HU182866B

HU182866B - Process for preparing new tetrapeptide derivatives

Info

Publication number: HU182866B
Application number: HU78EI814A
Authority: HU
Inventors: Edward L Smithwick; Robert C Frederickson; Robert Th Shuman
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1977-10-03
Filing date: 1978-09-29
Publication date: 1984-03-28
Also published as: EP0001684A2; SU908246A3; PL114271B1; GB2005688A; CH635571A5; YU231578A; PH14660A; PL210045A1; LU80316A1; BG31224A3; NZ188521A; US4264491A; IT7828359A0; AR224238A1; DD139710A5; AT367028B; FR2404629A1; GB2005688B; DK149231C; ZA785564B

Description

A találmány szerinti eljárást az jellemzi, hogy a peptidkémiában szokásos módon a védett I általános képletű tetrapeptid-származékról a védőcsoportokat savval, előnyösen trifluorecetsawal vagy jégecet-sósav eleggyel kezelve lehasítjuk, és kívánt esetben egy keletkezett savaddíciós sót szabad bázissá alakítunk.

A találmány tárgya eljárás parenterális alkalmazás esetén fájdalomcsillapító (analgesic) hatást mutató új tetrapeptid-származékok előállítására.

Az utóbbi időben emlős állatok agyvelejéből (mammalian brain) vagy agyvizéből (cerebral spinal fluid) oly morfinszerű tulajdonságokkal rendelkező endogén anyagokat vontak ki, melyeket encephalinoknak neveztek, és melyeket

H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH

H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leü-OH szekvenciával rendelkező pentapeptidként Hughes és társai, Natúré, 258, 577 (1975) cikkben identifikáltak. Ezeket a vegyületeket a szerzők metionín-encephalinként és leucin-encephalinként ismertették.

Bár ezek a vegyületek egerekkel végzett kísérletekben intracerebroventricularis (agykamrába való) alkalmazás esetén mutattak fájdalomcsillapító aktivitást [Bucher és társai, Natúré, 267, 423 (1976)], parenterális alkalmazás esetén azonban gyakorlatilag hatástalannak bizonyultak.

(l) (0) (L)

0 0 R, R« ι ι ι ii ?

FVN-CH-C-NH-CH-C-NH-CHr-C-N-C-C-NH^

OÜ

182 866

A találmány tárgya eljárás olyan vegyületek egy új csoportjának előállítására, mely vegyületek jelentős és kimutatható fájdalomcsillapító hatással rendelkeznek, az egész szervezetre kiterjedő szisztémás alkalmazás esetében.

A találmány tehát eljárás az I általános képletű tetrapeptidek egy csoportjának és gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sóinak előállítására, melyekben L és D, ha alkalmazható, a kiralitást (konfigurációt) határozza meg. Az I .ltalános képletben

R⁴ és R^s közül az egyik jelentése hidrogénatom, és a másiké 1 -3 szénatomos primer alkilcsoport.

A találmány értelmében úgy járunk el, hogy a megfelelően védett I általános képletű tetrapeptid-származékról egy sav alkalmazásával a védőcsoportokat lehasítjuk.

Gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sók lehetnek szerves és szervetlen savaddíciós sók, így például azok, — melyek a sósavból, kénsavból, szulfonsavból, borkősavból, fumársavból, hidrogénbromidból, glikolsavból, citromsavból, maleinsavból, foszforsavból, aszkorbinsavból, p-toluolszulfonsavból, benzoszulfonsavból naftalinszulfonsavból és propionsavból állíthatók elő. Előnyösen a savaddíciós sókat sósavból, ecetsavból vagy borostyánkőjavból állítjuk elő.

Attól függően, hogy milyen szubsztituenst tartalmaz, az I általános képletű tetrapeptid a specifikusan meghatározott tetrapeptidnek primer amid, primer alkohol vagy nitril származéka lehetnek. A sztereokonfiguráció ezeknek az I általános képletű vegyületeknek jellegzetes tulajdonsága. A kényelem kedvéért az I általános képletű átalakított tetrapeptidekaminosav-maradékait a terminális aminocsoporttal kezdve sorrendben megszámoztuk. Az aminosav-maradékok konfigurációja az 1. helytől a

3. helyig L. D és semmilyen. A3. helyen egy glicincsoport van és ez tudvalevőleg nem tartalmaz aszimmetriás szénatomot. A 4. helyen (C-terminális helyzet) levő primer amid, primer alkohol vagy nitrilcsoport konfigurációja a megfelelő feltételezett L-aminosav-maradékkal egyezik meg.

A fentiekben az R⁴ és R⁵ jelentésénél leírt „1-3 szénatomos primer alkilcsoport” lehet metil-, etil- és n-propil-csoport.

Az I általános képletű átalakított tetrapeptidek 1-4 helyén levő egyes aminosav-maradékokra a következő megfontolások érvényesek:

(A) 1. hely

Ez a hely az amino-terminális része a peptidnek, és az itt levő aminosav-maradék az L-tirozin.

(B) 2. hely

Az I általános képletű peptid 2. helyén egy D-sztereoizomer aminosav-maradéknak kell lennie. Ez az aminosav a D-alanin.

(C) 3. hely

Ezen a helyen levő aminosav-maradék a glicin- (Gly) · származéka.

(D) 4. hely

Ezen a C-terminális helyen levő csoport az L-fenilalanín (Phe) származéka. Ez a csoport minden esetben egy primer amid (Phe-NH₂).

A csoport vagy nem tartalmaz szubsztituenst, vagy ha igen, akkor az amino-nitrogénnél (R⁴) szubsztituált. Ha a csoport N-szubsztituált, akkor a szubsztituens Nmetil-, N-etil- vagy N-n-propil-csoport. Továbbá, abban 2 az esetben, ha a csoport az amino-nitrogénen nem tartalmaz szubsztituenst, akkor az α-szénatom (R^s) lehet metil-, til- vagy n-propil-csopoíttal szubsztituálva, azzal a megkötéssel, hogy az R⁴ és R⁵ közül az egyik jelentése 1-3 szénatomos primer alkilcsoport és a másik jelentése hidrogénatom. Előnyösebben, az 1-3 szénatomos primer alkilcsoport jelentése metilcsoport. így igen előnyösen alkalmazható vegyületek azok, melyekben az R⁴vagy R⁵ jelentése metilcsoport és legelőnyösebben, ha R⁴ jelentése metilcsoport.

A jelen leírásban a következő rövidítéseket használtuk fel, mely rövidítések legnagyobb része a szakemberek által jól ismert és gyakran alkalmazott:

Alá - alanin

Gly — glicin

Phe — fenilalanin

PH-NH₂ - fenilalanín-amid

Tyr — tirozin

Ac — aeetilesoport

Me — metilcsoport

Et - etilcsoport

Ip - izopropilcsoport

Pr - Ti-propilcsoport

Bu - n-butilcsoport i-Bu - izobutilcsoport t-Bu - terc-butilcsoport s-Bu - szek-butilcsoport

BOC - terc-butiloxikarbonilcsoport

Bzl - benzilcsoport

DCC — N.N'-diciklohexilkarbodiimid

HBT - 1-hidroxibenzotriazol

DMF - N,N-dimetilformamid

TFA — trifluorecetsav

THF — tetrahidrofurán

DEAE — dietilaminoetil

DCHA - diciklohexilamin

Az I általános képletű vegyületek peptidek szintézisére alkalmas rutin-eljárásokkal állíthatók elő. Az előállítás folyamán a vegyületek részleges racemizációja lehetséges, a fellépő racemizáció azonban ezeknek az I általános képletű vegyületeknek fájdalomcsillapító aktivitását csak kis mértékben változtatja meg.

Az 1 általános képletű vegyületek előállítását célzó eljárások lényege az, hogy aminosavak vagy peptid-fragmentumok kapcsolódnak össze úgy, hogy az egyik karboxilcsoportja reagál a másik aminocsoportjával, és ily módon egy amid-kötés jön létre. Azért, hogy ez a kapcsolódási reakció eredményesen vébemenjen, kívánatos, először az, hogy minden reaktív funkcionális csoport, amely nem vesz részt közvetlenül a reakcióban, alkalmas blokkoló csoportok felhasználásával inaktiválva legyen, és másodszor az, hogy a kapcsolási reakcióban megfelelően aktivált karboxilcsoport vegyen részt, mely lehetővé teszi a reakció előrehaladását. Mindez magábafoglalja a reakció-sorrend és a reakciókörülmények gondos kiválasztását, valamint specifikus védőcsoportok felhasználását úgy, hogy a kívánt peptid-terméket nyerjük. Az aminosavak, melyeket az I általános képletű vegyületek előállításánál alkalmazunk és amelyek főleg a kiválasztott védő-csoportokat és/vagy az aktivált funkcionális csoportokat tartalmazzák, a peptid-kémiával foglalkozó szakemberek számára jól ismert módon állíthatók elő.

182 866

Az I általános képletű vegyületek szintézisének minden műveleténél oly kiválasztott védőcsoportokat alkalmazunk, mely csoportok, vizsgálataink szerint, a legzavartalanabbul működnek. Más csoportok is alkalmazhatók ebben a szintézisben, bár valószínűleg kevésbé eredményesen. így például, az I általános képletű vegyületek szintézisében amino-védőcsoportként a benziloxikarbonil- (CBz), a terc-butiloxikarbonil- (BOC), a tercamiloxikarbonil- (AOC), a p-metoxibenziloxikarbonil(MBOC), az adamantiloxikarbonil- (AdOC) és az izoborniloxikarbonilcsoport különféle módon alkalmazható. Továbbá, a tirozil-maradéknál hidroxi-védőcsoportként általában benzilcsoportot (Bzl) alkalmazunk, bár más csoportok is jól felhasználhatók, mint például a p-nitrobenzil- (PNB) és a p-metoxibenzilcsoport (PMB).

