FI61028C - Foerfarande foer framstaellning av ovulation framkallande nonapeptidamidderivat - Google Patents

Description

I.OM..I [,] (11)KUULUTUSJULKAI*U 61028

Wa lJ '' UTLAGGNINGSSKItIFT

C Patentti ny'inn-'tty 10 C5 19C2 ^ T ^ (51) K».lk?/lm.a.3 C 07 C IO5/52 SUOMI—FINLAND (21) Patenttihakemus — Patentane6knlng 28**7/7*+

(22) HakemltpUvi — Ameknlnpdag 30.09.7 U

(23) Alkupilvl —GUtlghetsdag 30.09-71* (41) Tullut Julkiseksi — Bllvlt offentllg 30.03-73

Pitmtti· j* rekisterihallitus .... ... , , .. .. .

• (44) Nlhtlvlkslpanon Ja kuuLJulkalsun pvm. — n

Patent· och reglsterstyrelsen ' Anrtkin utlagd och utl.»krlft*n publicurad 29 · 01.82 (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus—Begird prlerltet 29.09.73 08.03.7*+ Japani-Japan (JP) 109951/73, 27 *+*+2/7*+ (71) Takeda Chemical Industries, Ltd., 27, Doshomachi 2-chome, Higashi-ku,

Osaka, Japani-Japan(jP) (72) Masahiko Fujino, Hyogo, Tsunehiko Fukuda, Osaka, Susumu Shinagawa,

Osalta, Japani-Japan(jP) (7*+) Oy Borenius 8s Co Ab (5*+) Menetelmä ovulaatiota aiheuttavien nonapeptidiamidijohdannaisten valmistamiseksi - Förfarande för framställning av ovulation framkallande nona-peptidamidderivat Tämän keksinnön kohteena on menetelmä uusien nonapeptidiamidijohdannaisten valmistamiseksi, joilla on voimakas ovulaatiota aiheuttava vaikutus ja joita esittää kaava: (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-R1-R2-R3-Arg-Pro-NH-R4 (I) jossa R,j on Tyr tai Phe; R2 on D-Leu, D-Ile, D-Nle, D-Val, D-Nva, D-Abu, α-Aibu, D-Phe, D-Phg, D-Ser, D-Thr tai D-Met; R3 on Leu, Ile tai Nle ja R4 on 1...3 hiiliatomia sisältävä alkyyli tai 2-hydroksietyyli.

Tässä selityksessä ja vaatimuksissa aminohappoja ja peptidejä merkitään lyhennyksillä, joita yleisesti käytetään kysymyksessä olevalla alalla tai jotka ovat IUPAC-IUB:n biokemiallisen nimistökomitean hyväksymiä. Aminohappo on L-muodossa, jollei muuta ole mainittu.

Tässä käytetään esimerkiksi seuraavia lyhennyksiä:

Abu : a-aminovoihappo α-Aibu : a-aminoisovoihappo

Arg: arginiini 2 61028 BOC: t-butoksikarbonyyli

Bzl: bentsyyli DCC: N,N*-disykloheksyylikarbodi-imidi

Gly: glysiini

His: histidiini HONB: N-hydroksi-5-norborneeni-2,3-dikarboksi-imidi HOSu: N-hydroksisukkinimidi IBOC: isobornyylioksikarbonyyli lie: isoleusiini

Leu: leusiini

Nle: norleusiini

Nva: norvaliini

Met: metioniini OMe: metyyliesteri OBzl: bentsyyliesteri ONB: N-hydroksi-5-norborneeni-2,3-dikarboksi-imidiesteri OSu: N-hydroksisukkinimidiesteri

Phe: fenyylialaniini

Phg: a-fenyyliglysiini

Pro: proliini (Pyr)Glu: pyroglutamiinihappo

Ser: seriini

Thr: treoniini

ToS: Tosyyli

Trp: tryptofaani

Tyr: tyrosiini

Vai: väliini Z: bentsyylioksikarbonyyli

Edellä mainittu substituentti R^ , suora- tai haaraketjuinen, 1...3 hiiliatomia sisältävä alkyyliryhmä,voi olla esimerkiksi metyyli, etyyli, n-propyyli tai i-propyyli.

Jo useita vuosia on tiedetty, että hypothalamus (alanäkökukkula) käsittää tekijöitä, jotka korkeammalla tasolla säätävät trooppisten hormonien eritystä aivolisäkkeestä. Sen jälkeen, kun tyrotropiinia vapauttava hormoni (THR) on eristetty, on hiljattain uutettu sioista ja lampaista puhtaana hormoni, joka edistää keltarauhashormonin eritystä, sekä osoitettu sen olevan dekapeptidi, jonka rakenne on: (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-N^. (A.V. Schally et ai, Biochem.

3 61028 L.l

Biophys. Res. Commun., 4_3, 1334 (1971): R. Guillemin et al, Pro.Nat. Acad. Sci., USA, 6£, 278 (1972)). Tätä havaintoa on seurannut useiden samankaltaisten peptidien synteesi, ja näillä analogisilla peptideillä on myös tehty biologisia kokeita. Pienikin muunnos edellä mainitun aminohapon koostumuksessa alentaa kuitenkin huomattavasti peptidin fysiologista vaikutusta, ja edellä mainittu kemiallinen rakenne on havaittu välttämättömäksi parhaan mahdollisen fysiologisen vaikutuksen saamiseksi. (A.V. Schally et ai, Biochem. Biophys. Res. Commun., 4^ 366 (1972)).

On myös onnistutttu syntetisoimaan eräänlaisia nonapeptidiamidijohdannaisia, joiden aktiviteetti kuitenkaan ei ole suurempi kuin noin 5 kertaa luonnollisesti esiintyvien LA-RH (keltarauhashormonia vapauttavien hormonien) aktiviteetti (M. Fujino et ai. Biochem. Biophys. Res.

Commun., Voi. 49 (3) 863...869 (1972)).

Asiantilan ollessa sanotunlainen keksijöiden on onnistunut syntetisoida nonapeptidiamidijohdannaisia (I), ja he ovat yllättäen havainneet, että näillä yhdisteillä on tehokkaampi ovulaatiota aikaansaava vaikutus kuin luonnossa esiintyvällä dekapeptidillä. Keksijät ovat myös havainneet, että nämä yhdisteet vaikuttavat aivolisäkkeeseen sekä keltarauhashormonin että munarakkulahormonin eritystä edistävästi. Keksijät ovat edelleen havainneet, että mainitut yhdisteet eivät ole käyttökelpoisia ainoastaan ihmisten lääkkeinä, esim. lääkeaineena aivolisäkkeen toimintahäiriössä tai gonadotropiinin puutoksessa ja amenorrhean hoidossa, vaan myös eläinlääketieteessä, erikoisesti eläinten jalostuksessa. Esillä oleva keksintö on sanottujen yllättävien havaintojen tuloksena.

Tämän keksinnön tarkoituksena on siten aikaansaada menetelmä nonapeptidiamidi johdannaisten (I) valmistamiseksi.

Muita tämän keksinnön avulla saavutettavia etuja selvitetään myöhemmin tässä patenttiselityksessä.

Nonapeptidiamidijohdannainen (I) valmistetaan menetelmällä, jolle on tunnusomaista, että reagenssi (A), jona on L-pyroglutamiinihappotähde tai peptiditähde, jossa on L-pyroglutamiinihappoyksikkö N-pääteamino-happona, ja joka siitä eteenpäin käsittää edellä sanotun aminohappo-ketjun, kondensoidaan reagenssin (B) kanssa, jona on amiinikomponentti, joka vastaa edellä sanotun nonapeptidiamidijohdannaisen (I) muuta osaa, jolloin reagenssit (A) ja (B) voidaan haluttaessa suojata ja suojaryh-mä(t) lopuksi poistaa, silloin kun niitä on.

4 61028

Raaganaai (A) on oil· L-pyroglutaniiniheppo tai paptidikatjun oaa, jaaaa on ^pyroglutamiinihappoykaikkö N-päätteeaaään ja joka aaaanaikaiaaati kärsittää kaaran (i) ·eittämän aminohappoaarjän, knn taaa reaganaain (A) kana-aa kondanaoitara raaganaai (B)on andinikorponentti,joka raataa nonapaptidi-aaidijohdannaiaan (i) muuta osaa,jolloin raaganaait (A) ja (b) orat ralin-naiaaati anojättäjä·

Saaraarasaa taulakoaaa 1 on aeitatty raagenaain (a) ja raaganaain (B) peru ajhdi a teiniä.

Taulmkka 1 ^^naaganaai

Ihdiatel^\ (A) (B) nä \ 1 (Pyr)Glu-OH H-Hi a-Irp-Ser^.-B.-Eg-Arf-Pr·- nh-e4 2 (Pyr)Gl*-Hie~OH B-Trp-Se^-Bj-J^-Bg-Arg-Pra-inM^ 8 (Pyr)Glu-Hi a-Trp-OH H-Sar-^-Bg-Rg-Arg-Pro-NH^ 4 (Pyr)Gln-Hi a-Trp-Se**-OH| H-Bj—Rj—Bj—Arg-Pro»NH-R4 5 (Pyr)Gl*-Hia-Trp-Sar-

Rj-OH H-B2-B8-Arg-Pro-NH-B4 6 (Pyr)Glu-Hia-Trp-8ar- R1-R2-0H H-R8-Arg-Pra-liH-B4 7 (Pyr)Glu-Hia-Trp-Sar-

Rj-Bg-Rg-OH H-Arg-Pro-Nfl-B4 8 (Pyr)Glu-Hia-TBp-Sar- H-Pro-NH-B4

Bj-Rg-RgArg-OH_____ 9 (Pyr)Glu-Hi a-Trp-Sar- NH2~B4

Bj—Bg-Rg-Arg-Pro-OH ________

Innaatään ti·datään nyös, että ylalakaaran (il) «ukainan fe-glutanyyliryhaä b6«o-ch2«h2ch(nh2)co- (11) (joaaa Bg on alkokairyhnä (aaia· netokai, atokai» n-propokai, i-prapokai, * 61028 a-butoksi jne·), aralkyyliokairyhmä (esi·· bentayylioksi jne.) tai amino) on helposti nuutettavisaa itse L-pyroglutanyyliryhmäksi:

H

O CO- saattanen s se kosketukseen emäksen kanssa (e ei·· annon!akin jne·) tai hapen kanssa (esi·· etikkahapon jne·) ja että ryhsiä (il) on ekvivalentti L-pyroglntaByyliryhnän itsensä kanssa tässä tapauksessa· Tämän keksinnön äkäisessä Menetelmässä on järjestettävä siten, että reagenaain («A) lr-pyro-glutanyyli (te. (Pyr)Gl*») ei sisällä ainoastaan itseään L-glutamyyliryb-mää Taan myös kaaran (li) esittämän suojatun Ir-glutamyyliryhmän. Tapauksensa, jossa reagenssia (i) (Pyr)Glu- esittää ryhmä (il), tänä ryhmä (li) on helposti muutettavissa itse L~pyroglutamyyliryhmäkei sinänsä tunnetuilla tavoilla» Tämän keksinnön mukainen kondensaatioreaktio voidaan suorittaa kondensoi-mistaToilla, jotka ovat tunnettuja peptidi sidosten muodostamisesta· Tällaisia kondenaaatiomenatelmiä ovet DCC/HONB-menetelmä (Belgialainen patent·· ti No. 796 399), ataidinenetelnä, kloridineneteinä, happoanhydridimenetel— mä, seeahappoanhydridinenetelnä, DCC-meneteinä, aktiivisen esterin menetel-ä, Woodeardin reagenssi K-meneteinä, karbodi-imidetsolinenetelnä, hapetus-pelkisty snene teinä sekä muut nahdolliset nenetelnät (The Peptides, Vei, 1 (I960), Schröder and Lubke, icademic Press, New York, U»S«i·)

Innan kaudensaatioreaktiota voidaan suojata kerboksyyli- ja amineryhmät, jotka eivät tule osallistumaan tarkoitettuun reaktioon, tai aktivoida karta ok syy li- ja/tai aninoryhnät, jotka ovat osailiaina reaktiosaa, sinänsä tunnetuilla taveilla. Lähtöaineen karboksyyliryhnätvoidaan suojata metallisuo-lojen nuodossa (esi·· natrium- tai kaliunsuolojen) tai estereinä (esim. etyyli-, etyyli-, beatsyyli-, p-nitrobenteyyli-, t-butyyli- tai t-anyyli-estereinä).

Lähtöaineiden anineryhnien auojaryhmä voi olla jokin tavanomainen suoja-ryhmä aninoryhaillä peptidisynteesiaaä, esi·· bentsyyliokaikarbonyyli, tabu teksikarbonyy li, isebornyylioksikarbonyyli jne. Seriinin hydroksyyliryh-ä voidaan suojata tavanomaisella auofaryhmällä, kuten bentsyylillä, tf»bm- β 61028 tyylillä ja «millä eattariä muodoatarilla ryhmillä. Tyroaiinin hydrokayy-liryhmä vaidaan auojata bantayyIillä, t-butyylillä ja muilla eattariä muo-doatari11a ryhmillä) arfiuiiuin guanidinoryhmä roidäan auojata sellaiailla ryhmillä kuin nitra, toayyli, karbobentsoksi, iaobornyyliekaikarbonyyli tai adamantyyliakaikarbonyyli· Saimerkkeinä lähtäainaidan aktiroiduiata karbek-yyliryhmiatä raidäan mainita raataarat happoanhydridi, ataidi, aktiiriaat aatarit (eaterit alkohelien kanaaa (aaim* pentaklooriianoli, 2,4,5-trikloo-rifaneli, 2,4-dinitrofanoli, ayaanomatyylialkoholi, p-nitrofonoli, N-hyd-roksi-5-norboraeeni-2,3-dikarbokai-imidi, N-hydrokaiaukkinimidi, N-hydrok-aiftaali-imidi tai Jt-hydrokaibontatriataali)) jaa· Lähtäainaidan aktiroltuna aninoryhmänä roi olla eaimerkikai raataara ioaforihappoamidi·

Seuraara taulukka aaoittaa eräitä eaimerkkejä aineiden (i) ga (B) karbok-ayyli- ja aminoryhnien tällaiatan muotojen yhdiatelmiatä·

Taulukka 2

Tyypilliaiä ______________________________________________________ yhdiatalmiä _(A) | (B) COOH NHg COOH NH^ 1 rapaa auojattu anojatta rapaa -—.......r--- 2 aktiroitu auajattu rapaa rapaai 8 ; rapaa auojattu j auojattu aktiroit^ (Huomautua) Merkillä z oaoitatuaaa tapaukaaaaa raaktiaaakaaaaa on edulli— saati läsnä redsnpoistoainetta (esim· karbodi-imidi—rengeassia kuten diayklehekayylikarbodi-inidiä)· Tämän kaksinnän auaritus käytännöasä roidaan oaittää aauraaraati: 61028 7 g * l β Ό •rt ·· ft* α * «· m rt® Η β

h PK

S § «ί • § g 3

I «H

•H O * : s !s w 8 a d * · O O —< βΛ rt» rt* · d +» rrt

•H fl*-N d rt» rH

β ·»* M K O

M· ft*-* :« >-» K ► M :« ή o «<-» ·

Td· · · · PQ :· · *· d rt» drt*d g B · a o « * m - 1 J3 i—i I m ·** ««h 6 K*h m »4 «n ki he g «rt» w « ft · Μ I ·· !· rt* I *-» d O d rt» M1 O · M· ee fi· o · h -h d ¢5 V · rt» ft5

©Md:· £ ·· 1 · I

*-«··-* i · λ a rtrt-edg 1 N « Wrt* g o · rt* g CO Oh } ft ► M | OS v a —'· OM O loo

I -7 I -HO h d O rt» M

ei «e rt» i» ft* :· a rt» ft«

M M · *d | IA· I

7 T «K ei W J3 « · M

ei <m · M O h M· i a e 7 * - «o h h < • J-ι | « rtrt o* | Ό \ «ο ->-»«· eo du a o m rt» a op I p m m i M a «* m U M O* a a 7 7 f Ϊ ^ · · • · to a β „ -* 1 i S ί ^ _____\ i__n g* O rt? ► ' (H / 6-1

Mw··* I I

· rt* · · Λ d :· O M d rtrt rtrt

►••Hdrt5«i-H H H

rt ««0h I I

• o K ·** ft o 0 0 ·»» w kt O rt» ^rt rrt 0 «Adv p o d o <-» · · ^ ^ rtrtodd· s* u 1 ·*» g a -h · K jk •h · ^ · I <» k a ft* a « ® i λ +» ή w w

1 «g FrtKKO H

2 s a <9 h ►*£ *s βο ON. £ -nad h d P · o rt» 1 o ♦ op n d«<d« ^ jm o i · m a ϊ a v a V a

£—> £->£ -J

i i i

•H Ή «M

«a a i l 1

H H H

O φ o 111 8 61 028 Tämä reaktio voidaan suorittaa liuotinta käyttäen. Liuotin voi olia tavallinen peptidin kondensaatioreaktioissa käytetty. Esimerkkeinä voidaan mainita vedetön tai vesipitoinen dimetyyliformamidi, dimetyyi£_ sulfoksidi, pyridiini, kloroformi, dioksaani, dikloorimetaani, tetra-hydrofuraani ja sopivat tällaisten liuottimien seokset.

