DK149114B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af gamma-endorphin-analoge hexadekapeptider eller peptidderivater - Google Patents

Description

U91U

i

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte psykofarmakologisk aktive peptider og peptidderivater, der er afledt af en vis fraktion af hormonet 0-lipotropin (Ø-LPH). Ø-lipotropin er et polypeptid bestående 5 af 91 aminosyrer, som dannes i hypofysebaglappen og udviser fedtmobiliserede virkning.

Nogle Ø-LPH-fragmenter er allerede kendt, og har været be= skrevet i litteraturen. Se f.eks. artiklerne i Chem. & 10 Eng. News fra 16. august 1976, side 18 og 15. november 1976, side 26.

Det er således kendt, at fragmentet γ-lipotropin, Ø-LPH-(1-58) har fedtmobiliserende egenskaber ligesom Ø-LPH 15 selv. Fragmentet Ø-LPH-(41-58) kaldet Ø-melanotropin er i stand til at påvirke pigmenteringen af huden ved at sti= mulere melanocyterne.

Sekvensen Ø-LPH-(61-91) kaldet Ø-endorphin vides at have 20 analgetisk virkning, der ligesom virkningen af morfin kan antagoniseres af naloxon, således at den antagelse, at både morfin og Ø-endorphin virker ved samme receptor er logisk og nærliggende.

25 I mellemtiden har det også vist sig, at en vis affinitet for opiatreceptoren også udvises af mindre peptidfragmen= ter af Ø-endorphin, f.eks. 0-LPH-(61-76) (α-endorphin), fragmentet Ø-LPH-(61-69) og fragmentet 0-LPH(61-65) (Met-enkephalin). Se Nature 258, 577 (1975).

30

Affinitet for opiatreceptoren er også beskrevet for det 65 endogene peptid Leu-enkephalin [Leu ]-ø -LPH-(61-65) og 6 o for det syntetiske D-Ala-Met-enkephalin, [D-Ala ]-Ø-LPH- 2 149114 (61-65). Se f.eks. Science 194, 330 (1976).

Det er endvidere allerede konstateret, at β-endorphin, β-LPH-(61-91) har visse psykofarmakologiske egenskaber.

F.eks. hammer dette peptid ekstinktionen af den (aktive) 5 flugtreaktion ved den velkendte stangklatringsprøve (ad= færd til undgåelse af stangspring). Denne egenskab hos β-endorphin kan ikke formindskes af kendte morfinantago= nister såsom naloxon eller naltrexon, således at en fag= mands konklusion om, at den psykofarmakologiske virkning af β-endorphin er fuldstændig uafhængig af opiatreceptor= stederne i hjernen, er berettiget.

10

Foruden β-endorphin er de mindre peptidfragmenter af= ledt af dette polypeptid, nemlig α-endorphin, fragmentet β-LPH-(61-69) og met-enkephalin blevet påvist at haanme ekstinktionen af flugtreaktionen på lignende måde.

15

Peptidet Y-endorphin, β-LPH (61-77), som har aminosyre-sekvensen L-Tyr-L-Gly-L-Gly-L-Phe-L-Met-L-Thr-L-Ser-L-Glu-L-Lys-L-Ser-L-Gln-L-Thr-L-Pro-L-Leu-L-Val-L-Thr-L-Leu, og som kun adskiller sig fra α-endorphin véd tilstedeværelsen af en ekstra aminosyre 20 ved den C-afsluttede ende, har også vist sig at have psyko- farmakologisk virkning, omend af en helt anden karakter end virkningen af a- og β-endorphin. Medens α-endorphin forhalede denne ekstinktion af flugtreaktionen, blev Y"-endorphin derimod påvist at fremskynde ekstinktionen af flugtreaktionen.

25 Det er bemærkelsesværdigt, at bare tilføjelse af én aminosyre- rest til den C-afsluttede del af α-endorphin kan bevirke en så dramatisk omvending af adfærdsvirkningen.

Overraskende har det nu vist sig, at peptiderne med en 30 aminosyrerækkefølge β-LPH-(62-77) eller nært beslægtede analoge deraf, hvilke peptider ikke har den første aminosyre i γ-endorphin, fremskynder ekstinktionen af flugtreaktionen i . større omfang end γ-endorphin. I modsætning til γ -endorphin har disse peptider fremstillet ifølge Opfindelsen 35 endvidere ikke affinitet til opiatreceptorerne.

3

U91H

I amerikansk patent nr. 4.097.471 er beskrevet et peptid af formlen H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-OH eller et salt deraf. Amerikansk patent nr. 4.127.517 beskriver et peptid af formlen H-Tyr-5 X-[Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-

Thr] -Leu-Phe-Lys-Asn-Ala-Ile. Amerikansk patent nr.

4.127.518 beskriver et peptid, H-Tyr-X-[Gly-Phe-Met-.Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr] -Leu-Y, hvor Y er OH, alkoxy, amin og salte deraf. Amerikansk patent nr.

10 4.127.519 viser et peptid af formlen analogt med '518, hvori Leu-delen uden for den del, der er i parentes, er erstattet med Leu-Phe-delen. Amerikansk patent nr. 4.127.520 beskriver også et peptid analogt med '518, men erstatter '518's Leu-Y med en Leu-Phe-Lys-Y-del. Ingen af disse forbindelser 15 har imidlertid fremskyndende virkning på ekstinktionen af flugtreaktionen.

Overraskende er der nu blevet fundet hidtil ukendte pepti= der med den almene formel: 20 B-Ai-A^.-L-Phe-X-L-Thr-L-Ser-^-Y-L-Ser-^-L-Thr-L-Pro-L-Leu-

L-Val-L-Thr-B

hvor 25 og A2 er en L-ammosyrerest ned den almene'-fonter -HN-ALK-OO-, hvor ALK er en alkylidengruppe med 1-6 carbonatomer, X er en af amino syreresterne L-Met, L-Met(O), L-Met(02) og L-Leu, 12 R og R er en af aminosyreresterne L-Glu og L-Gln, ·>Λ Y er aminosyreresten L-Lys eller D-Lys, og B er L-Leu-OH, L-MéLeta-OH eller L-Leucinol.

