SU908246A3 - Способ получени производных тетрапептидов или их солей - Google Patents

Description

1

Изобретение относитс  к способу получени  тетрапептидов или их солей - новых биологически активных соединений, которые могут найти применение в медицине.

Известен способ деблокировани  соответственно защищенных пептидов в кислой среде. Использование известного способа позвол ет получить новые соединени , обладающие интересными фармакологическими свойствами 1 1 .

Цель изобретени  - получение новых производных тетрапептидов или их солей, расшир ющих арсенал средств воздействи  на живой организм .

Поставленна  цель достигаетс  способом получени  производных тетрапептидов формулы

О ( о oWR,

Нч 1 п I N-CH-C-NH-CH-C-NW-СН,-C-W - C-Z

I

/., сн,

R.

где L и D означают хиральность;

R. - первичный алкил С..,- C-j; , К„ - водород или первичный

алкил С - Сз ; RI - водород или первичный

алкил С ,

1 CONH. (при условии, когда один из радикалов Rj и первичный алкил, второй - водород),

или их солей, заключающийс  в том, что защищенные соединени , соответствующие производным тетрапептидов формулы 1, деблокируют обработкой в кислой среде.

Причем деблокирование осуществл ют в трифторуксусной кислоте или в лед ной уксусной кислоте, насыщенной газообразным НСК.

Фармацевтически приемлемые нетоксичные кислые соли присоединени  включают соли органических и неорганических кисл-от, например хлористоводородной , серной, сульфокислоты, винной, фумаровой, бромистоводородной, гликолевой, лимонной, малеиновой, фосфорной,  нтарной, уксусной, азотной , бензойной, аскорбиновой кислот, паратолуолсульфокислоты, бензолсуль30 ;фокислоты, нафталинсульфокислоты и .

пропионовой кислоты. Предпочтительно дл  образовани  кислых солей выбирать хлористоводородную, уксусную или  нтарную кисло.ту. Любую из указанных солей получают известными методами.

Соединени  формулы 1  вл ютс  первичнымгГ амидами, первичными спиртами или производными нитрилов специально определенных тетрапептидов. Хиральность остатков аминокислот, при рассмотрении от положени  1 до 4 - oL, D, отсутствует. Остаток в положении 3 - глицинова  группа, следовательно он не может обладать хиральностью. Остаток в положении 4 может быть первичным амидом, первичным спиртом или нитрилом, его Хиральность согласуетс  с соответствующим предполагаемым остатком L аминокислоты.

Соединени  формулы Г получают с помощью известных способов синтеза пептидов. Возможно, что в процессе синтеза и некоторых соединений формулы I происходит частична  рацемизаци . Однако степень рацемизации , если такова  происходит, недостаточна, чтобы существенно изменить анестезирующую активность соединений формулы I.

Способы получени  -оединений формулы I включают соче ание аминокислот или фрагментов пептида посредством взаимодействи  функционалной группой с другой молекулой с образованием амидного св зывани . Дл  обеспечени .эффективного сочетани  желательно, чтобы все реакционноспособные функциональные группы , непосредственно не участвующие в реакции, были дезактивированы посредством использовани  соответствущих блокирующих групп и карбоксильна  функциональна  группа, котора  подлежит сочетанию, была соответствующим образом активирована дл  обеспечени  протекани  сочетани .

Все это требует тщательного выбора как последовательности превращений , так и условий реакции, а также использовани , специальных блокирующих групп. Каждую из аминокислот которые используют дл  получени  содинений формулы I и которые имеют специально подобранные защитные групы и/или активированные функциональные группы, получают при использовании известных методик.

На каждой стадии общего синтеза соединений формулы I примен ют выбранные комбинации блокирующих групп, в синтезе соединений формулы I могут работать и другие комбинации , хот , возможно, с меньшей степенью эффективности. Так, например, бензилоксикарбонил, трет.-бутилоксикарбонил , трет.-амилоксикарбонил, 1-меток сибензилоксикарбонил, а дама и тилоксикарбонил и изоборнилоксикарбонил могут в различных случа х использоватьс  в качестве групп блокирующих аминогруппы в синтезе соединений формулы. Более того, в качестве защищающего оксигруппу дл  остатка тирозила обычно используют радикал бензил. (Бзл), даже если могут быть использованы другие агенты , например п-нитробензил, п-метоксибензил .

Примен емые при синтезе соединений формулы 1 группы, блокирующие карбоксил, могут представл ть собой любые из типичных эфирообразующих групп, например, включающие метил,, этил,бензил, п-нитробензил,п-метоксибензил и 2,2,2-трихлорэтил.

.Сочетание соответствующим образом защищенных N-блокированных аминокислот или пептидных фрагментов с соответственно защищенными карбоксиблокированными аминокислотами или фрагментами пептида при получении соединений формулы I заключаетс  в превращении свободных функциональных карбоксильных групп аминокислот или пептидных фрагментов, активных в соотношении реакции сочетани . Это может быть осуществлено посредством использовани  любой из известных методик , одна из которых заключаетс  в превращении функциональной группы карбоксила в смешанный ангидрид. Свободные функциональные карбоксильные группы активируют посредством взаиг 1одействи  с другой кислотой, обычно производной карбоновой кислоты , например хлорангидрид кислот. Примерами хлорангидридов кислот, примен емых дл  образовани  смешанных ангидридов,  вл ютс  этилхлороформиа фенилхлороформиат, втор.-бутилхлороформиат , изобутилхлороформиат и пивалоилхлорид . Предпочтительно использовать изобутилхлороформиат.

Другим способом активировани  карбоксильных групп дл  целей проведени  реакции сочетани   вл етс  превращение их в соответствующие активные эфирные производные. Такие активные эфиры включают, например, эфир 2,4,5-трихлорфенила, эфир пентахлорфенила и эфир п-нитрофенила. Другим способом сочетани   вл етс  метод азидного сочетани .