Az I általános képletű vegyületek előállításánál karboxil-védő-csoportként bármely tipikus észterképző csoportot felhasználhatunk, mint például a metil-, etil-, benzil-, ρ-nitrobenzil-, p-metoxibenzil- és a 2,2,2-triklóretil-csoportot.

Az I általános képletű vegyületek előállításánál a megfelelően védett N-blokkolt aminosavnak vagy peptidrésznek egy megfelelően védett karboxi-blokkolt aminosavval vagy peptid-résszel történő kapcsolódásakor az aminosav vagy peptid-rész karboxilcsoportját aktiváljuk, a kapcsolódási reakcióra szabaddá tesszük. Ez megvalósítható bármely jól ismert eljárással. Egy ilyen aktiválási eljárás magába foglalja a karboxilcsoportnak egy vegyes anhidriddé történő átalakítását. A szabad karboxilcsoportot valamely más savval, jellegzetesen a karbonsavnak egy származékával, mint például egy savkloridjával, reagáltatva aktiváljuk. A kevert anhidridek képzésére alkalmas savkloridok például az etil-klórformiát, fenilklórformiát, szek-butil-klórformiát, izobutil-kloroformát és a pivaloilklorid. Előnyösen az izobutil-klórformiátot alkalmazzuk.

A karboxilcsoport aktiválása más módszerrel is történhet. nevezetesen a vegyületnek aktív észter-származékká történő átalakításával. Ilyen aktív észter például valamely 2,4.5-triklórfenilészter, pentaklórfenilészter és valamely p-nitrofenilészter.

A szóbanforgó vegyületek előállítására megfelelően alkalmazható a jól ismert azid-kapcsolási reakció is.

Az I általános képletű vegyületek előállítása előnyösen olyan kapcsolási eljárással történik, melynél N,Ndiciklohexilkarbodiimidet (DCC) alkalmazunk a szabad karboxilcsoport aktiválására azért, hogy a kapcsolódást lehetővé tegyük. Ennél az aktiválási és kapcsolási eljárásnál az aminosavra vagy a peptid-részre vonatkoztatva ekvimolekuláris mennyiségű DCC-et használunk, és a reakciót ekvimolekuláris mennyiségű 1-hidroxibenzotriazol (HBT) jelenlétében végezzük. A HBT felhasználásával a nem-kívánatos mellékreakciók, például lehetséges racemizáció kiküszöbölhető.

Az I általános képletű vegyületek előállításakor az alkalmazott műveletek sorrendjének bizonyos pontjainál szükséges a kiválasztott védőcsoportok lehasítása. A peptid-szintézisben jártas szakember a jellegzetes védőcsoportok közül könnyen ki tudja választani azokat a csoportokat, amelyek kompatíbilisak, abban az értelemben. hogy ezek alkalmazásakor a termék olyan szelektív hasítása valósítható meg. melynél az antinosavon vagy a peptid-részen jelen levő egy vagy több. de nem az összes vcdő-csoport hasad le. A peptid-kémiában ezek az eljárások jól ismertek.-Szelektív hasítási eljárásokról részletes ismertetést találhatunk az irodalomban, lásd Schröder és Lübke, The peptides, I. kötet, Akadémiai kiadó, New York (1965), különösen lényeges a 72-75. oldalon levő táblázat.

Karboxil-védő-csoportok hasítása lúgos elszappanosítással valósítható meg. Aránylag erősen lúgos körülmények között, jellegzetesen valamely alkálifémhidroxidot, mint például nátriumhidroxidot, káliumhidroxidot vagy litíumhidroxidot használva, történik általában a védőkarboxil-csoport dezészterezése. Az elszappanosítási reakció körülményei a szakemberek számára jól ismertek. A karboxil-vedőcsoportok katalitikus hidrogenolízissel is eltávolíthatók, például úgy, hogy a reakció palládium-szénen katalizátor jelenlétében megy végbe. Továbbá, abban az esetben, ha a karboxil-védő-csoport pnitrobenzil- vagy 2,2,2-triklóretil-csoport, akkor cink és sósav jelenlétében történő redukcióval is végrehajtható a blokkoló-csoport hasítása.

Az amino-védőcsoportok hasításánál a védett aminosavat vagy pepiidet egy savval, mint például hangyasavval, trifluorecetsawal (TFA), p-toluolszulfonsavval (TSA), benzolszulfonsavval (BSA), vagy naftalinszulfonsavval kezeljük, és ily módon termékként a megfelelő savaddíciós sót nyerjük. Az amino-blokkoló-csoportok hasítása a védett aminosavnak vagy pepiidnek hidrogénbromid vagy sósav és ecetsav keverékével való kezelésével is végrehajtható, és ily módon termékként a megfelelő hidrogénbromid vagy sósav-addíciós sót nyerjük. Az alkalmazott módszer vagy reagens a specifikus blokkoló reakcióban résztvevő anyagok kémiai vagy fizikai tulajdonságaitól függ. Vizsgálataink során azt találtuk, hogy abban az esetben, ha az R⁴ csoport jelentése más mint hidrogénatom és legalább három aminosav-maradékot tartalmazó peptid hasítását akarjuk végrehajtani, akkor igen előnyös a peptid blokkoló csoportjának hasítását trifluorecetsawal vagy hangyasawal végezni úgy. hogy termékként a megfelelő savaddíciós sót nyerjük. A só egy ioncserélő gyantával, mint például DEAE Sephadex A25-tel vagy Amberlyst A27-tel kezelve egy gyógyászatilag alkalmasabb vegyületté átalakítható.

A tirozil-maradékon jelen levő hidroxi-védő-csoportok rögzíthetők a pepiiden a peptid előállításának egész ideje alatt, és az utolsó művelet folyamán az amínovédő-csoportok hasításával együtt eltávolíthatók. Bár a karboxil-védő-csoportok eltávolítása az alkalmazott körülményektől függ. egy korábbi előállítási műveletnél is lehetséges ezek eltávolítása. Ha a karboxil-védő-csoportok hasítása lúgos elszappanosítással történik, akkor a hidroxi-védő-csoportok a peptiden maradnak, rögzítődnek; azonban, ha katalitikus hidrogenolizissel távolítjuk el a karboxil-védő-csoportokat akkor a hidroxi-védőcsoportok is lehasadnak. Ez utóbbi azonban nem komoly probléma, mivel az 1 általános képletű vegyületek előállítása szabad hidroxil-csoportot tartalmazó tirozil-maradék jelenlétében is végrehajtható.

Egy előnyös, specifikus eljárással az 1 általános képletű vegyületek előállítása a következőképpen történik: valamely, külön-külön előállított N-terininális tripeptidet egy C-terminális fenilalanilamiddal összekapcsolunk, majd az összes megmaradt blokkoló csoportot alkalmas módon eltávolítjuk. A szóban forgó vegyületek előállításánál az N-terminális tripeptiddel reagáló, külön előállított oly C-terminális fenilalanil-vegyület is alkalmazható. mely egy olyan csoportot tartalmaz, amely az

182 866 amidcsoportnak prekurzora. Az I általános képletű vegyületek előállításánál az általános szekvencia, a műveletek sorrendje, az alábbiak szerint írható le, melyben AA az aminosav-maradékot és a hozzá tartozó szám pedig az aminosav helyét jelenti a végtermék peptid 5 molekula sorrendjében.

A. A tripeptid rész előállítása

BOC-L-Tyr-OH . + H-D-(AA)₂ -OBzl

I

OBzl

DCC

HBT

BOC-L-Tyr-D-ÍAAji-OBzl

I

OBzl

OH' v

BOC-L—Tyr-D—(AA)₂ OH I

OBzl

H-Gly-OBzl

DCC

HBT

BOC—L—Tyr—D—(AA)₂—Gly-OBzl

OBzl

H₂

Pd/C

NaOH

THF/H₂0

BOC-L~TyrD—(AA)₂ -Gly-OH f

OH

BOC-L-Tyr-D-(AA)₂ -Gly-OH

OBzl

B. Tripeptid és terminális fenilalanil-csoport kapcsolása

BOC-L-Tyr-D(AA)₂ -Gfy-H

I

OH

R⁴R⁵

HN-Ó - 0

CH₂

Ph

DCC ,,ΗΒΤ

R⁴ R⁵

I I

BOC-L-Tyr-D-(AA)₂ -Gly-N-C-Q

Oy

CH₂

Ph

A fenti reakcióvázlatban

Ph jelentése fenilcsoport és f

jelentése C—NH₂ csoport

182 866

Mikor az átalakított tetrapeptidet, mely a C-terminális csoportot tartalmazza, előállítottuk, a tirozilon levő O-védőcsoport (ha jelen van) hidrogenolízissel és az N-BOC-védőcsoport trifluorecetsawal való kezeléssel eltávolítható. 5

A fentiekben csak egy műveleti sorrendet írtunk le az I általános képletű vegyületek előállítására, azonban ettől eltérő sorrend is alkalmazható. Más eljárás, amely az említett vegyületek előállítására felhasználható, magában foglalja az egyes aminosavaknak vagy származé- 10 kainak a karboxiamid-csoporttal kezdődő peptid lánc szerkezetében, lépésenként történő beépülési sorrendjét.

