DK149231B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af enkephalin-analoge tetrapeptidamider eller syreadditionssalte deraf - Google Patents

Description

149231

Den foreliggende opfindelse angår en analogi fremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte enkephalin-analoge te-trapeptidamider, der udviser analgetisk virkning ved parenteral indgivelse, eller farmaceutisk acceptable, ikke-toxiske syreadditionssalte heraf.

5 For nylig er det lykkedes at ekstrahere endogene stoffer med morfin-lignende egenskaber fra hjernen eller cerebralspinalvæske hos pattedyr. Disse forbindelser, der benævnes enkephaliner, er identificeret af Hughes et al., Nature, 258, 577 (1975) som pentapeptider, der har de føl-10 gende sekvenser:

H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH

H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH.

Disse forbindelser benævnes henholdsvis methionin-enke-phalin og leucin-enkephalin.

15 Selv om man har påvist, at disse forbindelser har analge tisk virkning på mus, når de indgives intracerebroventri-kulært [Buscher et al., Nature, 261, 423 (1976)] udviser de praktisk taget ingen nyttig analgetisk virkning, når de indgives parenteralt.

20 Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes en gruppe af hidtil ukendte forbindelser, der udviser en bemærkelsesværdig analgetisk virkning ved systemisk indgivelse.

Fra beskrivelsen til dansk patentansøgning nr. 283/77 kendes enkephalin-analoge pentapeptider, der er nært be-25 slægtede med de ifølge opfindelsen fremstillede tetrapep-tidamider. Disse kendte pentapeptider har en nyttig analgetisk virkning, som imidlertid ikke er så udtalt som virkningen af de ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser.

149231 2

Forbindelserne fremstillet ifølge opfindelsen har den i krav l's indledning anførte almene formel I, og fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

5 Farmaceutisk acceptable ikke-toxiske syreadditionssalte omfatter organiske og uorganiske syreadditionssalte, såsom salte, der fremstilles ud fra saltsyre, svovlsyre, sulfonsyrer, vinsyre, fumarsyre, hydrogenbromidsyre, gly-colsyre, citronsyre, maleinsyre, phosphorsyre, ravsyre, 10 eddikesyre, salpetersyre, benzoesyre, ascorbinsyre, p~ toluensulfonsyre, benzensulfonsyre, naphthalensulfonsyre og propionsyre. De foretrukne syreadditionssalte er de, der er fremstillet med saltsyre, eddikesyre eller ravsyre.

Alle de ovennævnte syreadditionssalte kan fremstilles ved 15 kendte metoder.

Forbindelserne med formel I er som nævnt tetrapeptidami-der. Et bemærkelsesværdigt træk ved forbindelserne med formel I er deres stereokonfiguration. Af bekvemmelighedshensyn er aminosyreresterne i tetrapeptidamiderne med 20 formel I numereret sekvensvis begyndende med syreresten ved den terminale aminofunktion. Chiraliteten af amino-syreresterne fra stilling 1 til stilling 3 er L, D og ingen. Syreresten i stilling 3 er en glycingruppe, som ikke giver anledning til chiralitet. Med hensyn til stil-25 ling 4 (den C-terminale stilling) defineres chiraliteten i overensstemmelse med den tilsvarende L-aminosyre-rest.

Primær alkyl med 1-3 carbonatomer refererer til methyl, ethyl og n-propyl. 1

Med hensyn til syreresterne i de enkelte stillinger i tetrapeptidamidet med formel I gælder følgende: 3 149231

Aminosyreresten i stilling 1 (den amino-terminale del af peptidet) er afledt af L-tyrosin (Tyr). Syreresten i stilling 2 er afledt af D-alanin (Ala), og syreresten i stilling 3 er som nævnt afledt af glycin (Gly).

5 Aminosyreresten i den C-terminale stilling 4 er afledt af L-phenylalanin (Phe) og er et primært amid (Phe-NI^). Syreresten kan enten være usubstitueret eller substitueret på amino-nitrogenet (R^), idet R^ kan være methyl, ethyl eller n-propyl foruden hydrogen.

10 Desuden gælder det, at syreresten, når den er usubsti tueret på amino-nitrogenet, må være substitueret på a-carbonatomet (R^). I sådanne tilfælde betegner R^ methyl, ethyl eller n-propyl. Den eneste begrænsning er, at en 4 5 af grupperne R og R betegner primær alkyl med 1-3 car-15 bonatomer og den anden betegner hydrogen. Specielt foretrækkes det, at den primære alkylgruppe med 1-3 carbon- atomer er methyl. Særligt foretrukne forbindelser er så- 4 5 ledes de, i hvilke R eller R betegner methyl, og især foretrækkes forbindelsen, hvori R^ betegner methyl og er hydrogen. Endvidere foretrækkes forbindelserne, hvori 5 4 20 R er hydrogen og R er ethyl eller n-propyl.

I denne beskrivelse anvendes følgende forkortelser, af hvilke de fleste er kendte for fagmanden og ofte benyttet i den kendte teknik:

Ala - alanin

Phe - phenylalanin

Phe-NH2 - phenylalaninamid Tyr - tyrosin AC - acetyl

Me - methyl

Et - ethyl

Pr - n-propyl 4 149231

Boc - t-butyloxycarbonyl

Bzl - benzyl DCC - N,N'-dicyclohexylcarbodiimid HBT - 1-hydroxybenzoetriazol 5 DMF - N,N-dimethylformamid TFA - trifluoreddikesyre THF - tetrahydrofuran DEAE - diethylaminoethyl DCHA - dicyclohexylamin.

10 De omhandlede enkephalin-analoge tetrapeptidamider med formel I fremstilles ud fra de tilsvarende beskyttede derivater af forbindelserne med formel I. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fraspalter man de beskyttende grupper i et surt medium, idet man behandler et sådant 15 beskyttet derivat af den ønskede forbindelse med formel I med en syre, der fortrinsvis er trifluoreddikesyre, gasformigt HC1 i iseddikesyre eller myresyre.

De beskyttede derivater af forbindelserne med formel I, der benyttes som udgangsmaterialer ved fremgangsmåden 20 ifølge opfindelsen, kan fremstilles ved sædvanlige metoder til peptidsyntese.

Fremgangsmåden til fremstilling af de beskyttede derivater af forbindelser med formel I omfatter kobling af aminosyrer eller peptidgrupper ved at lade carboxyl-funktionen 25 af den ene og amino-funktionen af den anden reagere med hinanden til dannelse af en amidbinding. Til opnåelse af en effektiv kobling er det for det første ønskeligt, at alle reaktive funktioner, der ikke deltager direkte i reaktionen, inaktiveres ved anvendelse af passende bloke-30 ringsgrupper, og for det andet er det ønskeligt, at den carboxyl^funktion, der skal kobles, er passende aktiveret, således at koblingen kan finde sted. Alt dette kræver en omhyggelig udvælgelse af både reaktionssekvens 5 149231 og reaktionsbetingelser såvel som anvendelse af specifikke blokeringsgrupper, således at det ønskede peptid-produkt opnås. Enhver aminosyre, som anvendes til fremstilling af de beskyttede derivater og forbindelser med 5 formel I og som indeholder de udvalgte beskyttende grupper og/eller aktiverende funktioner, kan fremstilles ved i sig selv kendte metoder inden for peptidkemien.

Udvalgte kombinationer af blokerende grupper anvendes i hvert enkelt trin af den totale syntese af de beskyt-10 tede derivater og forbindelser med formel I. Ved at anvende disse bestemte kombinationer opnår man det bedste reaktionsforløb. Andre kombinationer end de foretrukne vil kunne anvendes ved syntesen af de beskyttede derivater af forbindelser med formel I, men dette 15 kan resultere i et mindre heldigt reaktionsforløb. Således kan grupper som f.eks. benzyloxycarbonyl (CBz), t-butyloxycarbonyl (BOC), t-amyloxycarbonyl (AOC), p-methoxybenzyloxycarbonyl (MBOC), adamantyloxycarbonyl (AdOC) og isobornyloxycarbonyl anvendes som amino-20 blokerende grupper ved syntesen. Desuden anvendes almindeligvis benzyl (Bzl) som hydroxy-beskyttende gruppe for tyrosyl-resten, selv om andre grupper, såsom p-nitrobenzyl (PNB) eller p-methoxybenzyl (PMB), også kan anvendes.

25 Som carboxyl-beskyttende gruppe ved syntesen kan anvendes enhver typisk esterdannende gruppe som f.eks. methyl, ethyl, benzyl, p-nitrobenzyl, p-methoxybenzyl og 2,2,2-trichlorethy1.

Koblingen af den passende beskyttede N-blokerede amino-30 syre eller peptidgruppe med en passende beskyttet carboxy-blokeret aminosyre eller peptidgruppe består i aktivering af den frie carboxyl funktion af aminosyren eller peptidgruppen. Denne aktivering kan foretages ved kendte metoder. En sådan aktivering omfatter omdannelse af carboxyl-35 funktionen til et blandet anhydrid. Den frie carboxyl funk- 6 149231 tion aktiveres gennem reaktion med en anden syre, der typisk kan være et carboxylsyrederivat, såsom et syrechlo-rid. Eksempler på syrechlorider, der kan anvendes til dannelse af blandede anhydrider, omfatter ethylchlorformiat, 5 phenylchlorformiat, see.-butyl-chlorformiat, isobutylchlor-formiat og pivaloylchlorid. Fortrinsvis anvendes isobutyl-chlorformiat.

