výroby gonadorelinu, označovaného též jako faktor pro uvolňování luteinizačního a folikuly stimulujícího hormonu nebo LH/RH apod. Gonadorelin byl izolován z vepřového hypotalamu, jeho konstituci zjistil Schally se sp. (Biochem, Biophys. Res. Commun. li. 393 a 1334, 1971) a navrhl strukturu dekapeptidamidu vzorce I

23456789 10 pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NHg (I), které byla potvrzena porovnáním biologických účinků syntetické látky s účinky látky získané z přírodního materiálu.

Od objevu Schallyho vzrůstá zájem o gonadorelin v souvislosti s rozšiřujícími se možnostmi jeho praktického využití v humánní i veterinární medicíně (při léčení neplodnosti a v diagnostice), zejména však v živočišné výrobě při synchronizaci říje skotu, prasat, a ovcí, při zvyšování produkce ryb, drůbeže apod.

Pro přípravu této poměrně komplikované sloučeniny byly hledány co nejefektivnšjší syntézy, jak o tom svědčí mnoho publikací v odborné i patentové literatuře. Především byly sledovány dvě základní možnosti syntetického přístupu, a to základní klasická syntéza v roztoku a různé modifikace syntézy v pevné fázi (R. Geiger se sp., Biophys. Res. Commun. & (3), 767 (1971)i N. Yanaihara se sp., J. Med. Chem. J6 (4), 373, (1973);

T. Fuji se sp., Bull. Chem. Soc. Jpn. 49. 1595 (1976).

Jednotlivé postupy se liší především tzv. strategií nebo taktikou syntézy. Některé používají postupnou výstavbu peptidiokého řetězce, jiné spojují peptidické fragmenty podle různých schémat, například 2 + 8, 3 + 7 nebo 6+4 apod.

Molekula gonadorelinu obsahuje šest třífunkčních aminokyselin, což poskytuje mnoho možností pro charakter a počet vhodných chránících skupin při přípravě výchozích derivátů aminokyselin a potřebných peptidickýoh fragmentů (meziproduktů). Většinu publikovaných postupů pak charakterizuje snaha co nejvíce omezit použití chránících skupin a tím zjednodušit syntézu.

Velký počet autorů preferuje syntézy v pevné fázi (H. Sievertson se sp., J. Med. Chem. 22 (3). 222 (1972); W. H. Arnold se sp., J. Med. Chem. 16 (9), 1054 (1973)). V některých pracech se přímo porovnávají výtěžky a celková efektivnost klasické syntézy a syntézy v pevné fázi (G. Flouret se sp., J. Med. Chem. 16 (4), 369 (1973))· Jiní autoři obě metody více nebo méně úspěšně kombinují (L. Bilk se sp., Mh. Vet.-Med. 34 606 (1979)), například spojováním fragmentů podle schématu 3 + 7, přičemž heptapeptid se získává syntézou v pevné fázi. Souhrnně z literatury vyplývá, že předností syntézy v pevné fázi je velká úspora času a relativně vysoká výtěžnost. Naproti tomu poskytují klasické syntézy sice poněkud nižší výtěžky, ale čistota konečného produktu bývá vyšší, takže při jeho zpracování na kvalitu použitelnou pro farmaceutické účely bývají ztráty již relativně menší.

Při hledání nového v průmyslovém měřítku použitelného způsobu výroby gonadorelinu bylo nutno respektovat především hledisko maximální efektivnosti. Z tohoto hlediska byly proto podrobeny kritickému rozboru všechny dosud publikované syntézy. Na základě výběru nejvhodnějších poznatků, doplněných novými původními postupy, se podařilo vypracovat novou strategii syntézy gonadorelinu, která je předmětem tohoto vynálezu. Je pronikavě efektivnější než jiné dosud známé syntézy: je velmi rychlá, s malými nároky na pracnost a materiálové náklady, poskytuje velmi čistý, homogenní produkt, který lze jedinou operací, například preparativní HPLC, snadno a s minimálními ztrátami vyčistit do kvality žádoucí pro farmaceutické použití (chromatograficly čistá látka). Syntézu lze realizovat v běžném zařízení, ve velkých šaržích.