Az eljárásnál a fentiekben leírt reakciótechnika, valamint bármely más, elméletileg meghatározott műveleti sorrend alkalmazható. 15

Az I általános képletű vegyületek szilárd-fázis szintézis alkalmazásával is előállíthatok. Ebben az eljárásban a C-terminális maradék egy megfelelő polimer hordozóhoz kapcsolódik, majd a peptid hossza, egy-egy csoporttal, addig növekszik — még mindig a polimer hordozó- 20 hoz kapcsolódva - amíg a kívánt peptid kialakul. A pepiidet ezután egy megfelelő leválasztó szerrel eltávolítjuk a hordozóról. Például, a C-terminális gyököt, mely az α-amino-csoportnál egy terc-butiloxikarbonil-csoporttal védett, DCC aktiválási reakcióval egy benzhidrilamin 25 polimerhez kapcsoljuk. Az N-BOC csoportot a polimerhez kötött maradéknak trifluorecetsawal metilénkloridban való reakciójával lehasítjuk, eltávolítjuk.

Az így nyert sót egy alkalmas tercier aminnal semlegesítjük, és ezt a sorrendet ismételjük minden egymás 30 után következő aminosav hozzáadásakor addig, amíg termékként a kívánt peptidet nyeljük. Ezt a védett peptidet azután 0 °C hőmérsékleten, hidrogénfluoridos kezelést alkalmazva, a polimer hordozóról eltávolítjuk.

A terméket kromatográfiás eljárással tisztítjuk. A jel- 35 lemző reakciókörülmények, mégpedig a reakcióidő, reakcióhőmérséklet, mosási idő, reagensek, védőcsoportok és hasonlók a gyakorlati szilárdfázisú peptidszintézisben jártas szakemberek számára jól ismertek.

Ha az I általános képletű vegyületeknél az R⁴ csoport 40 valamely 1-3 szénatomos primer alkilcsoport, akkor az alkalmas N-szubsztituált aminosavat alkalmazzuk a peptid előállításánál. Bármely N-monoszubsztituált aminosav az alábbi műveleti sorrend szerint, kiindulási anyagként valamely N-védett aminosavat alkalmazva, elő- 45 állítható;

KH K⁺'

BOC-N-(AA)-COOH--> B0C-K-(AA)-C00‘K⁺ i

18-korona-6-éter

THF

DMF

1-3 szénatomos primer alkiljodid (R_ai)

BOC-N—(AA)—COOH

Mint a fenti reakcióvázlat jelzi, az N“-védett aminosavat először a dianion előállítása céljából káliumhidriddel kezeljük egy megfelelő korona-éter jelenlétében.

A keletkezett intermediert ezután az alkalmas alkil- 65 jodiddal kezeljük és ily módon a kívánt N-szubsztituált aminosavat nyeljük.

A peptid-szintézisben jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy az α-szénatomnál erősen alkálikus körülmények között, mint például a fent leírt alkilezési eljárásnál, racemizáció léphet fel. A racemizáció foka erősen függhet attól az amino-vegyülettől, melynél a racemizáció végbemegy. A racemizáció a minimumra csökkenthető a lehető legrövidebb reakcióidő és feleslegben levő alkilezőszer alkalmazásával. Azonban, ha igen nagy mértékű racemizáció lép fel, akkor is lehet a terméket átkristályosítással tisztítani, úgy mint egy megfelelő kiral amin sóját, például mint a d(+)a-feniletilamin sóját.

A termékként nyert aminosav, melyben R⁴ jelentése valamely 1-3 szénatomos primer alkilcsoport, bármely, a fentiekben leírt eljárással, amegfelelő amiddá átalakítható.

Ha az I általános képletű vegyületeknél az R⁵ jelentése valamely 1—3 szénatomos primer alkilcsoport, akkor az alkalmas α-szén-szubsztituált aminosavat, vagy az ennek megfelelő amid-származékot alkalmazzuk az előállítás műveletei Során. Az α-szén-szubsztituált fenilalanin rész a Stein ét al., Journal of the American Chemical Society, 77. kötet, 700-703 (1955) közleményben leírt eljárással állítható elő. A racém-keverék bomlása a Turk et al., J. Org. Chem., 40, 7, 953-955 (1975) közleményben leírt eljárással érhető el. Az így nyert α-szubsztituált fenilalanin a fentiekben leírt eljárásokkal a megfelelő amiddá, alkohollá vagy nitrillé átalakítható. Ez a művelet kivitelezhető a tetrapeptid előállítása előtt vagy után, bár sokkal előnyösebb ezt a tetrapeptid előállítása előtt végrehajtani.

Az I általános képletű vegyületek értékes gyógyszerek. Fájdalomcsillapító aktivitással rendelkeznek, és különösen alkalmasak emberek és emlős állatok parenterális úton történő kezelésére.

Az I általános képletű vegyületek alkalmazhatók tisztán, vagy parenterális kezelésre alkalmas gyógyszerkészítményekkel együtt, egységnyi mennyiségben. Az alkalmazott vegyület vagy készítmény tartalmazhat szerves vagy szervetlen, szilárd és/vagy folyékony, farmakológiailag elfogadható hordozót. E célra megfelelő hordozó a szakemberek számára jól ismert. A készítmények lehetnek tabletta, granulátum, kapszula, szuszpenzió, oldat és hasonló módon formulázva.

Az I általános képletű vegyületek, hatásos mennyiségben alkalmazva, fájdalomcsillapító hatást mutatnak. Az adagolás mértéke általában a következő: minden testsúly-kilogrammra számítva körülbelül 0,1-100 mg, előnyösen körülbelül 1,0-20 mg.

A következő példák az I általános képletű vegyületek előállításának és aktivitásának illusztrálására szolgálnak, de nem korlátozzák a találmányt.

1. példa

Az L-tirozil-D-alanil-glicil-(N^0,-metil)-L-fenilalanflamid acetát-só előállítása

A. Benzil-D-alinát-p-toluolszulfonát

55,1 g (0,29 mól) p-toluolszulfonsav-monohidrátot tartalmazó 100 ml benzÜalkohol és 200 ml benzol elegyéhez 25 g (0,281 mól) D-alanint adunk. A keveréket visszafolyató hűtő alkalmazásával forrási hőmérsékletre melegítjük, és a vizet Deaa-Stark'készülékben azeotropos

182 866 elegyként eltávolítjuk. A keveréket 15 órán keresztül melegítjük, majd szobahőmérsékletre lehűtjük, és éterrel hígítjuk. A keletkező csapadékot egyesítjük, metilalkohol-éter elegyből átkristályosítjuk, és ily módon 55,3 g (56 %) kívánt terméket nyerünk, melynek olvadáspontja 112-115 °C..

A C₁₇H₂₁NO_sS képlet alapján (Ms = 351,42) az analízis számított értékei: C 58,10. H 6.02. N 3.99 %. talált értékei: C 58,19, H 6,06, N 3,82 %.

B. Benzil-N“ -terc-butiloxikarbonil-O-benzil-L-tirozil-Dalinát

200 ml vízmentes Ν,Ν-dimetilformamidhoz (DMF) hozzáadunk 35,1 g (0,1 mól) A részben leírt terméket. Az így nyert elegyet keverjük, 0 °C-ra lehűtjük, és 11,2 g (0,1 mól) diazabícíklooktánt (DABCO) adunk hozzá. A keveréket 10 percen keresztül 0°C hőmérsékleten kevertetjük, ezután először 37,1 g (0,1 mól) N^-tercbutiloxikarbonil-O-benzil-Ltirozint, majd 13,5 g (0,1 mól) 1-hidroxi-benzotriazolt (HBT) és 20,6 g (0,1 mól) N.N’-diciklohexilkarbodiimidet (DCC) adunk hozzá. Az így nyert keveréket 0 °C hőmérsékleten 3 órán keresztül és ezután szobahőmérsékleten 24 órán keresztül kevertetjük, majd 0 °C-ra lehűtjük. Ekkor egy szuszpenzió keletkezik, melyet szűrünk, és a szűrletet vákuumban bekoncentráljuk. A maradékot ezután etilacetátban feloldjuk, majd először In nátriumhidrogénkarbonát-oldattal, azután vízzel, O,75n hideg citromsavoldattal és végül újból vízzel mossuk. A szerves fázist ezután vízmentes magnéziumszulfát felett szárítjuk, szűrjük, és vákuumban bekoncentráljuk. A visszamaradó anyagot ezután forró etilalkoholban feloldjuk, melyből lehűlés után az oldott anyag kikristályosodik. Etilalkoholból történő egyszeri átkristályosítás után 41,5 g (80 %) tiszta kívánt terméket kapunk, melynek olvadáspontja 121-123 °C.

A C_3OH₃₆N₂O₆ képlet alapján (Ms = 520,63) az analízis számított értékei: C 69.21, H 6.97, N 5,38 %, talált értékei: C 68,99, H 6,75, N 5,17 %.

C. N^-terc-butiloxikarbonil-O-benzil-L-tirozil-D-alanin

200 ml tetrahidrofurán (THF) és 20 ml víz keverékéhez 31,2 g (0,06 mól) B rész szerinti terméket adunk. Az így nyert oldatot 0 °C-ra lehűtjük, és lassan 13,2 ml (1,1 ekvivalens) 5n nátriumhidroxid-oldatot adunk hozzá. Az így nyert keveréket keverjük, és lassan szobahőmérsékletre hagyjuk felmelegedni, öt óra múlva a keveréket víz és éter között megoszlatjuk. Az elkülönített vizes fázist hűtjük, a pH-t citromsav hozzáadásával 2-re állítjuk be, és a keveréket etilacetáttal extraháljuk. Az etilacetátos extraktumot vízzel mossuk, vízmentes magnéziumszulfát felett szárítjuk, szűrjük, és éterrel hígítjuk. A kivált csapadékot egyesítjük, és ily módon 17,7 g (67 %) kivánt terméket nyerünk, melynek olvadáspontja 160-162 °C.

