DK148305B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af et lh-rh-analogt nonapeptidamidderivat eller et salt eller metalkompleks deraf - Google Patents

Description

i 148305

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt LH-RH-analogt nona-peptidamidderivat med kraftig ovulationsfremkaldende virkning, og med den almene formel

(PyrjGlu-His-Trp-Ser-F^-i^-i^-Arg-Pro-NH-R4 I

1 2 hvor R er Tyr eller Phe, R er D-Leu, D-Ile, D-Nle, D-Val, D-Nva, D-Abu, α-Aibu, D-Phe, D-Phg, D-Ser, D-Thr eller D-Met, 3 4 R er Leu, Ile eller Nle og R er en alkylgruppe med 1-3 kul-stofatomer som kan være substitueret med en hydroxylgruppe, eller et salt eller metalkompleks deraf.

I nærværende beskrivelse og krav er aminosyrer og peptider betegnet med forkortelser som er almindeligt anvendte inden for det særlige fagområde eller som er vedtaget af Committee on Biochemical Nomenclature of IUPAC-IUB. Aminosyrer er i L-konfiguration med mindre andet er angivet.

Der anvendes således følgende forkortelser:

Abu: a-Amino smørsyre a-Aibu: a-Aminoisosmørsyre

Arg: Arginin BOC: t-Butoxykarbonyl

Bzl: Benzyl DCC: N,N1-Dicyklohexylkarbodiimid

Gly: Glycin

His: Histidin HONB: N-Hydroxy-5-norbonen-2,3-dikarboximid HOSu: N-Hydroxysuccinimid IBOC: Isobomyloxykarbonyl

Ile: Isoleucin

Leu: Leucin

Nle: Norleucin

Nva: Norvalin

Met: Metionin OMe: Metylester OBzl: Benzylester ONB: N-hydroxy-5-norbonen-2,3-dikarboximidester OSu: N-hydroxysuccinimidester 2 148305

Phe: Fenylalanin

Phg: a-fenylglycin

Pro: Prolin (Pyr)Glu: Pyroglutaminsyre

Ser: Serin

Thr: Treonin

Tos: Tosyl

Trp: Tryptofan

Tyr: Tyrosin

Val: Valin Z: Benzyloxykarbonyl

Den ovenfor nævnte substituent der er en lige-kædet eller forgrenet alkylgruppe med 1-3 kulstofatomer som kan være substitueret med en hydroxylgruppe kan fx være metyl, ætyl, n-propyl, isopropyl, hydroxymetyl, 1-hydroxyætyl, 2-hydroxyætyl, 2-hydroxy-n-propyl eller 3-hydroxy-n-propyl.

Det har været kendt i mange år at hypotalamus indeholder faktorer som på et højere niveau kontrollerer sekretionen af tropiske hormoner fra hypofysen. For nylig er der efter isoleringen af et tyrotropi-stimulerende hormon (TRH) ekstraheret et hormon (LH-RH) som fremmer sekretionen af luteiniseren-de hormon i ren form fra svin og får, og det har vist sig at være et dekapeptid med strukturen: (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (A.V. Schally et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 43, 1334, 1971; R. Guillemin et al, Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A., 69 278, 1972).Denne opdagelse er blevet fulgt af syntesen af et tilsvarende antal peptider og der har også været udført biologiske prøver på disse analoge peptider. Imidlertid formindsker selv en lille modifikation i den ovenfor viste aminosyresammensætning i alvorlig grad den fysiologiske virkning af peptidet og den ovenfor viste kemiske struktur har været anset som essentiel til frembringelse af maksimal fysiologisk virkning.

(A.V. Schally et al, Biochem, Biophys. Res. Commun., 4, 366, 1972).

3 148305

Fra Biochem. Biophys. Res. Commun., Bind 49, nr. 3, side 863-869 (1972) kendes LH-RH-analoge nonapeptidamidderi-vater med en ovulationsfremkaldende virkning på op til 5 gange virkningen af LH-RH.

Det har på denne baggrund imidlertid vist sig at nona-peptidamidderivaterne med formel I har en overraskende kraftigere ovulationsfremkaldende virkning både i sammenligning med det naturligt forekommende dekapeptid LH-RH og i sammenligning med de ovennævnte kendte nonapeptidamidderivater.

Det har også vist sig at disse forbindelser virker på hypofysen ved at fremme sekretionen af såvel luteiniserende hormon og follikelstimulerende hormon. Det har desuden vist , sig at disse forbindelser ikke blot er nyttige som lægemidler til mennesker, fx midler til behandling af amenoré, men også som veterinært lægemiddel. Den foreliggende opfindelse bygger oå disse uventede opdagelser.

Det er således formålet med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en analogifremgangsmåde til fremstilling af nonapeptidamidderivaterne med den almene formel I.

Dette opnås ved en fremgangsmåde, der er ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del angivne.

Nonapeptidamidderivatet med formel I fremstilles således ved at et reagens A - L-pyroglutaminsyre eller et peptidfragment som har en L-pyroglutaminsyreenhed (dvs. (Pyr)Glu) i dets N-terminale ende og som indeholder 1-9 aminosyrer af den ovenfor viste aminosyresekvens, regnet fra den N-terminale ende -kondenseres med et reagens B - en aminoforbindelse som svarer til den resterende del af nonapeptidamidderivatet med formel I -, hvilke to reagenser A og B eventuelt er beskyttet med én eller flere beskyttelsesgrupper, hvorefter eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrupper fjernes.

Således er reagens A L-pyroglutaminsyre eller et peptidfragment som har en L-pyroglutaminsyreenhed i sin N-terminale ende og som indeholder 1-9 aminosyrer af aminosyresekvensen med formel I, regnet fra den N-terminale ende, og reagenset B som kondenseres med reagenset A er en aminoforbindelse som svarer til den resterende del af nonapeptidamidderivatet I, reagenserne A og B er eventuelt beskyttede.

148305 4

De grundliggende kombinationer af reagens A og reagens B er eksemplificeret i følgende tabel I.

Tabel 1.

\Reagens (A) (B)

KombinationN

1 (Pyr)Glu-OH Η-Ηΐε-Τηρ-Ββη-Η1-!*2- R3-Arg-Pro-NH-R4 2 (Pyr)Glu-His-OH H-Trp-Ser-R1-R2-R^-

Arg-Pro-NH-R4 3 (Pyr)Glu-His- H-Ser-R1-R2-R3-Arg-Pro-

Trp-OH NH-R4 4 (Pyr)Glu-His- H-R1-R2-R3-Arg-Pro-

Trp-Ser-OH NH-R4 5 (Pyr)Glu-His- H-R2-R^-Arg-Pro-

Trp-Ser-R1-OH NH-R4 6 (Pyr)Glu-His- H-R^-Arg-Pro-NH-R4

Trp-Ser-R1-R2-

OH

7 (Pyr)Glu-His- H-Arg-Pro-NH-R4

Trp-Ser-R1-R2-

R3-OH

8 (Pyr)Glu-His- H-Pro-NH-R4

Trp-Ser-R1-R2-

R^-Arg-OH

9 (Pyr)Glu-His- NH^-R4

Trp-Ser-R1-R2-R^-Arg-Pro-OH

____ 5 148305

Kondensationsreaktionen ifølge den foreliggende opfindelse kan gennemføres ved kendte kondenseringsmetoder for dannelse af peptidbindinger. Blandt sådanne kondensationsmetoder er DCC/HONB-processen (belgisk patentskrift nr. 796.399), azidpro-cessen, kloridprocessen, syreanhydridprocessen, blandet syrean-hydridprocessen, DCC-processen, aktiv ester processen, Woodward reagens K processen, karbodiimidazolprocessen, oxydations-re-duktionsprocessen og andre metoder (The Peptides, Vol. 1, 1966, Schrdder og Lubke, Academic Press, New York, USA).

Før kondensationsreaktionen kan man beåytte cfe karboxyl- og aminogrupper der ikke skal involveres i den påtænkte reaktion eller man kan aktivere de karboxyl- og/eller aminogrupper der skal tage del i reaktionen på i og for sig kendt måde. Karboxylgrupperne i udgangsmaterialet kan beskyttes i form af metalsaltet (fx natrium- og kaliumsaltet) eller estere (fx metyl-, ætyl-, benzyl-, p-nitrobenzyl-, t-butyl- eller t-amyl-estere.

Beskyttelsesgrupper for aminogrupper i udgangsmaterialerne kan være en hvilken som helst konventionel beskyttelsesgruppe for aminogrupper ved peptidsyntese, fx benzyloxykarbonyl, t-butyloxykarbonyl eller isobomyloxykarbonyl. Hydroxylgruppen i serin kan beskyttes med en konventionel beskyttelsesgruppe såsom benzyl, t-butyl eller andre æterdannende grupper. Hydroxylgruppen i tyrosin kan beskyttes med benzyl, t-butyl eller andre æterdannende grupper. Guanidingruppen i arginin kan beskyttes med sådanne grupper som nitro, tosyl, karbobenzoxy, isobomyloxykarbonyl eller adamantykoxykarbonyl. Som eksempler på aktiverede karboxylgrupper i udgangsmaterialerne kan nævnes det tilsvarende syreanhydrid, azid, aktive estere (estere med alkoholer, fx pentaklorfenol, 2,4,5-triklorfenol, 2,4-dinitrofenol, cyano-metylalkohol, p-nitrofenol, N-hydroxy-5-norbonen-2,3-dikarbox-imid, N-hydroxysuccinimid, N-hydroxyftalimid eller N-hydroxy-benztriazol). De aktiverede aminogrupper i udgangsmaterialerne kan fx være tilsvarende fosforsyreamider.

Følgende tabel viser nogle eksempler på kombinationer af sådanne former af karboxyl- og aminogrupper i materialerne A og B.

