Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych pochodnych czteropeptydów.W ostatnich latach droga ekstrakcji mózgów lub plynu mózgowo-rdzeniowego ssaków wydzielono substancje eudogenne o wlasciwosciach zblizonych do morfiny. Substancje te, zwane enkefalina, zo¬ staly zidentyfikowane przez Hughes'a i wspólpra¬ cowników (Nature, 258, 577 (1975)) jako pieciopep- tydy o nastepujacych sekwencjach: H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH zwane odpowiednio metionino-enkefalina i leucy- no-enkefalina.Jakkolwiek stwierdzono, ze powyzsze zwiazki maja dzialanie przeciwbólowe gdy podaje sie je myszom do komór mózgowych (Buscher i wspól¬ pracownicy, Nature, 261, 423 (1976)), to jednak praktycznie nie wykazuja one wcale tego dziala¬ nia przy podawaniu pozajelitowym.Obecnie odkryto sposób wytwarzania nowych po¬ chodnych czteropeptydów, wykazujacych silne i dajace sie udowodnic dzialanie przeciwbólowe przy podawaniu doukladowym.Sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie no¬ we pochodne czteropeptydów o ogólnym wzorze 1, w którym Rx i R2 sa jednakowe lub rózne i oznaczaja atom wodoru lub pierwszorzedowy rod¬ nik alkilowy o 1—3 atomach wegla, R3 oznacza pierwszorzedowy lub drugorzedowy rodnik alkilo- 10 30 wy o 1—4 atomach wegla lub grupe o wzorze CH3—S—CH2—CH2—, R4 oznacza atom wodoru lub pierwszorzedowy rodnik alkilowy o 1—3 atomach wegla, R5 oznacza atom wodoru lub pierwszorze¬ dowy rodnik alkilowy o 1—3 atomach wegla, Y o- znacza atom wodoru lub rodnik acetylowy, Z ozna^ cza grupe aminokarbonylowa, hydroksymetylowa lub cyjanowa, przy czym gdy jeden z podstawni¬ ków R4 i R5 oznacza pierwszorzedowy rodnik alki¬ lowy o 1—3 atomach wegla, wówczas drugi z nich oznacza atom wodoru, a L i D oznaczaja konfigu¬ racje absoiutna na atomach wegla stanowiacych centra chiraln-e, a takze addycyjne sole tych zwiaz¬ ków z farmakologicznie dopuszczalnymi, nietok¬ sycznymi kwasami.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze ze zwiazku o wzorze 1 zabezpieczonego odpowie¬ dnimi grupami blokujacymi odszczepia sie grupy blokujace za pomoca substancji o charakterze kwa¬ sowym.Addycyjnymi solami z farmakologicznie dopusz¬ czalnymi, nietoksycznymi kwasami moga byc ad¬ dycyjna sole z kwasami nieorganicznymi i orga¬ nicznymi, np. z kwasem solnym, kwasem siarko¬ wym, kwasem sulfonowym, kwasem winowym, kwasem fumarowym, kwasem bromowodorowym, kwasem glikolowym, kwasem cytrynowym, kwa¬ sem maleinowym, kwasem fosforowym, kwasem bursztynowym, kwasem octowym, kwasem azoto- U4 2713 ,ii4 m wym, kwasem benzoesowym, kwasem askorbino¬ wym, kwasem p-toluenosulfonowym, kwasem ben- zenosulfonowym, kwasem naftalenosulfonowym lub kwasem bursztynowym. Kazda z powyzszych soli mozna wytwarzac znanymi sposobami.Jak wynika z nizej podanych definicji róznych podstawników zwiazków o wzorze 1, zwiazki te sa pochodnymi typu pierwszorzedowego amidu, pier¬ wszorzedowego alkoholu lub nitrylu scisle okreslo¬ nych czteropeptydów, przy czym istotna cecha zwiazków o wzorze 1 jest ich konfiguracja prze¬ strzenna. Dla wygody, reszta aminokwasów w po¬ chodnych czteropeptydów o wzorze 1 ponumero¬ wano kolejno poczawszy od N-koncowej grupy a- minowej. Reszta aminokwasu w pozycji 1 wykazu¬ je konfiguracje absolutna L, a w pozycji 2 kon¬ figuracje absolutna D. Poniewaz reszta aminokwa¬ su w pozycji 3 pochodzi od glicyny, nie wystepuje tu chiralnosc. W pozycji 4 (C — koncowa pozycja), odpowiadajacej grupie pierwszorzedowego amidu, pierwszorzedowego alkoholu lub nitrylu, konfigu¬ racja absolutna zgodna jest z konfiguracja absolut¬ na reszty odpowiedniego L-aminokwasu.Okreslenie „pierwszorzedowy rodnik alkilowy o 1—3 atomach wegla" oznacza rodnik metylowy, e- tylowy i n-propylowy.Okreslenie „pierwszorzedowy. lub drugorzedowy rodnik alkilowy o 1^4 atomach wegla" oznacza rodnik metylowy, etylowy, n-propylowy, izopropy¬ lowy, n-butylowy, izobutylowy i II-rz.butylowy.Pozycja ii odpowiada czesci peptydu zawieraja¬ cej N- koncowa grupe aminowa. Znajdujaca sie - w tej pozycji reszta aminokwasu pochodzi od L- -tyrozyny lub L-/0-acetyloytyrozyny. Reszta ta mo¬ ze byc nie podstawiona przy atomie azotu, gdy oba podstawniki Rj i R2 oznaczaja atomy wodoru lub podstawiona jednym lub dwoma pierwszorzedowy- mi rodnikami alkilowymi o 1—3 atomach wegla, gdy Rj lub R2 oznaczaja taki rodnik albo Ri i R2 oznaczaja takie rodniki. Przykladami koncowych grup aminowych podstawionych pierwszorzedowy- mi rodnikami alkilowymi o 1—3 atomach wegla sa grupa N-metyloaminowa, N-etyloaminowa, N-n- -propyloaminowa, N,N-dwumetyloaminowa, N,N- -dwuetyloaminowa, N,N-dwu-n-propyloaminowa, N-metylo-N-etyloaminowa, N-metylo-N-n-propylo- aminowa i N-etylo-N-n-propyloaminowa. Korzyst¬ nie reszta aminokwasu w pozycji 1 jest nie pod¬ stawiona przy atomie azotu reszta tyrozylowa lub O-acetytotyrozylowa, a zwlaszcza nie podstawiona przy ^atomie azotu reszta tyrozylowa.W pozycji 2 zwiazków o wzorze 1 znajduje sie reszta aminokwasu majaca konfiguracje stereoizo- meru D i pochodzaca od takich aminokwasów jak D-alanina (Ala), w której R3 oznacza rodnik mety¬ lowy, kwas D-a-aminomaslowy R3 oznacza rodnik etylowy^ Ó-norwalina (Nva), w której R3 oznacza rodnik n-propylowy, D-wali- na (Val), w której R3 oznacza rodnik izopropylo¬ wy, D-norleucyna (Nie), w której R3 oznacza rod¬ nik n-butylowy, D-leucyna (Deu), w której R3 o- znacza rodnik izobutylowy, D-izoleucyna (Ile), w której R3 oznacza rodnik Il-rz.-butylowy i D-me- tionina (Met), w której R3 oznacza grupe o wzorze CH3—S—CH2—CH2, korzystnie pochodzaca od t- -alaniny.W pozycji 3 zwiazków o wzorze 1 znajduje sie reszta aminokwasu pochodzaca od glicyny. 5 Reszta aminokwasu w pozycji 4 zwiazków o wzo¬ rze 1 (pozycji C — koncowej) pochodzi do L-feny- loalaniny (Phe) lub jej pochodnej typu pierwszo¬ rzedowego alkoholu lub, nitrylu. Reszta ta moze J0 miec charakter pierwszorzedowego amidu (Phe— —NH2) gdy Z oznacza grupe aminokarbonylowa, pierwszorzedowego alkoholu (Phe—A) gdy A ozna¬ cza grupe hydroksymetylowa lub pierwszorzedowe¬ go nitrylu gdy Z oznacza grupe cyjanowa. Ko- 15 rzystnie Z oznacza pierwszorzedowy amid. Reszta jest podstawiona przy atomie azotu grupy amino¬ wej, gdy R4 oznacza rodnik metylowy, etylowy lub n-propylowy. Gdy reszta nie jest podstawiona przy atomie azotu, musi byc ona podstawiona przy ato- 20 mie wegla w pozycji «, a wówczas R5 oznacza rodnik metylowy, etylowy lub n-propylowy. Je¬ dynym ograniczeniem jest tu warunek, ze gdy je¬ den z podstawników R4 i R5 oznacza pierwszorze¬ dowy rodnik alkilowy o 1—3 atomach wegla, wów- 25 czas drugi z nich oznacza atom wodoru. W ko¬ rzystnych zwiazkach R4 lub R5 oznacza rodnik me¬ tylowy, a w szczególnie korzystnych R4 oznacza rodnik metylowy. W niniejszym opisie stosowane sa nastepujace, 30 powszechnie uzywane skróty: Abu — kwas a-aminomaslowy Ala — alanina Cys — cysteina Gly — glicyna 35 Hse — homoseryna Ile — izoleucyna Leu — leucyna Met — metionina Nie — norleucyna 40 Nva — norwalina Phe — fenyloalanina Phe-A — pochodna fenyloalaniny typu pierwszo¬ rzedowego alkoholu Phe-CN — pochodna fenyloalaniny typu nitrylu 45 Ser ¦— seryna Tyr — tyrozyna J Val — walina Ac — rodnik acetylowy Me — rodnik metylowy 50 Et — rodnik etylowy Ip — rodnik izopropylowy Pr — rodnik n-propylowy Bu — rodnik butylowy i-Bu — rodnik izobutylowy 55 t-Bu — rodnik III-rz.butylowy s-Bu — rodnik II-rz.butylowy BOC — grupa III-rz.butyloksykarbonylowa Bzl — rodnik benzylowy DCC — N,N'-dwucykloheksyloksykarbodwuimid 60 HBT — 1-hydroksybenzotriazol DMF — N,N-dwumetyloformamid TFA — kwas trójfluorooctowy THF — czterowodorofuran DEAE — grupa dwuetyloaminoetylowa 65 DCHA — dwucykloheksyloamina414 Zli 6 Przykladami typowych zwiazków o wzorze 1 sa czteropeptydy o nastepujacych sekwencjach: H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-/N-Et/Phe-NH2 H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-/N-Pr7Phe-NH2 H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-/N-Pr/Phe-A H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-/«-MieyPhe-NH2 H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-/N-Me/Phe-NH2 H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-/a-Et/Phe-NH2 H-L-Tyr-D-Ala-Gly-IWN-Me/Phe-CN H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-/N-Me/Phe-A H-L-Tyr-D-Met-Gly-L-/N-Et/Phe-NH2 H-L-Tyr-D-Met-Gly-LVN-Me/Phe-NH2 H-L-Tyr-D-Met-Gly-L-/N-Me/Phe-A H-L-Tyr-D-Met-Gly-L-/N-Et/Phe-CN H-L-Tyr-D-Met-Gly-L-/a-Et/Phe-NH2 H-L-Tyr-D-Met-Gly-L-/a-PryPhe-NH2 H-L-Tyr-/Ac/-D-Ala-Gly-WN-Me/Phe-NH2 H-L-Tyr/Ac/-D-Nle-Gly-Wa-Me/Phe-NH2 /N-EV-L-Tyr-D-Abu-Gly-WN-Et/Phe-NH2 /N,N-dwu-Pr/-L-Tyr-D-Val-Gly-L-M-Me/Phe-NH2 , /N-Pr/-L-Tyr-D-Deu-Gly-LVa-Et/Phe-NH2 /N,N-dwu-Et/-L-Tyr-D-Miet-Gly-L^/tt-Pr/Phe-NH2 /N-Me,N,Et/-L-Tyr-/Ac/-D-Nle-Gly-L-/«-Me/Phe- -NH2 /N,N-dwu-Mey-L-Tyr/Ac/-D-Ile-Gly-L-/a-Et/Phe- -NH2 /N-Me/-L-Tyr/Ac/-D-Leu-Gly-L-/a-Me/Phe-CN /N-Me/-L-Tyr/Acy-D-Nva-Gly-L^a-Pr/Phe-A /N-Me/-L-Tyr-D-Aia-Gly-Ln/to-Me/Phie-NH2 /N-Et/-L-Tyr/Ac/-D-Abu-Gly-Ln/a-Pr/Phe-NH2 H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-/a-Me/Phe-CN H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-M-Me/Phe-A H-L-fyr-D-Ala-Gly-Lr/a-Et/Phe-A ~ H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Ax-Pr/Phe-NH2 H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-,/a-Pr/Phe-CN /N,N-dwu-Me/-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-/«-Et/Phe-A /N,N-dwu-Me/-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-/N-Me/Phe-NH2 7N,N-dwu-Et/-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-/N-Et/Phe-CN /N-Me/-L-Tyr-D-Ala-Gly-LVN-Me/Phe-A /N-Me/-L-TyrrD-Ala-Gly-L-/N-Me/Phe-NH2 /N,N-dwu-Me/-L-Tyr-D-Val-Gly-L-/N-Me/Phe-NH2 /N,N-dwu-Pr/-L-Tyr-D-Ala-Gly-IWN-Pr/Phe-NH2 /N-Me/-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-/a-Et/Phe-NH2 /N,N-dwu-Me/-L-Tyr/Ac/-D-Ala-Gly-L-/N-Et/Phe- -CN /N,N-dwu-Pr/-L-Tyr/Ac/-D-Met-Gly-L-/N-Me/Phe- -A /N-Et/-L-Tyr-/Ac/-D-Met-Gly-L-/N-Pr/Phe-NH2 . /N-Me/-L-Tyr/Ac/-D-Met-Gly-L-/a-Me/Phe-NHp Zwiazki o wzorze 1 wytwarza sie sposobami o- gólnie znanymi w chemii peptydów. Istnieje moz¬ liwosc, ze podczas wytwarzania niektórych zwiaz¬ ków o wzorze 1 moze wystapic czesciowa race- mizacja, jednak stopien racemizacji nie jest tak znaczny by w istotny sposób obnizyc dzialanie, przeciwbólowe tych zwiazków.Metody otrzymywania zwiazków o wzorze 1 polegaja na sprzeganiu aminokwasów lub fragmen¬ tów peptydów droga reakcji karboksylowej grupy 60 funkcyjnej jednego aminokwasu lub fragmentu peptydu z aminowa grupa funkcyjna drugiego aJ- minokwasu lub fragmentu peptydu, co prowadzi do powstania wiazania amidowego. Dla uzyskania wydajnego sprzegania konieczne jest zabezpiecze- 65 10 15 20 25 30 35 40 50 55 nie wszystkich grup funkcyjnych nie bioracych bezposrednio udzialu w sprzeganiu za pomoca od¬ powiednich grup blokujacych oraz odpowiednie zaktywowanie bioracych udzial w sprzeganiu funk¬ cyjnych grup karboksylowych. Konieczny jest sta¬ ranny dobór lancucha reakcji i warunków reakcji oraz grup blokujacych. Kazdy z aminokwasów sto¬ sowanych do wytwarzania zwiazków o wzorze 1 i majacych scisle okreslone grupy blokujace i/lub odpowiednio zaktywowane grupy biorace udzial w reakcji wytwarza sie sposobami ogólnie znany¬ mi w chemii peptydów.W kazdym etapie syntezy zwiazków o wzorze 1 stosuje sie odpowiednio dobrane kombinacje grup - blokujacych, zapewniajace najkorzystniejszy przebieg reakcji. Istnieje mozliwosc stosowania innych kombinacji, jednak przebieg reakcji jest wtedy mniej korzystny. Przykladowo, jako grupy blokujace grupy aminowe stosuje sie w syntezie zwiazków o wzorze 1 grupe benzyloksykarbonylo- wa (CBz), III-rz.butyloksykarbonylowa (BOC), III- -rz.amyloksykarbonylowa (AOC), p-metoksybenzy- loksykarbonylowa (MBOC), adamantyloksykarbo- nylowa (AdOC) i izobornyloksykarbonylowa. Dla zabezpieczenia grup hydroksylowych w reszcie ty- rozylowej stosuje sie z kolei zazwyczaj grupe ben¬ zylowa (Bzl), jakkolwiek mozna takze stosowac grupe p-nitrobenzylowa (PNB) i p-metoksybenzylo- wa (PMB). Grupami blokujacymi grupy karboksy¬ lowe sa w syntezie zwiazków o wzorze 1 dowol¬ ne grupy tworzace estry, np. grupa metylowa, e- tylowa, benzylowa, p-nitrobenzylowa, p-metoksy- benzylowa i 2,2,2-trójchloroetyIowa.Sprzeganie aminokwasu lub fragmentu peptydu o zabezpieczonym atomie azotu z aminokwasem lub fragmentem peptydu o zablokowanej grupie karboksylowej zachodzi w syntezie Zwiazków o wzorze 1 po zaktywowaniu wolnej grupy karbo¬ ksylowej. Aktywacje mozna prowadzic znanymi sposobami, np. przeprowadzajac przemiane w mie¬ szany bezwodnik. Wolna grupa karboksylowa ule¬ ga aktywacji w wyniku reakcji z innym kwasem, zazwyczaj z pochodna kwasu weglowego, np. z chlorkiem. Przykladami chlorków kwasowych sto¬ sowanych do otrzymywania mieszanych bezwodni¬ ków sa chloromrówczan etylu, chlorornrówczan fe¬ nylu, chloromrówczan III-rz.butylu, chloromrów¬ czan izobutylu i chlorek piwaloilu, przy czym ko¬ rzystnie stosuje sie chloromrówczan izobutylu.Inna metoda aktywowania grupy karboksylowej w celu poddania jej reakcji sprzegania jest prze¬ miana w reaktywna pochodna estrowa, np. w ester 2,4,5-trójchloroi'enylowy, ester pieciochloro- fenylowy i ester p-nitrofenylowy. Jeszcze inna me¬ toda sprzegania jest ogólnie znana metoda sprze¬ gania przez azydek.W korzystnej metodzie sprzegania stosowanej w syntezie zwiazków o wzorze 1 aktywacje wolnej grupy karboksylowej prowadzi sie za pomoca N,N'- -dwucykloheksyloksykarbodwuimidu (DCC). Akty¬ wacje i sprzeganie prowadzi sie stosujac równo- molowe ilosci DCC i aminokwasu lub fragmentu peptydu, w obecnosci równomolowej ilosci 1-hy- droksybenzotriazolu (HBT). Obecnosc HBT zmniej-f sza prawdopodobienstwo zachodzenia niepozada¬ nych reakcji ubocznych, w tym takze racemiza- cji.W okreslonych etapach lancucha reakcji prowa¬ dzacego do powstawania zwiazków o wzorze 1, konieczne jest odszczepianie grup blokujacych. Dla fachowca w dziedzinie chemii peptydów nie jest trudne dobranie takich grup blokujacych, które po¬ zwola na prowadzenie selektywnego odszczepiania z produktu jednej lub wiecej niz jednej grupy blokujacej lecz nie wszystkich grup blokujacych obecnych w aminokwasie lub fragmencie peptydu.Sposoby prowadzenia -selektywnego odszczepiania sa znane, a szersze ich omówienie znajduje sie w pracy Schrodera i Liibke, The Peptides, Vol. 1, Academic Press, Nowy Jork (19£5), zwlaszcza w tablicach na str, 72—75.Odszczepianie grup zabezpieczajacych grupy kar¬ boksylowe mozna prowadzic droga hydrolizy zasa¬ dowej. Deestryfikacje zablokowanej grupy karbo¬ ksylowej prowadzi sie w warunkach dosc silnie zasadowych, stosujac zazwyczaj wodorotlenek me¬ talu alkalicznego, np. wodorotlenek sodowy, pota¬ sowy lub litowy, przy czym warunki prowadzenia hydrolizy sa ogólnie znane. Odszczepianie grup zabezpieczajacych grupy karboksylowe mozna rów¬ niez prowadzic droga katalizowanej hydrogenolizy, np. stosujac jako katalizator pallad na weglu. Po¬ nadto, w przypadku gdy grupami blokujacymi sa grupy p-nitrobenzylowe lub grupy 2,2,2-trójchlo- roetylowe, odszczepianie ich mozna prowadzic dro¬ ga redukcji w obecnosci c^hku i kwasu solnego.Grupy blokujace grifpy aminowe usuwa sie dzia¬ lajac na aminokwas lub peptyd o zabezpieczonej grupie aminowej kwasem, np. kwasem mrówko¬ wym, kwasem trójfluorooctowym (TFA), kwasem p-toluenosuffonowym (TSA), kwasem benzenosul- ionowym (BSA) lub kwasem naftalenosulfonowym, w wyniku czego powstaje sól addycyjna odpowied¬ niego kwasu. Odszczepianie grup blokujacych gru¬ py aminowe mozna takze prowadzic dzialajac na aminokwas lub pepty d o zabezpieczonej grupie a- minowej mieszanina gazowego bromowodoru lub chlorowodoru w lodowatym kwasie octowym, o- trzymujac addycyjna sól kwasu typu bromowodor- ku lub chlorowodorku. Wybór odpowiedniej me¬ tody i. odczynnika zalezy od fizycznych i chemicz¬ nych wlasciwosci substancji poddawanych reakcji odszczepiania grup blokujacych.Odkryto, ze w przypadku gdy R4 nie oznacza a- tomu wodoru i gdy peptyd zawiera co najmniej trzy reszty aminokwasowe, z których nalezy od- szczepic grupy blokujace, bardzo korzystnym spo¬ sobem odszczepiania jest dzialanie kwasem trój¬ fluorooctowym lub kwasem mrówkowym i wy¬ tworzeniem odpowiedniej soli addycyjnej. Sól te mozna przeprowadzic w zwiazek bardziej farma¬ kologicznie dopuszczalny droga obróbki za pomoca odpowiedniej zywicy jonowymiennej, np. DEAE Sephadex A25 lub Amberlyst A27. .Grupy blokujace grupe hydroksylowa reszty ty- rozylowej moga byc obecne podczas kolejnych re¬ akcji prowadzacych do powstania peptydu, a ich Odszczepienie mozna prowadzic w koncowym eta- im s pie syntezy, równoczesnie z usuwaniem grup blo¬ kujacych grupy aminowe. W zaleznosci jednaj od warunków, w jakich odbywa sie odszczepianie grup blokujacych grupy karboksylowe, usuniecie 5 grup blokujacych grupy hydroksylowe mozna prze^ • prowadzic wczesniej. Jesli grupy blokujace grupy karboksylowe usuwa sie droga zasadowej hydroli- • zy, grupy zabezpieczajace grupy hydroksylowe zo¬ staja zachowane, natomiast w przypadku stosowa- 10 nia katalizowanej hydrogenolizy, grupy chroniace grupy hydroksylowe ulegaja równiez odszczepie- niu. Równoczesne odszczepianie grup blokujacych grupy karboksylowe i grup blokujacych grupy hy¬ droksylowe nie stanowi powaznego problemu, po- 1 niewaz synteze zwiazków o wzorze 1 mozna pro¬ wadzic w obecnosci reszt tyrozylowych zawieraja¬ cych wolne grupy hydroksylowe.Korzystny sposób wytwarzania zwiazków o wzo¬ rze 1 polega na sprzeganiu oddzielnie otrzymanego N-koncowego trójpeptydu z oddzielnie otrzymanym C-koncowym fenyloalanyloamidem (Z oznacza gru¬ pe aminokarboksylowa) lub jego odpowiednia po¬ chodna typu alkoholu (Z oznacza grupe hydroksy- metylowa) lub nitrylu (Z oznacza grupe cyjano- 25 wa), a nastepnie odszczepianiu pozostalych jeszcze grup blokujacych. Alternatywnie, oddzielnie otrzy¬ many C-koncowy zwiazek fenyloalanylowy, który poddaje sie reakcji z N-koncowym trójpeptydem, moze zawierac grupe bedaca prekursorem ugrupo- 30 wania amidu, alkoholu lub nitrylu.Schematy 1 i 2 przedstawiaja lancuch reakcji prowadzacych do otrzymania zwiazków o wzorze 1. Schemat .1 ilustruje wytwarzanie segmentu trój- peptydowego o wzorze 2a lub 2b, a schemat 2 35 sprzeganie trójpeptydu z N-koncowa grupa fenylo- alanylowa.. Stosowany na schematach symbol AA oznacza reszte aminokwasu, a cyfra przy tym sym¬ bolu oznacza pozycje aminokwasu w sekwencji koncowego produktu peptydowego. 