4 149114

Opfindelsen angår således en analogifremgangsmåde til fremstilling af disse γ-endorphin-analoge peptider eller svreadditio-nssalte eller metalsalte, estere afledt af aliphatiske alkoholer med 1-6 carbonatomer, usubstituerede amider, N-alkanoyl-5 (C^-Cg) derivater eller metalkomplekser fremkommet ved kontakt af peptidet med et sparsomt opløseligt salt, hydroxyd eller oxyd af et metal, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig veddet i kravets kendetegnende del angivne.

10 1 2 Særligt foretrukne er peptiderne, hvori en af R og R er 1 o L-Glu og den anden L-Gln; især er R Glu og R Gin. Ved alkyliden med 1^6 carbonatomer menes en alkyliden hydrocarbon med 1-6 carbonatomer usubstitueret med andre molekyIdele.

15 Alkylidenerne kan være ligekædede eller forgrenede.

Aminosyreresterne dækket af og/eller A2 er f.eks. glycyl, alanyl, valyl, leucyl eller isoleucyl, fortrinsvis Gly og L-Ala.

20

Peptiderne ifølge den almene formel I og de funktionelle derivater fremstilles i trin, der hver især er velkendte. Fremgangsmåderne, der hyppigst anvendes til fremstilling af forbindelserne med formlen (I) eller deres funktionelle derivater, 25 - kan opsummeres som følger i tre alternative fremgangsmåder: (a) kondensation i nærværelse af et kondensationsmiddel af (1) en aminosyre eller et peptid indeholdende en fri carb= oxylgiruppe (og hvori andre reaktionsdygtige grupper er 30 blevet beskyttet) med (2) en forbindelse (aminosyre, pep= tid eller amin) indeholdende en fri amino gruppe, og hvori andre reaktionsdygtige grupper ligeledes er blevet beskyt= tet), eller 35 (b) kondensation af (1) en aminosyre eller et peptid inde= holdende en aktiveret carboxylgruppe, og hvori andre reak= tionsdygtige grupper eventuelt er blevet beskyttet,med (2) 5 149114 en forbindelse (aminosyre, peptid eller amin) indeholdende en fri NH2 gruppe, og hvori andre reaktionsdygtige grupper er blevet beskyttet, eller 5 (c) kondensation af (1) en aminosyre eller et peptid inde= holdende en fri carboxylgruppe (og hvori andre reaktions= dygtige grupper er blevet beskyttet) med (2) en forbindel* se (aminosyre, peptid eller amin) indeholdende en aktiveret aminogruppe),(og hvori andre reaktionsdygtige grupper even= 10 tuelt er blevet beskyttet), hvorpå de beskyttende grupper, om ønsket, fjernes.

Fremgangsmåder til at aktivere carboxylgruppen er kendt for fagfolk og indebærer omdannelse af denne til et syrehaloge= 15 nid, et azid, anhydrid, imidazolid eller en aktiveret ester, såsom N-hydroxyravsyreimidesteren eller p-nitrophenyleste= ren.

Aminogruppen kan aktiveres på kendte måder, herunder omdan= 20 nelse af aminogruppen til et phosphitamid, eller ved at an= vende "phosphor-azo"-metoden. Med henblik på begge aktive= ringsmåder henvises til: Houben-Weyl, Methoden der Orga= nischen Chemie, 4.udgave, bind XV/2 (Georg Thieme forlag).

25

De mest sædvanlige fremgangsmåder til ovennævnte kondensa= tionsreaktioner er: carbodiimidmetoden, azidmetoden, den blandede anhydridmetode og den aktiverede estermetode som beskrevet i E. Schroder og K. Lubke, "The Peptides", bind I, 1965 (Academic Press). Den såkaldte fastfase metode-ifølge 30

Merrifield, beskrevet i 85 J.Amer.Chem.Soc. 2149 (1963), kan endvidere anvendes til fremstillingen af peptiderne med den almene formel (I) og deres funktionelle derivater.

De reaktionsdygtige grupper, som ikke tager del i konden= ^ sationsreaktionen, beskyttes effektivt af egnede såkaldte beskyttende grupper, som igen senere let fjernes ved hy= drolyse eller reduktion. En carboxylgruppe kan således ef= fektivt beskyttes på kendte måder, f.eks. ved forestring med 149114 6 mindst en støkiometrisk effektiv mængde methanol, ethanol, tertiær butanol, benzylakohol eller p-nitrobenzylalkohol eller alternativt ved omdannelse på kendt måde til et amid, f.eks. som beskrevet i Houben-Weyl Methoden der Organischen 5 Chemie, 4. udgave, bind XV/1, side 315 ff. Denne sidstnævn® te beskyttende gruppe er dog meget vanskelig at fjerne, så® ledes at det anbefales, at denne gruppe kun benyttes til at beskytte carboxylgruppe i den C-afsluttende aminosyre i det endelige peptid eller γ-carboxylgruppen i glutaminsyre.

10 I dette tilfælde fører peptidsyntesen direkte til amidet af peptidet ifølge den almene formel I.

Grupper, der effektivt kan beskytte en aminogruppe, er i almindelighed egnede syregrupper, f.eks. en syregruppe af® 15 ledt af egnede alifatiske, aromatiske, aralifatiske eller heterocykliske carboxylsyrer (såsom eddikesyre, benzoesyre, pyridincarboxylsyre) eller en syregruppe afledt af carbon® syre (såsom ethoxycarbonyl, benzyloxycarbonyl, t-butyloxy= carbonyl eller p-methoxybenzyloxycarbonyl), eller en syre® 20 gruppe afledt af en sulfonsyre (såsom benzolsulfonyl eller p-toluolsulfonyl). Andre grupper kan også anvendes, såsom substituerede eller usubstituerede aryl- eller aralkylgrup® per, f.eks. benzyl og triphenylmethyl eller grupper såsom o-nitrophenylsulphenyl eller 2-benzoyl-l-methylvinyl. (Se 25 Houben-Weyl, bind XV/1, side 46 ff).