6 148305

Tabel 2

Kombina- Reagenser tionsek- ----- sempler (A) (B) COOH nh2 cooh nh2 lx fri beskyttet beskyttet fri 2 aktiveret beskyttet fri fri 3 fri beskyttet beskyttet aktiveret NB: I tilfældet betegnet med x, er der fortrinsvis et dehydreringsmiddel til stede i reaktionssystemet (fx et karbodiiinidreagens såsom dicyklo-hexylkarbodiimid.En praktisk udførelsesform for denne opfindelse kan skrives på følgende måde 148305 -7 ® 7 η H c

l © O

η φ & h

5¾ ES

>>æ x > η 2 ©

CO G o G

Φ gi N -H

^ s CO X

-Η X to

¢5 -Η G Vi -H

© ft '-'ft Η ft N >>

-4 ft ft -4- COS © H

ft CO'— ft Φ (¾ C0^ i i © ft ftftft ft φ Φ ft to >> 3 3 ft a © p, a r-i x ui x

1 Η ίν~> I Φ Ο M

ο © 3 G o G G co · Φ

G S G m G ffi-S Φ-dH

ft G baft ft > >> <r cosh l Φ CO I G ft ft H 3 © <r CM b0 Ό Φ *H (M bO 83 I I © > ft

O G ft ¢0 ¢0 O G SH ft ft''' - I

a—< a-c ^ a +3 φ g ft i v i -ho i g o a

fft -A ίΛ — Ο Ο Λ! >7-Ρ I

ft ' ft ΧΟ G in CO CO p I I ft ft φ Φ CO (-1 CM CM W G I ft G >, ft

ft ft Φ CM bO >>H I

I G H O G ft 6 ¢0 b0 n ο h a— < co -p g •Η Φ I -Η <0 <;

r ft ίΛ Φ ft I

(Oft ft CO CM Ift CO a I H H I ft

SO cm Φϋτ) I

©ft ft s S ft ft O'-'- i Geo ft

SO Η Φ T) I

Ο O ft Oft φ H

ftQ i ft co a ft

G I

Φ G

co φ

1 CO

— & ft ft § I -^ ^ Eh

ft Ο Φ i — co I

3 ft (¾ ft Η I -H CO

G ^ (¾ >h cO TJ ft -H

bO O 3 ft ft (1. I ft

CO O G to CO 3 I

Φ Ω bO © ft -d H 3

CO co ft Φ o H

h x φ x a ^ o

Φ Ch CO s vi G --S

-P v-" Γ-i Φ'— s tH G

-P © O ft tH

>-> S -p ft © ft ^ ft' X O -P CO ftp G —

to -H >1 ftft O

Φ P ft © 3 3 P

ft cO co co G ft CO

I I co Φ H bO Φ to

H S ft Φ to G S

ft Φ I S © H

I ft Η Mim H G C ft Φ H to P ft

Φ Ο I TO Φ -H CO I

CO X G ft ft ft ft G

φ Φ

+ CO CO

&-& -> & — EH Eh Eh

I I I

to to co

Ή -Η -H

ft ft ft

I I I

3 3 3

Η Η H

O O O

-—V /—s

G G G

>7 >7 ΪΗ ft ft ft 8 U8305

Denne reaktion kan gennemføres i nærværelse af et opløsningsmiddel. Opløsningsmidlet kan vælges blandt dem der er kendt som nyttige til peptidkondensationsreaktioner. Således kan der som eksempel nævnes vandfrit eller vandigt dimetylform-amid, dimetylsulfoxyd, pyridin, kloroform, dioxan, diklormetan, tetrahydrofuran og passende blandinger af sådanne opløsningsmidler.

Reaktionstemperaturen vælges inden for det område der er kendt som anvendeligt for reaktioner der fører til dannelse af peptidbindinger, dvs. normalt inden for området ca. -20 og ca. 30°C. Desuden kan prekursormaterialerne (beskyttede peptider) af de ønskede forbindelser ifølge opfindelsen let fremstilles ved fastfasesynteser.

Efter den ønskede kondensationsreaktion er tilendebragt kan beskyttelsesgrupper, dersom produktet bærer sådanne, fjernes ved kendte metoder. Blandt sådanne kendte metoder er katalytisk reduktion i nærværelse af en katalysator såsom palladiumsort, palladium-på-kulstof, platin eller lignende, solvolyse ved hjælp af hydrogenfluorid, trifluoreddikesyre eller lignende, og reduktion med metallisk natrium i flydende ammoniak.

Det således fremstillede peptid med formel I kan udvindes fra reaktionsblandingen ved kendte metoder til udvinding af peptider, fx ved ekstraktion, fordelingskromatografi eller søjlekromatografi.

Peptidet med formel I kan også udvindes i form af et salt eller en metalkompleksforbindelse.

Som syre der er i stand til at danne salte med peptider med formel I kan nævnes uorganiske syrer såsom saltsyre, brombrintesyre, perklorsyre, salpetersyre, tiocyansyre, svovlsyre og fosforsyre, og organiske syrer såsom myresyre, eddikesyre, propionsyre, glykolsyre, mælkesyre, pyrodruesyre, oxalsyre, malonsyre, ravsyre, æblesyre, fumarsyre, antranylsyre, kanelsyre, naftalensulfonsyre eller sulfanylsyre.

De metaller der er i stand til at danne metalkompleksforbindelser med peptidet med formel I indbefatter bl.a. zink, nikkel, kobolt, kobber og jern. Sådanne metalkompleksforbindelser kan fremstilles ved konventionelle metoder, fx ved at omsætte peptidet med formel I med hydroxydet eller oxydet af et metal af den ovennævnte art ved en pH-værdi på ca. 6-8.

De ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser med 9 148305 formel I har en LH-RH-(luteiniserende hormon-stimulerende hormon)-virkning og de er således i stand til at fremme sekretionen af LH(luteiniserende hormon) og FSH(follikelstimulerende hormon). Po-lypeptider med formel I er således nyttige som lægemidler til fremkaldelse af ovulationer hos kvinder og hundyr (fx rotter, får, svin, køer, hopper vagtler eller høns). Peptiderne kan også anvendes til andre farmaceutiske formål hvortil der har været anvendt konventionelle præparater af LH-RH, LH og FSH.

Eftersom LH-RH-virkningen af polypeptideme med formel I er ca. 5 til 80 gange så stor som for naturligt forekommende LH-RH kan den anvendte dosis ved hver indgift bestemmes på grundlag af det nævnte forhold mens man også tager andre faktorer i betragtning (fx det under behandling værende individ og arten af sygdommen). Fx kan en passende dosis vælges inden for området ca. 2 ng til 2 pg per dag per kg legemsvægt.

Polypeptiderne med formel I indgives først og fremmest ad ikke-oral vej (fx ved injektion eller ad rektal eller vaginal vej) selv om de indgives oralt i visse tilfælde.

De anvendelige dosisformer indbefatter fx injektionsblandinger, suppositorier, pessarer og pulvere. Injektions-blandingerne kan fremstilles ved at man opløser ca. 10 mikrogram til 100 mikrogram af polypeptid I i 1 ml fysiologisk saltopløsning. Polypeptiderne med formel I kan også tilberedes i form af frysetørrede ampulprodukter med mannitol tilsat som excipiens således at man kan indgive dem i form af på stedet fremstillede injektionsblandinger.

De peptidudgangsmaterialer der kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan fremstilles enten på kendt måde for peptidsyntese eller ved at anvende sådanne metoder som måtte være nødvendige.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres nærmere i det følgende ved hjælp af nogle eksempler.

I disse eksempler betegner følgende forkortelser Rf-værdien ved tyndlagskromatografi på silikagel med følgende opløsningsmiddelsystem.

Rf1: kloroform/metanol/eddikesyre, 9:1:0,5 p

Rf : ætylacetat/pyridin/eddikesyre/vand, 30:10:3:5

Rf^: n-butanol/ætylacetat/eddikesyre/vand, 1:1:1:1.

I eksemplerne nævnes følgende varemærker hvoraf "Sephadex" og "Amberlite" er indregistreret i Danmark mens U8305 ίο "Biogel" ikke er indregistreret i Danmark.

"Biogel" P-2: materialer til gelfiltrering fremstillet af BIO-RAD, USA.

"Sephadex" LH-20: forestret dextrangel.

"Amberlite" XAD-2: polystyrenharpiks.

"Amberlite" IR-45: svagt basisk anionbytter.

"Amberlite" IRA-410: stærkt basisk anionbytter. "Amberlite" CG-410: stærkt basisk anionbytter. "Amberlite" CG-45: svagt basisk anionbytter.

j 11 148305

Eksempel 1 (PyiOGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-CHgCHj a) Z-D-Leu-Leu-ArgiNOgi-Pro-NH-Ci^-CH^ I 50 ml diklormetan opløses 1,58 g Z-D-Leu-OH (olie) og 1,2 g HONB efterfulgt af tilsætning af 2,8 g H-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH^. Blandingen afkøles til 0°C hvorefter der tilsættes 1,4 g DCC og blandingen omrøres ved stuetemperatur i 8 timer.

Det som biprodukt fremstillede dicyklohexylurinstof fjernes ved filtrering og filtratet koncentreres til tørhed under nedsat tryk. Remanensen opløses i 150 ml ætylacetat, vaskes 2 gange med en 4#s vandig opløsning af natriumhydrogenkarbonat og 2 gange med vand, tørres over natriumsulfat og koncentreres til sidst til tørhed under nedsat tryk. Remanensen genudfældes fra ætyl-acetat/petroleumsbenzin. Den beskrevne procedure giver 3,6 g af den ønskede forbindelse. Smp. 134°C (sønderdeling), = -47,3° (c = 0,54 i metanol), Rf^· = 0,57·

Beregnet for C33H5308Ng: C 56,31, H 7,59, N 17,91 Fundet: C 56,08, H 7,82, N 17,69#· b) (Pyr^lu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-ArgftK^-Pro-NH-CHg-CH^ I 30 ml 25#s hydrogenbromid/iseddikesyre opløses 3,6 g Z-D-Leu-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH^ og opløsningen hvirvles rundt ved stuetemperatur i 50 minutter. Til opløsningen sættes 300 ml æter og det resulterende bundfald fjernes ved filtrering. Efter tørring opløses bundfaldet i 50 ml vand og føres gennem en kolonne på 2,5 x 20 cm af "Amberlite” CG-410 (fri base). Kolonnen vaskes grundigt med 30#s vandigt metanol. Effluenten og va-skevæskeme forenes og koncentreres under nedsat tryk til fjernelse af metanolen efterfulgt af frysetørring. Den beskrevne procedure giver 3,1 g af den frie base af H-D-Leu-Leu-ArgiNOg)-

Pro-NH-CHo-CH-z- 2 3 o ^

Rf = 0,24, Rf^ =0,68. I 4 ml dimetylformamid op- 148305 12 løses 228 mg af det ovenfor vundne produkt og 290 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH efterfulgt af tilsætningen af 144 mg Η0ΝΈ. Blandingen afkøles til -10°C og der tilsættes 90 mg DCC. Blandingen omrøres ved -10°C i 2 timer, ved 0°C i 4 timer og ved stuetemperatur i 4 timer. Reaktionsblandingen filtreres til fjernelse af dicyklohexylurinstoffet. Efter at der er sat ætylacetat til filtratet opsamles det resulterende bundfald ved filtrering. Bundfaldet tørres og opløses i 20%s vandig ætanol. Opløsningen føres gennem en kolonne af "Amberlite" XAD-2 (20 mesh, 3 x 20 cm) og der foretages gradienteluering med 20%s ætanol og absolut ætanol (300 ml af hver).

Det ønskede produkt kommer frem i fraktionerne fra 260 ml til 360 ml. Disse fraktioner koncentreres under nedsat. tryk og frysetørres. Proceduren giver 346 mg af det ønskede produkt.

ap5 = 38,28° (c = 0,1 i 0,5% metanol); Rf2 = 0,235, Rf3 = 0,765 c) (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH^ I 20 ml 60% vandig myresyre opløses 300 mg af den i eksempel 1 b) vundne IW^-forbindelse hvorefter der tilsættes 600 mg SnCl2,H20. Blandingen opvarmes til 80-85°C i 2 timer hvorefter den koncentreres til tørhed under nedsat tryk. Remanensen ekstraheres med 50 ml varmt vand (80°C). Ekstrakten filtreres og filtratet føres gennem en kolonne (3 x 20 cm) af "Amberlite" XAD-2 (200 mesh). Efter vask med vand gennemføres gradienteluering med vand og absolut ætanol (400 ml af hver).

