KR840001668B1

KR840001668B1 - 펩티드의 제조방법

Info

Publication number: KR840001668B1
Application number: KR1019800004795A
Authority: KR
Inventors: 데오도르 슈만 로버트
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니; 아더 알. 웨일
Priority date: 1979-12-17
Filing date: 1980-12-16
Publication date: 1984-10-13
Also published as: EP0030847B1; EP0030847A2; CH646415A5; FR2471971A1; GB2065135B; FR2471971B1; IT8026673A0; US4283330A; CA1140540A; EP0030847A3; KR830004219A; IL61700A; IT1141136B; JPS5697255A; BE886678A; IE802643L; GB2065135A; AR226578A1; IE50981B1; HU185229B

Abstract

내용 없음.

Description

펩티드의 제조방법

본 발명은 진통작용을 나타내는 신규 화합물의 제조방법에 관한 것이다.

최근에 포유동물의 뇌 또는 수액으로부터 모르핀과 유사한 성질을 갖는 내생(內生)물질을 추출하게 되었다. 엔케팔린(enkephalin)으로 명명된 이 물질은 Hughes등에 의해 다음의 아미노산 서열을 갖는 펜타펩티드로 확인되었다(Nature, 258,577(1975))

H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH

H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH

이들 화합물은 각각 메티오닌-엔케팔린 및 로이신-엔케팔린이라고 한다.

메티오닌 및 로이신 엔케팔린을 쥐에 뇌실내 투여할 때 준통활성이 나타나는 것이 밝혀졌지만[Buscher 등 Nature 261, 423(1976)], 비경구투여에 의해서는 진통활성을 나타내지 못한다.

따라서 엔케팔린이 발견된 이후, 활성이 강화되고 비경구 또는 경구 투여에 의해서도 생물학적활성을 나타내는 엔케팔린 동족체 화합물을 찾으려는 많은 시도가 있어왔다.

Dutta 등은, 그들이 제안한 구조 변형이 효능을 강화시킨다고 보고하고 있다(Life Science 21,559-562페이지(1977)). 그들에 의하면 다음과 같은 변형중 어느하나 또는 모두에 의해 활성을 강화시킬 수 있다.

(a) 2위치 Gly의 D-또는 α-아자-아미노산에 의한 치환,

(b) 말단 카복실의 메틸 에스테르 또는 아미드로의 전환,

(c) 4위치 Phe의 α-아자치환, N-메틸화 또는 방향족환의 수소화에 의한 변형.

이밖에도 Roemer 등은, Met⁵의 상응하는 카비놀로의 변형 및 메티오닌의 황의 설폭사이드로의 산화변형을 유용한 변형으로 제안하고 있다(Nature 268,547-549페이지(1977)).

또 다른 중요한 구조적 변형은 벨기에 특허 제859,026에 보고된 것이다. 여기에 의하면 2위치에 D-아미노산 잔기를 삽입하고, 말단카복실을 아미드로 전환시키고, 5위치 아미노산 잔기를 N-알킬화하므로써 엔케팔린의 활성 및 생물학적 효율이 증진된다.

진통작용이 우수한 엔케팔린 동족체는 본 발명에 이르러 비로서 발명되었다. 본 발명화합물은 펩티드의 4위치에 그의 질소가 시클로프로필메틸 또는 알릴로 치환된 L-페닐알라닌잔기가 존재하는 펩티드이다.

본 발명은 다음 일반식(Ⅱ)의 화합물을 적절한 차단제거제와 반응시킴을 특징으로 하여 다음 일반식(Ⅰ)의 화합물 및 그의 약학적으로 무독한 산부가염을 제조하는 방법에 관한 것이다.

상기식에서 L 및 D는 부재성을 나타내며, R₁은 수소 또는 C₁-C₃1급알킬이고, R₂는 C₁-C₄1급 또는 2급알킬, 알릴, 시클로프로필메틸, C₁-C₂하이드록시알킬 또는 -(CH₂)_m-u-CH₃인데 u는 -S-또는 -S-O이고 m은 1 또는 2이며, R₃는 시클로프로필메틸 또는 알릴이고,

Z는 -CH₂OR₄

또는

인데,

R₄는 수소, 아세틸 또는 아세톡시메틸이고,

R₅는 C₁-C₃알킬이며,

R₆는 수소, C₁-C₃1급알킬 또는 아미노차단기이고,

R₇는 상기한 바와같은 R₂또는 C₁-C₂하이드록시 알킬부위의 하이드록시-보호그룹이며,

R₈은 수소 또는 하이드록시-보호그룹이고,

Z'는 상기한 바와같은 Z 또는 잔기 지지체를 포함한 Z의 전구체이며, 단 R₆,R₇,R₈또는 Z' 중 하나이상은 차단기를 나타내야 한다.

약학적으로 무독한 산부가염에는 유기 및 무기 산부가염이 포함되는데, 예를 들면 염산, 황산, 설폰산, 타타르산, 푸마르산, 브롬화수소산, 글리콜산, 시트르산, 말레산, 인산, 숙신산, 아세트산, 질산, 벤조산, 아스코르빈산, p-톨루엔설폰산, 벤젠설폰산, 나프탈렌설폰산, 프로피온산 등과 같은 산으로부터 제조한 염을 들 수 잇다. 염산, 아세트산 또는 숙신산으로부터 제조한 염이 바람직하다. 상기한 염은 통상적 방법에 의해 제조한다.

상기 일반식에서 치환기들의 정의로부터 알 수 있듯이, 일반식(Ⅰ)화합물은 테트라펩티드이며 그의 C-말단 부위는 1급알콜 또는 그의 에스테르 유도체, 1급 아미드 또는 저급알킬 에스테르이다.