A C₂₄H_3oN₂O₆ képlet alapján (Ms = 442,51) az analízis számított értékei: C 65.14, H 6,83. N 6,63 %. talált értékei: C 64,73, H 6,70, N 6,20 %.

D. Benzil-N^a-terc-butiíoxikarbonií-0-benzil-L-tirozilD-alanil-glicinát ml vízmentes DMF-hoz hozzáadunk 6,74 g (0,02 mól) benzilglicinát p-toluolszulfonsavas sót, az így nyert keveréket 0 °C-ra lehűtjük, és 2,24 g (0,020 mól) DABCO-t adunk hozzá. A keveréket néhány percig kever6 jük, majd először 8,84 g (0,020 mól)C részben leírt terméket és ezután: 2.7 g (0,020 mól) HBT-t és 4.12 g (0,020 mól) DCC-et adunk hozzá. A reakciókeveréket 2 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Az így nyert szuszpenziót 0 °C-ra lehűtjük, szűrjük, és vákuumban bekoncentráljuk. A visszamaradó anyagot etilacetátban feloldjuk, és először In nátriumhidrogénkarbonátoldattal, majd vízzel, hideg O,75n citromsav-oldattal és végül újból vízzel mossuk. A szerves fázist vízmentes magnéziumszulfát felett szárítjuk, szűrjük, és vákuumban bekoncentráljuk. A maradéknak etilalkoholból történő kikristályosítása után 10,8 g (92 %) kivánt terméket nyerünk, melynek olvadáspontja 145—147 °C.

A C₃₃H₃₉N₃O₇ képlet alapján (Ms = 589,69) az analízis számított értékei: C 67.22. H 6.67. N 7.13 %. talált értékei: C 67,32, H 6,83, N 6,91 %.

E. N^ű-terc-butiloxikarbonil-0-benzil-Lztirozil-I>-alanilglicin

150 ml tetrahidrofurán és víz 9:1 arányú keverékéhez 15,95 g (27 mmól) D részben leírt terméket adunk. Az elegyet keveréssel 0 °C-ra lehűtjük, és cseppenként 30 ml In nátriumhidroxid-oldatot adunk hozzá, két órán át keverjük, amíg a nátriumhidroxid hozzácsepegtetése történik, majd ezután kétszer éteres extrakciót végzünk. Az elkülönített vizes fázist 30 ml In sósavoldattal megsavanyítjuk úgy, hogy a pH 2,5 legyen. A kívánt terméket kristályosodás után szűréssel egyesítjük, majd átkristályosítjuk egyszer metilalkohol-víz elegyből és kétszer etilacetátból. így 11,43 g (az elméleti 85 %-a) terméket kapunk, melynek olvadáspontja 104— 107 °C.

[a]²D^s = +31,4° (c = 0~5 MeOH).

A C₂₆H₃₃N₃O₇ képlet alapján (Ms = 499,54) az analízis számított értékei: C 62.51, H 6,66, N 8.41 %, talált értékei: C 62,31, H 6,83, N 8,12 %.

F. N“ -terc-butiloxikarbonil-(N^Q -metil)-L-fenil-alanin, d-(+)-a-metilbenzilamin só ml tetrahidrofuránhoz 13,26 g (0,05 mól) N^aterc-butíloxikarbonil-L-fenilalanint adunk. Az így nyert keveréket cseppenként 30 perc alatt hozzáadjuk 0,15 mól káliumhidridnek és 0,5 g 18-korona-6-éternek mechanikusan kevert szuszpenziójához 0 °C-on, nitrogén atmoszférában. A keveréket ezután egy további órán keresztül keverjük. 15 ml tetrahidrofuránban oldunk 6,23 ml (0,1 mól) metiljodidot, és ezt az oldatot cseppenként 15 perc alatt hozzáadjuk a keverékhez. A keveréket két órán át állni hagyjuk, ezután ÍÖ ml ecetsavnak és 10 ml tetrahidrofuránnak keverékét cseppenként, majd 20 ml etilalkoholt adunk hozzá. A keveréket ezután 400 ml jégbe öntjük. Az így nyert vizes fázis pH értékét 2n nátriumhidroxid-oldattal 12-13-ra állítjuk be. A vizes keveréket éterrel kétszer extraháljuk, majd szilárd citromsav hozzáadásával megsavanyítjuk úgy. hogy a pH 3 legyen. A vizes keveréket ezután éterrel háromszor extraháljuk. Az éteres extraktumokat egyesítjük, vízzel extraháljuk, vízmentes magnéziumszulfát felett szárítjuk, és vákuumban szirup sűrűségűre bepároljuk. A szirupot 50 ml éterben feloldjuk, majd 6,44 ml (0,05 mól) d(+)-a-metilbenzilamint adunk hozzá. Az így nyert oldatot 350 ml hexánnal felhígítjuk, és ezután az edény falát dörzsöljük,/hogy a kristályosodást megindítsuk. A terméket szűréssel egyesítjük, és így módon 15,83 g (az elméleti 79 %-a) kívánt termé-61

182 866 két nyerünk. Etilacetátból történő átkristályosítás után a termék súlya 13,70 g (az elméleti 68 %-a) és olvadáspontja 136—139 “C.

[a]²D^s = -28,2° (c = 1, EtOH).

A C₂₃H₃₂N₂O₄-re képlet alapján (Ms = 400,50) az analízis számított értékei: C 68.9^ H 8.05. N 6.99 %. talált értékei: C 68,75, H 7,81, N 6,74 %.

G. N“-terc-butiloxikarbonil-(N“-metil)-L-fenil-alanilamid

4,0 g (0,01 mól) N“-terc-butiloxikarbonil-(N“-metil)L-fenilalanint, melyet a d(+)-a-metilbenzilaminsó megsavanyításával és éterbe történő extrakciójával állítunk elő, 20 ml Ν,Ν-dimetilformamidban (DMF) oldunk. Az elegyet —15 °C-ra lehűtjük, 1,56 ml (0,012 mól) izobutil-kloroformátot, majd 1,32 ml (0,012 mól) Nmetilmorfolint adunk hozzá. A reakciókeveréket 10 percen keresztül —15 °C hőmérsékleten keverjük, majd 1,5 órán át vízmentes ammóniát buborékoltatunk át rajta, és ezután még 1 órán át -15 °C hőmérsékleten keverjük, majd a keveréket egy 200 ml jeget tartalmazó edénybe öntjük. A vizes oldatot etilacetáttal extraháljuk. A szerves fázist elkülönítjük, és először l,5n citromsav-oldattal, azután vízzel. In nátriumhidrogén-karbonát-oldattal és végül újból vízzel mossuk. Az etilacetátos oldatot vízmentes magnéziumszulfáton szárítjuk, vákuumban szirup sűrűségűre bekoncentráljuk. A szirupnak éter és petroléter keverékből történő kristályosításával 2,12 g (az elméleti 76. %-a) kívánt terméket nyerünk, melynek olvadáspontja 91—92 °C.

[ajjj =-111,2° (c = 0,5, CHC1₃).

A C₁₅H₂₂N₂O₃-ra képlet alapján (Ms = 278,33) az analízis számított értékei: C 64,73, H 7,97, N 10,06 %, talált értékei: C 64,95, H 7,81, N 9,79 %.

H. N^a-terc-butíloxikarbonil-0-benzil-L-tirozil-D-alanil-glicil-(N-metil)-L-fenilalanilamid

Vízmentes hidrogénkloridot (In) és 2 ml anizolt tartalmazó 20 ml frissen előállított jégecethez 1,95 g (0,007 mól) N^0l-terc-butíloxikarbonil-(N°^:-metil)-L-fenilalanilamidot adunk. Az így nyert keveréket szobahőmérsékleten, 30 percig keveijük. A keveréket ezután éterbe öntjük, a kiváló csapadékot egyesítjük és szárítjuk (1,5

g). A hidrokloridsót 30 ml DMF-ban feloldjuk, az oldatot 0°C-ra lehűtjük, majd 1,4 ml (0,007 mól) diciklohexilamint adunk hozzá. A keveréket néhány percig keverjük, és ezután 3,5 g (0,007 mól) N^a-terc-butiloxikarbonil-O-benzil-Ltirozil-D-alanil-glicint, 950 mg (0,007 mól) HBT-t és 1,4 g (0,007 mól) DCC-et adunk hozzá. A reakciókeveréket ezután 0 °C hőmérsékleten, 2 órán keresztül, majd 4 °C-on 24 órán keresztül keverjük. A keveréket 0 °C-ra lehűtjük és szüljük. A szűrletet vákuumban bekoncentráljuk, és az ily módon nyert olajat etilacetátban újból feloldjuk. Az etilacetátos oldatot először In nátriumhidrogénkarbonát-oldattal, azután vízzel, 0,75 n citromsav-oldattal és végül újból vízzel extraháljuk. A szerves fázist vízmentes magnéziumszulfát felett szárítjuk, és vákuumban bekoncentráljuk. Az így nyert olajat 40 cmX3 cm nagyságú, Grace és Davison Grade 62 szilikagél oszlopon kloroformban kromatografáljuk. A terméket egy lépésenként csökkenő mennyiségű kloroformot tartalmazó keverékkel eluáljuk, mely keverék végső összetétele 10 % metilalkohol kloroformban. Az egyesített frakciók vékonyrétegkromatográfiás vizsgálata alapján izolált termék 3,55 g súlyú (az elméleti érték 77 %-a).

[a]g = -9,2° (c = 0,5 MeOH).

A C₃₆H_4sN₅O-, képlet alapján (Ms = 659,8) az analízis számított értékei: C 65.54, H 6,57. N 10.61 %. talált értékei: C 65,46, H 6,58, N 10,36 %.