Reaktiolämpötilaksi valitaan lämpötila, joka on käyttökelpoinen pepti-disidosten muodostamiseen johtavissa reaktioissa, ts. normaalisti alueella noin -20 °C - noin 30 °C. Tämän keksinnön mukaisesti valmistettavaksi tarkoitettujen yhdisteiden esivalmisteita (suojattuja pepti<ie_ jä) voidaan myös valmistaa helposti synteettisillä menetelmillä kiinteässä faasissa.

Kun tarkoitettu kondensaatioreaktio on tapahtunut täydellisesti, voidaan, mikäli tuotteessa on suojaryhmiä, nämä poistaa tavallisilla menetelmillä. Tällaisia ovat katalyyttinen pelkistys katalysaattorin läsnäollessa, joka voi olla esim. tri fluorietikkahapon tai muun sellaisen avulla sekä pelkistys metallisen natriumin avulla nestemäisessä ammoniakissa.

Näin valmistettu peptidi (i) voidaan ottaa talteen reaktioseoksesta menetelmillä, jotka ovat tunnettuja peptidien talteenotossa, esim. uuttamalla, jakotislauksella, pylväskromatografialla jne.

Peptidi (I) voidaan myös ottaa talteen suolan tai metallikompleksi-yhdisteen muodossa.

Hapoista, jotka voivat muodostaa suoloja peptidin (i) kanssa, voidaan mainita epäorgaanisia happoja, kuten suolahappo, bromivetyhappo, per-kloorihappo, typpihappo, tiosyaanihappo, rikkihappo, fosforihappo, jne., sekä orgaanisia happoja, kuten muurahaishappo, etikkahappo, propioni-happo, glykolihappo, maitohappo, pyruviinihappo, oksaalihappo, maloni-happo, meripihkahappo, maleiinihappo, fumaarihappo, antranyylihappo, kanelihappo, naftaleenisulfonihappo ja sulfanyylihappo.

Tämän keksinnön mukaisilla polypeptideillä (i) on LH-RH-(keltarauhashormonia vapauttava hormoni) vaikutus ja siten ne pystyvät edistämään LH:n (keltarauhashormonin) sekä FSH:n (munarakkulahormonin) eritystä. Tästä syystä polypeptidit (I) ovat käyttökelpoisia lääkkeinä ovulaa- 9 61028 tion edistämiseen naisilla ja eri eläimillä (esim. rotilla, lampailla, sioilla, lehmillä, tammoilla, viiriäisillä ja kanoilla). Peptidejä voidaan myös käyttää muihin farmaseuttisiin tarkoituksiin, joihin on käytetty tavallisia LH-RH-, LH- ja FSH-valmisteita.

Koska polypeptidien (i) LH-RH-vaikutus on noin 5-60 kertainen luonnossa esiintyvään LH-RH:hon verrattuna, niiden annostus voidaan määrätä kulloinkin ottaen huomioon sanottu monikertaisuus, samalla kun muut tekijät (esim. annostuksen kohde tai taudin laatu) otetaan myös huomioon. Sopiva annostus voi olla esimerkiksi suuruusluokkaa noin 2 ng - 2 yug päivittäin kehonpainon kiloa kohti.

Polypeptidejä (i) annetaan ensisijaisesti muulla tavoin kuin suun kautta (esim. ruiskeena tai peräsuoleen tai emättimeen), vaikkakin eräissä tapauksissa niitä annetaan myös suun kautta.

Käytettävät annostusmuodot voivat olla esimerkiksi ruiskeet, peräpuikot, pessaarit ja jauheet. Ruiskeita voidaan valmistaa liuottamalla noin 10 - 100 γ polypeptidiä (i) 1 ml:aan fysiologista keittosuolaliuosta. Polypeptideistä (I) voidaan valmistaa myös lyofiloituja ampulli-tuotteita mannitolin avulla, jota lisätään täyteaineeksi, niin että tuotetta voidaan antaa ruiskeena valmistelemattomaan käyttöön.

Taulukossa 3 on esitetty keksinnön mukaisesti valmistettujen uusien nonapeptidiamidijohdannaisten ovulaatiota edistävä vaikutus luonnossa esiintyvään LH-RH:hon verrattuna. Vaikutus on määritetty menetelmällä, joka on selitetty julkaisussa J. Med. Chem. 16, llUU (1973).

ίο 610 2 8

Taulukko 3 (PyrjGlu-His-Trp-Ser-I^-Rg-Rj-Arg-Pro-NH-R^

Substituoitu tähde Ovulaatiota edis- R R_ R. R, tivä vaikutus (%) _1_L___2-Λ__(LH-RH 100)_

Tyr D-Abu Leu etyyli 6520

Tyr D-Nva Leu etyyli 5810

Tyr D-Leu Leu etyyli 8270

Tyr D-Leu Leu metyyli 1525

Tyr D-Leu Leu ProPyyli 361+1+

Phe D-Leu Leu etyyli 1+580

Tyr D-Leu Leu isopropyyli 2756

Tyr D-Thr Leu etyyli 1+135

Phe D-Phe Leu etyyli 51+00

Tyr D-Ser Leu etyyli 6lU0

Tyr D-Val Leu etyyli 3525

Tyr D-Ser Nle etyyli 2760

Tyr D-Leu Ile etyyli 1+250

Nva s norvaliini, Nle = norleusiini, Abu * aminovoihappo Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä lähtöaineena käyttökelpoisia peptidejä voidaan valmistaa joko tunnetuilla peptidisynteesi-menetel-millä tai käyttämällä muita sopivaksi havaittuja menetelmiä.

Seuraavat esimerkit on tarkoitettu keksinnön edelleen selventämiseksi.

Esimerkeissä seuraavat lyhenteet tarkoittavat ohutkerroskromatografian Rf-arvoa piigeelillä seuraavia liuotinsysteemejä käyttäen:

Rf : kloroformi - metanoli - etikkahappo, 9:1:0,5 2

Rf : etyyliasetaatti - pyridiini - etikkahappo - vesi, 30:10:3:5 3

Rf : n-butanoli - etyyliasetaatti - etikkahappo - vesi, 1:1:1:1 11 61028

Esimerkeissä käytetyt rekisteröidyt tavaranimet orat seuraavat:

Biegel P-2: geeliauodatuamatdriaaleja, Taimistaja BIO-RAD, U,S*A.

Sephadex LH-20: esteröity dekstraanigeeli, valmistaja Pharmacia Fine Chemicals, Ruotsi imberlite XAD-2: polystyreenihartsi imberlite IR-45: heikosti emäksinen anioninvaihtohartsi imberlite ULA-410: voimakkaasti emäksinen anioninvaihtohartsi Imberlite CG—410: voimakkaasti emäksinen anioninvaihtohartsi imberlite CG—45: heikosti emäksinen anioninvaihtohartsi

Kaikkien näiden hartsien valmistaja on Bohm and Haas Co·, Ltd·, U*S*i.

Esimerkki 1 (Pyr) Glu-Hi s-Trp-Ser-Tyr-D-Leu—Leu-Arg-Pro-NH-CI^CH^:n valmistus a) Z—D-Leu-Leu-Arg(N02)-Pro-NH—CHg—CH3:n valmistus 50 ml:aan dikloorimetaania liuotetaan 1,58 g Z-D-Leu-OH:· (öljy) ja 1,2 g HONBia, minkä jälkeen lisätään 2,8 g H-Leu-Arg(N00)-Pro-NH-CHe-CH_:a· Seos jäähdytetään 0°C:een sekä, kun on lisätty 1,4 g DCC:a, seosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa 8 tunnin ajan· Sivutuotteena tuleva disykloheksyyli-urea poistetaan suodattamalla ja suodoa väkevöidään kuiviin alennetussa paineessa· Jäännös liuotetaan 150 ml:aan etyyliasetaattia, peatään 4—prosenttisella natriumvetykarbonaatin vesiliuoksella kahdesti sekä vedellä kahde»-ti, kuivataan natriumsulfaatin yläpuolella sekä väkevöidään lopuksi kuiviin alennetussa paineessa. Jäännös seostetaan uudelleen etyyliasetaatti-bentsee-nistä· Selostetulla menetelmällä saadaan 3,6 g tarkoitettua tuotetta. Sulamispiste 134 °C (hajoaa)· -47,3° (e-0,54 metanoliasa)j Β^-Ο,δΤ.

Alkuaineanalyysi C^H^OgNg laskettu C, 56,31) H, 7,59; N, 17,91 saatu C, 56,08) H, 7,82) N, 17,69 (b) (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3:n valmi etua 30 ml:aan 25-proaenttista bromivety-jääetikkaa liuotetaan 3,6 g Z-D-Leu-Leu-^rg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3ia ja liuosta pyöritetään huoneen lämpötilassa 50 minuutin ajan. Liuokseen lisätään 300 ml eetteriä ja saatu saostuma otetaan talteen suodattamalla. Kuivaamisen jälkeen saostuma liuotetaan 50 ml:aan vettä ja saatetaan kulkemaan pylvään (2,5 x 20 cm) läpi, joka sisältää Imberlite CG-410:a (vapaa emäs)· Pylväs pestään hyvin 30-presenttisella me- 12 61 028 tanolin vesiliuoksella. Liuos ja pesunesteet yhdistetään ja väkevöidään alennetussa paineessa metanolin poistamiseksi, minkä jälkeen lyofiloidaan. Selostetulla menetelmällä sasdaan Tapsana emäksenä 3,1 g H—I^-Leu-Lei^*.Arg(NOg)-Pro-NH-CHg-CHj:a· 2 3

Rf “0,24$ Rf >4),68. 4 mltaan dimetyyliiormamidia liuotetaan 228 mg edellä-saatua tuotetta ja 290 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH:a, minkä jälkeen lisätään 144 mg HONBsa. Seos jäähdytetään-40 °C:een ja lisätään 90 mg DCCia·

Seosta sekoitetaan -10°C:ssa 2 tuntia, 0°Ctssa 4 tuntia ja huoneen lämpötilassa 4 tuntia. Reaktioseoa suodatetaan disykloheksyyliurean poistamiseksi.

Sun suodokseen on lisätty etyyliasetaattia, saatu saostuma otetaan talteen suodattamalla. Saostuma kuivataan ja liuotetaan 20 -prosenttiseen etanolin vesiliuokseen. Liuos johdetaan Anberlite XAD-2~(200 meoh, 3 z 20 em) pylvään läpi ja asteittainen eluutio suoritetaan 20-prosenttiaella etanolilla ja absoluuttisella etanolilla (300 ml kumpaakin)·

Haluttu tuote saadaan 260 ml - 360 ml:n fraktioina. Nämä fraktiot väkevöi— dään alennetussa paineessa ja lyofiloidaan. Menetelmällä saadaan 346 mg haluttua tuotetta.

fcj*5 -38.28°(c«0,1 0,6 $ metanoliasa)$ RfS-0,235, Rf3«0,765 (c) (Pyr)Glu-Him-Trp-Ser-Tyr—D-Leu-Leu-drg-Pro-NR-CHg-CHgin valmi etua 20 ml:aan 60-prosenttistä muurahaishappoa liuotetaan 300 mg NOg-yhdistettä, joka on saatu kohdassa (h), minkä jälkeen lisätään 600 mg SnClg.HgO:ta.

Seosta pidetään 80 - 85 °C:ssa 2 tuntia, minkä jälkeen se väkovöidään kuiviin alennetussa paineessa. Jäännös uutetaan 50 ml:11a lämmintä vettä (80°C)· Uute suodatetaan ja auodos johdetaan imberlite XiI^-2- (200 me sh) pylvään (3x20 cm) läpi. Kun on pesty vedellä, suoritetaan asteittainen eluutio vedellä ja absoluuttisella etanolilla (400 ml kumpaakin). Haluttu tuote saadaan 150 ml — 260 ml:n fraktioissa. Nämä fraktiot yhdistetään ja väkevöidään alennetussa paineessa etanolin poiatomi seksi. Väkevä liuos johdetaan karbok-simetyyliselluloosapylvääseen (2 z 33 cm) ja asteittainen eluutio suoritetaan 0,005M - 0,2M ammoniumssetaati11a (pH 6,8). Haluttu peptidi saadaan 330 ml - 520 ml:n fraktioissa. Nämä reaktiot yhdistetään ja lyofiloidaan, jolloin saadaan 282 mg valkeaa kuohkeaa jauhetta.

-32.66° (c«0,545 5 Jf etikkahapon vesiliuoksessa); Bf2-0,10, 3

Rf “ 0,75 « 61028 ininohappotnalyyii (hydrolyyai 6N BCl:llaf kun läsnä on tioglykolihappoa): Hie 1,00$ Arg 0,96$ Trp 0,96} Sor 1,00$ Gin 1,00$ Pro 1,04$ Lou 2,00$

Tyr 1,00.

