FI70228C - Foerfarande foer framstaellning av en enkefalin-analog-peptid - Google Patents

Description

17^71 γοι KUULUTUSJULKAISU 7ΠΟΟΟ

eSSF® B 11 UTLÄGGNINGSSKRIFT / U £ 21 O

c (45) ratct.ttl ;r.y:'>*."Ctt7 is co iohg (51) Kv.lk.*/lnt.CI.4 C 07 K 7/12 SUOMI—“FINLAND (21) Patenttihakemus — Patentansökning 770254 (22) Hakemispäivä — Ansökningsdag 26.01 . 77 (23) Alkupäivä — Giltighetsdag 26.01.77 (41) Tullut Julkiseksi — Blivit offentllg 27.07.77

Patentti- ja rekisterihallitus ^ Nähtäväksipanon Ja kuul.julkaisun pvm.— 28 02 86

Patent- och registerstyrelsen Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad / (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus—Begärd prloritet 26.01 .76 O3.O3.76, 23.ll.76 Englanti-England(GB) 2900/76, 8481/76, 48821/76 (71) The Wellcome Foundation Limited, 183-193 Euston Road, London N.W.I.,

Englant i-England(GB) (72) Samuel Wilkinson, Beckenham, Kent, Engl anti-Engl and(GB) (74) Oy Koister Ab (54) Menetelmä enkefaliini-analogi-peptid in valmistamiseksi -Förfarande för framstälIning av en enkefalin-analog-peptid

Keksinnön kohteena on menetelmä enkef aliini-analog.i-pepti-din, jolla on kaava H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-D-Leu-R^ 1 tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan (peptidi karboksylaat-tianionina ja farmaseuttisesti hyväksyttävä kationi) valmistamiseksi, tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän happoadditiosuolan val- 2 3 4 3 niistämiseksi, jossa R on NHR tai OR , jolloin R on 1 - 4 hiili- 4 atomia sisältävä alkyyliryhmä, ja R on vety, 1 - 4 hiiliatomia sisältävä alkyyliryhmä tai halogeenifenyyli.

Keksinnön mukaisesti valmistetulla peptidillä tai sen johdannaisilla on morf iini-agonist.inen vaikutus. Kuten yleisesti on hyväksytty ja kuten käsitettä on tässä käytetty, on morfiini-agonisti yhdiste, jonka biologinen vaikutus läheisesti muistuttaa luonnon alkaloidin vaikutusta.

2 70228

Morfiinin farmakologisia ominaisuuksia ja sen terapeuttista käyttöä on laajasti kuvattu kirjallisuudessa (esim. "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Goodman, L. S. ja Gilman, Δ., julkaissut The MacMillan Company, New York, 3. painos (1965), erityisesti kappale 15, ss. 246 - 266, sekä "Martindale: The Extra Pharmacopoeia", Blacow, N. W. , julkaissut The Pharmacuetical Press, Lontoo, 26. painos (1972), erityisesti sivut 1100 - 1106).

Kuten on tunnettua (Goodman, L. S. et ai., loc. cit., kappale 16), voi morfiinin jatkuva antaminen johtaa siihen, että saajalle kehittyy lääketottumus tähän lääkeaineeseen, sietokyky sen vaikutuksille, ja selviä vieroitusoireita kun lääkkeen anto lopetetaan. Siksi on monia vuosia tehty tutkimustyötä tarkoituksena löytää yhdiste, jolla olisi morfiinin va.ikutuskir jo, mutta jolta samalla puuttuisi sen haitat.

Tunnetaan luonnon enkefaliineja, kuten Met-enkefaliini, eli L-tyrosyyliglysyyliglysyyli-L-fenyylialanyyli-L-metioniini, ja Leu-enkefaliini, eli L-tyrosyyliglysyyliglysyyli-L-fenyylialanyyli-L-leusiini (Nature, 258 (1975), ss. 577 - 579).

