NO143218B

NO143218B - Analogifremgangsmaate til fremstilling av nonapeptidamider med lh-rh aktivitet

Info

Publication number: NO143218B
Application number: NO743538A
Authority: NO
Inventors: Masahiko Fujino; Tsunehiko Fukuda; Susumu Shinagawa
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1973-09-29
Filing date: 1974-09-30
Publication date: 1980-09-22
Also published as: SE420717B; FI61028B; FR2245375A1; NL930015I2; NO143218C; NO1994010I1; GB1434694A; CS180644B2; FI61028C; NL179289B; DE2446005A1; NO743538L; SE7412140L; US4008209A; FI284774A; HU173783B; ES430495A1; BE820451A; DK510374A; CA1027114A

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av nye nonapeptidamidderivater med sterk eggløsende virkning, og som har formelen:

(Pyr) Glu-His-Trp-Ser-^-^-^-Arg-Pro-NH-^ (I)

hvor betegner Tyr eller Phe, R2 betegner D-Leu, D-Ile, D-Nle, D-Val, D-Nva, D-Abu, ct-Aibu, D-Phe, D-Phg, D-Ser, D-Thr eller D-Met, R3 er Leu, Ile eller Nie og R^ er alkyl med 1 til 3 karbonatomer, eventuelt substituert med hydroksyl.

De angitte aminosyrer og peptider er gitt forkortelser

som er vanlige på området eller som er foreslått av "Committee on Biochemical Nomenclature of IUPAC-IUB". Aminosyrene er i L-konfigurasjon hvis intet annet er angitt.

De følgende forkortelser brukes, f.eks.:

Abu- CC-Aminosmørsyre .

a-Aibu:a-Aminoi sosmørsyre.

Arg: Arginin0

BOC: t-Butoksykarbonyl.

Bzl: Benzyl»

DCC: N, N1-Dicykloheksylkarbodiimid.

Gly: Glyein.

His: Histidin.

HONB: N-Hydroksy-5-norbornen-2,3-dikarboksimid.

HOSu: N-Hydroksysuccinimid.

IBOC: Isobornyloksykarbonyl.

Ile: Isoleukin,

Leu: Lukin,

Nie: Norleukin,

Nva: Norvalin.

Met: Metionin.

OMe: Metylester,

OBzl: Benzylester„

ONB: N-Hydroksy-5-norbornen-2,3-dikarboksimidester.

OSu: N-Hydroksysuc cinimide s ter.

Phe: Fenylalanin,

" Phg: a-Fenylglycin.

Pro: Prolin,

(Pyr) Glu: Pyrog^lutarninsyre...

Ser: Serin.

Thr: treonin.

To s: To syl.

Trp: Tryptofan.

Tyr: Tyrosin.

Val: Valin.

Z : Benzyloksykarbonyl.

Ovenstående substituent R h kan inneholde en forgrenet alkylgruppe med 1-3 C-atomer som kan være substituert med en hydroksylgruppe, f.eks. metyl, etyl, n-propyl, i-propyl, hydroksymetyl, 1-hydroksyetyl, 2-hydroksyetyl, 2-hydroksy-n-propyl, 3-hydroksy-n-propyl, 2,2-dihydroksy-i-propyl eller lignende.

Man har visst i mange år'at hypothalamus inneholder faktorer. som på et høyere nivå regulerer sekresjonen av tropiske hormoner fra hypofysen. I det siste har man, etter isolering av det tyrotropin-frigivende hormon (TRH), ekstrahert et hormon som befordrer utskilling av luteiniseringshormon, i ren form fra griser og sauer, og vist at hormonet er et dekapeptid med strukturen: (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2.

(A.V. Schally et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. , V}, 133'+

(1971) : R.Guillemin et al, Proe. Nat. Acad. Sei, USA, 69_, 278

(1972) ). Denne oppdagelse er fulgt av syntesen av en rekke lignende peptider, og biologiske forsøk har vært utført på disse analoge peptider. Selv en liten forandring i ovenstående aminosyre-sammen-setning nedsetter imidlertid i høy grad peptidets fysiologiske virkning, og man har antatt at ovenstående kjemiske struktur er essensiell for oppnåelse av maksimal fys±o3.oglsk aktivitet.

(A.V, Schally et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., ^t_, 366

(1972)).

Under disse forhold har man lykkes i å syntetisere nonapeptidamidderivatene (I) og har overraskende funnet at disse forbindelser har en kraftigere eggløsende virkning enn det naturlige dekapeptid. Man har også funnet at forbindelsene har virkning på hypofysen for befordring av utskilling av både luteiniserende hormon og foliikel-stimulerende hormon. Vicfere har oppfinnerne funnet at forbindelsene er nyttige, ikke bare som legemidler for mennekser, f.eks. legemidler for diagnose av hyposefunksjonen eller gonodatropin-defekter og behandling av amenorrhea, men også som veterinær-preparater, særlig for oppdrett av dyr.

Det er således en hovedhensikt ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe nye nonapeptidamidderivater (I) som har sterk eggløsende virkning.

Ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles således nonapeptidamidderivater med LH-RH-aktivitet og med formelen:

(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-R1~R2-R3-Arg-Pro-NH-R4

hvor R^j^ er Tyr eller Phe, R2 betegner D-Leu, D-Ile, D-Nle, D-Val D-Nva, D-Abu, a-Aibu, D-Phe, D-Phg, D-Ser, D-Thr eller D-Met,

R3 er Leu, Ile eller Nie og R4 betegner alkyl med 1-3 karbonatomer, som eventuelt er substituert med hydroksyl, og denne fremgangsmåte er kjennetegnet ved at en reagens (A) som er L-pyroglutaminsyre eller en forbindelse som helt eller delvis omfatter ovennevnte aminosyrefrekvens hvortil dennes terminale N-atom er bundet en L-pyroglutaminsyreenhet (dvs. (Pyr)Glu-), med en reagens (B) som er et amin tilsvarende resten av ovennevnte nonapeptid-amidderivat.

Grunnleggende kombinasjoner av reagens (A) og reagens (B)

er oppført som eksempler i følgende tabell 1.

Man har også kjent til at en beskyttet L-glutamylgruppe med generell formel (II): (hvor Rr betegner en alkoksygruppe (f.eks. metoksy, etoksy, n-propoksy, i-propoksy, n-butoksy, etc), en aralkyloksygruppe (f.eks. benzyloksy, etc.) eller amino), lett omdannes til L-pyroglutamylgruppen selv: ved kontakt med en base (f.eks. ammoniakk etc.) eller en syre (f.eks. eddiksyre etc.), og at gruppen (il) er ekvivalent til L-pyroglutamylgruppen selv på dette punkt. Ved fremgangsmåten

i henhold til foreliggende oppfinnelse skal L-pyroglutamyl(dvs.

(Pyr)Glu-) tilhørende reagens (A) omfatte ikke bare L-pyroglutamylgruppen selv, men også den beskyttede L-glutamylgruppen med formel (il) . Når (Pyr)Glu- i reagens (A.) representerer gruppen (il), kan gruppen (il) lett omdannes til L-pyroglutamylgruppen selv i henhold til kjente metoder.

Kondensasjonsreaksjonen i henhold til oppfinnelsen kan skje ved hjelp av de kjente metoder for kondensasjon under dannelse av peptidbindinger. Blandt disse kondensasjonsmetoder finnes DCC/ HONB-metoden (belgisk patent nr. 796.399» azidmetoden, klorid-metoden, syreanhydridmetoden, metoden med blandede anhydrider, DCC-metoden, metoden med aktive estere, Woodward-reagens-K-metoden, karbodiimidazolmetoden, oksydasjons-reduksjons-metoden og andre (The Peptides, bind 1 (1966), Schroder and Lubke, Academic Press, New York, USA).

Forut for kondensasjonsreaksjonen, kan man beskytte karboksyl- og aminogruppene som ikke skal inngå i reaksjonen, eller aktivere karboksyl- eller aminogruppene, som skal delta i reaksjonen, på

i og for seg kjente måter. Karboksylgruppene i utgangsstoffet kan beskyttes i form av metallsalter (f.eks. natrium- og kalium-salter) eller som estere (f.eks. metyl, etyl, b«nzyl, p-nitro-benzyl, t-butyl eller t-amylestere).

Beskyttelsesgrupper for aminogruppene i utgangsstoffene kan være hvilke som helst vanlige beskyttelsesgrupper for aminogrupper til peptidsyntese, f.eks. benzyloksykarbonyl, t-butoksykarbonyl, isobornyloksykarbonyl etc. Hydroksylgruppene i serin kan beskyttes med en vanlig beskyttelsesgruppe som benzyl, t-butyl eller andxe eterdannende grupper. Hydroksylgruppen i tyrosin kan beskyttes med benzyl-, t-butyl eller andre eterdannende grupper, guanidin-gruppen i arginin kan beskyttes med f.eks. nitro, tosyl, karbo-benzoksy, isobornyloksykarbonyl eller adamantyloksykarbonyl. Eksempler på aktiverte karboksylgrupper i utgangsstoffer kan være tilsvarende syreanhydrider, azider, aktive estere (estere med alkoholer (eksempelvis pentaklorfenol, 2, k,5-triklorfenyl, 2,4-dinitrofenyl, cyanometylalkohol, p-nitrofenol, N-hydroksy-5-nor-bornen-2,3-dikarboksimid, N-hydroksysuccinimid, N-hydroksyftalimid eller N-hydroksybenztriazol), etc. De aktiverte aminogrupper i utgangsstoffene kan f.eks. være de tilsvarende fosforsyreamider. Den følgende tabell viser en del eksempler på kombinasjoner av slike former av karboksyl- og aminogrupper i forbindelsene (a) og

(B).

(Bemerk) I eksemplet betegnet med <*>, tilsettes fortrinnsvis' et dehydratiseringsmiddel (f.eks. karbodiimidreagens som dicyklo-heksyl-karbodiimid) til reaksjonssystemet. En mulig praktisk utførelse av oppfinnelsen kan skrives som følger:

Denne reaksjon kan foretas i nærvær av et oppløsningsmiddel. Oppløsningsmidlet kan velges blandt slike som er kjent for peptid-kondensasjoner. Således f.eks. vandig eller vannfritt dimetylformamid, dimetylsulfoksyd, pyridin, kloroform, dioksan, diklormetan, tetrahydrofuran eller egnede blandinger av disse.

Reaksjonstemperaturen velges innenfor det område som er kjent for reaksjoner som fører til peptidbindinger, dvs. normalt mellom ca. -20 og 30°C. Videre kan utgangsstoffene (beskyttede peptider) for de aktuelle forbindelser ifølge oppfinnelsen lettvint fremstilles ved syntese i fast fase.

Etter avsluttet kondensasjonsreaksjon kan beskyttelsesgruppene fjernes ved hjelp av rutinemetoder, hvis slike finnes. Blandt disse rutinemetoder er katalytisk reduksjon i næarvær av katalysator som palladiumsvart, palladium-kull, platina eller lignende, solvo-lyse med hydrogenfluorld, trifluoreddiksyre eller lignende, og reduksjon med metallisk natrium i flytende ammoniakk.