En anden metode til aktivering af carboxylfunktionen inden gennemførelse af koblingsreaktionen består i en omdannel-10 se af carboxylfunktionen til dens aktive esterderivat. Sådanne aktive estere omfatter f.eks. en 2,4,5-trichlorphe-nylester, en pentachlorphenylester og en p-nitrophenyles-ter. Som koblingsmetode kan man også anvende den velkendte azid-koblings-metode.

15 Den foretrukne koblingsmetode ved fremstilling af de beskyttede derivater af forbindelser med formel I består i anvendelse af N,N'-dicyclohexylcarbodiimid (DCC) til aktivering af den frie carboxylfunktion, hvorefter koblingen kan foregå. Denne aktivering og kobling foregår ved anvendelse af 20 en ækvimolær mængde DCC i forhold til aminosyren eller peptidgruppen og gennemføres i nærværelse af en ækvimolær mængde 1-hydroxybenzoetriazol (HBT). Tilstedeværelsen af HBT modvirker uønskede sidereaktioner, herunder muligheden for racemisering. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

En fraspaltning af de udvalgte blokerende grupper er nød 2 vendig på bestemte steder i syntesesekvensen. Det vil være 3 let for fagmanden ud fra repræsentative beskyttende grup 4 per at udvælge sådanne, som er anvendelige i den forstand, 5 at en selektiv spaltning af produktet kan gennemføres ved 6 fjernelse af en eller flere, men ikke af alle de beskyt 7 tende grupper, der er tilstede på aminosyren eller pep 8 tid-sekvensen. En nøjere beskrivelse af de metoder, der 9 kan anvendes til selektiv spaltning, er beskrevet af Schro 10 der og Lubke, The Peptides, Volume I, Academic Press, New 11

York, (1965) og specielt i tabellen på siderne 72-75 i dette værk.

7 149231

Fraspaltningen af de carboxyl-beskyttende grupper kan gennemføres ved basisk hydrolyse. Der kræves relativt stærke basiske betingelser, f.eks. anvendelse af et alkalimetal-hydroxid såsom natriumhydroxid, kaliumhydroxid eller li-5 thiumhydroxid, til deesterificering af den beskyttede car-boxylgruppe. Reaktionsbetingelserne, under hvilke hydrolysen gennemføres, er velkendte. De carboxyl-blokerende grupper kan også fjernes ved katalytisk hydrogenolyse, f. eks. hydrogenolyse i nærværelse af en katalysator såsom 10 palladium-på-carbon. I de tilfælde, hvor den carboxyl- blokerende gruppe er p-nitrobenzyl eller 2,2,2-trichlor-ethyl, kan blokeringen ophæves ved reduktion i nærværelse af zink og saltsyre.

De amino-blokerende grupper kan fraspaltes ved at behand-15 le den beskyttede aminosyre eller det beskyttede peptid med en syre såsom myresyre, trifluoreddikesyre (TFA), p-toluensulfonsyre (TSA), benzensulfonsyre (BSA) eller napht-halensulfonsyre, til dannelse af det respektive syreadditionssalt. Fraspaltningen af den amino-beskyttende gruppe 20 kan også gennemføres ved at behandle den blokerede aminosyre eller det blokerede peptid med en blanding af eddikesyre og hydrogenbromidsyre eller saltsyre til dannelse af det tilsvarende hydrogenbromidsalt eller hydrogenchlorid-salt. Valget af metode og reagenser afhænger af de kemiske 25 og fysiske egenskaber af de materialer, der er involveret i den pågældende reaktion. I de tilfælde, hvor R4, betegner en anden gruppe end hydrogen, dvs. primær C^-C^-alkyl, og man ønsker at ophæve blokeringen af et peptid, der indeholder mindst tre aminosyrerester, foretrækkes det spe-30 cielt, at man ophæver blokaden af peptidet ved hjælp af trifluoreddikesyre eller myresyre til dannelse af det tilsvarende syreadditionssalt. Saltet kan omdannes til en farmaceutisk mere acceptabel form ved behandling med en passende ionbytter såsom "DEAE Sephadex® A25" eller "Am-35 berlyst® A27" .

8 149231

En hydroxy-beskyttende gruppe på tyrosylresten kan bevares under hele syntesen af det beskyttede derivat af forbindelsen med formlen I, idet gruppen fjernes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Afhængigt af 5 de betingelser, der anvendes ved fjernelse af den carboxyblokerende benzylgruppe, kan den hydroxy-beskyttende gruppe imidlertid fjernes på et tidligere trin af fremstillingen. Når carboxylgruppen fraspaltes ved basisk hydrolyse, tilbageholdes den hydroxy-beskyt-10 tende gruppe, hvorimod den fraspaltes sammen med den carboxy-beskyttende gruppe, når denne fjernes ved hjælp af katalytisk hydrogenolyse. Dette sidste tilfælde frembyder ikke noget væsentligt problem, idet fremstillingen af de beskyttede derivater af forbin-15 delser med formel I kan gennemføres i nærværelse af en tyrosyl-rest, der indeholder en fri hydroxylgruppe.

En foretrukken fremgangsmåde til fremstilling af de beskyttede derivater af forbindelser med formlen I består i sammenkobling af et separat fremstillet N-20 terminalt tripeptid og et separat fremstillet C-ter-minalt phenylalanylamid. Alternativt kan den separat fremstillede C-terminale phenylalanylforbindelse, som omsættes med det N-terminale tripeptid, struktureres således, at den indeholder en gruppe, der repræsenterer 25 et forstadium til amidgruppen. Den almene reaktions- sekvens, ved hvilken man fremstiller et tetrapeptidamid med formel I, kan illustreres på følgende måde.

9 149231 A. Fremstilling af tripeptid-delen.

BOC-L-Tyr-OH + H-b-Ala-OBzl

0Bzl ’ DCC

HBT

\ /

BOC-L-Tyr-D- Ala-OBzl I

OBzl OH" \ /

BOO- L-Ty r-D-A 1 a - O H I

OBzl H-Gly-OBzl

DCC

HBT

\ /

BOC-L-Ty r^D-A la-Gly-OBzl I

OBzl

Hz NaOH

Pd/C THF/HzO

\ / \ /

BOC-L-Tyr-D-Ala - G1 y - O H BOC-L-Tyr-D-Ala-Gly-OH

OBzl 149231 ίο B. kobling af tripeptidet og den terminale phenylalanyl-gruppe.

R4R50 BOC-L-Tyr-D-Ala-Gly-OH + HN-£-C-NH2 ch2

Ph

DCC

HBT

y r4r5q 5 BOC-L-Tyr-D-Ala -Gly-N-C-C-NH2 CH„ I 2

Ph I ovennævnte reaktion betegner Ph phenyl.

Efter at man har fremstillet det ønskede beskyttede te-trapeptid, der indeholder den C-terminale gruppe, kan den O-beskyttende gruppe i tyrosyldelen (hvis en sådan er til 10 stede) fjernes ved hydrogenolyse, og den N-BOC-beskytten- de gruppe kan fjernes ved behandling med trifluoreddike-syre.

Det i det ovenfor beskrevne repræsenterer kun en enkelt ud af flere mulige sekvenser til fremstilling af beskyt-15 tede derivater af forbindelser med formel I. En anden anvendelig metode omfatter en trinvis sekvensaddition af enkelte aminosyrer eller derivater deraf til opbygning af peptidkæde, idet man begynder med den terminale carboxamidgruppe. Ved denne metode, såvel som ved andre 20 anvendelige metoder, kan anvendes den i det foregående beskrevne reaktionsteknik.

En yderligere metode til fremstilling af de beskyttede derivater af forbindelser med formel I er fastfase- 11 149231 syntese. Ued denne metode bindes den C-terminale gruppe til en egnet polymerbærer, og peptidet opbygges med en gruppe ad gangen, indtil det ønskede peptid, som stadig er bundet til den polymere bærer, er syntetiseret.

5 Derefter fjernes peptidet fra bæreren ved anvendelse af et passende reagens. F.eks. kobles den C-terminale del, som er beskyttet ved α-aminogruppen med en t-butyl-oxycarbony1 gruppe, til en benzylhydrylaminopolymer ved hjælp af DCC-aktiveringen. N-BOC-gruppen kan fjernes 10 ved at omsætte den polymer-bundne rest med trifluoreddike-syre i methylenchlorid. Det resulterende salt neutraliseres med en passende tertiær amin, og sekvensen gentages ved addition af de efterfølgende aminosyrer. Når den ønskede peptidsekvens er opbygget, kan det blokerede peptid 15 fjernes fra den polymere bærer ved behandling med HF ved 0 °C. Herefter kan produktet renses ved chromatografi.

De nærmere betingelser ved syntesen, f.eks. reaktionstider, reaktionstemperaturer, udvaskning, reaktanter, beskyttende grupper og lignende, er alle kendte for fagman- 20 den. Fraspaltningen af peptidet fra den polymere bærer indbefatter fjernelse af alle blokerende grupper til dannelse af tetrapeptidet.