Det ønskede produkt fremkommer i fraktionerne 150 ml til 260 ml. Disse fraktioner forenes og koncentreres under nedsat tryk til fjernelse af ætanolen. Koncentratet føres gennem en kolonne (2 x 33 cm) af karboxymetylcellulose og der gennemføres gradienteluering med 0,005M til 0,2M ammoniumacetat (pH = 6,8). Det ønskede peptid fremkommer i fraktionerne 330 ml til 520 ml. Disse fraktioner forenes og frysetørres hvorved der vindes 284 mg af et hvidt fnugget pulver.

= 32,66° (c = 0,545 i 5%s vandig eddikesyre); Rf2 = 0,10,

Rf3 =0,75

Aminosyreanalyse (hydrolyse med 6N HC1 i nærværelse af tiogly-kolsyre): His 1,00, Arg 0,96, Trp 0,96, Ser 1,00, Glu 1,00, 13 148305

Pro 1,04, Leu 2,00, Tyr 1,00.

Eksempel 2 (Pyr)Glu-Hls-Trp-Ser-Tyr-a-Aibu-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH^ a) Z-a-Aibu-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2~CH^ I 7 ml dimetylformamid opløses 0,6 g Z-a-Aibu-OH og 0,9 g H-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH5. Opløsningen afkøles til 0°C og der tilsættes 0,71 g l-ætyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid, et vandopløseligt karbodiimid, hvorefter det omrøres i 12 timer. Opløsningsmidlet afdestilleres og remanensen opløses i 100 ml kloroform. Opløsningen vaskes med 4%s na triumhydr o genkarbonat og IN saltsyre, skylles med vand og tørres over magniumsulfat. Opløsningsmidlet afdestilleres under nedsat tryk og remanensen behandles med æter hvorved der vindes et pulver som opsamles ved filtrering.

Pulveret genudfældes fra ætylacetat/æter hvorved der vindes 473 mg af den ønskede forbindelse. Smp. 104-107°C.

(¾4 = -45,8° (c = 0,55 i DMF), Rf1 = 0,50.

Beregnet for C-j-jH^Q0gNg,0,5H20: C 54,28, N 7,50, N 18,38 Fundet: C 54,32, N 7,32, N 17,97%.

b) B0C-Tyr(Bzl)-a-Aibu-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH^ I 3 ml 25%s hydrogenbromid/iseddikesyre opløses 423 mg Z-a-Aibu-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH-j og blandingen hvirvledes rundt ved stuetemperatur i 40 minutter hvorefter der tilsættes 50 ml tør æter.

Det resulterende bundfald opsamles ved filtrering og tørres under nedsat tryk over natriumhydroxyd i en exsikkator Det vundne pulver opsamles i 3 ml DMF og opløsningen neutraliseres med 0,24 ml N-ætylmorfolin og afkøles til 0°C. Derefter 148305 14 sættes 557 mg BOC-Tyr(Bzl)-OH og 298 mg HONB til opløsningen hvorefter der tilsættes 280 mg DCC. Blandingen omrøres ved stuetemperatur i 6 dage. Dicyklohexylurinstoffet filtreres fra og DMF destilleres af under nedsat tryk. Remanensen opløses i 100 ml kloroform, vaskes med IN saltsyre og 4%s na-triumhydrogenkarbonat, skylles med vand og tørres over magniumsulfat hvorefter der koncentreres til tørhed under nedsat tryk. Remanensen krystalliseres fra ætylacetat. Udbytte 275 mg, smp. 227-229°C. a^ = -27,6° (c = 0,54 i DMF), Rf1 2 3 4 = 0,60.

Beregnet for C44Hg7°ioN10‘H20: C 57,82, H 7,61, N 15,32 Fundet: C 58,32, H 7,51, N 15,10%.

c) BOC-Ser-Tyr(Bzl)-a-Aibu-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CHg-CH^ I 3 ml trifluoreddikesyre indeholdende 0,1 ml anisol opløses 250 mg B0C-Tyr(Bzl)-a-Aibu-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH^ og opløsningen hvirvles rundt ved stuetemperatur i 30 timer. Der tilsættes 30 ml tør æter og det resulterende bundfald fjernes ved filtrering og tørres. Det vundne pulver opløses i 5 ml DMF og opløsningen neutraliseres med 0,08 ml N-ætylmorfolin. Derefter sættes 150 mg BOC-Ser-triklorfenyl-ester til opløsningen som omrøres i 2 dage. DMF afdestilleres og remanensen behandles med æter hvorved der vindes et pulver. Pulveret opsamles ved filtrering og genudfældes 2 gange fra ætylacetat. Udbytte 100 mg; smp. 140-142°C (sønderdeling); c^5 * 34,8° (c = 0,44 i DMF); Rf1 = 0,74.

Beregnet for C^Hy20^2N-Q. 3H20: C 54,43, H 7,58, N 14,84 Fundet: C 54,66, H 7,45, N 14,91%.

d) (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-a-Aibu-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH^ 3 ml trifluoreddikesyre indeholdende 0,1 ml ani 2 sol opløses 77 mg BOC-Ser-Tyr(Bzl)-oc-Aibu-Leu-Arg(N02)-Pro-NH- 3 CH2-CH-j og opløsningen hvirvledes rundt ved stuetemperatur i 4 30 minutter. Der tilsættes 30 ml tør æter og det resulterende 15 148305 bundfald opsamles ved filtrering og tørres. Det resulterende pulver opløses i 3 ml DMF og opløsningen neutraliseres med 0,21 ml 10%s opløsning af N-ætylmorfolin i DMF. Hertil sættes 37 mg krystaller af (Pyr)Glu-His-Trp-OH og blandingen afkøles til -10°C hvorefter der tilsættes 21 mg HONB og 30 mg DCC. Blandingen omrøres ved 0°C i 12 timer. Dicyklohexylurinstof-fet frafiltreres og filtratet koncentreres til tørhed under nedsat tryk. Remanensen opløses i 20%s ætanol og adsorberes på en kolonne (1 x 10 cm) af "Amberlite" XAD-2. Der gennemføres eluering ved gradientmetoden under anvendelse af fra 20%s til absolut ætanol (200 ml af hver). De fraktioner der er rige på den ønskede forbindelse,svarende til koncentrationsområdet for ætanol på 40% til 80%, forenes, koncentreres under nedsat tryk og frysetørres. Den beskrevne procedure giver 30 mg beskyttet nonapeptid (Rf = 0,31). Ved tilsætning af 0,1 ml anisol og 0,1 ml merkaptoætanol behandles dette beskyttede nonapeptid med 3 ml vandfrit hydrogenfluorid og blandingen omrøres ved 0°C i 60 minutter. Hydrogenfluoridet afdestille-res under nedsat tryk og remanensen opløses i 10 ml vand. Opløsningen ekstraheres 3 gange med 2 ml æter og vandlagene forenes og føres gennem en kolonne (2x4 cm) af "Amberlite" CG-410 (acetatform) som vaskes med vand. Effluenten og vandige vaskevæsker forenes og føres gennem en kolonne af karboxy-metylcellulose og en kolonne af "Amberlite" XAD-2 som beskrevet i eksempel 1. Efter frysetørring vindes 14 mg af et hvidt fnugget pulver.

= -54,1° (c = 0,31 i 5%s vandigt eddikesyre), Rf^ = 0,99,

Rf3 = 0,715.

Aminosyreanalyse (hydrolyse med 6N HC1 i nærværelse af tio-glykolsyre): His 0,49, Arg 0,97, Trp 0,81, Ser 1,06, Glu 0,97,

Pro 0,97, Leu 1,03, Tyr 1,03, a-Aibu 1,00.

Eksempel 3 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH^

a) (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-OH

I 100 ml metanol opløses 4,0 g Z-Ser-Phe-OMe og det 16 U8306 reduceres ved atmosfærisk tryk under anvendelse af 500 mg palladiumsort som katalysator i 1 1/2 time. Katalysatoren fjernes ved filtrering og metanolen afdestilleres straks under nedsat tryk. Remanensen opløses i 25 ml DMF og der tilsættes 4,1 g krystaller af (Pyr)Glu-His-Trp-OH. Blandingen køles til -5°C hvorefter der tilsættes 3,8 g HONB og 3 g DCC. Blandingen omrøres ved -5°C i 2 timer, ved 0°C i 2 timer og til sidst ved stuetemperatur i 8 timer. Det som biprodukt dannede dicyklohexylurinstof filtreres fra og filtratet koncentreres til tørhed under nedsat tryk. Remanensen behandles med ætylacetat og det vundne pulver opsamles ved filtrering (6,7 g). Dette pulver opløses i 30 ml 15%s metanol/kloroform og opløsningen føres gennem en kolonne (6 x 12 cm) af silikagel præpareret med 15% metanol/kloroform.

Der gennemføres eluering under anvendelse af 600 ml 15% metanol/kloroform, 1 1 25% metanol/kloroform og 1 1 30% metanol/kloroform. Fraktionerne mellem 400 ml 25%s metanol/kloroform og 700 ml 30%s metanol/kloroform forenes og koncentreres til tørhed under nedsat tryk. Remanensen behandles med ætylacetat og det fremkomne pulver opsamles ved filtrering. Proceduren giver 4,2 g af den ønskede forbindelse. Rf2 = 0,29.

I 20 ml metanol suspenderes 3,5 g af denne metylester og ved 0°C tilsættes 8 ml IN natriumhydroxyd. Blandingen omrøres i en time hvorefter den neutraliseres med 8 ml IN saltsyre. Metanolen afdestilleres under nedsat tryk og der tilsættes 20 ml koldt vand. Det resulterende bundfald opsamles ved filtrering, vaskes med afkølet vand og derpå med ætanol/æter i forholdet 4:6 hvorpå det tørres.

Proceduren giver 2,32 g af den ønskede forbindelse.

= -3,3° (c = o,55 i iseddikesyre), Rf^ = 0,61.

b) (PyrjGlu-His-Trp-Ser-Phe-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-CHg-CH^ I 4 ml DMF opløses 290 rag (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-OH og 228 mg H-D-Leu-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH^ hvorefter der tilsættes 140 mg HONB. Blandingen afkøles til -10°C hvorefter der tilsættes 90 mg DCC. Blandingen omrøres ved -10°C i 17 168305 2 timer, ved 0°C i 3 timer og til sidst ved stuetemperatur i 5 timer.

På nøjagtig samme måde som beskrevet i eksempel 1 under kastes denne reaktionsblanding søjlekromatografi på "Amberlite" XAD-2. Den beskrevne procedure giver 342 mg af den ønskede forbindelse.

cc25 = -41,74° (c = 0,115 i metanol); Rf2 = 0,265, Rf3 = 0,78 I 20 ml 609és vandig opløsning af myresyre opløses 300 mg af det ovenfor vundne produkt hvorefter der tilsættes 600 mg SnCl2,H20. Blandingen henstår ved 80-85°C i 2 timer hvorefter den koncentreres til tørhed under nedsat tryk. Derefter bliver koncentratet på nøjagtig samme måde som beskrevet i eksempel 1 renset ved hjælp af en søjle af "Amberlite” XAD-2 og en søjle af karboxymetylcellulose. Proceduren giver 211 mg af et hvidt fnugget pulver.