Peptidet (i) som således fremstilles kan opparbeides fra reaksjonsblandingen som kjent for opparbeidelse av peptider,

f.eks. ved ekstraksjon, oppløsningsmiddelfordeling, kolonnekrorna to-grafi- etc i

Peptidet (i) kan også utvinnes i fortn av et salt eller en metallkompleks-forblndelse.

Eksempler på syrer som kan danne salter med peptidene (i)

er uorganiske syrer som saltsyre, hydrogenbromsyre, perklorsyre, salpetersyre, tiocyansyre, svovelsyre, fosforsyre etc. og organiske syrer som maursyre, eddiksyre, propionsyre, glykolsyre, melkesyre, druesyre, oksalsyre, malonsyre, ravsyre, maleinsyre, fumarsyre, antranilsyre, kanelsyre, naftalensulfonsyre eller sulfanilsyre.

Metaller som kan danne metallkomplekser med peptidet (i) omfatter bl.a, sink, nikkel, kobolt, kopper og jern. Slike metall-kompleksforbindelser kan fremstilles på vanlig måte, f.eks. ved å omsette peptidet (i) med et hydroksyd eller oksyd av et metall blandt ovennevnte ved en pH på ca. 6 til 8.

Polypeptidene (I) har LH-RH-aktivitet (luteinizing

hormone releasing hormone) og er følgelig i stand til å befordre utskilling av LH (luteniserende hormon) bg FSH (folikkelstimu-

lerende hormon). Derfor brukes polypeptidene (I) som legemidler for befordring av eggløsning hos kvinner og hos dyr (f.eks. rotter, kuer, svin, marsvin, høner eller vaktler). Peptidene kan også brukes for andre farmasøytiske formål hvortil vanlige LH-RH, LH og FSH-preparater har vært brukt.

Siden LH-RH-aktiviteten for polypeptidene (i) er ca. 5 til 60 ganger aktiviteten for kjente naturlige LH-RH, kan doseringen fast-legges for hvert bruksområde på basis av ovenstående mulitiplikasjons-faktor i lys av andre faktorer som kan være aktuelle (f.ekse. dyret eller pasienten som behandles og sykdommens art). F.eks. kan en passende dose være mellom ca. 2 g og 2 jjg daglig pr. kg kroppsvekt.

Polypeptider (i) gis hovedsakelig non-oralt (dvs. ved injeksjon eller rektalt eller vaginalt), selv om de kan gis oralt i visse tilfelle.

Doseringsformene kan f.eks. være injeksjoner, suppositorier, pessarer og pulvere. Injeksjonsoppløsningene kan fremstilles ved å oppløse ca. 10 J til 100 " f polypeptid (i) i 1 ml fysiologisk saltvann. Polypeptidene (i) kan også fremstilles som frysetørkede ampuller med mannitol som drøynlngsmiddel, slik at forbindelsene kan injiseres etter behov.

Utgangs-peptidene som benyttes i henhold til oppfinnelsens fremgangsmåte kan fremstilles enten etter kjente metoder for peptidsyntese eller ved å ta i bruk andre metoder som finnes hensiktsmessige.

Oppfinnelsen skal illustreres ytterligere ved hjelp av

de nedenstående eksempler, hvor de følgende forkortelser med hensyn på Rf-verdien angir resultater av tynnsjiktkrbmatografering på silikagel med følgende solventsystemer:

Rf"*": Kloroform - metanol - eddiksyre, 9:1:0,5

Rf 2: Etylacetat - pyridin - eddiksyre - vann, 30:10:3:5

Rf 3: n-butanol - etylacetat - eddiksyre - vann, 1:1:1:1

Det benyttes følgende varemerker på forskjellige produkter: "Biogel P-2" : Stoffer for gelfiltrering

"Sephadex LH-20^ Forestret dekstrangel

"Amberlite XAD-2": Polystyrenharpiks.

"Amberlite kJ. R~ k5" : Svakt basisk ionevekslerharpiks .

"Amberlite IRA-410": Sterkt basisk ionevekslerharpiks. "Amberlite CG-410": Sterkt basisk anionvekslerharpiks.

"Amberlite CG-45: Svakt basisk anionutvekslerharpiks.

Eksempel 1.

Fremstilling av (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Arg-Pro-NH-CHgCH^.

a) Fremstilling av Z-D-Leu-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-GH^.

I 50 ml diklormetan oppløses 1,58 g Z-D-Leu-0H(olje) og

1,2 g HONB, hvorpå man tilsetter 2,8 g H-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH^. Blandingen avkjøles til 0°C, hvorpå man tilsetter l, k g DCC, blandingen røres ved romtemperatur i 8 timer. Biproduktet Dicykloheksylurea frafiltreres, og filtratet inndampes til tørrhet xinder nedsatt trykk. Residuet oppløses i 150 ml etylacetat, vaskes med k #-ig vandig oppløsning av natriumhydrogenkarbonat to ganger, og to ganger med vann, tørkes over natriumsulfat og konsentreres til tørrhet under nedsatt trykk. Inndampningsresten utfelles pånytt fra etylacetat-petroleumseter. Den angitte fremgangsmåten gis 3,6 g forbindelse med smeltepunkt 13'4pC, (dekomp. ) . (a)<2>5-^7;3°(c=0,5^ i metanol), Rf<1>=0,57. Elementæranalyse for <C>33^53°8<N>9<:>

Beregnet: C, 56,31, H,75? N, 17,91

Funnet: C, 56,08, H, 7,82, N, 17,69 b) Fremstilling av(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg(N00)-Pro-NH-CH2-CH3.

I 30 ml 25 $-ig hydrogenbromid-iseddik, oppløses 3,6 g Z-D-Leu-Leu-Arg(NOg)-Pro-NH-CH^-CH^ og oppløsningen ristes ved romtemperatur i 50 minutter. Til oppløsningen settes 300 ml eter og fellingen frafiltreres. Etter tørking oppløses fellingen i 50 ml vann og påsettes en kolonne (2,5 x 20 cm) inneholdende "Amberlite CG-410" (fri base) . Kolonnen vaskes grundig med 30 $-ig vandig metanol. Effluatet og vaskevæskene slås sammen og konsentreres under nedsatt trykk for å fjerne metanolen, hvorpå man frysetørker blandingen. Fremgangsmåten gir 3,1 S fri base H-D-Leu-Leu-Arg (NO,,)-Pro-NH-CH„-CH„.

2 T ^3

Rf =0,24, Rf-=0,68. I 4 ml dimetylformamid oppløses 228 mg

av ovenstående produkt og 290 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH,

hvorpå man tilsetter l44 mg HONB. Blandingen avkjøles til -10°C

og 90 mg DCC tilsettes. Det hele røres ved -10°C i 2 timer, ved 0°C i 4 timer og ved romtemperatur i 4 timer. Reaksjonsblandingen filtreres for å fjerne dicykloheksylurea.

Etter tilsetning av etylacetat til filtratet, frafiltreres fellingen. Fellingen tørkes og oppløses i 20 $-ig vandig etanol. Oppløsningen fylles på en kolonne av "Amberlite XAD-2" (200 mesh, 3x20 cm) og man gjennomfører en gradienteluering med 20 $-ig etanol og absolutt etanol (300 ml hver).

Produktet elueres i fraksjonene fra 260 til 360 ml. Disse fraksjoner konsetreres under nedsatt trykk og frysetørkes. Man får 3^6 mg ønsket produkt,

/"a_7p<5->38,28°C (c=0,l i 0,5 #-ig metanol), Rf<2> = 0,235, Rf<3> = 0,765. c) Fremstilling av (Pyr) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-CR^-CH^.

I 20 ml 60 $-ig vandig maursyre oppløses 300 mg N02-forbindel ser fremstilt under (b), fulgt av 600 mg SnClg.HgO. Blandingen oppvarmes ved 80-85°C i 2 timer og konsentreres til tørrhet under nedsatt trykk. Residuet ekstraheres med 50 ml varmt vann (80°C). Ekstraktet filtreres og filtratet fylles på en kolonne (3X20 cm) inneholdende "Amberlite XAD-2" (200 mesh). Etter vasking med vann, gradient-elueres med vann og absolutt etanol (400ml av hver). Produktet går ut med fraksjonene 150 tnl - 260 ml. Disse fraksjoner slås sammen og konsentreres under nedsatt trykk for å fjerne etanolen, Konsentratet fylles på en kolonne (2 x 33 cm) av karboksy-metyl-cellulose og man gradient-eluerer med 0,003 M til 0,2 M ammoniumacetat (pH 6,8). Peptidet kommer ut med 330 ml - 520 ml-fraksjonene. Disse fraksjoner slås sammen og frysetørres til 282 mg hvitt, voluminøst pulver. - <X-^^~ 32,66° (c = 0,5^5 i 5 #-ig vandig eddiksyre) , Rf<2> = 0,10, Rf<3> =0,75.

Aminosyreanalyse (hydrolyse med 6 N HC1 i nærvær av tioglykolsyre):- His 1,00, Arg 0,96, Trp 0,96, Ser 1,00, Glu 1,00, Pro 1,04, Leu 2,00, Tyr 1,00.

Eksempel 2.

Fremstilling av (Pyr) Glu- His-Trp-Ser-Tyr-a-Aibu-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH^.

a) Fremstilling av Z-a-Aibu-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CHg-CH^.

117 ml dimetylformamid oppløses 0,6 g Z-a-Aibu-OH og

0,9 g H-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH^. Oppløsningen avkjøles til 0°C og 0,71 S l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid, et vannoppløselig karbodiimid, tilsettes, hvoretter' man rører i 12 timer. Oppløsningsmidlet avdestilleres og inndampningsresten opp-løses i 100 ml kloroform. Oppløsningen vaskes med k $-ig natriumhydrogenkarbonat og IN-saltsyre, skylles med vann og tørkes over magnesiumsulfat. Oppløsningsmidlet avdestilleres under nedsatt trykk og residuet behandles med eter til et pulver som frafiltreres. Pulveret utfelles på nytt fra etylacetat-eter og man får 4-73 mg aktuell forbindelse. Smeltepunkt: 10'+-107°C.

/~a_72<4>= -<;>+5,8°C (c=0,55 i DMF). Rf<1>=0,50.

Elementæranalyse, C^H^Q<OgN>^<->g- HgO

Beregnet: C 5^,28, H . 7,50, N 18,38.

Funnet: C 5^,32, H 7,32, N 17,97. b) Fremstilling av BOC-Tyr(Bzl)-a-Aibu-Leu-Arg (N09)-Pro-NH-CH2-CH3.