4 1 visse forbindelser med formel I betegner R en primær alkylgruppe med 1-3 carbonatomer. I sådanne tilfælde an- 25 vendes den passende N-substituerede aminosyre i den præparative sekvens. Enhver N-monosubstitueret aminosyre kan fremstilles som angivet i det følgende reaktionsskema, i-det man anvender en N-beskyttet aminosyre som udgangsmateriale : Η KH K+ B0C-N-(AA)-C00H -^ B0C-N“-(AA)-C00"K+ 18-krone-6-ether

THF

DMF C^-C^-primært alkyliodid (Ral)

V

Ra

B0C-N-(AA)-C00H

30 AA betegner en aminosyrerest.

12 149231

Som det fremgår af reaktionsskemaet, behandles den N-a-beskyttede aminosyre først med kaliumhydrid i nærværelse af en passende krone-ether til dannelse af dianionen. Mellemproduktet behandles derefter med et passende alkyliodid 5 til opnåelse af den ønskede N-substituerede aminosyre.

Det vil være velkendt for fagmanden, at der kan optræde racemisering ved a-carbonatomet under stærkt basiske betingelser, såsom de, der forekommer i den ovenfor beskrevne proces. Graden af racemisering kan variere i afhængig-10 hed af den involverede aminoforbindelse. Racemiseringen kan nedbringes til et minimum ved anvendelse af et overskud af alkyleringsmiddel og ved at holde reaktionstiden så kort som muligt. Når racemiseringen forekommer, kan man rense produktet ved omkrystallisation i form af sal-15 tet af en passende chiral amin, f.eks. som saltet af d(+)-ot-phenylethylamin.

4

Den resulterende aminosyre, i hvilken R betegner en primær alkylgruppe med 1-3 carbonatomer, kan omdannes til 20 det tilsvarende amid ved anvendelse af den i det foregå ende beskrevne teknik.

I visse andre forbindelser med formlen I betegner R^ en primær alkylgruppe med 1-3 carbonatomer. I disse tilfælde anvender man i den præparative sekvens en passende a-car-25 bon-substitueret aminosyre eller dens korresponderende ester- eller amid-derivat. Den a-carbon-susbtituerede phenylalanin kan fremstilles som beskrevet af Stein et al., Journal of the American Chemical Society, Vol. 77, 700-703 (1955). Adskillelsen af den racemiske blanding 30 kan gennemføres som beskrevet af Turk et al., J. Org.

Chem., Vol. 40, nol 7, 953-955 (1975). Den resulterende α-substituerede phenylalanin kan omdannes til det tilsvarende amid i overensstemmelse med i sig selv kendte metoder. Dette kan gennemføres enten før eller efter frem- 13 149231 stillingen af tetrapeptidsekvensen. Imidlertid foretrækkes det, at omdannelsen sker før fremstillingen af tetra-peptidet.

Forbindelserne med formlen I er nyttige farmaceutiske mid-5 ler. De udviser analgetisk virkning, og de er specielt nyttige, når de indgives parenteralt til pattedyr, herunder mennesker. Forbindelserne kan indgives som de er, eller de kan formuleres som farmaceutiske præparationer i enhedsdoser til parenteral indgivelse. Til brug ved sådan-10 ne formuleringer kan anvendes organiske eller uorganiske faste stoffer og/eller væsker, som er farmaceutisk acceptable bærestoffer. Sådanne egnede bærestoffer er velkendte for fagmanden. De farmaceutiske midler kan foreligge i form af tabletter, pulvere, granulater, kapsler, sus-15 pensioner, opløsninger og lignende.

Forbindelserne med formlen I vil frembringe en analgetisk virkning, når de indgives i en effektiv mængde. De generelle dosisniveauer er fra omkring 0,1 mg til omkring 100 mg pr. kg legemsvægt af recipienten. Den foretrukne do-20 sis er almindeligvis fra omkring 1,0 mg til omkring 20 mg pr. kg legemsvægt af recipienten.

Opfindelsen illustreres nærmere ved de følgende eksempler. EKSEMPEL 1

Fremstilling af L-tyrosyl-D-alanyl-qlycyl-Na-methyl-L-25 phenylalanylamid, acetatsalt A. Benzyl-D-alaninat p-toluensulfonat.

Til en blanding af 100 ml benzylalkohol og 200 ml benzen indeholdende 55,1 g (0,29 mol) p-toluensulfonsyre-mono-hydrat blev sat 25 g (0,281 mol) D-alanin. Blandingen 14 149231 blev opvarmet til tilbagesvaling, og vandet blev fjernet azeotropisk i et Dean-Stark apparat. Blandingen blev opvarmet i 15 timer, hvorefter den afkøledes til stuetemperatur og fortyndedes med ether. Det resulterende bundfald 5 blev opsamlet og omkrystalliseret fra methanol-ether til opnåelse af 55,3 g (56Si) produkt med smeltepunkt 112-115°C.

Analyse, beregnet for ci7H21N05S (351,42): C 58,10} H 6,02} N 3,99 C 58,19} H 6,06} N 3,82.

10 B. Benzyl-Na-t-butyloxycarbonyl-0-benzyl-L-tyrosyl-D- alaninat.

Til 200 ml tør Ν,Ν-dimethylformamid (DMF) blev sat 35,1 g (0,1 mol) af produktet fra afsnit A. Den resulterende blanding blev omrørt og afkølet til 0 °C, og der tilsat-15 tes 11, 2 g (0,1 mol) diazabicyclooctan (DABCO). Blandin gen blev omrørt i 10 minutter ved 0 °C, hvorefter der blev tilsat 37,1 g (0,1 mol) N -t-butyloxycarbonyl-O-ben-zyl-L-tyrosin, 13,5 g (0,1 mol) 1-hydroxybenzoetraizol (HBT) og 20,6 g (0,1 mol) N,N'-dicyclohexylcarbodiimid 20 (DCC). Den resulterende blanding blev omrørt ved 0 °C i tre timer og derefter ved stuetemperatur i 24 timer. Derefter blev blandingen afkølet til 0 °C, den resulterende suspension blev filtreret, og filtratet blev koncentreret i vakuum. Inddampningsresten blev opløst i ethylacetat 25 og udvasket successivt med IN natriumbicarbonat, vand, 0,75N kold citronsyre og vand. Derefter blev den organiske fase tørret over magnesiumsulfat, filtreret og koncentreret i vakuum. Den resulterende rest blev opløst i varm ethanol, og udkrystallisation fulgte ved afkøling. Efter 30 en enkelt omkrystallisation fra ethanol opnåedes 41,5 g (80%) rent produkt med smeltepunkt 121-123 °C.

14923 1 15

Analyse, beregnet for ^ø^jg^Og (520,63): C 69,21; Η 6,97; N 5,38.

Fundet: C 68,99; H 6,75; N 5,17.

C. Na-t-butyloxycarbony1-0-benzyl-L-tyrosy1-D-alanin.

5 Til en blanding af 200 ml tetrahydrofuran (THF) og 20 ml vand blev sat 13,2 g (0,06 mol) af produktet fra afsnit B. Den resulterende opløsning blev afkølet til 0 °C, hvorefter der langsomt blev tilsat 13,2 ml (1,1 ækvivalent) 5N natriumhydroxid. Den resulterende blanding blev omrørt, 10 og man lod den opnå stuetemperatur. Efter 5 timers for løb blev blandingen fordelt imellem vand og ether. Den vandige fase blev skilt fra og afkølet, og pH blev indstillet til 2 ved tilsætning af citronsyre, hvorefter blandingne blev ekstraheret med ethylacetat. Ethylacetat-15 ekstrakten blev udvasket med vand, tørret over magnesium sulfat, filtreret og fortyndet med ether. Det resulterende bundfald blev opsamlet til opnåelse af 17,7 g (67¾) produkt med smp. 160-162 °C.

Analyse, beregnet for ^24^30^2^6 (442,51): 20 C 54,14; H 6,83; N 6,63.

Fundet: C 64,73; H 6,70; N 6,20.

D. Benzyl-N -t-butyloxycarbonyl-0-benzyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycinat.

Til 70 ml tør DMF blev sat 6,74 g (0,02 mol) af p-toluen-25 sulfonsyresaltet af benzylglycinat. Den resulterende blanding blev afkølet til 0 °C, og der blev tilsat 2,24 g (0,020 mol) DABC0. Blandingen blev omrørt i nogle minutter, og der tilsattes 8,84 g (0,020 mol) af produktet fra afsnit C, efterfulgt af 2,7 g (0,020 mol) HBT og 4,12 g 30 (0,020 mol) DCC. Reaktionsblandingen blev omrørt i 2 ti mer ved 0 °C og derefter i 24 timer ved stuetemperatur.

16 149231

Den resulterende suspension blew afkølet til 0 °C og filtreret, hvorefter filtratet blev koncentreret i vakuum. Inddampningsresten blev opløst i ethylacetat og successivt udvasket med IN natriumbicarbonat, vand, kold 0,75N ci-5 tronsyre og vand. Den organiske fase blev tørret over magnesiumsulfat, filtreret og koncentreret i vakuum. Resten blev omkrystalliseret fra ethanol til opnåelse af 10,8 g (92%) produkt med smp. 145-147 °C.

Analyse, beregnet for C^H^N^O^ (589,69): 10 C 67,22; H 6,67; N 7,13.

Fundet: C 67,32; H 6,83; N 6,91.