Esimerkki 2 (Pyr)Glu-Hia-Trp-Sor-Tyr-t?^ -Aibu-Leu-Arg-Pro-NH-CHg-CHg:n valmi atua a) Z-o(-Aibu-Leu-Arg(N02)~Pro-NH-0H -CH^rn Taimiatua 7 ml:aan dimetyyliformamidia liuotetaan 0,6 g Z-°( -Aibu-0H:ta ja 0,9 g H-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CHg-CHg:a. Liuoa jäähdytetään 0°C:een ja lisätään 0,71 g l-etyyli-3-(3-dimetyyliaminopropyyli)-karbodi-imidiä, resiliukoista karbodiimidiä, minkä jälkeen sekoitetaan 12 tuntia. Liuotin tislataan pois ja jäännös liuotetaan 100 mitään kloroformia. Liuos pestään 4-prosenttisella natriumretykarbonaatilla ja IN suolahapolla, huuhdotaan vodollä ja kuivataan magnesiumsulfaatin yläpuolella. Liuotin tislataan pois alennetussa paineessa ja jäännöstä käsitellään eetterillä, jolloin saadaan jauhetta, joka otetaan talteen suodattamalla.

Jauhe seostetaan uudelleen etyyliasetaatti-eetteristä, jolloin saadaan 473 mg haluttua yhdistettä. Sulamispiste: 104 - 107 °C.

^o<7p4 -46.8° (e-0,55 DMF). »f1-0,50

Alkuaine analyysi CgjH^OgN^OöHgO

laskettu C, 54.28$ H, 7.50$ N, 18.38 saatu C, 54.32$ H, 7.32; N, 17.97 b) BOC-Tyr(B*l)-o<-Aibu-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3:n Talmistus 3 ml:aan 25-prosenttistä bromivety-jääetikkaa liuotetaan 423 mg Z- o( -Aibu-Leu-Arg(N02)-Pro-NH—CH2—GH^:a ja seosta raTiotetaan huoneen lämpötilassa 40 minuutin ajan, minkä jälkeen lisätään 50 ml kuivaa eetteriä.

Syntynyt saostuma otetaan talteen suodattamalla ja kuivakan alennetussa paineessa natriumhydroksidin yläpuolella ekaikkaattoriasa. Saatu jauhe liuotetaan 8 ml:aan DUFil ja liuos neutraloidaan 0,24 ml:lla N-etyylimorfoliinia sekä jäähdytetään 0°C:een. Sitten liuokseen lisätään 557 mg BOC—Tyr(Bsl)-0H:a ja 298 mg H0NB:a, minkä jälkeen lisätään 280 mg DCC:a. Seosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa 6 päivän ajan. Disykloheksyyliurea poistetaan suodattamalla ja DVF tislataan pois alennetussa paineessa. Jäännös liuotetaan 100 ml: 1* 61028 san kloroformia, pestään IN suolahapolla ja 4-prosenttiaella natriumvety-karbonaatilla, huuhdellaan vedellä ja kuivataan magnesiumsulfaatin yläpuolella, minkä jälkeen väkevöidään kuiviin alennetussa paineessa. Jäännöa kiteytetään etyyliasetaatista. Saalis 276 mg; sulamispiste: 127-12Θ °C· /kjl* -27.6°(c-0,54 DMF: ssa), Β^-Ο,βΟ

Alkuaineanalyysi, C^H^O^N^.HgO

laskettu C, 57.82; H, 7.61} N, 15.32 saatu C, 58.32} H, 7.61; N, 15.10 c) BOC-Ser—Tyr(B*l)-o^ -Aibu-Leu—Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CHg:n valmistus 3 ml:aan trifluorietikkahappoa, joka sisältää 0,1 ml anisolia, liuotetaan 250 mg B0C-Tyr(Bcl)-o( -Aibu-Leu?-Arg(N02)-Pro-NH-CB^-CHg: a ja liuosta ravistetaan huoneen lämpötilassa 30 minuutin ajan. Siihen lisätään 30 ml kuivaa eetteriä ja syntynyt saostuma otetaan talteen suodattamalla ja kuivaamalla.

y

Saatu jauhe liuotetaan 5 oil;aan DMF ja ja liuos neutraloidaan 0,08 niillä N-etyylimorfoliinia. Sitten lisätään 150 mg BOC—Ser-trikloorifenyyliesteri-ä ja liuosta sekoitetaan 2 päivän ajan· DMF tislataan pois ja jäännöstä käsitellään eetterillä, jolloin muodostuu jauhetta. Jauhe otetaan talteen suodattamalla ja seostetaan kahdesti uudelleen etyyliasetaatista. Saalia 100 mg; sulamispiste: 140-142 °C (hajoaa); -34.8°(c-0,44 DMF: ssa), Bf1;0,74

Alkuaineanalyysi, C^H^gOj.SHgO

laskettu C, 54.43; H, 7.58; N, 14,84 saatu C, 54.66; H, 7.45; N, 14.01 d) (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr--Aibu-Leu-Arg-Pro-NH-CHg-CHgjn valmistus 3 mljaan trifluorietikkahappoa, joka sisältää 0,1 ml anisolia, liuotetaan 77 mg B0C-SermTyr4Bsl)-o< -Aibu-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3:a ja liuosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa 30 minuutin ajan. Siihen lisätään 30 ml kuivas eetteriä, ja syntynyt saostuma otetaan talteen suodattamalla ja kuivaamalla Saatu jauhe liuotetaan 3 ml:aan DMF:a ja liuos neutraloidaan 0,21 ml:lla 10-prosenttistä N-etyylimorfoliinin DMF-liuoata· Siihen lisätään 37 mg (Pyr)Glu-Hiβ-Trp-OH-kiteitä, ja seos jäähdytetään -10 °C:een, minkä jälkeen lisätään 21 mg HONBia ja 30 mg DCC:a. Sekoitetaan 0°C:asa 12 tuntia· Diaykloheksyyliurea suodatetaan pois ja suodos väkevöidään kuiviin alenne- 15 61 0 2 8 tasaa paineesta. Jäännös linotetaan 20-prosenttiseen etanoliin ja annetaan adsorboitua Amberlite XAD-2-pylvääaeen (1 x 10 en), Eluutio suoritetaan ao-teittaisesti käyttäen 20-prosentti sesta absoluuttiseen etanoliin (200 ·1 kutakin). Tarkoitettua yhdistettä runsaasti sisältävät fraktiot, jotka vahtaavat etanolin väkevyysaluotta 40-prosentti sesta 70-prosentti seen, yhdistetään, väkeväidään alennetussa paineessa ja lyofiloidaan. Kuvatulla menetel- o ällä saadaan 30 mg suojattua nonapeptidiä (Rf -0,31). Samalla kun lisätään 0,1 ml anisolia ja 0,1 ml merkaptoetanolia, tätä suojattua nonapeptidiä käsitellään 3 milliä vedetöntä fluorivetyä ja seosta sekoitetaan O °C:ssa 60 minuutin ajan· Fluerivety tislataan pois alennetussa paineessa ja jäännös liuotetaan 10 niiaan vettä. Liuos uutetaan kolmasti 2 ml:11a eetteriä ja veaikerrokeet yhdistetään ja johdetaan Amberlite CG-410- (aeetaattimuoto) pylvääseen (2x4 cm) ja pestään vedellä. Liuotin- ja vesipesuliuokaet yhdistetään ja johdetaan karboksimetyyliselluloosa-pylvääseen sekä Amberlite XAl^*2-pylvääseen samoin kuin esimerkissä 1,

Lyofiloinnin jälkeen saadaan 14 mg valkeaa, kuohkeaa jauhetta, 54,1° (c-0,31 5 % etikkahapon vesiliudnessa): Bf2-0«099; Rf3-0,715 iminohappoanalyysi (hydrolyysi 6N HClin kanssa, kun läsnä on tioglykolihap-poa): Hio 0,94) Arg 0,97; Trp 0,81; Ser 1,06; Glu 0,97; Pro 0,97; Leu 1,03; Tyr 1,03; o' -Aibu 1,00

Esimerkki 3 (Pyr)Glu-His-Trp—Ser-Phe—D-Leu-Leu-Arg—Pro-NH-CH —CH :n valmistua 2 3 a) (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe—OH:n valmistus 100 ml taan metanolia liuotetaan 4,0 g Z-Ser—Phe—Olle i a ja pelkistetään ilmakehän paineessa, käyttäen 500 mg palladiummuataa katalysaattorina, 1,5 tunnin aikana. Katalysaattori poistetaan suodattamalla ja metanoli tislataan heti poia alennetussa paineessa. Jäännös liuotetaan 25 ml saan DMF;a ja lisätään (Pyr)Glu-Hih-Trp-OE-kiteitä. Seos jäähdytetään —5 °Cieen, minkä jälkeen lisätään 3,8 g HONBjia ja 3 g DCC:a, Seosta sekoitetaan —5 °C:sas 2 tuntia, o 0 C:ssa 2 tuntia ja lopuksi huoneen lämpötilassa 8 tuntia. Sivutuotteena syntyvä disykloheksyyliurea poistetaan suodattamalla ja suodos väkevöidään kuiviin alennetussa paineessa. Jäännöstä käsitellään etyyliasetaatilla ja saatu jauhe otetaan talteen suodattamalla (6,7 g). Tämä jauhe liuotetaan 30 ml:aan 15-prosenttista metauoli-kloroformia ja liuos johdetaan piigeeli— pylvääseen (6 x 12 cm), joka on käsitelty 15-prosentti seila metanoli-kioro-forsilla.

16 61 028

Elnutio suoritetaan käyttäen 600 ·1 15-prosenttiata metanoli-kloroformia, 1 litra 25-pr o senttistä netanoli-klorof omia ja 1 litra 30-prosenttista me-taneli-kloroforsia· Fraktiot Talilla 400 ml 25-prosenttista metanoli-kloro-formia ja 700 ml 30-prosenttiata metanoli—kloriformia yhdistetään ja väke-Töidään kuiriin alennetussa paineessa. Jäännöstä käsitellään etyyliasetaatilla ja saatu jauhe otetaan talteen suodattamalla· Menetelmällä saadaan 4,2 g haluttua yhdistettä·

Bf2«0,29.

20 ml:aan metanolia snapendoidaan 3,5 g tätä metyyliä»teriä ja lisätään 0°C:ssä Θ ml IN natriumhydroksidia· Seosta sekoitetaan 1 tunnin ajan, minkä jälkeen se neutraloidaan 8 ml:11a IN suolahappoa· Metanoli tislataan pois alennetussa paineessa ja lisätään 20 ml kylmää rettä· Syntynyt saostuma otetaan talteen suodattamalla, pestään kylmällä vedellä ja sitten etanoli-eet-terillä (4:6) sokä kuivataan· Menetelmällä saadaan 2,32 g haluttua yhdistettä, -3,3° (c-e,55 jääetikasaa)$ Bf3*0,61 b) (Pyr)Glu-Hia~Trp— Ser-Phe—I>-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-d^-CH^:n valmistus 4 ml:aan DMFia liuotetaan 290 mg (Pyr)Glup-His-Trp-Ser-Phe-OH:a ja 228 mg H-D-Leu^Leu-4rg(N02)-Pro-NH-GH2-CH3:a, minkä jälkeen lisätään 140 mg DCC:a, Seos jäähdytetään -10°C:een, minkä jälkeen lisätään 90 mg DCC:a· Sekoitetaan p p -10 Cl osa 2 tuntia, 0 C:ssa 3 tuntia ja lopuksi huoneen lämpötilassa 6 tuntia· iivan samalla tavalla kuin esimerkissä 1 tämä reaktio seos käsitellään pyl-väskromatografiällä imberlite X4D~2:lla· Selostetulla menetelmällä saadaan 342 mg haluttua yhdistettä· [cxj™ —41*74* (c-0,115 metanoli»aa)j Bf2-0.265, Βί3*0·78.

20 ml:aan 60—prosenttista muurahaishapon vesiliuosta liuotetaan 300 mg edellä selostettua tuotetta, minkä jälkeen lisätään 600 mg SnCl2»H20:a. Seoksen annetaan seistä 80—85 °C:ssa 2 tuntia, minkä jälkeen se väkevöidään kuiviin alennetussa paineessa· 8itten aivan samoin kuin esimerkissä 1 väkevä liuos puhdistetaan Amberlite XAD-2-pylvään ja karboksimetyyliselluloosa-pylvään avulla. Menetelmällä saadaan 211 mg valkeaa, kuohkeaa jauhetta· 17 61 028

Ijat]^ -38.49° (c-0.53, 5 f etikkahapon vesiliuoksessa)j Rf2«0,l2, Rf3-0,74.

ininohappoanalyyai (hydrolyyai 6N HCljn kanssa, kun läanä on tioglykolihap-poa): His 1,00) Atg 1,04) Trp 0,98) Ser 0,92) Gin 1,00) Pro 1,00) Lon 2,04) Phe 1,00,

Esimerkki 4 (Pyr)Glu-Hi*-Trp-Ser~Tyr-I^-Phf-Lou-Arg-Pro-NH-CH2-CH3:n valuietna a ) Z-D-Phg-Len-Arg^Nip-Pro-NB-CHg-CHg: n va Ini atua

Seokaeon, joka sisältää 10 ail dinetyylifornanidia ja 20 «1 dikloorinetaa-nia, liuotetaan 580 mg Z-IM-’hg—OH:a ja 1,14 g H-Leu—ArgiNO-J-Pro-NH—CH,,- m 4» CHgja.

Täkin seokaoen liaätään 400 ng HONBja ja jäillä jäähdyttäen 500 ng DCCja. Sekoitetaan huoneen lämpötilassa 4 tunnin ajan. Sivutuotteena aaatu disyklo— hekayyliurea poiatetaan suodattane11a ja auodoa väkevöidään kuiviin. Jäännös liuotetaan 100 uljaan etyyliasetaattia. Liuos pestään 4-prosentti seila nat-riunvetykarbonaatilla ja vedellä, kuivataan natriunsulfaatin yläpuolella ja ti aletaan etyyliäaetaatin poiatamiaeksi. Jäännöa seostetaan uudelleen etyyliä aetaatti-petrolieetteriatä, jolloin saadaan 1,4 g jauhetta.

Rf2-0,83.

^_/ρδ-80.2° (c*0,5 »etanolisaa) h) (PyrjGlu-His-Trp-Ser-Tyr-IHPhg-Leu-Arg-Pro-NH-CHg-CHjjjn valmistua 80 uljaan etikkahappoa liuotetaan 150 ag Z-I^-Phg—Leu-A r g ( NO 2 )-Pro—NH—CHg— CH^ja. Sanalla knn lisätään 100 ng palladiunnustaa, vetykaasun annetaan kuplia liuoksen läpi ilnakehän paineessa pelkistänistä varten.

4 tunnin kuluttua katalysaattori poistetaan suodattenella ja lisätään 0,4 nl IN suolahappoa. Liuos väkevöidään kuiviin alennetussa paineessa ja väkevä liuos liuotetasn 20 uljaan vettä sekä lyofiloidaan» Saatu jauhe liuotetaan 8 uljaan dinetyylifornanidia sekä lisätään tipoittain 0,25 nl 10-prosenttis-ta N-etyylinorfOliinin dinetyylifornanidiliuosta. Sitten lisätään 141 mg (fyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OHja, minkä jälkeen lisätään 60 ng 1-hydrokaibentso-triatsolia ja sitten 40 ng DCCta -5 °C:ssa.