I 3 ml 25 $-ig hydrogenbromid-iseddik oppløses ^23 mg Z-a-Aibu-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH^ og blandingen ristes ved romtemperatur i ko minutter, hvorpå man tilsetter 50 ml tørr eter. Fellingen frafiltreres og torkes under nedsatt trykk over natriumhydroksyd i eksikator. Pulveret oppløses i 3 ml DMF og oppløs-ningen nøytraliseres med 0,24 ml N-etylmorfolin og avkjøles til 0°C. Derpå tilsettes 557 mg BOC-Tyr (Bzl)-OH og 298 mg HONB til oppløsningen, hvorpå man tilsetter 280 mg DCC. Blandingen røres ved romtemperatur i 6 dager. Dicykloheksylurea frafiltreres og DMF avdestilleres under nedsatt trykk» Residuet oppløses i 100 ml kloroform, vaskes med lN-saltsyre og 4 #~ig natriumhydrogenkarbonat, skylles med vann og tørkes over magnesiumsulfat, hvorpå man konsentrerer til tørrhet under nedsatt trykk. Inndampningsresten krystalliseres fra etylacetat og gir 275 mg, smeltepunkt: 127-129°C.

/~<X_7D = -27,6° (c=0,54 i DMF), Rf =0,60.

El ementaeranalyse : C^^H^^,010N10. HgO

Beregnet: C 57,82, H 7,6l, N 15,32.

Funnet: C 58,32, H 7,51, N 15,10. c) Fremstilling av BOC-Ser-Tyr (Bzl)~a-Aibu-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CHg-CH^.

1 3 ml trifluoreddiksyre inneholdende 0,1 ml anisol

oppløses 250 mg B0C-Tyr-(Bzl)-a-Aibu-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-

CH^ og oppløsningen ristes ved romtemperatur i 30 minutter.

Man tilsetter 30 ml tørr eter og fellingen frafiltreres og

tørkes. Pulveret oppløses i 5 ml DMF og oppløsningen nøytrali-seres med 0,08 ml N-etylmorfolin. Derpå tilsettes 150 mg BOC-Ser triklorfenylester og oppløsningen røres i 2 dager. DMF-oppløsnings-midlet avdestilleres og residuet behandles med eter for utfelling av et pulver. Pulveret utvinnes ved filtrering og utfelles to ganger fra etylacetat. Utbytte 100 mg, smeltepunkt: l40-l42°C (dekomp,), /~<x_7o5=~34,8° (c=0,44 i DMF), Rf<1> = 0,74.

El ementaeranalyse for CZ1.7H72012N11 * 3H20

Beregnet: C 54,43, H 7,58, N l4,84.

Funnet: C 54,66, H 7,45, N 14,91. d) Fremstilling av (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-a-Aibu-Leu-Arg-Pro-NH-CHg-CH^.

I 3 ml trifluoreddiksyre som inneholder 0,1 ml anisol opp-løses 77 mg B0C-Ser-Tyr(Bzl)-a-Aibu-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH^

og oppløsningen røres ved romtemperatur i 30 minutter. Man tilsetter 30 ml tørr eter og fellingen frafiltreres og tørkes. Pulveret oppløses i 3 ml DMF og oppløsningen nøytraliseres med

0,21 ml 10 $-ig oppløsning av en 10 $-ig oppløsning av N-etylmorfolin i DMF. Til dette settes 37 mg krystaller av (Pyr)Glu-

His-Trp-OH og blandingen avkjøles til -10°C, hvorpå man tilsetter 21 mg HONB og 30 mg DCC. Blandingen røres ved 0°C i 12 timer. Dicykloheksylurea filtreres fra og filtratet konsentreres til tørrhet under nedsatt trykk. Residuet oppløses i 20 $ etanol og adsorberes på en kolonne (l x 10 cm) "Amberlite XAD-2". Man eluderer ved gradientmetoden med 20 $-ig og opptil absolutt etanol (200 ml av hver). De fraksjoner som inneholder mye av den aktuelle forbindelsen, hvilket svarer til et konsentrasjonsområde av etanol fra 40 - 70 $, slås sammen, inndampes under nedsatt trykk og fryse-tørkes. Prosessen gir 30 mg beskyttet nonapeptid (Rf 2= 0,3l). Med tilsetning av 0,1 ml anisol og 0,1 ml merkaptoetanol behandles dette beskyttede nonapeptid med 3 ml vannfritt hydrogenfluorid og blandingen røres ved 0°C i 60 minutter. Hydrogenfluoridet avdestilleres under nedsatt trykk og residuet oppløses i 10 ml vann. Oppløsningen ekstraheres tre ganger med 2 ml eter og vann-sjiktene slås sammen og fylles på en kolonne (2x4 cm)

av "Amberlite CG-410" (acetatform) , Som vaskes med vann. Eluatet og de vandige vaskevæsker slås sammen og fylles på en kolonne av karboksymetylcellulose og en kolonne "Amberlite XAD-2", som beskrevet i eksempel 1.

Etter frysetørking fikk man l4 mg av et hvitt lett pulver.

~ tt"^D7 ~ 5^' lQ (c=°»31 i 5 #-ig vandig eddiksyre):Rf<2>=0,099,

Rf<3>= 0,715.

Aminosyreanalyse (hydrolyse med 6N HC1. i nærvær av tioglykolsyre): His 0,94, Arg 0,97, Trp 0,81, Ser 1,06, Glu 0,97,

Pro 0,97, Leu 1,103, Tyr 1,03, a-Aibu 1,00.

Eksempel 3.

Fremstilling av (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-CHg-CH^.

a) Fremstilling av (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-OH.

I 100 ml metanol oppløses 4,0 g Z-Ser-Phe-OMe som reduseres

ved atmosfæretrykk med 500 ml palladiumsvart som katalysator i 1,5 time. Katalysatoren filtreres fra og metanolen avdestilleres umiddelbart under nedsatt trykk. Residuet oppløses i 25 ml DMF og 4,1 g krystaller av (Pyr)Glu-His-Trp-OH tilsettes. Blandingen avkjøles til -5°C, fulgt av tilsetning av 3,8 g HONB og 3 g DCC. Blandingen røres ved -5°C i 2 timer, ved 0°C i 2 timer og

deretter ved romtemperatur i 8 timer. Biproduktet dicykloheksylurea filtreres fra og filtratet inndampes til tørrhet under ned-

satt trykk. Residuet behandles med etylacetat og pulveret filtreres fra (6,7 g) . Dette pulver oppløses i 30 ml 15 $ >- ±g metanol-kloroform og oppløsningen fylles på en kolonne (6x12 cm) silikagel preparert med 15 % metanol-kloroform.

Man eluerer med 600 ml 15 #-ig metanolkloroform, 1 1 25 #-ig metanol-kloroform og 1 1 30 #-ig metanolkloroform. Fraksjonene mellom 400 ml 25 #-ig metanolkloroform og 700 ml 30 #-ig metanol-klorof orm slås sammen og inndampes til tørrhet under nedsatt trykk. Residuet behandles med etylacetat og pulveret frafiltreres. Prosessen gir 4,2 g av den aktuelle forbindelsen. Rf 2= 0,29.

I 20 ml metanol suspenderes 3,5 g av metylesteren og ved

0°C tilsettes 8 ml IN natriumhydroksyd. Denne blanding røres i 1 time, hvoretter den nøytraliseres med 8 ml lN-saltsyre. Metanolen avdestilleres under nedsatt trykk og 20 ml kaldt vann tilsettes. Fellingen filtreres fra, vaskes med kaldt vann og deretter med etanol-eter (4:6), og tørkes. Dette gir 2,32 g av den aktuelle forbindelse.

/ a_ 726, 5 _3>3o (c = Q>55 ± iseddik) Rf<3> 0>6l

b) Fremstilling av (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-CHg-CH^.

I 4 ml DMF oppløses 290 mg (Pyr) Glu-His-Trp-Ser-Phe-OH og 228 mg H-D-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3, hvorpå man tilsetter 140 mg HONB. Blandingen avkjøles til -10°C, hvorpå 90 mg DCC tilsettes. Denne blanding røres ved -10°C i 2 timer, ved 0°C i 3 timer og til slutt i 5 timer ved romtemperatur.

På nøyaktig den samme måten som i eksempel 1 underkastes denne reaksjonsblanding kolonnekromatografi på "Amberlite XAD-2". Prosessen gir 342 mg av den aktuelle forbindelsen.

C<0>. 7 - 41,74° (c = 0,115 i metanol), Rf2 = 0,265, Rf3 = 0,78.

I 20 ml av en 60 $-ig vandig oppløsning av maursyre oppløses 300 mg av ovenstående produkt, fulgt av tilsetning av 600 mg SnCl2>H20. Blandingen hensettes ve.d 80-85°C i 2 timer, hvorpå

den inndampes til tørrhet under nedsatt trykk. På nøyaktig samme måten som i eksempel 1 renses konsentratet på en kolonne av "Amberlite XAD-2" og på karboksymetylcellulose. Fremgangsmåten gir 211 mg av et hvitt, lett pulver.

~ a~^D4 ~ 38,49° (c=0,53, i 5 #-ig vandig eddiksyre); Rf<2> 0,12, Rf<3> = 0,74.

Aminosyreanalyse (hydrolyse med 6 N HC1 i nærvær av tioglykolsyre): His 1,00, Arg l, 0k, Trp 0,98, Ser 0,92, Glu 1,00, Pro 1,00,

Leu 1,04, Phe 1,00, Tyr 0,98.

Eksemp el 4.

Fremstilling av (Pyr) Glu- His-Trp-Ser-Tyr-D-Phg-Leu-Arg-Pro-NH-CHgCH^o

a) Fremstilling av Z-D-Phg-Leu-Arg (N02)-Pro-NH-CH2-CH,}

I en blanding av 10 ml dimetylformamid og 20 ml diklormetan

oppløses 580 mg Z-D-Phg-0H og l,l4 g H-Leu-Arg (N09)-Pro-NH-CH2-CH3.

Til blandingen settes 400 mg HONB og under isavkjøling 500 mg DCC. Blandingen røres ved romtemperatur i 4 timer. Bip:roduktet dicykloheksylurea filtreres fra og filtratet inndampes til tørrhet. Residuet oppløses i 100 ml etylacetat. Oppløsningen vaskes med 4 i<>- ±g natriumhydrogenkarbonat og varm, tørkes over natriumsulfat og destilleres for inndampning av etylacetat. Residuet utfelles på nytt fra etylacetat-petroleter og man får 1,4 g pulver,

Rf<1> = 0,65, Rf<2> = 0,83.

a_725 _ 80f2° (c=0,5 i metanol).

b) Fremstilling av (Pyr) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phg-Leu-Arg-Pro-NH-CHg-CH^.

I 20 ml eddiksyre oppløses 150 ml Z-D-Phg-Leu-Arg (NQ,)-Pro-CH^j-CH^. Med tilsetning av 100 mg palladiumsvart, bobles hydrogen-gass gjennom oppløsningen ved atmosfæretrykk for å redusere forbindelsen.