40 Na schemacie 2 Q oznacza, grupe aminokarbony- lowa, hydroksymetylowa, cyjanowa, metoksykarbo- nylowa, ienylometoksykarbonylowa itd. Gdy grupa Q jest grupa metoksykarbonylówa, fenylometoksy- karbonylowa lub podobna grupa estrowa, po sprzeganiu mozna przeprowadzic ja w grupe hy¬ droksymetylowa dzialajac borowodorkiem sodu.Ten sposób redukcji znany jest z opisu patentowe¬ go St. Zjedn. Am. nr 3700 651. Gdy grupa Q jest grupa benzylowa lub inna grupa tworzaca ester i dajaca sie latwo usunac przez hydrogenolize, mo¬ zna ja przeprowadzic w wolny kwas droga hy¬ drogenolizy katalizowanej przez pallad na weglu.Wolny kwas mozna przeprowadzic w amid dziala- _ jac amoniakiem w obecnosci DCC lub HBT.Grupe amidowa mozna odwodnic z wytworze¬ niem nitrylu^ dzialajac chlorkiem p-toluenosulfo- nylu i pirydyna, zgodnie z metoda opisana przez Yamade i wspólpracowników w Buli. of the Chem. 60 Soc. of Japan, 50, 1088—1093 (1977).W syntezie zwiazków o wzorze 1 opartej na przedstawionym powyzej lancuchu reakcji bardzo korzystnym C-koncowym odczynnikiem jest zwia¬ zek zawierajacy grupe identyczna z grupa Z kon- 65 cowego produktu.I 114 271 9 10 Po otrzymaniu zmodyfikowanego C-koncowego trójpeptydu grupe zabezpieczajaca atom tlenu resz¬ ty tyrozylowej (jesli grupa taka jest obecna) mo¬ zna usunac droga hydrogenolizy, a grupe III-rz.bu- tyloksykarbonylowa zabezpieczajaca atom azotu ^ 5 mozna odszczepic dzialajac kwasem trójfluorooc- towym. % Omówiony powyzej lancuch reakcji stanowi je¬ dynie jedna z mozliwosci wytwarzania zwiazków o wzorze 1, jako ze mozliwe jest stosowanie in- 1 nych lancuchów reakcji.Inna metoda polega na stopniowej, kolejnej ad- dycji poszczególnych aminokwasów lub ich pochod¬ nych z wytworzeniem lancucha peptydowego roz¬ poczynajacego sie koncowym zgrupowaniem karbo- *5 namidu, alkoholu lub nitrylu. W metodzie tej, a takze w metodach opartych na innych lancuchach reakcji mozna wykorzystywac opisane powyzej sposoby prowadzenia poszczególnych reakcji. 20 Innym sposobem wytwarzania zwiazków o wzo¬ rze 1 jest synteza w fazie stalej. Zgodnie z ta me¬ toda C-koncowa reszte wiaze sie z odpowiednim nosnikiem polimerycznym, po czym do reszty tej przylacza sie kolejno inne reszty aminokwasów, az do utworzenia zadanego peptydu, który nadal zwia¬ zany jest z nosnikiem. Peptyd usuwa sie z nosnika stosujac odpowiedni odczynnik odszczepiajacy.Przykladowo, C-koncowa reszte o grupie a-amino- wej zabezpieczonej grupa III-rz.butyloksykarbony- 3Q Iowa sprzega sie z polimerem benzhydryloaminy, prowadzac aktywacje za pomoca DCC. Grupe III- -rz.butyloksykarbonylowa usuwa sie poprzez reak¬ cje zwiazanej z polimerem reszty i kwasu trój- fluorooctowego, prowadzona w chlorku metylenu.Powstala sól zobojetnia sie odpowiednia trzeciorze¬ dowa amina i lancuch reakcji powtarza sie powo¬ dujac addycje kolejnego aminokwasu. Po otrzy¬ maniu zadanej sekwencji peptydowej zabezpieczo¬ ny peptyd usuwa sie z polimerycznego nosnika 4Q dzialajac nan HF w temperaturze 0°C. Dla fa¬ chowca w dziedzinie syntezy peptydów w fazie stalej dobór warunków syntezy, np. czasu reakcji, temperatury reakcji, czasu przemywania reagen¬ tów, grup blokujacych itd. nie bedzie przedstawial 45 trudnosci.Odszczepienie peptydu • do polimerycznego nosni¬ ka powoduje odszczepienie wszystkich grup bloku¬ jacych, w wyniku czego powstaje czteropeptyd sta¬ nowiacy substancje przejsciowa. Poniewaz zacho¬ wanie grup blokujacych podczas przemiany pro¬ duktu w nitryl jest bardzo pozadane, stosowanie syntezy w fazie stalej w celu otrzymania zwiaz¬ ków o wzorze 1, w których Z oznacza grupe cyja¬ nowa, niie jest korzystne.W niektórych zwiazkach o wzorze l jeden lub wiecej niz jeden z podstawników Ri, R2 i R3 o- znacza pierwszorzedowy rodnik alkilowy o |1—3 a- tomach wegla. W tych przypadkach w reakcjach skladajacych sie na lancuch reakcji stosuje sie aminokwas podstawiony przy atomie azotu. Kazdy z N-monopodstawionych aminokwasów mozna wy¬ twarzac sposobem przedstawionym na schemacie 3, stosujac jako zwiazek wyjsciowy aminokwas o zabezpieczonej grupie aminowej, Jak wynika ze schematu 3, na aminokwas o zabezpieczonym a-a- tomie azotu dziala sie wodorkiem potasu w obec¬ nosci odpowiedniego eteru koronowego w celu wytworzenia dwuanionu. Na substancje przejscio¬ wa dziala sie nastepnie odpowiednim jodkiem al- kilu otrzymujac zadany N-podstawiony aminokwas.Dla fachowca je^t rzecza-oczywista, ze w silnie zasadowych warunkach stosowanych podczas alki¬ lowania moze zajsc racemizacja na atomie wegla w pozycji a. Stopien racemizacji moze sie zmie¬ niac w zaleznosci od rodzaju aminokwasu, przy- czym stopien ten mozna zmniejszyc stosujac nad¬ miar srodka alkilujacego i skracajac czas reakcji do minimum. Niemniej jednak nawet w przypad¬ ku zajscia racemizacji w nadmiernym stopniu, produkt mozna oczyscic droga jego rekrystalizacji w postaci soli odpowiedniej chiralnej aminy, np. soli d-(+)-«-fenyloetyloaminy. Otrzymany amino¬ kwas, w którym R4 oznacza pierwszorzedowy rod¬ nik alkilowy o 1—3 atomach wegla mozna przeproj wadzic wyzej podanymi metodami w odpowiedni amid, alkohol lub nitryl".W przypadku, gdy oba podstawniki Rj i R2 o- znaczaja taki sam pierwszorzedowy rodnik alkilo¬ wy o 1—3 atomach wegla, odpowiednia N,N-dwu- podstawiona tyrozyne mozna otrzymac metoda przedstawiona na schemacie 4, na którym zwiazek o wzorze RxCHO oznacza formaldehyd, aldehyd octowy lub aldehyd propionowy.W przypadku gdy podstawniki Rj i R2 ozna¬ czaja rózne pierwszorzedowe rodniki alkilowe o 1—3 atomach wegla, odpowiednia N,N-dwupod- stawiona tyrozyne otrzymuje sie poddajac N-mo- nopodstawiona tyrozyne wytworzona jak powyzej reakcji z formaldehydem octowym wyzej podana metoda.W niektórych zwiazkach o wzorze 1 R5 oznacza pierwszorzedowy rodnik alkilowy o 1—3 atomach wegla, a wówczas w lancuchu reakcji prowadza¬ cym do wytworzenia takich zwiazków stosuje sie aminokwas podstawiony przy atomie wegla w po¬ zycji a lub jego odpowiednia pochodna typu estru, amidu, alkoholu lub nitrylu. Podstawiona przy a- tomie wegla w pozycji a fenyloamine mozna wy¬ twarzac metoda opisana przez Steina i wspólpra¬ cowników w Journal of the American Chemical Society, Vol. 77, 700—703 (1955), a rozdzielanie mie¬ szaniny racemicznej prowadzic metoda podana przez Turka i wspólpracowników w J. Org. Chem., Vol. 40, 7, 953—955 (1975). Podstawiona przy ato¬ mie wegla w pozycji a fenyloamine mozna prze¬ prowadzac wyzej omówionymi sposobami w odpo¬ wiedni amid, alkohol lub nitryl, przy czym prze¬ miane te mozna prowadzic przed otrzymaniem lub po otrzymaniu sekwencji czteropeptydu, korzystnie przed otrzymaniem czteropeptydu.Zwiazki o wzorze 1, w których Y oznacza rod¬ nik acetylowy wytwarza sie z odpowiedniego pep¬ tydu, w którym Y oznacza atom wodoru i w któ¬ rym koncowa grupa aminowa jest zabezpieczona odpowiednia grupa blokujaca. Peptyd taki poddaje sie dzialaniu bezwodnika octowego w obecnosci pirydyny, otrzymujac peptyd o zablokowanym ato¬ mie azotu i atomie tlenu podstawionym rodni- 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6011 kiem acetylowym. Zadany zwiazek otrzymuje sie po odszczepieniu grupy blokujacej za pomoca mie¬ szaniny kwasu solnego i kwasu octowego.Zwiazki o wzorze 1 sa cennymi srodkami farma¬ kologicznymi o dzialaniu przeciwbólowym. Sa one szczególnie uzyteczne przy pozajelitowym poda¬ waniu ssakom, w tym takze ludziom.Zwiazki o wzorze 1 mozna podawac jako takie lub sporzadzac z nich preparaty farmakologiczne ' majace postac dawek jednostkowych do podawania pozajelitowego. Do sporzadzania takich preparatów stosowac mozna znane, farmakologicznie dopusz¬ czalne organiczne lub nieorganiczne nosniki w po¬ staci cial