Vynález se tedy týká způsobu výroby gonadorelinu výše uvedeného vzorce I, jehož podstata spočívá v tom, že se tripeptid 1 - 3 ve formě hydrazidu vzorce II

3 p-Glu-His-Trp-N₂H₃ (II), uvádí v reakci s heptapeptidamidem 4-10 vzorce III

5 6 7 8 9 10

Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-NH₂ (III), připraveným kondenzací pentapeptidamidu 6 - 10 vzorce IV

7 6 9 10

Gly-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-NH₂ (IV), s hydrazidem chráněného dipeptidu 4-5 vzorce V

Z-Ser-Tyr-KgH^ kde Z je chránící skupina například benzyloxykarbonylová, načež se ze získaného chráněného dekapeptidamidu odstraní chránící tosylskupina.

Taktika syntézy při výrobě gonaóorelinu podle vynálezu vychází z nóvého reakčního schématu 3 + (2 + 5)', který byl vybrán předevSím proto, že charakter tripeptidu .1-3 vzorce II je zřetelně odlišný od zbytku molekuly. Pro jeho přípravu se podařilo vypracovat originálně modifikovaný postup, který poskytuje vysoké výtěžky.

Ve snaze vystačit s minimálním chráněním funkčních skupin choulostivých aminokyselin, tj. šeřinu a tyrosinu, bylo snahou tyto kyseliny zařadit do syntetického schématu co nejpozději a reagovat s nimi v co nejmenším počtu reakčních stupňů. Bylo tedy využito dobře charakterizovatelného dipeptidhydrazinu Z-Ser-Tyr-NgH^, který se kondenzuje azidovým způsobem s pentapeptidesterem nebo příslušným amidem 6 - 10. Za těchto podmínek je potřebné jen minimální chránění funkčních skupin, stačí pouze blokování guanidoskupiny argininu tosylem.

I

Pentapeptidester 6 - 10 se připravuje známými metodami postupnou výstavbou z karboxylového konce, s použitím jednoduchých derivátů aminokyselin, které jsou běžně dostupné.

Pro azidovou kondenzaci pGlu-His-Trp-NgH^ s HBr/Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-IiH₂.' se podařilo vypracovat modifikovaný postup (v bezvodých podmínkách), který poskytuje příslušný chráněný dekapeptid ve vysoké čistotě a s velmi dobrými výtěžky.

Tripeptidhydrazid pGlu-His-Trp-NgH^ se připravuje novým postupem, při kterém se methyl— ester pyroglutamylhistidinu získává kondenzací dicyklohexylamonné soli pyroglutamové kyseliny s dihydrochloridem methylesteru histidinu pomocí dicyklohexylícarbodiimidu v dimethylformamidu. Methylester histidinu se uvolní in šitu přidáním dicyklohexylaminu a reakce probíhá 48 h za postupného přidávání kondenzačního činidla v nadbytku (1,5 ekvivalentu). Dipeptidester se izoluje ve výtěžku nad 90 % teorie. Příslušný hydrazid pyroglutamylhistidinu se získá hydrazinolýzou 80 až 90% hydrazinhydrátem obvyklým způsobem v methanolu.

232977 4

Příprava methylesteru pyroglutamyl - hystidyl - tryptofanu znesnadňuje jeho rozpustnost ve vodě a přítomnost solí v reakění směsi. Obtíže odstraňuje nově provedená azidová kondenzace za bezvodých podmínek s 1,1 ekvivalentem butylnitritu v dimethylformamidu za přítomnosti anisolu, přičemž se k úprevě pH používá dicyklohexylaminu. Výtěžek je i v tomto případě vyěěi než 90 % teorie.