Etter 4 timer filtreres katalysatoren fra og 0,4 ml 1N-saltsyre settes til. Oppløsningen konsentreres til tørrhet under nedsatt trykk og konsentratet oppløses i 20 rnl vann og frysetørkes. Det dannede pulver oppløses i 8 ml dimetylformamid, og 0,25 ml 10 $-ig oppløsning av N-etylmorfolin i dimetylformamid tilsettes, dråpevis. Derpå setter man til l4l mg (Pyr)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH, og 50 mg 1-hydroksybenzotriazol og endelig 40 mg DCC ved -5°C.

Blandingen røres ved -5 o C i 2 timer, ved 0 oC i 2 timer og

ved romtemperatur i 8 timer. Man tilsetter eter til reaksjonsblandingen og fellingen utvinnes ved filtrering samt oppløses i 20 ml vann. De uoppløselige stoffene filtreres fra og filtratet kjøres gjennom en kolonne av "Amberlite IRA-410" (acetatform) , som derpå vaskes med vann. Eluatet og de vandige vaskevæsker slås sammen og påfylles en ny kolonne (l,5 x 25 cm) inneholdende

karboksymetylcellulose. og man gjennomfører en gradi ent elue ring med 0,005 M ammoniumacetat og 0,175 M ammoniumacetat (pH 6,8)

(300 ml av hver). Produktet kommer ut med fraksjonene 170 - 2k0 ml. Disse fraksjoner slås sammen og fylles på en kolonne (2 x 20 cm) "Amberlite XAD-2" . Den adsorberte forbindelsen elueres ved gradient, metoden med vann (250 ml) og etanol (280 ml), og den rene forbindelsen kommer da ut i fraksjonene 190 - 2k0 ml. Eluatet inndampes under nedsatt trykk og frysetørkes. Prosessen gir 110 mg av den søkte forbindelse, Rf 2 = 0,098, Rf-3' = 0,73.

" 0C-^ l) i- -57'°° (c ~ °'56 1 5 # vandig eddiksyre). Aminosyreanalyse: (hydrolyse med 6N HC1 i nærvær av tioglykolsyre): His 0,96, Arg 1,04, Trp 0,92, Ser 0,93, Glu 1,00, Pro 1,00,

Leu 1,01, Phg 0,98, Tyr 1,01.

Eksempel 5.

Fremstilling av (Pyr) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D~Ser-Leu-Arg-Pro-NH-CHg-CH^.

a) Fremstilling av Z-D-Ser-Leu-ArgÉNO^-Pro-NH-CHg-CH^.

I en blanding av 10 ml dioksan og 10 ml dimetylformamid

oppløses 955 mg Z-D-Ser-OH, 1,82 g H-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH,j og 788 mg HONB. Oppløsningen avkjøles til 0°C og 907 mg DCC tilsettes. Blandingen røres ved 0°C i 2 timer og ved romtemperatur i 5 timer. Biproduktet dicykloheksylurea frafiltreres og filtratet inndampes til tørrhet under nedsatt trykk. Residuet oppløses i 100 ml kloroform. Oppløsningen vaskes med 0,5 N saltsyre og h $-ig natriumliydrogenkarbonat i denne rekkefølge, tørkes over magnesiumsulfat og inndampes til tørrhet under nedsatt trykk. Residuet behandles med petroleter og pulveret som utvinnes frafiltreres og utfelles på nytt fra etanol-eter. Utbytte 2, k g, smeltepunkt 123 - 126°C (dekomponering).

/ a_727_ _^9>8° (c =0,5 i metanol).

El ementaeranalyse C^H^yO^N^ .H,,0

Beregnet: C 51,79, H 7,09, N 18,12.

Funnet: C 52,01, H 6,96, N 18, Ok.

Rf<1> = 0,40. b) Fremstilling av (Pyr) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH3.

I en blanding av 20 ml metanol og 1 ml iseddiksyre oppløses 334 mg Z-D-Ser-Leu-Arg (N09)-Pro-NH-CHg-CH^ og man gjennomfører en katalytisk reduksjon med palladiumsvart som katalysator ved romtemperatur og atmosfæretrykk i k timer. Katalysatoren filtreres fra og filtratet inndampes til tørrhet under nedsatt trykk. Residuet oppløses ved å tilsette 9,6 ml 0,1 N-saltsyre, og fryse-tørkes.

Det tørre pulver og 280 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH oppløses i 3 ml DMF og 100 mg 1-hydroksybenzoetriazo.l og 0,6l5 ml av en 10 $-ig oppløsning av N-etylmorfolin i DMF tilsettes.

Blandingen avkjøles til -5°C, hvoretter man tilsetter 165 mg DCC. Blandingen røres ved -5°C i k timer og ved romtemperatur

i 8 timer. Ureaderivat-biproduktet filtreres fra og filtratet inndampes til tørrhet under nedsatt trykk. Inndampningsresten oppløses i 20 ml vann og uoppløselige stoffer filtreres fra. Filtratet kjøres på én kolonne (10 ml) "Amberlite IRA-4lo' (acetatform), og eluatet og vaskevæskene slås sammen og fylles på en ny kolonne (l,5 x 27 cm) karboksymetylcellulose. Man eluerer ved gradient-metoden med 0,005 M ammoniumacetat-puffer (300 ml) og 0,15 M ammoniumacetat (300 ml). Den søkte forbindelsen går ut i fraksjonene 280 - 322 ml. Disse fraksjonene slås sammen og frysetørkes til 135 mg råprodukt. Dette oppløses i litt vann og kjøres på en ny kolonne (l,5 x 17 cm) inneholdende "Amberlite XAD-2." Man gradient-eluerer med 5 $-ig vandig etanol (300 ml)

og 60 ia vandig etanol (330 ml). Fraksjonene 196 ml til 231 ml slås sammen og frysetørkes etter at etanolen er avdampet. Utbytte: 62 mg.

Dette produkt oppløses i 6,1 N vandig eddiksyre og gelfiltreres på en kolonne ( 1 x 5't cm) "Sephadex LH-2o" Etter frysetørking får man kO mg av det rene søkte stoff.

/ a_72<7>_ _46,4° (c = 0,5 i 5 #-ig vandig eddiksyre), Rf<2> = 6,055, Rf<3> = 0,70.

Aminosyreanalyse (hydrolyse med 6N HC1 i nærvær av tioglykolsyre) : His 1,00, Arg l, 0k, Trp .1,00, Ser 1,81, Glu 1,00, Pro 1,00, Leu 1,0<*>4, Tyr 0,96, etylamin 1,0<*>4.

Eksempel 6.

Fremstilling av (Pyr) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Abu-Leu-Arg-Pro-NH-CHp-CH3.

a) Fremstilling av Z-D-Abu-Leu-Arg (N02)-Pro-NH-CH^-CH^.

I 5 ml dime tylf ormamid oppløses 0,3 g Z-D-Abu-'0H og 0,*45 g

H-Leu-Arg(N09 ) -Pro-NH-CH^CH^.

Oppløsningen avkjøles til 0°C og 0,25 g HONB og 0,29

g DCC tilsettes. Blandingen røres ved 0°C i 1 time og ved romtemperatur i 5 timer. Ureaderivatet filtreres fra og filtratet inndampes til tørrhet under nedsatt trykk. Residuet oppløses i 80 ml kloroform, vaskes med 1 N saltsyre og 4 $ natriumhydrogenkarbonat.

Etter vasking med vanzi, tørkes forbindelsen over magnesiumsulfat og konsentreres til tørrhet under nedsatt trykk. Inndampningsresten behandles med eter og pulveret frafiltreres og utfelles på nytt fra etylacetat-petroleter. Man får 489 mg med smeltepunkt lll-ll4°C.

/"a 7D = -51,2° (c = 0,6 i metanol), Rf = 0,66.

b) Fremstilling av (Pyr) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Abu-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH3.

Z-D-Abu-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3 behandles med en

25 $-ig hydrogenbromid-iseddik og utfelles med eter.

Fellingen fylles på en kolonne av "Amberlite CG-4lo"(fri base)

for å fjerne hydrogenbromid. I 3 ml DMF oppløses 220 mg fri base av H-D-Abu-Leu-Arg(NOQ)-Pro-NH-CH -CH^ fremstilt ovenfor og 290 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH, hvorpå man tilsetter 150 mg HONB. Blandingen avkjøles til -10°C og tilsettes^ 85 mg DCC. Blandingen avkjøles nå ved -10°C i 2 timer, ved 0°C i 4 timer, og

ved romtemperatur i 7 timer. Til reaksjonsblandingen settes etylacetat og den resulterende felling frafiltreres. Fellingen oppløses i 20 $-ig vandig metanol under oppvårmning, og oppløs-ningen avkjøles, hvorpå en felling skilles ut. Denne felling frafiltreres og tørkes. Utbytte 284 mg, Rf<2> = 0,240, Rf<3>=0,772.

(i begge oppløsningsmidler inneholder produktet ca. 10 % forurens-ninger som gir en liten Rf-verdi.)

I 15 ml 60 $-ig vandig maursyre oppløses 200 mg av oven-

stående produkt, hvorpå man tilsetter 400 mg SnClg.HgO. Blandingen oppvarmes til 80-85°C. i 2 timer. Deretter konsentreres den til tørrhet under nedsatt trykk og inndampningsresten ekstraheres med 50 ml varmt vann.

De uoppløselige stoffer filtreres fra og filtratet fylles

på en kolonne "Amberlite XAD-2" karboksymetylcelluloso og Sephadex LH-20 i denne rekkefølge, hvorpå man frysetørker.

Den beskrevne fremgangsmåten gir 104 mg av et hvitt, voluminøst pulver. /~tx 7jj = -43,6° (c = 0,50 i 5 %-ig vandig eddiksyre),

R:c 2 = 0,08. Amino syr eanaly s o (hydrolyse med 6N HC1 i nærvær

av tioglykolsyre): His 0,98, Arg 0,96, Trp 0,94, Ser 0,92,

Glu 1,00, Pro 1,00, Leu 0,98, Abu 1,00, Tyr 1,00, etylamin 1,02.

Eksempel 7.

Fremstilling av (Pyr) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Nva-Leu-Arg-Pro-NH-CH^-CH^.

a) Fremstilling av Z-D-Nva-0H.

Etter den vanlige rutine-fremgangsmåte omsettes H-D-Nva-0H

med karbobenzoksyklorid i 2N natriumhydroksyd og den dannede forbindelse omkrystalliseres fra etylacetat-petroleter. Fremgangsmåten gir nåler som smelter ved 83 - 84°C.

/"a_7p6= + 12,1° (c = 1,0 i metanol).

El ementaeranalyse = C^^H^^O^N

Beregnet: C 62,l4, H 6,82, N 5,57.

Funnet C 62,17, H 6,88 N 5,62

b) Fremstilling av Z-D-Nva-Leu-Arg8N02)-Pro-NH-CHg-CH^.