Предпочтительный способ сочетани  при получении соединений формулы I включает использование N ,Ы-дициклогексилкарОодиимида (ДСС) дл  активировани  свободной карбоксильной группы и тем самым способствует протеканию реакции сочетани . Этот способ проводитс  при использовании эквимол рного количества ДСС относительно аминокислоты или пептидного фрагмента и осуществл етс   в присутствии эквимол рног-о количества 1-.окси6ензотриазола frOBT) . Наличие ОБТ подавл ет нежелательные побочные реакции, включа  веро тную рацемизацию. Отщепление выбранных блокирующих групп необходимо на определенных стади х в последовательности синтеза при получении соединений формулы Г. Отщепление карбоксилэащищающих групп может быть достигнуто посредством щелочного омылени . Обычно дл  деэтерификации защищенного карбоксила примен ют относительно сильные щелочи, типичным  вл етс  испольэование гидроокисей щелочных металлов (гидроокись натри ,гидроокись кали  и гидроокись лити ).Блокирующие карбоксил группы, кроме того, могут быть удалены каталитическим гидрогенолизом , например, включающим гидрогенолиз в присутствии ка тализатора - палладий на угле. Более того, в тех случа. х, когда блокирующа  карбоксилгруппа  вл етс  н-нитробензилом или 2,2,2трихлорэтилом , деблокирование може осуществл тьс  посредством восстановлени  в присутствии цинка и сол ной кислоты. Группы, блокирующие аминную функ цию, отщепл ютс  посредством обработки защищенной аминокислоты или пептида кислотой, например, муравьи ной кислотой, трифторуксусной кислотой (ТФУ), п-толуолсульфокислотой (ТСК), бензолсульфокислотой (БСК) и нафталинсульфокислотой с образованием в качестве продукта соли присоединени  соответствующей кисло ты. Отщепление аминоблокирующей гру пы также может осуществл тьс  посре ством обработки блокированной амино кислоты или пептида смесью НВ-г. или НС и уксусной кислоты, дл  того чтобы получить соответствующую кисл соль присоединени , гидробромид или гидрохлорид. Конкретный способ или используемые реагенты завис т от химических или физических характеристик примен емых материалов в специальной реакции деблокировани . В тех случа х , когда группа R, отличаетс  о водорода и пептид содержит, по край ней мере, три остатка аминокислоты, которые следует деблокировать, наиболее предпочтительно деблокировать пептид ТФУ или муравьиной кислотой, получа  соответствующую кислую соль присоединени . Эту соль можно превратить в более приемлемую фармацевт чески нейтральную фор1му посредством обработки соответствующей ионообменной смолой, например DEAE, Сефадект А25 и Амберлит А27. Присутствующа  в тирозильном остатке оксиэащищающа  группа может быть сохранена в пептиде на прот жении последовательных стадий его получени , причем ее удал ют на последней стадии синтеза в сочетании с отщеплением аминоблокирующих групп. Однако, 1, зависимости от примен емых условий дл  удалени  карбоксилблокирующих групп, она может быть удалена ранее, в процессе получени . Когда карбоксильную группу отщепл ют посредством.щелочного огиоллени , оксизащищакида  группа остаетс , однако при использовании каталитического гидрогенолиза дл  удалени  карбоксилзащищающей группы океизащищающа  группа также отщепл етс . Но получение соединений формулы I может осуществл тьс  в присутствии тирозильного остатка, имеющего свободную гидроксильную группу. Пример 1. Получение L-тирозил-0-аналин-глицил-№ -метил-1 .-фенилаланинамида (уксуснокислой.соли). А. Бензил-В-алинат-п-толуолсульфонат . К смеси 100 мл бензилового спирта и 200 мл бензола, содержащей 55,1 г (0,29 моль) моногидрата п-толуолсульфокислоты , добавл ют 25 г (0,201 моль) D-аланина. Смесь довод т до кипени , причем воду удал ют в виде азеотропа с помощью ловушки Дина-Старка. Эту смесь нагревают в течение 15 ч и затем охлаждают до комнатной температуры и разбавл ют эфиром. Полученный осадок отдел ют и перекристаллизовывают из смеси метанола и эфира, получа  55,3 г (56 %) соединени , т. пл. 112-115°С. Молекул рный вес 351,42. Элементный анализ: Бычислено,%:С 58,10;Н 6,02;N 3,99. С И,;, N05Найдено ,%: С 58,19;Н 6,06;N 3,82. Б. Бeнзил-N --тpeт.-бyтилo cикapбонил-О-бензил-L- тирозил-П-алинат. К 200 мл сухого диметилформамида (ДМФ) добавл ют 35,1 г (0,1 моль) диазабициклооктана (ДАБЦО). Смесь перемешивают в течение 10 мин при 0°С и добавл ют 37,1 -г (0,1 моль) N -Tpet.-бутилоксикарбонил-о-бензил1 .-тирозина и затем 13,5 г (0,1 моль) 1-оксибензотриазола (НВТ) и 20,6 г (0,1 моль)Ы ,Н-дициклогексилкарбодиимида (ДС.С) . Образовавшуюс  смесь перемешивают при 0°С в течение 3 ч и затем при комнатной температуре в течение 1 сут. Затем эту смесь охлаждают до , полученную суспензию фильтруют и фильтрат концентрируют в вакууме. Полученный осадок снова раствор ют в этилацетате и последовательно промывают 1 н. раствором NaHCO3f водой, холодным 0,75 н. раствором лимонной кислоты и водой. Органический слой сушат над сульфатом магни , фильтруют и концентрируют в вакууме. Полученный остаток раствор ют в гор чем этаноле. При охлаждении происходит кристаллизани . После первой кристаллизации из этанола получают 41,5 г (80 %) чистого вещества, т. пл. 121-123 С. Молекул рный ес 520,63,

Элементный анализ:

Вычислено, %: С 69,21;Н 6,97;N 5,38 СзоНзбНгОб

Найдено, % :С 68,99;Н 6,75:N 5,17

В. №-трет.-бутилоксикарбонил-0бензил-Ь-тирозил-В-аланин .