일반식(Ⅰ)화합물의 입체배위는 중요한 특징이다. 편의상, 일반식(Ⅰ)의 테트라펩티드의 아미노산잔기는 말단 아미노기 잔기부터 번호를 붙인다. 1부터 4까지의 아미노산 잔기의 부재성은 각각 L,D, 비부재성 및 L형이다. 3위치의 잔기는 글리신 부위인데 부재성을 나타내지 않는다.

R₁그룹은 C₁-C₃1급알킬을 포함한다. C₁-C₃1급알킬은 메틸, 에틸 및 n-프로필을 의미한다.

R₅그룹은 C₁-C₃알킬을 포함한다. C₁-C₃알킬은 메틸, 에틸 n-프로필 및 이소프로필을 의미한다.

상기 일반식의 R₂그룹은 C₁-C₄1급 또는 2급미킬을 포함한다. 이는 메틸, 에틸 n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸 및 2급 부틸을 나타낸다.

R₂그룹은 또한 C₁-C₂하이드록시 알킬로 정의되기도 한다. C₁-C₂하이드록시 알킬은 하이드록시메틸, 1-하이드록시에틸 및 2-하이드록시에틸을 의미한다.

일반식(Ⅰ)의 R₂그룹의 정의에는 -(CH₂)_m-u-CH₃그룹도 포함되는데, u는 -S-또는 >S-O-이고, m은 1 또는 2이다. -(CH₂)_m-u-CH₃는 메틸티오메틸, 메틸티오에틸, 메틸설피닐메틸 및 메틸설피닐에틸을 의미한다.

일반식(Ⅰ)의 테트라펩티드의 특정위치의 잔기에 관해 상세한 내용은 다음과 같다.

(A) 1위치

이 위치는 펩티드의 아미노-말단부위이며 L-티로신에서 유래된 잔기이다. 잔기의 N은 치환되지 않을 수도 있는데, R₁이 수소인 경우이다. 또한 N은 C₁-C₃1급알킬로 치환되어 N-메틸, N-에틸 또는 N-n-프로필을 생성할 수 있다. 1위치에 존재하는 티로실 잔기가 바람직하게 N-비치환 상태인 화합물은 비경구투여시, 진통작용이 탁월하다. 1위치의 티로실 잔기가 바람직하게 N-치환된 화합물은 경구투여시 진통작용이 우수하다. 이 경우 N-치환기는 메틸이 바람직하다.

(B) 2위치

일반식(Ⅰ)의 펩티드의 두번째 위치에 존재하는 아미노산 잔기는 D입체 이성체여야 하며, 몇가지 아미노산 잔기중 어느것이라도 무방하다. 여기에는 D-알라닌(Ala) (R₂는 메틸), D-α-아미노부티르산(Abu)(R₂는 에틸), D-노르발린(Nva) (R₂는 n-프로필), D-발린(Val) (R₂는 이소-프로필), D-노르로이신(Nle) (R₂는 n-부틸), D-로이신(Leu) (R₂는 이소부틸), D-이소로이신(Ile) (R₂는2급-부틸), D-알릴글리신[Gly(Al)] (R₂는 알릴), D-시클로프로필 메틸글리신 [Gly(CP)] (R₂는 시클로프로필 메틸), D-메티오닌(Met) (R₂는2-메틸티오메틸), D-(S-메틸)시스테인 [Cys(Me)] (R₂는 메틸티오 메틸), D-메티오닌 설폭사이드 [Met(O)] (R₂는 메틸설피닐에틸), D-(S-메틸)시스테인 설폭사이드[Cys(Me)(O)] (R₂는 메틸설피닐메틸), D-세린(Ser)(R₂는 하이드록시메틸), D-트레오닌(Hse)(R₂는 1-하이드록시에틸) 및 D-호모세린(Hse)(R₂는 2-하이드록시에틸)로부터 유래된 잔기가 포함된다. 바람직하게 R₂는 C₁-C₄1급 또는 2급 알킬 또는 C₁-C₂하이드록시알킬이다. 두 그룹중 C₁-C₄1급 또는 2급 알킬이 더 바람직하며 이중에서도 D-알라닌에서 유리된 잔기가 특히 바람직하다.

(C) 3위치

이 위치에 존재하는 아미노산 잔기는 글리신(Gly)으로부터 유래된다.

(D) 4위치

이 위치에 존재하는 아미노산 잔기는 L-페닐알라닌(Phe)으로부터 유래된다. 잔기의 아미노 질소(R₃)는 시클로프로필메틸 또는 알릴로 치환된다.

일반식(Ⅰ) 화합물의 C-말단위치에 존재하는 아미노산 잔기는, 그의 아미드(Z-CNH₂), 1급 알콜 또는 에스테르 유도체(Z는 -CH₂OR₄) 또는 C₁-C₃알킬에스테르(Z는

)유도체 형태이다. 1급 아미드 유도체, 알콜 또는 에스테르 유도체가 바람직하며, 특히 1급 아미드가 바람직하다.

본 명세서에서 이 분야에서 통상 사용되며 공지된 다음 약어를 사용한다.

Abu-α-아미노부티르산 Ile-이소로이신

Ala-알라닌 Leu-로이신

Cys-시스테인 Met-메티오닌

Cys(Me)-(S-메틸)시스테인 Met(O)-메티오닌 설폭사이드

Cys(Me)-(O)-(S-메틸)시스테인 Nle-노르로이신

설폭사이드 Nva-노르발린

Gly-글리신 Phe-페닐알라닌

Gly(Al)-알릴글리신 Ser-세린

Gly(Cp)-시클로프로필메틸글리신 Thr-트레오닌

Hse-호모세린 Tyr-티로신

Val-발린 S-Bu-2급-부틸

Ac-아세틸 Boc-t-부틸옥시카보닐

AcOMe-아세톡시메틸 Bzl-벤질

Al-알릴 Cbz-벤질옥시카보닐

Cp-시클로프로필메틸 DCC-N,N'-디시클로헥실카보디이미드

Me-메틸 HBT-1-히드록시벤조트리아졸

Et-에틸 DMF-N,N'-디메틸포름아미드

Ip-이소프로필 TFA-트리플루오로아세트산

Pr-n-프로필 THF-테트라하이드로푸란

Bu-n-부틸 DEAE-디에틸아미노에틸

i-Bu-이소부틸 IBCF-이소부틸클로로포르메이트

t-Bu-t-부틸 18-크라운-6-1,4,7,10,13,16-

헥사옥사시클로옥타데칸

일반식(Ⅰ) 화합물의 대표적예는 다음과 같으며, 이들은 약학적으로 산부 가염으로 존재할 수 있다.