I. N^a-terc-butiloxikarbonil-L-tirozil-D-alanil-glicil-N^ametil-L-fenilalanilamid

3,2 g (0,0485 mól) H részben leírt terméket 60 ml etilalkoholban feloldunk, és 1,5 g, vízben szuszpendált 5 %-os palládium-szén katalizátort adunk a keverékhez. Ezután a reakcíókeverékbe gáz-diszperziós csövön keresztül 5 percen át nitrogéngázt, majd 6 órán át hidrogéngázt buborékoltatunk. A reakciókeveréket ezután nitrogénnel átmossuk, és a palládium katalizátort szűréssel eltávolítjuk. A keveréket vákuumban szirup sűrűségűre bekoncentráljuk, a szirupot kloroformban feloldjuk, és egy 40 cmX3 cm nagyságú kromatográfiás oszlopra, amely Grace és Davison Grade 62 szilikagélt tartalmaz, abszorbeáljuk. A terméket egy lépésenként csökkenő mennyiségű kloroformot tartalmazó keverékkel, mely végül 10 % metilalkoholt tartalmazó kloroform keverék lesz, eluáljuk, és az egyesített frakciók vékonyrétegkromatográfiás vizsgálata . alapján ' Diaijuk. elkülönítjük. Ily módon 2,0 g (az elméleti 74 %-a) terméket nyerünk.

[a]g = —9,9° (c = 0,5, MeOH).

Az aminosav analízis talált értékei:

Gly: 1,01, Alá: 0,99, Tyr: 0,99, NH₃:1.14.

J. L-tirozil-D-alanil-glicil-(N“-metil)-L-fenil-alanilamid acetátsó

1,6 g (0,00281 mól) I részben leírt terméket 0,5 ml anizol tartalmú 10 ml trifluorecetsavban feloldunk. A keveréket 0 C-on 30 percig keveijük, ezután éterbe öntjük, a keletkező csapadékot egyesítjük és szárítjuk (1,1 g). A szilárd anyagot egy megfelelő puffer oldatban (1 % piridin és 0,05 % ecetsav) feloldjuk úgy. hogy 15 ml legyen, és ezt az oldatot egy 2.5 cmX99 cm nagyságú DEAE-Sephadex A—25 (acetát) oszlopra felvisszük, mely oszlopot előzőleg ugyanezzel a pufferral kezeltünk. Az eluátum összetételét 280 nm-nél vizsgáljuk, az alkalmas frakciókat egyesítjük és liofílizáljuk. 10 %-os ecetsavból történő ismételt liofilízálás, majd ezt követően 75:25 arányú víz-acetonitril keverékből történő liofilizálás után 0,84 g kívánt terméket nyerünk.

[a]g = +27,8° (c = 1, In HCl).

Aminosav analízis talált értékei:

Tyr: 0,98, Alá: 1,03, Gly: 1,00, NH₃:1,05.

2. példa

L-tirozil-D-alanil-glicil-L(a-metil)-fenilalanilamid acetátsó előállítása

A. L-(a-metil)-fenilalanin-benzilészter tozilátsó 100 ml benzolhoz 3,0 g (0,0168 mól) L-(ö-metil)fenilalanint adunk. Az így nyert szuszpenzióhoz ezután 3,5 g (1,1 ekvivalens) p-toluolszulfonsav-hidrátot és 10 ml berízilalkoholt adunk. A keveréket egy Dean-Stark vízzárral és visszafolyató hűtővel ellátott edényben négy napon át forraljuk. A keverékből szobahőmérsékletre

182 866 való lehűtés és éter hozzáadása után a tozilátsó kicsapódik. Ezt a csapadékot egyesítjük, szárítjuk, és ily módon 7,0 g (94 %) kivánt terméket nyerünk, melynek olvadáspontja 129—131 °C.

[α]θ = -10,7° (c = 0,5, In MeOH).

A C₂₄H₂₇NO₅S képlet alapján (Ms = 441,5) az analízis számított értéke: N 3,17 %, talált értéke: N 2,87 %.

B. N^a-terc-butiloxikarbonil-0-bcnzÍl-L-tirozil-D-alanilglicil-L-(a-metil)-fenilalanin-benzilészter ml DMF-hoz 5,74 g (0,013 mmól) A részben leírt terméket adunk. Az így nyert keveréket 0°C-ra lehűtjük, és 5 perc múlva 6,5 g (13 mmól) N^a-terc-butiloxikarbonil-O-benzil-L-tirozil-D-alanil-glicint (melyet az 1. példában leírtak szerint állítunk elő), 1,8 g (13 mmól) HBT-t és 2,7 g (13 mmól) DCC-et adunk hozzá. A keveréket 0 °C-on két órán át és szobahőmérsékleten 24 órán át keveijük. Ezután 0 °C-ra lehűtjük, és a keletkező csapadékot szűréssel eltávolítjuk. A szűrletet vákuumban beszárítjuk, a visszamaradó anyagot etilacetátban feloldjuk, és az etilacetátos oldatot először 1 n nátriumhidrogénkarbonát-oldattal, ezután vízzel, O,75n citromsav-oldattal és végül újból vízzel mossuk. A szerves fázist ezután vízmentes magnéziumszulfát felett szárítjuk, és vákuumban bekoncentráljuk. Az így nyert olajat éterből kristályosítjuk, majd etilacetát-éter keverékből átkristályosítjuk, és ily módon 7,0 g (72 %) kívánt terméket nyerünk.

[«Id = +7,9° (c = 0,5 MeOH).

A C4₃H₅₀N4 0g képlet alapján (Ms = 750,86) az analízis számított értékei: C 68,78, H 6,71, N 7,46 %, talált értékei: C 68,75, H 6,46, H 7,21 %.

C. N^Q-terc-butiloxikarbonil-L-tirozil-D-alanil-^icil-(L-ametil)-fenilalanin-diciklohexilaminsó ml etilalkoholhoz 4,0 g (0,0053 mól) B részben leírt terméket adunk. Ezután 2,0 g 5 %-os palládium szén katalizátor dimetilformamidos sűrű szuszpenzióját adjuk hozzá. Egy gáz-diszperziós csövön keresztül 5 percig nitrogéngázt, majd 4 órán keresztül hidrogéngázt buborékoltatunk a keverékbe. A keveréket ezután nítrogéngázzal átmossuk, és a palládium katalizátort szűréssel eltávolítjuk. A szűrletet vákuumban szirup sűrűségűre bekoncentráljuk. A kloroformban felvett szirupot egy 10 cmX2 cm nagyságú Grace és Davison Grade 62 szilikagél oszlopra felvisszük, majd az anyagot lépésenként csökkenő mennyiségű kloroformmal, kloroform:metanol (9,5:0,5) eluáljuk. A fő frakciókat egyesítjük, és az oldószert elpárologtatjuk. A visszamaradt olajat etilacetátban feloldjuk, majd 1 ml diciklohexilamint adunk hozzá. A keletkező csapadékot egyesítjük, szárítjuk, és ily módon 2,6 g (65 %) kívánt terméket kapunk, melynek olvadáspontja 142 146 °C.

Wp = +46,3° (c = 0,5, MeOH).

D. N^a-terc-butiloxikarbonil-L-tirozil-D-alanil-glicil-(La-metil)-fenil alanil amid

2,0 g (0,0027 mól) C részben leírt terméket etilacetát és 0,27n citromsav-oldat keverékével semlegesítjük. A szerves fázist elkülönítjük, vízzel extraháljuk, vízmentes magnéziumszulfát felett szárítjuk, vákuumban bekoncentráljuk, és ily módon 1,5 g olajat nyerünk. Az így nyert szabad savat 30 ml DMF-ban feloldjuk, és egy nyomásálló palackban lehűtjük 0 °C-ra. 560 mg (0,0027 mól) DCC-et adunk hozzá, és a keveréket °C-on 4 órán át, majd ezt követően 3 órán át szobahőmérsékleten keveijük. Az edényt ezután —78 °C-ra lehűtjük, és 30 ml vízmentes ammóniát adunk hozzá. Az edényt újból lezáijuk, és a keveréket szobahőmérsékleten 48 órán át keveijük. A keveréket ezután —78 °C-ra lehűtjük, az edényt kinyitjuk, és az ammóniát szobahőmérsékleten hagyjuk eltávozni. Az oldószert ezután vákuumban eltávolítjuk. A visszamaradó anyagot etilacetátban feloldjuk, és az etilacetátos oldatot először 0,75n citromsav-oldattal, azután vízzel exíraháljuk. Az oldatot vízmentes magnéziumszulfát felett szárítjuk, és az oldószert vákuumban elpárologtatjuk. A visszamaradó anyagot kloroformban feloldjuk, és az oldatot egy 3 cmX45 cm nagyságú Grace és Davison Grade 62 szilikagél oszlopra felvisszük. Az oszlopot egy lépésenként csökkenő mennyiségű kloroformot (-►kloroformmetanol arány 9:1) tartalmazó eleggyel eluáljuk. A vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatok alapján egyesített frakciókból az oldószer elpárologtatása után 1,1 g (72 %) kívánt terméket nyerünk.

[cv] D = -26° (c = 0,4 MeOH).

Az aminosav analízis talált értékei:

Gly: 0,99, Alá: 1,00, Tyr: 0,99, NH₃:1,12.