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että a) reagenssi, jonka kaava on

H—Y1—OH II

jossa Y on -Tyr- tai osittainen radikaalisekvenssi, jonka N-loppu-päässä on -Tyr- ja joka siitä eteenpäin on identtinen mainitun peptidin kanssa, saatetaan reagoimaan kaavan 2 2

H-Y -R III

2 mukaisen reagenssin kanssa, jossa kaavassa R merkitsee samaa kuin 2 edellä ja Y on osittainen radikaalisekvenssi, joka on identtinen edellä määritellyn tuotepeptidin loppuosan kanssa, jolloin reagens-sit II ja III ovat mahdollisesti suojattuja ja/tai aktivoituja, missä ja kun se on tarkoituksenmukaista, ja jolloin, mikäli se on tarkoituksenmukaista, poistetaan suojaryhmät, tai

II

3 70228 b) kun halutaan valmistaa sellainen kaavan I mukainen pep-2 3 tidi, jossa R on NHR , vastaava kaavan I mukainen peptidi, jossa 2 4 4 R on OR , jossa R on 1-4 hiiliatomia sisältävä alkyyliryhmä, saatetaan reagoimaan 1-4 hiiliatomia sisältävän monoalkyyliamiinin kanssa, tai c) kun halutaan valmistaa sellainen kaavan I mukainen pep- . . 2 4 4 tidi, jossa R on OR , jossa R on 1 - 4 hiiliatomia sisältävä alkyyliryhmä tai halogeenifenyyli, vastaava kaavan I mukainen peptidi, 2 4 4 jossa R on OR , jossa R on vety, esteröidään, jonka jälkeen saatu tuote haluttaessa tai tarvittaessa muutetaan vapaaksi emäkseksi tai farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi tai happoadditiosuolaksi

Aminohapoille ja niiden johdannaisille tässä käytetyt lyhenteet ovat alalla tavanomaisesti käytettyjä ja löytyvät esimerkiksi julkaisusta Biochemistry, 11, 1726 (1972). Edellä ja jatkossa kaikki viitteet tarkoittavat L-aminohappoja ja niiden johdannaisia, paitsi glys.i.inin tapauksessa ja ellei muuta ole esitetty.

Kaavan I mukaisen peptidin ja sen johdannaisten farmaseuttisesti arvokkaita happoadditiosuoloja ovat ne, jotka on johdettu seuraav.ista hapoista: a) mineraalihapot: kloorivetyhappo, bromivetyhappo, fosfo-rihappo, metafosforihappo, typpi- ja rikkihapot; ja b) orgaaniset hapot: viinihappo, etikkahappo, sitruunahappo, omenahappo, maitohappo, fumaarihappo, bentsoehappo, glykolihap-po, glukonihappo, gulonihappo, sukkiinihappo ja aryylisulfonihappo, esimerkiksi p-tolueenisulfonihappo.

Farmakologiset kokeet ja niiden tulokset A. In vitro-kokeet i) Hiiren eristetyn siemenjohtimen hermollisesti aikaansaatujen supistusten estäminen tutkittiin Hughes et ai.:n menetelmällä (Brain Research 88 (1975) 296) käyttäen 0,1 Hz:n sykäyksiä ja tunnettua narkoottista antagonista naloksonia eli 1-N-allyyli-7,8-d.i-hydro-14-hydroksi-normorfinonia.

i.i) Sähköisesti aikaansaatujen supistusten vähentäminen marsun eristetyssä sykkyräsuolessa tutkittiin PatonVin menetelmällä (Brit. J. Pharmacol., 12 (1957) 119 - 127). Jokainen suolilohko lävistettiin anodilla ja varustettiin 2-3 g:n painolla. Ärsyke-parametrit: taajuus 0,1 Hz, kestoaika 0,4 ms ja jännite enintään 30 - 40 V; supistukset siirrettiin isotoonisesti.