К смеси 200 мл тетрагидрофурана (ТГФ) и 20 мл воды добавл ют 31,2 г (0,06 моль) полученного продукта. Полученный раствор охлаждают до 0°С и медленно добавл ют к нему 13,2 мл (1,1.эквивалента} 5 н, раствора гидроокиси натри . Полученную смесь перемешивают и оставл ют медленно нагреватьс  до комнатной температуры. Черзз 5 ч смесь распредел ют между эфирным и водным сло ми. Водный слой отдел ют и охлаждают, поддержива  рН посредством добавлени  лимонной кислоты, и смесь экстрагируют этилацетатом . Этилацетатный экстракт промывают водой, сушат над сульфатом магни , фильтруют и разбавл ют эфиром . Полученный осадок собирают, получа  17,7 г (67 %) соединени , т. пл. 1бО-1б2°С. Молекул рный вес 442,51.

Элементный анализ:

Вычислено,%:С 65, 6,B3;N 6,6 C24H3oN2.0b

Найдено, % :С 64,73;Н 6,70;N 6,20

Г. Бензил-М -трет . -бутилоксикарбонил-О-бензил-L тирозил-0--аланилглицинат .

К 70 мл сухого ДМФ добавл ют 6,74 г (0,02 моль) кислой п-толуолсульфокислотной соли бензилглицината Полученную смесь охлаждают до 0°С и добавл ют 2,24 г (0,020 моль) DABCO. Смесь перемешивают в течение нескольких минут и добавл ют 8,84 г (0,020 моль) полученного продукта и затем 2,7 г (0,020 моль) НВТ и 4,12 г (0,020 моль) ДСС. Реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч при 0°С и затем в течение 1 сут при комнатной температуре. Полученную суспензию охлаждают до ос, фильтруют и фильтрат концентрируют в вакууме. Полученный осадок раствор ют в этилацетате и последовательно промывают 1 н. раствором бикарбоната натри , водой, холодным 0,75 н. раствором лимонной кислоты и водой. Органическую фазу сушат над сульфатом магни , фильтруют и концентрируют в вакууме. Полученный остаток кристаллизуют из этанола, получа  10,8 г (92,8 %) чистого соединени , т.пл. 145 147С . Молекул рный вес 589,69.

Элементный анализ:

Вычислено,%:С 67,22;Н 6,67;N 7,1 Cji Нзэы О,

Найдено, % :С 67,32;Н 6,83:N 6,9

Д. .-бутилоксикарбонил-Обензил-1 .-тирозил-В-аланил глицин.

К 150 мл смеси тетрагидрофурана и воды (9:1) добавл ют 15,95 г (27 моль) полученного продукта.Смесь охлаждают до Ос при перемешивании и к полученной смеси- по капл м добавл ют 30 мл 1 н. раствора гидроокиси натри . Смесь перемешивают в течение 2 ч до завершени  прика-

пывани  и затем ее дважды экстрагируют эфиром. Выделенный водный слой подкисл ют до рН 2,5 добавлением 30 мл 1 н. раствора сол ной кислоты. Вещество кристаллизуют, отдел ют фильтрацией и перекристаллизовывают

5 один раз из смеси метанола и воды и дважды из этилацетата, получа  11,43г (85% от теории) , т. пл. 104-107°С.

31,4° (,5; метанол). Молекул рный вес 499,54.

Элементный анализ:

Вычислено,%:С 62,51;Н 6,66;N 8,41

NjO

Найдено, % :С 62,31;Н 6,83;N 8,12. 5 Е. .-бутилоксикарбонил-№ метил-1-фенил-аланин, соль d(+)- метилбензиламина .

К 75 мл тетрагидрофурана добавл ют 13,26 г (0,05 моль) .0 бутилоксикарбонил-с -фенилаланина и полученную смесь по капл м в течение 30 мин прибавл ют при перемешивании к суспензии 0,15 моль гидрида кали  и 0,5 г 18-крау-6 эфира при

5 в атмосфере азота. Перемешивание продолжают при 0°С еще 1 ч. По капл м добавл ют раствор 6,23 мл (0,1 моль) йодистого метила в 15 мл тетрагидрофурана в течение 15 мин.

0 Смесь выдерживают в течение 2 ч и по капл м добавл ют смесь 10 мл уксусной кислоты и 10 мл тетрагидрофурана и затем добавл ют 20 мл этанола .- Затем смесь вливают в 400 мл льда. рН полученной водной фазы довод тдо 12-13 путем добавлени  2 н.раствора гидроокиси натри . Водную смесь дважды экстрагируют эфиром и затем подкисл ют до рН 3,0, добавл   твердую лимонную кислоту . Затем водную смесь экстрагируют эфиром-(3 X 200 мл) . Эфирные экстракты объедин ют, экстрагируют водой, высушивают над сульфатом магни  и упаривают в вакууме до сиропообразного состо ни . Этот сироп раствор ют в 50 мл .эфира и добавл ют 6,44мл (0,05 моль) d(+)-о -метилбензиламина . Продукт осаждают добавлением 350 мл гексана, отфильтровывают, получают 15,83 г (79% от теории) соединени . При перекристаллизации из этилацетата получают 13,70 г (68 % от теории) соединени , т. пл; 136 .139°С; ct - 28,2(С-1, этанол).

