DK149755B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af lhrh-analoge nonapeptidamidderivater eller fysiologisk acceptable salte eller metalkomplekser deraf - Google Patents
Analogifremgangsmaade til fremstilling af lhrh-analoge nonapeptidamidderivater eller fysiologisk acceptable salte eller metalkomplekser deraf Download PDFInfo
- Publication number
- DK149755B DK149755B DK441083A DK441083A DK149755B DK 149755 B DK149755 B DK 149755B DK 441083 A DK441083 A DK 441083A DK 441083 A DK441083 A DK 441083A DK 149755 B DK149755 B DK 149755B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- parts
- weight
- arg
- pro
- volume
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
14.9755 i
Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangs-måde til fremstilling af hidtil ukendte LHRH-analoge nonapeptid-amidderivater med den almene formel
H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-A1-Gly-A2-Arg-Pro-Y I
1 2 hvor A betegner Tyr eller Phe, hvor A betegner Leu, ILe, NLe, Val, NVal eller Met og hvor Y betegner en gruppe NHR hvor R er en lige eller grenet alkylgruppe med 1-3 kulstofatomer, eventuelt substitueret med hydroxy, eller fysiolo-•gisk acceptable salte eller metalkomplekser deraf. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.
I nærværende beskrivelse betegner (pyr)Glu, His, Trp,
Ser, Tyr, Phe, Gly, Leu, ILe, NLe, Val, NVal, Met, Arg og Pro "resterne" af henholdsvis L-pyroglutaminsyre, L-histidin, L-tryp-tofan, L-serin, L-tyrosin, L-fenylalanin, glycin, L-leucin, L-isoleucin, L-norleucin, L-valin, L-norvalin, L-metionin, L-argi-nin og L-prolin. Med udtrykket "rest" menes en gruppe afledet af den tilsvarende α-aminosyre ved eliminering af OH-delen fra karb-oxylgruppen og H-delen fra a-aminogruppen. I tilfælde af fx L-arginin,
HN
NHCHoCHrtCHrtCHCOOH
/ 2 2 2.
H2N NH2 der kan gengives ved formlen NH2-A-C00H (hvor NH2 angiver <x-ami-nogruppen), betegner gruppen (-NH-A-CO-) således en "rest" af L-arginin og forkortes til "-Arg-". Forkortelser for de andre ovenfor nævnte a-aminosyrer har tilsvarende betydning som den belysning der netop er givet for L-arginins vedkommende.
Med hensyn til ovennævnte substituent R, en lige eller grera alkylgruppe med 1-3 kulstofatomer, der kan være hydroxysubstitueret, kan som eksempler angives metyl, ætyl, n-propyl, i-propyl, hydroxymetyl, 1-hydroxyætyl, 2-hydroxyætyl, 2-hydroxy-n-propyl, 3-hydroxy-n-propyl og 2,2-dihydroxy-i-propyl.
2 149755
Det har i mange år været kendt at hypothalamus indeholder faktorer som på højere niveau kontrollerer udskillelsen af tropiske hormoner fra hypofysen. For nylig er der, efter isoleringen af et tyrotropinfrigivende hormon (TRH), blevet ekstraheret et hormon, som fremmer secerneringen af luteiniseringshormonet (LH), i ren form fra svin og får, og det er påvist at være et dekapeptid med strukturen H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (A. V. Schally et al, Biochem. Biophys. Res. Commun.
43, 1334, 1971; R.Gnillemin et al Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 69, 278, 1972). Dette resultat er efterfulgt af syntese af et antal lignende peptider, og der er også udført biologiske forsøg med disse analoge peptider. Imidlertid formindsker selv en lille modifikation i den ovenfor viste aminosyresammensætning alvorligt peptidets fysiologiske aktivitet, og den ovenfor viste kemiske struktur har været anset for afgørende for udviklingen af maximal fysiologisk aktivitet (A. V. . schally et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 4, 366, 1972).
På trods heraf er det nu lykkedes at syntetisere no-napeptidamidderivater med formel I og farmaceutisk acceptable salte deraf, og det har overraskende vist sig at disse forbindelser har kraftigere ovulationsinducerende virkning end det naturligt forekommende dekapeptid. Det har også vist sig at forbindelserne med den almene formel I virker på hypofysen og her fremmer sekretionen både af luteiniseringshormon og follikelstimulerende hormon. Det har endvidere vist sig at de nævnte forbindelser er nyttige både i humanmedicinen og veterinærmedicinen, således hos mennesker til behandling af amenorrhea og på det veterinære område hos dyr til induktion af ovulation og derved indirekte til induktion af svangerskab i tilfælde af forskellige sygelige tilstande i ovariet såsom ovariefollikelcyster. Nærmere belysning heraf findes sidst i nærværende beskrivelse.
Som det fremgår af patentkrav 1 fremstilles nonapeptid-amidderivater med den almene formel I ved at et reagens (A), L-pyroglutaminsyre eller et peptidfragment som indeholder en L-glutaminsyreenhed (dvs. H-(Pyr)Glu-) ved den N-terminale ende og som samtidig regnet derfra indeholder den ovennævnte amino-syresekvens, kondenseres med et reagens (B), nemlig en amin-komponent som svarer til den resterende del af det ovennævnte 1*9755 3 nonapeptidamidderivat med den almene formel I, idet de to reagenser (A) og (B) om ønsket er beskyttet med en eller flere beskyttelsesgrupper, hvorpå eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrupper fjernes.
Den indbyrdes relation mellem reagenserne A og B er derfor som det fremgår af nedenstående skema.
Metode Reagens A Reagens B
nr.
1 H-(Pyr)Glu-OH H-His-Trp-Ser-A1-Gly-A2-Arg-
Pro-Y
2 H-(Pyr)Glu-His-OH H-Trp-Ser-A1-Gly-A2-Arg-Pro-Y
3 H-(Pyr)Glu-Hi s-Trp-OH H-Ser-A^-Gly-A2 -Arg-Pro-Y
4 H-(Pyr) Glu-His-Trp-Ser- H-A^Gly-A2-Arg-pro-Y
OH
5 H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser- H-Gly-A2-Arg-Pro-Y
A -OH
6 H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser- H-A2-Arg-Pro-Y
A—Gly-OH
7 H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser- H-Arg-Pro-Y
A -Gly-A2-OH
8 H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser- H-Pro-Y
A ^-Gly-A 2-Ar g-OH
9 H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser- H-Y
12
A--Gly-A.-Arg-Pro-OH
4 149755 Når der som reagens A anvendes en forbindelse fra venstre kolonne, skal som reagens B bruges forbindelsen i højre kolonne på samme linie, der nemlig indeholder den resterende del af det ønskede produkt og således behøves i kondensationsreaktionen. Reagenset A og/eller B kan beskyttes før kondensationsreaktionen eller aktiveres under kondensationsreaktionen, nærmere betegnet før peptidbindingsdannelsesreaktionen som det beskrives i det følgende.
Blandt fagfolk på peptidsynteseområdet er det velkendt at alle slags peptider kan fremstilles ved at man kondenserer en aminosyre eller et fragmentpeptid (dvs et peptid med et mindre antal enheder) med en aminosyre eller et andet fragmentpeptid (atter et peptid med færre antal enheder end det ønskede slutprodukt). Der kendes udmærket et antal forskellig slags teknik til sådanne kondensationsreaktioner.
Fx kan den eller de funktionelle grupper (fx en amino-gruppe, karboxygruppe, hydroxygruppe, guanidinogruppe) der ikke er indblandet i den reaktion, ved hvilken peptidbindingen (dvs. -CONH-) dannes under kondensationen, beskyttes ved hjælp af en eller flere beskyttelsesgrupper før kondensationsreaktionen. Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan reagenset A eller B beskyttes på den eller de funktionelle grupper, som ikke deltager i kondensationsreaktionen, i overensstemmelse med i og for sig kendte fremgangsmåder.
Det er velkendt at man før peptidbindingsdannelsesreaktionen aktiverer den C-terminale karboxylgruppe eller den N-terminale aminogruppe i en aminosyre eller et peptidfragment, som er involveret i peptidbindingsdannelsesreaktionen, for at sætte den i stand til at fremkalde peptidbindingsdannelsen, og at peptidbindingsdannelsesreaktionen udføres i nærværelse af et dehydratiseringsmiddel hvis den ikke er aktiveret. Fremgangsmåder til aktivering af C-terminale karboxyl grupper og N-terminale aminogrupper er velkendte. Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan sådanne kendte fremgangsmåder anvendes. Dvs. at kondensationen ifølge opfindelsen kan udføres ved et første trin med aktivering af den C-terminale karboxylgruppe i reagenset A eller aktivering af den N-terminale aminogruppe i reagenset B, og et andet trin méd peptidbindingsdannelsesreaktionen mellem det aktiverede reagens A og reagens B eller mellem reagen- 5 148755 set A og det aktiverede reagens B; man kan også udføre reaktionen ved en peptidbindingsdannelsesreaktion mellem reagenset A og B i nærværelse af et dehydratiseringsmiddel, idet reagenserne A og B eventuelt er beskyttede.