I 5 ml DMF oppløses 376 mg Z-D-Nva-0H, 685 mg H-Leu-Arg(N0o)-Pro-NH-CH2-CR\3 og 295 mg HONB og derpå ved 0°C tilsettes 3;+0 mg DCC. Blandingen røres ved 0°C i 2 timer og ved romtemperatur

i 8 timer. Ureaderivåtet som biprodukt filtreres fra og 100 ml etylacetat settes til filtratet. Blandingen vaskes med 0,5 N-saltsyre og h $-ig natriumhydrogenkarbonat. Produktet vaskes med vann og tørkes over natriumsulfat. Man konsentrerer oppløs-ningen til tørrhet under redusert trykk og behandler med eter. Det dannede pulver frafiltreres og renses ved ny utfelling fra etylacetat-eter. Utbytte 900 mg, smeltepunkt 105-107°C (dekomp.). /"a_7<26> -51,2°C (c=l i metanol), Rf<1> = 0,6o.

Elementæramalyse C„0HC10oN_

51 o 9

Beregnet: C 55,71, H 7,^5, N 18,27.

Funnet: C 55,5'+, H 7,62, N 18,09. c) Fremstilling av (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Nva-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH3.

Ut fra Z-D-Nva-Leu-Arg(N00)-Pro-NH-CH2-CH3 fremstilt under

b) og (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH, følges samme fremgangsmåte og renseprosess som under eksempel 6)-b), for fremstilling av

den ønskede forbindelse.

/~ ix 725 = -39,8° (c = 0,51 i 5 %-ig vandig eddiksyre), Rf<2> = 0,094, Rf<3> = 0,74.

Aminosyreanalyse (hydrolyse med 6N HC1 i nærvær av tioglykolsyre): His 1,00, Arg 0,98, Trp 0,93, Ser 0,9'+, Glu 1,08, Pro 1,02, Nva 0,98, Leu 1,00, Tyr 0,98, etylamin 1,04.

Eksempel 8.

Fremstilling av (Pyr) Glu-His-Trp-Ser-Phe-D-Nva-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH2-CH3.

a) Fremstilling av Z-D-Nva-Leu-Arg(N0o)-Pro-NH-CH2-CH2-CH3.

I 2 ml 25 $-ig hydrogenbromid-iseddik oppløses 720 mg Z-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH2-CH,j og oppløsningen rystes i 4o. minutter. Man tilsetter 20 ml tørr eter og fellingen frafiltreres. Fellingen vaskes grundig med tørr eter. Derpå tørkes den over natriumhydroksyd under nedsatt trykk i en eksikator.

Etter tørking oppløses produktet i 5 ml DMF og man tilsetter 250 rng Z-D-Nva-0H, fulgt av 0915 ml trietylamin og 200 mg HONB. Blandingen avkjøles til 0°C og 230 mg DCC tilsettes, fulgt av røring ved romtemperatur i 8 timer. Derpå tilsettes 80 ml etyl-" acetat og uoppløselige stoffer filtreres fra. Filtratet vaskes

med 1 N saltsyre, 4 %-ig natriumhydrogenkarbonat og vann, og tørkes over natriumsulfat.

Derpå konsentreres forbindelsen til tørrhet under redusert trykk og inndampningsresten behandles med petroleter. Det resulterende pulver renses ved ny utfelling fra etylacetat-petrol-efcer. Utbytte 718 mg.

/"a 7<q>2= -51,0° (c=l,0 i metanol), Rf<1> 0,64.

Elementæranalyse C_„H-„0oN_

33 03 o ^

Beregnet: C 56,23, H 7,58, N 17,89.

Funnet: C 56,14, H 7,70, N 17,58. b) Fremstilling av (Pyr) Glu-His-Trp-Ser-Phe-D-Nva-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH2-CH3.

I 3 ml 25 $-ig hydrogenbromid-iseddik oppløses 500 mg Z-D-Nva-Leu-Arg (NO )-Pro-NH-CH2~CH2~CH3 °s oppløsningen rystes i

50 minutter.

Man tilsetter 60 ml tørr eter, og fellingen frafiltreres

og oppløses i 40 ml vann. Oppløsningen fylles på en kolonne (l x l4 cm) "Amberlite CG-4.10"(fri base) som etterpå vaskes med 30 ^-ig vandig metanol. Eiuatet og vaske-væskene slås sammen•og metanol avdestilleres under nedsatt trykk. Residuet frysetørkes

til 320 rng fri base av H-D-Nva-Leu-Arg(N02) -Pro-NH-CH^-CHg-CH^.

I 2 ml DMF oppløses 225 mg av ovenstående produkt og 280 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-OH, fulgt av 130 mg HONB. Blandingen avkjøles til -10°C og 87 mg DCC tilsettes. Blandingen røres ved -10°C i 3 timer, ved 0°C i 2 timer og ved romtemperatur 1 6 timer. Til reaksjonsblandingen settes ko ral etylacetat og fellingen utvinnes ved filtrering samt oppløses i 30 %-ig etanol under oppvarmning. Uoppløselige stoffer filtreres fra og-filtratet avkjøles, hvorpå man får en felling. Fellingen frafiltreres, vaskes med kaldtvann og tørkes. Utbytte: 3'fO mg.

I 20 ral 60 $-ig vandig maursyre oppløses 300 mg av ovenstående produkt, hvorpå man tilsetter 580 rag SnClg.H^O. Blandingen oppvarmes ved 85°C i 2 timer. Reaksjonsblandingen konsentreres til tørrhet under redusert trykk og ekstraheres med varmt vann.

Ekstraktet renses ved kromatograf ering på "Amberlite XAD-2," karboksyme tyl cellulo se og"Biogel P-2.' Dette gir 170 mg av

den søkte forbindelsen.

/"a_72<5>= -37,7°C (c = 0,505 i 5 %- ±g vandig eddiksyre), R<f2> = 0,13, Rf<3> = 0,76.

Aminsyreanalyse (hydrolyse med 6N HC1 i nærvær av tioglykolsyre): His 1,02, Arg 0,98, Trp 0,97, Ser 0,98, Glu 1,02, Pro 1,00,

Leu 1,00, Nva 1,02, Phe 0,98.

Ekse mpel 9.

Fremstilling av (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Abu-Leu-Arg-Pro-NH-CH(CH^)0.

a) Fremstilling av Z-D-Abu-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH(CH3)2

I 3 ml 25 $-ig hydrogenbromid-iseddik oppløses 700 rng

Z-Leu-Arg(N0p)-Pro-NH-CH(CH,j)2- og oppløsningen rystes i 60 min., hvoretter man tilsetter 50 rnl tørr eter. Fellingen gjenvinnes ved filtrering og tørkes. Det tørkede produkt oppløses i 6 ml DMF. Til oppløsningen settes 2h0 mg Z-D-Abu-OH og oppløsningen nøytraliseres med 0,15 nil trietylamin.

Derpå tilsettes 200 mg HONB og blandingen avkjøles så til 0°C, hvorpå man tilsetter 230 mg DCC. Man rører ved romtemperatur i 6 timer. Derpå tilsettes 100 ml etylacetat og de uoppløselige stoffer filtreres fra. Filtratet vaskes med 0,5 N saltsyre og h $-ig na triumliydrogenkarbonat og tørkes derpå over uatrium-sulfat. Oppløsningen Landampes til. tørrhet under iedsatt trykk og behandles med eter, som oi.ikrys tal li seres fra etylaoeta t-eter.

I 43218 Utbytte 725 mg.

/"a 725= -52,0°C (c = 0,5 i metanol), Rf<1> = 0,62.

El ementaeranalyse, C^gH^OgN^

Beregnet: C 55,71, H 7,45, N 18,27

Funnet: C 55,42, H 7,59, N 18,01

b) Fremstilling av (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Abu-Leu-Arg-Pro-NH-CH(CH^)2. Fra Z-D-Abu-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH(CH"3)2 fremstilt under a) og (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH, fremstilles ovenstående forbindelser på nøyaktig samme måte som beskrevet i eksempel 5.

/"a 7<26>= -41,0° (c=0,62 i 5 #-ig vandig eddiksyre), Rf<2> = 0,11, Rf<3> =0,74.

Aminosyreanalyse (hydrolyse med 6N HC1 og tioglykolsyre), His 1,00, Arg 0,90,Trp 0,87, Ser 0,97, Glu 1,00, Pro 0,94,

Abu 1,00, Leu 1,02, Tyr 0,96.

Eksempel 10.

Fremstilling av (Pyr) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-CHg-CH^ ved fast fase-metoden.

a) Fremstilling av BOC-Pro-harpiks.

I 50 ml DMF anbringes 15 g klormetylert harpiks (Cl-innhold

9,45 millimol), hvorpå man tilsetter 6,1 g BOC-Pro-OH og 3,33 ml trietylamin. Blandingen rystes i 5 dager. Harpiksen utvinnes ved filtrering og vaskes grundig med DMF, etanol, vann, etanol og eter i angitt rekkefølge, og tørkes. Utbytte 17,55 g. Aminosyreanalyse viser at harpiksen inneholder 0,3l4 millimol/g BOC-Pro. b) Fremstilling av (Pyr) Glu-His(Tos)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr-(Bzl)-D-Leu-Leu-Arg(To s)-Pro-harpiks.

Reaksjonsbeholderen i et automatisk peptidsyntetiserings-apparat (Simadzu Seisakusho Model APS-800) påfylles 3,l45 g BOC-Pro-harpiks fremstilt under a). Harpiksen svelles opp med diklormetan i 12 timer, hvoretter hver aminosyre ble innmatet etter følgende syklus: Diklormetan (3 minutter x 3) —f 50 % trifluoreddiksyre/diklormetan (lO min. og 30 min.) —* diklormetan (3 min. x 3) —? etanol (3 min. x 3) —^ diklormetan (3 min. x 3) '—^ 10 $-ig trietylamin/kloroform (lO min.) —^ kloroform (3 min, x 3) diklormetan (3 min. x 2) BOC-aminosyre-anhydrid (syntetisert fra BOC-aminosyre og DCC på kjent måte (30 min. og 60 min.) —^ acetylering (diklormetan, trietylamin og eddiksyreanhydrid)

(l time) —> diklormetan (3 min. x 3) /"(Pyr) Glu-OH alene kondenseres direkte med DCC i DMF 7»

Til slutt vaskes harpiksen med etanol, kloroform, dimetylformamid og eter og tørkes. Utbytte 3,89 g. c) Fremstilling av (Pyr) Glu-Hi s(To s)-Trp-S er(Bzl)-Tyr-(Bzl)-D-Leu-Leu-Arg(To s)-Pro-NH-CHg-CH^.

I 20 ml metanol suspenderes 3,52 g harpiks fremstilt

under b) og suspensjonen kjøles til 20°CC Etylaminet fremstilt ved oppvarmning av 80 $-ig vandig etylamin i varmtvannsbad bobles inn i suspensjonen gjennom natriumhydroksyd. Etter til-strekkelig metning, røres blandingen ved romtemperatur i 4o timer. Harpiksen filtreres fra og filtratet konsentreres til tørrhet under nedsatt trykk. Residuet behandles med eter og gir 835 mg råprodukt i pulverform. Råproduktet inneholder en stor mengde forurensning som sannsynligvis er metylesteren. Derfor oppløses 503 mg av dette produkt i metanol-DMF (8 ml-8ml) og på samme måte som ovenfor bobles etylamin gjennom oppløsningen. Oppløsningen røres i 34 timer, hvorpå metylesteren forsvinner.