Det foretrækkes at beskytte også ε-aminogruppen i lysin og eventuelt hydroxyIgrupperne i serin og threonin. Den sidst® nævnte beskyttelse er dog ikke uundgåeligt nødvendig. De sæivan® 30 lige beskyttende grupper i denne forbindelse er en tertiær butyloxycarbonylgruppe eller en tosylgruppe til £-amino= gruppen i lysin og en t-butyl- eller benzylgruppe til hydroxylgruppen i serin og threonin.

35 De beskyttende grupper kan spaltes på forskellige sædvan® lige måder afhængende af karakteren af den pågældende grup® pe, f.eks. ved hjælp af trifluoreddikesyre eller ved mild 149114 7 reduktion, f.eks. med hydrogen og en katalysator såsom palladium, eller med HBr i iseddike.

Peptider med aminosyreresten L-Met(O) kan fremstilles af det 5 tilsvarende Met-holdige peptid ved mild oxidation under an vendelse af kendte måder, f.eks. med fortyndet hydrogenper= oxid eller en persyre.

En sådan oxidation resulterer i en blanding af S- og R-10 sulfoxidet, der kan opspaltes til de adskilte diastereo= isomere på kendte måder, f.eks. ved selektiv krystallisa= tion. De adskilte diastereoisomere kan også fås direkte ved anvendelse af L-methionin-S (eller R)-sulfoxid ved pep= tidsyntesen.

15

Sulfonpeptiderne med: formlen-! (I.) med aminosyreresten M.et(02) kan fås ved oxidation af det tilsvarende Met-pep= tid I eller ved anvendelse af methioninsulfon ved peptid= syntesen.

20

De funktionelle derivater af peptiderne ifølge den almene formel I er: (a) syreadditionSsaltene og metalsaltene af peptiderne, 25 (b) estere.afledt af alifatiske alkoholer med 1-5 carbonato-mer, såsom methanol, ethanol, propanol, isopropanol, buta= nol, sekundær butylalkohol, amylalkohol, isoamylalkohol og 30 hexylalkohol, (c) usubstituerede amider, (d) N-acylderivater afledt af en alifatisk carboxylsyre 8 149114 med 1 til 6 carbonatomer og (e) metalkomplekser dannet ved at bringe peptiderne med formlen (I) i kontakt med et sparsomt opløseligt salt, hydroxid eller 5 oxid af et metal, fortrinsvis zink.

Salte kan fås direkte af reaktionsmediet, hvori peptiderne fremstilles, eller de kan fremstilles senere ved reaktion af peptidet med en base.

10

Syreadditionsaltene, der er nævnt ovenfor under (a) ,kan fås direkte ved at isolere peptidet af det ønskede sure me= dium, eller det fremkomne peptid kan omdannes senere til et syreadditionssalt ved reaktion af peptidet med en syre 15 såsom HC1, HBr, phosphorsyre, svovlsyre, eddikesyre, male= insyre, vinsyre, citronsyre, polyglutaminsyre eller car= boxymethylcellulose osv.

Metalsaltene, der er nævnt ovenfor under (a), især alkali= 20 metalsaltene fås ved reaktion af peptidet med den ønskede metalbase såsom NaOH, NaC03, NaHC03 osv.

N-acyIderivaterne, der er nævnt ovenfor under (d), hvorved specielt forstås N-endestillede acylderivater, fremstilles 25 fortrinsvis ved anvendelse i peptidsyntesen af en aminosyre, der allerede bærer den pågældende acylgruppe. Denne acyl= gruppe virker så også som beskyttende gruppe ved peptid= syntesen. På denne måde fremstilles de ønskede acylderi= vater direkte. Det er dog også muligt at indføre den ønske= 3ø de acylgruppe senere ved at acylere peptidet på sædvanlig måde, der er velkendt for fagfolk.

Den N-acylgruppe, der mest foretrækkes, er acetylgruppen.

35 Estere og amider under (b) og (c) fremstilles også for= trinsvis ved anvendelse i peptidsyntesen af en aminosyre, der allerede bærer den ønskede ester- eller amidgruppe. De 9

14911A

kan dog også fremstilles senere ved forestring af det frem= komne peptid på sædvanlig kendt måde eller ved at omdanne dette til et amid.

5 Metalkomplekserne under (e) ovenfor kan fås ved at bringe peptidet i.berøring med sparsomt opløselige metalsalte, metalhydroxider eller metaloxider. Metalphosphater, metal= pyrophosphaterne og metalpolyphosphaterne anvendes i reg= len som sparsomt opløselige metalsalt. Metallerne, der kan 10 anvendes ved denne fremgangsmåde, er de metaller som hører til "b" undergruppen i det periodiske system, f.eks. cobolt, nikkel, kobber, jern og fortrinsvis zink samt metaller fra hovedgrupperne i det periodiske system, der er i stand til at danne komplekser, såsom magnium og aluminium. Fremstil= 15 lingen af disse metalkomplekser sker på sædvanlig måde. Et metalkompleks kan f.eks. fås ved at sætte peptidet og et sparsomt opløseligt metalsalt, metalhydroxid eller metaloxid til et vandigt medium. Metalkomplekset kan også fås ved tilsætning af et alkalisk medium til en vandig opløsning 20 af peptidet og et opløseligt metalsalt, således at det uop= løselige peptid- metalhydroxidkompleks dannes. Metalkomplek* set kan endvidere fås ved tilsætning af peptidet, et opløse= ligt metalsalt og et yderligere opløseligt salt til et van= digt, fortrinsvis alkalisk medium, således at et uopløse* 25 ligt peptid-metalsaltkompleks dannes in situ.

Metalkomplekserne kan anvendes direkte uden yderligere op= arbejdning som suspensioner, eller de kan f.eks. frysetør* res og senere gensuspenderes.

Peptiderne ifølge den almene formel I og de funktionelle derivater som ovenfor defineret fremskynder (som allerede nævnt ovenfor) ekstinktionen af den (aktive) flugtreaktion 30 10 imu hos rotter ved den såkaldte stangklatringsprøve i meget betydeligt omfang.

Den passive flugtadfærd hos rotter nedsættes også betyde= ligt ved anvendelse af peptiderne f rans til let ved fremgangsmåden ifølge 5 opfindelsen.