Hydrazid pyroglutamyl - histidyl - tryptofanu se získá hydrazinolýzou předchozího tripeptidesteru obvyklým postupem v methanolu nebo dimethylformamidu. Výhodou této modifikace je využití nízké rozpustnosti hydrochloridu nebo hydrobromidu dicyklohexylaminu v dimethylformamidu a z toho vyplývající snadná izolace produktů a jejich odsolení prostou filtrací reakSní směsi. Přítomnost anisolu potlačuje vznik vedlejších produktů.

Příprava pentapeptidesteru 5-10 používá běžných postupů. Ke kondenzaci sloužila modifikované metoda směsných anhydridů s pivaloylchloridem v přítomnosti pyridinu, která poskytovala vysoké výtěžky homogenních a velmi čistých produktů. Benzyloxykarbonylová skupina byla odštěpována roztokem bromovodíku v ledové kyselině octové. Jednotlivé stupně byly prováděny přímo s přísluěnými hydrobromidy a k uvolnění peptidu in šitu byl používán (podle vlastností jednotlivých produktů) bu3 H-ethylpiperidin, triethylamin nebo dicyklohexylamin.

Z parciálně chráněného dekapeptidamidu gonadorelinu bylo možno odštěpit chránící tosylskupinu celou řadou známých postupů. Z nich jako nejvýhodnější a relativně šetrné bylo zjištěno štěpení kapalným fluorovodíkem, zejména v přítomnosti ochranných látek, například anisolu, thioanisolu, thioglykolové kyseliny nebo směsi těchto látek, zaručujících zvláště šetrný průběh štěpení, bez nebezpečí štěpení peptidickýoh vazeb nebo jiných vedlejších reakcí. Volný gonadorelin se získá ve vysokém výtěžku a uspokojivé čistotě. Lepších výsledků bylo dosaženo původním postupem štěpení, který spočívá v použití kyseliny trifluormethansuifonové za přítomnosti uvedených ochranných látek (anisolu atd.) a který poskytuje stejný výtěžek produktu jako štěpení kyselinou fluorovodíkovou, navíc je však jeho velkou výhodou vyšší čistota volného gonadorelinu. Ten lze nově vypracovaným postupem v jedné operaci vyčistit pomocí HPLC na chromatograficky jednotnou čistou látku, s obsahem téměř 100 % hmot., použitelnou k farmaceutickým účelům.

Způsob podle vynálezu je blíže ilustrován následujícím příkladem provedení, který však tento způsob neomezuje na podmínky v něm uvedené.

Methylester pyroglutamyl - histidyl - tryptofanu pGlu-His-N₂H₃ (4,2 g, t.t. 242 až 244 °C) se rozpustí ve směsi dimethylformamidu (170 ml) a 8 N kyseliny chlorovodíkové v dioxanu (5,2 ml). K roztoku ochlazenému na -30 °C se přikape n-butylnitrit (1,86 ml). Po 30 min míchání za chlazení na -15 až -20 °C se pomocí dicyklohexylaminu upraví pH na hodnotu 5 až 5 a k reakční směsi se přilije roztok HCl.Trp-Otóe (3,99 g, t.t. 218 až 223 °C) a anisolu (1,7 ml) v dimethylformamidu. Po úpravě pH na hodnotu 8 až 9 pomocí dicyklohexylaminu se v míchání při 0 °C pokračuje přes noc. Po filtraci se filtráty odpaří a odparek se krystaluje ze směsi methanol (30 ml), octan ethylnatý (300 ml) a ether (100 ml). Ziská se 5,94 g (85 % teorie) chromatograficky čistého pGlu-His-Trp-OMe s t.t. 225 až 227 °C.

Hydrazil pyroglutamyl - histidyl - tryptofanu

Roztok pGlu-His-Trp-Otáe (4,0 g) v dimethylformamidu (50 ml) s přídavkem 80% hydrazinhydrátu (5 ml) se nechá stát 4 h při teplotě místnosti a přes noc v lednici (0 °C).

Po odpaření rozpouštědel se přidá methanol (30 ml) a produkt se vyloučí stáním v mrazícím boxu. Filtrací a vysušením se získá 3,8 g (95 % teorie) pGlu-His-Trp-N^H^ s t.t.