Oppløsningen konsentreres til tørrhet under nedsatt trykk og -residuet behandles med eter. Pulveret filtreres fra, utbytte 465 mg. d) Fremstilling av (Pyr) Glu-Hi s-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH,j.

I nærvær av 0,4 ml anisol og 0,4 ml merkaptoetanol oppløses 327,8 mg råprodukt fremstilt under c) i 8 ml vannfritt hydrogenfluorid. Oppløsningen røres ved 0°_, . , .. , .,

Ci en time og inndampes til tørrhet under nedsatt trykk. Residuet oppløses i 20 ml vann og de uoppløselige stoffene filtreres fra. Filtratet kjøres gjennom

/ v il .11, ,

en kolonne (1,5 x 20 cm) Amberlite IRA-410 (acetatform) og renses derpå ved kromatografering på karboksymetylcellulose og "Amberlite XAD-2". Derpå gjennomgår produktet gelfiltrering på

en kolonne av^Sephadex LH-2o! Den beskrevne fremgangsmåte gir 98 mg produkt.

/"a_7p6= -32,0° (c=0,52 i 5 #-ig vandig eddiksyre), Rf<2> = 0,10, Rf<3> = 0,75.

Aminosyreanalyse (hydrolyse med 6N HC1 i nærvær av tioglykolsyre): His 0,98, Arg 1,00, Trp 0,87, Ser 0,90, Glu 1,02, Pro 1,02, Leu 2,01, Tyr 0,98, etylamin 1,10.

Eksempel . 11..

Fremstilling av (Pyr)Glu-Hi s-Trp-Ser-Tyr-D-Nle-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH3.

a) Fremstilling av B0C-D-Nel-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CHg-CH^.

I 10 ml DMF oppløses 346 mg B0C-D-Nle-0H og 820 mg H-Leu-Arg-(N02)-Pro-NH-CH2-CH,j. Blandingen avkjøles til 0°C, hvorpå man tilsetter 322 mg HONB og 371 mg DCC. Blandingen røres ved 0°C

i 2 timer og ved romtemperatur over natten. Ureaforbindelsen,

som er et biprodukt, filtreres fra og filtratet ekstraheres med

.10 ml kloroform. Ekstraktet vaskes med 0,1 N saltsyre, 5 #-ig natriumhydrogenkarbonat og vann, og tørkes over vannfritt natriumsulfat.

Kloroformen inndampes og residuet gnis ut med eter og omkrystalliseres fra etanol-eter til den aktuelle forbindelse. Utbytte 811 mg, smeltepunkt: 124-126°C (dekomp.) /"a_7^<2> -46,2°

(c=0,5 i metanol). El ementaeranalyse, C^^H^^OgN^ .-^HgO.

Beregnet. C 53,08, H 8,31, N 18,57.

Funnet: C 53,07. H 8,27, N 19,05. b) Fremstilling av (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Nle-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH3.

BOC-D-Nle-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3 som er fremstilt ovenfor under a), behandles med trifluoreddiksyre og utfelles med eter, samt filtreres fra. Produktet fylles på en kolonne av 'Amberlite CG-45"(fri base) for å fjerne trifluoreddiksyren. I 2 ml DMF oppløstes 190 mg av forbindelsen H-D-Nle-Leu-Arg-(N02)-Pro-NH-CH2~ CH^ og l68 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH. Blandingen avkjøles til 0°C, hvorpå man tilsetter 65 mg HONB og 75 mg DCC. Blandingen røres ved 0°C i 2 timer og ved romtemperatur over natten. Ureaforbindelsen, som er et biprodukt, frafiltreres og etylacetat settes til filtratet. Den resulterende felling frafiltreres og behandles med 4 ml vannfritt hydrogenfluorid i nærvær av 0,1 ml anisol og 0,1 ml 2-merkaptoetanol ved 0°C i 1 time. Hydrogenfluoridet Inndampes under nedsatt trykk og residuet tørkes grundig samt oppløses i 10 ml vann. Oppløsningen fylles på en kolonne av 'Amberlite IRa-4lo'(acetatform) og eluatet adsorberes på en kolonne av karboksymetylcellulose (l,2 x 22 cm) og man gjennom-fører derpå gradienteluering med 0,005 M ammoniumacetat (200 ml og 0,15 M ammoniumacetat (200 ml). Fraksjonene fra l47 ml til l68 ml slås sammen og frysetørkes og gir sluttproduktet i ren form.

22 T

Utbytte 40 mg. / a_7^ = 0,11, RfJ = 0,755.

Aminosyreanalyse (hydrolyse med 6B HC1 i nærvær av tioglykolsyre),

His 1,05, Arg 1,00, Trp 0,93, Ser 0,89, Tyr 1,00, Glu 1,00,

Pro 1,02, Leu 1,00, Nie 1,00, etylamin 1,05.

Eksempel 12.

Fremstilling av (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-D-Phe-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH3.

a) Fremstilling av H-D-Phe-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH,j.

Til en blanding av 10 ml diklormetan og 1 ml DMF settes

600 mg Z-D-Phe-0H, 500 mg HONB, 950 mg H-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CHg-CH^ og blandingen oppvarmes. Blandingen avkjøles til 0°C

og man tilsetter 500 mg DCC. Blandingen røres i 4 timer ved rom-" temperatur og dicykloheksylurea, et biprodukt, frafiltreres. Filtratet inndampes til tørrhet under nedsatt trykk og residuet oppløses i kloroform. Oppløsningen vaskes to ganger med 4 $-ig natriumhydrogenkarbonat og to ganger med vann og tørkes over vannfritt magnesiumsulfat samt inndampes til tørrhet under nedsatt trykk. Umiddelbart derpå oppløses residuet i 2 ml iseddik.

Etter tilsetning av 5 ml 25 $-ig hydrogenbromid-iseddik, røres blandingen ved romtemperatur i 1 time, hvorpå man tilsetter 50 ml tørr eter. Fellingen som separeres ut filtreres fra og vaskes grundig med eter og tørkes. Fellingen oppløses i 10 ml 30 $-ig vandig metanol. Oppløsningen fylles på en kolonne 'Amberlite IRA-4l0"(fri form),' som elueres med 100 ml 30 $-ig vandig metanol. Eluatet slås sammen og konsentreres for å fjerne metanolen.

Frysetørking av residuet gir den søkte forbindelsen H-D-Phe-Leu-Arg (N02)-Pro-NH-CHg-CH^ som et hvitt pulver.

Utbytte 1,67 g.

/"a 7^ = -94,26°C (c = 1,01 i metanol).

El ementaeranalyse , Cg^H^^OgN^ .HgO

Beregnet: C 54,09, H 7,62, N 20,28.

Funnet: C 53,84, H 7,79, N 19,91. b) Fremstilling av (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-D-Phe-Leu-Arg-Pro-NH-CHg-CH^.

I 6 ml DMF oppløses 290 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-OH og

Zko mg H-D-Phe-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-GH3, fulgt av tilsetning av 150 mg HONB. Blandingen avkjøles til -10°C og 90 mg DCC tilsettes. Blandingen røres ved -10°C i 2 timer,

ved 0°C i 2 timer og ved romtemperatur i 6 timer. Ureaforbindelsen, et biprodukt, frafiltreres og 40 ml eter tilsettes filtratet. Fellingen som skilles ut frafiltreres. Utfelling fra etanol og etylacetat gir det rå beskyttede peptid. Utbytte 510 mg. Råpeptidet oppløses i 4-0 ml 60 $-ig vandig maursyre. Etter å ha tilsatt 1 g SnCl2.H20 til oppløsningen, settes blandingen tilside ved 80-85°C i 2 timer. Blandingen konsentreres til tørrhet under nedsatt trykk. Etter tilsetning av 50 ml vann til residuet, innstilles blandingen på pH 7, 0 med vandig ammoniakkoppløsning. Fellingen filtreres fra og filtratet renses for kolonne 'Amberlite XAD-2Uog karboksymetylcellulose og frysetørkes som angitt i eksempel 1, hvorpå man får den søkte forbindelse som et hvitt, lett pulver. Utbytte 392 mg.

/"a_7^<6>= -71,8° (c=0,195 i 5 #-ig vandig syre), Rf<2> = 0,l4, Rf<3>= 0,76.

Aminosyreanalyse (hydrolyse med 6N HC1 i nærvær av tioglykolsyre).

Hi,s 0,98, Arg 1,00, Trp 0,97, Ser 0,93, Glu 1,00, Pro 0,98,

Leu 1,00, Phe 1,96.

Eksempel 13. Frems tilling av (Pyr)Glu-Hi s-Trp-Ser-Tyr-D-Thr-Leu-Arg-Pro-NH-CHg-<CH>^.

a) Fremstilling av B0C-D-Thr-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CHg-CH^.

I 10 .ml acetonitril oppløses k^ 8 mg BOC-D-Thr-OH (en olje-aktig forbindelse) og 4l8 mg HONB, hvorpå man tilsetter 912 mg H-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH,j. Blandingen avkjøles til 0°C og man tilsetter hjh mg DCC. Blandingen røres ved romtemperatur i 10 timer og uoppløselige stoffer filtreres fra. Filtratet inndampes til tørrhet under nedsatt trykk og residuet ekstraheres med 100 ml etylacetat. Ekstraktet vaskes med 5 $-ig natriumhydrogenkarbonat, 10 $-ig vandig sitronsyreoppløsning og vann i angitt rekkefølge

og tørkes over vannfritt natriumsulfat. Derpå inndampes oppløs-ningen til tørrhet under nedsatt trykk og residuet utfelles fra etanol-eter. Dette gir 900 mg søkt forbindelse med Smeltepunkt 119-121°C (dekomp.), /~<X 7^- 38,6° (c=0,5) i metanol, Rf<1> = 0,45.

El ementaeranalyse , C^gH^O^N^ °H2°

Beregnet: C 4a,76, H 7,90, N 18,65.

Funnet: C 4-9,64, H 7,70, N 18,46. b) Fremstilling av (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D~Thr-Leu-Arg-Pro-NH-CHg-CH^.

I 10 ml trifluoreddiksyre oppløses 657 mg BOC-D-Thr-Leu-Arg(N02)~Pro-NH-CH2-CH3 og oppløsningen rystes i 40 minutter. Man tilsetter 60 ml eter og fellingen frafiltreres og oppløses

på nytt i 30 ml vann. Vannoppløsningen fylles på en kolonne

(l x 10 cm) 'Amberlite IR-45"(fri base) som vaskes med 30 %-ig metanol. Eluatet og vaskevæskene slås sammen og konsentreres for å fjerne metanolen under nedsatt trykk. Residuet fryse-tørkes. Dette gir 471 mg D-Thr-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH,j.