5 Молекул рный вес 400,50, Элементный анализ: Вычислено,%:С 68,97;Н 8,05;N 6,9 q2i Найдено, % :С 68,75;Н 7,81;N 6,7 Ж. .-бутилоксикарбонил-Ы метил-Ь-фенилаланиламид. , N -трет.-бутилоксикарбонил-N -ме тил-i-фенилаланин (4 г, 0,01 моль) полученный посредством подкислени  d (t) -метилбензиламинной соли и последукндей экстракцией эфиром, раствор ют в 20 мл ДМФ. Смесь охлаж дают до -5С и добавл ют 1,56 мл (0,012 моль) изобутилхлороформиата и затем 1,32 мл (0,012 моль) N-метилморфолина . Реакционную смесь пер мешивают в течени,е 10 мин при и барботируют в нее безводный сшмиа в течение 1,5 ч. Полученную смесь п ремешивают в течение 1 ч при и затем вливают в сосуд, содержащий 200 мл льда. Водный раствор экстр агируют этилацетатом. Органический слой отдел ют и промывают последовательно 1,5 н. раствором лимонной кислоты, водой, 1 н. раствором бика боната натри  и водой. Затем этилацетатный раствор высушивают над сульфатом магни  и упаривают в вакууме до сиропообразного состо ни . Сироп кристаллизуетс  из смеси эфира и петролейного эфира, получают 2,12 г (76 % от теории) соединени  т. пл. 91 - 92°C,laL:i - 111,2 (С 0,5 CHC6j ). Молекул рный вес 278,33. Элеме н т н ый а н ализ: Вычислено,%:С 64,73;Н 7,97;N 10, C 5-%CN203 Найдено, % :С 64,95;Н 7,8l;N 9,7 3. .-бутилоксикарбонил-Обензил-1-тирозил-О-аланилглицил-№ метил- -фенилаланиламид. К 20 мл свежеприготовленной лед  ной, уксусной кислоты, содержащей безводный хлористый водород (1н.рас вор) и 2 мл анизола, до&авл ют 1,95 ( 0,007 моль) №-ткет.-бутилоксикарбонил-Н метил-Ь-фенилаланиламида . Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем вливают в эфир, выпавший осадок отдел ют, высушивают получают 1,5 г хлористоводородной соли, которую раствор ют в 30 мл ДМФ. Раствор охлаждают до 0°С и добавл ют к нему 1,4 мл (0,007 мол дициклогексиламина. Смесь перемешивают в течение нескольких минут ипобавл ют 3,5 г (0,007 моль) .-бутилоксикарбонил-0-бензилЬ-тирозил-П-аланилглицина , 950 мг (0,007 моль) НВТ и 1,4 г (0,007моль ДОС. Затем реакционную смесь перемешивают при в течение 2 ч и затем при .в течение 1 сут, внов охлаждают до и фильтруют. Филь.т рат концентрируют в вакууме до маслообразного состо ни ; масло повторно раствор ют в этилацетате, Этилацетатннй раствор последовательно экстрагируют 1 н. раствором бикарбонату натри , водой, холодным раствором 0,75 н. лимонной кислоты и водой. Органическую фазу высушивают над сульфатом магни  и концентрируют в вакууме до масла. Масло подвергают хроматографической очистке на колонке 40 см х 3 см с силйкагелем марки Грейс и Дэвисон 62 в хлороформе. Продукт элюиругот, использу  ступенчатый градиент концентрации хлороформа в смеси 10 % метанола в хлороформе. Контроль за ходом очистки ведут с помощью тонкослойной хроматографии отбираемых фракций. Получают 3,55 г (77 % от теории) соединени , ,- 9,2 (С О, 5; метанол). Молекул рный вес 659,8. Элементный анализ: Вычислено,%:С 65,54;Н 6,57;il 10,61 С Н N О Найдено, % :С 65,46;Н 6,58;N 10,36 И. 1 Р -трет.-бутилоксикарбонил1 .-тирозил-П-аланил-глицил-К -метилL-фенилаланиламид . 3,2 г полученного продукта (0,0485 моль) раствор ют в 60 мл этанола и добавл ют к смеси в виде водной суспензии 1,5 г паллади  (5%) на угле. Через реакционную смесь барботируют азот с помощью газораспределительной трубки в течение 5 мин и затем пропускают водород в течение 6 ч. Затем реакционную смесь продувают азотом и палладиевый катализатор отдел ют фильтрованием. Смесь концетрируют в вакууме до сиропообразного состо ни . Сироп раствор ют в хлороформе и пропускают через хломатографическую колонку 40 X 3 см, содержащую силикагель марки Грейс и Дэвисон 62. Продукт элюируют, использу  ступенчатый градиент концентрации хлороформа в смеси 10 % метанола в хлороформе, и выдел ют в соответствии с тонкослойным профилем отобранных фракций , получа  2,0 г соединени  (74% от теории), 9,9 (,5 метанол ) . Аминокислотный состав-гССу 1,01, Аба 0,99; Туг 0,99; ННз 1,14. .К; .4j-тирозил-1)-аланил-глицилN -метил-Л-фенилаланиламид, ацетатна  соль. 1,6 г полученного продукта (0,00281 моль) раствор ют в 10 мл ТФУ, содержащей 0,5 мл анизола. Смесь перемешивают при 0°С в течение 30 мин, затем выливают в эфир и полученный осадок собирают и высушивают (1,1 г). Твердое вещество раствор ют в соответствуюЕдем количестве водного буферного раствора (1 % пиридина и 0,05 % уксусной кислоты) до объема 15 мл и раствор пропускают через колонку DEAEСефа .цекс А-25 (ацетат) размером 2,5 X 99 см,уравновешенную тем же буфером. Элюат просматривают при 280 нм и соответствующие фракции оСъедин ют и лиофилизуют.При повтор ной лиoфиJy зaции из 10 %-ной уксусНОЙ кислоты, с последующей лиофилизацией из смеси воды и ацетонитрила (3:1), получают 0,84 г соединени . + -27,8 (С 1,1 н. раствор HC Аминокислотный состав: Туг 0,98 1,03; сеу 1,00; ЫНз 1,05. II р и м е р 2. Получение L-тир зил-0-аланил-глицил-Ь-с --метилфенил аланиламида, ацетатна  соль. А. L-o rмeтилфeнилaлaнин, бензило вый эфир, тозилатна  соль. К 100 мл бензола добавл ют 3,0 (0,0168 моль) L-bt-метилфенилалани К полученной суспензии затем добав л ют 3,5 г (1,1 эквивалента) гидра п-толуолсульфокислоты и 10 мл бензилового спирта. Смесь кип т т с обратным холодильником и ловушкой Дина-Старка дл  воды в течение 4 су Затем смесь охлаждают до комнатной температуры и добавл ют к ней эфир чтобы осадить соль тозилата. Полученный осадок собирают и высушивают получа  7,0 г (94 %) соединени , т. пл. 129 - 131°С. bU|f- 10,7° (С 0,5; 1 н. раствор в метиловом спирте). Молекул рный вес 441,5. Элементный анализ: Вычислено,%: N 3,17 N GSНайдено , % : N 2,87. Б. N-трет.