4 70228 B) In vivo-kokeet i) Yhdisteiden kipua lievittävä vaikutus määritettiin kuu-malevykokeella. Koe-eläimet (uroshiiri, CFLP-kanta, Hacking ja Churchill) sijoitettiin kukin erikseen kuparipohjäiseen pleksilasi-laatikkoon, joka kellui 55°C vesihauteessa, ja niitä tarkkailtiin epämukavuuden merkkien, kuten vapinan tai käpälien nuolemisen, havaitsemiseksi, ja reaktioaika (aina maks. 30 s asti) merkittiin muistiin. Viiden hiiren ryhmät saivat sen jälkeen joko koeyhdistet-tä tai suolaliuosta (0,85 %) aivoselkäydinlihasruiskeena (20 μΐ annostilavuus), ja koe toistettiin 15 min välein käsittelyn jälkeen. Koeyhdisteiden ED^q-luvut laskettiin niiden eläinten lukumäärästä, joilla oli käsittelyn jälkeinen reaktioaika, joka oli kaksinkertainen esikäsittelylukuun nähden.

ii) Yhdisteiden ripulia ehkäisevä vaikutus määritettiin seu-raavalla tavalla: Naaraspuoliset Cops Wistar-rotat (Charles River) pidettiin nälässä 24 tuntia, jonka jälkeen annettiin tutkittavan yhdisteen vesiliuosta (10 ml/kg) ihonalaisesti. 15 minuutin kuluttua kukin rotta sai 1 ml risiiniöljyä suun kautta ja eläimiä tarkkailtiin tunnin ajan ripulin esiintymisen havaitsemiseksi. Kunkin yhdisteen ED^Q-luku oli se vapaan peptidin mg-määrä/paino-kg, joka tarvitaan estämään ripuli 50 %:ssa eläimistä

Suoritettujen kokeiden tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa.

5 Λ S ~ 70228 0) \ * cd tr * cos * Ή ^ '—" 3 >ι E"< Ε-< VO CO Ο Ο 3 en Ο 3 2 CN τ- τ-

CD 3 ίΠ Λ V V

Η :3 Q ι « Μ ϋ

VO

—. CN

(Tl VO

oi a.

I O — r- tn I

3 3 — .—. LO LO O O

* LD

3>Lnl**ooo o in 3 0) Q vo

3 3 W

VO

I Γ-

-H CT

rH t— 0 — 3 en o :3 vo

C C —* i (N

3 >i* co vo CM

en 3 t— fooocr <m (U

Sh 3 (D - - - - - - H

3 >i O O O vo CN o O 3 g :n 3 T- 4-> 3 2

C

•H · TS Ή 3 3

O

•n -P 3 C C —. 0) -3

CD CD * -P

Pi g oo cg 'S’ r— -h -n •1-10)0) ro ro r- c\i t— Γ- *— N 3

•H -H o (M r- T— N -P

3 eo 3 *- il 3 3

«H -P •H fH

G CD -h •h m οι

•H

3 >4H · Il O sh m

3 O · E-I

-H · g O 2

CD i—I

rH 3 a ~ CD · , -K -K -ie 2 r-H in * * • CD te cv' ^1 * CO K CN |

3 CD

O 3 K ^ 1 0 0 2 lii r 3 3 3 3

0) (D CD CD

3 3 Cl 3

III I

a a a a

III I

CD CD CD CD

3 3 3 3 3 3 CH Oj

III I

•rl -H S>1 >Ί £>1 S>1 C G 3 rH 3 3

H -rl CD O O CD

H 3 I I I I

3 i—13 3 3 3

0) 3 3'—I rH |—I |—I

-P UH 3 < < <c < en 3 o i i i i •H 3 3 Q Q Q a

TS G G I I I I

3 3 CD G G G Sh S* i I I >i >i >i >< -P 3 EH H En Eh

01 CD I I I I

2 3 3 3 3 3 70228

Kaavan I mukaisia peptidejä ja niiden edellä mainittuja johdannaisia voidaan valmistaa sinänsä tunnetuilla menetelmillä. Niinpä niitä voidaan muodostaa liittämällä peräkkäin sopivia aminohappoja käyttäen joko peptidisynteesin tai kiinteätaasimenetelmien klassisia menettelytapoja tai valmistamalla ensin peptidi-alayksiköt ja sen jälkeen liittämällä ne toisiinsa.