I 2 ml DMF oppløses 167 mg av dette produkt og 175 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH, hvorpå man tilsetter 67 mg HONB, Blandingen avkjøles til -5°C og 77 mg DCC tilsettes. Denne blanding røres ved -5°C i 3 timer og derpå ved romtemperatur i 10 timer. Uoppløselige stoffer filtreres fra og 50 ml etylacetat tilsettes til filtratet. Fellingen filtreres fra og utfelles på nytt fra DMF-etylacetat. Utbytte 290 mg. l60 mg av dette produktet opp-løses i 10 ml 60 ^C-ig vandig maursyre, med tilsetning av 400 mg SnCl2.H20, og oppløsningen behandles ved 80°C i 2 timer. Reaksjonsblandingen inndampes under nedsatt trykk og man tilsetter 10 ml vann, hvorpå de uoppløselige stoffer filtreres fra.

Filtratet renses ved kromatografi på Amberlite XAD-2" karboksymetylcellulose og Bio-gel P-2. Fremgangsmåten gir 65 mg av den søkte forbindelse. /~ a_ 7D = -37,4° (c = 2,5 i 5 #-ig vandig eddiksyre), Rf2 = 0,12, Rf<3> = 0,68.

Aminosyreanalyse (hydrolyse med 6N HC1 i nærvær av tioglykolsyre): His 1,00, Arg 0,97, Trp 0,94, Thr 1,03, Ser 0,90, Glu 1,00,

Pro 1,06, Leu 1,06, Tyr 1,00, etylamin 1,10.

Eksempel l4.

Fremstilling av (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Ile-Arg-Pro-NH-CH2-CH3.

a) Fremstilling av Z-Ile-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3.

I 12 ml 25 $-ig hydrogenbromid-iseddik oppløses 1,43 g

Z-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3 og blandingen rystes i 40 minutter

ved romtemperatur. Til oppløsningen settes 300 mg tørr eter og fellingen filtreres fra og tørkes i eksikator over na triumhydrok syd,

Pulveret oppløses i 25 ml DMF og oppløsningen nøytraliseres med

0,84 ml trietylamin og avkjøles til 0°C„ Derpå tilsettes 795 mg Z-Ile-OH, 590 mg HONB og 680 rag DCC, og blandingen røres ved

0°C i 5 timer og i 8 timer véd romtemperatur. Reaksjonsblandingen filtreres fra og filtratet dampes inn. Residuet oppløses i 100 ml kloroform, vaskes med 0,1 N-saltsyre, 5 #-ig natriumhydrogenkarbonat og vann, og tørkes over magnesiumsulfat.

Etter inndamping av oppløsningsmidlet utfelles residuet på nytt

fra etylacetat-eter. Omfelling fra etanol-eter gir 1,1 g av den søkte forbindelsen, smeltepunkt: 103-105°C.

/~<X_7<23>= -58,1° (c=l,0 i metanol), Rf<1> 0,48.

Elementæranalyse , Cg^H^gO^Ng 6-l H^O

Beregnet, C 54,08, H 7,23, N, 18,68.

Funnet: C 53,80, H 7,15, N, 18,84.

b) Fremstilling av Z-D-Leu-Ile-Arg(N02)-Pro-NH-CHg-CH^.

I 4 ml 25 $-ig hydrogenbromid-iseddik opoløses 590 mg

Z-Ile-Arg(N02)-Pro-NH-CHg-CH^ og blandingen rystes ved romtempe-

ratur i 40 minutter. Til oppløsningen settes 50 ml tørr eter og den resulterende felling frafiltreres og tørkes i en eksikator over natriumhydroksyd. Pulveret oppløses i 8 ml DMF og oppløs-ningen nøytraliseres med 0,l4 ml trietylamin og avkjøles til 0°C. Derpå tilsettes 264 mg Z-D-Leu-OH, 2l6 mg HONB og 247 mg DCC,

og blandingen røres ved 0°C i 2 timer og ved romtemperatur i 12

timer. Reaksjonsblandingen behandles derpå videre som beskrevet under a) og man får 620 mg av den aktuelle forbindelse med smeltepunkt 112 - 113°C. /"a 7^ ?= -47,8° (c=0,5 i metanol),

1 - - u

Rf = 0,53. Elementæranalyse, C^H^OgN^ «HgO.

Beregnet: C 54,91, H 7,68, N, 17,47.

Funnet: C 54,72, H 7,52 N 17,19. c) Fremstilling av (Pyr)Glu-Hi s-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Ile-Arg-Pro-NH-CHg-CH^.

I 3 ml 25 %-lg hydrogenbromid-iseddik oppløses 220 mg Z-D-Leu-Ile-Arg^OgJ-Pro-NH-CHg-CH^ og oppløsningen rystes ved romtemperatur i 50 minutter. Oppløsningen tilsettes 50 ml tørr eter og den dannede felling frafiltreres og tørkes i eksikator over natriumhydroksyd. Forbindelsen oppløses i litt vann som fylles på en kolonne (l,2 x 7 cm) "Amberlite IR-45<*>(fri form).

Eluatet og vaskevæskene slås sammen og frysetørkes. Forbindelsen oppløses i 5 ml DMF sammen med 230 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-

OH og 108 mg HONB. Blandingen kjøles til -10°C og 124 mg DCC tilsettes. Blandingen røres ved -10°C i 2 timer, i 2 timer ved 0°C og i 10 timer ved romtemperatur og derpå filtrert. Filtratet konsentreres og konsentrasjonsresten renses på en kolonne (l,8 x 20 cm) 'kmberlite XAD-2" (200-300 mesh), med gradient-eluering ved hjelp av 5 $ vandig etanol opptil 80 $ vandig etanol (250 ml av hver). Den søkte forbindelsen elueres med fraksjonene 150 ml - 300 ml. Disse fraksjoner konsentreres under nedsatt trykk og frysetørkes. Forbindelsen oppløses i 7 ml 60$-ig vandig maursyre og 450 mg SnClg.^O tilsettes. Blandingen oppvarmes ved 80-85°

i 2 timer. Uoppløselige stoffer filtreres fra og filtratet inndampes til tørrhet under nedsatt trykk. Residuet ekstraheres med 30 ml varmt vann (80°C)o Ekstraktet filtreres og filtratet settes på en kolonne (l,8 x 15 cm) "Amberlite XAD-2<1>'(200-300 mesh), og kolonnen vaskes grundig med vann. Man eluerer med en lineær gradient av vandig etanol (20-80 %, 250 ml-250 ml). Den søkte forbindelsen elueres i fraksjonene 100 - 230 ml. Disse fraksjoner slås sammen og konsentreres under nedsatt trykk for å fjerne etanolen. Konsentratet påsettes en kolonne (l,2 x 40 cm) karboksymetylcellulose, produktet elueres ved lineær gradienteluering (0,005 M - 0,2 M ammoniumacetat, pH 6,8, 200 ml-200 ml). Det søkte peptidet går ut med fraksjonene 180 - 290 ml. Disse fraksjonene slås sammen og frysetørkes og gir et utbytte på 130 mg. /'a_7p3= -39,2° (c=0,5 i 5 #-ig vandig eddiksyre): Rf<2>=0,11, Aminosyreanalyse (hydrolyse med 6N HC1 i nærvær av tioglykolsyre): His 0,97, Arg 1,02, Trp 0,92, Ser 0,94, Glu 1,00, Pro 1,05, Ile 1,00, Leu 1,00, Tyr 0,97.

Eksempel 15.

Fremstilling av (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Nle-Arg-Pro-NH-CHg-CH^.

a) Fremstilling av Z-Nle-Arg (NO^-Pro-NH-CHg-CH^.

I 10 ml 25 $-ig hydrogenbromid-iseddik oppløses 715 mg

Z-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3 og blandingen røres ved romtemperatur

i 30 minutter. Til oppløsningen settes 250 ml tørr eter og den dannede felling filtreres fra og tørkes i eksikator over natriumhydroksyd. Pulveret som fremstilles på denne måten oppløses i 15 ml DMF sammen med 400 mg Z-Nle-0H og oppløsningen avkjøles til 0°C. Derpå tilsettes 0,45 ml trietylamin og 295 mg HONB samt 340 mg DCC. Blandingen røres ved 0°C i 3 timer og

i 10 timer ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen behandles

derpå som beskrevet i eksempel 14a) og gir den søkte forbindelsen, utbytte 824 mg, smeltepunkt 109-110°C.

/"a_722= -50,4°C (c=0,5 i etanol). Rf<1> = 0,4l.

Elementæranalyse, C^ H^^ O^ Nq.^ HgO "

Beregnet: C 54,08, H 7,23, '' 2f ■ 18,68.

Funnet: C 53,79, H 7,09* N 18,34.

b) Fremstilling av Z-D-Leu-Nle-Arg(N02)-Pro-NH-CH2~CH,j.

I 5 ml 25 $-ig hydrogenbromid-iseddik oppløses 590 mg

Z-Nle-Arg(N02)-Pro-NH-CHg-CH^ og blandingen rystes i 30 minutter ved romtemperatur. Til dette settes 200 ml tørr eter, og den dannede felling frafiltreres, tørkes i eksikator over natriumhydroksyd. Produktet oppløses i 5 ml DMF og oppløsningen nøytrali-seres med 0,l4 ml trietylamin ved 0°C. Til dette settes 264 mg Z-D-Leu-OH, 216 mg HONB og derpå 247 mg DCC ved 0°C. Blandingen røres i 2 timer ved 0°C og i 10 timer ved romtemperatur og behandles derpå videre som beskrevet i eksempel l4-b, og gir 59^ mg av den søkte forbindelsen, smeltepunkt: 101-103°C.

/"a_7^3= -45,2°C (c=0,5 i metanol), Rf<1> = 0,55.

Elementæranalyse, C^^H^^OgN^.HgO

Beregnet: C 54,91, H, 7,68, N 17,47

Funnet: C 54,63, H 7,54, N 17,08 c) Fremstilling av (Pyr)Glu-Hi s-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Nle-Arg-Pro-NH-CHg-CH^.

I 4 ml 25 $-ig hydrogenbromid-iseddik oppløses 250 mg Z-D-Leu-Nle-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3 og blandingen rystes i 40 min. ved romtemperatur. Denne blandingen tilsettes 300 ml tørr eter og den dannede felling frafiltreres og tørkes i eksikator over natriumhydroksyd. •

Den fremstilte forbindelsen oppløses i 2 ml vann og oppløsningen fylles på en kolonne (l,2 x 7 cm 'Amberlite IR-45*'

fri form). Kolonnen vaskes grundig med vann. Eluat og vaske-vann slås sammen og frysetørkes. Produktet koples med 345 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH i 6 ml DMF i nærvær av 180 mg HONB og 206 mg DCC. Blandingen opparbeides og produktet renses ved kromato<g>raf ering på "Amberlite XAD-2<1>'som beskrevet i eksempel l4-c. Fjerning av nitrogruppen og rensing av det søkte peptidet gjennomføres også som beskrevet i eksempel l4-c). Utbytte 213 mg. /"a 7p3= -38,6° (c= 0,5 i 5 #-ig vandig eddiksyre). Rf<2>=0,10.