-бутилоксикарбонил-Обензил-Ь-тирозил-В-аланил-глицил-ЬоС-метилфенилаланин , бензиловый эфир К 80 Nm ДМФ добавл ют 5,74 г (0,013 моль) полученного продукта. Полученную смесь охлаждают до в течение 5 мин и добавл ют 6,5 г (13 моль). № -трет-бутилоксикарбони 0-бен:зил-Ь-тирозил-0-аланил-глицина (полученного как в примере 1), 1,8 г (13 моль) НВТ и 2,7 г (13 мо ДСС. Смесьперемешивают при течение 2 ч и затем при комнатной температуре в течение 1 сут. Затем смесь охлаждают до 0°С и полученный осадок отдел ют фильтрацией. Фильтрат упаривают в вакууме. Полученный остаток раствор ют в этилацетате и этилацетатный раствор последовательно экстрагируют 1 н. раствором бикарбоната натри , водой, 0,75 н. раствором лиманной кислоты и водой Органический слой затем высушивают над сульфатом магни  и упаривают в вакууме до маслообразного состо ни  Масло кристаллизуют из эфира и лерекристаллизуют из смеси этилацеТ1та и эфира. Получают 7,0 г (72 % соедине: и . У. +7,9 (С 0,5 метанол). Молекул рный вес 750,86, Элементный анализ: Вычислено,%:С 68,78;;; 6,7l;N 7,46 Найдено.. % :С 68,75;Н 6,46;N 7,21. В. .-бутилоксик-арбонилЬ-тирозил-В-аланил-глицил-Ь-о1-метилфенилаланин , соль дицигслогексиламина . К 50 мл этанола добавл ют 4,0 г (0,053 моль) полученного продукта. Затем добавл ют суспензию 2,0 г паллади  (5%) на угле в ДМФ. Через смесь пропускают азот, подаваемый через газораспределительную трубку в течение 5 мин, и затем подают газообразный водород в течение 4. Затем смесь обильно продувают азотом и отдел ют палладиевый катализатор фильтрацией. Фильтрат концетрируют в вакууме до сиропообразного состо ни  . Сироп в растворе хлороформа подают на колонку размером 10 х 2см, родержащую силикагель марки Грейс и Дэвисон 62. Колонку элюируют при ступенчатом градиенте концентрации хлороформа в смеси хлороформ метанол (9 у 5: О, 5). Основные фракции объедин ют и растворитель упаривают . Полученное масло раствор ют в этилацетате и добавл ют к раст.вору 1 мл дициклогексиламина. Выпавший в осадок продукт отфильтровывают , высушивают, получа  2,6 г (65 %) соединени ,т. пл. 142 - d +46,3 (С 0,5, метанол). Г. N -трет.-бутилоксикарбонилЬ-тирозил-О-аланил-глицил-Ь-о -метилфенилаланиламид . 2,0 г полученного продукта (0,0227 моль) нейтрализуют смесью этилацетата и 0,75 н. раствора лимонной кислоты. Выделившийс  органический слой отдел ют, экстрагируют водой, высушивают над сульфатом магни  и упаривают в вакууме до масла (1,5 г). Полученную свободную кислоту раствор ют в 30 мл ДМФ и раствор охлаждают до 0°С в бутыли, выдерживающей давление. Добавл ют 560 мг ДСС (0,0027 моль) и смесь перемешивают 4 ч при 0°С и затем в течение 3 ч при комнатной температуре. Затем бутыль охлаждают до -78С и добавл ют 30 мл безводного аммиака. Бутыль снова закупоривают и смесь оставл ют перемешиватьс  при комнатной температуре в течение 48 ч. Смесь охлаждают до -78°С, бутыль открывают и непрореагировавший аммиак дегазируют в процессе нагревани  бутыли до комнатной температуры. Затем растворитель выпаривают в вакууме. Полученный остаток раствор ют в этилацетате и этилацетатный раствор экстрагируют сначала 0,75 н. раствором лимонной кислоты и затем водой. Раствор высушлвают над сульфатом магни , и растворитель выпаривают в вакууме. Остаток раствор ют в хлороформе и подают на колонку размером 3 х 45 с с силикагелем. Колонку элюируют при постепенном градиенте, включающем добавление хлороформа к смеси хлоро форм - метанол (9:1). Контроль за ходом очистки ведут с помощью хромотографии в тонком слое. Фракции, содержащие продукт, объедин ют, упа ривают и получают 1,1 г (72%) -соеди нени , 26° (С 4, метанол) Анализ аминокислот: G€y 0,99J АСа 1,00; Туг 0,99; ЫНз 1,12. Д. Ь-тирозил-О-аланил-глицилL-ci-метилфенилаланиламид , ацетатна  соль. К 20 мл смеси 1 н. раствора хлористого водорода в лед ной уксусной кислоте, содержащей 0,3 мл анизола, добавл ют 0,9 г (0,0016 моль) полученного продукта. Смесь перемешиваю при комнатной температуре в течение 30 мин и затем вливают в эфир. Полу ченный осадоК собирают и высушивают (720 мг). Твердое вещество рас твор ют в таком количестве буферного раствора (1 % пиридина и 0,05 % уксусной кислоты), чтобы конечный объем был 5 мл, и раствор подают на колонку размером 2,5 см х 99 см с DEAE-Сефадекс А-25 (ацетата) , предварительно доведенным до равновеси  с тем же самым буфером. Элюат просматривают при 2ЬО им и соответству щие фракции объедин ют и лиофи лизируют . Повторную лиофилизацию провод т из 10 %-ной уксусной кислоты и затем из смеси воды и ацето нитрила (3:1). Получают 400 мг соединени  23,9° (С 0,5; 1 н. раствор неб). Молекул рный вес 529,60. Элементный анализ; Вычислено,%: С 58,97; Н 6,66; N 13,22; О 21,15. С2бНз5%07 Найдено, % : С 59,02) Н 6,36, N 12,99; О 21,41. Анализ аминокислот: Туг 0,96) Аба l,0i; Ggy 1,00; NHj 1,03. Примерз. Получение Ь-тиро зил-В-аланил-глицил-Ы н-пропил-Ьфенилаланиламида , ацетата. А. N -трет.-бутилоксикарбонилN -н-пропил-Ь-фенилаланин. К 70 мл тетрагидрофурана добавл ют 10,6 г (0,04 моль) .-бу тилоксикарбонил-Ь-фенилаланина и по лученную смесь по капл м в течение 30 мин прибавл ют при сильном перемешивании к суспензии 0,12 моль гид рида кали  в 220 мл тетрагидрофурана и 0,5 г 18-краун-6 эфира при . Процесс ведут в атмосфере азота . Смесь перемешивают еще 10 мин п ОС. По капл м добавл ют раствор 23,3 мл (0,24-моль.) 1-иодопропана 40 мл тетрагидрофурана в течение 20 мин. Смесь выдерживают .