= -38,49° (c = 0,53 i 5% vandigt eddikesyre), Rf2 =0,12,

Rf3 = 0,74.

Aminosyreanalyse (hydrolyse med 6N HC1 i nærværelse af tiogly-kolsyre): His 1,00, Arg 1,04, Trp 0,98, Ser 0,92, Glu 1,00,

Pro 1,00, Leu 1,98, Phe 1,00

Eksempel 4 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phg-Leu-Arg-Pro-NH-CH2CHj a) Z-D-Phg-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3 1 en blanding af 10 ml dimetylformamid og 20 ml diklormetan opløses 580 mg Z-D-Phg-OH og 1,14 g H-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3·

Til denne blanding sættes 400 mg HONB og under afkøling med is tilsættes 500 mg DCC. Blandingen omrøres ved stuetemperatur i 4 timer. Det som biprodukt dannede dicyklohexylurin-stof frafiltreres og filtratet koncentreres til tørhed. Remanensen opløses i 100 ml ætylacetat. Opløsningen vaskes med 4%s na-triumhydrogenkarbonat og vand, tørres over natriumsulfat og destilleres til afdampning af ætylacetat. Remanensen genudfældes fra ætylacetat/petroelumsæter hvorved der vindes 1,4 g af 148305 18 et pulver Rf1 = 0,65, Rf2 = 0,83, a25 = -80,2° (c = 0,5 1 metanol) .

b) (PyrjGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phg-Leu-Arg-Pro-NH-C^-CH^ I 20 ml eddikesyre opløses 150 mg Z-D-Phg-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH-p-CH^ . Med tilsætning af 100 mg palladiums sort bobles hydrogengas gennem opløsningen ved atmosfærisk tryk til fremkaldelse af reduktion.

Efter 4 timer filtreres katalysatoren fra og der tilsættes 0,4 ml IN saltsyre. Opløsningen koncentreres til tørhed under nedsat tryk og koncentratet opløses i 20 ml vand og frysetørres. Det fremkomne pulver opløses i 8 ml dimetylformamid og der tilsættes dråbevis 0,25 ml af en 10%s opløsning af N-ætyl-morfolin i dimetylformamid. Derefter tilsættes der 141 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH hvorefter der tilsættes 50 mg 1-hydroxybenzo-triazol og derpå 40 mg DCC ved -5°C.

Blandingen omrøres ved -5°C i 2 timer, ved 0°C i 2 timer og ved stuetemperatur i 8 timer. Der sættes æter til reaktionsblandingen og det resulterende bundfald opsamles ved filtrering og opløses i 20 ml vand. De uopløselige bestanddele filtreres fra og filtratet føres gennem en kolonne af "Amberlite" IRA-410 (acetatform) som derefter vaskes med vand. Effluenten og de vandige vaskevæsker forenes og føres gennem en kolonne på 1,5 x 25 cm af karboxymetylcellulose og der gennemføres gradient-eluering under anvendelse af 300 ml 0,005M ammoniumacetat og 300 ml 0,175M ammoniumacetat (pH 6,8). Det ønskede produkt fremkommer i fraktionerne fra 170 ml til 240 ml. Disse fraktioner forenes og føres gennem en kolonne på 2 x 20 cm af '’Amberlite" XAD-2. Den adsorberede forbindelse elueres ved gradientmetoden under anvendelse af 250 ml vand og 280 ml ætanol hvorpå den rene forbindelse fremkommer i fraktionerne fra 190 ml til 240 ml.

Eluatet koncentreres under nedsat tryk og frysetørres. Den be- 2 skrevne metode giver 110 mg af det ønskede produkt. Rf = 0,098,

Rf^ = 0,73, = -57,0° (c = 0,56 i 5% vandigt eddikesyre)

Aminosyreanalyse (hydrolyse med 6N HC1 i nærværelse af tioglykol-syre): His 0,96, Arg 1,04, Trp 0,92, Ser 0,93, Glu 1,00, Pro 1,00, Leu 1,01, Phg 0,98, Tyr 1,01.

19 148305

Eksempel 5 (PyrjGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser-Leu-Arg-Pro-NH-C^-CH^ a) Z-D-Ser-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH^ I en blanding af 10 ml dioxan og 10 ml dimetylform-amid opløses 955 mg Z-D-Ser-OH, 1,82 g H-Leu-ArgCNOgJ-Pro-NH-CH2-CH^ og 788 mg HONB. Opløsningen afkøles til 0°C og der tilsættes 907 mg DCC. Blandingen omrøres ved 0°C i 2 timer og ved stuetemperatur i 5 timer. Det som biprodukt dannede dicyklo-hexylurinstof frafiltreres og filtratet koncentreres til tørhed under nedsat tryk. Remanensen opløses i 100 ml kloroform. Opløsningen vaskes med 0,5N saltsyre og 4% natriumhydrogenkarbo-nat i den nævnte rækkefølge, tørres over magniumsulfat og koncentreres til tørhed under nedsat tryk. Remanensen behandles med petroleumsæter og det resulterende pulver opsamles ved filtrering og genudfældes fra ætanol/æter. Udbytte 2,4 g; smp.

123-126°C (sønderdeling), = -49,8° (c = 0,5 i metanol)

Beregnet for C3oH47^9N9 ,H20: C 51,79, H 7,09, N 18,12 Fundet: C 52,01, H 6,96, N 18,04%

Rf1 = 0,40 b) (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH^ en blanding af 20 ml metanol og 1 ml iseddikesyre opløses 334 mg Z-D-Ser-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH^ og med palladium-sort som katalysator gennemføres katalysereduktion ved stuetemperatur og atmosfærisk tryk i 4 timer. Katalysatoren frafiltreres og filtratet koncentreres til tørhed under nedsat tryk. Remanensen opløses ved tilsætning af 9,6 ml 0,1N salsyre hvorpå den frysetørres.

Det tørre pulver og 280 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH opløses i 3 ml DMF og der tilsættes 100 mg 1-hydroxybenzotria-zol og 0,615 ml af en 10%s opløsning af N-ætylmorfolin i DMF.

148305 20

Blandingen afkøles til -5°C hvorefter der tilsættes 165 mg DCC. Blandingen omrøres ved -5°C i 4 timer og ved stuetemperatur i 8 timer. Det som biprodukt dannede urinstofderivat frafiltreres og filtratet koncentreres til tørhed under nedsat tryk. Remanensen opløses i 20 ml vand og de uopløselige bestanddele frafiltreres. Filtratet føres gennem en kolonne (10 ml) af "Amberlite" IRA-410 (acetatform) og effluenten og vaskevæskerne forenes og føres gennem en kolonne på 1,5 x 27 cm af karboxymetylcellulose. Der gennemføres elue-ring ved gradientmetoden under anvendelse af 300 ml 0,005M ammoniumacetatpuffer og 300 ml 0,15M ammoniumacetat. Den ønskede forbindelse fremkommer i fraktionerne fra 280 til 322 ml. Disse fraktioner forenes og frysetørres hvorved der vindes 135 mg råprodukt. Dette opløses i en lille mængde vand og anbringes på en kolonne på 1,5 x 17 cm af "Amberlite" XAD-2. Der gennemføres eluering ved gradientmetoden under anvendelse af 300 ml 5%s vandigt ætanol og 330 ml 60?6s vandigt ætanol. Fraktionerne fra 196 ml til 231 ml forenes og efter fjernelse af ætanolen ved destillation frysetørres remanensen. Udbytte 62 mg.

Dette produkt opløses i 0,1N vandig eddikesyre og underkastes gelfiltrering på en kolonne på 1 x 54 cm af "Sephadex" LH-20. Efter frysetørring vindes 40 mg af det ønskede produkt i ren tilstand.

27 2 dp = -46,4° (c = 0,5 i vandigt eddikesyre), Rf = 0,055,

Rf3 =0,70

Aminosyreanalyse (hydrolyse med 6N HC1 i nærværelse af tio-glykolsyre) His 1,00, Arg 1,04, Trp 1,00, Ser 1,81, Glu 1,00,

Pro 1,00, Leu 1,04, Tyr 0,96, ætylamin 1,04

Eksempel 6 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Abu-Leu-Arg-Pro-NH-CH2CH3 a) Z-D-Abu-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2CH3 1 5 ml dimetylformamid opløses 0,3 g Z-D-Abu-OH og 0,45 g H-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3.

21 148305

Opløsningen afkøles til 0°C og der tilsættes 0,25 g HONB og 0,29 g DCC. Blandingen omrøres ved 0°C i en time og ved stuetemperatur i 5 timer. Urinstofderivatet frafiltreres og filtratet koncentreres til tørhed under nedsat tryk. Remanensen opløses i 80 ml kloroform, vaskes med IN saltsyre og h%s natrium-hydrogenkarbonat.

Efter vask med vand tørres over magniumsulfat og der koncentreres til tørhed under nedsat tryk. Remanensen behandles med æter og det resulterende pulver opsamles ved filtrering og genudfældes fra ætylacetat/petroleumsbenzin. Udbytte 489 mg, smp. 11-114°C. α^ = -51,2° (c = 0,6 i metanol), Rf^ = 0,66 b) (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Abu-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH^ Z-D-Abu-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CHj behandles med 25%s hydrogenbromid/iseddikesyre og udfældes med æter. Bundfaldet føres gennem en kolonne af "Amberlite" CG-410 (fri base) til fjernelse af hydrogenbromidet. I 3 ml DMF opløses 220 mg af den således vundne frie base af H-D-Abu-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CHj og 290 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH hvorefter der tilsættes 150 mg HONB. Blandingen afkøles til -10°C og der tilsættes 85 mg DCC. Blandingen omrøres ved -10°C i 2 timer, ved 0°C i 4 timer og ved stuetemperatur i 7 timer. Til reaktionsblandingen sættes ætylacetat og det resulterende bundfald opsamles ved filtrering. Bundfaldet opløses i 209és vandigt metanol under opvarmning og opløsningen afkøles hvorpå der udskiller sig et bundfald. Dette bundfald opsamles ved filtrering og tørres. Udbytte 284 mg, Rf2 = 0,240, Rf^ = 0,772 (i begge opløsningsmidler indeholder produktet ca. 10?és urenheder som giver en lille Rf-værdi).

I 15 ml 609és vandigt myresyre opløses 200 mg af det ovenfor vundne produkt hvorefter der tilsættes 400 mg SnCl2,H20. Blandingen opvarmes til 80-85°C i 2 timer. Derefter koncentreres blandingen til tørhed under nedsat tryk og remanensen ekstrahe-res med 50 ml varmt vand.

De uopløselige bestanddele fjernes ved filtrering og filtratet føres gennem en kolonne af "Amberlite" XAD-2, kar-boxymetylcellulose "Sephadex" LH-20 i den nævnte rækkefølge hvorefter der frysetørres. Den beskrevne procedure giver 104 mg af et hvidt fnugget pulver.