일반식(Ⅰ)화합물은 펩티드 합성의 공지된 방법에 의해 제조한다. 일반식(Ⅰ)화합물의 합성 도중에, 부분적인 라세미화가 일어날 수 있다. 그러나 라세미화가 일어나더라도 일반식(Ⅰ)화합물의 진통작용을 현저하게 변화시킬 정도는 아니다.

일반식(Ⅰ)화합물은 고상(Solid phase) 펩티드 합성법 또는 전통적인 액상합성법에 의해 합성할 수 있다. 고상법에서는 벤즈히드릴 아민수지 또는 클로로메틸화 폴리스티렌 수지와 같은 수지 지지체를 사용하며 펩티소쇄를 연쇄적으로 생성한다. 생성물을 약 0℃에서 HF를 사용하여 수지로부터 분리해내어 크로마토 그라프를 실시하여 정제한다.

어느 방법을 사용하거나, 일반식(Ⅰ)화합물의 제조에는 한 아미노산의 카복실기와 다른 아미노산의 아미노기의 반응에 의해 아미드 결합을 생성하는 아미노산 또는 펩티드 프래그먼트의 커플링을 포함한다. 커플링이 효과적으로 이루어지려면, 우선 반응에 직접 참여하지 않는 모든 방응성 관능기를 적절한 차단기로 불활성화하고 이어서 커플링시키려는 카복실기를 적절하게 활성화시킨다. 여기에서는 반응순서 및 반응조건의 주의깊은 선택뿐 아니라 목적 펩티드 생성물을 수득하기 위한 차단기의 선택적사용이 중요하다. 일반식(Ⅰ)화합물의 제조에 사용되며, 특별히 선택된 보호그룹 및/또는 활성화 관능기를 갖는 아미노산은 펩티드분야에 공지된 방법에 의해 제조한다.

일반식(Ⅰ)화합물의 전합성의 각 단계는 차단기의 선택적 배합에 의한다. 이러한 특정한 배합이 이루어져야 반응이 가장 순조롭게 진행된다. 그외의 배합으로도 일반식(Ⅰ)화합물의 합성이 가능하지만, 만족스럽지 못하다. 일반식(Ⅰ)화합물 합성에서 아미노 차단기로 벤질옥시카보닐, t-부틸옥시카보닐, t-아밀옥시카보닐, p-메톡시벤질옥시카보닐, 아다만틸옥시카보닐 및 이소보닐옥시카보닐을 사용할 수 있다. 또한 p-니트로벤질(PNB), p-메톡시벤질(PMB)들도 사용할 수 있으나 벤질(Bzl)을 일반적으로 티토실 잔기의 하이드록시-보호기로 사용한다.

일반식(Ⅰ)화합물의 제조에 사용하는 카복실차단기는 메틸, 에틸, 벤질, p-니트로벤질, p-메톡시벤질, 2,2,2-트리클로로에틸 등을 포함한 전형적인 에스테르-형성그룹의 어느 것이라도 무방하다.

일반식(Ⅰ)화합물의 제조에서, 적절하게 보호된 N-차단아미노산 또는 펩티드 프래그먼트와 적절하게 보호된 카복시-차단 아미노산 또는 펩티드 프래그먼트의 커플링반응을 위해 아미노산 또는 펩티드 프래그먼트의 유리 카복실기를 커플링 반응에 대해 활성화시킨다. 이를 위해서는 공지된 몇가지 방법중 어느방법이라도 사용할 수 있다. 그 중 한가지는 카복실기를 혼합무수물로 전환시키는 것을 포함한다. 유리카복실기는 카본산염화물같은 카본산 유도체 등과의 반응으로 활성화된다. 혼합 무수물을 생성하는데 사용되는 산염화물의 예로는, 에틸클로로포르메이트, 페닐클로로포르메이트, 2급-부틸 클로로포르메이트, 이소부틸클로로포르메이트, 피발로일클로라이드 등이 있다. 바람직하게는 이소부틸 클로로포르메이트를 사용한다.

커플링 반응을 수행하기 위한 또 다른 카복실기 활성화 방법은, 그의 활성 에스테르 유도체로 전환시키는 것이다. 그런 활성 에스테르에는 2,4,5-트리클로로페닐 에스테르, 펜타클로로페닐 에스테르, p-니트로페닐 에스테르 등이 포함된다. 사용할 수 있는 또 다른 커플링 방법은 공지된 아지드 커플링법이다.

일반식(Ⅰ)화합물의 제조에서 바람직한 커플링법은 N,N'-디시클로헥실카보디이미드(DCC)를 사용하여 유리카복실기를 활성화시키고, 그에 의해 커플링반응을 진행시키는 것이다. 이러한 활성화 및 커플링법은 아미노산 또는 펩티드 프래그먼트에 대해 동몰량의 DCC를 사용하여 동몰량의 1-하이드록시벤조트리아졸(HBT)의 존재하에 이루어진다. HBT는 라세미화의 가능성을 포함한 원치않는 부반응을 억제한다.