Seosta sekoitetaan -5 °C:aaa 2 tuntia, 0°Ctsaa 2 tuntia ja huoneen länpöti- is 61028 laaaa 8 tuntia· Reaktioaeokaeen lisätään setteriä ja syntyvä aaoatuna otetaan talteen suodattavalla sekä liuotetaan 20 nl:aan vettä. Liukenevattonat aineet poistetaan suodattavalla ja auodoa johdetaan Amberlite IRA-410 (asetä at ti vuo to) pylvääseen, joka sitten pestään vedellä· Liuotin- ja vesipesu-nesteet yhdistetään ja johdetaan karboksivetyyliaellulooaa-pylvääaeen (1,5 x 25 cv), ja suoritetaan asteittainen eluutio käyttäen 0,005M ammonium— aaetaattia ja 0,175 li avnoniuvaaetaattia (pH 5,8) (300 vl kumpaakin)· Tarkoitettu tuote saadaan 170 ml:n ja 240 vl:n fraktioissa· Nämä fraktiot yhdistetään ja johdetaan Amberlite XAD-2-pylvääseen (2 x 20 cv)· Adsorboitunut haluttu yhdiste eluoidaan asteittaisella menetelmällä käyttäen vettä (250 ml) ja etanolin (280 ml), minkä jälkeen puhdas yhdiste saadaan 190 ml:n -240 ml:n fraktioissa· Eluaatti väkevöidään alannetuaaa paineessa ja lyofi-loidaan· Selostetulla menetelmällä saadaan 110 mg haluttua tuotetta·

Rf2-0,098, Bf3«0,73 /p(J^ -57·0° (c-0.56 5 Jt etikkahapon veailiuokaeasa)

Aminohappoanalyyai (hydrolyyai 5N HCl:n kanaa· kun läsnä on tioglykolihap-poa)j Hi a 0,96) Arg 1,04} Trp 0,92) Ser 0,93) Glu 1,00) Pro 1,00) Leu 1,01)

Phg 0,98) Tyr 1,01

Esimerkki 5 (Pyr)Glu-Hi a-Trp-Ser—Tyr—D-Ser—Leu-Arg-Pro—NH—CH,,—CHg:n valmi etua a) Z-D-Ser—Leu-Arg^NOgJ-Pro—NH-CHg-CHgjn valmiatua

Seokseen, joka sisältää 10 ml dioksaania ja 10 ml dimetyyliformavidia, liuotetaan 955 mg Z-D-Ser—OH: a, 1,82 g H-Leu-ArgtNO^-Pro-NB-CHg-CHgi a ja 788 mg HONBsa· Liuos jäähdytetään 0°C:een ja aiihen lisätään 907 mg OCCja» Sitä sekoitetaan 0°C:esa 2 tuntia ja huoneen lämpötilassa 5 tuntia· Sivutuotteena ayntyvä diayklohekayyliurea poistetaan suodattamalla ja auodoa väkeTöidään kuiviin alennetussa paineessa· Jäännös liuotetaan 100 ml:aan kloroformia· Linea pestään 0,5 N suolahapolla ja 4-prosenttisella natriumvetykarbonaa-tilla aanotusaa järjeatykaeaaä, kuivataan magneaiumaulfaatin yläpuolella sekä väkevöidään kuiviin alennetussa paineessa· Jäännöstä käaitellään petroli-eetterillä ja syntyvä jauhe otetaan talteen suodattamalla sekä aaootetaan uudelleen etanoli-eetteriatä· Saalis 2,4 g) sulamispiste: 123-125 °C (hajoaa).

/*727 —49·8° (c-0.5 metanoliaaa) 19 61028

Alkuaineanalyysi, C30H47°9N9“H2° laskettu C, 51.79) H, 7.09) N, 18.12 aaatu C, 52.01) H, 6.96) N, 18.04

Bf^-0,40 b) (Pyr)Glu-His-Trp4ISer-Tyr-I>~Ser—Leu-Arg-Pro-NH—CH^-CHg:n Taimiatua

Seokseen, joka sisältää 20 ml metanolia ja 1 ml:n jääetikkaa, liuotetaan 334 mg fr-D-Sei^-Leu-Arg(NOgJ-Pro-NH-CHg-CHg:a ja suoritetaan katalyyttinen pelkistys huoneen lämpötilasss ja ilmakehän paineessa 4 tunnin aikana, käyttäen katalysaattorina palladiummustaa. Katalysaattori poistetaan suodattamalla ja suodoa Täkeröidään kuiriin alennetussa paineessa. Jäännös liuotetaan lisäämällä 9,6 ml 0,1 N suolahappoa ja lyofiloidaan.

Koira jauhe ja 280 mg (Pyr)Glu-Hia-Trp-Ser—Tyr-OH:a liuotetaan 3 ml:aan DUFta sekä lisätään 100 mg 1-hydroksibentsotriatsolia ja 0,615 ml 10-prosent-tiata N-etyylimorfoliinin DMF-liuosta.

Seos jäähdytetään -5 °C:een, minkä jälkeen lisätään 165 mg DCCia. Sekoitetaan -5 °C:ssa 4 tuntia ja huoneen lämpötilassa 8 tuntia. Sirutuotteena syntyrä ureajohdannainen poistetaan suodattamalla ja auodoa räkeröidään kuiriin alennetussa paineessa. Jäännös liuotetaan 20 ml:aan rettä ja liukenemattomat aineet suodatetaan pois. Suodoa johdetaan Amberlite 1RA-410-(asetaattimuoto)pylrääseen (10 ml) ja neste ja pesuliuokset yhdistetään ja johdetaan karboksimetyyliselluloosa-pylrääseen (1,5 z 27). Eluutio suoritetaan asteittaisella eluointimenetelmällä käyttäen 0,005 M ammoniumasetaat-tipuskuria (300 ml) ja 0,15 li ammoniumssataattia (300 ml). Haluttu tuota saadaan 280 ml - 322 ml:n fraktioissa· Nämä fraktiot yhdistetään ja lyofiloidaan, jolloin saadaan 135 mg raakatuotetta. Tämä liuotetaan pieneen määrään rettä ja johdetaan Amberlite XAD-2—pylrääaeen (1,5 x 17 cm). Eluointi suoritetaan asteittaisella menetelmällä käyttäen δ-prosenttista etanolin resi-liuosta (300 ml) ja 60-prosenttistä etanolia (330 ml). 196 ml · 231 ml fraktiot yhdistetään ja kun etanoli on poistettu tislaamalla, lyofiloidaanl Saalis 62 mg.

Tämä tuote liuotetaan 0,1 N etikkahapon resiliuokaeen ja geeliauodatetaan Sophadez LH-20-pylrääsaä (1 x 54 cm). Lyofiloinnin jälkeen saadaan 40 mg haluttua tuotetta puhtaana.

jo 61028 /o</27 -46,4° (6*0,5 5 % etikkahapon re si Huokeassa), Rf2*0,055, Rf3-0,70 iminohappoanalyysi (hydrolyysi 6N HCl:n kanssa, kun läsnä on tioglykoli-happoa): His 1,00) Arg 1,04} Trp 1,00) Ser 1,81) Glu 1,00) Pro 1,00)

Leu 1,04) Tyr 0,06) etyyliaaiini 1,04

Esiaerkki 6 (Pyr)Glu-Hiβ-Trp-Sar-Tyr—D-lbu—Leu-Arg-Pro—NH-CHg-CHgsn valmi etua a) Z-D-Abu~Lau-lrg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3:n valmistua 5 ml:aan diaetyyliforaaaidia liuotetaan 0,3 g Z-I^-Abu-OH:a ja 0,45 g H-Leu-A r g(NO 2)-Pro-NH-CHg-CHg: a,

Liuos jäähdytetään 0 °C:ean ja lisätään 0,25 g HONBsia jn 0,29 g DCCsa· Seosta sekoitetaan O °Ctssa 1 tuntia ja huoneen lämpötilassa 5 tuntia· Urea-johdannainen suodatetaan pois ja suodos väkevöidään kuiviin alennetussa paineessa. Jäännös liuotetaan 80 aisaan kloroforaia, pestään 1 N suolahapolla ja 4-prosenttiaella natriumvetykarbonaatilla·

Vesipesun jälkeen se kuivataan magnesiuasulfaatin yläpuolella ja väkevöi-dään kuiviin alennetussa paineessa. Jäännöstä käsitellään eetterillä ja syntyvä jäuhe otetaan talteen suodattamalla sekä seostetaan uudelleen etyyliasetaatti—petrolibensiinistä. Saalis 489 mg, sulamispiste] 111-114 °C« -51.2° (c«0,6 aetanoliasa)) Rf**0,66 b) (Pyr )Glu-fli a-Trp-Ser-Tyr-D-Abu-Leu-jirg-Pro-NH-CHg-CHg: n valmi etua Z-lKAbu—Leup-ärg(N02)—Pro—NH-CHg-CHgSn käsitellään 25-prosenttisella bromi-vety-jääetikalla ja säestetään eetterillä·

Saostuma johdetaan imberlite CG-410—pylvääseen (vapaa happo) broaivedyn poiataaiseksi. 3 aisaan DUFsa liuotetaan 220ag näin saatua H-D-Jtbu-Leu-ärg(N02)-Pro-KB-CH2-CH3:n vapaata säästä ja 290 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OHsa, ainkä jälkeen lisätään 150 ag HONBia. Seoa jäähdytetään -10°Cseen ja siihen lisätään 85 ag OCCsa. Seosta sekoitetaan -10°Csssa 2 tuntia, 0®C: osa 4 tuntia ja huoneen lämpötilassa 7 tuntia· Reaktioaeokseen lisätään etyyliasetaattia ja syntyvä saostuma otetaan talteen suodattamalla. Saostuma 21 61028 liuotetaan 20-prosentti seen »etanolin vesiliuokseen lämmittäen ja liuos jäähdytetään, jolloin saostuma erottuu· Tänä saostuma otetaan talteen suodattamalla ja kuivataan. Saalia 284 mg· Bf2»0,240, Bi3-0,772. (Molemmissa liuoksissa tuote sisältää noin 10 j( epäpuhtautta, joka antaa pienen Ei—arvon).

15 ml:aan 60-prosenttistä muurahaishapon vesiliuosta liuotetaan 200 mg edel-läsaatua tuotetta, minkä jälkeen lisätään 400 mg SnCl9.Ho0ta. Seosta pide- O * * tään 80—85 C:sea 2 tuntia. Sitten seos väkevöidään kuiviin alennetussa paineessa ja jäännös uutetaan 50 ml:11a lämmintä vettä.

Liukenemattomat ainekset poistetaan suodattamalla ja suodoa johdetaan Am-berlite 3LAD-2-, kerb ok s im e tyyli selluloosa- ja Sephadez LH-20-pylväiaiin sanotussa järjestyksessä, minkä jälkeen lyofiloidaan. Selostetulla menetelmällä saadaan 104 mg valkeaa kuohkeaa jauhetta.

-43.6° (c*0.50, 5 $ etikkahapon vesiliuoksessa), Rf2»0.08.

Aminohappoanalyysi (hydrolyysi 6N HCl:lla, kun läsnä on tioglykolihappoa)t Hi s 0.98) Arg 0.96; Trp 0.94) Ser 0.92; Glu 1,00; Pro 1,00) Len 0,98)

Abu 1,00) Tyr 1,00; etyyliamiini 1.02.

Esimerkki 7 (Pyr)Glu-His-Irp-Ser-Tyr-D-Nva-Leu-Arg-Pro-NH-CH.-CH.:n valmi atus 4 o a) Z-D-Nva—OH:n valmistus H— B-Nva—OH saatetaan tavalliseen tapaan reagoimaan karbolmntbentsokeikloridin kanssa 2 N natriumhydroksidissa, ja saatu yhdiste kiteytetään etyyliäsetaat-ti-petrolibenaiinistä. Menetelmällä saadaan neulasia, jotka sulavat 83-84°C:ssa M™ *i». 1° (c»1.0 metanolissa)

Alkuaineanalyysi, ci3H1704N

laskettu C, 62.14; H, 6.82; N, 5.57 •••tu C, 62.17; H, 6.88) N, 5.62 b) Z-D-Nva—Leu-Ar g(NO g)-Pro—NIL*CHCH^:n valmistus 5 ml:aan DMF:a liuotetaan 376 mg Z-D-Nva-OH:a, 685 mg H-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CHj-CHgja ja 295 mg H0NB:a sekä lisätään sitten 0°C:asa 340 mg DCC:a. Seosta 22 61 O 2 8 sekoitetaan 0 °C:saa 2 tuntia ja huoneen lämpötilassa 8 tuntia. Sivutuotteena syntynyt ureajohdannainen poistetaan suodattamalla, ja suodokaeen lisätään 100 ·1 etyyliasetaattia. Seos pestään 0,5 N suolahapolla ja 4-pro-senttisella natriumvetykarbonaatilla. Se peatään vedellä ja kuivataan nat-riumsulfaatin yläpuolella. Liuos väkevöidään kuiviin alennetussa paineessa ja sitä käsitellään eetterillä. Syntyvä jauhe otetaan talteen suodattamalla ja puhdistetaan kiteyttämällä uudelleen etyyliasetaatti-eetteristä. Saalis 900 mg, sulamispiste: 105-107 °C (hajoaa).

[ct]^ -51.2® (c-1 metanolissa); Rf^-0.60 Alkuaineanalyysi, C32fl51°8N9 laakettu C, 55.71) H, 7.45) N, 18.27 saatu C, 55.54) H, 7.62) N, 18.09 c) (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Nva-Leu-Arg-Pro-NH-CH„-CH :n valmistus * 3 Käyttäen lähtöaineena Z-D-Nva-Leu-Arg(NO2 )-Pro-NH-CH2~CH3J 8» Joka on saatu kohdassa b), ja (PJfr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH:a suoritetaan aama reaktio ja puhdistusmenetelmä kuin esimerkissä 6)-b)t jolloin saadaan haluttua yhdistettä.

-39.8° (c-0.51 5 % etikkahapon vesiliuoksessa)) Rf^-0.094) Rf3«0.74

Aminohappoanalyysi (hydrolyysi 6N HCl:lla kun läsnä on tioglykolihappoa):

His 1.00) Arg 0.98) Trp 0.93) Ser 0.94) Glu 1.08) Pro 1.02) Nva 0.98)

Leu 1.00) Tyr 0.98) etyyliamiini 1,04

Esimerkki 8 (Pyr ) Glu-His-Trp-Ser-Phe-D-Nva-Leu-Arg-Pro-NH^CHg-CF^-CH^: n valmistus a ) Z-D-Nva-Leu-Arg (NOgJ-Pro-NH-CH^- : n valmistus 2 mitään 25-prosenttistä bromivety-jääetikkaa liuotetaan 720 mg Z—Leu-ArgtNO^)-Pro-NH-CH^CH^CH^ :a ja liuosta ravistetaan 40 minuutin ajan. Siihen lisätään 20 ml kuivaa eetteriä ja syntyvä saostuma otetaan talteen suodattamalla. Saostuma pestään hyvin kuivalla eetterillä. 8itten ae kuivataan natriumhydrokäidin yläpuolella alennetussa paineessa eksikkaattorissa.