stalych i/lub cieczy. Preparaty moga miec postac tabletek, zgranulowanych proszków, kapsu¬ lek, zawiesin,-roztworów itp.Zwiazki o wzorze 1 wykazuja dzialanie przeciw-, bólowe przy podawaniu ich w skutecznych daw¬ kach, przy czym rozpietosc dawki wynosi zazwy- ozaj okolo 0,1—<100 mg na 1 kg wagi ciala pacjenta, korzystnie okolo 1,0—20 mg na 1 kg wagi ciala pacjenta.Wytwarzanie zwiazków o wzorze 1 oraz ich dzia¬ lanie ilustruja nizej podane przyklady.Przyklad I. Wytwarzanie soli octanowej L- -tyrozylo-D-alanyloglicylo-Na-metylo-L-fenyloala- nyloamidu.A. p-Toluenosulfonian D-alaninianu benzylu Do mieszaniny 100 ml alkoholu benzylowego i * 200 ml benzenu zawierajacej 55,1 g (0,29 mola) jed- nowodzianu kwasu p-toluenosulfonowego dodaje sie 25 g (0,281 mola) D-alaniny, po czym miesza¬ nine doprowadza sie do stanu wrzenia pod chlod¬ nica zwrotna, usuwajac wode w postaci azeotropu za pomoca aparatu Dean-Starka.Mieszanine ogrzewa sie w ciagu 15 godzin, chlo¬ dzi do temperatury pokojowej i rozciencza eterem.Wytracona substancje odsacza sie, poddaje rekry¬ stalizacji z mieszaniny metanolu i eteru, otrzymu¬ jac 55,3 g (50°/o wydajnosci teoretycznej) p-tólueno- sulfonianu D-alaninianu benzylu o temperaturze topnienia 112—115°C.Analiza elementarna dla C17H2iN05S (351,42) obliczono: C, 58,10; H, 6,02; N, 3,99. stwierdzono: C, 58,19; H, 6,06; N, 3,82.B. Na-III-rz.butyloksykarbonylo-0-benzylo-L-ty- rozylo-D-alaninian benzylu.Do 200 ml bezwodnego N,N-dwumetyloformami- du (DMF) dodaje sie 35,1 g (0,1 mola) p-toluenosul- fonian D-alaninianu benzylu. Powstala mieszani¬ ne miesza sie, chlodzi do temperatury 0°C i do¬ daje 11,2 g (0,1 mola) trójetylenodwuaminy. Mie¬ szanine miesza sie w ciagu 10 minut w tempera¬ turze 0°C i dodaje do niej 37,1 g (0,1 mola) Na-III- -rz.butyloksykarbonylo-O-benzylo-L-tyrozyny, a na¬ stepnie 13,5 g (0,1 mola) 1-hydroksybenzotriazolu SHBT) i 20,6 g (0,1 mola) N,N'-dwucykloheksyloksy- karbodwuimidu (DCC). Otrzymana mieszanine mie¬ sza sie w ciagu 3 godzin w temperaturze 0°C, a nastepnie w ciagu 24 godzin w temperaturze po¬ kojowej, po czym chlodzi sie ja do temperatury 0°C, odsacza powstala zawiesine i przesacz odpa¬ rowuje pod zmniejszonym cisnieniem.'Pozostalosc rozpuszcza sie w octanie etylu i 1271 12 przemywa kolejno In wodoroweglanem sodowym, woda, zimnym 0,75n kwasem cytrynowym i woda. _ Warstwe organiczna suszy sie nad siarczanem ma¬ gnezowym, przesacza i odparowuje pod zmniejszo- 5 nym cisnieniem, a pozostalosc rozpuszcza w gora¬ cym etanolu. Z roztworu wytracaja sie po ochlo- • dzeniu krysztaly, z których po jednorazowej rekry¬ stalizacji z etanolu otrzymuje sie 41,5 g (80% wy¬ dajnosci teoretycznej) czystego Na-III-rz.butyloksy- 10 karbonylo-O-benzylo-L-tyrozylo-D-alaninianu ben¬ zylu o temperaturze topnienia 121—123°C.Analiza elementarna dla CsoH^^Og (520,63) obliczono: C, 69,21; H, 6,97; N, 5,38. stwierdzono: C, 68,99; H, 6,75; N, 5,17. 15 C. Na-III-rz.butyloksykarbonylo-0-benzylo-L-tyro- zylo-D-alanina.Do mieszaniny 200 ml czterowodbrofuranu (THF) i 20 ml wody dodaje sie 31,2 g (0,06 mola) Na-III- -rz.butylbksykarbonylo-O-benzylo-Li-tyrozylo-D-ala- ninianu benzylu, powstala mieszanine chlodzi sie do temperatury 0°C i dodaje powoli (13,2 ml (1,1 równowaznika) 5n wodorotlenku sodowego. Po u- plywie 5 godzin mieszanina rozdziela sie na war¬ stwe eterowa i wodna. 25 Warstwe wotina oddziela sie, chlodzi i odczyn jej doprowadza do wartosci pH 2 za pomoca kwa¬ su cytrynowego. Mieszanine ekstrahuje sie octa¬ nem etylu, ekstrakt octanowy przemywa woda, su- M szy nad siarczanem magnezowym, przesacza i roz¬ ciencza eterem. Wytracona substancje odsacza sie, otrzymujac 17,7 g (67% wydajnosci teoretycznej) Na-III-rz.butyloksykarbonylo-0-benzylo-L-tyrozylo- -D-alaniny o temperaturze topnienia 160—162°C. 3g Analiza elementarna dla C24H30N2O6 (442,51) obliczono: C, 65,14; H, 6,83; N, 6,63. stwierdzono: C, 64,73; H, 6,70; N, 6,20.D. Na-III-rz,butyloksykarbónylo-0-benzylo-L-tyro- zylo-D-alanylo-glicynian benzylu. 40 Do 70 ml suchego DMF dodaje sie 6,74 g (0,02 mola) p-toluenosulfpnianu glicynianu benzylu, mie¬ szanine chlodzi sie dó temperatury 0°C i dodaje 2,24 g (0,020 mola) trójetylenodwuaminy. Mieszani¬ ne miesza sie w ciagu kilku minut i dodaje 8,84 g 45 (0,020 mola) Na-III-rz.butyloksykarbonylo-0-benzy- lo-L-tyrozylo-D-alaniny, a nastepnie 2,7 g (0,020 mola) HBT i 4,12 g (0,020 mola) DCC. Mieszanine reakcyjna miesza sie w ciagu 2 godzin w tempe¬ raturze 0°C, a nastepnie w ciagu 24 godzin w tem- 50 peraturze pokojowej, po czym powstala zawiesine chlodzi sie do temperatury 0°C, odsacza i przesacz odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem.Pozostalosc rozpuszcza sie w octanie etylu i prze¬ mywa kolejno In wodoroweglanem sodowym, wo- 55 da, zimnym 0,75n kwasem cytrynowym i woda.Faze organiczna suszy sie nad siarczanem magne¬ zowym, przesacza i przesacz odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem. Pozostalosc krystalizuje sie z etanolu otrzymujac 10,8 g (92% wydajnosci 60 teoretycznej) czystego Na-III-rz.butyloksykarbony- lo-O-benzylo-L-tyrozylo-D-alanylo-glicynianu ben¬ zylu o temperaturze topnienia 145—147°C.Analiza elementarna dla C33H39N3O7 (589,69) obliczono: C, 67,22; H, 6,67; N, 7,il3. 65 stwierdzono: C, 67,32; H, 6,83; N, 6,91.13 114 271 14 ao E. Na-III-rz.butyloksykarbonylo-0-benzylo-L-tyro- zylo-D-alanylo-glicyna.Do 150 ml mieszaniny czterowodorofuranu i wody (9 : 1) dodaje sie 15,95 g (27 milimoli) Na-III-rz.bu- tyloksykarbonylo-O-benzylo-L-tyrozylo-D-alanylo- -glicynianu benzylu. Mieszanine chlodzi sie miesza¬ jac do temperatury 0°C, po czym kontynuujac mie¬ szanie wkrapla sie w ciagu 2 godzin 30 ml In wo¬ dorotlenku sodowego. Po zakonczeniu wkraplania mieszanine ekstrahuje sie dwukrotnie eterem i od¬ czyn oddzielonej warstwy wodnej doprowadza sie do wartosci pH 2,5 za pomoca 30 ml In kwasu solnego.Wykrystalizowana Na-III-rz.butyloksykarbonylo- 15 -O-benzylo-L-tyrozylo-D-alanylo-glicyne odsacza sie, rekrystalizuje z mieszaniny wody i eteru, a nastepnie dwukrotnie z octanu etylu, otrzymujac 11,43 g (85°/o wydajnosci teoretycznej) produktu o temperaturze topnienia 104—107°C i wartosci 2o Md wynoszacej +31,4° (C = 0,5, MeOH). % Analiza elementarna dla C26H33N3O7 (499,54) obliczono: C, 62,51; H, 6,66; N, 8,41. stwierdzono: C, 62,31; H, 6,83; N, 8,12.F. Sól d-(+)-«-metylobenzyloaminy i Na-III- 25 -rz.butyloksykarbonylo-Na-metylo-L-fenyloalaniny.Do 75 ml czterowodorofuranu dodaje sie 13,29 g (0,05 mola) Na-III-rz.butyloksykarbonylo-L-fenylo- alaniny i powstala mieszanine wkrapla sie w ciagu 30 minut do mieszanej mechanicznie zawiesiny 0,15 30 mola wodorku potasu i 0,5 g eteru 18-koronowego- -6, przy czym wkraplanie prowadzi sie w tempe¬ raturze 0°C i w atmosferze azotu. Mieszanine mie¬ sza sie jeszcze w ciagu 1 godziny w temperaturze 0°C, po czym w ciagu 15 minut wkrapla roztwór 35 6,23 ml (0,1 mola) jodku metylu w 15 ml cztero¬ wodorofuranu.Mieszanine odstawia sie, a po uplywie 2 godzin wkrapla do niej mieszanine 10 ml kwasu octowego 40 i 10 ml czterowodorofuranu, a nastepnie 20 ml e- tanolu. Mieszanine wylewa sie na 400 ml lodu i odczyn powstalej fazy wodnej doprowadza do war¬ tosci pH 12—13 /za pomoca 2n wodorotlenku sodo¬ wego. Wodna mieszanine ekstrahuje sie dwukrot- 45 nie eterem, po czym odczyn doprowadza sie do wartosci pH 3,0 za pomoca stalego kwasu cytry¬ nowego. Mieszanine ekstrahuje sie trzykrotnie 200 ml eteru, polaczone ekstrakty eterowe ekstrahuja sie woda, suszy nad siarczanem magnezowym i od- 50 parowuje pod zmniejszonym cisnieniem do konsys¬ tencji syropu. Syrop rozpuszcza sie w 50 ml eteru i dodaje 6,64 ml (0,05 mola) d(+)-«-metylobenzylo- aminy.Powstaly roztwór rozciencza sie 350 ml heksanu 55 i wywoluje sie krystalizacje przez potarcie scian¬ ki naczynia. Produkt odsacza sie otrzymujac 15,83 g (79°/o wydajnosci teoretycznej) soli. Po rekry-' stalizacji z octanu etylu otrzymuje sie 13,70 g (6o°U wydajnosci teoretycznej) soli d-(+)-a-mety- eo lobenzyloaminy i N«-III-rz.butyloksykarbonylo-N- -metylo-L-fenyloalaniny o temperaturze topnienia 136—139°C i wartosci \[a]JJ wynoszacej —28,2°C (C = l,.EtOH).Analiza elementarna dla C23H32N2O4 (400,50) & obliczono: G, 68,97; H, 8,05; N, 6,99. stwierdzono: C, 68,75; H, 7,81; N, 6,74.G. N«-III-rz.butyloksykarbonylo-N«-metylo-L- -fenylo-alanyloamid. 