E. N -t-butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycin.

Til 150 ml af en blanding af tetrahydrofuran og vand 15 (9:1) blev sat 15,95 g (27 mmol) af produktet fra afsnit D. Blandingen blev afkølet til 0 °C under omrøring, og der blev dråbevis sat 30 ml IN natriumhydroxid til den resulterende blanding. Blandingen blev omrørt i yderligere 2 timer efter at den dråbevise tilsætning var fær-20 dig, hvorefter den blev ekstraheret to gange med ether.

Den vandige fase blev skilt fra og gjort sur til pH 7,5 ved tilsætning af 30 ml IN saltsyre. Det udkrystalliserede produkt blev skilt fra ved filtrering og omkrystalliseret en gang fra en blanding af methanol- og vand, og 25 derefter to gange fra ethylacetat til opnåelse af 11,43 g (85S af det teoretiske udbytte) produkt med smp. 104-107 °C.

[a]p5 =-+31,4° (C = 0,5, MeOH).

Analyse, beregnet for ^26^33^3^7 (499,54): 30 C 62,51; H 6,66; N 8,41.

Fundet: C 62,31; H 6,83; N 8,12.

17 149231

Cfc Od F. N -t-butyloxycarbonyl-N -methyl-L-phenylalanin, d-(+) a-methylbenzylaminsalt.

Til 75 ml tetrahydrofuran blev sat 13,26 g (0,05 mol) Na-t-butyloxycarbonyl-L-phenylalanin. Den resulterende blan-5 ding blev i løbet af 30 minutter dråbevis sat til en me kanisk omrører i suspension af 0,15 mol kaliumhydrid og 0,5 g 18-krone-6-ether ved 0 °C under nitrogenatmosfære. Blandingen blev omrørt i endnu 1 time ved 0 °C. Derefter blev i løbet af 15 minutter dråbevis tilsat en opløsning 10 af 6,23 ml (0,1 mol) methyliodid i 15 ml tetrahydrofuran.

Efter 2 timers henstand blev der til blandingen dråbevis sat en blanding af 10 ml eddikesyre og 10 ml tetrahydrofuran efterfulgt af 20 ml ethanol. Derefter blev blandingen udhældt i 400 ml is. pH i den resulterende vandige 15 fase blev indstillet på 12-13 ved tilsætning af 2N natriumhydroxid. Den vandige blanding blev ekstraheret to genge med ether og derefter gjort sur til pH 3,0 ved tilsætning af fast citronsyre. Derefter blev den vandige blanding ekstraheret tre gange med 200 ml ether. Ether-eks-20 trakterne blev samlet, ekstraheret med vand, tørret over magnesiumsulfat og inddampet i vakuum til en sirup. Denne blev opløst i 50 ml ether, og der blev tilsat 6,44 ml (0,05 mol) d(+)-a-methylbenzylamin. Den resulterende opløsning blev fortyndet med 350 ml hexan, og produktet ud-25 krystalliserede ved skrabning. Efter filtrering opnåedes 15,83 g (79% af det teoretiske udbytte) produkt. Omkrystallisation fra ethylacetat gav 13,70 g (68% af det teoretiske udbytte) produkt med et smp. på 136-139 °C.

[all5 = -28>2°’ (c = EtOH).

30 Analyse, beregnet for Ε23Η32^2°4 (400,50): C 68,97; H 8,05; N 6,99 Fundet: C 68,75; H 7,81; N 6,74.

18 149231 G. Να-t-butyloxycarbonyl-Na-methyl-L-phenylalanylamid.

Na-t-butyloxycarbonyl-Na-methyl-L-phenylalanin (4,0 g; 0,01 mol; fremstillet ved at gøre d(+)-a-methylbenzyl-aminsaltet surt og ekstrahere det over i ether) blev op-5 løst i 20 ml Ν,Ν-dimethylformamid (DMF). Blandingen blev afkølet til -15 °C, og der blev tilsat 1,56 ml (0,012 mol) isobutylchlorformiat efterfulgt af 1,32 ml (0,012 mol) N-methylmorpholin. Reaktionsblandingen blev omrørt i 10 minutter ved -15 °C, hvorefter der blev blæst vandfri ammo-10 niak igennem reaktionsblandingen i 1,5 time. Blandingen blev omrørt i 1 time ved -15 °C, hvorefter den blev udhældt i en beholder, der indeholdt 200 ml is. Den vandige opløsning blev ekstraheret med ethylacetat, hvorefter den organiske fase blev skilt fra og udvasket successivt med 15 1,5N citronsyre, vand, IN natriumbicarbonat og vand. Ethyl- acetatopløsningen blev derefter tørret over magnesiumsulfat og inddampet i vakuum til en sirup, der udkrystalliserede fra en blanding af ether og petroleumsether til opnåelse af 2,12 g (76?ό af det teoretiske udbytte) pro-20 dukt med et smp. 91-92 °C [a]p5 = -111,2 °, (C = 0,5, CHClj).

Analyse, beregnet for ^1^22^2^3 (278,33): C 64,73; H 7,97; N 10,06.

Fundet: C 64,95; H 7,81; N 9,79.

OL

25 Η. N -t-butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-alanyl-

Qi glycyl-N -methy1-L-phenylalanylamid.

Til 20 ml frisk fremstillet iseddike indeholdende vandfri hydrogenchlorid (IN) og 2 ml anisol blev sat 1,95 g (0,007 mol) N -t-butyloxycarbonyl-N -methyl-L-phenylala-30 nylamid. Den resulterende blanding blev omrørt ved stue-tempartur i 30 minutter. Derefter blev blandingen udhældt i ether, og det dannede bundfald blev opsamlet og tørret 19 149231 (1,5 g). Hydrochloridsaltet blev derefter opløst i 30 ml DMF. Opløsningen blev afkølet til 0 °C, og der blev tilsat 1,4 ml (0,007 mol) dicyclohexylamin. Blandingen blev omrørt i nogle minutter, hvorefter der blev tilsat 3,5 g 5 (0,007 mol) Na-t-butyloxycarbonyl-0-benzyl-L~tyrosyl-D- alanyl-glycin, 950 mg (0,007 mol) HBT og 1,4 g (0,007 mol) DCC. Reaktionsblandingen blev omrørt, først ved 0 °C i 2 timer og derefter ved 4 "C i 24 timer. Herefter blev blandingen afkølet til 0 °C Qg filtreret. Filtratet blev kon-10 centreret i vakuum til en olie, som blev genopløst i ethylacetat. Ethylacetatopølsningen blev ekstraheret successivt med IN natriumbicarbonat, vand, kold 0,75N citronsyre og vand. Den organiske fase blev tørret over magnesiumsulfat og koncentreret i vakuum til en olie. Denne 15 olie blev kromatograferet på en 40 cm x 3 cm silicagel-kolonne i chloroform (Grace and Davison Grade 62). Produktet blev elueret ved brug af en trinvis gradient af chloroform til en blanding af 10¾ methanol i chloroform.

Produktet blev isoleret i overensstemmelse med tyndtlags-20 profilen af de opsamlede fraktioner til opnåelse af 3,55 g (77¾ af det teoretiske udbytte) produkt. [a]p^ = -9,2°, (C = 0,5, MeOH).

Analyse, beregnet for C^H^NjO-j (659,8): C 65,54; H 6,57; N 10,61.

25 Fundet: C 65,46; H 6,58; N 10,36.

Ct OL

I. N -t-butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N -methyl-L-phenylalanylamid.

Produktet fra afsnit H (3,2 g; 0,0485 mol) blev opløst i 60 ml ethanol, og der tilsattes 1,5 g 5¾ palladium-på-30 carbon i form af en vandig opslæmning. Der blæstes nitrogen ind i reaktionsblandingen igennem et gasdispersionsrør i omkring 5 minutter efterfulgt af hydrogen i 6 timer. Derefter blev reaktionsblandingen gennemblæst med nitrogen, 20 149231 og palladium-katalysatoren blev fjernet ved filtrering.

Blandingen blev koncentreret i vakuum til en sirup, som opløstes i chloroform og absorberedes på en 40 cm x 3 cm kromatografisk kolonne indeholdende Grace and Davison 5 Grade 62 silicagel. Produktet blev elueret ved hjælp af en trihvis gradient af chloroform til 10,¾ methanol i chloroform og blev isoleret i overensstemmelse med tyndtlags-profilen af de opsamlede fraktioner til opnåelse af 2,0 g produkt (74¾ af det teoretiske udbytte). [a]p^ = -9,9°, 10 (C = 0,5, MeOH).

Aminosyreanalyse: Fundets Gly, 1,01; Ala, 0,99;

Tyr, 0,99; NHj, 1,14.

Cfc J. L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N -methyl-L-phenylalanyl-amid, acetatsalt.

15 Produktet fra afsnit I (1,6 g; 0,00281 mol) blev opløst i 10 ml trifluoreddikesyre indeholdende 0,5 ml anisol.

Blandingen blev omrørt ved 0 °C i 30 minutter. Derefter blev blandingen udhældt i ether, og det dannede bundfald blev opsamlet og tørret (1,1 g). Det faste stof blev op-20 løst i en tilstrækkelig mængde vandig pufferopløsning (ΐ/ό pyridin og 0,05¾ eddikesyre) til at danne 15 ml opløsning, og opløsningen blev derefter overført tilden 2,5 cm· x 99 cm kolonne indeholdende DEAE Sephadex·^ A-25 (acetat), som forinden var bragt i ligevægt ved hjælp af 25 den samme puffer. Eluatet blev analyseret ved 280 nm, og passende fraktioner blev samlet og lyofiliseret. Re-lyo-filisering fra 10¾ eddikesyre efterfulgt af lyofilisering fra en 75:25 blanding af vand og acetonitril gav 0,85 g produkt. [a]jp = -27,8° (C = 1, IN HC1). 1

Aminosyreanalyse: Fundet: Tyr, 0,98; Ala, 1,03;

Gly, 1,00; NHj, 1,05.