в течени 2,5 ч при и ввод т в нее по капл м 11,5 мл (0,12 моль) 1-иодопропана . Перемешивание продолжают еще 2 ч при , затем внос т 10мл лед ной уксусной кислоты и вновь перемешивают в течение-10 мин. Затем смесь выливают на раздробленный лед. рН полученной водной фазы довод т до 8,0, добавл   2 н.раствор гидроокиси натри . Водную фазу дважды экстрагируют эфиром и затем подкисл ют до рН 2,5 добавлением холодного 2 н. раствора НСб. Затем водную фазу экстрагируют этилацетатом. Этилацетатный экстракт промывают один раз водой, высушивают нгщ сульфатом маг- ни  и упаривают в вакууме до сиропообразного состо ни . Сироп раствор ют в 200 мл эфира и добавл ют 8 мл ,(0,04 моль) DCHA. Осадок о1-фильтровывают и фильтрат промывают 1,. 5 н. раствором лимонной кислоты и волы. Эфирный слой высушивают над сульфатом магни  и упаривают в вакууме до маслообразного состо ни . Масло очищают хроматографически на колонке размером 3 х 40 см с силикагелем в хлороформе-. Продукт элюируют, использу  ступенчатый градиент хлороформа в смеси 5 % метанола в хлороформе. За ходом очистки след т с помощью хроматографии в тонком слое. Фракции, содержащие продукт, собирают, упаривают и получают 3,6г (31 % от теории) соединени , aL - 153,3 (С - 1 метанол). ЯМР-спектр: сГ () 10,47; сГ(МезС-) 1,50. Молекул рный вес 295,4. Элементный анализ: Вычислено,%:С 65,06;Н 8,53; 4,74 C. найдено, % :С 65,2б;Н 8,29; N4,69 Б..-бутилоксикарбоксилN -н-пропил-Ь-фенилаланиламид. К раствору м-трет.-бутилоксикарбонил-к н-пропил-Ь-февилаланина в ДМФ, охлажденному до -15°С, добавл ют один эквивалент изобутилхлороформиата и затем один эквивалент N-метилморфолина. Смесь перемешивают в течение 10 мин при -15 С и затем пропускают через нее в течение 30 мин безводный аммиак. Полученную смесь перемешивают 1 ч при -15 С и затем смеь вливают в сосуд, содержащий 200 мл льда. Водный раствор экстрагируют этилацетатом. Органический слой отдел ют и промывают последовательно 1,5 н. раствором лимонной кислоты, водой, 1 н. раствором бикарбоната натри  и водой. Слой этилацетата отдел ют и высушивают над сульфатом магни , упаривают в вакууме, получа  указанное соединение. В. ы -трет. -бутилоксикарбрнилЬ-тирозил-В-аланил-глицил-Ы -н-пропил-Ь-фенилаланиламид . К 20 мл свежеприготовленного 1 н раствора безводного НСБ в лед ной уксусной кислоте/ содержащего 2 мл анизола, добагл ют один эквивалент .трет.-бутилоксикарбонил-Ы -н-про пил-Ь-фёнилаланиламида. Полученную смесь перевешивают при комнатной температуре 30 мин, затем вливают в эфир и образовавшийс  осадок собирают и высушивают. Затем хлористо водородную соль раствор ют.в 30 мл ДМФ. Раствор охлаждают до и добавл ют один эквивалент N -трет,бутилоксикарбонил-О-бензил-Ь-тирозил-О-аланил-глицина {полученного как в примере 1 Д),один эквивалент HAT 1 экв ивалент ДСС.Затем реакционную смесь перемешивают при в течение 2 ч и при 4°С в течение 1 сут.Смесь охлаждают до и фильт руют. Фильтрат концентрируют в ва кууме до масла, которое снова раствор ют в этилацетате, Этилац Татный раствор промывают посЛедо шательно 1 н, раствором бикарбо ната натри , водой, холодным 0,7 н. раствором лимонной кислоты водой. Органическую фазу высушивают над сульфатом магни  и концен трируют в вакууме до масла. Масло хроматографируют на колонке размером 3 X 40 см с силикагелем в хлороформе . Продукт элюируют, использу  ступенчатый градиент хлороформа в смеси 10 % метанола в хлороформе , За ходом хроматографии след т с помощью хроматографии в тонком слое отобранных фракций, получают Ы -трет, -бутилоксикарбонил-0бензил-Ь-тирозил-Ь-аланил-глицилМ -н-пропил-Ь-фенилаланиламид . Полученный продукт раствор ют в 60 мл этанола и к смеси добавл ют 1,5 г паллади  (5%) на угле в виде водной суспензии, В реакционную смесь через газораспределительную трубку пропускают азот в течение 5мин и затем водород в течение 6ч. Затем реакционную смесь проду вают i3OTOM и палладиевый катализа тор удал ют фильтрованием. Смесь концентрируют в вакууме до сиропообразного состо ни . Сироп раствор ют в хлороформе и чист т хромат графией на колонке 40 х 3 см, содержащей силикагель. Продукт элюир ют, использу  ступенчатый градиен хлороформа в смеси 10 % метанола в хлороформе, и выдел ют в соответст с тонкослойным- профилем отобранных фракций, получа  соединение, молекул рный вес 597,7, oi- - 34,8 ( С 0,5 метанол). Элементный анализ: Вычислено,%:С 62,29;Н 7,25;N 11 Сэ1 Н43 ЩО-, Найдено, % :С 62,13;Н 7,24;N 11 Г. Ь-тирозил-О-аланил-глицил-К 1-пропил-1|-фенилаланиламид, ацетат 800 мг полученного продукта (1,34 ммоль) раствор ют в 10 мл трифторуксусной кислоты, содержащей 0,5 мл анизола. Смесь перемешивают при в течение 30 мин. Реакционную смесь сушат лиофилизацией. Твердое вещество раствор ют в достаточном количестве водного буферного раствора (1% пиридина и 0,5 % уксусной кислоты), объем довод т до 10 мл; раствор педают на колонку размером 2,5 х 99 см с DEAE-Сефадексом А-25 (ацетат), который уравновешен тем же самым буфером , Элюат просматривают при длине волны 280 нм и соответствующие фракции объедин ют и лиофилизуют. Повторна  лиофилизаци  из 1 М раствора уксусной кислоты дает 655 мг соединени , - 11,0° (С 0,5, 1 н, раствор НСР), Молекул рный вес 557,6, Элементный анализ: Вычислено,%:С 60,31;Н 7,05: N12,56 C2gH39%07 Найдено, % :С 60,23;Н 6,98;N 12,49 Анализ аминокислот. Туг 0,99J Аеа 1,00, сеу 1,01; NH 0,95. П р и м е р 4, Получение L-тиpoзил-D-aлaнил-глицил-№ этил-L-фeнилаланиламида , ацетатна  соль, А, N -бутилоксикарбонил-N-этилL-фенилаланйн , К 70 мл тетрагидрофурана добавл ют 10,6 г (0,04 моль) № бутилоксикарбонил-Ь-фенилаланина , Полученную смесь добавл ют по капл м в течение 30 мин к механически перемешиваемой суспензии 0,12 моль гидрида кали  в 220 мл тетрагидрофурана и 0,5 г 18-краун-б эфира при Ос в атмосфере азота. Смесь перемешивают дополнительно в течение 10 мин при , Затем по капл м в течение 20 мин добавл ют раствор 19,4 мл (0,24 моль) йодистого этила в 40 мл. тетрагидрофурана. Смесь выдерживают в течение 4 ч при 0°С, Добавл ют еще 19,4 мл (0,24 моль) йодистого этила к смеси двум  равными порци ми. Смесь перемешивают дополнительно 2 ч при и затем добавл ют 10 мл лед ной уксусной кислоты. После перемешивани  в течение 10 мин смесь вливают на 400 мл измельченного льда, рН полученной водной фазы увеличивают до 8,0 добавлением 2 н, раствора гидроокиси натри . Водную смесь дважды экстрагируют эфиром и затем подкисл ют до рН 2,5 добавлением холодного 2 н. раствора сол ной кислоты. Затем в.рдную смесь экстрагируют этилацетатом, экстракт промывают водой, высушивают над сульфатом магни  и выпаривают в вакууме до сиропообразного состо ни . Сироп раствор ют в 200 мл эфира и добавл ют 8 мл (0,04 моль) DCHA, Осадок отфильтровывают и фильтрат экстрагируют 1/5 н. раствором лимонной кислаты и водой,. Эфирный слой высушивают .над сульфатом магни  и упаривают в вакууме, получают 4,6 г (39 % от теории) соединени . Спект ЯМР: cf (фенил) 7,2; {f (Ме,СОС-)1,4. Б. N -трет.-бутилоксикарбонилN -этил-Ь-фенилаланиламид. 4,3 г полученного ,-бутилоксикарбонил-Ы этил-Ь-фенилаланила (0,0416 моль) раствор ют в 60 мл ДМФ. Смесь охлаждают до 0°С и добавл ют к ней 3,0 г (0,0146 мол ДСС. Реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч при и затем 72 ч при комнатной температуре. Затем смесь охлаждают до и фильтруют Фильтрат концентрируют в вакууме до масла, которое повторно раствор ют в этилацетате. Раствор экстрагируют 1 и. раствором бикарбоната натри , водой, холодным 1,5 н. раствором ли монной кислоты и водой. Органическую фазу высушивают над сульфатом магни  и концентрируют, получа  3,33 г (91 % от теории) соединени  - 101,51 (С 1, метанол). Молекул рный вес 292,4. Элементный анализ: Вычислено,%:С 65,73;Н 8,27;N 9, С еН24«2.С3 Найдено, % :С 66,03;Н 8,13;N 9, В. Н этил-Ь-фенилаланиламид, хл ристоводородна  соль. 3,5 г полученного соединени  (11,95 моль) раствор ют в 40 мл свежеприготовленной уксусной кисло ты, содержащей безводныйхлористый водород (1 н. раствор) и 1,5 мл анизола и (С,-) SiH. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре 30 мин и затем вливают в эфир. Выпавший в осадок продукт отфильтровывают и высушивают, полу чают 2,6 г (96 % от теории) соединени , т. пл. 276 - 211°С. Молекул рный вес 227,7. Элементный Вычислено,%:С 58,02;Н 7,08;N 12 С И-f N2.C2 Найдено, % :С 57,97;Н 7,26;N 12 Г. N-трет.-бутилоксикарбонилL-тиpoзил-D-aлaнил-глицил-N этилL-фенилаланинамид . К 50 мл ДМФ добавл ют 1,14 г (0,005 моль) М этил-Ь-фенилалан амида в виде хлористоводородной со ли. Смесь охлаждают до 0°С и затем добавл ют 2,95 г (0,005 моль) соли DCHA . -бутилоксикарбонилЬ-тирсзил-О-аланил-глицина . Реакционную м ссу перемешивают при 5 мин и затем добавл ют к ней 675 (0,005 моль) МВТ и 1,03 г (0,005мо ДСС. Перемешивание продолжают при 6,5 ч и аатем при комнатной те пературе в течение 20 ч. Смесь ох .лаждают до ОС и фильтруют. Фильтр концентрируют в вакууме до масла, которое снова раствор ют в этиладетате , экстрагируют 1 н. раствором бикарбоната натри , водой, холодным 1,5 fj. раствором лимонной кислоты и водой. Органическую фазу высушивают над сульфатом магни  и концентрируют в вакууме до масла. Масло очищают хроматографически на колонке 3 х 40 см с силикагелем в хлороформе. Продукт элюируют, использу  ступенчатый градиент хлороформа в смеси 15 % метанола с хлороформом . Продукт выдел ют согласно тонкослойному профилю отобранных фракций, получают 1,13 г (39 % от теории) соединени , ot 21,0 (С 0,5, метанол). Молекул рный вес 583,7. Элементный анализ: Вычислено,%:С 61,73;Н 7,08;N 12,0 С30 4 N507 Найдено, % :С 60,35;Н 7v26;N 11,25 Д. Ь-Гирозил-О-аланил-глицил ,N -зтил-Ь-фенилаланиламид, ацетат. 1 г полученного продукта (1,71 ммоль) раствор ют в 20 мл трифторуксусной кислоты, содержащей 3 мл анизола и 3 мл (С.}-,, SiH. Смесь перемешивают при 0°С в течение ЗОмин и вливают в эфир, выпавший в осадок , продукт отфильтровывают и высушивают (660 мг) . Твердое веидество раствор ют в небольшом количестве буферного водного раствора (1 % пиридина и 0,05 % уксусной кислоты), объем довод т до 10 мл и этот раствэр подают на колонку 2,5 х 90 см с DEAE-Сефадексом А-25 (ацетат), который уравновешивают предварительно с тем же самым буфером. Элюат просматривают при длине волны 280 нм и соответствующие фракции собирают и лиофилизуют. Твердое ве1цество раствор ют в 0. ,2М растворе уксусной кислоты (10 мл) и. раствор чист т хроматографически на колонке 2,5х99см с Сефадексом G-10, который предварительно уравновешивают с тем же самым растворителем. Элюат просматривают при длине волны 280 нм и соответствующие фракции объедин ют и лиофилизуют, получа  448 мг (48 % от теории) соединени  10,6 (С 0,5, 1 н. раствор нее). Молекул рный вес 543,6. Элементный анализ: Вычислено,%:С 59,65;Н 6,86;N 12,88 Са7Нэ7М5-07 найдено, % :С 59,41;Н 7,26;N 13,18 Анализ аминокислот :Туг 1,03; Аба 0,99; СЕу. 0,97; NH 0,98. Анестезирующа  активность соединений формулы 1 изучена в опыте с мышами на гор чей пластине. Мышь помещают в вертикальный акриловый цилиндр, в основании которого расположена гор ча  пластина, температура которой поддерживаетс  равной 52С. Мышь получает подкожную