Det er også kendt at når den eller de ovennævnte funktionelle grupper er beskyttede med beskyttelsesgrupper før kondensationsreaktionen, så kan beskyttelsesgruppen eller beskyttelsesgrupperne fjernes efter kondensationsreaktionen. Ved den foreliggende fremgangsmåde udføres fjernelse af beskyttelsesgrupper i overensstemmelse med kendt teknik.
I denne sammenhæng er det kendt at en beskyttet L-glut-amylgruppe med den almene formel
rco-ch2ch2ch(nh2)co- II
hvor R er en alkoxygruppe (fx metoxy, ætoxy, n-propoxy, i-propoxy eller n-butoxy), en aralkoxygruppe (fx benzyloxy) eller amino-gruppe let kan omdannes til selve L-pyroglutamylgruppen
T
ved kontakt med en base som fx ammoniak eller en syre som fx eddikesyre, og at gruppen II er ækvivalent med selve L-pyroglutamyl gruppen i denne henseende. Ved den foreliggende fremgangsmåde skal det forstås at L-pyroglutamylgruppen (dvs. H-(Pyr)Glu-) i reagenset A ikke blot skal opfattes som selve L-pyroglutamylgruppen, men også den beskyttede L-glutamylgruppe med den almene formel II. I tilfælde hvor H-(Pyr)Glu- i reagenset A er en gruppe II, omdannes gruppen II let til selve L-pyroglutamylgruppen i overensstemmelse med i og for sig kendt teknik.
Nedenfor nævnes nogle af de procedurer der med fordel kan anvendes til gennemførelse af peptidbindingsdannelsesreaktionen ifølge opfindelsen.
l) Den metode som består i at et beskyttet eller ubeskyttet reagens A, hvis C-terminale gruppe er en fri karboxyl-gruppe, omsættes med et beskytte eller ubeskyttet reagens B hvis N-terminale aminogruppe er en fri aminogruppe, i nærværelse 6 148715 af et kondensationsmiddel.
2) Den fremgangsmåde som består i at et beskyttet eller ubeskyttet reagens A, hvis C-terminale karboxylgruppe er blevet aktiveret, omsættes med et reagens B hvis N-terminale aminogruppe er en fri aminogruppe.
3) Den metode som består i at et beskyttet eller ubeskyttet reagens A, hvis C-terminale karboxylgruppe er en fri . karboxylgruppe, omsættes med et beskyttet eller ubeskyttet reagens B, hvis N-terminale aminogruppe er blevet aktiveret.
Eksempler på en beskyttelsesgruppe for den intramole-kylære aminogruppe på L-pyroglutaminsyre er således benzyloxy-karbonyl, t-butoxykarbonyl og isobornyloxykarbonyl; eksempler på beskyttelsesgrupper for iminogruppen i L-histidin er benzyl, tosyl, 2,4-dinitrofenyl, t-bu±oxykarbonyl og karbobenzoxy; eksempler på beskyttelsesgrupper for hydroxylgruppen i L-serin er sådanne æterdannende grupper som benzyl og t-butyl; eksempler på beskyttelsesgrupper for hydroxylgruppen i tyrosin er sådanne æterdannende grupper som benzyl og t-butyl; eksempler på beskyttelsesgrupper for guanidinogruppen i L-arginin er nitro, tosyl, karbobenzoxy, isobornyloxykarbonyl og adamantyloxykarbonyl. Desuden kan guanidinogruppen i L-arginin beskyttes ved saltdannelse med en proton som afledes af en syre (fx saltsyre eller brombrin-tesyre), og det vil forståsat protonen indgår i begrebet beskyttelsesgruppe i nærværende beskrivelse.
Denaktiverede form for den C-terminale karboxylgruppe i reagenset A kan eksemplificeres ved det tilsvarende syreanhy-drid såsom et blandet anhydrid med en karbonsyremonoalkylester; eller et azid; eller en aktiv ester såsom den tilsvarende ester med en alkohol såsom pentaklorfenol, 2,4,5-triklorfenol, 2,4-dinitrofenol, cyanometyl alkohol, p-nitrofenol, N-hydroxysuccin-imid, N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dikarboxamid, N-hydroxyftalimid, N-hydroxybenztriazol. Blandt disse estere foretrækkes N-hydroxy- 5-norbornen-2,3-dikarboximidesteren. Skønt N-hydroxy-5-norbor-nen-2,3-dikarboximidestere af aminosyrer eller peptider er hidtil ukendte, kan de fremstilles i overensstemmelse med samme metode som den der anvendes til fremstilling af N-hydroxysuccin-imidestere af aminosyrer eller peptider.
Det tilsvarende fosforsyreamid nævnes som et eksempel på en aktiveret form af den N-terminale aminogruppe i det beskyt- U9755 7 tede eller ubeskyttede reagens B.
Som dehydratiseringsmiddel kan man bruge'et hvilket som helst reagens af de arter der bruges i peptidsynteser. I særlig grad foretrækkes de såkaldte karbodiimidreagenser såsom dicyklo-hexylkarbodiimid.
Ved gennemførelse af kondensationsreaktionen ifølge opfindelsen kan man i en enkelt reaktor anbringe l) det beskyttede eller ubeskyttede reagens A med fri c-terminal karboxylgruppe, 2) det beskyttede eller ubeskyttede reagens B med fri N-terminal ami-nogruppe, 3) den ovennævnte alkohol sctn fx N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dikarboximid eller N-hydroxysuccinimid, og 4) dehydratiseringsmiddel. I det tilfælde reagerer det beskyttede eller ubeskyttede reagens A med fri C-terminal karboxylgruppe med alkoholen ved hjælp af dehydratiseringsmidlet til dannelse af det beskyttede eller ubeskyttede reagens A med aktiveret C-terminal karboxyl-gruppe, hvorefter det således dannede beskyttede eller ubeskyttede reagens A med aktiveret C-terminal karboxylgruppe reagerer med det beskyttede eller ubeskyttede reagens B med fri N-terminal ami-nogruppe. Ved·-denne udførelsesform udføres aktiveringen af den C-terminale karboxylgruppe og dannelsen af peptidbindingen under ét i en enkelt beholder.
Ved fremstillingen af de ovennævnte peptider med den almene formel I kan man således vælge mellem forskellige udførelsesformer og kombinationer af de nødvendige procedurer.
En foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen vises skematisk i det følgende.
8 *4*756 i) H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-A1-Gly-OK (reagens A)
+ DCC + HONBI
aktivering Ψ ?
/ \ 1 2 I
H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-A -Gly-ONBI + H-A ,-Arg-Pro-Y
aktiveret reagens A beskyttet reagens B
I dannelse af J, peptidbinding
Z
1 2 I
H-(Pyr)-Glu-His-Trp-Ser-A -Gly-A -Arg-Pro-Y
fjernelse af beskyttelse Ψ
Η-(Pyr jGlu-His-Trp-Ser-A1-Gly-A2-Arg-Pro-Y
Z
Il)H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-A1-Gly-OH + H-A -Arg-Pro-Y
reagens A beskyttet reagens B
+ DCC + HONBI
(l) aktivering
© peptidbindingsdannelse Ψ Z
. 1 2 I
H-(Pyr)Glu-His-ITp-Ser-A -Gly-A -Arg-Pro-Y
fjernelse af beskyttelse Ψ
/ \ . 1 2 H-(PyrJGlu-His-Trp-Ser-A -Gly-A -Arg-Pro-Y
9 149755 I dette skema står DCC for N,N'-dicyklohexylkarbodiimid, HONBI for N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dikarboximid og Z en beskyttelsesgruppe på guanidinogruppen i L-argininresten.
Peptidbindingsdannelsesreaktioner som dem der nævnes ovenfor under l), 2) eller 3) udføres i almindelighed i et passende opløsningsmiddel. Eksempler på opløsningsmidler er tørt eller vandigt dimetylformamid, dimetylsulfoxyd, pyridin, kloroform, dioxan, diklormetan,eller tetrahydrofuran eller blandinger af sådanne opløsningsmidler.
Omend reaktionstemperaturen sædvanligvis ligger i området fra ca. -20°C til ca. +30°C kan reaktionen udføres ved endnu lavere temperatur eller under opvarmning.
De to udgangsmaterialer, der skal danne en peptidbinding, anvendes i almindelighed i ækvimolære mængder selv om man også om ønsket kan anvende andre indbyrdes vægtforhold. Generelt anvender man for hver molækvivalent af det ene udgangsmateriale 1 almindelighed mellem 1 og 2 molækvivalenter og fortrinsvis l til 1,4 ækvivalenter af det andet af de to udgangsmaterialer. Mængden af dehydratiseringsmidlet er sædvanligvis omkring 1 til 2 molækvivalenter i relation til det vand der elimineres ved peptidbindingsdannelsen.
Der opnås ofte tilfredsstillende resultater når reaktionstiden er i området fra ca. seks til ca. ti timer.
Efter at dannelsesreaktionen for peptidbindingen er fuldført kan reaktionsproduktet isoleres, fx ved udfældning med et opløsningsmiddel (i hvilket den dannede forbindelse er tungt opløselig), hvorefter man udvinder udfældningen ved filtrering.
Når reagens A og/eller reagens B er beskyttede med en eller flere beskyttelsesgrupper, genfindes beskyttelsesgruppen eller beskyttelsesgrupperne i almindelighed i kondensationsproduktet. Som ovenfor nævnt kan beskyttelsesgruppen eller -grupperne fjernes ved konventionelle processer som ikke forstyrrer aminosyresekvensen i det som produkt vundne nonapeptidamidderi-vat, og beskyttelsesfjernelsen efterlader nonapeptidamidderiva-tet I i en tilstand fri for beskyttelsesgrupper.