E. L-tirozil-D-alaníl-glicil-L-(a-metil)-fenilalanilamidacetátsó

In gázhalmazállapotú hidrogénklorid jégecetben és 0,3 ml anizol keverékének 20 ml-éhez 900 mg (0,0016 mól) D részben leírt terméket adunk. A keveréket szobahőmérsékleten 30 percig keverjük, majd éterbe öntjük. A keletkező csapadékot egyesítjük és szárítjuk (720 mg). A szilárd anyagot megfelelő puffer oldatban (1 % piridin és 0,05 % ecetsav) feloldjuk úgy, hogy a térfogat 5 ml legyen, és az oldatot előzőleg ugyanezzel a pufferral kezelt 2,5 cmX99 cm nagyságú DEAE-Sephadex A—25 (acetát) oszlopra felvisszük. Az eluátum összetételét 280 nm-nél vizsgáljuk, az alkalmas frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. 10 %-os ecetsavból történő ismételt liofilizálás és víz-acetonitril 75:25 arányú keverékéből történő liofilizálás után 400 mg kívánt terméket nyerünk.

[a]²D⁵ = +23,9° (c = 0,5 In HCl).

A C₂₆H₃sNsO₇ képlet alapján (Ms = 529,60) az analízis számított értékei: C 58,97, H 6.66, N 13,22 O 21,15 %, talált értékei: C 59,02, H 6,36, N 12,99, 021,41%.

Az aminosav analízis talált értékei:

Tyr: 0,96, Alá: 1,01, Gly: 1,00, NH₃: 1,03.

3. példa

L - tirozil - O - alanil - glicil - (N“-propil)-L- fenilalanilamid-acetátsó előállítása

A. N“-terc-butiloxikarbonil-(N^a-n-propil)-L-fenilalanin ml tetrahidrofuránhoz 10,6 g (0,04 mól) N“-tercbutiloxikarbonil-L-fenilalanínt adunk. Az így nyert keveréket cseppenként, 30 perc alatt, 220 ml tetrahidrofuránban levő 0,12 mól káliumhidrid és 0,5 g 18korona-6-éter mechanikusan kevert szuszpenziójához adjuk, 0 °C-on, és nitrogén atmoszférában. A keveréket további 10 percen át keverjük. Ezután 23,3 ml (0,24 mól) 1-jódpropánnak 40 ml tetrahidrofuránnal alkotott oldatát 20 perc alatt cseppenként hozzáadjuk. A keveréket 2,5 órán át 0 °C hőmérsékleten tartjuk, majd

182 866

11,5 ml (0,12 mól) 1-jódpropánt cseppenként a keverékhez adunk, és még 2 órán át 0 °C-on keverjük. Ezután 10 ml jégecetet adunk hozzá, 10 percig keverjük, és összetört jégbe öntjük. Az így nyert vizes fázis pH-ját 2n nátriumhidroxid-oldattal 8,0-ra beállítjuk. A vizes keveréket éterrel kétszer extraháljuk, majd hideg 2n sósav hozzáadásával megsavanyítjuk úgy, hogy a pH 2,5 legyen. A vizes keveréket ezután etilacetáttal extraháljuk. Az etilacetátos extraktumot vízzel egyszer extraháljuk, vízmentes magnéziumszulfát felett szárítjuk, és vákuumban szirup sűrűségűre bekoncentráljuk. A szirupot 200 ml éterben feloldjuk, és 8 ml (0,04 mól) DCHADCHA-t adunk hozzá. A keletkezett csapadékot szűrjük, és a szűrletet egyszer l,5n citromsav-oldattal és vízzel extraháljuk. Az éteres fázist vízmentes magnéziumszulfát felett szárítjuk, és vákuumban az oldószert elpárologtatjuk. Az így nyert olajat 40 cmX3 cm nagyságú Grace és Davison Grade 62 szilikagél oszlopra, kloroformban felvisszük. A terméket egy lépésenként csökkenő menynyiségű kloroformot tartalmazó keverékkel, mely keverék összetétele végül 5 % metanol kloroformban, eluáljuk. A vékonyrétegkromatográfiával vizsgált, egyesített frakciókból 3,6 g (31 %-a az elméleti értéknek) kívánt terméket különíthetünk el.

[a] d = -153,3° (C = 1 MeOH).

A C₁₇H_2SNO₄ képlet alapján (307,4) az analízis számított értékei: C 66,43, H 8,20, N 4,56 %, talált értékei: C 66,16, H 7,99, N 4,45 %.

B. N^-terc-butiloxikarbonil/N^-n-propilj-L-fenilalanilamid

Az A részben leírtak szerint előállított N^a-terc-butiloxikarbonil-(N^&-n-propil)-L-fenilalanint N,N-dimetilformamidban (DMF) feloldjuk. A keveréket -15 °C-ra lehűtjük, majd először 1 ekvivalens izobutilklórformiátot és azután 1 ekvivalens N-metilmorfolint adunk hozzá. A keveréket -15 °C-on 10 percig keverjük, és ezután 30 percen keresztül vízmentes ammóniát buborékoltatunk át rajta. Ezt az elegyet -15 °C-on 1 órán át keverjük, majd egy 200 ml jeget tartalmazó edénybe öntjük. A vizes oldatot etilacetáttal extraháljuk. A szerves fázist elkülönítjük, és először l,5n citromsav-oldattal, azután vízzel, In nátriumhidrogénkarbonát-oldattal és végül újból vízzel mossuk. Az etilacetátos oldatot vízmentes magnéziumszulfát felett szárítjuk, vákuumban az oldószert elpárologtatjuk, és ily módon a kívánt terméket nyeqük.

C. N^-terc-butiloxikarbonil-L-tirozil-D-alanil-glicil(N“ -n-propil)-L-fenil alanilamid ml frissen előállított jégecethez, amely vízmentes hidrogénkloridot (In) és 2 ml anizolt tartalmaz, 1 ekvivalens N^a-terc-butiloxikarbonil-(N“-n-propil)-L-fenilalanilamidot adunk. Az így nyert keveréket szobahőmérsékleten 30 percig keverjük, majd éterbe öntjük, és a keletkező csapadékot egyesítjük, szárítjuk. A hidrokloridsót ezután 30 ml DMF-ban feloldjuk. Az oldatot 0 °C-ra lehűtjük, és 1 ekvivalens diciklohexilamint adunk hozzá. Az elegyet néhány percig keverjük, majd 1 ekvivalens Nőiére - butiloxikarbonil - O - benzil - L - tirozil - D - alanilglicint (az 1E példa szerint előállítva), 1 ekvivalens HBT-t és 1 ekvivalens DCC-et adunk hozzá. A keveréket 0 °C-on 2 órán át, majd 4 °C-on további 24 órán át keverjük. A keveréket lehűtjük 0 °C-ra és szűrjük. A szűrletet vákuumban bekoncentráljuk, és az így nyert olajat etilacetátban újból feloldjuk. Az etilacetátos oldatot először In nátriumhidrogénkarbonát-oldattal, azután vízzel, hideg 0,75n citromsav-oldattal és végül újból vízzel extraháljuk. A szerves fázist vízmentes magnéziumszulfát felett szárítjuk, és vákuumban bekoncentráljuk. A vissza^ maradó olajat egy 40 cmX3 cm nagyságú Grace és Davison Grade 62 szilikagél oszlopon kloroformban kromatografáljuk. A terméket egy lépésenként csökkenő mennyiségű kloroformot tartalmazó eleggyel eluáljuk, mely elegy végső összetétele 10 % metilalkohol tartalmú kloroform. Az egyesített frakciók vékonyrétegkromatográfiás vizsgálata alapján izolálható termék az N“-tercbutiloxikarbonil - O - benzil - L - tirozil - D - alanil - glicil(N“ -n-propil)-L-fenilalanilamid.

A fenti bekezdésben leírt terméket 60 ml etilalkoholban feloldjuk, és 1,5 g, vízben szuszpendált 5 %-os palládium-szén katalizátort adunk hozzá. A reakciókeverékbe egy gáz diszperziós csövön keresztül 5 percen át nitrogént, majd 6 órán át hidrogéngázt buborékoltatunk. A reakciókeveréket ezután nitrogéngázzal átmossuk, és a palládium katalizátort szűréssel eltávolítjuk. A keveréket vákuumban szirup sűrűségűre bekoncentráljuk. A szirupot kloroformban feloldjuk, és az oldatot 40 cmX3 cm nagyságú Grace és Davison Grade 62 szilikagél kromatográfiás oszlopon abszorbeáljuk. A terméket egy lépésenként csökkenő mennyiségű kloroformot tartalmazó eleggyel eluáljuk, melynek végső összetétele 10 % metilalkohol kloroformban, és az egyesített frakcióknak vékonyrétegkromatográfiás vizsgálata alapján izoláljuk.

[a]g =-34,8° (c = 0,5, MeOH).

A C3JL3N5O7 képlet alapján (Ms = 597.7) az analízis számított értékei: C 62.29. H 7.25. Ν 11,72 %, talált értékei: C 62,13, H 7,24, Ν 11,70 %.

D. L-tirozil-D-alanil-glicil-ÍN^-n-propilj-L-fenilalanilamid-acetátsó

800 mg (1,34 mmól) C részben leírt terméket 0,5 ml anizolt tartalmazó 10 ml trifluoreeetsavban feloldunk. A keveréket 30 percig 0 °C-on keveqük, majd a reakciókeveréket liofilizáljuk. A szilárd anyagot megfelelő puffer oldatban (1 % piridin és 0,05 % ecetsav) feloldjuk úgy, hogy a térfogat 10 ml legyen, és ezt az oldatot egy előzőleg ugyanezzel a pufferral kezelt, 2,5 cmX99 cm nagyságú DEAE-Sephadex A-25 (acetát) oszlopra felvisszük. Az eluátum összetételét 280 nm hullámhossznál vizsgáljuk, az alkalmas frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. lm ecetsavból való ismételt liofilizálás után 655 mg kívánt terméket kapunk.