148305 22 = -43,6° (c = 0,50 i 5% vandigt eddikesyre), Rf2 = 0,08. Aminosyreanalyse (hydrolyse med 6N HC1 i nærværelse af tio-glykolsyre): His 0,98, Arg 0,96, Trp 0,94, Ser 0,92, Glu 1,00,

Pro 1,00, Leu 0,98, Abu 1,00, Tyr 1,00, ætylamin 1,02.

Eksempel 7 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Nva-Leu-Arg-Pro-NH-CH2~CH^

a) Z-D-Nva-0H

På den rutinemæssige måde omsættes H-D-Nva-0H med karbobenzooxyklorid i 2N natriumhydroxyd og den resulterende forbindelse omkrystalliseres fra ætylacetat/petroleumsbenzin. Proceduren giver nåle med smp. 83-84°C.

= +12,1° (c = 1,0 i metanol)

Beregnet for C-^H-^O^N: C 62,14, H 6,82, N 5,57 Fundet: C 62,17, H 6,88, N 5,62%.

b) Z-D-Nva-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3 1 5 ml DMF opløses 376 mg Z-D-Nva-OH, 685 mg H-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2~CHj og 295 mg HONB og derefter ved 0°C 340 mg DCC. Blandingen omrøres ved 0°C i 2 timer og ved stuetem-; peratur i 8 timer. Det som biprodukt dannede urinstofderivat fra- filtreres og der sættes 10 ml ætylacetat til filtratet. Blandingen vaskes med 0,5N saltsyre og 4%s natriumhydrogenkarbonat.

Der vaskes med vand og tørres over natriumsulfat. Opløsningen koncentreres til tørhed under nedsat tryk og behandles med æter.

Det resulterende pulver opsamles ved filtrering og renses ved genudfældning fra ætylacetat/æter. Udbytte 900 mg, smp. 105-107°C (sønderdeling), = -51,2° (c = 1 i metanol), Rf = 0,60

Beregnet for C32H51^8N9: C 55,71, H 7,45, N 18,27 Fundet: C 55,54, H 7,62, N 18,09%.

23 148305 c) (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Nva-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH^

Ud fra det i eksempel 7b) vundne Z-D-Nva-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3 og (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH følges de samme reaktions-og rensningsmetoder som beskrevet i eksempel 6 b) hvorved man vinder den ønskede forbindelse, ocjp = -39,8° (c = 0,51 i 5% vandigt eddikesyre), Rf^ = 0,094,

Rf3 = 0,74

Aminosyreanalyse (hydrolyse med 6N HC1 i nærværelse af tiogly-kolsyre) His 1,00, Arg 0,98, Trp 0,93, Ser 0,94, Glu 1,08,

Pro 1,02, Nva 0,98, Leu 1,00, Tyr 0,98, ætylamin 1,04.

Eksempel 8 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-D-Nva-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH2-CH^ a) Z-D-Nva-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH2-CH^ I 2 ml 25%s hydrogenbromid/iseddikesyre opløses 720 mg Z-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH2-CH-j og opløsningen rystes i 40 minutter. Til opløsningen sættes 20 ml tørt æter og det resulterende bundfald opsamles ved filtrering. Bundfaldet vaskes grundigt med tør æter. Derefter tørres det over natrium-hydroxyd under nedsat tryk i en exsikkator.

Efter tørring opløses produktet i 5 ml DMF og der tilsættes 250 mg Z-D-Nva-OH hvorefter der tilsættes 0,15 ml i triætylamin og 200 ml HONB. Blandingen afkøles til 0°C og der tilsættes 230 mg DCC hvorefter der omrøres ved stuetemperatur i 8 timer. Der tilsættes 80 ml ætylacetat og de uopløselige bestanddele frafiltreres. Filtratet vaskes med IN saltsyre, 4%s natriumhydrogenkarbonat og vand og tørres over natrium-sulfat.

Derefter koncentreres det til tørhed under nedsat tryk og remanensen behandles med petroleumsæter. Det resulterende pulver renses ved genudfældning fra ætylacetat/pe-troleumsæter. Udbytte 718 mg, ajp = -51,0° (c = 1,0 i metanol),

Rf1 = 0,64.

148305 24

Beregnet for C^H^OgNg: C 56,23, H 7,58, N 17,89 Fundet: C 56,14, N 7,70, N 17,58%.

b) (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-D-Nva-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH2-CHj I 3 ml 25%s hydrogenbromid/iseddikesyre opløses 500 mg Z-D-Nva-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH2-CH3 og opløsningen rystes i 50 minutter. Til opløsningen sættes 60 ml tør æter og det resulterende bundfald opsamles ved filtrering og opløses i 40 ml vand. Opløsningen føres gennem en kolonne på 1 x 14 cm af "Amberlite" CG-410 (fri base) som derefter vaskes med 30%s vandigt metanol. Effluenten og vaskevæsker forenes og metanolen afdestilleres under nedsat tryk. Remanensen frysetørres hvorved der vindes 320 mg af den frie base af H-D-Nva-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH2-CH^. I 2 ml DMF opløses 225 mg af det ovenfor vundne produkt og 280 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-OH hvorefter der tilsættes 130 mg HONB. Blandingen afkøles til -10°C og der tilsættes 87 mg DCC. Blandingen omrøres ved -10°C i 60 timer. Ved 0°C i 2 timer og ved stuetemperatur i 6 timer. Til denne reaktionsblanding sættes 40 ml ætylacetat og det resulterende bundfald opsamles ved filtrering og opløses i 30%s vandigt ætanol under opvarmning. De uopløselige bestanddele frafiltreres og filtratet afkøles hvorved der vindes et bundfald. Bundfaldet opsamles ved filtrering, vaskes med koldt vand og tørres. Udbytte 340 mg.

I 20 ml 60%s vandig myresyre opløses 300 mg af det ovenfor vundne produkt hvorefter der tilsættes 580 mg SnCl2,H20. Blandingen opvarmes til 85°C i 2 timer. Reaktionsblandingen koncentreres til tørhed under nedsat tryk og ekstraheres med varmt vand.

Ekstrakten renses ved kromatografi på "Amberlite" XAD-2, karboxymetylcellulose og "Biogel" P-2. Proceduren giver 170 mg af det ønskede produkt.

= -37,7° (c= 0,505 i 5% vandig eddikesyre), Rf2 = 0,13, RF3 =0,76

Aminosyreanalyse (hydrolyse med 6N HC1 i nærværelse af tiogly-kolsyre): His 1,02, Arg 0,98, Trp 0,97, Ser 0,98, Glu 1,02,

Pro 1,00, Leu 1,00, Nva 1,02, Phe 0,98.

25 148305

Eksempel 9 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Abu-Leu-Arg-Pro-NH-CH(CH^)2 a) Z-D-Abu-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH(CH^)2 I 3 ml 25%s hydrogenbromid/iseddikesyre opløses 700 mg Z-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH(CH^)2 og opløsningen omrystes i 60 minutter hvorefter der tilsættes 50 ml tør æter. Det resulterende bundfald opsamles ved filtrering og tørres. Det tørrede produkt opløses i 6 ml DMF. Til denne opløsning sættes 240 mg Z-D-Abu-OH og opløsningen neutraliseres med 0,15 ml triætylamin.

Derefter tilsættes 200 mg HONB og blandingen afkøles til 0°C hvorefter der tilsættes 230 mg DCC. Blandingen omrøres ved stuetemperatur i 6 timer. Til blandingen sættes 100 ml ætylacetat og de uopløselige bestanddele frafiltreres. Filtratet vaskes med 0,5N saltsyre og 4#s natriumhydrogenkarbonat hvorefter det tørres over natriumsulfat. Derefter koncentreres det til tørhed under nedsat tryk og behandles med æter. Det resulterende pulver genudfældes fra ætylacetat/æter. Udbytte 725 mg.

o.^ = -52,0° (c = 0,5 i metanol), Rf^ = 0,62

Beregnet for C32H51°8N9: C 55,71, H 7,45, N 18,27 Fundet: C 55,42, H 7,59, N 18,01# b) (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Abu-Leu-Arg-Pro-NH-CH(CH^)2

Ud fra det i eksempel 9a) vundne Z-D-Abu-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH(CH^)2 og (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH vindes den i overskriften angivne forbindelse ved nøjagtig samme procedure som den der er beskrevet i eksempel 5.

= -41,0° (c = 0,62 i 5% vandigt eddikesyre), Rf2 = 0,11, RF3 = 0,74.

Aminosyreanalyse (hydrolyse med 6N HC1 i nærværelse af tiogly-kolsyre): His 1,00, Arg 0,90, Trp 0,87, Ser 0,97, Glu 1,00,

Pro 0,94, Abu 1,00, Leu 1,02, Tyr 0,96 t

Eksempel 10 26 148305 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH3, fremstilling i_fast_fase____________ a) BOC-Pro-harpiks I 50 ml DMF anbringes 15 g klormetyleret harpiks (Cl-indhold 9,45 mmol) hvorefter der tilsættes 6,1 g BOC-Pro-OH og 3,35 ml triætylamin. Blandingen rystes i 5 dage. Harpiksen opsamles ved filtrering og vaskes grundigt med DMF, ætanol, vand, ætanol og æter i den nævnte rækkefølge hvorpå den tørres. Udbytte 17,55 g. Aminosyreanalyse afslører at denne harpiks indeholder 0,314 mmol/g BOC-Pro.

b) (Pyr)Glu-His(Tos)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-D-Leu-Leu-Arg(Tos)-Pro-harpiks

Reaktionsbeholderen til et automatisk peptidsyntese-apparat (Simadzu Seisakusho model "APS-800"® fyldes med 3,145 g af den i eksempel 10 a) vundne BOC-Pro-harpiks. Harpiksen kvældes med diklormetan i 12 timer hvorefter hver aminosyre tilførtes i den følgende cyklus.

Diklormetan (3 minutter x 3)—»· 50%s trifluoreddi-kesyre/diklormetan (10 minutter og 30 minutter) —> diklormetan (3 minutter x 3)—* ætanol (3 minutter x 3) -diklormetan ->· (3 minutter x 3) —> 10% triætylamin/kloroform (10 minutter) kloroform (3 minutter x 3) —» diklormetan (3 minutter x 2) —> BOC-aminosyre-anhydrid (syntetiseret fra BOC-aminosyre og DCC på konventionel måde)(30 minutter og 60 minutter) —^ acety-lering (diklormetan, triætylamin og eddikesyreanhydrid) (en time) -diklormetan (3 minutter x 3) /7Pyr)Glu-0H kondenseres direkte med DCC i DMF7-

Til sidst vaskes harpiksen med ætanol, kloroform, dimetylformamid og æter hvorpå den tørres. Udbytte 3,89 g.

c) (Pyr)Glu-His(Tos)-Trp-Ser-(Bzl)-Tyr(Bzl)-D-Leu-Leu-Arg(Tos)-Pro-NH-CH2-CH3 'Π i 27 148305 I 20 ml metanol suspenderes 3,52 g af den i eksempel 10 b) vundne harpiks og suspensionen afkøles til 20°C. Ætyl-aminen der er vundet ved opvarmning af 809és vandigt ætylamin i et varmt vandbad bobles ind i suspensionen gennem natriumhydroxyd. Efter tilstrækkelig mætning omrøres blandingen ved stuetemperatur i 40 timer. Harpiksen opsamles ved filtrering og filtratet koncentreres til tørhed under nedsat tryk. Remanensen behandles med æter hvorved der vindes 835 mg af et råt pulverformet produkt.