Tällaiset reaktiot voidaan saattaa tapahtumaan esimerkiksi aktivoimalla liittyvän aminohapon karboksyyliryhmä ja suojaamalla reaktioon osallistumattomat amino- ja karboksyylihapporyhmät. Tällaiset menetelmät ovat normaaleja peptidi-alalla. Yksityiskohtia sopivista aktivoivista ja suojaavista (peittävistä) ryhmistä sekä sopivista reaktio-olosuhteista (sekä liittämisreaktioita että suojaryh-mien poistamista varten), jotka antavat pienemmän rasemoitumisen, löytyy kirjallisuudesta, esimerkiksi: a) GB-patentit n:o 1 042 487, 1 048 086 ja 1 281 383> b) Schröder ja Lubke, "The Peptides" (Academic Press) (1 965); c) Bellean ja Malek, J. Am. Chem. Soc. 90 (1968) 165; d) Tilak, Tetrahedron Letters (1970) 849; e) Beyerman, Helv. Chim. Acta 56 (1973), 1729; f) Stewart ja Young, "Solid Phase Peptide Synthesis" (W. H.

Freeman et al.) (1969).

Reaktio-olosuhteista riippuen kaavan I mukaiset peptidit ja niiden johdannaiset saadaan vapaan emäksen tai sen happoadditio-suolan muodossa, tai itse peptidien ollessa kyseessä, niiden suolan muodossa. Happoadditiosuolat voidaan muuttaa vapaiksi emäksiksi tai muiden happojen suoloiksi ja emäkset voidaan muuttaa näiden happo-additiosuoloiksi alalla tunnetuilla menetelmillä. Samalla tavalla peptidit voidaan muuttaa suoloikseen, ja suolat muuttaa peptideiksi tai muiksi suoloiksi hyviksi todetuilla menetelmillä.

li 7 70228

Seuraavien esimerkkien avulla valaistaan keksintöä. Esimerkeissä on käytetty seuraavia lyhennyksiä: HOBT 1 -hydroks.ibentsodiatsoli DCCI disykloheksyylikarbodi-imidi DCU disykloheksyyliurea NMM N-metyyl.imorf Oliini DMF dimetyyl.iformamidi THF tetrahydrofuraani i-Pr isopropanoli DIPE di-isopropyylieetteri PE petrolieetteri

EtOAc etyyliasetaatti i-BuOCOCl isobutyylikloroformiaatti Z bentsyylioks.ikarbonyyli

Bu tert.-butyyli BOC tert.-butyylioksikarbonyyli

Bzl bentsyyli CP 4-kloorifenyyli

Peptidit tutkittiin ohutlevykromatografisesti käyttäen Merck-piihappogeelilevyjä ja seuraavia liuotinjärjestelmiä: 1) Metyylietyyliketoni 2) n-butanoli/etikkahappo/vesi (3:1:1) 3) kloroform.i/metanoli/32-% etikkahappo (12:9:4) 4) kloroform.i/metanoli/0,88-ammoniakk.i (12:9:4) 5) etyyliasetaatti/n-butanoli/etikkahappo/vesi (1:1:1:1) 6) kloroformi/metanoli (8:1) 7) kloroform.i/metanoli/32-% etikkahappo (1 20:90:5) 8) kloroform.i/metanoli/32-% ammoniakki (120:90:5)

Kaikilla aminohapoilla oli L-konfiguraatio, jollei toisin ole ilmoitettu.

Optiset kiertokulmat määritettiin automaattisella polarimet-rillä Bendix NPL.

Peptidi-hydrolysaattien (valmistettu käsittelemällä 6-n suolahapolla 110°C:ssa 24 tuntia tyhjössä) aminohappokoostumus määritettiin aminohappoanalysaattorilla Beckman-Spingo Model 120C tai Rank Chromostak.