Som eksempler på en konventionel fremgangsmåde til fjernelse af beskyttelsesgrupper kan nævnes katalytisk reduktion med sådanne katalysatorer som palladiumsort, palladium på kulstof eller platin; sur hydrolyse med fx hydrogenfluorid eller ίο
U975S
trifluoreddikesyre; og kemisk reduktion med fx natriummetal i flydende ammoniak. Efter enhver af disse processer kan den ønskede forbindelse isoleres på i og for sig konventionel måde. Blandt egnede metoder kan nævnes den ovennævnte fældningsteknik.
Det således isolerede slutprodukt kan renses på passende måde såsom ved søjlekromatografering på fx karboxymetylcellulose eller kommercielt tilgængelige; polymerer til brug ved rensning som fx "Sephadex" eller "Amberlite" XAD-2 (i Danmark indregistrerede varemærker).
I afhængighed af de anvendte reaktionsbetingelser vindes den ønskede forbindelse i form af en base eller som et salt, herunder et fysiologisk acceptabelt salt. Fra saltet kan man frigøre basen på konventionel måde og basen kan omdannes til salte ved omsætning med syre som egner sig til fremstilling af fysiologisk acceptable salte. Blandt eksempler på sådanne syrer kan nævnes uorganiske syrer som hydrohalogenider såsom saltsyre, brombrintesyre, endvidere perklorsyre, salpetersyre, tiocyansy-re,. svovlsyre eller fosforsyre samt organiske syrer som fx myresyre, eddikesyre, propionsyre, glykolsyre, mælkesyre, pyrodrue-syre, oxalsyre, malonsyre, ravsyre, maleinsyre, fumarsyre, an-tranylsyre, kanelsyre, naftalensulfonsyre og sulfanilsyre.
Den på denne måde vundne- slutforbindelse kan omdannes til metalkompleks-saltforbindeiser på i og for sig kendt måde.
Fx kan man omsætte en vandig opløsning af det på den beskrevne måde vundne^Pl^ti dami dderivat med et salt, hydroxyd eller oxyd af et eller flere af metallerne zink, nikkel, kobolt, kobber og jern og derefter regulere reaktionsblandingen til en pH omkring 6 til 8, hvorved der vindes en tungt opløselig adsorption-kom-plekssaltforbindelse mellem metalforbindelsen og nonapeptidamid-derivatet.
Det viser sig at zinkkomplekssaltforbindelserne er de mest ønskelige blandt de forskellige metalkomplekssaltforbindel-ser der kan vindes på denne måde, nemlig med hensyn til forlænget virkning efter indgift.
På grund af den yderst lave toxicitet kan man uden risiko anvende de på den beskrevne måde vundne nonapeptidamidderi-vater og fysiologisk acceptable salte deraf, hvorved der opnås en kraftig ovulationsinducerende virkning.
11
14975S
Når man giver rotter en ganske lille mængde (fx 50 til 500 ng/100 g) af nonapeptidamidderivat I eller et fysiologisk acceptabelt salt deraf ved intravenøs, intramuskulær eller subkutan indgift, konstateres der en stejl stigning i koncentrationen af luteiniseringshormon og follikelstimulerende hormon i blodet; når rotterne infu seres med 10 til 200 ng/100 g af en sådan forbindelse ved intravenøs eller intramuskulær vej induceres der ovulation hos ca. 50% af rotterne; og når rotterne infuseres med 0,1 til 5 μg/l00 g af forbindelsen ad intravenøs eller intramuskulær vej induceres der ovulation hos 100% af de afprøvede rotter, selv om rotterne er i diøstrus (dvs. perioderne mellem brunstperioderne). Når dosis holdes konstant er intravenøs infusion i almindelighed dobbelt så effektiv som subkutan infusion.
I nærværende beskrivelse betyder betegnelsen ng nanogram.
Disse fakta viser at de omhandlede peptider, fremstillet ved den foreliggende fremgangsmåde, har kraftigere hormonal virkning end det naturligt forekommende luteiniseringshormon-frigi-vende hormon.
Injektionspræparater kan fremstilles ved at man opløser et ifølge opfindelsen fremstillet nonapeptidderivat i fysiologisk saltopløsning.
Da de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser har tilstrækkelig fysiologisk aktivitet selv når de kun bruges i ganske små mængder, er det hensigtsmæssigt at bruge dem i form af frysetørrede ampulpræparater indeholdende mannitol som excipient.
Nogle eksempler tjener til nærmere belysning af fremgangsmåden ifølge opfindelsen. I eksemplerne bruges følgende forkortelser: Z-*·: benzyloxykarboxyl; IB0C-: isobornyloxykarbonyl; B0C-: t-butyloxykarbonyl; -OEt: ætylester; -0SU: N-hydroxysuc-cinimidester; -OtBu: t-butylester; -0NDP: 2,4-dinitrofenolester; -0NBI: N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dikarboximidester; Η0ΝΒΙ: N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dikarboximid; DCC: Ν,Ν'-dicyklohexyl-karbodiimid; DMF: Ν,Ν-dimetylformamid; TLC: tyndlagskromatografi; DCHA: dicyklohexylamin; MeOH: metanol; EtOH: ætanol; n-Bu0H: n-butanol.
Ved tyndlagskromatografering anvendes følgende fremkaldelsessystemer : 12 149755
Rf 1 = kloroform/metanol/eddikesyre 9:1:0,5;
Rf 2 = ætylacetat/pyridin/eddikesyre/vand 60:20:6:11; R£ 3 = n-butanol/ætylacetat/eddikesyre/vand 1:1:1:1;
Rf ή- = n-butanol/eddikesyre/vand 4:1:1;
Rf 5 = n-butanol/pyridin/eddikesyre/vand 30:20:6:24.
I eksemplerne har vægtdele samme relation til rumfangsdele som g til ml og procenter er vægt0/ med mindre andet er angivet. "Amberlite" CG-400 er en tertiær amin-styren-divinylbenzen-kopolymer fra Rohm og Haas Co., USA; "Sephadex" LH-20 er en for-estret dextrangel fra Pharmacia Fine Chemicals, Sverige; "Amberlite" XAD-2 er en makroretikulær styren-divinylbenzenkopolymer - fra Rohm 8c Haas Co., USA og "Amberlite" IRA-400 er en tertiær amin-styren-divinylbenzenkopolymer fra samme firma.
Eksempel 1 H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-NHC^H^ a) Z-Arg(N02)-Pro-NHC2H5 I 10 rumfangsdele DMF opløses 0,901 vægtdel Z-Arg(N02)-Pro-OH og 0,181 vægtdel ætylaminhydroklorid, og under afkøling til 0°C tilsættes dråbevis 0,38 rumfangsdel triætylamin. Derefter tilsættes der 0,43 vægtdel HONBI og 0,495 vægtdel DCC og blandingen omrøres ved 0°C i fem timer og derefter ved stuetemperatur i ti timer. Det som biprodukt dannede urinstof frafiltreres og DMF afdestilleres. Remanensen ekstraheres med kloroform, vaskes med vand og tørres over vandfrit magniumsulfat. Kloroformen afdestilleres og remanensen behandles med æter og genudfældes fra metanol/ æter. Udbytte 0,692 vægtdel, Rf 1 = 0,5o; smeltepunkt 141-145°C (sønderdeling), = -44,6° (c = 1 i metanol).
Beregnet for C2]H3106N7: C 52,82 H 6,54 N 20,53 fundet: C 52,95 H 6,77 N 19,65°/ 13
t4975S
b) Z-Leu-Arg(N02)-Pro-NHC2H5 0,572 vægtdel Z-Arg(N02)-Pro-NHC2H5 opløses i 5 rumfangsdele 25%s HBr/eddikesyre og opløsningen henstår ved stuetemperatur i 30 minutter. Derefter sættes der tør æter til reaktionsblandingen og det resulterende bundfald udvindes ved filtrering og tørres. I mellemtiden opløses 0,291 vægtdel Z-Leu-OH i 5 rumfangsdele dioxan og under afkøling tilsættes der 0,247 vægtdel DCC og 0,215 vægtdel Η0ΝΒΙ. Blandingen omrøres i to timer og det som biprodukt dannede urinstof frafiltreres. Til filtratet sættes det i henhold til det foranstående dannede bundfald, som opløses ved tilsætning af 3 rumfangsdele DMF. Under afkøling tilsættes der dråbevis 0,17 rumfangsdel triætylamin og derefter omrøres blandingen ved stuetemperatur natten over. Opløsningsmidlet afdestilleres og remanensen ekstraheres med kloroform og vaskes med vand. Kloroformlaget tørres over vandfrit magniumsulfat og kloroformen afdestilieres. Remanensen behandles med æter og genudfældes fra metanol/æter. Udbytte 0,47 vægtdel (72%) med smeltepunkt 144-146°C (sønderdeling), Rf 1 = 0,40, = -58,0° (c = 1 i metanol).
c) 0,165 vægtdel Z-Leu-Arg(N02)-Pro-NHC2H5 opløses i 25%s HBr/eddikesyre og opløsningen henstår ved stuetemperatur i 30 minutter. Derefter sættes der tør æter til reaktionsblandingen og det dannede bundfald udvindes ved filtrering og tørres godt. Dette bundfald opløses i 3 rumfangsdele DMF og under afkøling og omrøring tilsættes der dråbevis 0,05 rumfangsdel N-ætyl-morfolin. I denne opløsning opløses der 0,19 rumfangsdel H-(Pyr)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OH-hydroklorid efterfulgt af tilsætning af 0,054 vægtdel HONBI og 0,062 vægtdel DCC.