21 149231 EKSEMPEL 2

Fremstilling af L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-a-methyl-phenylalanylamid, acetatsalt.

A. L-a-methylphenylalanin, benzylester, tosylatsalt.

5 Til 100 ml benzen blev sat 3,0 g (0,0168 mol) L-a-methyl-phenylalanin, og til den dannede suspension blev sat 3,5 g (1,1 ækvivalent) p-toluensulfonsyrehydrat og 10 ml ben-zylalkohol. Blandingen blev opvarmet under tilbagesvalind i nærværelse af en Dean-Stark væskefanger i 4 dage. Der-10 efter blev blandingen afkølet til stuetemperatur, og der blev tilsat ether til udfældning af tosylatsaltet. Det dannede bundfald blev opsamlet og tørret til opnåelse af 7,0 g (94¾9 produkt med et smp. 129-131 °C. [a]*5 =: -10,7°, (0 = 0,5, IN MeOH).

15 Analyse, beregnet for ^24^27^5^ (441,5): N 3,17 Fundet: N 2,87.

Cfc- ' * B. N -t-butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-oi-methylphenylalanin, benzylester.

20 Til 80 ml DMF blev sat 5,74 g (0,014 mmol) af produktet'· fra afsnit A. Blandingen blev afkølet til 0 °C i 5 minut--ter, hvorefter der blev tilsat 6,5 g (13 mmol) N0i-t-butyl-oxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycin (fremstillet som i eksempel 1), 1,8 g (13 mmol)-HBT og 2,7 g (13 25 mmol) DCC. Blandingen blev omrørt ved 0 °C i 2 timer og derefter ved stuetemperatur i 24 timer. Herefter blev blandingen afkølet til 0 °C, og det udskilte bundfald blev fjernet ved filtrering. Filtratet blev inddampet i vakuum, og inddampningsresten opløstes i ethylacetat. Den-30 ne opløsning blev successivt ekstraheret med IN natrium- 22 149231 bicarbonat, vand, 0,75N citronsyre og vand. Den organiske fase blev tørret over magnesiumsulfat og inddampet i vakuum til en olie. Denne blev udkrystalliseret fra ether og omkrystalliseret fra en blanding af ethylacetat og 5 ether til opnåelse af 7,0 g {12%) produkt. [a]^= +7,9°, (C = 0,5, MeOH).

Analyse, beregnet for £43^50^4^ (750,86): C 68,78; H 6,71; N 7,46.

Fundet: C 68,75; H 6,46; N 7,21.

10 C. Na-t~butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-α-methylphenylalanin, dicyclohexylaminsalt.

Til 50 ml ethanol blev sat 4,0 g (0,0053 mol) af produktet fra afsnit B. Der tilsattes 2,0 g 5¾ palladium-på-car-bon udrørt i DMF. Igennem et gasdispersionsrør blev blæst 15 nitrogen ind i opløsningen i 5 minutter og derefter hydrogen i 4 timer. Derefter blev blandingen gennemblæst med nitrogen, og palladium-katalysatoren blev fjernet ved filtrering. Filtratet blev koncentreret i vakuum til en sirup, som blev udrørt i chloroform og overført til en 10 cm 20 x 2 cm kolonne indeholdende Grace and Davison Grade 62 silicagel. Kolonnen blev elueret med en trinvis gradient af chloroform til en blanding af chloroform og methanol (9,5:0,5). Hovedfraktionerne blev kombineret, og opløsningsmidlet blev bortdampet. Den resulterende olie opløs-25 tes i ethylacetat, og der tilsattes 1 ml dicyclohexylamin.

Det resulterende bundfald blev opsamlet og tørret til opnåelse af 2,6 g C65?□ 9 produkt med et smp. 142-146 °C.

[a]*5 = 46,3° (C = 0,5, MeOH).

D. Na-t-butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-a-30 methylphenylalanylamid.

Produktet fra afsnit C (2,0 g; 0,0027 mol) blev neutrali- 23 149231 seret med en blanding af ethylacetat og 0,76N citronsyre.

Den organiske fase blev skilt fra, ekstraheret med vand, tørret over magnesiumsulfat og inddampet i vakuum til en olie (1,5 g). Den resulterende fri syre blev opløst i 30 5 ml DMF, og opløsningen blev afkølet til 0 °C i en trykkol be. Der tilsattes DCC (560 mg; 0,0027 mol), og blandingen blev omrørt i 4 timer ved 0 °C og derefter i 3 timer ved stuetemperatur. Derpå blev kolben afkølet til -78 °C, og der tilsattes 30 ml vandfri ammoniak. Kolben blev igen 10 lukket tæt, og blandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 48 timer. Derefter blev den afkølet til -78 °C, kolben blev åbnet, og man lod ammoniakken fordampe ved stuetemperatur. Derefter blev opløsningsmidlet bortdampet i vakuum. Inddampningsresten blev opløst i ethylacetat, og ethylace-15 tatopløsningen blev ekstraheret med 0,76N citronsyre og derefter med vand. Opløsningen blev tørret over magnesiumsulfat, og opløsningsmidlet blev bortdampet i vakuum. Inddampningsresten opløstes i chloroform, hvorefter den blev overført til en 3 cm x 45 cm kolonne med Grace and Davison 20 Grade 62 silicagel. Kolonnen blev elueret med en trinvis gradient fra ren chloroform til 10¾ methanol i chloroform.

De relevante fraktioner blev kombineret og gav, efter bortdampning af opløsningsmidlet, 1,1 g (72¾) produkt.

[a]p5 = -26 0 (C = 0,4, MeOH).

25 Aminosyreanalyse:

Fundet: Gly, 0,99; Ala, 1,00; Tyr, 0,99; NH^, 1,12.

E. L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-a-methy1-phenylalanylamid, acetatsalt.

Til 20 ml af en blanding af IN gasformig hydrogenchlorid 30 i iseddike indeholdende 0,3 ml anisol blev sat 900 mg (0,0016 mol) af produktet fra afsnit D. Blandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 30 minutter, hvorefter den blev udhældt i ether. Det dannede bundfald blev opsamlet 24 149231 og tørret' (720 mg). Det faste stof blev opløst i så meget vandig pufferopløsning (1¾ pyridin og 0,05¾ eddikesyre), at der opnåedes 5 ml volumen, og opløsningen blev overført til en 2,5 cm x 99 cm kolonne af DEAE Sephadex'0'A-25 (ace-5 tat), der for inden var bragt i ligevægt ved hjælp af den samme pufferopløsning. Passende fraktioner ved 280 nm blev kombineret og lyofiliseret. Re-lyofilisering fra 10¾ eddikesyre efterfulgt af lyofilisering fra en 75:25 blanding af 25 vand og acetonitril gav 400 ml produkt. [ot)p = +23,9° 10 (C = 0,5, IN HC1).

Analyse, beregnet for ^26^35^5^7 (629,60): C 58,97; H 6,66; N 13,22; 0 21,15.

Fundet: C 59,02; H 6,36; N 12,99; 0 21,41.

Aminosyreanalyse: 15 Fundet: Tyr, 0,96; Ala, 1,01; Gly, 1,00} NH^, 1,03.

EKSEMPEL 3

Fremstilling af L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-Na-n-propyl-L-phenylalanylamid, acetatsalt.

A. N^-t-butyloxycarbonyl-N^-n-propyl-L-phenylalanin.

20 Til 70 ml tetrahydrofuran blev sat 10,6 g (0,04 mol) Na-t-butyloxycarbony1-L-phenylalanin. Den resulterende blanding blev i løbet af 30 minutter dråbevis sat til en mekanisk omrørt suspension af 0,12 mol kaliumhydrid i 220 ml tetrahydrofuran og 0,5 g 18-krone-6-ether ved 0 °C i ni-25 trogenatmosfære. Blandingen blev omrørt i yderligere 10 minutter ved 0 °C, og i løbet af 20 minutter blev dråbevis tilsat en opløsning af 23,3 mg (0,24 mol) 1-iodpropan i 40 ml tetrahydrofuran. Blandingen blev holdt ved 0 °C i 2,5 timer, hvorefter der dråbevis blev tilsat yderli-30 gere 11,5 ml (0,12 mol) 1-iodpropan til blandingen. Denne 25 149231 blev omrørt i yderligere 2 timer ved 0 °C, der tilsattes 10 ml iseddike, og blandingen blev omrørt i endnu 10 minutter. Derefter blev blandingen hældt ud over knust is, pH i den resulterende vandige fase blev hævet til 8,0 ved 5 hjælp af 2N natriumhydroxid. Den vandige blanding blev ekstraheret to gange med ether, hvorefter den blev gjort sur til pH 2,5 ved tilsætning af kold 2N saltsyre. Derefter blev den vandige blanding ekstraheret med ethylace-tat. Ethylacetatekstrakten blev ekstraheret en gang med 10 vand, tørret over magnesiumsulfat og inddampet i vakuum til en sirup. Denne blev opløst i 200 ml ether, og der blev tilsat 8 ml (0,04 mol) DCHA. Det udskilte bundfald blev frafiltreret, og filtratet blev ekstraheret en gang med 1,5N citronsyre og vand. Etherfasen blev tørret over 15 magnesiumsulfat og inddampet i vakuum til en olie. Denne blev kromatograferet på en 40 cm x 3 cm kolonne af Grace and Davison Grade 62 silicagel i chloroform. Produktet blev elueret ved hjælp af en trinvis gradient af chloroform til en blanding af 5?ό methanol i chloroform. Ud fra 20 tyndtlagsprofilen af de samlede fraktioner isoleredes 3,6 g (31?ό af det teoretiske udbytte) produkt. [ct]p^ = -153,3 (C = 1, MeOH).