4 g (0,01 mola) Ncc-III-rz.butyloksykarbonylo-N- -metylo-L-fenyloalaniny (otrzymanej przez przepro¬ wadzenie w kwas soli d-(+)^a-metylobenzyloaminy i ekstrakcje eterem) rozpuszcza sie w 20 ml N,N- -dwumetyloformamidu (DMF). Mieszanine chlodzi sie do temperatury —15°C i dodaje 1,56 ml (0,012 mola) chloromrówczanu izobutylu, a nastepnie 1,32 ml (0,012 mola)N-metylomorfoliny. Mieszanine re¬ akcyjna miesza sie w ciagu 10 minut w tempera¬ turze —15°G, a nastepnie w ciagu 1,5 godziny prze¬ puszcza przez nia pecherzyki bezwodnego amo¬ niaku.Powstala mieszanine miesza sie w ciagu 1 go¬ dziny w temperaturze -^15°C, a nastepnie wle¬ wa do naczynia zawierajacego 200 ml lodu. Wodny roztw*6r ekstrahuje sie octanem etylu, a warstwe organiczna oddziela i przemywa kolejno l,5n kwa¬ sem cytrynowym, woda, In wodoroweglanem so¬ dowym i woda. Roztwór w octanie etylu suszy sie nad siarczanem magnezowym i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem do konsystencji sy¬ ropu. _ Syrop krystalizuje sie z mieszaniny eteru i ete¬ ru naftowego, otrzymujac 2,12 g (76% wydaj¬ nosci teoretycznej) Na-III-rz.butyloksykarbonylo- -Na-metylo-L-fenyloalanyloamidu o temperaturze topnienia 91—92°C i wartosci \[a] ^ wynoszacej —111,2° (C = 0,5, CHCI3).Analiza elementarna dla C23H32N2O4 (400,50) obliczono: C, 68,97; H, 8,05; N, 6,99. stwierdzono: C, 68,75; H, 7,81; N, 6,74.H. Na-III-rz.-butyloksykarbonylo-O-benzylo-L-ty- rozylo-D-alanylo-glicylo-Na-metylo-L-fenyloalany- loamid.Do 20 ml swiezo przygotowanego lodowatego kwasu octowego zawierajacego bezwodny chloro¬ wodór (In) i 2 ml anizolu, dodaje sie 1,95 g (0,007 mola) N«-III-rz.butyloksykarbonylo-N«-metylo-L- -fenyloalanyloamidu. Mieszanine miesza sie w tem¬ peraturze pokojowej w ciagu 30 minut, a nastep¬ nie wlewa do eteru, po czym wytracona substan¬ cje odsacza sie i suszy otrzymujac 1,5 g chloro¬ wodorku. Chlorowodorek rozpuszcza sie w 30v ml DMF, roztwór chlodzi do temperatury 1)°C i do¬ daje don ,1,4 ml (0,007 mola) dwucykloheksylo- aminy.Mieszanine miesza sie w ciagu kilku minut i dodaje 3,5 gt (0,007 mola) Na-III-rz.butyloksykar- bonylo-O-benzylo-L-tyrozylo-D-alanylo-glicyny, 950 g (0,007 mola) HBT i 1,4 g (0,007 mola) DCC.Mieszanine reakcyjna miesza sie w temperaturze 0°C w ciagu 2 godzin, a nastepnie w tempera¬ turze 4°C w ciagu 24 godzin, po czym chlodzi sie ja do temperatury 0°C i przesacza. Przesacz odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem, o- trzymujac olej, który rozpuszcza sie w octanie etylu. Roztwór octanowy ekstrahuje sie kolejno In wodoroweglanem sodowym, woda, zimnym 0,75n kwasem cytrynowym i woda. Faze organiczna su-.114 271 15 16 \ 5 szy sie nad siarczanem i odparowuje pod zmniej¬ szonym cisnieniem.Powstaly olej chromatografuje sie na kolumnie o wymiarach 40 cm X 3 cm wypelnionej zelem ¦krzemionkowym Grace and Davison Grajde 62 w chloroformie. Produkt eluuje sie stosujac jako eluent chloroform o stopniowo wzrastajacej za¬ wartosci metanolu (od zera do 10%), a nastep¬ nie wyodrebnia na podstawie chromatogramu cien¬ kowarstwowego odebranych frakcji, otrzymujac 3,55 g (77% wydajnosci teoretycznej) Na-III-rz.bu- tyloksykarbonylo-O-benzylo-L-tyryzolo-D-alanylo- -glicylo-N«-metylo-L-fenyloalanyloamidu o warto¬ sci {cl™ wynoszacej —9,2° (C = 0,5, MeOH). 15 Analiza elementarna dla C36H45N5O7 (659,8) obliczono: C, 65,54; H, 6,57; N, 10,61. stwierdzono: C, 65,46; H, 6,58; N, 10,36.I. Na-III-rz.butyloksykarbonylo-L-tyrozylo-D-ala- nylo-glicylo-Na-metylo-L-fenyloalanyloamid. 20 3,2 g (0,0485 mola) Na-III-rz.butyloksykarbonylo- -O-benzylo-L-tyrozylo-D-alanylo-glicylo-Na-metylo- -L-fenyloalanyloamidu rozpuszcza sie w 60 ml etanolu, po czym dodaje sie 1,5 g 5% palladu na wcglu w postaci wodnej papki. Przez mie- 25 szanine przepuszcza sie w ciagu 5 minut poda¬ wany przez belkotke azot, a nastepnie w ciagu 6 godzin wodór, po czym mieszanine przeplukuje sie azotem i odsacza katalizator.Mieszanine zateza sie pod zmniejszonym cisnie- 30 niem i powstaly syrop rozpuszcza w chlorofor¬ mie, a ^nastepnie osadza w kolumnie chromato¬ graficznej o wymiarach 40 cm X 3 cm wypel¬ nionej zelem krzemionkowym Grace and Davison 62. Produkt eluuje sie' chloroformem o stopnio- 35 wo wzrastajacej zawartosci metanolu (od zera do 10%), po czym wyodrebnia na podstawie chro¬ matogramu cienkowarstwowego odebranych frak¬ cji, otrzymujac 2,0 g ,(74% wydajnosci teoretycz¬ nej) Na-III-rz.butyloksykarbonylo-L-tyrozylo-D-ala- , 40 nylo-glicylo-Na-metylo-L-fenyloalanyloamidu o wartosci fa]£5 wynoszacej —9,9° (C = 0,05, MeOH).Analiza aminokwasu: stwierdzono: Gly, 1,1; Ala, 0,99; Tyr, 0,99; NH3, 1,14. *. '. 45 J, Sól octanowa L-tyrozylo-D-alanylo-glicylo-Na- -metylo-L-fenylpalanylo-amidu. 1,6 g (0,00281 mola) Na-III-rz.butyloksykarbonylo- -L-tyrozylo-D-alanylo-glicylo-Na-metylo-L-fenyloa- lanyloamidu rozpuszcza sie w 10 ml kwasu trój- 50. fluorooctowego zawierajacego 0,5 ml anizolu, po czym mieszanine miesza sie w ciagu 3p minut w temperaturze 0°C, a "nastepnie wlewa do eteru.Wytracony osad odsacza sie i suszj, otrzymujac 1,1 g substancji stalej, która rozpuszcza sie w 55 takiej' ilosci wodnego roztworu buforu (1% piry¬ dyny i 0,05% kwasu octowego), by otrzymac 15 ml roztworu.Roztwór umieszcza sie w kolumnie o wymia¬ rach 2,5 cm X 99 cm wypelnionej DEAE-Sepha- 6° dex* A-25 (octan), który równowazy sie tym sa¬ mym buforem. Eluat analizuje sie przy 280 nm, po czym odpowiednie frakcje laczy sie i liofili¬ zuje. Po ponownej liofilizacji z 10% kwasu octo¬ wego, a nastepnie z mieszaniny wody i ace- 65 tonitrylu (75 : 25) otrzymuje sie 0,84 g soli octa¬ nowej L-tyrozylo-D-alanyloglicylo-Na-metylo-L-fe- nyloalanyloamidu o wartosci [«]** wynoszacej +27,8° (C ,= 1, In HC1).Analiza aminokwasu: stwierdzono: Tyr, 0,98; Ala, 1,03; Gly, 1,00; NH3, 1,05.Przyklad II. Wytwarzanie soli octanowej L- -tyrozylo-D-alanylo-glicylo-L^a-metylofenyloalany- loamidu A. Sól tosylowa L^a-metylofenyloalaninianu ben¬ zylu.Do 100 ml benzenu dodaje sie 3,0 g (0,0168 mo¬ la) L.Ha-metylofenyloalaniny i do powstalej zawie¬ siny dodaje sie 3,5 g (1,1 równowaznika) wodzia- nu kwasu p-toluenosulfonowego i 10 ml alkoholu benzylowego. Mieszanine ogrzewa sie w stanie wrzenia pod chlodnica zwrotna w ciagu 4 dni stosujac do usuwania wody aparat Dean-Starka 0po czym mieszanine chlodzi sie do temperatury pokojowej i dodaje eter w celu stracenia soli tosylowej.Wytracona sól odsacza sie i suszy otrzymujac 7,0 g (94% wydajnosci teoretycznej) soli tosylo¬ wej L-tyrozylo-p-alanylo-glicyfo-Lna-metylofenylo- alanyloamidu o temperaturze topnienia 129—131°C i wartosci Md wynoszacej —10,7° (C -.= 0,5, In MeOH).Analiza elementarna dla C42H27NO5S (441,5) obliczono: N, 3,17 stwierdzono: N, 2,87 B. Na-III-rz.butyloksykarbonylo-O-benzylo-L-ty- rozylo-D-alanylo-glicylo-L-a-metylofenyloalaninian benzylu.Do 80 ml DMF dodaje sie 5,74 g (0,013 mili- mola) soli tosylowej L-tyrozylp-D-alanylo-glicylo- -L^a-metylofenyloalanyloamidu, powstala mieszani¬ ne chlodzi sie w ciagu 5 minut do temperatury 0°C i dodaje 6,5 g (13 milimoli) Na-III-rz.butylo- ksykarbonylo-O-benzylo-L-tyrozylo-D-alanylo-glicy- ny (otrzymanej jak w przykladzie I), 1,8 g (13 mi¬ limoli) HBT i 2,7 g (13 milimoli) DCC. Miesza¬ nine miesza sie w ciagu 2 godzin w tempera¬ turze 0°C i w ciagu 24 godzin w temperaturze pokojowej, po czym chlodzi sie ja do tempera¬ tury 0°C i odsacza wytracony osad. Przesacz od¬ parowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem, a po¬ zostalosc rozpuszcza w octanie etylu.Roztwór octanowy ekstrahuje sie kolejno In wodoroweglanem sodowym, woda, 0,75n kwasem cytrynowym i woda. Warstwe organiczna suszy sie nad siarczanem magnezowym i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem. Powstaly olej kry¬ stalizuje sie z eteru, po czym prowadzi sie re¬ krystalizacje z mieszaniny octanu etylu i eteru, 'otrzymujac 7,0 g (72% wydajnosci teoretycznej) Nia-III-rz.butyloksykarbonylo-O-benzylo-L-tyrozy- lo-D-alanylo-glicylo-L^a-metylofenyloalaninianu benzylu o wartosci {«]D5 wynoszacej +7,9°(^C = 0,5, MeOH).Analiza elementarna dla C43H50N4O7 (750,86) obliczono: C, 68J8; H, 6,71; N, 7,46. stwierdzono: C, 68,75; H, 6,46; N, 7,21,114 271 17 i* C. Sól dwucykloheksyloaminy i Na-III-rz.butylo- ksykarbonylo-L-tyrozylo-D-alanylo-glicylo-L-a-me- tylofenyloalaniny. x Do 50 ml etanolu dodaje sie 4,0 g (0,0053 mo¬ la) N«-III-rz.butyloksykarbonylo-0-benzylo-L-tyro- zylo-D-alanylo-glicylo-LH2-metylofenyloalaninianu benzylu, a nastepnie zawiesine 2,0 g 5l°/o palladu na weglu w DMF. Przez mieszanine przepuszcza sie w ciagu 5 minut wprowadzany belkotka azot, l a nastepnie w ciagu 4 godzin wodór.Nastepnie mieszanine przeplukuje sie azotem i odsacza z niej katalizator. Przesacz zateza sie, pod zmniejszonym cisnieniem do konsystencji sy¬ ropu, po czym syrop w chloroformie wprowadza sie do kolumny o wymiarach 10 cm X 2 cm wypelnionej zelem krzemionkowym Grace and Da- vison Grade 62. Kolumne leluuje sie chlorofor¬ mem o stopniowo wzrastajacej zawartosci meta¬ nolu, tak, ze w koncowej mieszaninie stosunek 2Q chloroformu do metanolu wynosi 9,5 : 0,5.Glówne frakcje laczy sie, a olej powstaly po odparowaniu rozpuszczalnika rozpuszcza sie w oc¬ tanie etylu i dodaje don 1 ml dwucykloheksylo¬ aminy. Wytracona substancje odsacza sie i su- 25 szy otrzymujac 2,6 g (651% wydajnosci teoretycz¬ nej) soli dwucykloheksyloaminy i Na-III-rz.butylo- ksykarbonylo-L-tyrozylo-D-alanylo-glicylo-L-a-me- tylofenyloalaniny o temperaturze topnienia 142— -^146°C i wartosci M^5 wynoszacej +46,3° (C = 30 0,5, MeOH).D. Na-III-rz.butyloksykarbonylo-L-tyrozylo-D-ala- * nylo-glicylo-L-«-metylofenyloalanyloamid. 