일반식(Ⅰ)화합물의 합성 연쇄과정중 특정한 단계에서는 차단기의 선택적 제거가 필요하다. 펩티드 합성분야의 전문가라하며, 아미노산 또는 펩티드 프래그먼트상에 존재하는 보호그룹을 하나이상(그러나 전부인 경우는 제외) 제거하므로써 생성물의 선택적 분리가 이루어질 수 있는 점을 고려하여, 대표적인 보호그룹중에서 사용할 수 있는 적절한 그룹을 쉽게 선택할 수 있다. 이러한 방법은 펩티드 분야에 공지되어 있다. 선택적 제거에 사용할 수 있는 방법의 더 상세한 것은, The Peptides I권(Schroder and Lubke Academic Press, New York (1965)) 특히 그 중에서 72 내지 75페이지의 표에 기술되어 있다.

카복실 보호그룹은 알칼리성 비누화에 의해 제거할 수 있다. 수산화나트륨, 수산화칼륨 수산화리튬 등 같은 알칼리금속 수산화물을 사용한 비교적 강알칼리성 조건하에 보호된 카복실기를 탈에스테르화한다. 비누화의 반응조건은 이 분야에 공지되어 있다. 많은 카복실차단기는 탄소상 팔라듐같은 촉매존재하의 수소첨가 분해를 포함한 촉매적 수소첨가 분해에 의해서도 제거할 수 있다. 또한 카복실 차단기가 p-니트로벤질 또는 2,2,2-트리클로로에틸인 경우, 아연 및 염산 존재하에 환원시켜 제거할 수 있다.

많은 아미노차단기는, 보호된 아미노산 또는 펩티드를 포름산, 트리플루오로아세트산(TFA), p-톨루엔설폰산(TSA), 벤젠설폰산(BSA), 나프탈렌설폰산 등과 같은 산으로 처리하여 각각의 산부가염을 생성시켜 제거한다. 예를 들어 벤질옥시키보닐은 차단된 아미노산 또는 펩티드를 HBr 및 아세트산 혼합물로 처리하여 상응하는 하이드로브로마이드 산부가염을 생성시켜 제거할 수 있다. 사용하는 방법 또는 반응제는 특정차단기 제거반응에 포함되는 물질의 화학적 또는 물리적 특성에 관계된다. 생성된 산부가염은 DEAE 세파덱스 A25,앰버리스트 A27 등과 같은 적절한 이온 교환수지로 처리하여 약학적으로 더 무독한 형태로 전환시킬 수 있다.

하이드록시-보호그룹은 제조과정을 통해 펩티드상에 유지시키다가 아미노 차단기의 제거와 함께 합성 최종단계 도중에 제거할 수 있다. 그러나 카복실 차단기 제거조건에 따라, 제조단계에서 앞서 제거될 수도 있다. 카복실그룹을 알칼리성 비누화에 의해 제거할 때, 하이드록시-보호그룹은 영향을 받지 않는다. 그러나 카복실보호그룹의 제거에 촉매적 수소첨가 분해법을 사용할 때는, 하이드록시보호그룹도 제거된다. 후자 경우에도 큰 문제가 없는데, 일반식(Ⅰ)화합물의 제조는 티로실 잔기 등과 같은 유리 하이드록실 그룹을 갖는 잔기 존재하에서도 가능하기 때문이다.

일반식(Ⅰ)화합물의 바람직한 제조방법은 둘째 및 세째 아미노산 잔기를 나타내는 별도 제조한 디펩티드와 별도로 제조한 C-말단 아미노산을 커플링시키고, 생성된 트리펩티드를 N-말단티로신에 커플링시키는 것이다. 별도로 제조한 C-말단 아미노산은 아미드, 알콜, 에테르 또는 에스테르부분을 갖도록 할 수 있다. 또는 목적하는 C-말단 부분의 전구체를 나타내는 그룹을 함유할 수 있다. 일반식(Ⅰ)의 테트라펩티드의 제조를 설명해주는 일반적인 합성 연쇄과정은 다음으로 나타낼 수 있다. 여기에서 z는 최종형태 또는 전구체로서의 C-말단 부분을 나타내고 AA는 아미노산잔기를 나타내며, 기호 AA에 붙여진 번호는 최종적인 펩티드 서열에서의 아미노산 위치를 나타낸다.

상기 도표는 일반식(Ⅰ)화합물 제조의 한가지 방법일 뿐이며 다른 순서로도 할 수 있다. 또 다른 방법인 용액법에서는 C-말단 아미노산 부분부터 시작하여 단계적이며, 연쇄적으로 아미노산을 커플링시켜 펩티드쇄를 생성한다. 상술한 바와 같은 반응기술은 본 발명뿐 아니라 다른 제조방법에서도 사용된다.

일반식(Ⅰ)화합물에서, 그룹 R₁및 R₃중 하나이상은 알킬, 알릴, 또는 시클로프로필메틸이다. 이러한 경우에, 적절한 N-치환된 아미노산을 제조 연쇄 과정에 사용한다. N-단일치환된 아미노산 제조의 한 방법은 출발물질로 N-보호된 아미노산을 사용하여 다음과 같이 진행된다.

상기 연쇄과정이 나타내듯이, 아미노산을 먼저 적절한 크라운 에테르 존재하에 칼륨 하이드라이드로 처리하여 이가 음이온을 생성시킨다. 이어서 중간체를 적절한 알릴, 시클로프로필메틸 또는 알킬 요다이드로 처리하여 목적하는 N-치환된 아미노산을 수득한다. N-치환된 아미노산의 다른 제법은 아미드형태의 N-비치환된 아미노산을 약 4당량의 나트륨 비카보네이트 및 적절한 알릴, 시클로프로필메틸 또는 알킬 할라이드로 환류 에탄올 중에서 처리하는 것이다.