NMR S(-C02H) = 10,47; S(Me3C-) = 1,50

Analyse, beregnet for 0^^Η2^Ν0^ (307,4); 25 C 66,43; H 8,20; N 4,56.

Fundet; C 66,16; H 7,99; N 4,45.

CX OL

B. N -t-butyloxycarbony1-N -n-propyl-L-phenylalanylamid.

N -t-butyloxycarbonyl-N -n-propyl-L-phenylalanin (fremstillet i afsnit A) blev opløst i N,N-dimethylformamid 30 (DMF). Blandingen blev afkølet til -15 °C, og der blev tilsat en ækvivalent isobutylchloroformiat efterfulgt af en ækvivalent N-methylmorpholin. Blandingen blev omrørt i 26 149231 10 minutter ued -15 °C, og der blæstes uandfri ammoniak igennem blandingen i 30 minutter. Den resulterende blanding bleu omrørt i 1 time ued -15 °C, huorefter blandingen bleu udhældt i en beholder indeholdende 200 ml is. Den uan-5 dige opløsning ekstraheredes med ethylacetat, og den organiske fase skiltes fra og uduaskedes successiut med 1,5N citronsyre, uand, IN natriumbicarbonat og uand. Ethylace-tatopløsningen bleu derefter tørret over magnesiumsulfat og inddampet i uakuum til opnåelse af det ønskede produkt.

10 C. Na~t-butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-Na-n- propyl-L-phenylalanylamid.

Til 20 ml frisk fremstillet iseddike indeholdende uandfri hydrogenchlorid (IN) og 2 ml anisol bleu sat en ækuiualent Na-t-butyloxycarbonyl-Na-n-propyl-L-phenylalanylamid. Den resulterende blanding bleu omrørt ued stuetemperatur i 15 30 minutter. Derefter bleu blandingen udhældt i ether, og det udskilte bundfald bleu opsamlet og tørret. Hydrochlo-ridsaltet bleu opløst i 30 ml DMF, og opløsningen bleu afkølet til 0 °C, huorefter der tilsattes en ækuiualent dicyclohexylamin. Blandingen bleu omrørt i nogle minutter, 20 huorefter der tilsattes en ækuiualent N -t-butyloxycarbo- nyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycin (fremstillet som i eksempel 1E), en ækuiualent HBT og en ækuiualent DCC. Reaktionsblandingen bleu omrørt ued 0 °C i 2 timer og derefter ued 4 °C i 24 timer. Blandingen bleu afkølet til 0 °C 25 og filtreret. Filtratet bleu koncentreret i uakuum til en olie, som bleu genopløst i ethylacetat. Ethylacetatopløs-ningen bleu ekstraheret successiut med IN natriumbicarbonat, uand, kold 0,75N citronsyre og uand. Den organiske fase bleu tørret ouer magnesiumsulfat og koncentreret i 30 uakuum til en olie. Denne bleu kromatograferet på en 40 cm x 3 cm kolonne af Grace and Dauison Grade 62 silicagel i chloroform. Produktet bleu elueret ued hjælp af en trinuis gradient af chloroform til en blanding af 10?ό methanol i 27 149231 chloroform. Produktet blev isoleret i overensstemmelse med tyndtlagsprofilen af de opsamlede fraktioner til op- e Ot

nåelse af N -t-butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-ala-OL

nyl-glycyl-N -n-propyl-L-phenyl-alanylamid.

5 Det ovennævnte produkt blev opløst i 60 ml ethanol, og der blev tilsat 1,5 g 5¾ palladium-på-carbon i form af en vandig opslæmning. Igennem et gasdispersionsrør blev blæst nitrogen igennem reaktionsblandingen i 5 minutter efterfulgt af hydrogen i 6 timer. Derefter blev reaktionsblan-10 dingen gennemblæst med nitrogen, og palladium-katalysatoren blev fjernet ved filtrering. Blandingen blev koncentreret i vakuum til en sirup. Denne blev opløst i chloroform og absorberet på en 40 cm x 3 cm kromatografisk kolonne indeholdende Grace and Davison Grade 62 silicagel.

15 Produktet blev elueret ved hjælp af en trinvis gradient af chloroform til 10¾ methanol i chloroform og blev isoleret i henhold til tyndtlagsprofilen af de opsamlede fraktioner. [ct]= -34,8° (C = 0,5, MeOH).

Analyse, .beregnet for C^H^N^Oy (597,7): 20 C 62,29; H 7,25; N 11,72,

Fundet: C 62,13; H 7,24; N 11,70.

Ql D. L-tyrosy1-D-alany1-glycy1-N -n-propy1-L-phenylalany1-amid, acetatsalt.

Produktet fra afsnit C (800 mg; 1,34 mmol) blev opløst i 25 10 ml trifluoreddikesyre indeholdende 0,5 ml anisol. Blan dingen blev omrørt ved 0 °C i 30 minutter og derefter lyo-filiseret. Det faste stof blev opløst i tilstrækkelig meget vandig pufferopløsning (1¾ pyridin og 0,05¾ eddikesyre) til at danne 10 ml opløsning, og denne blev overført til 30 en 2,5 cm x 99 cm kolonne af DEAE-Sephadex® A-25 (acetat), som var bragt i ligevægt ved hjælp af den samme pufferop-løsning. Passende fraktioner ved 280 nm blev samlet og lyo-filiseret. Re-lyofilisering fra 1M eddikesyre gav 655 mg 28 149231 produkt. [ot]p5 = -11,0° (C = 0,5, IN HC1).

Analyse, beregnet for C28*^39N5^7 (557,6): C 60,31; H 7,05; N 12,56.

Fundet: C 60,23; H 6,98; N 12,49.

5 Aminosyreanalyse:

Fundet: Tyr, 0,99; Ala, 1,00; Gly, 1,01; NH^, 0,96.

EKSEMPEL 4

Fremstilling af L-tyrosyl-D-alanyl-qlycyl-N -ethyl-L-phenylalanylamid, acetatsalt.

10 A. N -butyloxycarbonyl-N -ethyl-L-phenylalanin,

Til 70 ml tetrahydrofuran blev sat 10,6 g (0,04 mol) Na-butyloxycarbonyl-L-phenylalanin. Den resulterende blanding blev i løbet af 30 minutter dråbevis sat til en mekanisk omrørt suspension af 0,12 mol kaliumhydrid i 220 ml tetra-15 hydrofuran og 0,5 g 18-krone-6-ether ved 0 °C i nitrogen-atmosfære. Blandingen blev omrørt i yderligere 10 minutter ved 0 °C, og en opløsning af 19,4 ml (0,24 mol) ethyliodid i 40 ml tetrahydrofuran blev dråbevis tilsat i løbet af 20 minutter. Blandingen blev holdt i 4 timer ved 0 °C.

20 Der tilsattes yderligere 19,4 ml (0,24 mol) ethyliodid i to lige store portioner. Blandingen blev omrørt i yderligere 2 timer ved 0 °C, hvorefter der tilsattes 10 ml iseddike. Efter 10 minutters omrøring blev blandingen udhældt over 400 ml knust is. pH af den resulterende vandige fase 25 blev hævet til 8,0 ved tilsætning af 2N natriumhydroxid.

Den vandige blanding blev ekstraheret 2 gange med ether og derefter gjort sur til pH 2,5 ved tilsætning af kold 2N saltsyre. Derefter blev den vandige blanding ekstraheret med ethylacetat. Ekstrakten blev udvasket med vand, 30 tørret over magnesiumsulfat og inddampet i vakuum til en 29 149231 sirup. Denne blev opløst i 200 ml ether, og der tilsattes 8 ml (0,04 mol) DCHA. Det udskilte bundfald blev frafiltreret, og filtratet blev ekstraheret med 1,5N citronsyre og vand. Etherfasen blev tørret over magnesiumsulfat og 5 inddampet i vakuum til opnåelse af 4,6 g (39¾ af det teo retiske udbytte) produkt. NMR (phenyl) = 7,2; 0 (Me^COC-) = 1,4.

B. Nm-t-butyloxycarbonyl-Na-ethyl-L-phenylalanylamid.

10 N -t-butyloxycarbonyl-N -ethyl-L-phenylalanin (4,3 g; 0,0146 mol; fremstillet i afsnit A) blev opløst i 60 ml N,N-dimethylformamid (DMF). Blandingen blev afkølet til 0 °C, og der blev tilsat 3,0 g (0,0146 mol) N,N1-dicyclo-hexylcarbodiimid (DCC). Reaktionsblandingen blev omrørt i 15 2 timer ved 0 °C og derefter i 72 timer ved stuetempera tur. Derefter blev blandingen afkølet til 0 °C og filtreret. Filtratet blev koncentreret i vakuum til en olie, som blev genopløst i ethylacetat. Opløsningen blev ekstraheret med IN natriumbicarbonat, vand, kold 1,5N citronsy-20 re og vand. Den organiske fase blev tørret over magnesium sulfat og koncentreret til opnåelse af 3,93 g (91¾ af det teoretiske udbytte) produkt. [cOp = -101,51° (C = 1,

MeOH).