Dette produkt indeholder en stor del urenhed som sandsynligvis er metylester. Derfor opløses 503 mg af dette produkt i metanol/DMF (8 ml/8 ml) og på samme måde som beskrevet ovenfor bobles der ætylamin ind i opløsningen. Opløsningen omrøres i 34 timer hvorved metylesteren forsvinder.

Derefter koncentreres opløsningen til tørhed under nedsat tryk og remanensen behandles med æter. Det resulterende pulver opsamles ved filtrering. Udbytte 465 mg.

d) (Pyr)Glu-Hi s-T rp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CHj I nærværelse af 0,4 ml anisol og 0,4 ml merkapto-ætanol opløses 327,8 mg af det i eksempel 10 c) vundne råprodukt i 8 ml vandfrit hydrogenfluorid. Opløsningen omrøres ved 0°C i en time hvorefter den koncentreres til tørhed under nedsat tryk. Remanensen opløses i 20 ml vand og de uopløselige bestanddele frafiltreres. Filtratet føres gennem en kolonne på 1,5 x 20 cm af "Amberlite" IRA-410 (acetatform) og renses derpå ved kromatografi på karboxymetylcellulose og "Amberlite"XAD-2. Derefter underkastes produktet gelfiltrering på en kolonne af "Sephadex" LH-20. Den beskrevne procedure giver 98 mg af det ønskede pro-'! dukt.

= -32,0° (C = 0,52 i 5% vandigt eddikesyre), Rf2 = 0,10, RF5 = 0,75.

Aminosyreanalyse (hydrolyse med 6N HC1 i nærværelse af tiogly-kolsyre): His 0,98, Arg 1,00, Trp 0,87, Ser 0,90, Glu 1,02,

Pro 1,02, Leu 2,01, Tyr 0,98, ætylamin 1,10.

i U8305

Eksempel 11 28 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Nle-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH^ a) BOC-D-Nle-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH^CH^ I 10 ml DMF opløses 346 mg BOC-D-Nle-OH og 820 mg H-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CHj. Blandingen afkøles til 0°C hvorefter der tilsættes 322 mg HONB og 371 mg DCC. Blandingen omrøres ved 0°C i 2 timer og ved stuetemperatur natten over. Den som biprodukt dannede urinstofforbindelse fjernes ved filtrering og filtratet ekstraheresmed 10 ml kloroform. Ekstrakten vaskes med 0,1N saltsyre, 5%s natriumhydrogenkarbonat og vand, hvorefter den tørres over vandfrit natriumsulfat.

Kloroformen afdampes og remanensen tritureres med æter hvorved man vinder den ønskede forbindelse. Udbytte 811 mg, smp. 124-126°C (sønderdeling), a^2 = -46,2° (c = 0,5 i metanol) Beregnet for C^0H^^0gNg.l/2H20: C 53,08, H 8,31, N 18,57 Fundet: C 53,07, H 8,27, N 19,05#· b) (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Nle-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH^

Det i eksempel 11 a) vundne B0C-D-Nle-Leu-Arg(N02)~ Pro-NH-CH2-CH^ behandles med trifluoreddikesyre og bundfældes med æter og opsamles ved filtrering. Produktet føres gennem en kolonne af "Amberlite" CG-45 (fri base) til fjernelse af tri-fluoreddikesyren. I 2 ml DMF opløses 190 mg af forbindelsen H-D-Nle-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH·^ og 168 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH. Blandingen afkøles til 0°C hvorefter der tilsættes 65 mg HONB og 75 mg DCC. Blandingen omrøres ved 0°C i 2 timer og ved stuetemperatur natten over. Den som biprodukt dannede urinstof-forbindelse fjernes ved filtrering og der sættes ætylacetat til filtratet. Det resulterende bundfald opsamles ved filtrering og behandles med 4 ml vandfrit hydrogenfluorid i nærværelse af 0,1 ml anisol og 0,1 ml 2-merkaptoætanol ved 0°C i en time. Hydrogenfluoridet afdampes under nedsat tryk og remanensen tørres grundigt i 29 1 48305 og opløses i 10 ml vand. Opløsningen føres over en kolonne af "Amberlite" IRA-410 (acetatform) og effluenten adsorberes på en kolonne af karboxymetylcellulose (1,2 x 22 cm) og der gennemføres gradienteluering med 200 ml 0,005M ammoniumacetat og 200 ml 0,15M ammoniumacetat. Fraktionerne fra 147 ml til 168 ml forenes og frysetørres hvorved det ønskede produkt vindes i findelt form. Udbytte 40 mg. α^ = -42,2° (c = 0,5 i 5% vandigt eddikesyre), Rf^ = 0,11, Rf^ = 0,755-

Aminosyreanalyse (hydrolyse med 6N HC1 i nærværelse af tiogly-kolsyre): His 1,05, Arg 1,00, Trp 0,93, Ser 0,89, Tyr 1,00,

Glu 1,00, Pro 1,02, Leu 1,00, Nle 1,00, ætylamin 1,05.

Eksempel 12 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-D-Phe-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH^ a) H-D-Phe-Leu-Arg-(N02J-Pro-NH-CHg-CH^

Til en blanding af 10 ml diklormetan og 1 ml DMF sættes 600 ml Z-D-Phe-OH, 500 mg HONB og 950 mg H-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH^ og blandingen opvarmes. Blandingen afkøles til 0°C og der tilsættes 500 mg DCC. Blandingen omrøres i 4 timer ved stuetemperatur og det som biprodukt dannede dicyklohexyl-urinstof fjernes ved filtrering. Filtratet koncentreres til tørhed under nedsat tryk og remanensen opløses i kloroform. Opløsningen vaskes 2 gange med 4%s natriumhydrogenkarbonat og 2 gange med vand og tørres over vandfrit magniumsulfat og koncentreres til tørhed under nedsat tryk. Remanensen opløses øjeblikkeligt i 2 ml iseddikesyre. Efter tilsætning af 2 ml 25%s hydrogen-bromid/iseddikesyre omrøres blandingen ved stuetemperatur i en time hvorefter der tilsættes 50 ml tør æter. Det udskilte bundfald opsamles ved filtrering, vaskes grundigt med æter og tørres. Bundfaldet opløses i 10 ml 30%s vandig metanol. Opløsningen føres gennem en kolonne af "Amberlite" IRA-410 (fri form) som elueres med 100 ml 30%s vandig metanol. Effluenten opsamles og koncentreres til fjernelse af metanol.

Frysetørring af remanensen giver den ønskede forbindelse H-D-Phe-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH^ i form af et hvidt 4 » i /

- -’I

30 148305 pulver. Udbytte 1,67 g, = -94,26° (c = 1,01 i metanol)

Beregnet for C23H45°6N9,H20; C 54,09, H 7,62, N 20,28 Fundet: C 53,84, H 7,79, N 19,91%.

b) (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-D-Phe-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH^ I 6 ml DMF opløses 290 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-OH og 240 mg H-D-Phe-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH^ hvorefter der tilsættes 150 mg HONB. Blandingen afkøles til -10°C og der tilsættes 90 mg DCC. Blandingen omrøres ved -10°C i 2 timer, ved 0°C i 2 timer og ved stuetemperatur i 6 timer. Den som biprodukt dannede urinstofforbindelse fjernes ved filtrering og der sættes 40 ml æter til filtratet. Det udskilte bundfald op-samles ved filtrering. Genudfældning fra ætanol og ætylacetat giver et råt beskyttet peptid. Udbytte 510 mg. Det rå peptid opløses i 40 ml 60%s vandig myresyre. Efter tilsætning af 1 g SnCl2,H20 til opløsningen henstår blandingen ved 80-85°C i 2 timer. Blandingen koncentreres til tørhed under nedsat tryk.

Efter tilsætning af 50 ml vand til remanensen indstilles blandingen til pH 7,0 med vandig ammoniakopløsning. Det udskilte bundfald fjernes ved filtrering. Filtratet renses på en kolonne af "Amberlite" XAD-2 og karboxymetylcellulose og frysetørres på samme måde som beskrevet i eksempel 1 hvorved den ønskede forbindelse vindes som et hvidt fnugget pulver. Udbytte 392 mg. α^ = -71,8° (c = 0,195 i 5% vandigt eddikesyre), Rf2 = 0,14,

Rf3 = 0,76.

Aminosyreanalyse (hydrolyse med 6N HC1 i nærværelse af tiogly-j kolsyre)

His 0,98, Arg 1,00, Trp 0,97, Ser 0,93, Glu 1,00, Pro 0,98,

Leu 1,00, Phe 1,96.

Eksempel 13 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Thr-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH^ a) B0C-D-Thr-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3 i 31 148305 I 10 ml acetonitril opløses 438 mg BOC-D-Thr-OH (et olieagtigt stof) og 418 mg HONB hvorefter der tilsættes 912 mg H-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH^. Blandingen afkøles til 0°C og derefter tilsættes 494 mg DCC. Blandingen omrøres ved stuetemperatur i 10 timer og de uopløselige bestanddele fjernes ved filtrering. Filtratet koncentreres til tørhed under nedsat tryk og remanensen ekstraheres med 100 ml ætylacetat. Ekstrakten vaskes med 5%s natriumhydrogenkarbonat, 10%s vandig citronsyreopløsning og vand i den nævnte rækkefølge og tørres over vandfrit natriumsulfat. Derefter koncentreres den til tørhed under nedsat tryk og remanensen genudfældes fra ætanol/æter. Proceduren giver 900 mg af den ønskede forbindelse. Smp. 119-121 °C (sønderdeling), oc^ = -38,6° (c = 0,5 i metanol), Rf1 = 0,45.