[α] θ = -11,0° (c = 0,5, In HCl)

A C₂₈H₃₉NsO7 képlet alapján (Ms = 557,6) az analízis számított értékei: C 60.31. H 7,05. N 12.56 %, talált értékei: C 60,23, H 6,98, N 12,49 %.

Az aminosav analízis talált értékei: Tyr: 0.99. Alá: 1,00, Gly: 1,01, NH_S :0,96.

4. példa

L - tirozü - D - alanil - glicil - (N“ - etil) - L - fenilalanilamid-acetátsó előállítása

A. N“-butiloxikarbonil-(N^a-etil)-L-fenilalanin ml tetrahidrofuránhoz 10,6 g (0,04 mól) N<*-butiloxikarbonil-L-fenilalanint adunk. Az így nyert keveréket 30 perc alatt, cseppenként egy mechanikusan kevert szuszpenzióhoz adjuk, mely szuszpenzió 0,12 mól káliumhidrid 220 ml tetrahidrofuránban' és 0,5 g 18korona-6-éter. 0 °C-on, nitrogén atmoszférában. A keveréket 0 °C hőmérsékleten további 10 percig keveqük.

Í82 866 majd 40 ml tetrahidrofuránban oldott 19,4 ml (0.24 mól) etiljodidot 20 perc alatt cseppenként hozzáadunk. Ezután a keveréket 0 °C-on 4 órán át állni hagyjuk. A keverékhez még 19.4 ml (0,24 mól) etiljodidot adunk két egyenlő részletben. A keveréket 2 órán át 0°C-on keveqük, majd 10 ml jégecetet adunk hozzá. 10 perc keverés után a keveréket 400 ml összetört jégbe öntjük. Az így nyert vizes fázis pH-ját 2n nátriumhidroxidoldattal 8,0-ra beállítjuk, éterrel kétszer extraháljuk, és ezután a vizes keveréket hideg 2n sósav hozzáadásával megsavanyítjuk úgy, hogy a pH 2,5 legyen. A vizes keveréket ezt követően etilacetáttal extraháljuk, az extraktumot vízzel mossuk, vízmentes magnéziumszulfát felett szárítjuk, majd vákuumban az oldószert elpárologtatjuk. A visszamaradó szirupot 200 ml éterben feloldjuk, és 8 ml (0,04 mól) DCHA-t adunk hozzá. A keletkezett csapadékot kiszűqük, és a szűrletet l,5n citromsavoldattal és vízzel extraháljuk. Az éteres fázist vízmentes magnéziumszulfát felett szárítjuk, vákuumban az oldószert elpárologtatjuk, és ily módon 4,6 g (az elméleti érték 39 %-a) kívánt terméket kapunk.

O

NMR δ (fenil) = 7,2; 6(Me₃CO<í -) = 1,4.

B. N^a-terc-butiloxikarbonil-(N“-etil)-L-fenilalanilaniid ml Ν,Ν-dimetilformamidban (DMF) 4,3 g (0,0146 mól) az A részben leírtak szerint előállított N“-tercbutiloxikarbonil-N“-etil-L-fenilalanint feloldunk. A keveréket 0 °C-ra lehűtjük, és 3,0 g (0,0146 mól) N,N-diciklohexilkarbodiimidet adunk hozzá. A reakciókeveréket 2 órán át 0 °C hőmérsékleten, majd 72 órán át szobahőmérsékleten keveijük. A keveréket ezután 0 °Cra lehűtjük, ezután szűqük, a szűrletet vákuumban bekoncentráljuk, és a visszamaradó olajat etilacetátban feloldjuk. Az oldatot In nátríumhidrogénkarbonát-oldattal, azután vízzel, hideg 1,5 n citromsav-oldattal és újból vízzel extraháljuk. A szerves fázist vízmentes magnéziumszulfát felett szárítjuk, majd bekoncentráljuk, és ily módon 3,93 g (az elméleti érték 91 %-a) kívánt terméket nyerünk.

I«j²d⁵ = -101,51° (c = l,MeOH).

A C₁₆H„Nj O₃ képlet alapján (Ms = 292,4) az analízis számított értékei: C 65,73, H 8,27, N 9,58 %, talált értékei: C 66,03, H 8,13, N 9,85 %.

C. (N“-etil)-L-fenilalanilamid-hidrokloridsó

3,5 g (11,95 mmól) B részben leírtak szerint előállított N^a-terc-butiloxikarbonil-(N^0í-etil)-L-fenilalanilamidot feloldunk 40 ml frissen előállított jégecetben, mely vízmentes hidrogénkloridot (In), 1,5 ml anizolt és 1,5 ml (C₂H_s)SiH-et tartalmaz. Az így nyert keveréket szobahőmérsékleten 30 percig keveqük. A keveréket ezután éterbe öntjük, a keletkezett csapadékot egyesítjük, szárítjuk, és ily módon 2,6 g (az elméleti 96 %-a) kívánt terméket kapunk, melynek olvadáspontja 276- 277 °C.

A C_nH₁₆N₂OCl képlet alapján (Ms =227,7) az analízis számított értékei: C 58,02, H 7,08, N 12,30 %, talált értékei: C 57,97, H 7,26, N 12,54 %.

D. N“-terc-butiloxikarbonil-L-tirozil-L-alaniI-glicil(N“-etil)-L-fenilalanilamid ml DMF-hoz 1,14 g (0,005 mól) C rész szerint előállított (N^Q-etil)-L-fenilalanilamid-hidrokloridsót adunk. A keveréket 0°C-ra lehűtjük, majd 2,95 g (0,005 mól) N“ - tere - butiloxikarbonil - L - tirozil - D - alanil - glicinDCHA-sót adunk hozzá, és 0 °C-on 5 percig keveqük. A keverékhez ezután 675 mg (0,005 mól) HBT-t és 10

1,03 g (0,005 mól) DCC-et adunk, majd 0 °C hőmérsékleten 6,5 órán át és ezután szobahőmérsékleten 20 órán át keveqük. Ezt a keveréket 0 °C-ra lehűtjük és szűqük. A szűrletet vákuumban bekoncentráljuk, a visszamaradó olajat etilacetátban feloldjuk, és In nátriumhidrogénkarbonát-oldattal. vízzel, hideg l,5n citromsav-oldattal és újból vízzel extraháljuk. A szerves fázist vízmentes magnéziumszulfát felett szárítjuk, és vákuumban bekoncentráljuk. Az így nyert olajat egy 40 cmX3 cm nagyságú Grace és Davison Grade 62 szilikagél oszlopon, kloroformban abszorbeáljuk. A terméket egy lépésenként csökkenő mennyiségű kloroformot tartalmazó keverékkel eluáljuk, mely keverék végső összetétele 15 % metanol kloroformban. Az egyesített frakciókból vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat alapján 1,13 g (az elméleti 39 %-a) kívánt terméket kapunk.

[«]p =-21,0° (c = 0,5, MeOH)

A C₃₀H₄₁NsO₇ képlet alapján (Ms = 583.7) az analízis számított értékei: C 61.73,H 7.08, N 12.00 %. talált értékei: C 60,35, H 7,26, Ν 11,25 %.

E. L-tirozil-D-alanil-glicil-(N“-etil)-L-fenilalanil-amidacetát só g (1,71 mmól) D részben leírt terméket feloldunk 20 ml trifluorecetsavban, amely 3 ml anizolt és 3 ml (C₂H₅)SiH-et tartalmaz. A keveréket 0 °C-on 30 percig keveqük, majd éterbe öntjük, a keletkező csapadékot egyesítjük és szárítjuk (660 mg). A szilárd anyagot megfelelő puffer oldatban (1 % piridin és 0,05 % ecetsav) feloldjuk úgy, hogy a térfogat 10 ml legyen, és ezt az oldatot 2,5 cmX90 cm nagyságú, előzőleg ugyanezzel a puffénál kezelt DEAE-Sephadex A-25 (acetát) oszlopra felvisszük. Az eluátum összetételét 280 nm-nél vizsgáljuk, az alkalmas frakciókat egyesítjük, majd liofilizáljuk. A szilárd anyagot 10 ml 0,2m ecetsavban feloldjuk, és az oldatot egy 2,5 cmX99 cm nagyságú, előzőleg ugyanezzel az oldószerrel kezelt G-10 Sephadex oszlopon kromatografáljuk. Az eluátum összetételét 280 nm-nél vizsgáljuk, a megfelelő frakciókat egyesítjük, ezután liofilizáljuk, és ily módon 448 mg (az elméleti 48 %-a) kívánt terméket kapunk.

[aj²D⁵ = -10,6° (c = 0,5, IN HCI).

A C₂₇H₃₇N₅O₇ képlet alapján (Ms = 543,6) az analízis számított értékei: C 59.65. H 6,86, N 12.88 %, talált értékei: C 59,4l' H 1,26, N 13’ 18 %.

Az aminosav analízis talált értékei:

Tyr: 1,03, Alá: 0,99, Gly: 0,97, NH₃: 0,98.