Foruden de ovennævnte virkninger på adfærden bevirker de ifølge opfindelsen fremstillede peptider i højere doser en udtalt nedsættelse af bevægelsen af rotter, en overraskende 10 virkning, der ikke kunne iagttages med a-endorphin eller selv med γ-endorphin.

De ifølge opfindelsen fremstillede peptider er endvidere overraskende aktive ved den såkaldte gribeprøve, som anses for 15 at være en yderligere prøve for mulig neuroleptisk virkning.

Rotterne behandlet med peptiderne fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen hænger over burets gulv med deres forpoter fattende en blyant i betydeligt længere tid end rotter behandlet med saltvand (placebo) eller a-endorphin.

20

Denne farmakologiske profil gør peptiderne og peptidderivaterne særligt egnede til brug ved behandling af visse mentale forstyrrelser, ved hvilke der ønskes en reduktion af de cerebrale funktioner. Specielt er de ifølge opfindelsen frem-25 stillede peptider neuroleptisk virksomme og er således egnede til behandling af f.eks. schizofrene syndromer.

Peptiderne anvendes i effektive mængder med kendte bærere og bruges fortrinsvis i en dosering på 1 jug til 1 mg pr.

2Q kg legemsvægt pr. dag afhængende af den form, hvori de ad ministreres. Mennesker behandles fortrinsvis med en daglig dosis på 0,1 mg til ca. 10 mg, specielt mellem 0,5 og 2 mg.

35

Peptiderne kan administreres ad enten den orale, rektale eller parenterale vej ved hjælp af en farmaceutisk effektiv 149114 11 bærer, der er velkendt inden for dette tekniske område. Peptiderne anvendes fortrinsvis som injicerbare præparater. Til injektionsformål bliver de opløst, suspenderet eller emulgeret i en egnet væske. Blandet med egnede hjælpestoffer og fyldig stoffer kan peptiderne endvidere leveres i en form egnet til oral administration, såsom piller, tabletter, drageer eller kapsler. De ifølge opfindelsen fremstillede peptider kan endvidere administreres i form af et suppositorium eller en sprøj-tevæske.

10 Særligt værdifulde præparater fås, når peptiderne leveres i en form, der giver forlænget virkning. Fortrinsvis anven= des metalkomplekserne. Disse metalkomplekser kan fås ved at bringe peptiderne i berøring med sparsomt opløselige me= talsalte, metalhydroxider eller oxider af velkendt art. Me= 15 talphosphaterne metalpyrophosphaterne og metalpolyphospha= terne anvendes i almindelighed som sparsomt opløselige me= talsalte.

Peptider ifølge den almene formel I, der særligt foretræk= 2o kes, er de peptider, hvori A^ og A2 er Gly eller L-Ala, X er L-Met, L-Met(O) eller L-Met(00), 1 z R er L-Glu, 25 Y er L-Lys, er L-Gln, og B er L-Leu-OH, samt syreadditionssaltene, de alifatiske (1-6C estere og uSubstituerede amider deraf.

Med hensyn til de følgende eksempler skal gøres følgende bemærkninger: I. Hvis der ikke anføres nogen optisk konfiguration for= stås L-formen.

35 II. Følgende forkortelser er anvendt for de benyttede be= skyttende eller aktiverende grupper: U9114 12

Boc = tertiær butyloxycarbonyl tBu = tertiær butyl Me = methyl ONp = p-nitrophenyloxy 5 Z = benzyloxycarbonyl III. Følgende forkortelser er anvendt for de benyttede op= løsningsmidler eller reagenser: 10 To = toluol

EtOH = ethanol

Bu = butanol

Py = pyridin

Ac = eddikesyre 15 EtOAc = ethylacetat

Am = amylalkohol I.A.N. eller IAN = iso-amylnitrit DMF = dimethylformamid THF = tetrahydrofuran 20 DCCI = dicyklohexylcarbodi-imid DCHU = dicyklohexylurinstof TEA = triethylamin TFA = trifluoreddikesyre

Wa = vand 25 N.E.M. = N-ethylmorpholin HOBt = N-hydroxybenztriazol IV. Følgende forkortelser er anvendt for aminosyregrupper= ne: 30

Met = methionyl

Met(O) = sulfoxid af methionyl

MetCC^) = sulfon af methionyl

Phe = phenylalanyl 35 Pro = prolyl

Ser = seryl

Lys = lysyl 1491 14 13

Thr = threonyl

Glu = glutamyl

Gin = glutaminyl

Gly = glycyl 5 Val = valyl

Leu = leucyl

Ala = alanyl

MeLeu = Na-methylleucyl 10 Eksempler - udgangsmaterialer A. Syntese af Boc-Gly-Gly-Phe-Met-OH og analoge.

(1) H-Phe-Met-OMe,HC1 15 11,83 g Boc-Phe-Met- OMe (se Biochemistry 8, 4183 (1969) opløses i 100 ml methylenchlorid, hvorefter HC1 ledes ind i opløsningen i ca. 40 minutter. Efter inddampning af opløsningen til tørhed tilsættes 75 ml ethyl= acetat, hvilket resulterer i et bundfald. Det faste stof 20 fraskilles ved filtrering, vaskes med petroleumsether og tørres. Smeltepunkt 123-124°C.

Rf i To-.EtOH (8:2) » 0,43 på Si02· (2) Boc-Gly-Gly-OH 25

Den anvendte fremgangsmåde var den ifølge Tetrahedron 25, 2119 (1976) · Rf i Bu:Py:Ac:Wa (4:0,75:0,25:1) = 0,42 på Si02·

Dekomponering ved 125-127°C.

30 (3) Boc-Gly-Gly-Phe-Met-OMe 4,43 g Boc-Gly-Gly-OH, A (2) opløses i 30 ml DMF og af= køles til 0°C, hvorefter der tilsættes 1 ækvivalent TEA 35 (triethylamin). Blandingen afkøles yderligere til ca.