펩티드합성분야의 전문가라면 상기 알킬화 반응에 사용된 것 같은 강알칼리성 조건하에서는 α-탄소에 대해 라세미화가 일어날 수 있는 사실을 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 라세미화의 정도는 포함된 아미노산에 달려 있다. 과량의 알킬화제를 사용하고 반응시간을 가능한한 단축시키므로써 라세미화를 최소화할 수 있다. 그러나 라세미화가 과도하게 일어나더라도, 생성물은 재결정화에 의해 d(+) α-페닐에틸아민염으로서 정제할 수 있다.

일반식(Ⅰ)의 펩티드의 C-말단 부분은 그의 1급아미드, 에스테르, 알콜 또는 에테르로 전환시킨다. 아미드로의 유도를 위해서는 아미노산의 카복실그룹을 1-하이드록시 벤조트리아졸(HBT) 존재하에 N,N'-디시클로헥실 카보디이미드(DCC)로 활성화하여 HBT에스테르를 생성하고 이 에스테르를 무수 암모니아와 반응시켜 아미드를 생성한다.

C-말단 에스테르는 이 분야에 공지된 기술에 의해 상응하는 산으로부터 수득할 수 있다. 1급 알콜로의 유도를 위해서도 C-말단 아미노산 또는 펩티드의 메틸 에스테르를 제조하고, 이를 나트륨 보로하이드라이드 및 리튬 클로라이드를 사용하여 환원시켜 상응하는 1급 알콜 유도체를 수득한다.

에테르는 공지된 여러 방법에 의해 제조할 수 있다. 그중 하나는 상응하는 알콜을 수성 수산화나트륨매질 중에서 알킬 브로마이드로 처리하는 것인데, 이때 알킬그룹은 에테르생성물의 알킬부분에 상응한다.

일반식(Ⅰ)화합물은 유능한 약제이다. 그들은 진통작용 및 신경안정작용을 나타낸다. 그들은 포유류 및 인체에 비경구 또는 경구투여할 때 특히 통증의 경감 및 정서장애의 완화에 유용하다.

일반식(Ⅰ)화합물은 단독으로 또는 약학적으로 무독한 담체와 함께 투여할 수 있는데, 그 비율은 화합물의 용해도 및 화학적 특성, 투여방법 및 표준관례에 따라 결정된다.

바람직한 조성물은 비경구투여 즉 근육주사, 피하주사 또는 정맥주사에 적절한 조성물이다. 여기에는 멸균주사액 또는 현탁제 및 무균주사용 데포(depot) 또는 서방출성 제형이 포함된다. 특히 편리한 멸균 주사액은 등장성 식염수나 등장성 덱스트로스로 제조한다. 멸균 주사용 조성물은 제조하여 그 자체로 저장하거나, 성분의 멸균성을 보장하는 바이알 또는 앰플 등의 바히클중에 함유된 기지량의 멸균활성 성분에 물과 같은 멸균매질을 사용하기 직전에 가하므로써 제조할 수 잇다. 멸균매질을 기지량의 멸균성분에 부가한 후에 등장용액 또는 현탁액이 생성되도록, 충분량의 멸균 덱스트로스 또는 염화나트륨을 함유시킬 수 있다.

바람직한 조성물에는 또한 경구 투여에 적절한 조성물도 포함된다. 이들은 캅셀제, 정제 등과 같은 단위제형으로 제조될 수 있으며, 각 제형은 미리 정해진 양의 활성성분을 함유한다. 또한 산제 또는 과립제, 수성 또는 비수성 매질중의 액제 또는 현탁제 또는 유제형태로 제조할 수 있다.

정제는 하나 이상의 보조성분과 함께 압축하여 제조한다. 분말 또는 과립과 같은 자유-유동형태의 활성성분을 결합제, 활탁제, 불활성 희석제, 계면활성제, 완충액, 향미제, 농화제, 보존제, 분산제 등과 같은 하나 이상의 다른 성분과 혼합하여 타정한다.

일반식(Ⅰ)화합물의 가장 적절한 실제 용량은 주치의가 결정한다. 용량은 투여방법, 투여화합물 환자의 상태 및 치료방법에 관계된다. 그러나 일반적인 용량범위는 근육주사 또는 피하주사시, 환자 체중 kg당 0.5㎍ 내지 2mg이며, 바람직하게는 10㎍ 내지 100㎍이며, 정맥주사 경우에는 체중 kg당 0.1㎍ 내지 500㎍, 바람직하게는 5㎍ 내지 50㎍이다. 경구투여시의 용량범위는 일반적으로 체중 kg당 100㎍ 내지 200mg이며, 바람직하게는 500㎍ 내지 100mg이고, 더 바람직하게는 5mg 내지 20mg이다.

다음 실시에는 일반식(Ⅰ)화합물의 제조 및 활성을 설명하며 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

[실시예 1]

L-티로실-D-알라닐-글리실-L-(N^α-알릴)페닐알라닌 아미드, 초산염의 제조

A. N^α-t-부틸옥시카보닐-N^α-알릴-L-페닐알라닌 100

100의 THF에 10.6그램(15밀리몰)의 N^α-t-부틸옥시카보닐-L-페닐알라닌을 가한다. 0.5그램의 18-크라운-6-에테르를 함유하는 250ml의 건조 THF 중 0.12몰의 칼륨 하이드라이드의 현탁액을 기계적으로 교반하고 0℃, 질소 대기하에서 여기에 혼합물을 1시간에 걸쳐 적가한다. 혼합물을 0℃에서 10분간 더 교반하고, 20ml의 THF 중 4ml(44밀리몰)의 알릴요다이드 용액을 30분에 걸쳐 적가한다. 생성된 혼합물을 4시간 유지하고, 20ml의 THF 중 4.6ml의 빙초산 혼합물을 적가한다. 혼합물을 10분 교반하고 400ml의 얼음상에 붓는다. 수상의 pH를 1N수산화나트륨으로 8.0으로 조절한다. 수상을 에테르로 추출하고 냉 1NHCL로 pH 2.0으로 조절한다. 수성 혼합물을 에틸아세테이트로 추출한다. 에틸아세테이트를 물로 추출하고 마그네슘 설페이트상에서 건조하고 시럽상으로 진공 증발시킨다. 시럽을 200ml의 에테르에 용해하고 8ml(0.04몰)의 디시클로헥실아민(DCHA)을 가한다. 생성된 침전을 여과하고 여액을 1.5N시트트산 및 물로 계속 추출한다. 에테르층을 마그네슘 설페이트상에서 건조하고 진공증발시켜 9그램(74%)의 표제화합물을 시럽으로 수득한다.