Kuivaamisen jälkeen tuote liuotetaan 5 ml jaan DMFia ja lisätään 250 mg Z-D-Nva-OH:a, minkä jälkeen lisätään 0,15 ml trietyyliamiinia ja 200 mg HONBja 23 61 028

Seoa jäähdytetään 0°C:een ja lisätään 230 mg DCCta, ninkä jälkeen sekoitetaan huoneen lämpötilassa 8 tunnin ajan* Sitten lisätään 80 ml etyyliasetaattia ja liukenenättömät ainekset suodatetaan pois· Suodos pestään 1 N suolahapolla, 4-prosenttisella natriunvetykarbonaatilla ja vedellä sekä kuivataan natriumsuliaatin yläpuolella·

Sitten se väkevöidään kuiviin alennetussa paineessa ja jäännöstä käsitellään petrolieetterillä· Saatu jauhe puhdistetaan seostamalla etyyliaaetaattipet-rolieetteristä· Saanto 718 mg· /cxJq5 -51,0® (c«1.0 netanolissa)) Bf *«0.64 Alkuaineanalyysi, CggHggOg^ laskettu C, 56.23) H, 7,58) N, 17.80 saatu C» 56.14) H, 7.70) N, 17.58 b) (Pyr)Glu-Hi s-Trp-Ser-Phe-D-Nva-Leu-Arg-Pro-NH-CHg-CHg-CHgtn valmi etua 3 ml $ aan 25-prosenttistä bromivety-jääetikkaa liuotetaan 500 mg Z-D-Nva-Leu-irg(N0g)-Pro-NH—CHg-CHg—CHgja ja liuosta ravistetaan 50 minuutin ajan.

Siihen lisätään 60 ml kuivaa eetteriä ja saatu saostuma ototam talteen suodattamalla sekä liuotetaan 40 ml:aan vettä. Liuos johdetaan Amberlite CG—410- (vapaa emäs) pylvään kautta (1 x 14 cm), joka Bitten pestään 30-pro-senttisella metanolin vesiliuoksella. Neste ja pesunesteet yhdistetään ja metanoli tislataan pois alennetussa paineessa. Jäännös lyofiloidaan, jolloin saadaan 320 mg H—D-Nva—Leu-Arg^Og^Pro-NH-CHg-CHg-CHgta vapaana emäksenä.

225 mg edellä saatua tuotetta ja 280 mg (Pyr)Glu-Hia-Trp-8er-Phe-OH:a liuotetaan 2 ml:aan DMFta, minkä jälkeen lisätään 130 mg H0NB:a. Seos jäähdytetään -10°C:een sekä lisätään 87 mg DCC:a. Seosta sekoitetaan -10°C:osa 3 tuntia, 0°C:ass 2 tuntia ja huoneen lämpötilassa 6 tuntia. Tähän reaktioseok-seen lisätään 40 ml etyyliasetaattia ja syntyvä saostuma otetaan talteen suodattamalla sekä liuotetaan 30-prosenttiseen etanoliin lämmittäen. Liukenemattomat ainekset suodatetaan pois ja suodos jäähdytetään, jolloin saadaan saostuma. Tämä otetaan talteen suodattamalla, pestään kylmällä vedellä ja kuivataan. Saalis 340 mg. 20 mitään 60—prosenttista muurahaishapon vesiliuosta liuotetaan 300 mg edelläaanottua tuotetta, minkä jälkeen lisätään 580 mg SnClg.HgOta. Seosta pidetään 85 °C:ssa 2 tuntia. Reaktioaeos väkevöidään kuiviin alennetussa paineessa ja uutetaan lämpimällä vedellä.

Uute puhdistetaan kromatografisesti Ambexlite XAD-2:lla, karboksimetyyliselluloosalla ja Biogel P—2:11a. Menetelmällä saadaan 170 mg haluttua tuotetta.

61 028 24 -37.7° (c-Ο.δΟδ δ $ etikkahapon vesiliuoksessa)) Bf2H>,13) Bf3«0,76

Aminohappoanalyysi (hydrolyyei 6N HCl:n kanssa, kun läanä on tioglykolihap-poa) j His-1.02j Arg 0.98) Trp 0.97) Sor 0.98) Gin 1,02) Pro 1,00) Len 1,00) Nva 1,02) Phe 0.98

Esimerkki 9 (Pyr)Glu-Hie-Tr p-Ser—Tyr—D-Abu-Leu-Ar g-Pr o-NH-CH(CHg)^:n Talsi etu a a) Z-l>-ibu-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH(CH3)2in valoi etua 3 sijaan bromivety-jääetikkaa liuotetaan 700 »g Z-Leu-Arg(N02)-Pro-NE-CH(0H_)oja ja liuosta ravistetaan 60 minuutin ajan, minkä jälkeen lisätään 50 ml kuivaa eetteriä» Syntyvä saostuma otetaan talteen suodattamalla ja kuivataan. Kuivattu tuote liuotetaan 6 sijaan DMFja, Tähän liuokseen lisältään 240 mg Z-IV-Abu-OH;a ja liuos neutraloidaan 0,15 mljlla trietyyli amiinia.

Sitten lisätään 200 mg HONBja ja seos jäähdytetään 0°Cteen, minkä jälkeen lisätään 230 ng DCC;a. Seosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa 6 tuntia. Sitten lisätään 100 ml etyyliasetaattia ja liukenemattomat ainekset poistetaan suodattamalla. Suodos pestään 0,5 N suolahapolla ja 4-prosenttisella natriumvetykarbonaatilla sekä kuivataan sitten natriumaulfaatin yläpuolella. Sitten se väkevöidään kuiviin alennetussa paineessa ja käsitellään eetterillä. Syntyvä jauhe seostetaan uudelleen etyyliasetaatti—eetteristä. Saalis 72δ mg.

/^(/^-52.00 (c*0.5 metanolisaa), Bf*-0.62

Alkuaineanalyysi, C32H5i°8N9 laskettu C, δδ·71) H, 7.45) N, 18.27 saatu C, 55.42) H, 7.59) N, 18.01 b) (Pyr)Glu-Hie-Trp-Ser-Tyr-D~Abu-Leu-Arg-Pro-NH-CH(CHg)2jn valmistus

Kohdassa ä) saadusta Z-D-Abu-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH(CHg)2: sta ja (Pyr)Glu-His-Trp-Ser—Tyr—OHi»ta saadaan edelläsanottua yhdistettä tarkoin samalla menetelmällä kuin esimerkissä 5.

/©C7j^e —41.0° (c*0.82 · % etikkahapon vesilinokeeeea)) Bf2-0.11) Rf3«0,74 iminehappeanalyysi (hydrolyysi 6N HCIju kanssa, kun läsnä on tioglykolihap-poa)j Hio 1.00) Arg 0.90) Trp 0.87) Ser 0.97) Glu 1.00) Pro 0.94) Abu 1,00) Leu 1.02) Tyr 0.96 25 61 028 *

Esimerkki 10 (Pyr)Glu-Hi *-Trp-Ser—Tyr-IJ-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-CH^-CHgj n Taimi etua ki inteäs-aä laaaiaaa a) BOC-Pro-hartain valmistua 50 ml:aan DMF:a lisätään 15 g kloorimetyloitua hartsia (Cl-pitoisuua 9,45 millimoolia), minkä jälkeen lisätään 6,1 g BOC-Pro—OH;a ja 3,33 ml trietyy-liamiinia. Seosta ravistetaan 5 päivän ajan· Hartsi otetaan talteen suodattamalla ja pestään hyvin BMP:11a, etanolilla, vedellä, etanolilla ja eetterillä, täsaä järjestyksessä, sekä kuivataan· Saalis 17,55 g· Aminohappoana-lyysi osoittaa, että tämä hartsi sisältää 0,314 millimoolia/g BOC—Bros a· b) (Pyr)Glu-His(Toe)-Trp-Ser(B*l)-Tyr(Bsl)-D-Leu-Leu-Arg(Tos)-PrO-hartsin valmistus

Automaattisen peptidisyntetisaattorin reaktiosstia (Simadzu Seiaakusho Model APS-800) täytetään 3,145 gtlla BOC-Pro-hartsia, joka on saatu kohdassa a)· Hartsi saatetaan paisuvaan dikloorimetaanin avulla 12 tunnin aikana, minkä jälkeen kukin aminohappo syötetään seuraavansa järjestyksessä·

Dikloorimetaani (3 minuuttia z 3) —* 50 j( trifluorietikkahappo/dikloorime— taani (10 min ja 30 min) —> dikloorimetaani (3 min x 3) —» etanoli (3 min x 3) -^ dikloorimetaani (3 min x 3) —* 10 % trietyyliamiini/kloroformi (10 min) —> kloroformi (3 min x 3) —^ dikloorimetaani (3 min x 2) —> BOC— aminohappoanhydridi (syntetisoitu BOC-aminohapoata ja D0C:sta tavalliseen tapaan) (30 min ja 60 min) —4 asetylaatio (dikloorimetaani, trietyyliamiini ja etikkahappoanhydridi) (1 tunti) —> dikloorimetaani (3 min x 3) ((Pyr)Glu-OH yksi kondensoidaan suoraan DCC:n kanssa DMFtssa)·

Lopuksi hartsi pestään etanolilla, kloroformilla, dimetyyliformamidilla ja eetterillä sekä kuivataan· Saalis 3,89 g.

o) (Pyr)Glu-His(Toe)-Trp-Ser(Bsl)-Tyr(Bsl)-l>-Leu-Leu-Arg(Toe)-Pro-NH-CH2-CH^jn valmistus 20 ml:aan metanolia suspendoidaan 3,52 g kohdassa b) saatua hartsia ja suspensio jäähdytetään 20°C:een. Etyyli amiinin, joka on saatu kuumentamalla 80-prosenttistä etyyliamiinin vesiliuosta vesihauteella, annetaan kuplia suspensioon natriumhydrokaidin kautta. Siittävän kyllästämisen jälkeen seosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa 50 tunnin ajan. Hartsi otetaan talteen 26 61028 suodattamalla ja suodoa väkevöidään kuiviin alennetussa paineessa. Jäännöstä käsitellään eetterillä, jolloin saadaan 835 mg jauhemaista raakatuotetta. Tämä raakatuote sisältää suuren määrn epäpuhtautta, joka todennäköisesti on metyyliesteriä. Tästä syystä 503 mg tätä tuotetta liuotetaan metanoli-DMF:aan (8 ml - 8 ml) ja, samalla tavalla kuin edellä etyyliamiini saatetaan kuplimaan liuokseen» Liuosta sekoitetaan 34 tuntia, jolloin metyyliesteri häviää.

Liuos väkevöidään sitten kuiviin alennetussa paineessa ja jäännöstä käsitellään eetterillä. Saatu jauhe otetaan talteen suodattamalla. Saalis 465 mg.

d) (Pyr)Glu-Hie-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-CH -CH :n valmistus 327,8 mg kohdassa e) saatua raakatuotetta liuotetaan 8 ml:aan vedetöntä fluorivetyä, kun läsnä on 0,4 ml anisolia ja 0,4 ml merkaptoetanolia. Liuosta sekoitetaan O °C:ssa tunnin ajan, minkä jälkeen se väkevöidään kuiviin alennetussa paineessa. Jäännös liuotetaan 20 ml:aan vettä ja liukenemattomat ainekset poistetaan suodattamalla. Suodos saatetaan kulkemaan Amberlite IRA-410- (asetaattimuoto) pylvään läpi (l,S x 20 cm) ja puhdistetaan sitten kromatograafieesti karbokaimetyylisellulooaalle ja Amberlite XAD-2:lla. Sitten tuote geeli suodatetaan Sephadex LH-20-pylväässä. Selostetulla menetelmällä saadaan 98 mg haluttua tuotetta.

-32.0° (c«0.52 5 ^ etikkahappn vesiliuoksessa)) Rf2-0.10) Rf^-0.75

Aminohappoanalyysi (hydrolyysi 6N HCl:ftla, kun läsnä on tioglykolihappoa):

His 0.98; irg 1.00) Trp 0.87) Ser 0.90) Glu 1.02} Pro 1.02) Leu 2.01)

Tyr 0.98; etyyliamiini 1.10

Esimerkki 11 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Nle-Leu-Arg-Pro-NH-CHg-CHg:n valmistus a) BOC-D-Nle-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3:n valmistus 10 ml; aan DL'F:a liuotetaan 346 mg BOC-D-Nle-OH: a ja 820 mg H-Leu-Arg(N02)-Pro—NH—CH-CH :a. Seos jäähdytetään 0°C:een, minkä jälkeen lisätään 322 mg 3 φ H0NB:a ja 371 mg DCC:a. Seosta sekoitetaan 0 C:esa 2 tuntia ja huoneen lämpötilassa yön yli. Sivutuotteena oleva ureayhdiste poistetaan suodattamalla ja suodos uutetaan 10 cl;11a kloroformia. Uute pestään 0,1 N suolahapolla, 5-prosenttisella natriumvetykarbonaatilla ja vedellä sekä kuivataan vedettömän natriumsulfaatin yläpuolella.

27 61028

Kloroformi haihdutetaan pois ja jäännös hierretään eetterin kanssa ja seostetaan etanoli-eetteristä, jolloin saadaan haluttu tuote· Saalis 811 mg. Sulamispiste* 124-126 °C (hajoaa).

/p-46.2° (c«0.5 »etanolissa) .Alkuaineanalyysi, ^¢^5^8^9^2° laskettu C, 53.08) K, 8.31; N, 18.57 saatu C, 53.07; I, 8.27; N, 19.05; b) (Pyr)Glu-Hie-Trp-Ser-Tyr-D-Nle-Leu-irg-Pro-NH-Cn -CH_:n Taimi stus 2 o BOC—IMile—Leu—Arg(NOg)—Pro—NH—CHg—CH^:a, joka on valmistettu edellä kohdan a) mukaisesti, käsitellään trifluorietikkahapolla ja seostetaan eetterillä sekä otetaan talteen suodattamalla. Tuote saatetaan kulkemaan Amberlite CG-45- (vapaa emäs) pylvään läpi trifluorietikkahapon poistamiseksi» 2 ml;aan DMFja liuotetaan 190 mg yhdistettä H-D-Nle-Leu-Arg(NO_)-Pro-NB-CH0-GH. ja

* m Q

168 mg (Pyr)eiu-His-Trp-Ser-Tyr-OHja. Saos jäähdytetään 0°C:een, minkä jälkeen lisätään 65 mg HOMBia ja 75 mg DCC:a« Saosta sekoitetaan 0°C:saa 2 tunti a ja huoneen lämpötilassa yön yli· Sivutuotteena oleva ureayhdiste poistetaan suodattamalla ja suodokseen lisätään etyyliasetaattia. Syntyvä saostuma otetaan talteen suodattamalla ja sitä käsitellään 4 ulilla vedetöntä fluori-vetyä, kun läsnä on 0,1 ml anisolia ja 0,1 ml 2-merkaptoetanolia, 0°Cissa tunnin aikana. Fluorivety haihdutetaan alennetussa paineessa ja jäännös kuivataan hyvin ja liuotetaan 10 ml s aan vettä. Liuos saatetaan kulkemaan Amberlite IRA—410- (asetaattimuoto) pylvään läpi ja neste adsorboidaan karboksi-metyyliaelluloosa-pylvääseen (1,2 x 22 cm) ja asteittainen eluointi suoritetaan 0,005 M ammoniuma setaati11a (200 ml) ja 0,15 M ammoniumssetaati11a (200 ml). Fraktiot 147 mlssta 168 ml;aan yhdistetään ja lyofiloidaan, jolloin saadaan haluttu tuote puhtaana· Saalis 40 mg· -42.2° (c-0.5 5 % etikkahapon vesiliuoksessa) Rf^-0»11, Rf®-0,755

Aminohappoanalyysi (hydrolyysi 6N HCljLla, kun läsnä on tioglykolihappoa)

Hio 1.05; Arg 1.00; Trp 0.93; Ser 0*98; Tyr 1*00; Glu 1.00; Pro 1.02;

Leu 1.00; Nle 1*00; etyyliemiini 1.05

Esimerkki 12 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe—D-Phe-Leu-Arg-Pro-NH—CHg-CHgjn valmi stua a) H-D-Phe—Leu-Arg(N0o)-Pro-NH-CH_-CH_:n valmistus * 6 tf 28 61 028

Seokseen, joka sisältää 10 nl dikloorimetaania ja 1 ml:n DDF:a, lisätään 600 ng Z-D-Phe-0H:a, 500 mg HONB:a, 950 mg H-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3:a ja seos kuumennetaan. Seos jäähdytetään 0°Cseen ja lisätään 500 mg DCC:a. Seosta sekoitetaan 4 tunnin ajan huoneen lämpötilassa, ja sivutuotteena oleva disykloheksyyliurea poistetaan suodattamalla· Suodos väkevöidään kuiviin alennetussa paineessa ja jäännös liuotetaan kloroformiin. Liuos pestään kahdesti 4—prosenttisella natriunvetykarbonaatilla ja kahdesti vedellä sekä kuivataan vedettömän magnesiumsulfaatin yläpuolella ja väkevöidään kuiviin alennetussa paineessa. Jäännös liuotetaan heti 2 mitään jääetikkaa.