2,0 g (0,0027 mola) soli dwucykloheksyloaminy i Na-III-rz.butyloksykarbonylo-L-tyrozylo-D-alany- 35 lo-glicylo-L-a-metylofenyloalaniny zobojetnia sie mieszanina octanu etylu i 0,75n kwasu cytrynowe¬ go. Powstala warstwe organiczna oddziela sie, eks¬ trahuje woda, suszy nad siarczanem magnezowym i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem, otrzy- 40 mujac 1,5 g oleju. Tak otrzymany wolny kwas rozpuszcza sie w 30 ml DMF i roztwór chlodzi do - temperatury 0°C w naczyniu cisnieniowym.Po dodaniu 560 mg (0,0027 mola) DCC miesza¬ nine miesza sie w ciagu 4 godzin w tempera- 45 turze 0°C, a nastepnie w ciagu 3 godzin w tem¬ peraturze pokojowej, ,po czym naczynie chlodzi sie do temperatury —78°C i dodaje don 30 ml bezwodnego amoniaku.Po ponownym szczelnym zamknieciu naczynia 50 mieszanine miesza sie w temperaturze pokojowej w ciagu 48 godzin, chlodzi do temperatury —78°C, otwiera naczynie i odparowuje amoniak -w tem¬ peraturze pokojowej, a nastepnie pod zmniejszo¬ nym cisnieniem. Pozostalosc rozpuszczai sie w 55 octanie etylu i roztwór octanowy ekstrahuje 0,75n kwasem cytrynowym, a nastepnie woda. Roztwór suszy sie nad siarczanem magnezowym i odpa¬ rowuje rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnie¬ niem. Pozostalosc rozpuszcza sie w chloroformie 00 i umieszcza w kolumnie o wymiarach 3 cm X 45 cm wypelnionej zelem krzemionkowym Grace and Davison Grade 62.Kolumne eluuje sie chloroformem o stopniowo wzrastajacej zawartosci metanolu tak, ze w kon- 65 cowej mieszaninie stosunek chloroformu do me¬ tanolu wynosi 9 : 1. Z frakcji zebranych w opar¬ ciu o chromatogram cienkowarstwowy odparowy- wuje sie rozpuszczalnik otrzymujac 1,1 g (72% wydajnosci teoretycznej) N«-III-rz.butyloksykarbo- nylo-L-tyrozylo-D-alanylo-glicylo-L-a-metylofenylo- alanyloamidu o wartosci [«]^ wynoszacej —26° (C - 0,4, MeOH).Analiza aminokwasu stwierdzono: Gly, 0,99; Ala, 1,00; Tyr, 0,99; NH3, 1,12.E. Sól octanowa L-tyrozylo-D-alanylo-glicylo-L- -a-metylofenyloalanyloamidu.Do 20 ml mieszaniny In gazowego chlorowodo¬ ru w lodowatym kwasie octowym, zawierajacej 0,3 ml anizolu dodaje sie 900 mg (0,0016 mola) Na- -III-rz.butyloksykarbonylo-L-tyrozylo-D-alanylo-gli- cylo-L-«-metylofenyloalanyloamidu. Mieszanine miesza sie w ciagu 30 minut w temperaturze poko¬ jowej i wlewa do eteru, a wytracony osad od¬ sacza sie i suszy otrzymujac 720 mg stalej sub¬ stancji. Substancje te rozpuszcza sie w takiej ilosci wodnego roztworu buforu (1*/* pirydyny i 0,05% kwasu octowego) by otrzymac 5 ml roz¬ tworu.Roztwór umieszcza sie w kolumnie o wymia¬ rach 2,5 cm X 99 cm, której wypelnienie sta¬ nowi DEAE-Sephadex A-25 (octan) zrównowazony uprzednio tym samym buforem. Eluat analizuje sie przy 280 nm, a odpowiednie frakcje laczy sie i liofilizuje. Po powtórnej liofilizacji z 10% kwa¬ su octowego, a nastepnie z mieszaniny wody i acetanitrylu (75. : 25) otrzymuje sie 400 mg soli octanowej L-tyrozylo-D-alanylo-glicylo-L-a-metylo- fenyloalanyloamidu o wartosci flcJ-JJ wynoszacej +23,9°-(G t= 0,5, In HC1).Analiza elementarna dla C26H35N3O7 (529,60) obliczono: C, 58,97; H, 6,66; N, }13,22; O, 21,15. stwierdzono: C, 59,02; H, 6,36; N, 12,99; O, 21,41.Analiza aminokwasu stwierdzono: Tyr, 0,96; Ala, 1,01; Gly, 1,00; NH3, 1,03.Przyklad III. Wytwarzanie soli octanowej L- -tyrozylo-D-alanylo-glicylo-Na-n-propylo-L-fenylo- alanyloamidu.A. Na-III-rz.butyloksykarbonylo-Na-n-propylo-L- -fenyloalaniny.Do 70 ml czterowodorofuranu dodaje sie 10,6 g (0,04 mola) N«-III-rz.butyloksykarbonylo-L-fenylo- alaniny. Powstala mieszanine wkrapla sie w cia¬ gu 30 minut do mieszanej mechanicznie zawiesi¬ ny 0,12 mola wodorku potasu w 220 ml cztero¬ wodorofuranu i 0,5 g eteru 18-koronowego-6, przy czym wkraplanie prowadzi sie w temperaturze 0°C i w atmosferze azotu.Mieszanine miesza sie jeszcze w 10 minut w temperaturze 0°C, po czym w ciagu 20 minut wkrapla sie do niej roztwór 23,3 ml (0,24 mola) 1-jodopropanu w 40 ml czterowodorofuranu. Mie¬ szanine pozostawia sie w ciagu 2,5 godzin w tem¬ peraturze 0°C, po czym wkrapla sie jeszcze dl,5 ml (0,12 mola) 1-jodopropanu. Mieszanine miesza sie dodatkowo w ciagu 2 godzin w temperaturze 0°C, dodaje 10 ml lodowatego kwasu octowego i mie-19 sza jeszcze w ciagu 10 minut, a 'nastepnie wyle¬ wa na pokruszony lód. Odczyn fazy wodnej do¬ prowadza sie do wartosci pH 8,0 za pomoca 2n wodorotlenku sodowego, wodna mieszanine eks¬ trahuje si,e dwukrotnie eterem, odczyn jej do¬ prowadza do wartosci pH 2,5 za pomoca zimne¬ go 2n HC1 i mieszanine ekstrahuje sie octanem etylu.Ekstrakt octanowy poddaje sie jednorazowej eks¬ trakcji woda, suszy nad siarczanem magnezowym i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem do konsystencji syropu. Syrop rozpuszcza sie w 200 ml eteru i dodaje 8 ml (0,04 mola) DCHA. Wytraco¬ ny osad odsacza sie i przesacz ekstrahuje raz l,5n kwasem cytrynowym i raz woda. Warstwe ete¬ rowa suszy sie nad siarczanem magnezowym i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem. Pow¬ staly olej chromatografuje sie w kolumnie o wy¬ miarach 40 cm X 3 cm wypelnionej zelem krze¬ mionkowym Graoe and Davison Grade 62 w chlo¬ roformie.Produkt eluuje sie chloroformem o zawartosci metanolu wzrastajacej stopniowo od zera do 5%, a nastepnie wyodrebnia na podstawie chromato- gramu cienkowarstwowego odebranych frakcji. O- trzymuje sie 3,6 g (31% wydajnosci teoretycznej) Na-III-rz.butyloksykarbonylo-Na-n-propylo-L-feny- loalaniny o wartosci i[«]^ wynoszacej —153;3 (C = 1, MeOH).Widmo NMR S (—C02H) = 10,47; d (Me2C—) = 1,50.Analiza elementarna C17H25NO4 (307,4) obliczono: C, 66,43; H, 8,20; N, 4,56. stwierdzono: C, 66,16; H, 7,99; N, 4,45; B. Na-III-rz.butyloksykarbonylo-Na-n-propylo-L- -fenyloalanyloamid.Nia-III-rz.butyloksykarbonylo-Na-n-propyló-L-fe- nyloamine (otrzymana jak w punkcie A) roz¬ puszcza sie w N,N-dwumetyloformamidzie, mie- mieszanine chlodzi sie do temperatury —15°C i dodaje do niej 1 równowaznik chloromrówczanu izobutylu, a nastepnie 1 równowaznik N-metylo- mórfoliny. Mieszanine miesza sie w ciagu 10 minut w temperaturze —15°C, po czym w ciagu 30 mi¬ nut przepuszcza sie przez nia bezwodny amo¬ niak.Powstala mieszanine miesza sie w ciagu 1 go¬ dziny w temperaturze —15°C, po czym wlewa do naczynia zawierajacego 200 ml lodu. Wodny roztwór ekstrahuje sie octanem etylu, a warstwe wodna oddziela i przemywa kolejno l,5n kwasem cytrynowym, woda, In wodoroweglanem sodowym i woda. Roztwór octanowy suszy sie nad siar¬ czanem magnezowym i odparowuje pod zmniej¬ szonym cisnieniem otrzymujac N«-III-rz.butyloksy- karbonylo-Na-n-propylo-L-fenyloalanyloamid.C. Na-III-rz.butyloksykarbonylo-L-tyrozylo-D-a- lanylo-glicylo-Na-n-propylo-L-fenyloalanyloamid.Do 20 ml swiezo przygotowanego lodowatego kwasu octowego zawierajacego bezwodny chloro¬ wodór (In) i 2 ml anizolu dodaje si§ 1 równowaz¬ nik Na-III-rz.butyloksykarbonylo-N«-n-propylo-L- -fenyloalanyloamidUt Powstala mieszanine miesza 4271 20 sie w ciagu 30 minut w temperaturze pokojowej, a nastepnie wlewa do eteru. Wytracony osad od- saeza sie i suszy, po czym tak otrzymany chloro¬ wodorek rozpuszcza sie w 30 ml DMF. 5 Roztwór chlodzi sie do temperatury 0°C, dodaje 1 równowaznik dwucykloheksyloaminy i miesza¬ nine miesza w ciagu kilku minut, a nastepnie dodaje 1 równowaznik Na-III-rz.butyloksykarbony- lo-O-benzylo-L-tyrozylo-D-alanyloglicyny (otrzyma¬ nej jak w przykladzie I E), 1 równowaznik HBT i 1 równowaznik DCC. Mieszanine reakcyjna mie¬ sza sie w ciagu 2 godzin w temperaturze 0°C i w ciagu 24 godzin w temperaturze 4°C. Mieszanine chlodzi sie do temperatury 0°C i przesacza, a przesacz zateza pod zmniejszonym cisnieniem uzy¬ skujac olej, który rozpuszcza sie w octanie ety¬ lu.Roztwór octanowy ekstrahuje sie kolejno In 20 wodoroweglanem sodowym, woda, zimnym 0,75n kwasem cytrynowym i woda. Faze organiczna su¬ szy sie nad siarczanem magnezowym i zateza pod zmniejszonym cisnieniem otrzymujac olej, któ¬ ry chromatografuje' sie na kolumnie o wymiarach £5 40 cm X 3 cm wypelnionej zelem krzemionko¬ wym Grace and Davison Grade 62 w' chlorofor¬ mie. Produkt eluuje sie chloroformem o zawarto¬ sci metanolu wzrastajacej stopniowo od zera ^do 10l0/o i wyodrebnia na podstawie chromatogramu ^ cienkowarstwowego, otrzymujac Na-III-rz.butylok- sykarbonylo-O-benzylo-L-tyrozylo-D-alanylo-glicy- - lo-Na-n-propylo-L-fenyloalanyloamid. Zwiazek ten rozpuszcza sie w 60 ml etanolu i do roztworu dodaje 1,5 g 510/© palladu na weglu w postaci wod¬ nej papkL W ciagu 5 minut przepuszcza sie przez mieszanine doprowadzony belkotka azot, a nastep¬ nie w ciagu 6 godzin wodór.Mieszanine przeplukuje sie azotem i odsacza katalizator, po czym przesacz zateza sie pod zmniej- 40- szonym cisnieniem otrzymujac syrop, który roz¬ puszcza sie w chloroformie i osadza w kolumnie chromatograficznej o wymiarach 40 cm X 3 cm wypelnionej zelem krzemionkowym Grace and Da- vison Grade 62. Produkt eluuje sie chloroformem 45 o zawartosci metanolu wzrastajacej stopniowo od zera do 10% i wyodrebnia na podstawie chro¬ matogramu cienkowarstwowego odebranych frak¬ cji, otrzymujac Na-III-rz.butyloksykarbonylo-L-ty- rozylo-D-alanylo-glicylo-Na-n-propylo-L-fenyloala- - 60, nyloamid o wartosci {a]^f wynoszacej —34,8° (C = 0,5, MeOH).Analiza elementarna dla C31H43N5O7 (597,7) obliczono: C, 62,29; H, 7,26; N, 11,72. stwierdzono: C, 62,13; H, 7,24; N, 11,70. 