-10°C, hvorefter der tilsættes 1 ækvivalent ethylchlorfor= 1491 Η 14 miat, og det hele omrøres i ca. 10 minutter. Derefter sæt= tes 6,6 g H-Phe-Met-OMe,HCl (Al) i 30 ml DMF og 1,1 ækvi= valent TEA til blandingen, som omrøres i ca. 30 minutter ved ca. - 10°C og i yderligere 20 timer ved stuetemperatur.

5 Efter afkøling til ca. -10°C fraskilles TEA,HC1 ved filtre= ring, og filtratet inddampes til tørhed. Remanensen opløses i 235 ml EtOAc og 55 ml vand og vaskes derefter med 30%

NaCl opløsning, 0,1N HC1, 30% NaCl opløsning, 5% NaHCO^ opløsning og 30% NaCl opløsning. Opløsningen tørres så over NaS04, filtreres og inddampes til tørhed. Smeltepunkt 100-101°C. Rf i CHCl3:CH3OH:Wa (70:30:5) = 0,94 på SiOj.

(4) Boc-Gly-Gly-Phé-Met-OH

15 2 ,62 g af peptidet fremstillet i A(3) opløses i 30 ml dioxan/H20-(9:l). Efter tilsætning af 1,2 ækvivalent 2,17N NaOH omrøres det hele ved stuetemperatur i ca. 1 time, hvorefter blandingens pH-værdi indstilles til ca. 6, og den inddampes til tørhed. Remanensen opløses derefter i 2q ' 50 ml EtOAc, hvorefter pH-værdien indstilles til 2 med IN HC1. Efter vask med 30% NaCl (3 x), tørring over Na2S04 og filtrering inddampes opløsningen til tørhed.

Rf = 0,65.' Smeltepunkt 97-98°C.

25 (5) Følgende peptider fremstilles på analog måde:

Boc-Gly-Ala-Phe-Met-OH; Rf = 0,72;

Boc-Ala-Gly-Phe-Met-OH; Rf = 0,73

Boc-Leu-Gly-Phe-Met-OH; Rf = 0,77.

30

Systemet anvendt i A(4) og A(5) er Bu:Py:Ac:Wa (4:0,75: 0,25:1).

B. Syntese af H-Thr-Ser-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-OMe og analoge.

35 (1) H-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-OMe.

15 1-49114 a) 35,3 g Z-Glu(OtBu)-OH og 27,0 g HOBt opløses i 150 ml DMF, hvorefter blandingen afkøles til ca. -22°C. 29,7 g Η-Lys (Boc) -OMe,HCl i 100 ml DMF og 1 askvi valent NEM sættes så til den afkølede blanding. Blandingens pH-værdi indstil- 5 les til 6,4 med NEM, og der tilsættes 23 g DCCI. Efter om røring i ca. 15 minutter ved ca. -22°C og ca. 12 timer ved stuetemperatur, fraskilles DCHU ved filtrering, og filtratet inddampes til tørhed.

lø Remanensen opløses i 400 ml EtOAc og vaskes i rækkefølge med 15% NaCl-opløsning, 5% KHSO^-opløsning, 5% NaHCOg-opløsning og 15% NaCl-opløsning. Efter tørring og filtrering inddampes filtratet til tørhed. Remanensen krystalliseres af ether/petroleumsether (1:2). Udbytte 86,6%, 15 smeltepunkt. 54-56°C.

b) Peptidet fremstillet i B(l) opløses i DMF, hvorefter der tilsættes Pd/C (10%), og H2 ledes igennem, indtil udviklingen af CC>2 ophører. Efter filtrering inddampes fil- 2o tratet til tørhed.

Rf i TosEtOH (8:2) = 0,24 på Si02.

(2) Z-Thr-Ser-N2H3.

25 38,05 g Z-Thr-Ser-OMe (se Recueil 83, 255, (1964), opløses i 12 ml ethanol, hvorefter der tilsættes 43 ml hydrazinhydrat. Efter omrøring i ca. 2 timer, fraskilles det faste stof ved filtrering, vaskes med etha= 30 nol/ether (1:1) og tørres..

Rf i CHCl^sCH^OHiWa (70:30:5) = 0,58 på SiC>2$ dekomponering 215-216°C.

(3) H-Thr-Ser-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-OMe.

35 -- a) 1,22 g af hydrazidet fremstillet i B(2) suspenderes i 16

U91U

15 ml DMF, hvorefter der tilsættes 4,28 ml 2,42N HC1/DMF.

Den klare opløsning afkøles til -20°C. Derefter tilsættes 0,7 ml IAN, og blandingen omrøres i ca. 30 minutter ved ca. -20°C.

5 1,5 g af peptidet fremstillet i B(l) i 10 ml DMF tilsættes så. Reaktionsblandingens pH-værdi indstilles til 7,2, og det hele anbringes i køleskab i ca. 6 dage.

Opløsningsmidlet fjernes så ved fordampning, remanensen 10 opløses i EtOAc, og den fremkomne opløsning vaskes. Ind- dampning til tørhed giver et fast stof. Udbytte 61,9%, smeltepunkt 130-132°C.

b) På lignende måde som beskrevet i B(l) (b) bliver det 15 Z-beskyttede peptid hydrogeneret i methanol med palladium på trækul som katalysator. Udbytte 99%. Rf i Bu:Py:Ac:Wa (38:24:8:30) = 0,73 på Si02· (4) Følgende beskyttede peptider fås på analog måde: 20 H-Thr-Ser-Glu(OtBu)-D-Lys(Boc)-OMe.

Rf i Bu:Py:Ac:Wa (38:24:8:30) = 0,77 på Si02f 25 H-Thr-Ser-Gln-Lys(Boc)-OMe.

Rf i Bu:Py:Ac:Wa (38:24:8:30) * 0,65 på Si02.

C. Syntese af Z-Ser-R^-Thr-Pro-OH (R^ = Glu eller Gin).

30 (1) H-Thr-Pro-OtBu.

17 149114 På den måde, der er beskrevet i B(l), kobles 0,33 mol Z-Thr-OH og 0,35 mol H-Pro-OtBu ved hjælp af HOBt og DCCI i DMF. Udbytte 64%, smeltepunkt 65-67°C.