[α]_D ²⁵-130.8°(C=0.5MeOH)

NMR δ1.25(H₂O=), 1.45(t-부틸), 7.25(페닐), 10.5(카복실)

B. N^α-t-부틸옥시카보닐-N^α-알릴-L-페닐알라닌 아미드

A로부터의 생성물(9그램, 29.5밀티몰)을 60ml의 DMF에 용해한다. 혼합물을 0℃로 냉각하고, 4.49그램(29.5밀리몰)의 HBT:암모니아 복합체 및 6.08그램(29.5밀티몰)의 DCC를 혼합물에 가한다. 혼합물을 0℃에서 2시간, 실온에서 72시간 교반한다. 혼합물을 0℃로 냉각하고 여과한다. 여액을 진공농축하여 오일을 수득하고, 오일을 에틸아세테이트에 용해하고 1N 나트륨 비카보네이트, 물, 냉 1.5N 시트르산, 물로 계속 추출한다. 유기상을 마그네슘 설페이트상에서 건조하고 진공농축하여 오일을 수득한다. 오일을 3×40cm의 Grace and Davision grade 62실라카겔 컬럼(클로로포름중)상에 충진한다. 생성물을, 5%까지의 메탄올을 함유하는 클로로포름으로 구배 용출한다. 생성물을 채취분획의 박층 크로마토그래프 특징에 따라 분리하여 3.55그램(70퍼센트)의 표제 화합물을 수득한다.

[α]^D ₂₅-114.7°(C=0.5, MeOH)

C₁₇H₂₄N₂O₃(304.4)의 분석치

계산치: C,67.08, H,7.95, N,9.20

실측치: C,67.34, H,7.66, N,8.98

NMR δ1.4(t-부틸):7.2(페닐)

C. N^α-알릴-L-페닐알라닌 아미드, 하이드로클로라이드염

5ml의 아니솔 및 5ml의 트리에틸실란을 함유한 빙초산중 1N HCl(기체) 50ml에 B의 생성물 5.9그램(19.3밀리몰)을 가한다. 혼합물을 실온에서 30분 교반하고 에테르에 붓는다. 생성된 침전을 모아 건조시켜 융점이 250 내지 253℃인 4.1그램(88퍼센트)의 표제화합물을 수득한다.

[α]_d ²⁵+12.1°(C=0.5,DMF)

C₁₂H₁₇N₂OCl(240.7)의 분석치

계산치: C,59.87, H,7.12, N,11.64

실측치: C,59.65, H, 6.84, N,11.83

NMR δ3.45(C₆H₅CH₂-), 4.0(-CH-) 및 7.3(페닐)

D. N^α-t-부틸옥시카보닐-D-알라닐-글라실-L-(N^α-알릴)-페닐알라닌아미드

20ml의 DMF에 C의 생성물 1.2그램(5밀리몰)을 가한다. 혼합물을 0℃로 냉각하고, 2.19그램(5밀리몰)의 N^α-t-부틸옥시카보닐-D-알라닌-글리신, 디시클로헥실 암모늄염을 가한다. 혼합물을 0℃에서 5분 교반하고 0.68그램(5밀리몰)의 HBT 및 1.03그램(5밀리몰)의 DCC를 가한다. 혼합물을 0℃에서 2시간, 실온에서 24시간 교반한다. 혼합물을 0℃로 냉각하고, 생성된 침전을 여과제거하고, 여액을 진공증발시킨다. 생성된 잔사를 에틸아세테이트에 용해하고 에틸아세테이트를 1N나트륨 비카보네이트, 물, 0.75N 시트르산 및 물로 계속해 추출한다. 유기상을 마그네슘 설페이트상에서 건조하고 진공 증발시켜 오일을 수득한다. 오일을 아세톤에 용해하고, 두개의 프레파라티브 박층판상에 전개시킨다. 판을 9:1비의 클로로포름 및 메탄올의 혼합물로 용출한다. 주성분 부위를 TLC판으로부터 긁어내고, 표제 화합물을 실리카겔로부터 용출시켜 1.1그램(51퍼센트)의 표제화합물을 수득한다.

[α]^D ₂₅-64°(C=0.5,MeOH)

C₂₂H₃₂N₄O₅(432.5)의 분석치

계산치: C,61.09 H,7.46, N,12.95

실측치: C,60.89 H,7.25, N,12.66

E. L-티로실-D-알라닐-글리실-L-(N^α-알릴)페닐알라닌 아미드, 아세테이트염

3ml의 아니솔 및 3ml의 트리에틸실란을 함유하는 빙초산중의 35ml의 새로운 1N HCl(기체)에 D의 생성물 900mg(2.1밀리몰)을 가한다. 혼합물을 실온에서 25분 교반하고, 에테르중에 붓는다. 생성된 침전을 모아 건조한다(700mg).

N^α-t-부틸옥시카보닐-L-티로신(533mg, 1.9밀리몰)을 5ml의 DMF에 현탁시킨다. 혼합물을 -15℃로 냉각하고, 교반하고 0.25ml(1.9밀리몰)의 이소부틸클로로포르메이트 및 0.21ml(1.9밀리몰)의 NMM을 신속하게 가한다. 다음의 제조과정 동안에 용액을 -15℃에서 계속 교반한다.