Blandingen omrøres ved 0°C i to timer og derefter ved stuetemperatur natten over. Det som biprodukt dannede urinstof fjernes ved filtrering og DMF afdestilleres. Remanensen behandles med ætylacetat hvorved der vindes et pulver som vejer 0,32 vægtdel. Dette pulver anbringes på en kolonne af "Amberlite" XAD-2 og desorberes i et lineært gradient-elueringssystem fra 5%s vandig ætanol til ætanol. Hovedfraktionen frysetørres, hvorved der vindes 0,11 rumfangsdel rent H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg(N02)-Pro-NHC2H5· Dette produkt behandles med 4 rumfangsdele hydrogenfluorid ved 0°C i en time i nærværelse af 0,02 rumfangsdel 14 140755 anisol og 0,02 rumfangsdel merkaptoætanol. Hydrogenfluoridet af-destilleres og efter tørring opløses remanensen i vand. Opløsningen føres gennem en kolonne af "Amberlite" IRA-400 i acetatform og bringes derefter til adsorption på en kolonne af karboxy-metylcellulose. Kolonnen elueres i et lineært gradient-eluerings-system med fra 0,005N vandigt ammoniumacetat til 0,2N vandigt ammoniumacetat, og hovedfraktionen frysetørres. På denne måde vindes der 0,087 vægtdel rent H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-NHC2H5. Rf 3 = 0,36, a^4 = -56,2° (c = 0,5 i 5% s eddikesyre). Aminosyreanalyse: His 0,95 (l)> Arg 0,98 (l), Ser 0,95 (l), Glu 0,98 (1), Pro 1,00 (l), Gly 1,00 (l), Leu 1,00 (l), Tyr 1,00 (l) og ΝΗ^Ο^Η^ 1,10 (l). Tallene i parentes angiver de teoretiske værdier.
Eksempel 2
H-(Pyr) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-NHC2H^0H
a) Z-Arg(N02)-Pro-NHC2H40H
I 5 rumfangsdele DMF opløses der 0,9 vægtdel Z-Arg(N02)-Pro-OH og 0,43 vægtdel HONBI og under afkøling til 0°C tilsættes der 0,495 vægtdel DCC. Blandingen omrøres natten over. Den udskilte urinstofforbindelse frafiltreres og der sættes 0,1832 vægtdel ætanolamin til filtratet, hvorefter der omrøres natten over. DMF afdestilleres under nedsat tryk og der sættes dioxan til remanensen. Uopløseligt materiale frafiltreres. Dioxanen af-destilleres under nedsat tryk og remanensen ekstraheres med n-bu-tanol. Ekstrakten vaskes med vand, fortyndet saltsyre, vand, en-vandig opløsning af natriumhydrogenkarbonat og vand i nævnte rækkefølge og derefter afdestilleres n-butanolen under nedsat tryk. Remanensen behandles med æter og genudfældes fra metanol/æter. Udbytte 0,625 vægtdel (63,3%), smeltepunkt 124-128°C (sønderdeling), Rf 2 = 0,23, a^° = -36,6° (c = 0,5 i ætanol).
15 143755
b) Z-Leu-Arg(N02)-Pro-NHC2H40H
I 2 rtunfangsdele 25$s HBr/eddikesyre opløses der 0,493 vægtdel Z-Arg(N02)-Pr o-NHCgH^OH og opløsningen henstår ved stuetemperatur i 30 minutter. Herefter tilsættes der tør æter og det resulterende bundfald udvindes ved filtrering og tørres til dannelse af et pulverformigt produkt. I mellemtiden opløses 0,282 vægtdel Z-Leu-OH og 0,215 vægtdel HONBI i 3 rumfangsdele DMF og under afkøling til 0°C tilsættes der 0,248 vægtdel DCC efterfulgt af omrøring i to timer. Til opløsningen sættes det ovennævnte pulverformige produkt og der tilsættes dråbevis 0,15 rumfangsdel triætylamin. Blandingen omrøres natten over. Urinstoffet frafilteres og DMF afdestilleres under nedsat tryk. Remanensen bringes til adsorption på en kolonne af 50 vægtdele silikagel og desorbe-res me^^op1øsningsmidde1system af kloroform/metanol/eddikesyre 9:1:0,5. Opløsningsmidlerne afdestilleres og remanensen krystalliseres med æter. Udbytte 0,153 vægtdel, smeltepunkt 110-113°C (sønderdeling), Ef 1 = 0,49, a^0 = -46,6° (c = 0,5 i ætanol).
c) I nærværelse af 0,1 rumfangsdel anisol opløses 0,152 vægtdel z-Leu-Arg(N02)-Pro-NHC2H40H i 3 rumfangsdele hydrofluorid. Opløsningen omrøres ved 0°C i en time. Hydrogenfluoridet afdestilleres og remanensen tørres godt og opløses i vand. Efter tilsætning af en ringe mængde koncentreret saltsyre vaskes opløsningen med æter og det vandige lag frysetørres. Det resulterende pulver opløses i 5 rumfangsdele DMF sammen med 0,19 rumfangsdel H-(Pyr)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OH-hydroklorid og 0,0493 vægtdel HONBI. Opløsningen afkøles til 0°C og der tilsættes 0,0567 vægtdel DCC og 0,07 rumfangsdel N-ætylmorfolin. Hele blandingen omrøres natten over. DMF afdestilleres under nedsat tryk og remanensen opløses i vand. Det uopløselige materiale frafiltreres og filtratet føres gennem en kolonne "Amberlite" IRA-400 i acetatform. Efflu-enten opsamles og frysetørres. Dette produkt anbringes på en kolonne af "Amberlite" XAD-2 og desorberes i et lineært gradient-elueringssystem af vand-metanol. Hovedfraktionen frysetørres, hvorved der vindes 0,023 vægtdel rent H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-NHC2H40H. Rf 3 = 0,28, a£° = -54,4° (c = 0,5 i 5%s vandig eddikesyre).
149756 16
Aminosyreanalyse:His 1,00 (1), Arg 1,05 (l), Ser 0,95 (1), Glu 1,00 (1), Pro 1,05 (l), Gly 1,00 (l), Leu 0,95 (l), Tyr 0,76 (1).
Eksempel 3 H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Eeu-Arg-Pro-NHCH^ a) Z-Arg(N02)-Pro-NHCH3 I 5 rumfangsdele DMF opløses 0,675 vægtdel Z-Arg{N02)-Pro-OH og 0,101 vægtdel metylaminhydroklorid, og mens opløsningen afkøles til 0°C tilsættes der dråbevis 0,21 rumfangsdel triætyl-amin.
Derefter tilsættes der 0,322 vægtdel HONBI og 0,37 vægtdel DCC og hele blandingen omrøres ved 0°C i fem timer og derpå ved stuetemperatyr i ti timer. Det som biprodukt dannede urinstof frafiltreres og DMF afdestilleres. Remanensen ekstra-heres med kloroform, vaskes med vand og tørres over vandfrit magniumsulfat. Kloroformen af destilleres og remanensen behandles med ætanol og genudfældes fra metanol/æter. Udbytte 0,612 vægtdel (88%), Ef 1 = 0,30, smeltepunkt 137-143°C (sønderdeling), = -41,5° (c = 1 i metanol).
Beregnet for C20H2906N7: C 51,82 H 6,31 N 21,15 fundet: C 51,84 H 6,54 N 21,57% b) Z-Leu-Arg(N02)-Pro-NHCH3 I 5 vægtdele 25%s HBr/eddikesyre opløses der 0,556 vægtdel Z-Arg(N02)-Pro-NHCH3 og opløsningen henstår ved stuetemperatur i 30 minutter. Derefter tilsættes der tør æter og‘de resulterende krystaller udvindes ved filtrering og tørres. I mellemtiden opløses 0,312 vægtdel Z-Leu-OH i 5 rumfangsdele dioxan/ ætylacetat 1:1, og mens opløsningen afkøles tilsættes der 0,268 vægtdel DCC og 0,232 vægtdel HONBI. Hele blandingen omrøres i to timer. Det som biprodukt dannede urinstof frafiltreres og de i henhold til det foranstående fremstillede krystaller sættes til filtratet og opløses ved tilsætning af 3 rumfangsdele DMF. Under 149756 17 afkøling tilsættes der 0,17 rumfangsdel triætylamin. Blandingen omrøres ved stuetemperatur natten over. Opløsningsmidlet afdestilleres. Remanensen ekstraheres med kloroform og vaskes med vand. Kloroformlaget tørres over vandfrit magniumsulfat og derefter afdestilleres kloroformen. Så behandles remanensen med æter og genudfældes fra metano1/æter. Udbytte 0,45 vægtdel (78%), Rf 1 = 0,25.