8 70228

Seuraavia yleisiä menetelniä käytettiin kaikissa peptidien synteeseissä: a) Liittämiset suoritettiin DMF:ssä ja välitettiin DCClillä.

b) Aminohappoesterihydrokloridit muutettiin vapaiksi estereiksi lisäämällä tertiääristä emästä, joko tr.ietyyliamiinia tai N-metyylimorfoliinia.

c) HOBT lisättiin liittämisvaiheessa, kun sirpalekondensoi-minen käsitti peptidin, jolla oli optisesti aktiivinen karboksipää-teaminohappo, esim. liittämällä BOC-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-OH:n kanssa.

d) Liittymisten annettiin jatkua 24 tunnin ajan kylmässä . , .o tilassa +4 C:ssa.

e) Liittämisen jälkeen puhdistaminen suoritettiin pesemällä hapolla ja emäksellä muuttumattomien reaktioaineiden poistamiseksi.

f) Alkaliset saippuoinnit suoritettiin vesipitoisessa meta-nolissa autotitraattorilla pH-arvossa 11,5 - 12,0 1-n NaOH:lla.

g) Bentsyylioksikarbonyyli-suojaryhmät poistettiin hydroge-nolyysillä metanoli/etikkahapossa 10-% palladium/hiilellä.

h) Edellä esitetystä hydrogenolyysistä saadut asetaattisuolat muutettiin vastaaviksi hydroklorideiksi lisäämällä metanolipi-toista kloorivetyä.

i) Bentsyyli-suojaus poistettiin hydrogenolyysillä metanolis-sa 10-%palladium/hiilellä.

j) Tert.-butyyli- ja tert.-butyylioksikarbonyyli-suojaryhmät poistettiin N-kloorivedyllä etikkahapossa anisolin läsnäollessa, joka toimii puhdistusaineena. Erottumisen annettiin jatkua 60 - 90 minuuttia .

k) OBu-suojaryhmät treoniinin ja seriinin alkoholiryhmissä poistettiin trifluorietikkahapolla, joka sisälsi 10 % vettä, jolloin erottumisen annettiin jatkua 90 minuutin ajan.

l) Lopulliset peptidit eristettiin hydroklorideinaan ja lyo-filoitiin vesiliuoksesta.

Il 9 70228

Esimerkki 1

H.Tyr - D-Ala - Gly - Phe - D-Leu.OH

Bzl BOC.Tyr.OH HC1.D-Ala.OMe ,BZl © BOC.Tyr - D-Ala.OMe

Bzl ^ I (i) 30C.Tyr ——- D-Ala.OH Gly. QMe BOC.PheOH D-Leu.CMe

Bzl I (3) (J) BOC.Tyr--D-Ala -—- Gly. QMe BOC.Phe ——— D-Leu.CMe

Bzl r-N

I (4) (ö) BOC.Tyr - D-Ala -- Gly.OH MCI.Phe —^— D-Leu.CVe

Bzl L © BOC.Tyr - D-Ala - Gly -- Phe D-Leu.CMe

Bzl I @

BOC.Tyr - D-Ala - Gly - Phe D-Leu.CH

(Γ)

BOC.Tyr - D-Ala - Gly ——— Phe - D-Leu.CH

(To)

H.Tyr - D-Ala - Gly —^— Phe - D-Leu.CH

Vaihe 1 Bz 1 BOC.Tyr.D-Ala.QMe

Liuotettiin 12,25 g BOC.Tyr.OH 60 ml:aan THF:a, jäähdytettiin -25°C:seen, lisättiin 3,33 g N-metyyl.imorfoliinia THF:ssa (10 ml), sekä 4,30 g iso-butyyl.ikloroformiaattia THFrssä (10 ml). Sekoitettiin -25°C:ssa 2 minuutin ajan, jonka jälkeen lisättiin -25°C:seen esijäähdytetty seos, jossa oli 4,18 g D-Ala.OMe.HC1 ja 3,03 g N-metyy-limorfoliinia dimetyyliformamidissa (80 ml).

10 70228

Seosta sekoitettiin -15°C:ssa 2,5 tunnin ajan, astia siirrettiin jäähauteeseen ja sitä sekoitettiin 0°C:ssa 2-m KHCO^n (36 ml) kanssa vielä 30 minuutin ajan. THF poistettiin tyhjössä ja jäännös jaettiin etyyliasetaattiin (30 ml) ja 50-% kyllästettyyn suolaliuokseen liukeneviin osiin. Orgaaninen faasi pestiin ensin 2 x 75 mlrlla 5-% ^200^:3; 1 x 50 ml:lla 50-% kyllästettyä NaCl:a, kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja väkevöitiin tyhjössä.