Kun on lisätty 5 ml 25-rpsenttists bromivety-jääetikkaa, seosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa tunnin ajan, minkä jälkeen lisätään 50 ml kuivaa eetteriä. Erottuva saostuma otetaan talteen suodattamalla ja pestään hyvin eetterillä ja kuivataan· Saostuma liuotetaan 10 mliaan 30-prosenttista nte-tanolin vesiliuosta. Liuos johdetaan imberlite IRA—410- (vapaa muoto) pylvään läpi, joka eluoidaan 100 ulilla 30-prosenttista »etanolin vesiliuosta. Nesteet yhdistetään ja väkevöidään metanolin poistamiseksi.

Lyofiloimalla jäännös saadaan haluttu yhdiste, H-D-Phe-Leu-.Arg(N02)-Pro—NH— CHg-CHg, valkeana jauheena. Saalis 1,67 g.

-94.26° (eal.01 »etanolissa)

Alkuaineanalyysi c23H45°eN8*H2° laskettu C, 54«09j H, 7.62} N, 20.28 saatu C, 53.84} H, 7.79) N, 19.91 b) (Pyr)G1 u-Hia-Trp-Ser—Phe-I>-Phe—Leu—Arg—Pro-NH-CH2-CHg:n valmistus 6 ml taan Olffta liuotetaan 290 mg (pyr)Glu-His-Trp—Ser-Pha-OHja ja 240 mg H-D-Phe—Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CHgta, minkä jälkeen lisätään 150 mg HONBsa. Soos jäähdytetään -10 Cteen ja lisätään 90 mg DCCia. Seosts sekoitetaan —10 °C:saa 2 tuntia, O °Cjssa 2 tuntia ja huoneen lämpötilassa 6 tuntia. Sivutuotteena oleva ureayhdiate poistetaan suodattamalla ja auodokseen lisätään 40 ml eetteriä. Erottuva saostuma otetasn talteen suodattamalla. Seostamalla uudelleen etanolista ja etyyliasetaatista saadaan raakatuotteena suojattu peptidi. Saalis 510 mg. Raakapeptidi liuotetaan 40 ml:aan 60—prosenttista muurahaishapon vesiliuosta. Kun liuokseen on lisätty 1 g SnClg. HgOia, se jätetään seisomaan 80-85 °C:een 2 tunniksi. Seos väkevöidään kuiviin alennetussa paineessa. Kun on lisätty 50 ml vettä jäännökseen, seoksen pfl säädetään arvoon 7,0 ammoniakin vesiliuoksella. Erottuva saostuma poiste— 29 6 1 0 2 8 taan suodattamalla. Suo do a puhdistetaan Amberlite XAD-2- ja karboksimetyy-liselluloosapylväällä sekä lyofiloidaan samalla menetelmällä kuin esimerkissä 1, jolloin haluttu tuote saadaan valkeana kuohkeana jauheena» Saalis 392 mg» /σ</ρβ -71.8° (c«*0.195 5 H etikkahapon vesiliuoksessa) Bf2-0.14, Bf3-0.76

Aminohappoanalyysi (hydrolyysi 6N HCljlla, kun läsnä on tioglykolihappoa)

Hi a 0.98) Arg 1.00) Trp 0.97) Ser 0.93) Glu 1.00) Pro 0.98) Leu 1,00)

Phe 1.96

Esimerkki 13 (Pyr)G1u-H i β~Trp-Se r-Tyr-D-Thr-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CU3:n valmistus a) B0C-D-Thr-Leu-Arg(N0g)-Pro-NH-CII2-CHg:n valmistus 10 ml: aan asetonitriiliä liuotetaan 438 mg B0C-I>-Thr—0H: a (öljymäinen aine) ja 418 mg H0NB:a, minkä jälkeen lisätään 912 mg H-Leu-Arg(NOg)-Pro-NH-CHg-CHgja. Seos jäähdytetään 0°C:een ja sitten lisätään 494 mg DCC:a. Seosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa 10 tuntia ja liukenemattomat ainekset poistetaan suodattamalla» Suodos väkevöidään kuiviin alennetussa paineessa ja jäännös uutetaan 100 ml;lla etyyliasetaattia. Uute pestään 6-prosentti sella natriumvetykarbonaatilla, 10—prosentti sella sitruunahapon vesiliuoksella ja vedellä, sanotussa järjestyksessä, sekä kuivataan vedettömän natriumaul-faatin yläpuolella» Sitten se väkevöidään kuiviin alennetussa paineessa ja jäännös saostetaan uudelleen etanoli-eetteristä» Menetelmällä saadaan 900 mg haluttua tuotetta. Sulamispiste: 119-121 °G (hajoaa), —38.6° (c-Ο.δ metanolisaa), Bf^-0.45 ilkuaineanalyysi, C28H51°9N9*H2° laskettu C, 49.76) H, 7.90) N, 18.65 saatu C, 49.64) H, 7.70) N, 18,46 b) (PyrjGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Thr-Leu-irg-Pro-NH-CHg-CHg:n valmistus 10 ml:aan trifluorietikkahappoa liuotetaan 657 mg B0C—D-Thr-Leu-Arg(NOg)-Pro-NH-CHg-CHgja ja liuosta ravistetaan 40 minuutin ajan. Siihan lisätään 60 ml eetteriä ja syntyvä saostuma otetaan talteen suodattamalla sekä liuotetaan 30 ml:aan vettä. Yesiliuos saatetaan kulkemaan Amberlite IR-45-(vapaa emäs) pylvään (1 x 10 cm) kautta, joka pylväs sitten pestään 30-pro-entti sella metanolin vesiliuoksella. Neste ja peauliuokaet yhdistetään ja väkevöidään alennetussa paineessa metanolin poistamiseksi. Jäännös lyofiloi- 30 61028 daan. Menetelmällä saadaan 471 mg B-Thr—Leu-.Arg(N00)-Pro-NH-CH0-CH_: a·

ft 6 O

2 ai: aan DlfF:a liuotetaan 167 mg tätä tuotetta aekä 175 mg (Pyr)Glu-Hi*-Trp-Ser-Tyr—OE:a, minkä jälkeen lisätään 67 mg H0NB:a· Seos jäähdytetään ->5 C:een ja lisätään 77 mg DCC:a« Seosta sekoitetaan -5 Ctasa 3 tuntia ja sitten huoneen lämpötilaapa 10 tuntia· Liukenemattomat ainekset suodatetaan pois ja suodokseen lisätään 50 ml etyyliasetaattia, Syntyrä saostuma otetaan talteen suodattamalla ja seostetaan uudelleen DMF-e tyyli a se taa tietä. Saalia 290 mg· 160 mg:n erä tätä tuotetta liuotetaan 10 ml:aan 60-pro— senttistä muurahaishapon vesiliuosta, ja kun on lisätty 400 mg SnCl0«H 0:a, O * * liuosta pidetään 80 C:ssa 2 tuntia. Beaktioseos väkevöidään kuiviin alennetussa paineessa. Sitten lisätään 10 ml vettä ja liukenemattomat aineosat suodatetaan pois· Suodos puhdistetaan kromatograafisosti Amberlite XAD-2:lla, karbokaimetyyliselluloosalia ja Biogel P-2:lla. Menetelmällä saadaan 65 mg haluttua yhdistettä· *>37*4° (c-0*5 5 j( etikkahapon vesiliuoksessa), Bf^-0.12, Bf^-0.68 iminohappoanalyysi (hydrolyyei 6H HCltlla, kun läsnä on tioglykolihappoa):

Hi s 1.00) irg 0.97}'Trp 0.94} Thr 1.03) Ser 0.90} Glu 1.00} Pro 1.06}

Leu 1,06) Tyr l.OOj etyyliamiini 1.10·

Esimerkki 14 (PyrjGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Ile-Arg-Pro-NH-CHg-CHgZn valmistus a) Z-Ile-ärg(K02)-Pro-NH-CH2-CH3 :n valmistus 12 ml:aan 25-prosenttista bromivety-jääetikkaa liuotetaan 1,43 g Z-Arg(N02)-Pro—HH—CHg—CHg:a ja seosta ravistetaan 40 minuutäa huoneen lämpötilassa· Tähän liuokseen lisätään 300 ml kuivaa eetteriä ja syntyvä saostuma otetaan talteen suodattamalla ja kuivataan eksikaattorissa natriumhydroksidin yläpuolella· Saatu jauhe liuotetaan 25 ml:aan DMF:a ja liuos neutraloidaan 0,84 ml:lla trietyyliamiinia sekä jäähdytetään 0 °C:een· Sitten lisätään 795 mg 2—Ile—0H:a, 590 mg H0NB:a ja 680 mg DCC:a ja seosta sekoitetaan 0 0 C:ssa 5 tuntia ja 8 tuntia huoneen lämpötilassa. Beaktioseos suodatetaan ja suodos haihdutetaan* Jäännös liuotetaan 100 mlillm kloroformia, pestään 0,1 N suolahapolla, 5-prosenttiseila natriumvetykarbonaatilla ja vedellä sekä kuivataan sitten magnesiumsulfaatin yläpuolella. Kun liuotin on haihdutettu, jäännös seostetaan etyyliasetaatti-eetteristä· Kun seostetaan uudelleen etanoli—eetteristä, saadaan 1,1 g haluttua tuotetta} sulamispiste 103-105 °C.

31 61028 /ρ(/^ -58*1° (c»l,0 »etanoli saa) , Rf*-o.48

Alkuaineanalyysi, ¢27^2^7^^2° laskotta C, 54.08) H, 7.23) N, 18.68 saata C, 53.80) H, 7.15) N, 18.84 b) Z-D-Leu-Ile-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3:n valmistus 4 ml:aan 25-proSenttista bromivety-jääetikkaa liuotetaan 5Θ0 mg Z-Ile-irg(N02)-Pro-NH-CHg-CHgja ja seosta raviotetaan huoneen lämpötilassa 40 minuutin ajan. Tähän liuokseen lisätään 50 ml kuiraa eetteriä ja saatu saostuma otetaan talteen suodattamalla ja kuivataan eksikkattorisaa natriumhyd-roksidin yläpuolella. Saatu jauhe liuotetaan 8 ml:aan DlfF:a ja liuos neutraloidaan 0,14 ml;11a trietyyliamiinia sekä jäähdytetään 0 °C:een. Sitten lisätään 264 mg Z -D-Leu-QH: a, 216 mg H0MB;a ja 247 mg SCC:a ja seosta sekoitetaan 0°C:aaa 2 tuntia ja huoneen lämpötilassa 12 tuntia. Sitten reaktiose-oata käsitellään kohdassa a) selostetulla tavalla, jolloin saadaan 620 mg haluttua tuotetta) sulamispiste 112-113 °C.

47.8® (c-0.5 »etanolisaa), Bf1-0.53

Alkuaineanalyysi, C33B53°8^9aB2** laskettu C, 54.91) H, 7.68) N, 17.47 saatu C, 54.72) H, 7.52) N, 17.19 c) (Pyr)G1u-His-Trp—Ser-Tyr-D-Leu-11e-Arg-Pro-NH-CHg-CHg:n valmistus 1 2 3 4 5 6 7 ml:aan 25-prosenttista bromivety-jääetikkaa liuotetaan 220 mg Z-D-Leu-Ile-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CHg:a ja liuosta ravistetaan huoneen lämpötilassa 50 minuutin ajan. Tähän liuokseen lisätään 50 ml kuivaa eetteriä ja syntyvä saostuma otetaan talteen suodattamalla ja kuivataan eksikäattorisaa natrium— 2 hydroksidin yläpuolella. Tämä aine liuotetaan pieneen määrään vettä ja saa 3 tetaan kulkemaan Amberlite IR-45- (vapaa muoto) pylvään (1,2 x 7 cm) läpi. Neste ja peauliuokset yhdistetään ja lyofiloidaan. dine liuotetaan 5 ml:aan 4 DUF:a yhdessä 230 mg:n kanssa (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH:a ja 108 mg:n kanssa H0NB:a. Seos jäähdytetään -10 °C:een ja siihen lisätään 124 mg DCC:a.

5

Seosta sekoitetaan -10 °C:ssa 2 tuntia, 0 °C:ssa 2 tuntia ja huoneen lämpö- 6 tilaasa 10 tuntia, minkä jälkeen suodatetaan. Suodoa väkevöidään ja jäännös puhdistetaan Amberlite XAD-2- (200-300 mosh) pylväällä (1,8 x 20 cm) asteittaisella eluutiolla 5-prosentti sesta etanolista 80-prosentti seen etanoliin 7 (vesiliuos, kutakin 250 ml). Haluttu tuote saadaan 150 ml - 300 ml:n frak- 32 61028 tioisaa. Nämä fraktiot väkevöidään alennetussa paineessa ja lyofiloidaan· Näin saatu aine liuotetaan 7 ml;aan 60-prosenttista muurahaishapon vesi-liuosta ja siihen lisätään 450 mg SnClg.HgOja. Seosta pidetään 80-85 °C:ssa 2 tuntia. Liukenematon aines poistetaan suodattamalla ja auodos haihduta-^ taan kuiriin alennetussa paineessa. Jäännös uutetaan 30 ml:11a lämmintä vettä (80 °C). Uute suodatetaan ja suodos johdetaan Amberlite tap—2 (200-300 mesh) pylvääseen (1,8 x 15 cm) ja pylväs pestään hyvin vedellä. Eluoimiaeen käytetään asteittaista etanolin vesiliuosta (20-80 250 ml - 250 ml).

Haluttu tuote saadaan 100 ml - 230 ml:n fraktioissa. Fraktiot yhdistetään ja räkeröidään alennetussa paineessa etanolin poistamiseksi. Väkevä liuos johdetaan karboksimetyyliselluloosapylrääseen (1,2 x 40 cm), sitten tuote eluoidaan lineaarisella ateittaisella eluutiolla (0,005 M - 0,2 M ammonium-asetäättia, pH 6,8, 200 ml - 200 ml). Haluttu peptidi saadaan 180 ml-290 ml;n fsaktioissa. Nämä fraktiot yhdistetään ja lyofiloidaan. Saalis 130 mg.