Beregnet for CggH^OgNgjI^O: C 49,76, H 7,90, N 18,65 Fundet: C 49,64, H 7,70, N 18,46%.

b) (PyrjGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Thr-Leu-Arg-Pro-NH-C^-CH^ I 10 ml trifluoreddikesyre opløses 657 mg BOC-D-Thr-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2“CH^ og opløsningen rystes i 40 minutter. Til opløsningen sættes 60 ml æter og det resulterende bundfald opsamles ved filtrering og opløses i 30 ml vand. Den vandige opløsning føres gennem en kolonne på 1 x 10 cm af "Amberlite" IR-45 (fri base) som derpå vaskes med 30%s vandig metanol. Effluenten og vaskevæskerne forenes og koncentreres til fjernelse af metanol under nedsat tryk. Remanensen fryse- tørres. Proceduren giver 471 mg D-Thr-Leu-ArgirR^J-Pro-NH-CI^- CH-j. I 2 ml DMF opløses 167 mg af dette produkt og 175 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH hvorefter der tilsættes 67 mg HONB. Blandingen afkøles til -5°C og der tilsættes 77 mg DCC. Blandingen omrøres ved -5°C i 3 timer og derefter ved stuetemperatur i 10 timer. De uopløselige bestanddele frafiltreres og der sættes 50 ml ætylacetat til filtratet. Det resulterende bundfald opsamles ved filtrering og genudfældes fra DMF/ætylacetat. Udbytte 290 mg. En portion på 160 mg af dette produkt opløses i 10 ml 60%s vandig myresyre og med tilsætning af 400 mg SnClgj^O behandles opløsningen ved 80°C i 2 timer. Reaktionsblandingen . Ί 148305 32 koncentreres til tørhed under nedsat tryk. Derpå tilsættes 10 ml vand og de uopløselige bestanddele filtreres fra. Filtratet renses ved kromatografi på "Amberlite" XAD-2, karboxymetylcellulose og "Biogel" P-2. Proceduren giver 65 mg af den ønskede forbindelse .

cc^2 = -37,4° (c = 0,5 i 5% vandig eddikesyre), Rf2 = 0,12,

Rf3 = 0,68.

Aminosyreanalyse (hydrolyse med 6N HC1 i nærværelse af tiogly-kolsyre):

His 1,00, Arg 0,97, Trp 0,94, Thr 1,03, Ser 0,90, Glu 1,00, Pro 1,06, Leu 1,06, Tyr 1,00, ætylamin 1,10.

Eksempel 14 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Ile-Arg-Pro-NH-CH2-CH3 a) Z-Ile-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3 I 12 ml 25%s hydrogenbromid/iseddikesyre opløses 1,43 g Z-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3 og blandingen rystes i 40 minutter ved stuetemperatur. Til denne opløsning sættes 300 ml tør æter og det resulterende bundfald opsamles ved filtrering og tørres i en exsikkator over natriumhydroxyd. Det vundne pulver opløses i 25 ml DMF og opløsningen neutraliseres med 0,84 ml triætylamin og afkøles til 0°C. Derefter tilsættes 795 mg Z-Ile-OH, 590 mg HONB og 680 mg DCC og blandingen omrøres ved 0°C i 5 timer og ved stuetemperatur i 8 timer. Reaktionsblandingen filtreres og filtratet inddampes. Remanensen opløses i 100 ml kloroform, vaskes med 0,1N saltsyre, 5%s natriumhydrogenkarbonat og vand hvorefter den tørres over magniumsulfat. Efter afdampning af opløsningsmidlet udfældes remanensen fra ætylacetat/æter. Genudfældning fra ætanol/æter giver 1,1 g af det ønskede produkt med snip. 103-105°C.

a^3 = -58,1° (c = 1,0 i metanol), Rf1 = 0,48

Beregnet for 02^Η^20^Ν8,1/2Η20: C 54,08, H 7,23, N 18,68 Fundet: C 53,80, H 7,15, N 18,84%.

Λ 33 1A 8 3 O 5 b) Z-D-Leu-Ile-Arg(N02)-Pro-NH~CH2-CH5 I 4 ml 25%s hydrogenbromid/iseddikesyre opløses 590 mg Z-Ile-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3 og blandingen omrystes ved stuetemperatur i 40 minutter. Til denne opløsning sættes 50 ml tør æter og det resulterende bundfald opsamles ved filtrering og tørres i en exsikkator over natriumhydroxyd. Det vundne pulver opløses i 8 ml DMF og opløsningen neutraliseres med 0,14 ml triætylamin og afkøles til 0°C. Derefter tilsættes 264 mg Z-D-Leu-OH, 216 mg HONB og 247 mg DCC og blandingen omrøres ved 0°C i 2 timer og ved stuetemperatur i 12 timer. Derefter behandles reaktionsblandingen på samme måde som beskrevet i eksempel 14 a) hvorved der vindes 620 mg af det ønskede produkt med smp. 112-115°C a^p = -47,8° (c = 0,5 i metanol), Rf1 = 0,53-

Beregnet for C^H^OgNg.F^O: C 54,91, H 7,68, N 17,47 Fundet: C 54,72, H 7,52, N 17,19%.

c) (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Ile-Arg-Pro-NH-CH2-CH3 3 ml 25%s hydrogenbromid/iseddikesyre opløses 220 mg Z-D-Leu-Ile-Arg(N02)-Pro-H-CH2-CH3 og opløsningen omrystes ved stuetemperatur i 50 minutter. Til denne opløsning sættes 50 ml tør æter og det resulterende bundfald opsamles ved filtrering og tørres i en exsifckator over natriumhydroxyd. Dette materiale opløses i en lille mængde vand og føres gennem en kolonne på 1,2 x 7 cm af "Amberlite" IR-45 (fri form). Effluenten og vaskevæskeme forenes og frysetørres. Materialet opløses i 5 ml DMF sammen med 230 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH og 108 mg HONB. Blandingen afkøles til -10°C og der tilsættes 124 mg DCC. Blandingen omrøres ved -10°C i 2 timer, i 2 timer ved 0°C og i 10 timer ved stuetemperatur hvorefter den filtreres. Filtratet koncentreres og remanensen renses på en kolonne på 1,8 x 20 cm af "Amberlite" XAD-2 (200-300 mesh) med gradienteluering med 250 ml 5%s vandig ætanol og 250 ml 80%s vandig ætanol. Det ønskede produkt fremkommer i fraktionerne fra 150 ml til 300 ml.

Disse fraktioner koncentreres under nedsat tryk og frysetørres.

Det således vundne materiale opløses i 7 ml 60%s vandig myresyre og der tilsættes 450 mg SnCl2,H2o. Blandingen opvarmes til U8305 34 80-85°C i 2 timer. De uopløselige bestanddele filtreres fra og filtratet inddampes til tørhed under nedsat tryk. Remanensen ekstraheres med 30 ml varmt vand (80°C). Ekstrakten filtreres og filtratet føres på en kolonne på 1,8 x 15 cm af "Amberlite" XAD-2 (200-300 mesh) og kolonnen vaskes grundigt med vand. Til eluering anvendes en lineær gradient af vandig ætanol (20-80%, 250 ml-250 ml). Den ønskede forbindelse fremkommer i fraktionerne fra 100 ml til 230 ml. Disse fraktioner forenes og koncentreres under nedsat tryk til fjernelse af ætanol. Koncentratet føres gennem en kolonne på 1,2 x 40 cm af karboxymetylcellulose og derefter elueres produktet ved lineær gradienteluering (0,005M -0,2M ammoniumacetat, pH 6,8, 200 ml-200 ral). Det ønskede peptid fremkommer i fraktionerne fra 180 ml til 280 ml. Disse fraktioner forenes og frysetørres. Udbytte 130 mg. ajp = -39,2° (c = 0,5 i 5% vandig eddikesyre), Rf2 = 0,11. Aminosyreanalyse (hydrolyse med 6N HC1 i nærværelse af tiogly-kolsyre).

His 0,97, Arg 1,02, Trp 0,92, Ser 0,94, Glu 1,00, Pro 1,05,

Ile 1,00, Leu 1,00, Tyr 0,97.

Eksempel 15 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Nle-Arg-Pro-NH-CH2“CH^ a) Z-Nle-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3 I 10 ml 25%s hydrogenbromid/iseddikesyre opløses 715 mg Z-ArgiNO^-Pro-NH-CI^-CH^ og blandingen omrystes ved stuetemperatur i 30 minutter. Til dame opløsning sættes 250 ml tør æter og det resulterende bundfald opsamles ved filtrering og tørres i en exsikkator over natriumhydroxyd. Det således vundne pulver opløses i 15 ml DMF sammen med 400 mg Z-Nle-OH og opløsningen afkøles til 0°C. Til denne opløsning sættes 0,45 ml tri-ætylamin og derefter 295 mg HONB og 340 mg DCC. Blandingen omrøres ved 0°C i 3 timer og i 10 timer ved stuetemperatur. Derefter behandles reaktionsblandingen som beskrevet i eksempel 14-a) hvorved man vinder det ønskede produkt. Udbytte 824 mg, smp. 109-110°C.

U8305 35 aj^ = -50,4° (c = 0,5 i metanol), Rf1 = 0,41

Beregnet for C2yH^20^Ng,l/2H20: C 54,08, H 7,23, N 18,68 Fundet: C 53,79, H 7,09, N 18,34%.

b) Z-D-Leu-Nle-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH5 I 5 ml 25%s hydrogenbromid/iseddikesyre opløses 590 mg Z-Nle-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH·^ og blandingen rystes i 40 minutter ved stuetemperatur. Til denne opløsning sættes 200 ml tør æter og det resulterende bundfald opsamles ved filtrering og tørres i enexsikkator over natriumhydroxyd. Produktet opløses i 5 ml DMF og opløsningen neutraliseres med 0,14 ml triætylamin ved 0°C. Der tilsættes 264 mg Z-D-Leu-0H, 216 mg HONB og derefter 247 mg DCC ved 0°C. Blandingen omrøres i 2 timer ved 0°C og i 10 timer ved stuetemperatur og behandles derefter som beskrevet i eksempel 14-b) hvorved der vindes 594 mg af det ønskede produkt. Smp. 101-103°C.

= -45,2° (c = 0,5 i metanol), Rf1 = 0,55

Beregnet for C33H53°8N9’H20: C 54,91, H 7,68, N 17,47 Fundet: C 54,63, H 7,54, N 17,08%.

c) (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Nle-Arg-Pro-NH-CH2-CHj i I 4 ml 25%s hydrogenbromid/iseddikesyre opløses 350 mg Z-D-Leu-Nle-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH-j og blandingen omrystes i 40 minutter ved stuetemperatur. Til blandingen sættes ; 300 ml tør æter og det resulterende bundfald opsamles ved fil trering og tørres i en exsjkkator over natriumhydroxyd.

Det således vundne materiale opløses i 200 ml vand og opløsningen føres gennem en kolonne på 1,2 x 7 cm af "Amber-lite" IR-45 (fri fonn). Kolonnen vaskes grundigt med vand.

Effluenten og vaskevæskerne forenes og frysetørres. Dette produkt kobles med 345 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH i 6 ml DMF i nærværelse af 180 mg HONB og 206 mg DCC. Blandingen oparbejdes og det vundne produkt renses ved kromatografi på "Amberlite" XAD-2 som beskrevet i eksempel 14-c). Fjernelse af nitrogruppen ,1 U8305 36 og rensning af den ønskede peptid kan også gennemføres på en måde svarende til den der er beskrevet i eksempel 14-c). Udbytte 213 mg. «g3 = -38,6° (c = 0,5 i 5% vandig eddikesyre), Rf^ = 0,10.

Aminosyreanalyse (hydrolyse med 6N HC1 i nærværelse af tiogly-kolsyre): His 0,98, Arg 1,00, Trp 0,91, Ser 0,95, Glu 1,00, Pro 1,08 Leu 1,00, Nle 1,00, Tyr 0,96.