Beregnet for CggH^Ngj C 54,15 H 7,02 N 19,43 fundet: C 54,37 H 6,98 N 19,52% c) I 5 rumfangsdele 25%s HBr/eddikesyre opløses der 0,144 vægtdel Z-Leu-Arg(N02)-Pro-NHCH3 og efter at opløsningen har henstået ved stuetemperatur i 30 minutter tilsættes der tør æter. Det resulterende bundfald opsamles ved filtrering og tørres grundigt. Derefter opløses det i 3 rumfangsdele DMP og under afkøling og omrøring tilsættes der dråbevis 0,05 rumfangsdel N-ætylmorfolin.
I denne opløsning opløses der 0,19 vægtdel H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OH-hydroklorid efterfulgt af tilsætning af 0,054 vægtdel HONBI og 0,062 vægtdel DCC. Hele blandingen omrøres ved 0°C i to timer og derefter ved stuetemperatur natten over. Det som biprodukt dannede urinstof frafiltreres og DMP af-destilleres. Remanensen anbringes på en kolonne af "Amberiite" XAD-2 og desorberes i et lineært gradient-elueringssystem fra 5%s vandig ætanol til ætanol. Hovedfraktionen frysetørres, hvorved der vindes 0,137 vægtdel ren H-(Pyr)Glu-His-ITp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg(N02)-Pro-NHCH3· En portion af dette produkt på 0,09 vægtdel behandles med 4 vægtdele hydrogenylfluorid i nærværelse af 0,02 rumfangsdel anisol og.0,02 rumfangsdel merkaptoætanol ved 0°C i en time. Hydrogenfluoridet af destilleres og efter tørring opløses remanensen i vand. Opløsningen føres gennem "Amberiite" IRA-400 i acetatform og bringes derefter til adsorption på en kolonne af karboxymetylcellulose. Kolonnen elueres i et lineært gradient-elueringssystem strækkende sig fra 0,005N vandigt ammoniumacetat til 0,2N vandigt ammoniumacetat, og hovedfraktionen frysetørres. På denne måde vindes der 0,06 vægtdel rent H-(Pyr)Glu-His-ΊΤρ-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-NHCH3. Rf 3 = 0,37, a|4 = -55,6° (c = 0,5 i 5%s vandig eddikesyre).
149755 18
Aminosyreanalyse: His 0,96 (l), Arg 0,98 (l), Ser 0,96 (1), Glu 1,00 (l), Pro 1,00 (l), Gly 1,00 (l), Leu 0,98 (l), Tyr 0,98 (l), NH2CH3 1,12 (l). De i parentes angivne tal er de teoretiske værdier.
'Eksempel 4 H— (Pyr) Glu—His-Trp—Ser—Tyr—Gly-NLe-Arg-Pro-NH-CH2CH3 a) Z-NLe-Arg(N02)-Pro-NH-CH2CH3 I 4 rumfangsdele 25%s hydrogenbromid/eddikesyre opløses der 0,4775 vægtdel Z-Arg(N02)-Pro-NH-CH2CH3 og opløsningen henstår ved stuetemperatur i 30 minutter. Derefter sættes der 50 rumfangsdele tør æter til reaktionsblandingen og det resulterende bundfald udvindes ved filtrering, vaskes godt med æter og tørres over natriumhydroxyd under nedsat tryk. I mellemtiden opløses 0,2653 vægtdel Z-NLe-0H i en blanding af 2 rumfangsdele ætylacetat og 12 rumfangsdele dioxan. Mens opløsningen afkøles til 0°C tilsættes der 0,197 vægtdel Η0ΝΒΙ og 0,226 vægtdel DCC og hele blandingen omrøres i tre timer. Det som biprodukt dannede urinstof, der har udskilt sig, frafiltreres og filtratet sæt- wundne tes til en opløsning af det i henhold til det ovenstående/bundfald i 1 rumfangsdel DMF, efterfulgt af dråbevis tilsætning af 0,28 rumfangsdel triætylamin. Blandingen omrøres natten over. Opløsningsmidlet afdestilleres og remanensen ekstraheres med 100 rumfangsdele kloroform. Ekstrakten vaskes med en 5%s vandig opløsning af natriumhydr o genkar bonat, vand, 0,5N saltsyre og vand og tørres derefter over vandfrit magniumsulfat. Kloroformen afdestilleres og remanensen behandles med æter og genudfældes fra ætanol/æter. Udbytte 0,41 vægtdele, smeltepunkt 109-111°C (sønderdeling), dp2 = -50,4° (c = 0,5 i ætanol).
Beregnet for C^H^OyNg, l/2 H20 : C 54,07 H 7,22 N 18,68 fundet: C 53,79 H 7,09 N 18,24% b) I 2 rumfangsdele 25%s hydrogenbromid/eddikesyre opløses der 0,155 vægtdel Z-NLe-Arg(N02)-Pro-NH-CH2CH3 og opløsningen henstår ved stuetemperatur i 30 minutter. Derefter sættes der 50 rumfangsdele tør æter til reaktionsblandingen og det re- 19 1487 55 suiterende bundfald udvindes ved filtrering, vaskes grundigt med æter og tørres over natriumhydroxyd under nedsat tryk.
Derefter opløses det i 2 rumfangsdele DMF og under afkøling til 0°C tilsættes der 0,19 vægtdel H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OH-hydroklorid, 0,09 vægtdel HONBI, 0,103 vægtdel DCC og 0,1 rumfangsdel N-ætylmorfolin i nævnte rækkefølge. Blandingen omrøres ved 0°C i fem timer og ved stuetemperatur i ti timer.
Det udskilte, som biprodukt dannede urinstof frafiltreres og DMF afdestilleres under nedsat tryk. Remanensen opløses i 4 rumfangsdele vandig ætanol sammen med 0,2 vægtdel urinstof, og opløsningen bringes til adsorption på en kolonne af "Amberlite" XAD-2 og desorberes i et lineært gradient-elueringssystem gående fra 5%s vandig ætanol til 80%s vandig ætanol. Hovedfraktionen frysetørres, hvorved der vindes 0,067 vægtdel H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-NLe-Arg(N02J-Pro-NH-C^CH^. En portion på 0,060 vægtdel af dette produkt opløses i 4 rumfangsdele hydrogenfluorid ved -50°C i nærværelse af 0,05 rumfangsdel anisol og 0,02 rumfangsdel 2-merkaptoætanol, og opløsningen omrøres ved 0°C i en time. Hydrogenfluoridet afdestilleres under nedsat tryk og remanensen tørres i en desikkator indeholdende natriumhydroxyd. Remanensen opløses i 20 rumfangsdele vand og opløsningen føres gennem "Amberlite" CG-400 i acetatform. Effluenten frysetørres og anbringes på en kolonne af karboxymetylcellulose. Den desorberes i et lineært gradient-elueringssystem strækkende sig fra 0,005N ammoniumacetat til 0,2N ammoniumacetat. Hovedfraktionen frysetørres, hvorved der vindes 0,035 vægtdel af det ønskede produkt. Dette produkt anbringes yderligere på en kolonne af "Sephadex" LH-20 og desorberes med 0,1N eddikesyre. Den homogene fraktion frysetørres, hvorved der vindes 0,028 vægtdel ren H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-NLe-Arg-Pro-NH-CH2CH3. cc£5 = -52,2° (c = 0,5 i 5%s eddikesyre). Aminosyreanalyse: His 1,00 (l), Arg 1,02 (l), ΊΤρ 1,00 (l), Ser 0,91 (1), Glu 1,00 (1), Pro 1,05 (l), Gly 0,98 (l), Tyr 1,00 (l), NLe 1,02 (1).
20 149765
Eksempel 5 Η- ( Pyr ) Glu-His-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Ar g-Pro-NH-CHrjCH^ a) Z-S er-Phe-Gly-OE t 2,5 vægtdele Z-Ehe-Gly-OEt opløses i 50 rumfangsdele metanol- og opløsningen underkastes katalytisk reduktion med 5%s palladium på kul i fire timer. Katalysatoren fjernes ved filtrering og opløsningsmidlet afdestilleres. Remanensen opløses i 20 rumfangsdele dimetylformamid og derefter tilsættes der 2,6 vægtdele Z-Ser-ODNP efterfulgt af omrøring i otte timer. Opløsningsmidlet af destilleres og remanensen opløses i ætylacetat. Opløsningsmidlet vaskes med en 5%s vandig opløsning af natriumhydrogen-karbonat, IN saltsyre og vand og tørres derefter over magniumsulfat. Opløsningsmidlet .afdestilleres og den faste remanens krystalliseres fra ætylacetat/petroleumsæter. udbyttet er 1,75 vægt-delei(74,2°/0, smeltepunkt 128-129°C, a^2 = -26,2° (c = 0,6 i ætanol) .
Beregnet for ^24Η29<'>7^3: C 61,13 H 6,20 N 8,91 fundet: C 60,47 H 6,00 H 8,88% b) Z-Ser-Phe-Gly-NHNHg 1,65 vægtdele z-Ser-Phe-Gly-OEt opløses i 20 rumfangs-dele metanol og derefter tilsættes 0,71 rumfangsdel hydrazinhydrat. Blandingen henstår i otte timer og de resulterende krystaller udvindes ved filtrering og vaskes med metanol/æter 1:1. Udbyttet er 1,6 vægtdel (100%), smeltepunkt 191-193°C, a^2 = -23,0° (c = 2 i DMF).