-39.2° (c»0.5 5 % etikkahapon vesiliuoksessa): Hf^-0.11

Aminohappoanalyysi (hydrolyysi 6N HCl:n kanssa, kun läsnä on tioglykolihappoa): His 0.97} Arg 1,02; Trp 0.92} Ser 0.94} Glu 1,00} Pro 1,05} Ile 1.00} Leu 1,00} Tyr 0.97

Esimerkki 15 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Nle-Arg-Pro-NH-CHg-CHgjn valaistus a) Z-Nle—Arg(N0g)-Pro—NH-CHg-CHg:n valmistus 1 ml: aan 25-prosentti ats bromivety-jääetikkaa liuotetaan 715 mg Z-Arg^Og)-

Pro-NH-CH -CH_:a ja meesta ravistetaan huoneen lämpötilassa 30 minuutin ajan. i o Tähän liuokseen lisätään 250 ml kuivaa eetteriä ja syntyvä saostuma otetaan talteen suodattamalla ja kuivataan eksikaattoriasa natriumhydroksidin yläpuolella. Näin saatu jauhe liuotetaan 15 ml:aan DMF:a yhdessä 400 ngtn kanssa Z-Nle—OH:a ja liuos jäähdytetään 0 °C:een. Siihen lisätään 0,45 ml tri-etyyliamiinia ja sitten 295 mg H0NB:a ja 340 mg DCC:a. Seosta sekoitetaan 0°C:ssa 3 tuntia ja 10 tuntia huoneen lämpötilassa. Sitten reaktioseoata käsitellään esimerkissä 14-a) selostetulla tavalla, jolloin saadaan haluttua tuotetta. Saalis 824 mg} sulamispiste 109-110 °C.

/piTff -50.4° (c-0.5 etanolissa). Rf*«0.4l

Alkuaineanalyysi, C27H42°7N8*^H2° laskettu C, 54.08} H, 7.23) N, 18.68 saatu C, 53.79} H, 7.09} N, 18.34 33 61 028 b) Z-D-Leu—Nle-ArgiNO^J-Pro-NH-CHg-CH^:n valmistus 5 ml:aan 25-prosenttiata bromivety-jääetikkaa liuotetaan 590 mg Z-Nle-ArgiNOgJ-Pro-NH-CHg-CHgja ja seoata raviatetaan 40 minuutin ajan huoneen lämpötilasea. Siihen lisätään 200 ml koiraa eetteriä ja ayntyrä aaoatuma kerätään suodattamalla ja kuivataan ekaikkaattorisaa natriumhydrokaidin yläpuolella· Tämä tuote liuotetaan 5 ml:aan DMF:a ja liuoa neutraloidaan 0,14 ml:11a trietyyliamiini a 0 °C;ssa. Siihen lisätään 264 mg Z-D-Leu-OH:a, 216 mg HONBta ja sitten 247 mg DCCia 0°C:aaa. Seosta sekoitetaan 2 tuntia 0°C:aaa ja 10 tuntia huoneen lämpötilassa ja käsitellään sitten esimerkissä 14-b) selostetulla tavalla jolloin saadaan 594 mg haluttua tuotetta. Sulamispiste 101-103 °C.

-45,2° (c-0.5 metanolissa), Rf^-0.55

Alkuaineanalyysi, ¢33^303^.^0 laskettu C, 54.91) H, 7.68) N, 17.47 saatu C, 54.63) H, 7.54) N, 17.08 c) (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Nle-Arg-Pr0-NH-CH~CHo:n valmistus • « 4 ml:aan bromivety-jääetikkaa liuotetaan 350 mg Z-D-Lau-Nle-Arg^O^J—Pro-NH-CHg-CHg:a ja seosta ravistetaan 40 minuutin ajan huoneen lämpötilassa. Tähän seokseen lisätään 300 ml kuivaa eetteriä ja syntyvä saostuma kerätään suodattamalla ja kuivataan eksikaattorissa natriumhydrokaidin yläpuolella.

Näin saatu aine liuotetaan 2 ml:aan vettä ja liuos saatetaan kulkemaan Amberlite IB-45- (vapaa muoto) pylvään (1,2 z 7 em) läpi. Pylväs pestään hyvin vedellä. Neste ja pesunesteet yhdistetään ja lyofiloidaan. Tähän tuotteeseen lisätään 345 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH:a 6 ulissa DMF:a, kun läsnä on 180 mg H0NB:a ja 206 mg DCC:a. Sekoitetaan ja saatu tuote puhdistetaan kromatograafieesti Amberlite XAD-2:lla niinkuin esimerkissä 14-c) on selostettu. Nitroryhmän poistaminen ja halutun peptidin puhdistaminen suoritetaan myös samalla tavalla kuin esimerkissä 14-c). Saalis 213 mg.

-38.6° (c-0.5 6jt vedettömässä etikkahapossa). Rf^-0.10

Aminohappoanalyysi: (hydrolyysi 6N HCl:lla kun läsnä on tioglykolihappoa):

His 0.98) Arg 1.00; Trp 0.91) Ser 0.95; Glu 1,00) Pro 1.08) Leu 1,00)

Nle 1.00) Tyr 0.96 61028 3«

Esimerkki 16 (Pyr)Glu-Hi a—Trp—Ser-Tyr—D-Yal-Leu—Arg—Pro—NH-CHg-CHg: n valmi atua a) BOC-D-Va1-Leu-AEG(NO-)—Pro—NB-CH.-CH ;n valmiatua

Liuokseen, joka sisältää 540 mg B0C-I>-Val-0H:a (öljy) ja 1,14 g H—Leu-ABG(N02)-Pro-NH-CH2-CH3sa 10 ml:**a DMF:a, lisätään 537 mg HONB:a ja 620 mg DCC:a 0°C:aaa· Seosta sekoitetaan 3 tuntia 0°C:aaa ja 10 tuntia huoneen lämpötilassa ja suodatetaan sitten. Suodoa haihdutetaan kuiriin ja jäännös liuotetaan 100 ml:aan etyyliasetaattia· Liuos pestään 0,1 N suolahapolla, 5-proaenttisella netriumvetykarbonaatilla, kuivataan vedettömän natriumsulfaatin yläpuolella ja haihdutetaan· Jäännös hierretään potrolieetterin kanssa, jolloin saadaan raakatuotetta, joka sitten seostetaan etyyliasetaatti-eetteristä. Saalis 1,1 g) sulamispiste 144-146 °C (hajoaa)· 43,7° (c**l»0 metanolissa). Bf*-0.55

Alkuaineanalyysi, C29H53®8N9*aH2® laskettu C, 52.39# 9, 8.18# N, 18.96 saatu C, 52.40) H, 8.32# N, 18.52 b) (Pyr)Glu-Hia-Trp-Ser-Tyr-D-Va1-Leu-Arg-Pro-NH-CHg-CHg:n valmistus 1 ml:aan trifluorietikkahappoa liuotetaan 300 mg B0C-D-Val-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CHg-CEgja ja seosta ravistetaan 30 minuutin ajan huoneen lämpötilassa. Siihen lisätään 50 ml kuivaa eetteriä ja saatu valkea kiinteä aine otetaan talteen ja kuivataan alennetussa paineessa eksikaattorissa natrium-hydroksidin yläpuolella. Tämä aino liuotetaan 20 ml;aan 20-prosenttista metanolin vesiliuosta ja liuos johdetaan Amberlite IB-45- (vapaa muoto) pylvääseen (1x5 cm). Pylväs pestään samalla liuottimelle. Neste ja pesunesteet yhdistetään väkevöidään pieneen tilavuuteen ja lyofiloidaanj 165 mg. Tätä ainetta (150 mg) liuotetaan 2 ml:aan DMF:a ja samalla 168 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH:a ja 65 mg H0NB:a, ja seos jäähdytetään O °C:een. Siihen lisätään 75 mg DCC:a ja seosta sekoitetaan 2 tuntia 0 °C:ssa ja 12 tuntia huoneen lämpötilassa. Reaktioseos suodatetaan ja laimennetaan 50 ml:11a etyyliasetaattia. Saostuma otetaan talteen suodattamalla, kuivataan ja puhdistetaan pylväskromatografiällä piigeelillä (4 g). Eluoimiaeen käytetään 2

Rf -systeemiä. Fraktiot, jotka sisältävät suojatun nonapeptidin, yhdistetään ja liuotin haihdutetaan kuiviin: 140 mg. Tätä suojattua nonapeptidiä (110 mg) käsitellään 4 ml:11a vedetöntä fluorivetyö, kun läsnä on 0,1 cl anisolia ja 0,02 ml merkaptoetanolia, 0°C:ssa tunnin ajan. Fluorivety pois- 35 61028 tetaan alexmetuaaa paineeaaa ja jäännös uutetaan 20 ml:lla vettä· Uute pestään eetterillä ja saatetaan kulkemaan Amberlite IBA-400- (asetaatti-muoto) pylvään (1,5 x 3 cm) läpi ja pylväs pestään vedellä. Neste ja pesunesteet yhdistetään ja lyofiloidaan. Aine liuotetaan pieneen vesimäärään ja liuos johdetaan karboksimetyyliselluloosa-pylvääseen (1,2 x 30 cm)· Eluoimi-seen käytetään lineaarista asteittaista ammoniumssetaattia (0,005 II - 0,2 li, 150ml-150ml). Haluttu tuote saadaan 110 ml - 130 ml:n fraktioissa. Nämä fraktiot yhdistetään ja lyofiloidaan. Saalia 87 mg.

/£<7*1 2 -40.8° (c«0.5 5}ί vedettömässä etikkahaposaa), Bf1“0.12, Bf1»0*86

Aninobappoanalyysi (hydrolyysi 6N HCl:Ala, kun läsnä on tioglykolihappoa):

His 1.00} Arg 1.02) Trp 0.85; Ser 0.95) Glu 0.98} Pro 1.02) Vai 0.91| Leu 0.95) Tyr 1.00) etyyliamiini, 1.01.

Esimerkki 17 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Met—Leu-Arg-Pro-NH«*CH2“CB^·n ▼•l** »tus a) ΒΟβ-D-Uet-Leu-Arg(N0g)-Pro-NH-CH2-CH3:n valmistus BOC-D-ket—Leu—Arg(NO 2)-Pro—NH—CHg—CHg valmistetaan samalla tavalla kuin esimerkissä 16-a) on selostettu 623 mg:sta B0C-I>-Met-0H:a, 1,14 g:sta H—Leu— ABG(N02)-Pro-NH-CH_-CH :a, 537 mg:eta HONB:a ja 620 mg:sta DCC:a. Saalis 1,1 g) sulamispiste 125-130 C (hajoaa).

-51.5° (e»1.0 »etanolissa), Bf*« 0.59 Alkuaineenalyyso, C29H53°8N93 laskettu C, 50.64) H, 7.77) N, 18.32) S, 4.66 saatu C, 50.51) H, 7.52) N, 18.54) S, 4.30 b) (Pyr)Gliv-Hie-Trp-Sei>-Tyr-D-Met-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CHg:n valmistus ml:aan trifluorietikkahappoa liuotetaan 300 mg BOC-D-Uet-Leu-Arg(NO.)-Pro-NH—CHg—CHg:a ja seosta ravistetaan 20 minuutin ajan huoneen lämpötilassa. Siihen lisätään 40 ml kuivaa eetteriä ja saatu valkea saostuma otetaan talteen suodattamalla ja kuivataan. Tämä aine muutetaan vapaaseen muotoon 2 johtamalla se Amberlite IB-45- (vapaa muoto) pylvään (1x5 cm) läpi niinkuin 3 esimerkissä 16-b) on selostettu. Saatu osaksi suojattu tetrapeptidi, H-D-Met-Leu-Akg^OgJ-Pro-NH-CHg-CHg, (147 mg) saatetaan reagoimaan 171 mgjn kanssa (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH:a, kun läsnä on 67 mg HONBta, ja 77 mg 61028 3e i’CC: e, jolloin saadaan osaksi suojattu nonapeptidi» Tänä yhdiste puhdiste-+ B8D Amberlite XAD-2-pylväässä ja sitä käsitellään sitten SnClgaHgO:lla q 6C-prosenttisessa nuurahaishapon vesiliuoksessa 2 tunnin ajan 80-85 C:asa. Näin saatu lopullinen tuote puhdistetaan kromatograafisaati Amberlite XAD-2:lla ja karboksimetyyliselluloosalla · Kaikki nämä menetelmät ovat aa-saniaisia kuin esimerkissä 16-b) selostetut» Saalis 79 mg.

39.6° (c-0.5 5$t etikkahapon vesiliuoksessa), Rf**»0.16

Aminohappoanalyysi (hydrolyysi 6N HCl:lla kun läsnä on tioglykolihappoa)j His 1.02) Arg 1.00) Trp 0.90) Ser 0.89) Glu 1,00) Pro 1.00) Met 0.91) l>eu 0.98) Tyr 1.02) etyyliäniini, 1.00

Istmerkki 18 (PyrjGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ile-Leu-Arg-Pro-NH-CHg-CHgjn valmistus a) BOC-D-Ile-lieu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-Cllgin valmistus B0C&>Ile-Leu-Akg(N02)-Pro-NH-CH2-CBg valmistetaan samalla tavalla kuin esimerkissä 16-a) 579 mg:sta BOG-D-lle-OH:a, 1,14 g:ota H-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CHg-CBgta, 537 mg:sta HONBta ja 620 mg:sta DCC:a· Saalis 0,9 g) sulamispiste 127-131 °C (hajoaa).

AO Λ -48.3 (c-1.0 metanolissa)

Alkuaineanalyyso, Cg^gO^ laskettu C, 53.79) H, 8.27) N, 18.18 eestti Cp 53·81( Εψ 8*31} Ν$ 18·65 h) (Pyr)Glu-Hia-Trp—Ser-Tyr-D-Ile-teu-Arg-Pro-NH-CHg-CHgi® ▼almistus 3 ml:aan trifluorietikkahappoa liuotetaan 300 mg BOC-D-I1e-Leu-Arg-(NOgJ-Pro-NH-CHg-CHgSa ja seosta ravistetaan 25 minuutin ajan huoneen lämpötilassa. Siihen lisätään 40 ml kuivaa eetteriä ja syntynyt saostuma otetaan talteen suodattamalla ja kuivataan. Tämä aine muutetaan vapaaseen muotoon johtamalla se Amberlite IR-45- (vapaa muoto) pylvään (1x5 cm) läpi samoin kuin esimerkissä 16-b). Saatu osaksi suojattu tetrapeptidi, H-D-Ile—Leu-Arg(NOg)—Pro—NB-CHg-CHg, (142 mg) saatetaan reagoimaan 171 mg:n kanssa (Pyr)Glu-Hie-Trp-Ser-Tyr-OH:a, 67 mg:n kanssa H0NB:a ja 77 mg:n kanssa DCC:a, jolloin saadaan osaksi suojattu nonapeptidi. Tämä yhdiste puhdistetaan Amberlite XAD-2-pylväässä ja käsitellään sitten SnCL..Ho0:11a eo-^prosentti- H 6» sessa muurahaishapon vesiliuoksessa 2 tunnin aikana 80-85 °C:esa· Näin saatu 37 61 028 tuote puhdistetaan kromatograafisesti Amberlite XAD-2:lla ja karboksi-metyyliselluloosalla. Kaikki nämä menetelmät ovat samanlaisia kuin esimerkissä 16-b) selostetut. Saalis 93 mg.