Eksempel 16 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Val-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH^ a) BOC-D-Val-Leu-Arg-(N02)-Pro-NH-CH2-CH3

Til en opløsning af 540 mg BOC-D-Val-OH (olie) og 1,14 g H-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH^ i 10 ml DMF sættes 537 mg Η0ΝΒ og 620 mg DCC ved 0°C. Blandingen omrøres i 3 timer ved 0°C og i 10 timer ved stuetemperatur hvorpå den filtreres. Filtratet inddampes under nedsat tryk til tørhed og remanensen opløses i 100 ml ætylacetat. Opløsningen vaskes med 0,1N saltsyre, 5%s na-triumhydrogenkarbonat, tørres over vandfrit natriumsulfat og inddampes. Remanensen tritureres med petroleumsæter hvorved der vindes et råprodukt som derefter genudfældes fra ætylacetat/æter. Udbytte 1,1 g, smp. 144-146°C (sønderdeling).

= -43,7° (c = 1,0 i metanol), Rf1 = 0,55

Beregnet for C2gH^^0gNg,1/2H20: C 52,39, H 8,18, N 18,96 Fundet: C 52,40, H 8,32, N 18,52%.

b) (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Val-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH^ I 5 ml trifluoreddikesyre opløses 300 mg BOC-D-Val-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH^ og blandingen omrystes i 30 minutter ved stuetemperatur. Til opløsningen sættes 50 ml tør æter og det resulterende hvide faste stof opsamles og tørres under nedsat tryk i en exsikkator over natriumhydroxyd. Dette materiale opløses i 20 ml 20%s vandig metanol og opløsningen føres til en kolonne 37 148305 på 1 x 5 cm af "Amberlite" IR-45 (fri form). Kolonnen vaskes med det samme opløsningsmiddel. Effluenten og vaskevæskerne forenes, koncentreres til et lille rumfang og frysetørres. Udbytte 165 mg. Dette materiale (150 mg) opløses i 2 ml DMF sammen med 168 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH og 65 mg HONB og blandingen afkøles til 0°C. Derefter tilsættes 75 mg DCC og blandingen omrøres i 2 timer ved 0°C og i 12 timer ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen filtreres og fortyndes med 50 ml ætylacetat. Bundfaldet opsamles ved filtrering, tørres og renses ved søjlekromatografi på silikagel (4 g). Til eluering an-2 vendes Rf -opløsningsmiddelsystemet. De fraktioner der indeholder det beskyttede nonapeptid forenes og opløsningsmidlet afdampes til tørhed. Udbytte 140 mg. Dette beskyttede nonapeptid (110 mg) behandles med 4 ml vandfrit hydrogenfluorid i nærværelse af 0,1 ml anisol og 0,02 ml merkaptoætanol ved 0°C i en time. Hydrogenfluoridet fjernes under nedsat tryk og remanensen ekstraheres med 20 ml vand. Ekstrakten vaskes med æter og føres gennem en kolonne på 1,5 x 3 cm af "Amberlite" IRA-400 (acetatform) og kolonnen vaskes med vand. Effluenten og vaskevæskerne forenes og frysetørres. Materialet opløses i en lille mængde vand og opløsningen føres til en kolonne på 1,2 x 30 cm af karboxymetylcellulose. Til eluering anvendes en lineær gradient af ammoniumacetat (0,005M, 150 ml-150 ml). Det ønskede produkt fremkommer i fraktionerne på 110 ml til 130 ml. Disse fraktioner forenes og frysetørres. Udbytte 87 mg. ocjp = -40,8° (c = 0,5 i 5% vandig eddikesyre), Rf^ = 0,12,

Rf5 = 0,66.

Aminosyreanalyse (hydrolyse med 6N HC1 i nærværelse af tiogly-kolsyre): His 1,00, Arg 1,02, Trp 0,85, Ser 0,95, Glu 0,98,

Pro 1,02, Val 0,91, Leu 0,95, Tyr 1,00, ætylamin 1,01.

Eksempel 17 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Met-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH^ a) B0C-D-Met-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3 B0C-D-Met-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3 fremstilles 38 148305 på en måde svarende til den der er beskrevet i eksempel 16-a) ud fra 623 mg BOC-D-Met-OH, 114 g H-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH5, 537 mg HONB og 620 mg DCC. Udbytte 1,1 g, smp. 125-130°C (sønderdeling) a^p = -51,5° (c = 1,0 i metanol), Rf1 = 0,59

Beregnet for C2gH^^0QNgS: C 50,64, H 7,77, N 18,32, S 4,65 Fundet: C 50,51, H 7,52, N 18,54, S 4,30%.

b) (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Met-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH^ I 3 ml trifluoreddikesyre opløses 300 mg BOC-D-Met-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH^ og blandingen omrystes i 20 minutter ved stuetemperatur. Til denne blanding sættes 40 ml tør æter og det resulterende hvide bundfald opsamles ved filtrering og tørres. Dette materiale omdannes til den frie form ved at føre igennem en kolonne på 1x5 cm af "Amberlite", IR-45 (fri form) som beskrevet i eksempel 16-b). Det resulterende delvis beskyttede tetrapeptid, H-D-Met-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH^ (147 mg) får lov til at reagere med 171 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH i nærværelse af 57 mg HONB og 77 mg DCC hvorved der vindes et delvist beskyttet nonapeptid. Denne forbindelse renses på en kolonne af "Amberlite" XAD-2 og behandles derefter med SnCl2,H20 i 60%s vandig myresyre i 2 timer ved 80-85°C. Det således vundne slutprodukt renses ved kromatografi på "Amberlite" XAD-2 og karboxymetylcellulose. Alle disse procedurer er magen til dem der er beskrevet i eksempel 16-b). Udbytte 79 mg. oc^p = -39,6° (c = 0,5 i 5% vandig eddikesyre), Rf^ = 0,16,

Aminosyreanalyse (hydrolyse med 6N HC1 i nærværelse af tiogly-kolsyre): His 1,02, Arg 1,00, Trp 0,90, Ser 0,89, Glu 1,00,

Pro 1,00, Met 0,91, Leu 0,98, Tyr 1,02, ætylamin 1,00.

Eksempel 18 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ile-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH^ a) BOC-D-Ile-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3 t 39 148305 BOC-D-Ile-Leu-ArgiNO^-Pro-NH-CHg-CH^ fremstilles på en måde svarende til den der er beskrevet i eksempel 16-a) ud fra 579 mg BOC-D-Ile-OH, 1,14 g H-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CHj, 537 mg HONB og 620 mg DCC. Udbytte 0,9 g, smp. 127-131°C (sønderdeling).

= - 48,3° (c = 1,0 i metanol)

Beregnet for C30H55°8N9: C 53,79, H 8,27, N 18,18 Fundet: C 53,81, H 8,31, N 18,65#· b) (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ile-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH^ I 3 ml trifluoreddikesyre opløses 300 mg BOC-D-Ile-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH·^ og blandingen rystes i 25 minutter ved stuetemperatur. Til denne blanding sættes 40 ml tør æter og r·' det resulterende bundfald opsamles ved filtrering og tørres. Dette materiale omdannes til den frie form ved at føre det gennem en kolonne på 1,5 cm af "Amberlite" IR-45 (fri form) som beskrevet i eksempel 16-b). Det resulterende delvis beskyttede tetrapep-tid, H-D-Ile-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH·^ (145 mg), får lov til at reagere med 171 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH, 67 mg HONB og 77 mg DCC hvorved der vindes et delvis beskyttet nonapeptid.

Denne forbindelse renses på en søjle af "Amberlite" XAD-2 og behandles derefter med SnCl2,H20 i 60#s vandig myresyre i 2 timer ved 80-85°C. Det således vundne produkt renses ved kromatografi på "Amberlite" XAD-2 og karboxymetylcellulose. Alle disse procedurer svarer til dem der er beskrevet i eksempel 16-b).

Udbytte 93 mg.

; ajp = - 41,5° (c = 0,5 i 5% vandig eddikesyre), Rf2 = 0,13 ! Rf3 = 0,66.

Aminosyreanalyse (hydrolyse med 6N HC1 i nærværelse af tiogly-kolsyre): His 0,98, Arg 1,00, Trp 0,89, Ser 0,91, Glu 0,95,

Pro 1,00, Ile 1,00, Leu 1,00, Tyr 1,00, ætylamin 1,01.

\l ' » 40 148305

Biologisk forsøgsrapport

Der er foretaget en bestemmelse af de ifølge opfindelsen fremstillede forbindelsers ovulationsfremkaldende virkning ved anvendelse af den metode, der er beskrevet i J. Med. Chem.

16, 1144-1147, (1973), idet virkningen sammenlignes med virkningen af LH-RH = (Pyr)Glu-Ηίs-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 og af en nært beslægtet, kendt LH-RH-analog.

Resultaterne fremgår af følgende tabel: (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-R1-R2-R3-Arg-Pro-NH-R4

Ovulationsfremkalden- 1 o -i λ de virkning (%)

R R R R

(LH-RH = 100)

Tyr D-Abu Leu ætyl 6520

Tyr D-Nva Leu ætyl 5810

Tyr D-Leu Leu ætyl 8270

Tyr D-Leu Leu metyl 1525

Tyr D-Leu Leu propyl 3644

Phe D-Leu Leu ætyl 4580

Tyr D-Leu Leu isopropyl 2756

Tyr D-Thr Leu ætyl 4135

Phe D-Phe Leu ætyl 5400

Tyr D-Ser Leu ætyl 6140

Tyr D-Val Leu ætyl 3525

Tyr D-Ser Nle ætyl 2760

Tyr D-Leu Ile ætyl 4250 (x) ( Pyr)Glu-His-Trp-Ser~Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH2 500

Nva = norvalin, Nle = norleucin, Abu = aminosmørsyre, (x) kendt forbindelse, Biochem.Biophys.Res.Commun. Bind 49, nr. 3, side 863-869 (1972) .

Claims (1)

1 A 03 O 5 Analogifremgangsmåde til fremstilling af et LH-RH-analogt nonapeptidamidderivat med den almene formel (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-R^-R2-R^-Arg-Pro-NH-R^ I 1 2 hvor R er Tyr eller Phe, R er D-Leu, D-Ile, D-Nle, D-Val, D-Nva, D-Abu, α-Aibu, D-Phe, D-Phg, D-Ser, D-Thr eller D-Met, R^ er Leu, 4 Ile eller Nle og R er en alkylgruppe med 1-3 kulstofatomer som kan være substitueret med en hydroxylgruppe, eller et salt eller metalkompleks deraf, kendetegnet ved at man kondenserer et reagens A - L-pyroglutaminsyre eller et peptidfragment som indeholder fra 1 til 9 aminosyrer af den ovennævnte aminosyrese-kvens, regnet fra den N-terminale ende, og som har en L-pyrogluta-minsyreenhed (dvs. (Pyr)Glu-) i sin N-terminale ende - med et reagens B - en aminoforbindelse som svarer til den resterende del af det ovennævnte nonapeptidamidderivat -, hvilke reagenser A og B eventuelt er beskyttede, hvorefter man fjerner eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrupper og om ønsket omdanner det dannede produkt til et salt eller et metalkompleks deraf. Fremdragne publikationer: Biochem.Biophys.Res.Commun., bind 49, nr. 3, 1972, side 863-869. % i