Analyse, beregnet for (292,4): 25 C 65,73; H 8,27; N 9,58.

Fundett C 66,03; H 8,13; N 9,85.

C. Na-ethyl-L-phenylalanylamid, hydrochloridsalt.

Na-t-butyloxycarbonyl-Na-ethyl-L-phenylalanylamid (3,5 g; 11,95 mM; fremstillet i afsnit B) blev opløst i 40 ml frisk 30 fremstillet iseddike indeholdende vandfri hydrogenchlorid (IN) og 1,5 ml anisol, samt 1,5 ml (C2H^)SiH. Den resulte- 30 149231 rende blandings blev omrørt ved stuetemperatur i 30 minutter, hvorefter blandingen blev udhældt i ether, og det dannede bundfald blev opsamlet og tørret til opnåelse af 2,6 g (95¾ af det teoretiske udbytte) produkt med et smp. 276-277 °C.

5

Analyse, beregnet for C^H^g^OCl (227,7): C 58,02; H 7,08; N 12,30.

Fundet: C 57,97; H 7,26; N 12,54.

OL ft D. N -t-butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N - 10 ethyl-L-phenylalanylamid.

Til 50 ml DMF blev sat 1,14 g (0,005 mol) Na-ethyl-L-phe-nyl-alanylamid, hydrochloridsalt, (fremstillet i afsnit C). Blandingen blev afkølet til 0 °C, hvorefter der tilsattes 2,95 g (0,005 mol) Na-t-butyloxycarbony1-L-tyrosyl-D-ala-15 nyl-glycin, DCHA salt. Blandingen blev omrørt ved 0 °C i 5 minutter, hvorefter der tilsattes 675 mg (0,005 mol) HBT og 1,03 g (0,005 mol) DCC. Reaktionsblandingen blev om-rørt ved 0 "C i 6,5 timer og derefter ved stuetemperatur i 20 timer. Derefter blev blandingen afkølet til 0 °C og 20 filtreret. Filtratet blev koncentreret i vakuum til en olie, som blev genopløst i ethylacetat og ekstraheret med IN natriumbicarbonat, vand, kold 1,5N citronsyre og vand.

Den organiske fase blev tørret over magnesiumsulfat og koncentreret i vakuum til en olie. Denne blev kromatogra-25 feret på en 40 cm x 3 cm kolonne af Grace and Davison Grade 62 silicagel i chloroform. Produktet blev elueret ved brug af en trinvis gradient af chloroform til en blanding af 15¾ methanol i chloroform. Ud fra tyndtlagsprofilen af de opsamlede fraktioner isoleredes 1,13 g (39¾ af det teo-30 retiske udbytte) produkt. [01]^ = -21,0° (C = 0,5, MeOH).

Analyse, beregnet for ^30^41^5^7 (583,7): C 61,73; H 7,08; N 12,00.

Fundet: C 60,35; H 7,26; N 11,25.

31 149231

OL

E. L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N -ethyl-L-phenylalanylamid, acetatsalt.

Produktet fra afsnit D (1 g; 1,71 mmol) blev opløst i 20 ml trifluoreddikesyre indeholdende 3 ml anisol og 3 ml 5 (C2H^)jSiH. Blandingen blev omrørt ved 0 °C i 30 minutter, hvorefter den blev udhældt i ether, og det dannede bundfald blev opsamlet og tørret (660 mg). Det faste stof blev opløst i en tilstrækkelig mængde vandig pufferopløsning (1¾ pyridin, og 0,05¾ eddikesyre) til at danne 10 ml op-10 løsning, og denne blev^overført til en 2,5 cm x 90 cm ko lonne af DEAE-Sephadex^A-25 (acetat), som var bragt i ligevægt ved hjælp af den samme pufferopløsning. Der blev opsamlet passende fraktioner ved 280 nm, og disse blev kombineret og lyofiliseret. Det faste stof blev opløst i 15 0,2M eddikesyre (10 ml), og opløsningen blev kromatogra- feret på en 2,5 cm x 99 cm kolonne af G-10 Sephadei^, som var bragt i ligevægt ved hjælp af det samme opløsningsmiddel. Ved 280 nm opsamledes passende fraktioner, som blev kombineret og lyofiliseret til opnåelse af 448 mg (48¾ af 20 det teoretiske udbytte) produkt, [a]jp = -10,6° (C = 0,5, IN HC1).

Analyse, beregnet for C27H37N5O7 (543,6): C 59,65; H 6,86; N 12,88.

Fundet: C 59,41; H 7,26; N 13,18.

25 Aminosyreanalyse:

Fundet: Tyr, 1,03; ALa, 0,99; Gly; NH^, 0,98.

Forbindelserne med formel I er nyttige som analgetica. Den analgetiske virkning af forbindelserne med formel I demonstreres ved et varmeplade-forsøg på mus. I dette forsøg an-30 bringes en mus inden i en lodret acrylcylinder, der som bund har en varmeplade, der opretholdes på 52 °C. Ved forsøget indgives musen subkutant en forud bestemt mængde testforbindelse opløst eller suspenderet i en passende bæ- 32 149231 rer. Efter et passende tidsrum anbringes musen på varmepladen, og man bestemmer (i sekunder) latensperioderne, indtil to separate fænomener optræder. For det første måler man den latenstid, der går, før musen slikker sin bagpote, 3 og for det andet måler man den latenstid, der går, før mu sen springer væk fra varmepladen. En analgetisk virkende forbindelse bevirker en forøgelse af disse latenstider sammenlignet med kontrolmus, som kun er blevet injiceret med bærestoffet. I de efterfølgende tabeller er angivet resul-10 taterne, der opnåedes ved denne test, sammenlignet med en kontrolprøve (salt). I tabel I er anført den latenstid, der forløber, før musen slikker sin bagpote, og i tabel II er angivet den latenstid, der forløber, før musen springer væk fra varmepladen. Kriteriet for en bekræftet anal-15 getisk virkning er følgende: Latenstiderne for behandlede dyr skal være lig med eller større end den gennemsnitlige kontrol-latenstid plus to standardafgivelser af middelværdien. Resulateterne anført i de følgende tabeller I og II repræsenterer middelværdien plus eller minus standardaf-20 vigelse.

33 149231

O I I I I I I I I I

fO

CM H 'ί ChH CM * *<> Η ΚΛ in 0\ LH Λ Λ Λ **

CM H IS VO ΓΟ CM

b +i i +i +i +1+1 i i +i

H IS CM CM O CM

fk ·»·««·» Λ

-ί Η H VO CM O

Η Ο N 4 IA

Η H

ΙΛ ΙΛ CM VO

IV »V

CM IS

ro +i +i i i i i i i •I rt

bl CM H

Φ i hC ** ·* tii x <2 cJ| \ m -5 3i 5c ,*!» ε

(Dl CM

Oil · *

I 01 CM

H *H

hi ω H i +i i i i i » i i

CD I O

-Pi Q ΙΛ

Ol ·> H

QJ fO S- in 5a m ·> ··

511 (dl CM H

β r^l ,, , , t

•Η I +1 +1 I

ΰ ‘hi m i i i i i i .

h x cdi » -d· o in I O ·» *> rH Ή hCl CTV "ί Θ ► $3l CM ΓΛ

fit -HI

B| il til Λ

EH 01 ^1 ^ SHC\INO\^HO^N

p HI ? HtncMCMOOfnHH

Φ oil π 5t I ΐ +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1

i f a U

do! 5 lfl<f<fOCMCMOiOO

<2l wVOrimcMCOCOVOir\CO

•di _ cMmmmcMCMcMcMcM

•HI °

-PI <D

Oil U 01 fll ®H

0)1 -P 0) -Pi *H > Sti φιφ·η·η minmooomino

Jl 50 fi HHHmvOCT\HHCM

Tti Ό H

•H 53 Eh *H

P

0) ta

H

0)

rS

fi , •H <ti £ £ 1A9231 34

O i I I I I 1 I i I I I I

to to to

\0 O H

« « H CO m vo vo H

r\| o ·. ·.·>*>·* ·> Η

H H VO fOlOtOH to O

H +1 I +1 +1 I +1 +1 +1 +1 I +1 i +· <j- <r <t" O H VO CO H o •s A ·« ·* r »» Λ Λ * to σ\ to ο- ο σ> to οο ο md ιλ <J- to to cm cm in <f

CM

CM H

to CM CM

" ^ oT ^ n “ N +,.+.

co +.+...1,1111,

y CM CM

su, o- irv lcr + mi * * i·*» *>r § ω in o „ r°> ^ o! g to <t κχ.

gj -+ σ\ gj CQ to CM to “I M CM +,,+.1 +Γ Ui P H 1 +1 « I I I I I I ™ w +>! ® w w +> o, _r to <r o Ml Si lo tO fO ^ <H S Si σι to !>-

w ί ·°| to H cm" CM

H I 'SI O 1 1 1 1 ......