Aminosyreanalys<g>: (hydrolyse med 6N HC1 i nærvær av tioglykolsyre): His 0,98, Arg 1,00, Trp 0,91, Ser 0,95, Glu 1,00, Pro 1,08,

Leu 1,00, Nie 1,00, Tyr 0,96.

Eksempel 16.

Fremstilling av (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Val-Leu-. Arg-Pro-NH-CHg-CH^.

a) Fremstilling av B0C-D-Val-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CHo-CH3.

Til en oppløsning av 5^0 mg B0C-D-Val-0H(olje) og

1,14 g H-Leu-Arg^N02)-Pro-NH-CH2-CH3 i 10 ml DMF settes 537 mg HONB og 620 mg DCC ved 0°C. Blandingen røres i 3 timer ved 0°C og i 10 timer ved romtemperatur og filtreres. Filtratet inndampes under nedsatt trykk til tørrhet og residuet oppløses i 100 ml etylacetat. Oppløsningen vaskes med 0,1 N saltsyre, 5 $-ig natriumhydrogenkarbonat, tørkes over vannfritt natriumsulfat, og inndampes. Residuet gnis ut med petroleter som gir råproduktet, og dette utfelles fra etylacetat-eter. Utbytte 1,1 g, smeltepunkt: lkk- lk6°C (dekomp.).

/~a<_>7p3-z+3,7°C (c=l,0 i metanol). Rf<1> 0,55.

Elementæranalyse, Cg^H^^<O>gN^.^ H2°

Beregnet: C 52,39, H 8,18, N 18,96.

Funnet: C 52, ho, H 8,32, N 18,52.

b) Fremstilling av (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Val-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH3.

I 5 ml trifluoreddiksyre oppløses 300 mg B0C-D-Val-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CHg-CH^ og blandingen rystes i 30 minutter ved romtemperatur. Til dette settes 50 ml tørr eter og det dannede hvite faste stoff filtreres fra og tørkes tunder nedsatt trykk i eksikator over natriumhydroksyd. Stoffet oppløses i 20 ml 20 $-ig vandig metanol og oppløsningen påsettes en kolonne (l x 5 cm) "AmberliteIR-45" (fri form). Kolonnen vaskes med det samme opp-løsningsmiddel. Eluat og vaske-oppløsninger slås sammen, konsentreres til et lite volum og frysetørkes: 165 mg. Dette stoff (l50 mg) oppløses i 2 ml DMF sammen med 168 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-0H og 65 mg HONB, og blandingen avkjøles til 0°C,

Man tilsetter 75 mg DCC og blandingen røres i 2 timer ved 0°C

og i 12 timer ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen filtreres og fortynnes med 50 ml etylacetat. Fellingen frafiltreres, tørkes og renses ved kolonnekromatografering på silikagel ( k g).

For eluering benyttes Rf 2-solventsystem. De fraksjoner som inneholder det beskyttede nonapeptidet slås sammen og oppløsnings-midlet inndampes til tørrhet: l40 mg. Dette beskyttede nonapeptid (llO mg) behandles med 4 ml vannfritt hydrogenfluorid i nærvær av-0 ,1ml- -anisol og 0,02 ml- merkaptoetanol ved 0°C i en time.

Man fjerner hydrogenfluoridet under nedsatt trykk og residuet ekstraheres med 20 ml vann. Ekstraktet vaskes med eter og fylles på en kolonne (l, 5 x 3 cm) "Amberlite IRA-4001'(acetatf orm) , og kolonnen vaskes med vann. Eluat og vaske-væske slås sammen og frysetørkes. Stoffet oppløses i litt vann og oppløsningen settes på en kolonne (l,2 x 30 cm) karboksymetylcellulose. For eluering brukes en lineær gradient ammoniumacetat (0,005 M-0,2 M, 150 ml~150 ml). Den søkte forbindelsen går ut med fraksjonene 110 ml~130 ml. Disse fraksjoner slås sammen og frysetørkes. Utbytte 87 mg.

/"a 7^ P- -40,8° (c=0,5 i 5 #-ig vandig eddiksyre),

"2" T

Rf = 0,12, Rf<J> = 0,66.

Aminosyreanalyse (hydrolyse med 6N HC1 i nærvær av tioglykolsyre): His 1,00, Arg 1,02, Trp 0,85, Ser 0,95, Glu 0,98, Pro 1,02,

Val 0,91, Leu 0,95, Tyr 1,00, etylamin 1,01.

Eksempel 17.

Fremstilling av (Pyr) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Met-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH3. r-a) Fremstilling av BOC-D-Met-Leu-Arg(NO„)-Pro-NH-CH„-CH .

B0C-D-Met-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CHg fremstilles pa lignende

måte som beskrevet i eksempel l6a) ut fra 623 mg BOC-D-Met-OH, 1,14 g H-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3, 537 mg HONB, og 620 mg DCC. Utbytte 1,1 g: smeltepunkt: 125-130°C (dekomp.).

/~a_7f53 = -51,5°C (c = 1,0 i metanol), Rf<1> 0,59.

Elementæranalyse, C„ H_„OftN S

Beregnet: C 50,64, H 7,77, N 18,32, S 4,65.

Funnet: C 50,5-1, H 7,52, N 18,54, S 4,30. b) Fremstilling av (Pyr) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Met-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH3.

I'3 ml trifluoreddiksyre oppløses 300 mg BOC-D-Met-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CHg-CH^ og blandingen rystes i 20 minutter ved romtemperatur. Map tilsetter 40 ml tørr eter og den hvite fellingen frafiltreres og tørkes. Forbindelsen omdannes, til fri

/ \ " ill form ved a føres gjennom en kolonne (1x5 cm) Amberlite IR-45 (fri form) som beskrevet i eksempel l6-b).. Det resulterende,

delvis beskyttede tetrapeptid, H-D-Met-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CR^( lk7 mg) omsettes med 171 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH

i nærvær av 67 mg HONB og 77 mg DCC for fremstilling av det delvis beskyttede nonapeptid. Denne forbindelse renses på en kolonne av

"Amberlite XAD-2" og behandles med SnCl2.H20 i 60 #-ig vandig maursyre i 2 timer ved 80-85°C. Sluttproduktet renses ved kromatografering på "Amberlite XAD-2"og karboksymetylcellulose. Alle disse fremgangsmåter er som beskrevet i eksempel l6-b).

Utbytte 79 mg.

/~£X_7^5 = -39,6° (c=0,5 i 5 #-ig vandig eddiksyre), Rf<2> = 0,l6. Aminosyreanalyse (hydrolyse med 6N HC1 i nærvær av tioglykolsyre): His 1,02, Arg 1,00, Trp 0,90, Ser 0,89, Glu 1,00, Pro 1,00, Met 0,91, Leu 0,98, Tyr 1,02, etylamin 1,00.

Eksempel 18.

Fremstilling av (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ile-Leu-Arg-Pro-NH-CHg-CH^. a) Fremstilling av B0C-D-Ile-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CHg-CH^.

BOC-D-Ile-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3 fremstilles på lignende

måte som beskrevet i eksempel l6-a) fra 579 mg av B0C-D-Ile-0H, 1,1*4 g H-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH , 537 mg HONB og 620 mg DCC. Utbytte 0,9 g, smeltepunkt: 127-131 C (dekomp.).

/"a_7g3 = -48,3° (c = 1,0 i metanol).

Elementæranalyse, C^^ R^^ Oq N^,

Beregnet:' C 53,79, H 8,27, N 18,18.

Funnet: C 53,81, H 8,31, N 18,65. b) Fremstilling av (Pyr) Glu-Hi s-Trp-Ser-Ty r-D-I.le-Leu-Ar g-Pro-NH-CH2-CH3.

I 3 ml trifluoreddiksyre oppløses 300 mg B0C-D-Ile-Leu-Arg(N02) Pro-NH-CHg-CH^ og blandingen rystes i 25 minutter ved romtemperatur. Dette tilsettes ko ml tørr eter og den dannede felling frafiltreres og tørkes. Dette materiale omdannes til fri form ved å fylles på en kolonne (l x 5 cm) 'Amberlite IR-45" (fri form) som beskfevet i eksempel l6-b). Det resulterende, delvis beskyttede tetrapeptid, H-D-Ile-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CHg-CH^ (l*42 mg) omsettes med 171 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH, 67 mg HONB og 77 mg DCC, for fremstilling av det delvis beskyttede nonapeptid. Denne forbindelse renses på en kolonne av 'Amberlite XAD-2" og behandles derpå med SnCl2.Ho0 i 60 $-ig vandig maursyre- i 2 timer ved 80-85°C. Den søkte forbindelse renses ved kromatografering på "Amberlite XAD-2" og karboksymetylcellulose. Alle disse frem-gangsmåtér ér analoge med metoden beskrevet i eksempel 16-b). Utbytte 93 mg.

Z~a_/25 = -41,5°: (o=0,5 i 5.%.-ig ..vandig eddiksyre) .

Rf2 = 0,13, Rf3 = 0,66.

Aminosyreanalyse (hydrolyse med ,.6N HC1 i nærvær av tioglykolsyre: His 0,98, Arg 1,00, Trp 0,89, Ser 0,91, Glu 0,95, Pro 1,00,

Ile 1,00, Leu 1,00, Tyr 1,00, etylamin 1,01.

Ved forsøk har man oppnådd nedenstående data for den eggløsende virkning til foreliggende nonapeptidamidderivatene:

Nva = norvalin, Nie = norleucin, Abu = aminosmørsyre.

Den eggløsende aktivitet ble bestemt ved den metode som er.beskrevet i J. Med. Chem. 16, 1144 (1973) og sammenlignet med den til LH-RH ;

LH-RH = PyrGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Rro-Gly-NH2.

Claims

Analogifremgangsmåte for fremstilling av forbindelser med LH-RH aktivitet og med formelen: (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-R1-R2-R3-Arg-Pro-NH-R4

hvor R1 er Tyr eller Phe, R2 betegner D-Leu, D-Ile, D-Nle, D-Val, D-Nva, D-Abu, a-Aibu, D-Phe, D-Phg, D-Ser, D-Thr eller D-Met,

R3 er Leu, Ile eller Nie og R4 betegner alkyl med 1-3 karbonatomer, som eventuelt er substituert med hydroksyl, karakterisert ved at man.kondenserer en reagens (A) som er L-pyroglutaminsyre eller en forbindelse som helt eller delvis omfatter nevnte aminosyrefrekvens hvortil dennes terminale N-atom er bundet en L-pyroglutaminsyreenhet (dvs. (Pyr)Glu-), med en reagens (B) som er et amin tilsvarende resten av ovennevnte nonapeptid-amidderivat.