55 D. Só# octanowa L-tyrozylo-D-alanylo-glicylo-Na- -n-propylo-L-fenyloalanyloamidu. 800 mg (1,43 milimola) Na-III-rz.butyloksykarbo- nylo-L-tyrozylo-D-alanylo-glicylo-NcMi-propylo-Li- -fenyloalanyloamidu rozpuszcza sie w 10 ml kwasu fio trójfluorooctowego zawierajacego 0,5 _ml anizolu, po czym mieszanine miesza sie w ciagu 30 minut w temperaturze 0°C, a nastepnie liofilizuje. StaKJ substancje rozpuszcza sie w takiej ilosci wodne¬ go roztworu buforu (1% pirydyny i 0,05% kwasu 65 octowego), tjy uzyskac 10 ml roztworu, który chro-21 matografuje sie na kolumnie o wymiarach 2,5 cm X 99 cm.Wypelnienie kolumny stanowi DEAE-Sephadex A-25 (octan} zrównowazony uprzednio tym samym buforem. Eluat analizuje sie przy 280 nm, a odpo¬ wiednie frakcje laczy sie i liofilizuje. Po powtór¬ nej liofilizacji z In kwasu octowego otrzymuje sie 655 mg soli octanowej L-tyrozylo-D-alanylo-glicy- lo-Na-n-propylo-L-fenyloalanyloamidu o wartosci Md5 wynoszacej —11,0° (C = 0,5, In HC1).Analiza elementarna dla C28H39N5O7 (557,6) obliczono: C, 60,31; H, 7,05; N, 12,56. stwierdzono: C, 60,23; H; 6,98; N, 12,49.Analiza aminokwasu stwierdzono: Tyr, 0,99; Ala, 1,00; Gly, 1,01; NH3, 0,96. \ , Przyklad IV. Wytwarzanie soli octanowej L- -tyrozylo-P-alanylo-glicylo-Ncc-etylo-L-fenyloalany- loamidu A. Na-butyloksykarbonylo-N«-etylo-L-fenyloala- nina Do 70 ml czterowodorofuranu dodaje sie 10,6 g (0,04 mola) Na-butyloksykarbonylo-L-fenyloalaniny.Powstala mieszanine wkrapla sie w ciagu 30 mi¬ nut do mieszanej mechanicznie zawiesiny 0,12 mo¬ la wodorku potasu w 220 ml czterowodorofura¬ nu i 0,5 g eteru 18-koronowego-6, przy czym wkra- planie prowadzi sie w temperaturze 0°C i w atmosferze azotu.Mieszanine 'miesza sie jeszcze w ciagu 10 mi¬ nut w temperaturze 0°C, po czym w ciagu 20 mi¬ nut wkrapla sie do niej roztwór 19,4 ml (0,24 mola) jodku etylu w 40 ml czterowodorofuranu.Mieszanine pozostawia sie w temperaturze 0°C w ciagu 4 godzin, po czym dodaje sie do niej w dwu jednakowych porcjach jeszcze 19,4 ml (0,24 mola) jodku etylu. Mieszanine miesza sie w cia- x gu 2 godzin w temperaturze 0°C, poy czym do¬ daje do niej 10 ml lodowatego kwasu octowego i miesza w ciagu 10 minut, a nastepnie wylewa na 400 ml pokruszonego lodu. Odczyn powstalej fazy wodnej doprowadza sie do wartosci pH 8,0 za pomoca 2n wodorotlenku sodowego, wodna mieszanine ekstrahuje dwukrotnie eterem i od¬ czyn jej doprowadza do wartosci pH 2 za pomoca zimnego 2n kwasu solnego.Wodna mieszanine ekstrahuje sie octanem ety¬ lu, a ekstrakt przemywa woda, suszy nad siar¬ czanem magnezowym i odparowuje pod zmniej¬ szonym cisnieniem. Tak otrzymany syrop rozpu¬ szcza sie w 200 ml eteru i dodaje 8 ml (0,04 mo¬ la) DCHA. Wytracona substancje odsacza sie, a przesacz ekstrahuje l,5n kwasem cytrynowym i woda. Warstwe eterowa suszy sie nad siarczanem magnezowym i odparowuje pod zmniejszonym cis¬ nieniem otrzymujac 4,6 mg (39*/o wydajnosci teo¬ retycznej) soli octanowej L-tyrozylo-D-alanylo-gli- cylo-Na-etylo-L-fenyloalanyloamidu.Widmo UME: <5 (fenyl) 1= 7,2; <5 (Me3COC)0(—) = 1,4.B. N«-III-rz.butyloksykarbonylo-N«-etylo-L-feny- loalanyloamid ;....• 4,3 g (0,0146 mola) Na-III-rz.butyloksykarbonylo- -N«-etylorL-fenyloalaniny (otrzymanej jak w punk- 4271 22 cie A) rozpuszcza sie w 60 ml N,N-dwumetylo- formamidu (DMF), mieszanine chlodzi sie do tem¬ peratury 0°C i dodaje 3,0 g (0,0146 mola) N,N'-dwu- cykloheksylokarbodwuimidu (DCC).Mieszanine miesza sie w ciagu 2 godzin w tem¬ peraturze 0°C i w ciagu 72 godzin w temperatu¬ rze pokojowej, po czym chlodzi sie ja do tem¬ peratury 0°C i przesacza. Przesacz zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem, a powstaly olej rozpu- 10 szcza sie w octanie etylu.Roztwór ekstrahuje sie In .wodoroweglanem so- dowyms woda, zimnym l,5n kwasem cytrynowym i woda. Faze organiczna suszy sie nad siarcza¬ nem magnezowym i odparowuje otrzymujac 3,93 g 15 (91P/o wydajnosci teoretycznej) Na-III-rz.butyloksy- karbonylo-Nia-etylo-L-£enyloalanyloamic[u o warto¬ sci [a]gf wynoszacej —101,51° (C = 1, MeOH).Analiza elementarna dla Ci6H24N203 (292,4) obliczono: C, 65,73; H, 8,27; N, 9,58. stwierdzono: C, 66,03; H, 8,13; N, 9,85.C. Chlorowodorek Na-etylo-L-fenyloalanyloamidu 3,5 g (11,95 mmoli) Na-III-rz.butyloksykarbonylo- -Na-etylo-L-flenyloalanyloamidu (otrzymanego jak 25 w punkcie B) rozpuszcza sie w 40 ml swiezo przy-, gotowanego lodowatego kwasu octowego zawiera¬ jacego bezwodny chlorowodór (In), 1,5 ml ani- zolu i 1,5 ml (C2H'5)3SiH. Powstala mieszanine miesza sie w ciagu 30 minut w temperaturze po- kojowej i wlewa do eteru, a wytracony osad odsacza sie i suszy otrzymujac 2,6 g (961% wy- -. dajnosci teoretycznej) chlorowodorku NcHetylo-L- -fenyloalanyloamidu.Analiza elementarna dla C11H16N2OCl (227,7) 35 obliczono: C, 58,02; H, 7,08.; N, 12,30. stwierdzono: C, 57,97; H, 7,26; N, 12,54.D. Na-III-rz.butylpksykarbonylo-L-tyr-ozylo-D-ala- nylo-glicylo-Na-etylo-L-fenyloalanyloamid.Do 50 ml DMF dodaje sie 1,14 g (0,005 mola) 40 chlorowodorku Na-etylo-L-fenyloalanyloamidu po¬ trzymanego jak w punkcie C). Mieszanina" chlo¬ dzi sie do temperatury 0°C i dodaje 2,95 g (0,005 . mola) soli DCHA i Na-III-butyloksykarbonylo-L- -tyrozylo-D-alanylo-glicyny. Mieszanine miesza sie 45 w ciagu 5 minut w temperaturze 0°C i dodaje . 675 mg (0,005^ mola) HBT i 1,03 g (0,005 mola) DCC.Mieszanine reakcyjna miesza sie w ciagu 6,5 godziny w temperaturze 0°C i w ciagu 20 go- 50 dzin w temperaturze pokojowej, pó czym chlodzi sie ja do temperatury 0°C i przesacza.Przesacz zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem i powstaly olej rozpuszcza w octanie etylu. Roz¬ twór octanowy ekstrahuje sie kolejno In wodo- 55 roweglanem sodowym, woda, zimnym l,5n kwa¬ sem cytrynowym i woda. Faze organiczna suszy sie nad siarczanem magnezowym i zateza pod zmniejszonym cisnieniem, a powstaly olej chro- matografuje sie w kolumnie o wymiarach 40 cm X 60 3 cm wypelnionej zelem krzemionkowym Grace and Davison Grade 62 w chloroformie.Produkt eluuje sie chloroformem o zawartosci metanolu wzrastajacej stopniowo od zeraz do 15°/o i wyodrebnia na podstawie chromatogramu cien- 65 kowarstwowego odebranych frakcji otrzymujae23 114 271 24 1,13 g (39P/o wydajnosci teoretycznej) Na-III-rz.bu- tyloksykarbonylo-L-tyrozylo-D-alanylo-glicylo-Na- netylo-L-fenyloalanyloamidu o wartosci [a] & wy¬ noszacej —21,0° (C = 0,5, MeOH).Analiza elementarna dla C30H41N5O7 (583,7) obliczono: C, 61,73; H, 7,08; N, 12,00. stwierdzono: C, 60,35; H, 7,26; N, 11,25.E. Sól octanowa L-tyrozylo-D-alanylo-glicylo-Na- -etylo-L-fenyloalanyloamidii. 