157 až 158 °C,/a/ = -20,7 ⁰ (c = 0,2; dimethylformamid).

Methylester benzyloxykarbonylseryl - tyrosinu

K roztoku benzyloxykarbonylšeřinu (22,2 g, t.t. 109 až 1 11 °C) ve směsi dimethylformamidu (50 ml) a pyridinu (8,2 ml), ochlazené na -50 °C, se přikape N-ethylpiperidin (12,7 ml) a pivaloylchlorid (11,32 ml). Po 10 min míchání se přidá roztok hydrochloridu methylesteru tyrosinu (21,4 g t.t. 189 až 194 °C) v dimethylformamidu (50 ml) a N-ethylpiperidinu (12,7 ml), pH se upraví na hodnotu 7,5 a reakční směs se nechá stát 20 h při 0 °C. Rozpouštědla se oddestilují, odparek se rozpustí v methylenohloridu (300 ml), vytřepe roztokem, 1 N kyseliny chlorovodíkové a 5% roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Azeotropickou destilací s benzenem se získá 38,6 g (100 % teorie) Z-Ser-Tyr-OMe ve formě chromatograficky čistého oleje.

Hydrazid benzyloxykarbonylseryl - tyrosinu

K roztoku Z-Ser-Tyr-OMe (38,6 g) v methanolu (460 ml) se přidá 80% hydrazinhydrát (40 ml) při teplotě místnosti. Po 1 h se přidá další podíl methanolu (300 ml) a po dalších 3 h se reakční směs uloží na 20 h při 0 °C. Filtrací a vysušením se získá 36,67 g (95 % teorie) chromatograficky čistého Z-Ser-Tyr-NgH^ s t.t. 220 až 225 °G.

^ť Q

Amid benzyloxykarbonylseryl - tyrosyl - glycyl - leucyl - N - tosyl - arginyl - prolyl - glycinu

K roztoku chromatograficky čistého Z-Gly-Leu-Arg(Tos)-Pro~Gly-NH₂ (17 g) v kyselině octové (50 ml) se přidá roztok 35% bromovodíku v kyselině octové (50 ml). Vzniklý hybrobro-., mid pentapeptidamidu se po 1 h vyeráží 1 litrem etheru, zfiltruje a vysuší. Poté se k roztoku Z-Ser-Tyr-NgH^ (9 g) ve směsi dimethylformamidu (70 ml) a 7 N chlorovodíku v dioxanu (22,3 ml), ochlazenému na -50 °C, přikape n-butylnitrit (3,66 ml). Po 15 min míchání při teplotě -10 až -30 °C se reakční směs ochladí na -50 °G a přidá se roztok hydrobromidu pentapeptidamidu v dimethylformamidu (70 ml). Pomocí N-ethylpiperidinu se ihned upraví pH reakční směsi na hodnotu 7,0 až 7,5 a uloží se na 48 h při 0 °C. Po odpaření rozpouštědel se odparek rozpustí v methylenohloridu (250 ml), vytřepe roztokem 1 N kyseliny chlorovodíkové a vodou. Azeotropickou destilací s benzenem a krystalizaci odparku ze směsi methanolu s etherem se získá 20,62 g (92 % teorie) Z-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-NH₂ s t.t. 157 °C.

Aminokyselinové složení: Ser 0,91; Tyr 1,03; Gly 1,93; Arg 1,06; Orn 0,009; Pro 1,04;

Leu 1,08.

Nalezené hodnoty elementární analýzy souhlasí s hodnotami vypočítanými.