Az I általános képletű vegyületek hasznos fájdalomcsillapító aktivitással rendelkeznek, mely aktivitást egerekkel végzett forró lémez kísérleteink bizonyítják. A teszt folyamán az egeret egy függőleges akril hengerbe helyeztük, melyben egy forró felületű lemez volt, és ezt a lemezt 52 °C hőmérsékleten tartottuk. A kísérleti egérnek egy bőr alá (szubkután) adott injekció formájában alkalmas hordozóban feloldott vagy szuszpendált, előre meghatározott mennyiségű teszt vegyületet adtunk. Egy előre meghatározott, a kezelés számára megfelelő idő elteltével az egeret a forró felületű lemezre helyeztük. A latens állapot idejét, amely eltelt, addig, amíg az alábbi két tünetet észleltük, másodpercekben kifejezve jegyeztük fel. Először mértük azt az időt, vagyis azt a latens állapotot, amíg az egér a hátsó lábát megnyalta, és másodszor azt az időt, amíg az egér a forró felületről felugrott. Egy fájdalomcsillapító szer hatására

-101

182 866

-ea. a latens állapot hosszabb lesz viszonyítva olyan.kont*γοΠ egerék reakcióihoz, melyek ősák a hordozót kapták ’meg‘ injekció formájában. Ezt az injekciót az állatoknak olyan adagokban adtuk, melyeknél 'semmiféle mozgási rendezetlenséget vagy akadályoztatást nem tapasztaltunk. A következő táblázatokban a vizsgálatnál nyert eredményeket tüntettük fel. összehasonlítva ezeket Sconyhasós Iktezetéet tkapott kontroll Sáliatok vizsgálataiAiál nyert teredménytekkel. Az 1. táblázatban a hátsó láb megnyalásáig eltelt latens állapot idejét, a II. táblázatban pedig az ugrással történő nfenekülésig eltelt latens állapot idejét tűntettük fel. Egy tényleges fájdalomcsillapító hatás kritériumai a következők: a kezelt állatoknál a hátsó láb megnyalásáig eltelt időnek, vagy az ugrással történő menekülésig eltelt időnek azonosnak vagy nagyobbnak kell lennie, mint az átlagos kontroll érték plusz az átlagérték standard eltérésének kétszerese. -Az 4. és 5L táblázatban feltüntetett értékek jelentése a következő: az átlagérték plusz vagy mínusz a standard eltérés. ' »

I./táblázat

Fájdalomcsillapító aktivitás

A hátsó láb megnyalásáig (latens állapot) eltelt idő (másodperc)

iVegyöleth	.Kezeléstől ja kísérletig 4-el telt idő á (perc)	r Adagolás i
	Kontroll	0,3	1' 3	10	30
A	15	26,641,7		33,2±2.2³		114,4424,4’	_
	45	34,4+34	-	33,3422 48,1+7j6³	T i	-	—
	as	•33,4422	-	— —	I j j	101.7415,9¹	—
	©O	132,0+2,7	—	—		71,247,1¹	—
	60	28.240.9	—	— —		46,246,3’	—
	90	282+0,9	—			32,0+3,5	—
	15	-26’,9+3,1	29.4+2.7	— _		—
	45	25,041.9	-34,041,5*	— —		—	—
	120	28,041,7	-	- -	_r	30,2429	-
B	15	29,241.7	—	35.742,3³		63,,4412,6³	—
	15	31,4+4,7	—	34,842.5 χ 40,542,7’		—	—
	30	29.846,9	—	— —		59,4410,0³	—
	60	29.846,9	—	— _		43.4+6.1	—
	T5	^25,011,9	31,9+1,9³	— _	*	—	—
	60	30.0+26	—	— _		37.043,8	—
	90	-3OO±2.ó	—		4	30,143.9	—
	120	232±K4	—	_ —	*	29,643.6	—
	120	2&,0±1.7	—	_ —		25.841.6	—
C	*15	-26.4+1.8	329+2,3³	32;4+2.4³			—
	15	26.141,7	—	35,2+2.7’		58.145.1*	—
D	15	. 30242,7	32,042,7	42,2439³		—	—
	15	25,7+1.1	—	54.2+7,2’		240,040’	—

Lábjegyzet 50

a) Az indexben levő „1”, „2” és „3” számok Jeteik, hogy az eredmény sorrendben a p< 0,001, p<0,01, illetve p < 0,05 értékhez tartozik. 55

b) Az A, B, C és D jelek a következő vegyületeket jelentik:

A) L-tirozil-D-alanil-glicil-(N“-metil)-L-fenilalanilamid-acetátsó,

B) L-tirozil-D-alanil-glicil-L-(a-metil)-fenilalanilamidacetátsó,

C) L-tirozil-D-alanil-glicil-(N“-n-propil)-L-fenilalanilamid-acetátsó,

D) L-tirozil-D-alanil-glicil-(N^a-etil)-L-fenilalanilamidacetátsó.

-111

182 866

II. táblázat

Fájdalomcsillapító aktivitás

A felugrással történő menekülésig (latens állapot) eltelt idő (másodperc)

Vegyület·⁵	Kezeléstől a kísérletig eltelt idő (perc)			Adagolás mg/kg^a
		Kontroll	0,3	1	3	10	30
A	15	.48.4+4,7	__		133.1+14,8*	222,2+9,1¹
	15	62.H9.1	—	126.5+5.7*	140,4+i^O¹	—	—
	15	80,2+7,4	-	—	—	237.3+2,7*	—
	30	60,2+6,1	—	—	—	189.2112.8'
	60	80,518.8	-	—	—	105,0+14.2	—
	90	80,5+8,8	—		—	110,2+9,8³
	15	73,716,9	126,2+14,7²	—
	Γ5	63,7+9,1	107,0+8,1	—	—	—
	120	69,8+4,2	—	—	— .	104.7+7,0*
B	15	43,8+5,5	—	—	152.4+17,5¹	226,2+7,7*	—
	15	62.9+10,3	-	112,2+21,2³	144.3+Í3.2¹		—
	30	73,8+14,6	—	—		218.3116.4'
	60	73,8+14,6	-	—		89,4116.7
	15	63,7+9.1	130,7+15.8*	—	—
	60	59.2±5.8	—	—		84.3+13.2³
	90	59,2±5.8	-	—		89,4+7.5²	—
	120	79.4+5,7	—	—	—	104,1+5,8²
	120	69.8+4.2	—	—	—	126,4+11,7*
C	15	62,7+7.5	118,9+15.5²	120,6+14,2¹	—
	15	75,6+5,7	-	-	155,0+17,9¹	—	—
						237,6+2,4*	—
D	15	63,8+7.7	121,2+15,7²	185.1+15.01*		—
	15	79,1+7,7	-	-	218,4+16,2¹	—	—
						240,010*	-

Lábjegyzet

a) Az indexben levő „1”, „2” és „3” számok jelzik, hogy az eredmény sorrendben a p< 0,001, p<0,01, illetve p < 0,05 értékhez tartozik.

b) Az A, B, C és D jelek a következő vegyületeket jelentik:

A) L-tirozil-D-alanil-glicil-(N“ -metil)-L-fenilalanilamid-acetátsó,

B) L-tirozil-D-alanil-glicil-L-(a-metil)-fenilalanilamidacetátsó,

C) L-tirozil-D-alanil-glicil-(N“-n-propil)-L-fenilalanilamid-acetátsó,

D) L-tirozil-D-alanil-glicil-(N^a-etil)-L-fenilalanilamidacetátsó.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás az 1 általános képletű tetrapeptid-származékok és ezek gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sóinak előállítására, ahol L és D, ha alkalmazható a kiralitást (konfigurációt) határozza meg. mely általános képletben R⁴ és R^s közül az egyik jelentése hidrogénatom és a másiké ] - 3 szénatomos primer alkilcsoport, azzal jellemezve, hogy a peptidkémiában szokásos módon védett I általános képletű tetrapeptid-származékról a védőcsoportokat savval, előnyösen trifluorecetsavval vagy jégecet-sósav eleggyel kezelve lehasítjuk, és kívánt esetben egy keletkezett savaddíciós sót szabad bázissá alakítunk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja olyan I általános képletű tetrapeptid-származékok előállítására, ahol R⁴ jelentése valamely 1-3 szénatomos primer alkilcsoport és az 1. igénypontban megadott, gazzal jellemezve, hogy olyan védett I általános képletű tetrapeptid-származékokból indulunk ki, ahol R⁴ a fenti és az 1. igénypontban megadott.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja olyan I általános képletű tetrapeptid-származékok gQ előállítására, ahol R⁵ jelentése valamely 1 3 szénatomos primer alkilcsoport és R⁴ az 1. igénypontban megadott, azzal jellemezve, hogy olyan védett I általános képletű tetrapeptid-származékokból indulunk ki. ahol R⁵ a fent és az 1. igénypontban megadott.

ββ
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási

-121

182 866 módja az L-tirozii-D-alanil-glicil-(N^a-metil)-L-fenilalanilamid-acetátsó előállítására, azzal jellemezve, hogy az Nőiére - butiloxikarbonil - L - tirozil - D - álanil - glicil - (N“metil)-L-fenilalanilamidot trifluorecetsáwal reagáltatjuk, majd pedig ecetsavból liofilizáljuk. ₅
5, Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja az L-tirozil-D-alanil-glicil-L-(á-metil-fenilalanilamid-acetátsó előállítására, azzal jellemezve, hogy az 'Ne - tetc - butiloxikarbonil - L - tirozil -J) - alanil - glicilL-(a-metil-fenilalanil-amidot hidrogén-klöriddal jégecet- -,θ ben reagáltatjuk, majd pedig ecetsavból liofilizáljuk.
6., Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja az L-tirozil-D-aIanil-glicil-(N^a-n-propil)-L-fenil-alanilamidot hidrokloriddal jégecetben reagáltatjuk, majd pedig ecetsavból liofilizáljuk.
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja az L-tirozil-D-alanil-glicil-(N^a-etil)-L-fenilalanilamidacetátsó előállítására, azzal jejlemezve, hogy az N“terc - butiloxikarbonil - L - tirozil - D - alaril - glicil(N“-etil)-L-fenilalanilamidot tjifluorecetsavval reagáltatjuk, majd pedig ecetsavból liofilizáljuk.