^ £ yj CTt · cr> o

rt v< ·η! H CM CM

B I |{ ^ IO to

ΦΗΙ -h C'-C'-CTvCrtOtvOVO<l‘C,--COISC'-H

hf ΓΑ· Ο

ι t-ι HHvOvOHCMCMHHHHCMH

Ο ο! c +1 +| +| +| +| +1 +, +, +, +, +, +« +, JJ 6_J| Ο

^ I N-^COOOOOOlSO'iHWN

(Hi ν-''

•Η C^HCAOtinOOtOCOvOUJOlO

43| CD O CMtOCMCMCMtOtOCMCMCMCMtOCM

to. β w βΙ ®H Φ. P φ ^ lo! φ·η β toioootoooooioioioio

J| 60<H HHtOvOHvQCJvCMCMHHHH

-d-d g HH

Η β ^

EHH

P

Φ 01

H

ω s pq o n •πί fl £ 35 149231

O I I I I I I I I I I I I I

ro

i—I i I

Η H CO CM ro HH <f O- H ts * ·> 00 O C— - *

» ·% C\J f» λ ·» KO KO

Q\ CM Η H CT\ C*""*- ri rH

O +1 I +1 +1 +1+1 I I +1 +1 i +1+1 H CM ro cm o cm is cm ro -+ f> M ft ft ft ft ft ft ** CM N 0> ΙΛ O >+ CO CO CT\

CM rOCOOH O CM H CO

CM CMHHH H CM CM

Η H HH

CO O lO CM

A ft ft ^ is ro

HH HH

ro +i +i i i i i i i i +i +i i i H '••i* <1* ro A ft ft ft ro o cm -¾ tn in -+

ri Η H HH

hl tit ϋΐ H cm βΐ ω es ·

3l g H

.Si to cm 0)1 *

CO I 10 +1 I I I I I I I I +1 I I

I Ή

H CO lO CM

ωι oh ~ ~ •di p co w

ril CM H

Hl Η H

P| 2»

fil ISH

bil hl " H

β ril -+

H *H >1 ro H CO

Η β I ·> I I I I I I

M ril o +i +i i i i i i H h h* Λ1 ^

0) ·Η <HI CM O

,Ω > | »-

ri bflf CO S

(H .Μ βΙ CM O

CO ·ΗΙ Η Η ^ Λ Λ

•η hi --- ro VO CO

-P P| -i tSH-d'HCOCOCDHCMin·'···« φ cQ| O ************ O <T •»Ci’

b£ I <-> <rO)b-cOCOCOvOO)<ririHHH

ri Ol C +| +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 d Vil o <! I <t-HCMCMiniOSISC0C0acC0C0 ιτ-j I s»/ ftftftftftftftftftftftftft hi cd mcMOOOororoavrocMroro

PI h CO O <TCOCOCOCOCOSCOCO<fCONIS

CO I <DH /-> βι +> ω · <D| <M > β _ -pi <o η -H inininooominoininoo

ril bog HHHfOCOOvHHCMHHrocO

β| riri ^ H

•Η β Eh Η

rQ

<D

co

H

0) •ri β < m

•H

,Ω h

O

fe 36 149231

O I I I I I I I I I

tO

tov H

CM CM <M 0- H

• ΙΛ 00

ΚΛ *- *- (—I ·* H

H l· in H CM O

O I +1 +1 +1 +Γ I +1 · +1

tO -+ H vo O

A ·» «V » ·* ^ cn -i vD c*- o 00 CO O CM to <f

HH CM CM

Η H

CTi CM

•t Φ*

C'- VO

Η H

IO I I I I I I +1 I +1 O <f * * in co

in H

H cm fcl <s ,

<DI &£ Η H

dl .y CM O

H i V,, ·» » 3i bi -+ m

,ΜΙ g HH

(Dl

Ml · H I I I I 1 +1 I +1 I

I CO

HH VO H

,Η ©I tQ ~ -P 'di o o in (0 (01 P CM <g

03 Hl HH

+3 Qi

S ©I H CM CM

o Si oo in i>- H Ml Si - “ —' S cdi in in in

H f>l H HH

H d I to H ,¾ cOl **+11111+11+11

L 0j| O

Η H *HI C«- (Ti CM

ø > I ·* ·> ·>

py* O 00 H

(0 ,¾ Si ΙΟ H CM

Éh CO Hl H HH

Η St ^ -p pj (DtQ| ^ HCOCOSWmSNl·

^ I O

h hi £ oiininin-i + inss S Hl q +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1

Tf! -* NCMCM-dOONlOCOH

•pj I w -Pi © _ toaiCTiOiavcMintoov ιοί Jhcq ° iDininMOiOMOt«

Si ©H^~ (Dl +> (D ·

-PI H > S

si ©HH inoooomininin

Hl hog HVOOVCMCMHHHH

tJ Η H

H S EHH

& ©

tQ

H

© s m o π

•H

s (2 37 149231

Noter til tabellerne: a. Tallene "1", "2" og "3" angiver at resultatet er signifikant henholdsvis til P<0,001, P<0,001 og P<0,5.

b. Betegnelserne angiver følgende forbindelser: 3 A. L-tyrosyl-D-alany1-glycyl-N -methyl-L-phenylalanylamid, acetatsalt (eksempel 1).

B. L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-a-methylphenylalanylamid, acetatsalt (eksempel 2).

C. L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-Na-n-propyl-L-phenylalanyl- 10 amid, acetatsalt (eksempel 3).

Ot D. L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N -ethyl-L-phenylalanylamid, acetatsalt (eksempel 4).

Der er også foretaget sammenligninger imellem en nært beslægtet enkephalin-analog peptid-forbindelse og to forbin-15 delser fremstillet ifølge opfindelsen. De undersøgte for bindelser er hver især underkastet to dyreforsøg, nemlig dels det ovenfor beskrevne varmeplade-forsøg med mus og dels det såkaldte "vas deferens-forsøg", ligeledes med mus.

Det sidstnævnte forsøg er et standardforsøg, der er be-20 skrevet i US patentskrift nr. 4 322 339.

Ud over de ovenfor angivne forbindelser A (fra eksempel 1) og B (fra eksempel 2) undersøgtes den følgende sammenligningsforbindelse:

Forbindelse E: Η-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-NH-CH^ (kendt sammen-25 ligningsforbindelse).

Der opnåedes følgende resultater: 38 149231

TABEL III

Varmeplade-forsøg Vas Deferens Forbindelse mg/kg (subcutant) ICcn

ED 5U

_lu30_ A 0,34 396 5 B 0,47 115 E 12,1 2740 ED50 er den dosis i mg/kg, som giver ophævet smertevirkning hos 50% af forsøgsdyrene, og den beregnes ved regressionsanalyse af fundne dosis-respons-data. Hver dosis-res-10 pons-kurve indeholder mindst fire punkter, og hvert punkt bestemmes på grundlag af data fra mindst 10 behandlede mus og 10 kontrolmus.

Ved IC^g forstås den koncentration ( i nmol), som ophæver 50% af de elektrisk fremkaldte kontraktioner. Ved dette 15 forsøg suspenderes enkelte vas Deferens fra voksne mus (Cox, 30-40 g) i 3 ml modificeret Krebs' opløsning, som er beluftet med 95% 0^/5% CO^ og holdt ved 37 °C. De vridninger, som induceres ved feltstimulering (0,15 Hz, 1 msek, 40V), optegnes på en polygraf via en isometrisk' transducer.

20 Testforbindelsen sættes til badet i prøver på 20-30^ul. En dosis-respons-kurve konstrueres ved kumulativ tilsætning af passende mængder af forbindelsen til badet.

Af de i tabel III angivne resultater fremgår det, at forbindelserne fremstillet ifølge opfindelsen er betyde-25 ligt mere virksomme end nært beslægtede kendte forbindelser.

Claims (3)

149231 Patentkrav :

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af enkephalin-analoge tetrapeptidamider med den almene formel (L) (D) (L) 000 r4r5o H„N-CH-C-NH-CH-C-NH-CH0-C-N-C-C-NH0 (I)

2. Analogifremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg- 15 net ved, at det sure medium er trifluoreddikesyre, is- eddikesyre og gasformigt hydrogenchlorid, eller myresyre.

2. I 2 J 2 6 0 0Ή hvori L og D definerer aminosyrerestens chiralitet, og hvori

5 R4 og R^ hver for sig er hydrogen eller primær C.-C..-alkyl, 4 5 1-5 idet den ene af grupperne R og R er hydrogen og den anden er primær C^-C^-alkyl, eller farmaceutisk acceptable, ikke-toxiske syreadditionssalte heraf, kendetegnet ved, at man i et surt medium spalter beskyttelses-10 grupperne fra tilsvarende beskyttede derivater af forbin delserne med formel I, hvorefter man om ønsket omdanner de fremkomne forbindelser til farmaceutisk acceptable, ikke toxiske syreadditionssalte deraf.

3. Analogi fremgangsmåde ifølge krav 1 til fremstilling af acetatsaltet af L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-Na-methyl-L-phenylalanylamid, kendetegnet ved, at man om- 20 sætter Nffi-t-butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl- Na-methyl-L-phenylalanylamid med trifluoreddikesyre og lyofiliserer den fremkomne forbindelse fra eddikesyre.