상기의 하이드로클로라이드염(700mg, 1.9밀리몰)을 5ml의 DMF에 용해한다. 혼합물을 0℃로 냉각하고 0.21ml(1.9밀리몰)의 NMM을 1회에 가한다. 용액을 진탕하여 반응을 완결짓는다. 생성된 혼합물을 상기에서 제조한 용액에 신속히 가하고, 혼합물을 -15℃에서 2.5시간 교반한다. 혼합물을 빙편 및 1N나트륨 비카보네이트의 혼합물상에 붓는다. 수용액을 에틸아세테이트로 추출한다. 유기상을 분리하여 물, 1.5N 시트르산 : 물로 계속 세척한다. 에틸아세테이트를 마그네슘 설페이트상에서 건조하고 진공농축하여 오일(1.0그램)을 수득한다.

상기 오일(900mg)을 1.5ml의 아니솔 및 1.5ml의 트리에틸실란을 함유하는 15ml의 트리플루오로아세트산에 용해한다. 혼합물을 0℃에서 30분 교반하고 에테르중에 붓고, 생성된 침전을 모아 건조한다(700mg). 수즉물을 충분량의 완충액(1퍼센트 피리딘, 0.05퍼센트 아세트산)에 용해하여 10ml의 용액을 제조하고, 이용액을 크기가 2.5×90cm이며 동일완충액과 미리 평형을 이룬 세파덱스 DEAE A-25(아세테이트) 칼럼에 적용한다. 용출액을 280nm에서 검사하고, 해당 분획을 합해 동결건조하여 백색 고체를 수득한다. 고체를 10ml의 0.2M 아세트산에 용해하고, 용액을 2.5×90cm의 세파덱스 G-10칼럼에 적용한다. 칼럼을 0.2M아세트산으로 용출하고, 용출액을 280nm에서 검사한다. 해당분획을 합해 동결건조하여 463mg(40퍼센트)의 표제화합물을 백색고체로 수득한다.

[α]_D ²⁵-1.19°(C=0.5, 1N HCl)

C₂₈H₃₇N₅O₇(555.6)의 분석치

계산치: C,60.53 H,6.71 N,12.60

실측치: C,60.26 H,6.67 N,12.89

아미노산분석: 티로신 1.00, 알라닌 0.99, 글리신 1.00, NH₃0.98

[실시예 2]

L-티로실-D-알라닐-글리실-L-(N^α-시클로프로필메틸)페닐알라닌 아미드, 아세테이트염의 제조

A. N^α-시클로프로필메틸-L-페닐알라닌 아미드

100ml의 무수에탄올에 8그램(0.04몰)의 L-페닐알라닌 아미드 하이드로클로라이드를 가한다. 이 혼합물에, 13.4그램(0.16몰)의 고체 무수나트륨 비카보네이트 및 6.44그램(0.048몰)의 브로모메틸 시클로프로판을 가한다. 혼합물을 7시간 환류하고 진공증발시켜 오일을 수득한다. 오일을 에틸아세테이트에 용해하고, 에틸아세테이트 용액을 물로 용출한다. 유기상을 마그네슘 설페이트상에서 건조하고 진공 증발시켜 오일을 수득한다. 오일을 3×50cm크기의 클로로포름중 실리카겔(Grace and Davison Grade 62)칼럼에 적용한다. 생성물을 메탄올함량을 5퍼센트까지 변화시켜가며 클로로포름으로 용출한다. 생성물을 수집분획의 박층 크로마토그라피 특징에 따라 분리하여 3.41그램(39퍼센트)의 표제 화합물을 수득한다.

NMR δ1.45(H-N-), 7.3(페닐)

B. N^α-t-부틸옥시카보닐-D-알라닐-글리신-L-(N^α-시클로프로필메틸)페닐알라닌 아미드.

A의 생성물(3.41그램,0.016몰)을 25ml의 DMF에 용해한다. 혼합물을 0℃로 냉각하고, 4.23그램(0.016몰)의 N^α-t-부틸옥시카보닐-D-알라닐-글라신을 가하고 이어서 2.16그램(0.016몰)의 HBT 및 3.03그램(0.016몰)의 DCC를 가한다. 혼합물을 0℃에서 2시간 실온에서 2일간 교반한다. 혼합물을 0℃로 냉각하고, 생성된 침전을 여과제거하고, 여액을 진공 증발시킨다. 잔사를 에틸아세테이트에 용해하고, 에틸아세테이트를 1N 나트륨 비카보네이트, 물, 1.5N 시트르산 및 물로 계속 추출한다. 유기상을 마그네슘 설페이트상에서 건조하고 진공 증발시켜 고체를 수득한다. 고체를 3×50cm의 클로로포름중 실리카겔(Grace and Davison 62) 칼럼에 적용한다. 생성물을, 메탄올함량을 5퍼센트까지 변화시킨 클로로포름으로 용출한다. 수집분획의 박층 크로마토그라피 특징에 따라 생성물을 분리하여 융점이 83내지 84℃인 표제화합물 2.51그램(35퍼센트)을 수득한다.

C₂₃H₃₆N₄O₅(448.6)의 분석치

계산치: C,61.59 H,8.09 N,12.49

실측치: C,60.05 H,7.40 N,13.23

C. N^α-t-부틸옥시카보닐-L-티로실-D-알라닐-글리실-L-(N^α-시클로프로필메틸)페닐 알라닌 아미드

B의 생성물(2.4그램 : 5.3밀리몰)을 5ml의 아니솔을 함유하는 20ml의 트리플루오로아세트산에 용해한다. 혼합물을 0℃에서 30분 교반하고, 그 다음 가열하지 않고 진공증발시켜 용매를 제거한다. 생성된 오일에 에테르를 가하고, 상등액을 경사하고 잔류오일을 진공건조한다.