Beregnet for C22H27N506: C 57,76 H 5,95 N 15,31 fundet: C 57,32 H 6,21 N 15,53% 149755 21 c) Z-Ser-Phe-Gly-I,eu~Arg(N02 J-Pro-NH-CHgCHg 0,8 vægtdel Z-Ser-Phe-GIy-NHNH^ opløses i 10 rumfangs-dele DMF og opløsningen afkøles. Derefter tilsættes der 3,5 rumfangsdele 2N saltsyre. Under omrøring til -6°C tilsættes der 2N vandig opløsning af natriumnitrit og man lader blandingen reagere i ti minutter. I mellemtiden opløses bundfaldet ved tilsætning af 10 rumfangsdele DMF. Der sættes en-mættet vandig opløsning af natriumklorid til reaktionsblandingen, efterfulgt af ekstraktion med ætylacetat. Ekstrakten forenes med vaskevæskerne og opløsningen vaskes med en 5%s vandig opløsning af natriumhydrogenkarbo-nat og en mættet vandig opløsning af natriumklorid. Ætylacetat-laget, 80 rumfangsdele, tørres over natriumsulfat og sættes derefter til 20 rumfangsdele af en opløsning af 1,04 vægtdele H-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2CH2 i DMF. Ætylacetatlaget afdestilleres i isbad og den resulterende homogene opløsning omrøres ved 3°C i to dage. Opløsningsmidlet afdestilleres og remanensen renses ved kromatografering på silikagel. Kromatogrammet fremkaldes med et opløsningsmiddelsystem af ætylacetat/pyridin/eddikesyre/vand 60: 20:6:10, og de aktive fraktioner forenes og destilleres til fjernelse af opløsningsmidlerne. Der sættes vand til remanensen og det resulterende faste materiale udvindes ved filtrering. Udbyttet andrager 0,87 vægtdel (61,2%) med smeltepunkt 108°C, a22 = -59,1° (c = 0,7 i ætanol).
Beregnet for c41H59011N11,H20: C 54,72 H 6,83 N 17,12 fundet: C 54,95 H 6,84 N 16,74%
d) 0,836 vægtdel Z-Ser-Phe-Gly-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CHjjCH^ opløses i metanol og derefter tilsættes der 1 rumfangsdel IN saltsyre. Opløsningen underkastes katalytisk reduktion med palladiumsort. Katalysatoren fjernes ved filtrering og opløsningsmidlet afdestilleres. Remanensen opløses i 10 rumfangsdele DMF
og derefter opløses 0,83 vægtdel H-(Pyr)Glu-His-Trp-OH og 0,36 vægtdel HONBI. Blandingen afkøles til -5°C og derefter tilsættes der 0,412 vægtdel DCC. Man lader blandingen reagere i to dage hvorefter bundfaldet frafiltreres og DMF afdestilleres. Remanen 149756 22 sen renses ved kromatografering under anvendelse a£ en kolonne af "Amberlite" XAD-2 i et lineært gradient-elueringssystem strækkende sig fra 5%s vandig ætanol til 80%s vandig ætanol. De aktive fraktioner forenes og destilleres til fjernelse af ætanolen, hvorefter den tilbageværende vandige opløsning frysetørres. Det resulterende pulver renses yderligere ved ionbytterkromatografi på karboxymetylcellulose i et lineært gradient-elueringssystem strækkende sig fra 0,005N til 0,1N vandig opløsning af ammoniumacetat. Den aktive fraktion frysetørres til dannelse af et rent hvidt pulver. Udbyttet andrager 0,424 vægtdel, a^ = -55° (c = 0,5 i 5%s eddikesyre).
Aminosyreanalyse: His 1,02 (l), Arg 1,01 (l), Trp 0,91 (1), Ser 0,90 (1), Glu 1,00 (l), Pro 1,00 (l), Gly 0,98 (l), Leu 1,00 (1), Phe 1,00 (l), ætylamin 1,06 (l).
Til bestemmelse af udbyttet af Trp udføres hele amino-syreanalysen ved sur hydrolyse med 5»7N HC1 i nærværelse af tio-glykolsyre.
Eksempel 6 H-(Pyr)Glu-Ηίs-Trp-Ser-Phe-Gly-ILe-Arg-Pro-NHCgH^ a) H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-Gly-otBu 1,57 vægtdele H-Gly-0tBu og 4,0 vægtdele Z-Phe-OSU opløses i 20 rumfangsdele ætylacetat og blandingen omrøres ved stuetemperatur natten over. Reaktionsblandingen vaskes med en 5%s vandig opløsning af natriumhydrogenkarbonat, N saltsyre og vand, tørres over magniumsulfat og koncentreres under nedsat tryk. Der sættes petroleumsæter til remanensen og bundfaldet opsamles ved filtrering og giver 3,5 vægtdele (85%) Z-Phe-Gly-OtBu med smeltepunkt 78-79°C, ap3 = -16,7° (c = 1,0 i ætanol).
Beregnet for C23H2g05N2: C 66,97 H 6,87 N 6,79 fundet: C 67,14 H 6,64 N 6,88% 149755 23 » 7,0 vægtdele Z-Phe-Gly-OtBu opløses i 50 rumfangsdele metanol. Opløsningen underkastes katalytisk reduktion med palladiumsort som katalysator og reduktionen tager fem timer. Reaktionsblandingen filtreres og filtratet koncentreres ved afdampning af opløsningsmidlet. Remanensen opløses i 10 rumfangsdele acetonitril hvorefter der tilsættes 1,62 vægtdele Z-Ser-ODNP.
Den resulterende blanding omrøres ved stuetemperatur i en dag og acetonitril afdampes. Remanensen opløses i ætylacetat. Opløsningen vaskes med 10%s ammoniak, N saltsyre og vand, tørres over vandfrit magniumsulfat og koncentreres ved afdampning af opløsningsmidlet. Remanensen opsamles ved hjælp af petroleumsæter og omkrystalliseres fra ætylacetat/petroleumsæter, hvorved der vindes 1,41 vægtdele (70%) Z-Ser-Phe-Gly-OtBu med smeltepunkt 105-106°C, aj^3 = -26,6° (c = 0,74 i ætanol).
Beregnet for C26H3307N3: C 62,t50 H 6,66 N 8,41 fundet: C 62,91 H 6,38 N 8,12% 1,34 vægtdele Z-Ser-phe-Gly-OtBu opløses i 50 rumfangsdele metanol. Opløsningen underkastes katalytisk reduktion ved hjælp af palladiumsort som katalysator i fem timer. Blandingen filtreres og filtratet koncentreres til opnåelse af en remanens. Remanensen og 1,27 vægtdele H-(Pyr)Glu-His-Trp-OH og 0,83 vægtdel HONBI opløses i 20 rumfangsdele DMF hvorefter der afkøles med is. Til blandingen sættes der 0,95 vægtdel DCC og man lader den resulterende blanding reagere natten over. Bundfaldet fjernes ved filtrering og filtratet koncentreres. Der sættes acetonitril til remanensen hvorefter der opvarmes. Pulvere i blandingen opsamles ved filtrering og underkastes genudfældning fra 50%s vandig ætanol, hvorved der vindes 1,8 vægtdel (87%) H-(Pyr) Glu-His-Trp-Ser-Phe-Gly-OtBu, a^3 = -20,6° ( c = 1,0 i DMF). Beregnet for C40H490gN9,2H20: C 58,59 H 6,52 N 15,38 fundet: C 59,02 H 6,62 N 15,23% 24 t69755 b) &-ILe-Arg(N02)-Pro-NHC2H5 1,43 vægtdele Z-Arg(N02)-Pro-NHC2H^ opløses i 10 rumfangsdele 25%s HBr/eddikesyre og blandingen henstår ved stuetem-, peratur i 40 minutter. Der tilsættes yderligere 80 rumfangsdele tørret æter og bundfaldet opsamles ved filtrering og tørres til frembringelse af pulvere.
På den anden side opløses 0,795 vægtdel Z-ILe-OH i 10 rumfangsdele dioxan, hvorefter der afkøles til 0°C. Til denne opløsning sættes 0,59 vægtdel Η0ΝΒΙ og 0,68 vægtdel DCC og blandingen omrøres i to timer. Blandingen filtreres til fjernelse af bundfaldet og til filtratet sættes de pulvere der fremstilledes på den foran beskrevne måde. 0,84 rumfangs del triætylamin tilsættes yderligere, hvorefter blandingen omrøres ved stuetemperatur i 12 timer. Opløsningsmidlet dioxan fjernes ved afdampning. Remanensen opløses i 100 rumfangsdele kloroform. Opløsningen vaskes med 0,1N saltsyre, 5%s vandigt natriumhydrogenkarbonat og vand, hvorefter den tørres over vandfrit magniumsulfat og koncentreres ved afdampning af kloroformen. Remanensen tritureres med æter til frembringelse af et bundfald, der genudfældes fra æta-nol/æter. Der vindes 1,1 vægtdele Z-ILe-Arg(N02)-Pro-NHC2H^ med smeltepunkt 103-105°C (sønderdeling), = -58,1° (c = 1 i metanol).