1 g'(l,71 milimola) Na-III-rz.butyloksykarbonylo- -L-tyrozylo-D-alanylo-glicylo-Na-etylo-L-fenyloala- nylomaidu rozpuszcza sie w 20 ml kwasu trój- fluorooctowego zawierajacego 3 ml anizolu i 3 ml (C2H5)3 SiH. Mieszanine miesza sie w ciagu 30 minut w temperaturze 0°C, a nastepnie wlewa do eteru i wytracona substancje odsacza sie i suszy otrzymujac 660 mg stalej substancji. Sub¬ stancje te rozpuszcza sie w takiej ilosci wodne¬ go roztworu buforu (lw/o pirydyny i 0,05*Vo kwasu octowego), by uzyskac 10 ml roztworu.Roztwór chromatografuje sie na kolumnie o wymiarach 2,5 cm X 90 cm, której wypelnienie stanowi DEAE-Sephadex A-25 (octan), zrównowa¬ zony uprzednio tym samym buforem. Eluat ana¬ lizuje sie przy 280 nm i odpowiednie frakcje la¬ czy sie i liofilizuje. Stala substancje rozpuszcza sie w 10 ml 0,2n kwasu octowego i roztwór chro¬ matografuje sie na kolumnie o wymiarach 2,5 cm X 99 cm, której wypelnienie stanowi G-10 Sep- hadex, zrównowazony uprzednio tym samym roz¬ puszczalnikiem.Eluat analizuje sie przy 280 nm i odpowiednie frakcje laczy sie i liofilizuje, otrzymujac 448 mg (48% wydajnosci teoretycznej) soli octanowej L- -tyrozylo-D-alanylo-glicylo-Na-etylo-L-fenyloalany- loamidu o wartosci \[a]^ vynoszacej —10,6° (C = 0,5, In HC1).Analiza elementarna dla CyH37N507 (543,6) obliczono: C, 59,65; H, 6,86; N, 12,88. stwierdzono: C, 59,41; H, 7,26; N, 13,18.Analiza aminokwasu stwierdzono: Tyr, 1,03; Ala, 0,99; Gly, 0,97; NH3, 0,98.Zwiazki o wzorze 1 sa uzyteczne jako leki prze¬ ciwbólowe. Dzialanie przeciwbólowe tych zwiaz¬ ków bada sie obserwujac reakcje myszy posadzo¬ nej na goracej plycie. W próbie tej, mysz umie¬ szcza sie w pionowym cylindrze z poliakryloni- 15 20 35 40 45 trylu majacym za podstawe powierzchnie meta¬ lowej plyty o^ temperaturze 52°C. Myszy podaje sie podskórnie scisle okreslona ilosc badanego zwiazku w postaci roztwroru lub zawiesiny w od¬ powiednim* nosniku.Mysz umieszcza sie na goracej powierzchni ply¬ ty po uplywie z góry okreslonego okresu czasu od momentu podania zwiazku, a nastepnie reje¬ struje sie okresy czasu (w sekundach) uplywajace od momentu zajscia dwóch zjawisk. Jako pierwszy rejestruje sie okres czasu od momentu poliza¬ nia przez mysz tylnej lapki, a jako drugi, okres czasu do momentu wykonania przez mysz skoku ucieczki z goracej plyty. Srodek o dzialaniu prze¬ ciwbólowym powoduje wydluzenie obu tych o- kresów w stosunku do odpowiednich okresów za¬ rejestrowanych w przypadku kontrolnej myszy, której podano tylko nosnik. Wydluzenie okresu musi przy tym zachodzic bez wystapienia obja¬ wów braku koordynacji lub niezdolnosci motory- cznej. Rezultaty próby podano w tablicy 1 (okres czasu od momentu posadzenia myszy na goracej powierzchni plyty do momentu polizania przez mysz tylnej lapki), i w tablicy 2 (okres czasu od momentu posadzenia myszy na goracej po¬ wierzchni plyty do momentu wykonania przez mysz skoku ucieczki z plyty). Myszy kontrolnej podawano roztwór soli.Kryterium potwierdzajacym dzialanie przeciwbó¬ lowe bylo stwierdzenie, ze okres czasu do momen¬ tu polizania tylnej lapki poddanego zabiegowi zwierzecia lub do momentu skoku ucieczki jest równy lub wiekszy od sumy sredniego okresu czasu w przypadku myszy kontrolnej i wartosci dwóch standardowych odchylen od sredniej. Kazdy z wy¬ ników podanych w tablicy 1 i 2 odpowiada war¬ tosci sredniej plus minus blad, standardowy. Wy¬ niki oznaczone cyframi 1, 2 i 3 maja wartosc znaczaca przy prawdopodobienstwach odpowied¬ nio p 0,001, p 0,01 i p 0,05.Uzyte w tablicach litery oznaczaja: A. sól octanowa L-tyrozylo-D-alanylo-glicylo-Na- -metylo-L-fenyloalanyloamidu, B. sól octanowa L-tyrozylo-D-alanylo-glicylo-L-a- -metylo-fenyloalanyloamidu, C. sól octanowa L-tyrozylo-D-alanylo-glicylo-Na- n-propylo-L-fenyloalanyloamidu, D. sól octanowa L-tyrozylo-D-alanylo-glicylo-Na- ^etylo-L-fenyloalanyloamidu.Tablica 1 Badany zwiazek 1 A Okres czasu od podania zwiazku do umieszcze¬ nia myszy na plycie (w minu¬ tach) 2 15 15 Dawka mg/kg 0,0 (zwierze kontrolne) 3 26.6+1.7 31.4±3.1 0.3 4 — 1 5. 33.3+2.2 3 6 33.2+2.23 48/LZ7.63 10 7 114.4+24.42 30 8 | —Xi CO CS co t co lO "* co CO rH 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 II 1 1 1 1 1 1 1 05 rH lo '"l rH C- +1 +1 t- CO i—1 i—1 O t rH 1 1 1 1 1 1 CO f- CO CO +1 +1 Tf O co co" co co LO o i-H CO co co +1 CO co ^ 1 1 1 05 O +1 CO 00 co O co LO co +1 o co co 1 1 1 o o +1 co 00 co o OJ 1 1 1 1 [ co +1 ^ oi co co +1 O) co co LO rH 1 1 1 1 lO rH +1 o ^ co 05 rH +1 o lO co LO co o °. co* o *i CO rH rH CO +1 +1 1 +1 +1 CO ^ l "^ Tt" O CO O) 00 co co 10 "tf co co er co co 35.7+ 40.5+ LO co 34.8 + 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 C» C* t* 05 OJ rH rH rH CO CO +1 +1 +1 +1 +1 O CO tH 00 00 00 05 rH Oi Oi co co co co co o m 10 o o CO rH rH CO CO PQ 00 co 1 +1 1 o t- co 1 1 1 1 O) rH +1 1 05 1 rH co 05 CO rH CO +1 +1 o o LO O co co LO O rH CO Oi CO co co +1 +1 rH CO O Oi co co 1 1 1 1 1 1 1 1 co <* CO rH +1 +1 O t O CO co co O O Oi CO co rH +1 00 LO co 1 1 1 1 c* rH +1 O co co o co rH LO 1 +1 1 rH co LO L co 35.2± ^ co 32.4± co co +1 1 Oi 1 co co 00 L- rH rH +1 +1 ^ rH co co co co LO LO o o 1 +1 ° o* T}H co co t» 54.2+ Oi 00 42.2+ c- co +1 1 o 1 co co C- rH CO rH +1 +1 co r- O LO co co LO LO rH rH Q W) r« "ab B CO rW cO Q 2 a ..-S rH 5fi S £ rg .2 co £ C h * s a cO T3 j£ 00 2 M o w t? ^ d O ° N N _, 1—< Oi +1 co co co co ,_, C~ co 1 +1 1 co L co co co co rH +1 co Oi co rH co ^h +1 o LO o '—I w 00 Oi +1 co o rH r-1 +1 +1 t co co co +1 +1 co ^ od oi rH 00 co co co -- „ c- LO CO ^ ¦ . L - LO rH +1 +1 +1 +1 CO ^F rH ^ ^' Oi ^' CD 00 00 O CO co +1 +1 co p ^" Oi +1 +1 rH ^ I I I LO r- rH +1 ^ CO LO co 00 +1 co ^ ^f I I I I I I I I +1 +1 LO rH rH CO + 1 CO +1 MMII i +i +i rH 00 +1 +1 CO O +1 +1 +1 Oi l CO od t-i co co co - -^ ^ "~! °9 °°. rH Oi LO LO LO CO LO 1 H ^ H CO 00 Oi rH CO LO T^' O) l CO* CO 00 CO Oi'^ LO rH rH rH Oi LO LO LO ^ C^ LO I l + 1 +1 +1 +1 +| +1 +| +1 +| +| +| +1 +| +| +| +| +| +| +| +| +| +| ^rHCOCOLOLOL^t^OOCOOiOOCOt^COCO^OOC-COCOrH rH CO CO LO LO t- L; 00 00 Oi 00 00 L CO CO| ^ 00 C^ CD CO ¦ ¦ CO CO* O O O O CO CO Oi CO CO 00 CO CO Oi Oj Oi Oi' CO* LO CO Oi" ^COCOCOCOOOt^CDCD^COtr-t-COLOLOC^COCDt-COt- ^azfeiMz PQ pq o114271 ZT Zastrzezenia patentowe 28 1. Sposób wytwarzania nowych pochodnych czte- ropeptydów o ogólnym wzorze 1, w którym Rj i R2 sa jednakowe lub rózne i oznaczaja atom wo- 5 dom lub pierwszorzedowy rodnik alkilowy o 1—3 atomach wegla, R3 oznacza pierwszorzedowy lub drugorzedowy rodnik alkilowy o 1—4 atomach we¬ gla lub grupe o wzorze CH3—S—CH2CH»—, R4 oznacza atom wodoru lub pierwszorzedowy rodnik 10 alkilowy o 1—3 atomach wegla, R5 oznacza atom wodoru lub pierwszorzedowy rodnik alkilowy o 1—3 atomach wegla, Y oznacza atom wodoru lub rodnik acetylowy, Z oznacza grupe aminokarbony- lowa, hydroksymetylowa lub cyjanowa, przy cz^m 15 gdy jeden z podstawników R4 i R5 oznacza pierw¬ szorzedowy rodnik alkilowy o 1—3 atomach wegla, wówczas drugi z nich oznacza atom wodoru, a L i D oznaczaja konfiguracje absolutna na atomach wegla stanowiacych centra chiralne, oraz addycyj- 20 nych soli tych zwiazków z nietoksycznymi, farma¬ kologicznie dopuszczalnymi kwasami, znamienny tym, ze ze zwiazku o wzorze 1 zabezpieczonego odpowiednimi grupami blokujacymi odszczepia sie grupy blokujace za pomoca substancji o charak- 25 terze kwasowym. 2. Sposób wedlug zastrz. I, znamienny tym, ze jako substancje o charakterze kwasowym stosuje sie kwas trójfluorooctowy, gazowy chlorowodór w lodowatym kwasie octowym lub kwas mrówkowy. 30 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w celu wytworzenia soli octanowej L-tyrozylo-D- -alanylo-glicylo-Na-metylo-L-fienyloalanyloamidu poddaje sie Na-III-rz.butyloksykarbonylo-L-tyrozy- lo-D-alanylo-glicylo-Na-metylo-L-fenyloalanyloa- mid reakcji z kwasem trójfluorooctowym, po czym tak otrzymany produkt liofilizuje sie z kwasu octo¬ wego. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w celu wytworzenia soli octanowej L-tyrozylo-D- -alanylo-glicylo-L-a-metylofenyloalanyloamidu pod¬ daje sie Na-III-rz.butyloksykarbonylo-L-tyrozylor -D-alanylo-glieylo-L-a-metylofenyloalanyloamid re¬ akcji z chlorowodorem w lodowatym kwasie octo¬ wym, po czym tak otrzymany produkt liofilizuje sie z kwasu octowego. 5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w celu wytworzenia soli octanowej L-tyrozylo-D- -alanylo-glicylo-Na-n-propylo-L-fenylo-alanyloami- du poddaje sie Na-III-rz.butyloksykarbonylo-L-ty- rozylo-D-alanylo-glicylo-Na-n-propylo-L-fenyloala- nyloamid reakcji z kwasem trójfluorooctowym, po czym tak otrzymany produkt liofilizuje sie z kwa¬ su octowego. 6. Sposób wedlug zastrz. ,1, znamienny tym, ze w celu wytworzenia soli octanowej L-tyrozylo-D- -alanylo-glicylo-Na-etylo-L-fenyloalanyloamidu pod¬ daje sie Na-III-rz.butyloksykarbonylo-L-tyrozylo- -D-alanylo-glicylo-Na-etylo-L-fenyloalanyloamid re¬ akcji z kwasem trójfluorooctowym, po czym tak otrzymany produkt liofilizuje sie z kwasu octowe¬ go.(L) ;D) R, R, 0 0 (D o R4 R5 :N-CH-C NH-'CH-C-NH-CH2-C-N-C-Z CH, OY R Wzór !114 271 BOC-L-Tyr-OH +H-D-(AA)2-0Bzl I OBzl , DCC,HBT y BOC-L-Tyr-D-(AA)2-OBzl OBzl OH" BOC-L-Tyr-D- (AA)2-OH OBzl H-Gly-OBzl, DCC,HBT BOC-L-Tyr-D-(AA)2-Gly-0Bzl BOC-L- Pd/C 'yr-D-(AA)2-6ly-0H OH Wzór 2a NaOH THF/HzO BOC-L-Tyr-D-(AA)2-Gly-OH OBzl Yiz&r 2b Schemat f114 271 R4pS B0C-L-Tyr-D-^A)2-Gly-0H+ HN-CH} OY CH5 DCCHBT ?4 ^5 BOC-L-Tyr-D-(AA)2-Gly-N-C-Q CH3 Schemat 2 BOC-N-^A)-COOH?S-BOC-|s|-^A)-axrK+ IBiioronony-6 jodek alkiiu Schemat 3 THF DMT | (Raj) Ra BOC-N-(AA)-COOH I 12, Schemat 4 DN-3, zam. 75/82 Cena 100 zl PL PL PL PL PL PL PL PL PL