/ -41,5° (c=0,5 5% etikkahapon vesiliuoksessa). Rf -0,13,

Rf3= 0,66.

Aminohappoanalyysi (hydrolyysi 6N HCl:lla, kun läsnä on tioglykoli-happoa): His 0,98; Arg 1,00; Trp 0,89; Ser 0,91; Glu 0,95; Pro 1,00;

Ile 1,00; Leu 1,00; Tyr 1,00; etyyliamiini, 1,01.

Esimerkki 19 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-CHg:n valmistus a) Z-D-Leu-Leu-ArgiNC^ ^Pro-NH-CH^:n valmistus 5 ml:aan 25%:ista bromivety-jääetikkaa liuotetaan 576 mg Z-Leu-ArgOiC^)-Pro-NH-CHg (M. Fujino et ai., Biochem. Biophys. Res. Commun., 49, 863(1972) ) ja seosta hämmennetään huoneenlämpötilassa 30 minuuttia. Liuokseen lisätään 30 ml kuivaa eetteriä ja muodostunut saostuma suodatetaan ja kuivataan alennetussa paineessa natrium-hydroksidin avulla eksikaattorissa. Näin saatu jauhe liuotetaan 5 mlraan DMF:a ja liuos neutraloidaan 0,15 ml:11a trietyyliamiinia ja jäähdytetään 0 °C:een. Liuokseen lisätään 265 mg Z-D-Leu-0H:a, 198 mg H0NB:a ja 217 mg DCC:a. Liuosta sekoitetaan 0 °C:ssa 3 tuntia ja sitten 10 tuntia huoneenlämpötilassa. Muodostunut disykloheksyyli-urea suodatetaan pois ja DMF tislataan pois alennetussa paineessa. Jäännös liuotetaan 30 ml:aan kloroformia ja liuos pestään 5%:isella natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja 1N suolahapolla. Pesty kloroformikerros kuivataan magnesiumsulfaatin avulla ja haihdutetaan kuiviin. Jäännös kierretään eetterin kanssa, jolloin saadaan jauhe, joka otetaan talteen suodattamalla. Saalis 594 mg, sp. 118...119 °C; /~a_7£6 -22,6° (c = 1 ,0 metanolissa).

Alkuaineanalyysi: C32H51°8N9 ‘ H2°

Laskettu C 54,29 H 7,54 N 17,81

Saatu C 53,98 H 7,56 N 17,55.

61 028 38 b) (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-CH^:n valmistus 5 ml:aan 25%:ista bromivety-jääetikkaa liuotetaan 500 mg Z-D-Leu-Leu-Arg-(NOji-Pro-NH-CHg ja seosta hämmennetään huoneenlämpötilassa 30 minuuttia. Liuokseen lisätään 40 ml kuivaa eetteriä ja muodostunut saostuma suodatetaan ja kuivataan alennetussa paineessa natriumhydroksidin avulla eksikaattorissa. Näin saatu jauhe liuotetaan 10 ml:aan 30%:ista metanolin vesiliuosta ja liuos johdetaan Amberlite IRA-410 pylvään (1,8 x 5 cm, vapaa muoto) läpi. Pylväs pestään 50 ml:lla vettä.

Eluaatti ja pesuneste yhdistetään ja haihdutetaan pieneen tilavuuteen, jonka jälkeen lyofiloimalla saadaan valkoinen jauhe. Tämä jauhe ja 503 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH:a ja 256 mg H0NB:a liuotetaan 10 ml:aan DMF:a. Liuos jäähdytetään -5 °C:een, jonka jälkeen lisätään 295 mg DCC:a. Seosta sekoitetaan -5 °C:ssa 5 tuntia ja tämän jälkeen 12 tuntia huoneenlämpötilassa. Reaktioseoksesta poistetaan muodostunut disykloheksyyli-urea suodattamalla ja lisätään 50 ml asetonitriiliä, jolloin saadaan saostuma, joka suodatetaan ja pestään hyvin aseto-nitriilillä. Saalis 760 mg.

Näin saatu jauhe liuotetaan 15ml:aan 60%:ista muurahaishappo-vesiliuosta yhdessä 1,5 g:n kanssa SnC^ia. Seosta sekoitetaan 80 °C:ssa 2 tuntia Muodostunut saostuma poistetaan suodattamalla ja suodos liuotetaan 5ml:aan vettä. Liuos johdetaan Amberlite XAD-2 pylvään (2x15 cm) läpi. Pylväs pestään vedellä ja absorboitunut aines eluoidaan.70%:isella etanolilla. Eluaatti haihdutetaan etanolin poistamiseksi ja vesipitoinen liuos johdetaan karboksimetyyliselluloosapylvääseen (3 x 20 cm). Pylväs eluoidaan asteittain (kerralla 400 ml: 0,005 M ammoniumasetaatti/ 0,15 M ammoniumasetaatti). Puhtaan tuotteen sisältävät fraktiot yhdistetään ja lyofiloidaan, jolloin saadaan 215 mg tuotetta.

ΟΠ Λ /~α_7ρ -33,2υ (c = 0,5 5%:ssa etikkahapossa)

Rf2 = 0,07, Rf3 = 0,56.

Aminohappoanalyysi: His: 0,98; Arg: 1,00; Trp: 0,86; Ser: 0,94;

Glu: 1,05; Pro: 1,02; Leu: 2,10; Tyr: 1,05 (peptidipitoisuus 86,0%).

Esimerkki 20 (Pyr^lu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C^-Ci^-CHg :n valmistus 61028 39 a) BOC-D-Leu-Leu-Arg(NC>2 J-Pro-NH-CHj-CI^-CHg : n valmistus 5 ml:aan 25%:ista bromivety-jääetikkaa liuotetaan 640 mg Z-Leu-ArgCNC^i-Pro-NH-Ci^ CHj-Cri^ ja seosta hämmennetään huoneenlämpötilassa 30 minuuttia. Liuokseen lisätään 40 ml kuivaa eetteriä ja muodostunut saostuma suodatetaan ja kuivataan alennetussa paineessa natriumhydrok-sidin avu}'a eksikaattorissa. Näin saatu jauhe liuotetaan 5 ml:aan DMF:a ja j.iuos neutraloidaan 0,15 ml:11a trietyyliamiinia ja jäähdytetään 0 °C:een. Liuokseen lisätään 231 mg B0C-D-Leu-0H:a, 200 mg H0NB:a ja 217 mg DCC:a. Liuosta sekoitetaan 0 °C:ssa 2 tuntia ja sitten huoneenlämpötilassa 10 tuntia. Muodostunut disykloheksyyli-urea suodatetaan pois ja DMF tislataan pois alennetussa paineessa. Jäännös liuotetaan 50 ml:aan kloroformia ja pestään 4%:isella natriumkarbonaatin vesiliuoksella ja 1N suolahapolla. Pesty kloroformikerros kuivataan magnesiumsulfaatin avulla ja haihdutetaan kuiviin. Jäännös hierretään eetterin kanssa, jolloin saadaan jauhe, joka otetaan talteen suodattamalla. Saalis 537 mg, sp. 122...123 °C; /~a_722 - 24,1° (c = 0,5 DMF:ssa); Rf1 = 0,44

Alkuaineanalyysi: C^H^OgNg . H20

Laskettu C 53,05, H 8,47, N 17,96,

Saatu C 53,09, H 8,27, N 18,31 b) (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH2“CH2:n valmistus 1 ml:aan trifluorietikkahappoon liuotetaan 444 mg BOC-D-Leu-Leu-ArgiNOjJ-Pro-NH-CHg-CHj'CHgia, ja seosta hämmennetään huoneenlämpö-tilassa 30 minuuttia. Liuokseen lisätään 40 ml kuivaa eetteriä ja muodostunut saostuma suodatetaan ja kuivataan alennetussa painessa natrium-hydroksidin avulla eksikaattorissa. Näin saatu jauhe liuotetaan 10 ml: aan 30%:ista metanolin vesiliuosta ja liuos johdetaan Amberlite IRA-410 pylvään (1,8 x 5 cm, vapaa muoto) läpi. Pylväs pestään 50 ml: 11a 30%:ista metanolia ja sitten vedellä. Eluaatti ja pesuneste yhdistetään ja haihdutetaan pieneen tilavuuteen, jonka jälkeen lyofiloimalla saadaan valkoinen jauhe. Tämä jauhe ja 457 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH ja 2 85 mg H0NB:a liuotetaan .10 ml:aan DMF:a. Seosta sekoitetaan -5 °C:ssa 4 tuntia ja sitten huoneenlämpötilassa 12.tuntia. Reaktio-seos laimennetaan 40 ml:11a etyyliasetaattia, jolloin muodostuu saostuma, joka suodatetaan ja pestään hyvin etyyliasetaatilla.

61028 «o Näin saatu jauhe liuotetaan 15 ml:aan 60%:ista muurahaishappo-vesiliuosta yhdessä 1,5 g:n kanssa SnC^^a. Seosta sekoitetaan 80 °C:ssa 2 tuntia. Muodostunut saostuma poistetaan suodattamalla ja suodos liuotetaan 5 mitään vettä. Liuos johdetaan Amberlite XAD-2 pylvään (2x15 cm) läpi. Pylväs pestään vedellä ja absorboitunut aines eluoi-daan 75%:isella etanolilla. Eluaatti haihdutetaan etanolin poistamiseksi ja jäännös liuotetaan 10 mitään 0,005 M ammoniumasetaattipuskuria (pH 6,8) ja liuos johdetaan karboksimetyyliselluloosapylvääseen (3x20 cm). Pylväs eluoidaan asteittain (kerralla 400 ml: 0,005 M ammonium-asetaatti/0,15 M ammoniumasetaatti). Puhtaan tuotteen sisältävät fraktiot yhdistetään ja lyofiloidaan, jolloin saadaan 242 mg tuotetta.

/ a 722 -35,0° (c = 0 5%tisessa etikkahapossa); Rf2 = 0,05,

Rf3'= 0,51.

Aminohappoanalyysit His 0,96; Argt 1,02; Trp 0,92; Ser 0,96;

Glu 1,00; Pro 1,00; Leu 2,04; Tyr 1,02 (peptidipitoisuus 88,1%).

Esimerkki 21 (Pyr^lu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Abu-Leu-Arg-Pro-NH-C^-CHj-OH:n valmistus a) Z-D-Abu-Leu-ArgiNC^J-Pro-NH-C^-C^-OHtn valmistus 5 mitään 25%:ista bromivety-jääetikkaa liuotetaan 607 mg Z-Leu-Arg-(NC>2)-Pro-NH-C^-C^-OH (M. Fujino et ai., Biochem. Biophys. Res. Commun., 4J_, 863(1 972) ) ja seosta hämmennetään huoneenlämpötilassa 30 minuuttia. Liuokseen lisätään 30 ml kuivaa eetteriä ja muodostunut saostuma suodatetaan ja kuivataan alennetussa paineessa natriumhydroksi-din avulla eksikaattorissa. Näin saatu jauhe liuotetaan 5 mitään DMFta ja liuos neutraloidaan 0,15 ml tila trietyyliamiinia ja jäähdytetään 0 °Cteen. Liuokseen lisätään 240 mg Z-D-Abu-OHta, 200 mg HONBta ja 219 mg DCCta. Liuosta sekoitetaan huoneenlämpötilassa 6 tuntia ja muodostunut disykloheksyyliurea poistetaan suodattamalla. Suodos haihdutetaan kuiviin ja jäännös liuotetaan 50 mitään kloroformia ja liuos pestään 5%tisella natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja 1N suolahapolla. Kloroformikerros kuivataan magnesiumsulfaatin avulla ja haihdutetaan kuiviin. Jäännös hierretään etyyliasetaatin ja eetterin seoksella (1:1), jolloin saadaan hieno jauhe, joka otetaan talteen suodattamalla. Saalis 495 mg tuotetta, sp. 113...116 °C (hajoaa); /‘a_722 -26,5 (c = 1,0 DMFtssa), Rf1 = 0,41.

61028 41

Alkuaineanalyysi C^H^gOgN^ . HgO

Laskettu C 52,45; H 7,24; N 17,76

Saatu C 52,26; H 7,35; N 17,58 b) (Pyr JGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Abu-Leu-Arg-Pro-NH-C^-C^-OH: n valmistus 5 ml:aan 25%:ista bromivety-jääetikkaa liuotetaan 440 mg Z-D-Abu-Leu-ArgCNC^i-Pro-NH-Ci^-Ci^OHja ja seosta hämmennetään huoneenlämpö-tilassa 30 minuuttia. Liuokseen lisätään 40 ml kuivaa eetteriä ja muodostunut saostuma suodatetaan ja kuivataan alennetussa paineessa natriumhydroksidin avulla eksikaattorissa. Näin saatu jauhe liuotetaan 10 ml:aan vettä ja liuos johdetaan Amberlite IRA-410 pylvään (1,5x 6 cm) läpi. Pylväs pestään 50 ml:11a vettä. Eluaatti ja pesuneste yhdistetään ja haihdutetaan pieneen tilavuuteen, jonka jälkeen lyofi-loimalla saadaan valkoinen jauhe. Tämä jauhe ja 457 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH:a ja 235 mg H0NB:a liuotetaan 10 ml:aan DMF:a. Liuos jäähdytetään -5 °C:een ja 268 mg DCC:a lisätään. Seosta sekoitetaan -5 °C:ssa 5 tuntia ja tämän jälkeen 12 tuntia huoneenlämpötilassa. Reaktioseoksesta poistetaan muodostunut disykloheksyyli-urea suodattamalla ja lisätään 60 ml etyyliasetaattia, jolloin saadaan saostuma, joka suodatetaan ja pestään etyyliasetaatilla.

Näin saatu jauhe liuotetaan 10 ml:aan fluorivetyä yhdessä 0,1 ml:n kanssa anisolia ja 0,05 ml:n kanssa merkaptoetanolia. Seosta sekoitetaan 0 °C:ssa 45 minuuttia. Reaktioseos haihdutetaan kuiviin ja jäännös liuotetaan 20 ml:aan vettä. Vesipitoinen liuos pestään 20 ml :11a eetteriä ja 20 ml:11a etyyliasetaattia. Pesty liuos johdetaan Amberlite IRA-41 0 (asetaattimuoto) pylvääseen (1 ,8 x 5 cm) ja pylväs pestään 60 ml :11a vettä. Eluaatti ja pesuneste yhdistetään ja lyofiloidaan, jolloin saadaan keltainen jauhe, joka liuotetaan 50 mitään 0,005 M ammoniumasetaattipuskuria (pH 6,8). Liuos johdetaan karboksimetyyli-selluloosapylvääseen (3x 20 cm) ja pylväs eluoidaan asteittain ammonium-asetaattipuskurilla (400 ml kerralla; 0,005 M/0,15 M). Puhtaan tuotteen sisältävät fraktiot yhdistetään ja lyofiloidaan, jolloin saadaan 283 mg tuotetta.

/ a_7p2 -32,5° (c = 0*5 5%:isessa etikkahapossa); Rf^ = 0,06,

Rf3 = 0,48.

Aminohappoanalyysi His 0,98; Arg 0,98; Trp 0,91; Ser 0,97;

Glu 0,98; Pro 1,02; Abu 1,02; Leu 1,00; Tyr 1,00 (peptidi-pitoisuus 82,4%).