Q

Amid pyroglutamyl - histidyl - tryptofyl - seryl - tyrosyl - glycyl - leucyl - N - tosyl - arginyl - prolyl - glycinu

Do roztoku Z-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-NH₂ (2,2 g) v kyselině trifluoroctové (30 ml) se přes promývačku obsahující anisol zavádí při teplotě 0 °C plynný bromovodík po dobu 1 h. Vysrážením etherem a vysušením v exsikétoru se získá hydrobromid heptapeptidamidu, ze kterého se odstraní hydrobromidové ionty na anexu v OH - cyklu (100 ml). Eluce se provádí methanolem. Zahuštěním a azeotropickou destilací s benzenem se získají 2,05 g látky. Poté se k roztoku pGlu-His-Trp-^H^ (0,665 g) ve směsi dimethylformamidu (7 ml), dimethylsulfoxidu (6 ml) a 2,4 N chlorovodíku v tetrahydrofuranu (35 ml), ochlazenému na -20 °C, přikape roztok n-butylnitritu (0,173 ml) v dimethylformamidu (1 ml).

Po 30 min míchání při teplotě -20 °C se pomocí triethylaminu upraví pH na hodnotu 8 až 9 a přidá se roztok dříve připraveného heptapeptidamidu v dimethylformamidu (6 ml). Po dalších 30 min míchání při teplotě -30 °G se reakční směs uloží na 20 h do lednice při 0 °C. Po filtraci x se filtrát odpaří a odparek se z roztoku v dimethylformamidu (3 ml) přesráží octanem ethylnatým (150 ml). Filtraci a vysušením se získá 2,61 g (92% teorie) chromatograficky čistého pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-NH₂ s t.t. 175 až 180 °C.

Aminokyselinové složení: Ser 0,91; Tyr 0,95; Olu 1,05; Pro 1,02; Leu 1,00; Arg 0,95;

Gly 1,95; His 1,01; Trp 0,92.

Gonadorelin

K roztoku chráněného dekapeptidamidu (10 g) v kyselině trifluoroctové (50 mg) a kyselině thioglykolové (10 ml), ochlazenému na 0 °C, se přidá kyselina trifluormethansulfonová (50 ml). Po míchání 60 min při 0 °C se reakční směs vlije do 1 litru etheru a uloží na 2 h při -20 °C. Filtrací a vysuSenlm v exsikétoru se získá 6,76 g (99%) gonado-, relinu, který se čistí preparativní kapalinovou chromatografií na koloně upraveného silikagelu (1 500 g) pomocí mobilní fáze obsahující 40 % obj. methanolu a 60 % obj. 0,2% kyseliny trifluoroctové. Odpařeníma lyo.filizací z roztoku v 50% kyselině octové se získá 7,96 g (90 % teorie) čiětěné substance amfoterní struktury. Čistota látky byla ověřena kapalinovou chromatografií (2 systémy) a elektroforézou na papíře (2 pufry). Aminokyselinové složení: Ser 0,93; Tyr 0,98; Glu 1,03; Pro 1,02; Leu 1,00; Arg 0,97;

Gly 1,95; His 1,01; Trp 0,96. Nalezené hodnoty elementární analýzy souhlasí s hodnotami vypočítanými.

Vysvětlení k celé PV:

HPLC ........vysokotlaká kapalinové chromatografie

Claims (2)

1. Způsob výroby gonadorelinu vzorce I

1 23456789 10 pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NHg vyznačující se tím, že se trípeptid 1 - 3 ve formě hydrazidu vzorce II

1 2 3 pGlu-Ηί s-Trp-NgHj uvádí v reakci s heptapeptidamidem 4—10 vzorce III

4 5 6-7 8 910

Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-KH^ připraveným kondenzací pentapeptidamidu 6-10 vzorce IV

678 9 10 Gly-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-NHg s hydrazidem chráněného dipeptidu 4-5 vzorce V (II), (III), (IV),

4 5

Z-Ser-Tyr-^H-j (V), kde Z je chránící skupina, např. benzyloxykarbonylová, načež se ze získaného chráněného dekapeptidamidu odstraní chránící tosylskupina.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se tosylskupina odstraňuje z chráněného dekapeptidamidu působením kyseliny trifluormethansulfonové, v přítomnosti ochranných látek, zejména anisolu, thianisolu, thioglykolové kyseliny nebo jejich směsí, při teplotě 0 až -30 °C.