иньекцйю заданного количества испытуемого соединени , растворенного или суспендированного в соответствущем носителе. Выдерживают заданный промежуток времени после введени  испытуемого соединени  и затем мышь помещают tj поверхность гор чей платины . Затем записывают латентности двух отдельных  влений в секундах. Сначала измер етс  латентность до тех пор, покамышь не начнет лизать задние лапы, и затем измер етс  латентность до момента, когда мышь прыгнет с гор чей пластины. Вещество , которое про вл ет анестезирующую активность, обеспечивает увеличение этих латентных периодов по сравнению с контрольными мышами, которым при инъекции вводили только

носитель. Это должно происходить при величине дозы, котора  не вызывает нарушени  моторной координации или выводит мышь из стро .

В табл. 1 приведены латентности 5 до момента лизани  задних лап, а в табл. 2 - латентности бегства прыжком. Критерий положительного анестезирующего зффекта состоит в следующем: латентность момента

0 лизани  задних лап или бегства прыжком должна быть равной или большей, чем средн   контрольна  латентность плюс два стандартных отклонени  от среднего. Каждый результат, приведенный в табл. 1 и 2, представл ет собой среднюю величину плюс-минус стандартное отклонение.

Таблица

15 26,4il,8 32,9±2,3 32,4t2,4

26,,7

30,2±2,7 32,0±2,7 42,2±3,9 15 .25,7±1,.1

Продолжение табл.1

РО

35,2±2,7 58,li5,l

54,2i:7,2 240,OtO

Тавлица2

Ь-Тирозил-О-аланил-гл цил-К метил-Ь-феннлаланилампл , ацетат

9080,5±8,8

1-J73,,9 126,2il4,7

:.62,7i9,l lC7,ei8,l

,,2

L:. 13,,5 Ii 62,9i-10,3

30 73,i;tl4,6

-0 73,,6

63,,1 130,7±15,

60 59,

90 59,,8 120 79,4t5,7 . - .. 120 69,8i4,2

;;л- л «и;-; н: s 62,7,7,. 118,, i2o,6tu.2

пропил-Ь-Фенилала15 75,Gt5,7

ниламид, ацетат

:;:л:: лйци;°« - ,8.7,7 121,2115,7-X85,,o

этил-Ь-фенилала15 7q.li7,7

ниламид, ацетат Примечай. с.

lJ3,ltl4,8 222,2±9,l 140,,0

237,,7 189,2112,8 105,,2 110,219,8

104, ,0

152.,4irl7,5 22Г, ,J17,7

112,2t21,2 144,,2

I

218,ЗГ16,4 69,4tl6,

89,4t7,.5 104,Its,« 126,4-11,7

I55,0tl7,9 237,,4

218,,2 240,Oio Индексн 1-3 указывают, что результат значим с лостоверностью V 0,001; Р 0,05 и Р 0,05, соответственно.

Claims (3)

1. Формула изобретени 

   I. Способ получени  производных тетрапептидов формулы I

   „ о , oW«,

   Нч Л п I

   ; H-CH-t-NH-CH c-NH- сн.- с-н - с- z

   Н

   L и D означают хиральность; R - первичный алкил R/j - водород или первичный

   алкил Сз;

   Ra - водород или первичный алкил СМ ;

   Z - CONH (при условии, когда один из радикалов Ку и Rjпервичный алкил, второй водород ),

   или их солей, отличающийс   тем, что защищенные соединени , соответствующие производным тетрапептидов формулы I, деблокируют обработкой в кислой среде.
2. 2. Способ по п. 1,отлича ющ и и с   тем, что деблокирование провод т в трифторуксусной кислоте.
3. 3. Способ по п. 1, отличающийс  тем, что деблокирование провод т в лед ной уксусной кислоте , насыщенной газообразным НСС .

   Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе 1. Шредер Э., Любке К. Пептиды,

   Мир

   ч. 1, 1967, М,,

   с, 112.