2 Z-Thr-Pro-OtBu fremstillet på denne måde hydrogeneres på den måde, der er beskrevet ovenfor (se B.3.b.)· Rf i TosEtOH (8:2) = 0,10 på Si02· (2) H-Gln-Thr-Pro-OtBu.

10 1,36 g H-Thr-Pro-OtBu opløses i 10 ml DMF, hvorefter der tilsættes 1,93 g Z-Gln-ONp, og reaktionsblandingen omrøres i ca. 20 timer ved stuetemperatur.

Efter inddampning af blandingen til tørhed, opløses remanensen i EtOAc og vaskes i rækkefølge med 5% KHS04~opløs-ning, 5% NaHCO^-opløsning og en mættet NaCl-opløsning. Opløsningen tørres så over Na2S04 og filtreres, og filtratet inddampes til tørhed. Smeltepunkt 89-90°C, udbytte 20 59%*

Det fremstillede Z-beskyttede peptid hydrogeneres i DMF på den ovenfor beskrevne måde.

25 Rf i CHC13:CH30H (8:2) = 0,08 på Si02· (3) Z-Ser-Gln-Thr-Pro-OtBu.

På analog måde som beskrevet i C(1) kobles 20,5 g Z-Ser-30 OH med peptidet fremstillet i C(2) ved hjælp af DCCI og HOBt. Udbytte 70%. Smeltepunkt 104-106°C.

(4) Z-Ser-Gln-Thr-Pro-OH.

33 1,43 g af peptidet fremstillet i C(3) omrøres i 15 ml 90% TFA ved stuetemperatur i ca. 30 minutter. Blandingen hældes så i ether. Det faste materiale fraskilles ved filtre- 18

14911A

ring, vaskes med ether og tørres. Udbytte 90%, smeltepunkt 111-113°C.

Rf i CHCl3:CH3OH:Wa (70:30:5) = 0,23 på Si02· 5 (5) Z-Ser-Glu(OtBu)-Thr-Pro-OH.

H-Thr-Pro-OMe fremstillet ved kobling af Z-Thr-OH og H-Pro-OMe ved hjælp af HOBt/DCCI-metoden efterfulgt af hydro= 10 genering kobles i. rækkefølge med Z-Glu(OtBu)-OH og Z-Ser- OH. Begge koblingsreaktioner udføres ved HOBt/DCCI-metoden, og efter den første kobling hydrogeneres det fremkomne Z-beskyttede peptid. Det fremkomne peptid Z-Ser-Glu(OtBu)-Thr-Pro-OMe forsæbes derefter ved opløsning i dioxan/vand 15 (9:1) og tilsætning af 0,2N NaOH (se A(4)).

Rf i CHCl3:CH3OH:Wa (70:30:5) = 0,29 på Si02· D. Syntese af H-leu-Val-Thr-Leu-OtBu. .

20 (1) H-Thr-Leu-OtBu.

På en måde svarende til den, der er beskrevet i J.A.C.S.

95, 877 (1973), fremstilles Z-Thr-Leu-OtBu via HOBt/DCCI 25 . koblingsmetoden.

Smeltepunkt 81,5-83°C.

Det Z-beskyttede dipeptid hydrogeneres så på den ovenfor 30 beskrevne måde.

Udbytte 100%; Rf i To:EtOH (8:2) = 0,20 på Si02·

O

19 149114 (2) H-Val-Thr-Leu-OtBu.

Kobling af 7,85 g Z-Val-ONp med 5,53 g H-Thr-Leu-OtBu i 160 ml DMF på den måde, der er beskrevet i C(2) giver Z-5 Val-Thr-Leu-OtBu i et udbytte på 72%.

Smeltepunkt 127-129°C.

Hydrogenering af dette Z-beskyttede peptid i methanol giver 9,1 g af et olieagtigt produkt.

(3) Η-Leu-Val-Thr-Leu-OtBu.

15 Kobling af 6,7 g Z-Leu-ONp og 6,1 g af peptidet fremstil let i D(2), i 160 ml DMF på den måde, der er beskrevet i C(2), giver det Z-beskyttede peptid i et udbytte på 7,7 g (77%). Smeltepunkt 153-155°C. Dette Z-beskyttede peptid hydrogeneres i methanol. Rf = 0,75 på Si02· 20 (4) H-Leu-Val-Thr-Leuclnol. Rf = 0,50.

(5) H-Leu-Val-Thr-MeLeu-OtBu. Rf = 0,68 25 · fremstillet analogt med D(3).

Rf i CHCl3:CH3OH:Wa (70:30:5) på Si02.

30 E. Syntese af Boc-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-OMe og analoge.

(1) Boc-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-OMe 35 2,4 g Boc-Gly-Gly-Phe-Met-OH, A(4) og 3,15 g H-Thr-Ser-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-OMe, B(3) kobles ved hjælp af to ækvivalenter HOBt og et ækvivalent DCCI på den måde, der er beskrevet i B(1).

20 0 149114

Efter fjernelse af DCHU ved filtrering inddampes filtratet til tørhed, og den fremkomne remanens krystalliseres af methanol. Smeltepunkt 207-209°C under dekomponering. Udbytte 61%.

5 (2) Boc-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-OH.

2,92 g af peptidet fremstillet i E(l) opløses i 30 ml di= oxan/vand (9:1), hvorefter der sættes 14,4 ml 0,217 g 10 NaOH til opløsningen. Reaktionsblandingen omrøres i 18 minutter ved stuetemperatur.

Blandingens pH-værdi indstilles så til 2 med N HC1. Efter tilsætning af ca. 10 ml vand krystalliserer et fast stof, 15 og dette frafiltreres og tørres.

Udbytte 78%. Smeltepunkt 215-216°C under dekomponering.

Rf i CHCl-.:CH,OH:Wa (70:30:5) = 0,49 på Si0o.

Følgende fremstilles på tilsvarende måde: (3) Boc-Ala-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-OH 25 Rf i CHCl3:CH3OH:Wa (70:30:5) = 0,52 på Si02.

(4) Boc-Gly-Ala-Phe-Met-Thr-Ser-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-OH Rf i CHCl3:CH3OH:Wa (70:30:5) - 0,51 på Si02.