10ml의 DMF에 1.4그램(5.3밀리몰)의 N^α-t-부틸옥시카보닐-L-티로신을 가한다. 혼합물을 -15℃로 냉각하고 교반하고 0.58ml(5.3밀리몰)의 NMM 및 0.69ml(5.3밀리몰)의 이소부틸 클로로포르메이트를 신속하게 가한다. 용액을 다음의 제조과정 동안에 -15℃에서 계속 교반한다.

상기의 트리플루오로아세테이트염을 10ml의 DMF에 용해한다. 혼합물을 -15℃로 냉각하고, 0.58ml의 NMM을 1회에 가한다. 혼합물을 진탕하여 반응을 완결짓고 상기의 혼합무수물 용액에 가한다. 생성된 혼합물을 4시간 교반하고, 빙편 및 1N 나트륨 비카보네이트 혼합물상에 붓는다. 수용액을 에틸아세테이트로 추출하고, 에틸아세테이트 추출액을 물, 1.5N 시트르산 및 물로 계속해서 추출한다. 에틸아세테이트를 마그네슘 설페이트상에서 건조하고 진공농축하여 오일(2.7그램)을 수득한다.

오일을 네개의 프레파라티브 박층판에 적용한다. 클로로포름 및 메탄올의 9:1비 혼합물로 판을 용출한다. 주성분 부위를 TLC판에서 긁어내어, 실리카겔로부터 생성물을 용출하여 2.0그램(62퍼센트)의 표제화합물을 수득한다.

[α]_D ²⁵-38.44°(C=0.5, MeOH)

C₃₂H₄₃N₅O₇(609.7)의 분석치

계산치: C,63.04 H,7.11 N,11.49

실측치: C,61.92 H,6.89 N,11.13

아미노산분석: 티로신 1.02, 알라닌 0.99, 글리신 0.99, NH₃1.01

D. L-티로실-D-알라닐-글리실-L-(N^α-시클로프로필메틸)-페닐알라닌 아미드, 아세테이트염.

C의 생성물(1.7그램, 2.8밀리몰)을 3ml의 아니솔을 함유하는 15ml의 트리플루오로아세트산에 용해한다. 혼합물을 0℃에서 30분 교반하고 동결건조한다. 생성된 고체를 충분량의 완충액(1퍼센트 피리딘:0.05퍼센트 아세트산)에 용해시켜 10ml로 하고, 이 용액을 동일 완충액과 평형을 이룬 2.5×90cm 크기의 세파덱스 DEAE A-25(아세테이트)칼럼에 적용한다. 용출액을 280nm에서 검사하고, 해당 분획을 합해 동결건조한다. 생성된 고체를 10ml의 0.2M 아세트산에 용해하고, 이 용액을 동일 용매중에서 평형을 이룬 2.5×90cm의 세파덱스 G-10칼럼에 적용한다. 용출액을 280nm에서 검사하고, 해당분획을 합해 동결 건조하여 1.3그램(82퍼센트)의 표제화합물을 수득한다.

[α]_D ²⁵-20.2°(C=0.5, MeOH)

C₂₉H₃₉N₅O₇(569.7)의 분석치

계산치: C,61.15 H,6.90 N,12.29

실측치: C,61.38 H,6.66 N,12.06

아미노산분석: 티로신 1.00, 알라닌 1.00, 글리신 0.99, NH₃1.02

일반식(I)화합물의 진통작용은 쥐를 사용한 열판시펌(hot plate test)을 통해 입증된다. 이 시험에서, 52℃를 유지하는 열판면을 바닥으로 하는 수직형 아크릴 원통중에 쥐를 넣는다. 쥐에게 적절한 담체중에 용해하거나 현탁시킨 미리 결정한 양의 시험 화합물을 경구투여 또는 피하주사하고, 15분후, 쥐를 열판면상에 놓는다. 쥐가 열판면으로부터 뛰어 오르기까지의 잠복시간(초)을 잰다. 진통작용을 나타내는 약제는 담체만을 투여한 대조쥐에 비해 잠복기를 연장시킨다. 이러한 효과는 운동실조 또는 불능을 일으키지 않는 용량범위내에서 나타내야 한다. 다음 표는 이 시험결과 얻어진 ED₅₀값이다.

[표]

진통작용, 열판시험

Claims

일반식(Ⅲ) 화합물과 일반식(Ⅳ)화합물을 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드 및 1-하이드록시벤조트리아졸 존재하에 액상법에 의해 커플링시키고, 생성된 일반식(Ⅱ)의 화합물로부터 보호그룹을 제거함을 특징으로 하여 일반식(Ⅰ)의 화합물 및 그의 약학적으로 무독한 산부가염을 제조하는 방법

L 및 D는 부재성을 나타내며, R₁은 수소 또는 C₁-C₃1급 알킬이고, R₂는 C₁-C₄1급 또는 2급 알킬, 알릴, 시클로프로필메틸, C₁-C₂하이드록시알킬 또는 -(CH₂)_n-u-CH₃인데 u는 -S->S-O이고 m은 1 또는 2이며, R₃는 시클로프로필메틸 또는 알릴이고,

Z는 -CH₂OR₄,
, 또는
인데 R₄는 수소, 아세틸 또는 아세톡시메틸이고, R₅는 C₁-C₃알킬이며, R₆는 수소, C₁-C₃1급 알킬 또는 아미노차단기이고, R₇는 상기한 바와같은 R₂또는 C₁-C₂하이드록시 알킬부위의 하이드록시-보호그룹이며, R₈은 수소 또는 하이드록시-보호그룹이고, 단 R₆,R₇,R₈또는 Z중 하나이상은 차단기를 나타내야 한다.