Beregnet for 027Η420?Ν8,l/2 H20: C 54,08 H 7,23 N 18,68 fundet: C 53,80 H 7,15 N 18,84¾ c) 0,177 vægtdel z-ILe-Arg(N02)-ProNHC2H^ opløses i 3 rumfangsdele 25%s HBr/eddikesyre hvorefter opløsningen henstår ved stuetemperatur i 30 minutter efterfulgt af tilsætning af 50 rumfangsdele tørret æter. Bundfaldet opsamles ved filtrering, vaskes godt med æter og tørres til frembringelse af en aminkom-ponent.
På den anden side opløses 0,221 vægtdel H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-Gly-OtBu i 5 rumfangsdele trifluoreddikesyre og opløsningen henstår ved stuetemperatur i 40 minutter. Der sættes 0,05 rumfangsdel 5,7N saltsyre til opløsningen hvorefter der tilsættes 50 rumfangsdele æter. Bundfaldet opsamles ved filtrering, tørres og opløses i 3 rumfangsdele DMF, hvorpå opløsningen afkøles til 0°C. Til opløsningen sættes aminkomponenten fremstillet 25 1*9756 i henhold til det foranstående, 0,097 vægtdel HONBI, 0,111 vægtdel DCC og 0,126 ruinfangsdel triætylamin. Den resulterende blanding omrøres ved 0°C i fem timer og derefter ved stuetemperatur i yderligere ti timer. Blandingen filtreres til fjernelse af det på denne måde dannede dicyklohexylurinstof og filtratet koncentreres under nedsat tryk. Remanensen opløses i 10 rumfangsdele 10%s vandig ætanol og opløsningen udhældes på toppen af en kolonne pakket med "Amberlite" XAD-2. Desorption udføres i et lineært gradient-elueringssystem strækkende sig fra 10%s vandig ætanol til 80%s vandig ætanol. De fraktioner som indeholder produktet opsamles, koncentreres ved afdampning af opløsningsmidlet ætanol og frysetørres, hvorved der vindes 0,085 vægtdel H-(Pyr) Glu-His-Trp-Ser-Phe-Gly-ILe-Arg(N02)-Pro-NHC2H^.
0,07 vægtdel af dette produkt opløses i en blanding af 0,02 rumfangsdel anisol, 0,02 rumfangsdel 2-merkaptoætanol og 4 rumfangsdele vandfrit hydrogenfluorid. Opløsningen omrøres ved 0°C i en time hvorefter hydrogenfluoridet afdampes under nedsat tryk. Remanensen tørres i en desikkator hvorefter den opløses i 50 rumfangsdele vand og føres gennem en kolonne pakket med "Amberlite" IRA-400 i acetatform. Efter at være ført gennem kolonnen frysetørres opløsningen, hvorved der vindes 0,075 vægtdel råprodukt. Dette råprodukt bringes til adsorption på en kolonne af karboxymetylcellulose og desorberes i et lineært gradient-elueringssystem fra 0,005N ammoniumacetat til 0,2N ammoniumacetat.
De fraktioner som indeholder det ønskede produkt frysetørres.
Det på denne måde vundne produkt opløses i 0,1N vandig eddikesyre og føres gennem en kolonne af "Sephadex" LH-20. Efter at være ført gennem iblonnen frysetørres opløsningen og der vindes 0,043 vægtdel rent produkt. Rf 3 = 0,41, a^3 = -59,4° (c = 0,5 i 5%s eddikesyre) .
Aminosyreanalyse: His 1,1 (l), Arg 1,1 (1), Trp 0,87 (1), ætylamin 1,0 (l), Ser 0,8l (l), Glu 1,03 (l), Pro 1,0 (l),
Gly 1,0 (1), ILe 1,06 (l), Phe 0,97 (l).
Eksempel 7 26 149756 H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Met-Arg-Pro-NHC2H,- a) BOC-Met-Arg-Pro-NHC2H5 1,91 vægtdele Z-Arg(N02)-pro-NHC2H5 opløses i 10 rumfangsdele 25#s HBr/eddikesyre og opløsningen henstår i 30 minutter hvorefter der tilsættes tørret æter. Bundfaldet opsamles ved filtrering, vaskes godt med æter og tørres til frembringelse af en aminkomponent.
På den anden side opløses 1,75 vægtdel BOC-Met-OH.DCHA i 100 rumfangsdele æter, hvorefter der vaskes to gange med 50 rumfangsdele 0,2N vandig svovlsyre og tørres over vandfrit natriumsulfat. Æteren afdampes og remanensen opløses i 20 rumfangsdele dioxan.' Opløsningen afkøles til 0°C og til opløsningen sættes derefter 0,905 vægtdel DCC og 0,79 vægtdel HONBI. Blandingen omrøres i to timer. Det dannede dicyklohexylurinstof frafiltreres og filtratet koncentreres. Remanensen tilsættes 5 rumfangsdele DMF og hele mængden af aminkomponenten fremstillet som beskrevet først i eksemplet. Den resulterende opløsning afkøles, hvorefter der tilsættes 1,12 rumfangsdele triætylamin. Blandingen omrøres ved stuetemperatur i 12 timer og DMF afdampes. Remanensen opløses - i 100 rumfangsdele kloroform, vaskes med 0,IN saltsyre, 5#s vandig natriumhydrogenkarbonatopløsning og vand, tørres over vandfrit magniumsulfat og koncentreres ved afdampning af kloroform.
Der sættes æter til remanensen for at vinde fast materiale. Det fåste materiale genudfældes fra ætylacetat/æter, hvorved der vindes 1,4 vægt dele B0C-Met-Arg-Pro-NHCoH,- med smeltepunkt 101-104°C 22 ^ (sønderdeling), aD = -64,4° (c = 1,0 i metanol).
Beregnet for C23H4207NgS,l/2 HgO: C 47,,33 H 7,42 N 19,20 S 5,49 fundet: C 47,67 H 7,23 N 18,94 S 5,48# b) H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Met-Arg-Pro-NHC2H^ 0,275 vægtdel BOC-Met-Arg(NO2)-Pro-NHCopløses i en blanding af 0,1 rumfangsdel 2-merkaptoætanol og 5 rumfangsdele trifluoreddikesyre og henstår ved stuetemperatur i 30 minutter.
Til blandingen sættes der 0,085 rumfangsdel 5,7N saltsyre.
149756 27
Den resulterende blanding afkøles og der tilsættes 50 rumfangsdele æter. Bundfaldet opsamles ved filtrering, vaskes med æter, tørres, opløses i DMF og afkøles til 0°0. Til opløsningen sættes der 0,318 vægtdel H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OH-hy-droklorid, 0,107 vægtdel HONBI, 0,124 vægtdel DCC og 0,17 vægtdel N-ætylmorfolin, hvorefter blandingen omrøres i 12 timer. Det udfældede dicyklohexylurinstof fjernes ved filtrering og filtratet koncentreres under nedsat tryk. Remanensen opløses i 5 rumfangsdele 5%s vandig ætanol, anbringes på en kolonne af "Amberlite'· XAD-2 og desorberes i et lineært gradient-elueringssystem strækkende sig fra 5%s vandig ætanol til 80%s vandig ætanol. Hovedfraktionerne frysetørres og der vindes 0,135 vægtdel H-(pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Met-Arg(N02)-Pro-NHC2H^. 0,1 vægtdel af dette produkt opløses i en blanding af 0,02 rumfangsdel anisol, 0,02 rumfangsdel ætanol og 0,02 rumfangsdel 2-merkaptoætanol samt 6 rumfangsdele hydrogenfluorid, hvorefter blandingen omrøres ved 0°C i en time. Hydrogenfluoridet fjernes ved afdampning under nedsat tryk og remanensen tørres i en desikkator. Remanensen opløses i 20 rumfangsdele vand og føres gennem en kolonne af "Am-berlite" CG-400 i acetatform. Efter at være ført gennem kolonnen frysetørres opløsningen. Remanensen opløses i 20 rumfangsdele vand og til remanensen sættes der 0,4 rumfangsdel tioglykolsyre. Blandingen henstår ved 60°C i ti timer. Reaktionsblandingen fortyndes med 50 rumfangsdele vand, adsorberes på en kolonne af karboxymetylcellulose og desorberes i et lineært gradient-elueringssystem strækkende sig fra 0,005N ammoniumacetat til 0,2N ammoniumacetat. Hovedfraktionerne frysetørres hvorved der vindes 0,02 vægtdel af det ønskede produkt i rå form. Produktet bringes til adsorption på en kolonne af "Sephadex" LH-20 og elueres med 0,IN eddikesyre. Den eluerede opløsning frysetørres til frembringelse af et renset produkt, tic: Rf = 0,31 (silikagel; n-butanol/ eddikesyre/ætylacetat/vand 1:1:1:1) = -43,2° (c = 0,25 i 5%s eddikesyre).
Aminosyreanalyse: His 0,9 (1), Arg 0,9 (1), Trp 0,8 (1), Ser 0,7 (1), Glu 0,9 (l), Pro 1,1 (l), Gly 1,0 (l), Met 0,9 (l), Tyr 0,7 (l), ætylamin 0,9 (l).
28 149765
Forsøg
De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser, herunder saltene, er som nævnt nyttige til behandling af forskellige ovariesygdomme, særlig ovariefollikel-cyster, og til induktion af svangerskab hos abnorme eller syge dyr med sådanne sygdomme.