30 (5) Boc-Leu-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-OH

Rf i CHCl3:CH3OH:Wa (70:30:5) - 0,54 på Si02.

(6) Boc-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu(OtBu)-D-Lys(Boc)-OH Rf i CHCl3:CH3OH:Wa (70:30:5) = 0,50 på Si02· 35 (7) Boc-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Gln-Lys(Boc)-OH Rf i CHCl3:CH3OH:Wa (70:30:5) = 0,40 på Si02·

O

21 149114 5 P. Syntese af H-Ser-R -Thr-Pro-Leu-Val-Thr- o

Leu-OtBu (R - Glu(OtBu) eller Gin) og analoge.

5 (1) H-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-OtBu.

1,17 g Z-Ser-Gln-Thr-Pro-OH fra C(4) kobles til 930 mg H-Leu-Val-Thr-Leu-OtBu D(5) ved hjælp af 2 ækvivalenter HOBt og 1 ækvivalent DCCI, efter fremgangsmåden beskrevet i B(l).

10 Efter fjernelse af det dannede DCHU ved filtrering, inddam pes filtratet til tørhed og opløses i en blanding af sekundær butanol og CHCl^ (2:3), hvorefter opløsningen vaskes og inddampes til tørhed. Remanensen krystalliseres af DMF/EtOAc (1:20). Smeltepunkt 210-212°C. Udbytte 72%.

15

Det fremkomne Z-beskyttede peptid hydrogeneres i methanol på den ovenfor beskrevne måde. Udbytte 86%. Rf i CHCl^: CH3OH:Wa (70:30:5) = 0,25 på Si02.

20 Følgende peptider fremstilles på tilsvarende måde: (2) H-Ser-Glu(OtBu)-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-OtBu, C(5) + D(3).

25 Rf i CHCl3:CH3OH:Wa (70:30:5) = 0,35 på SiOj.

(3) H-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-OMe.

100 mg af peptidet Z-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-OtBu 30 (se F(1)) i 2 ml 90% TFA omrøres i 20 minutter ved stue temperatur. Blandingen inddampes så til tørhed, og det faste materiale frafiltreres og tørres. Det faste stof (80 mg) opløses i DMF og forestres med caesiumcarbonat og methyliodid på den måde, der er beskrevet i J.O.C. 42, 35 1286 (1977), Den Z-beskyttede peptidmethylester hydrogene- reres så i DMF på sædvanlig måde.

Udbytte: 45 mg.

Rf i CHCl3:CH3OH:Wa (70:30:5) = 0,34 på Si02· 22 149114 o (4) H-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-MeLeu-OtBu.

Rf = 0,30 på Si02.

(5) H-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leucinol.

5 Rf = 0,16 på Si02·

Eksempel 1.

Syntese af H-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-OH.

1,28 g Boc-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-OH

fra E(2) ovenfor og 308 mg HOBt blev opløst i 10 ml DMF, og blandingen blev afkølet til ca. -22°C. 1,05 g H-Ser-15

Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-OtBu (F(l)) i 5 ml DMF, og 1 ækvivalent NEM blev derefter tilsat til den afkølede blanding.' Blandingens pH-værdi blev indstillet til 6,5 med NEM, og der blev tilsat 247 mg DCCI. Efter omrøring i 15 20 minutter ved ca. -22°C, 8 timer ved stuetemperatur og til sidst 12 timer ved 35°C under N2, blev det dannede DCHU fraskilt ved filtrering, og filtratet blev vasket og tørret.

25 Det dannede bundfald blev vasket og tørret.

Udbytte 77%. Dekomponering ved 212-214°C.

Rf i CHCl3:CH3OH:Wa (70:30:5) = 0,79 på Si02· 30 1,65 g af det således fremstillede beskyttede peptid blev anbragt i 30 ml 90% TFA, og der blev tilsat nogle få drå-,ber tertiær butylsulfid. Blandingen blev omrørt i 1 time ved stuetemperatur, hvorefter den blev hældt i ether. Det 35 således fremkomne faste stof blev fraskilt ved filtrering og tørret. Stoffet blev så opløst i 30 ml tertiær butanol/ vand (1:1), der tilsættes en ionbytterharpiks i acetatform (LEWATIT®),og blandingen omrøres i ca. 30 minutter. Ion-bytterharpiksen fjernes derpå ved filtrering, og filtratet inddampes til tørhed. Udbytte 1,2 g.

23

1A91U

O Rf i Bu:Py:Ac:Wa (2:0,75:0,25:1) = 0,26 på Si02·

Stoffet renses ved modstrømsfordeling i et opløsningsmiddelsystem Bu:Ac:Wa (4:1:5). Udbytte 680 mg.

5 Eksempel 2.

Syntese af H-Gly-Gly-Phe-Met(O)-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-OH.

10 200 mg af peptidet fremstillet i eksempel 1 opløses i 20 ml iseddike, hvorefter der tilsættes 0,08 ml 30% hydrogen= peroxid. Blandingen omrøres i ca. 1 time ved stuetemperatur, hvorefter der tilsættes 300 mg platinsort i iseddike til blandingen, og det hele omrøres i ca. 15 minutter.

15

Det faste materiale fraskilles ved filtrering, og filtratet inddampes til tørhed. Udbytte 190 mg.

Det således fremkomne peptid renses yderligere ved mod- 20 strømsfordelingskromatografi i opløsningsmiddelsystemet Bu:Ac:Wa (4:1:5).

Udbytte 150 mg (som acetat).

25

Rf i Bu:Py:Ac:Wa (2:0,75:0,25:1) = 0,20 på SiC^·

Eksempel 3.

Syntese af H-Gly-Gly-Phe-Met(0^)-Thr-Ser-Glu-Eys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-OH♦ 200 mg af peptidet fremstillet i eksempel 1 indføres i 5 ml vand, hvorefter der tilsættes 0,025 ml 0,5 M ammonium= 35 molybdat, 0,125 ml HClO^ og 0,075 ml 30% hydrogenperoxid. Blandingen omrøres i ca, 4 timer ved stuetemperatur, hvorefter der tilsættes 5 ml tertiær butanol/vand (1:1), og en ionbytterharpiks i acetatform. Efter omrøring i ca. 30 minutter, fraskilles ionbytterharpiksen ved filtrering, og filtratet inddampes til tørhed.

24 149114 O Udbytte 180mg peptid (i acetatform).

Rf i Bu:Py:Ac:Wa (2:0,75:0,25:1) = 0,23 på SK^·

Eksempel 4.

5 Følgende fremstilles på tilsvarende måde som beskrevet i eksempel 1:

1. H-Ala-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-OH

(E.3 + F.l) Rf = 0,28.

2. H-Gly-Ala-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-OH

(E.4 + F.l) Rf = 0,27.

3. H-Leu-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-OH

20 (E.5 + F.l) Rf = 0,30.

4. H-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-D-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-OH

(E.6 + F.l) Rf - 0,27.

25

5. H-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Gln-Lys-Ser-Glu-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-OH

(E.7 + F.2) Rf = 0,29.

6. H-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-30 Leu-Val~Thr-Leu-OCH3 (E.2 + F.3) Rf = 0,37.

7. (E.2 + F.10) Rf = 0,29.

'8 . H-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-35

Leu-Val-Thr-Leucino1 (E.2 + F.5) Rf * 0,28.

.9'. H-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-

Leu-Val-Thr-MeLeu-OH

(E.2 + F. 4) Rf = 0,32.

O

25 149114

Alle Rf-værdier i Bu:Py:Ac:Wa (2:0,75:0,25:1) på SiC^· 5 Eksempel 5.

Adfærd til undgåelse af stangspring.

Rotter blev trænet til at springe på en stang inden for 10 5 sekunder efter præsentation af den betingede stimulus (CS), som var et lys oven på buret. Rotter, som ikke sprang inden for 5 sekunder, fik uregelmæssige fodchock (0,2 mA) som ubetinget stimulus (UCS), indtil reaktionen fremkom, eller i maksimalt 30 sekunder. Der blev foretaget 15 10 forsøg om dagen inden for en given periode med et gen nemsnitligt mellemrum mellem forsøgene på 60 sekunder. Mellemrummene mellem forsøgene var 40, 60 og 80 sekunder, der blev præsenteret på tilfældig måde. Rotter blev trænet i 4 dage. Extinktion blev undersøgt dagen efter er-20 hvervelsen. I den første periode efter erhvervelsen blev manglende reaktion inden for 5 sekunder på CS ikke efterfulgt af UCS. Alle rotter fik en periode på 10 forsøg til extinktion. De dyr, som foretog 8 eller flere undgåeiser, blev anvendt til yderligere forsøg. Disse rotter modtog 25 peptid eller placebo (saltvand) i et rumfang på 0,5 ml pr. rotte subkutant, umiddelbart efter afslutningen af første extinktionsperiode. Extinktionen blev undersøgt igen 2 og 4 timer senere.

149114 O 26

Resultater.

5 __

Behandling Extinktion (10 forsøg)_ __0__2__41 2 γ-endorohin (reference) „ . j 0,03 μg3 8,8 - 0,3^ 6,7 1 0,8 4,0 - 0,7 10 0,1 pg 9,3 - 0,3 5,5 - 0,6 2,3 - 0,4 0,3 pg 9,0 - 0,4 4,6 - 0,3 0,8 - 0,4

Saltvand 0,5 ml 9,4 ± 0,4 8,0 - 0,5 7,8 - 0,7 α-endorphin (reference) 0,3 pg 9,0 - 0,4 8,3 - 0,3 7,8 ± 0,3 15 Haloperidol (reference) 0,03 pg 9,3 - 0,3 6,5 - 0,7 4,0 - 0,6 0,1 pg 9,5 - 0,4 3,0 - 0,0 0,5 ± 0,4

Saltvand 0,5 ml 9,8 - 0,3 9,0 - 0,4 7,8 ί 0,5 20 [Des-Tyr^]γ-endorphin 0,01 pg 9,0 - 0,3 6,2 - 0,4 4,2 * 0,7 0,1 pg 8,8 ^ 0,4 2,8 - 1,0 1,2 ~ 0,5 0,3 pg 9,3 - 0,5 3,0 - 0,7 1,3 - 0,5

Saltvand 0,5 ml 9,7 - 0,4 9,7 - 0,4 8,7 - 0,6 25 15 [Des-Tyr ,Met(0)- γ-endorphin 0,003 μg 9,0 - 0,3 7,8 - 0,8 4,4 - 0,9 0,01 pg 9,4 - 0,3 4,8 - 0,7 1,4 - 0,7 30 timer efter injektion 2 ^ middel - S.E.

35 3 , 3 dosxs pr. rotte s.c.

27

14911A

Gribeprøve:

Til denne prøve blev anvendt rotter vejende 170 - 190 g.

Først blev rotternes forpoter forsigtigt anbragt på en stang med en diameter på 9 mm, som var anbragt vandret ca.

23 cm over burets gulv. Der blev målt tiden (i tiendedele sekund), hvori dyrene hang over gulvet. Prøven blev udført to gange i rækkefølge. Kun resultaterne fra den anden prøve blev anvendt.

Dyrene blev først prøvet uden behandling, og straks derefter fik de injiceret subkutant enten 10 eller 50 /ug af den pågældende forbindelse opløst i saltvand eller placebo. Prøven blev udført igen 30 og 120 minutter efter injektionen. Mellem prøverne opholdt dyrene sig i grupper på 5 dyr pr. bur i et lyddæmpet værelse.

(2) Aktivitetskode; + (mildt aktiv). Forskel mellem peptid og placebo >0,40 sek., men <0,70 sek.

++(aktiv). Forskel >0,70 sek.

Absolut forskel med placebo (sek.) -- . (2)

Administreret forbindelse 10 /ag 50 /ag Aktivitet (des-Tyr1)-Y^-endorphin 0,72 ++ (des-Tyr1, D-Lys^) -i'-en= doiphin 0,49 + (des-Tyr1, Glu11) - Y^-en= dorphin 0,55 + (des-Tyr1, Ala^)- V-en= dorphin 0,52 + (des-Tyr1, Leu5)-Y-en= dorphin 0,87 ++