Den terapeutiske virkning og svangerskabsinduktionen beskrives i det følgende på basis af forsøg med forbindelsen H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-NHC2H5-acetat (i det følgende betegnet I').
1· QY§tiefollikelcyster
Ca. 700 køer af racerne Holstein og Japanese Black, diagnosticeret til at have follikelcyster, fik intramuskulært forbindelsen 1' i en dosis på 25-500 μg pr. individ. 66% af dyrene blev klinisk helbredt, og 55% blev frugtsommelige.
Som kontrol fik 150 køer af racen Holstein 5000-30000 I.U. (internationale enheder) HCG (humant chorigonadotropin) intramuskulært. Procenten af klinisk helbredte dyr var 40 og af'dyr. der blev frugtsommelige 33.
Som ovariekarakterer efter behandlingen med forbindelsen 1' iagttoges brud på de cystiske follikler, luteinisering eller regression af de cystiske follikler. Koncentrationer af LH (luteiniseringshormon) måltes i nogle tilfælde. Plasma-LH steg hurtigt efter behandlingen og nåede topværdi 1-2 timer efter den. Ændringer i plasma LH-mønsteret lignede den præ-ovulations-bølge der ses hos køer med normal cyklus.
Det er bemærkelsesværdigt at nogle af køerne undfangede ved insemination 0-2 dage efter behandlingen.
350 køer fik 25-500 μg af forbindelsen 1' og blev insemineret kort tid efter behandlingen..
Der.iagttoges ovulationer ved rektal palpitation i 84% af tilfældene og der opnåedes en undfangelsesfrekvens på 67% ved første og anden insemination.
149755 29 3· QYåEieEgssivitet
Ca. 230 køer der var diagnosticeret som havende abnormt hvilende ovarier fik 100-500 μg af forbindelsen I'. 65% af køerne kom i østrus og 50% af dem undfangede. Udvikling af folliklen og corpus luteum konstateredes hos køer der havde reageret.
4· Forsøg_med_rotter
Et antal af de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede nonapeptidamidderivater blev indgivet til rotter i diøstrus. Rotterne holdtes under betingelser med lys fra kl. 7.30 til 21.30 på behandlingsdagen, og kl. 14.30 denne dag blev testforbindelsen indgivet subkutant. Næste dags morgen blev de ovulerede æg i ægledernes udvidelser inspiceret under et differential-interferensmikroskop. På basis heraf bestemtes EDgQ for den ovulationsinducerende effekt, og værdierne fremgår af nedenstående tabel.
Disse forsøg kan anses for kriterium på om de virksomme forbindelser også vil være virksomme i de foran beskrevne forsøg 1-3.
Ai; a2 y ed50, ng/ioo g legemsvægt
Tyr Leu NH-CH3 165,0
Tyr Leu NH-CH2-CH3 32,0
Tyr Leu NH-CH2-CH2-CH3 56,0
Tyr Leu NH-CH2-CH2-0H 170,0
Tyr Leu NH-CH(CH3)2 76,0
Tyr NLe NH-CH2-CH3 53,6
Tyr Met NH-CH2-CH3 35,0
Phe9 Leu NH-CH2-CH3 84,0
Phe ILe NH-CH2-CH3 115,0
Tyr Leu Gly-NH2 215 + 12 ng naturligt dekapeptid
Claims (5)
1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af LHRH-analoge nonapeptidamidderivater med den almene formel L-pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptofyl-L- _ 12 x seryl-A -glycyl-A -L-arginyl-L-prolyl-Y 1. hvor A betegner L-tyrosyl eller L-fenylalanyl, hvor A betegner L-leucyl, L-isoleucyl, L-norleucyl, L-valyl, L-norvalyl; eller L-metionyl og hvor Y betegner gruppen:: NHR hvor R er en lige eller grenet alkylgruppe med 1-3 kulstofatomer, eventuelt substitueret med hydroxy, eller fysiologisk acceptable salte eller metalkomplekser deraf, kendetegnet ved at et reagens A, der består af L-pyroglutaminsyre eller et peptidfragment som indeholder en L-pyroglutaminsyreenhed i den N-terminale ende og regnet derfra indeholder en del af den i formel I viste aminosyresekvens, kondenseres med et reagens B som udgøres af en prdnokonponent der svarer til den resterende del af nona-peptidamidderivatet med den almene formel I, hvilke reagenser A og B om ønsket er beskyttet med en eller flere beskyttelsesgrupper, hvorefter eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrupper fjernes og det dannede produkt om ønsket omdannes til et fysiologisk acceptabelt salt eller metalkompleks deraf.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 1 2 ved at A er L-tyrosyl, A er L-leucyl og Y er NHCI^CH^ eller nhch2ch2oh.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at A^ er L-tyrosyl, A^ er L-leucyl og Y er NHCH^.
4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 1 2 ved at A er L-fenylalanyl, A er L-isoleucyl og Y er NHCH2CH3.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at A"*" er L-tyrosyl, A^ er L-leucyl og Y er NHCH2CH2CH3.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at A1 er L-tyrosyl, A2 er L-leucyl og Y er NHCH(CH3)2·
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP4268672 | 1972-04-29 | ||
JP4268672A JPS5324423B2 (da) | 1972-04-29 | 1972-04-29 | |
JP11845272 | 1972-11-24 | ||
JP11845272A JPS5324424B2 (da) | 1972-11-24 | 1972-11-24 | |
DK225073A DK147851C (da) | 1972-04-29 | 1973-04-25 | Nonapeptidamidderivater til brug ved diagnosticering af hypofysefunktionog gonadotropindeficiens samt regulering af formeringen hos normale dyr |
DK225073 | 1973-04-25 |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DK441083A DK441083A (da) | 1983-09-27 |
DK441083D0 DK441083D0 (da) | 1983-09-27 |
DK149755B true DK149755B (da) | 1986-09-22 |
DK149755C DK149755C (da) | 1987-12-07 |
Family
ID=27221541
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DK441083A DK149755C (da) | 1972-04-29 | 1983-09-27 | Analogifremgangsmaade til fremstilling af lhrh-analoge nonapeptidamidderivater eller fysiologisk acceptable salte eller metalkomplekser deraf |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DK (1) | DK149755C (da) |
-
1983
- 1983-09-27 DK DK441083A patent/DK149755C/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK441083A (da) | 1983-09-27 |
DK441083D0 (da) | 1983-09-27 |
DK149755C (da) | 1987-12-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DK147851B (da) | Nonapeptidamidderivater til brug ved diagnosticering af hypofysefunktionog gonadotropindeficiens samt regulering af formeringen hos normale dyr | |
FI60553B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av ovulationsframkallande nonapeptidamidderivat | |
BG60740B2 (bg) | Полипептид | |
US4118483A (en) | Peptides having gonadoliberin activity and process for their manufacture | |
DK148305B (da) | Analogifremgangsmaade til fremstilling af et lh-rh-analogt nonapeptidamidderivat eller et salt eller metalkompleks deraf | |
AU682702B2 (en) | Process for the preparation of phenylalanine derivatives or homologues containing a guanidino or modified guanidino group useful for the preparation GnRH of antagonistic peptides | |
DK149862B (da) | Analogifremgangsmaade til fremstilling af lh-rh-analoge dekapeptidamider eller et salt eller et metalkompleks deraf | |
JP2542362B2 (ja) | 新規ハロ低級アルキルグアニジノ置換アミノ酸化合物およびその製法 | |
US6235876B1 (en) | Liquid phase process for the preparation of GNRH peptides | |
Rivier et al. | Gonadotropin-releasing hormone antagonists: novel members of the azaline B family | |
GB2058079A (en) | TRH analogues | |
US3835108A (en) | Process for preparing the releasing hormone of luteinizing hormone(lh)and of follicle stimulating hormone(fsh),salts and compositions thereof,and intermediates therefor | |
JP3568952B2 (ja) | 5位及び6位に修飾アミノアシル残基を有するlhrh拮抗薬 | |
US3749703A (en) | Asn15-bovine thyrocalcitonin | |
US3888838A (en) | Decapeptide having luteinizing hormone (lh)-and follicle stimulating hormone (fsh)-releasing activity, salts and compositions thereof, a process for preparing same, and intermediates therefor | |
US3862927A (en) | Process for preparation of vasoactive intestinal peptide | |
US4111923A (en) | Octapeptides and methods for their production | |
JPH0631314B2 (ja) | 新規なゴナドリベリン誘導体 | |
SE461042B (sv) | Peptider med tillvaextbefraemjande aktivitet jaemte veterinaera kompositioner innehaallande naemnda peptider | |
JPS6220200B2 (da) | ||
DK149755B (da) | Analogifremgangsmaade til fremstilling af lhrh-analoge nonapeptidamidderivater eller fysiologisk acceptable salte eller metalkomplekser deraf | |
US4087419A (en) | Heptapeptides and methods for their production | |
GB2109796A (en) | Anorexigenic tripeptides, process for the preparation thereof and pharmaceutical compositions containing them | |
DK149114B (da) | Analogifremgangsmaade til fremstilling af gamma-endorphin-analoge hexadekapeptider eller peptidderivater | |
US4087416A (en) | New heptapeptides and methods for their production |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PUP | Patent expired |