Jäännös kiteytettiin etyyliasetaatti/kevytbensiinistä, jolloin saatiin värittömiä prismoja; sp. 117 - 119°C (12,05 g, 80 % 1) saanto); 0,70 .

C25H32N2°6 laskettu: c 65,79 H 7/02 N 6,14 löydetty: C 65,99 H 7,24 N 5,93.

Vaihe 2 Bzl

BOC.Tyr.D-Ala.OH

Bzl

Liuotettiin 12,05 g BOC.Tyr.D-Ala.OMe metanoliin (250 ml) ja lisättiin 2-n NaOH:a (14 ml) ja sekoitettiin huoneen lämpötilassa 2 tunnin ajan. Metanoli poistettiin tyhjössä ja vettä (150 ml) lisättiin. Suodatuksen jälkeen liuos tehtiin happameksi kiinteällä sitruunahapolla ja uutettiin kahdesti EtOAcrlla (250 ml). Pestiin 2 x 100 mlrlla vettä, ja orgaaninen vaihe erotettiin ja kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja väkevöitiin tyhjössä.

Jäännös kiteytettiin EtOAc/kevytbensiinistä, jolloin saatiin prismanmuotoisia kiteitä; sp. 158 - 159°C (10,72 g, 92 %).

Rf 0,677); 0,608); 0,802'.

C_.H_.N-0,. laskettu: C 65,16 H 6,79 N 6,33 24 30 2 6 löydetty: C 65,01 H 6,47 N 6,08.

Valhe 3 Bzl BOC.Tyr.D-Ala.Gly.OMe

Meneteltiin kuten on kuvattu vaiheessa 1, mutta lähdettiin seka-anhydridistä, joka oli valmistettu BOC.Tyr.D-Ala.OH:sta (2,43 g), iBuOCOClrsta (716,6 mg) ja NMMrstä (555,5 mg) THFrssa (20 ml), ja Gly.OMe.HClrn (627 mg) ja NMM:n (505 g) seoksesta DMFrssa (20 ml), jolloin saatiin tuote, joka kiteytyi prismoiksi; sp. 125 - 127°C EtOAc/kevytbensiinistä (2,30 g, 89 %) .

Rf 0,857) ; 0,828) ; 0,652) ’ C27H35N3°7 laskettu: C 63,16 H 6,82 N 8,19 löydetty: C 63,33 H 6,76 N 7,92.

II

1 1

Vaihe 4 - 70228

Bzl

BOC.Tyr.D-Ala.Gly.OH

Bzl l BOC.Tyr.D-Ala.Gly.OMe (2,30 g) saippuoitiin metanolissa (50 ml) 2-n NaOH:n (2,5 ml) läsnäollessa kuten vaiheessa 2, jolloin saatiin happo, joka kiteytyi neuloiksi EtOAc/kevytbensiinistä; sp. 99 - 100°C (1,85 g, 83 %).

Rf 0,72?) ; 0,648); 0,602) .

C_,H__N_0_ laskettu: C 62,53 H 6,61 N 8,42 2b jj 3 / löydetty: C 61,96 H 6,80 N 7,99.

Vaihe 5 BOC.Phe.D-Leu.OMe

Liuotettiin 19,85 g BOC.Phe DMF:iin (150 ml), liuos jäähdytettiin -5°C:seen, ja lisättiin 20,25 g HOBT:a ja 15,45 g DCl:a.

30 minuutin sekoittamisen jälkeen lisättiin D-Leu.OMe.HC1 (13,61 g) ja NEt^ (10,38 ml) ja sekoittamista jatkettiin 24 tunnin ajan +4°C:ssa.

DCU suodatettiin, pestiin kylmällä DFM:lla ja suodos väke-vöitiin tyhjössä. Jäännös liuotettiin dietyylieetteriin (900 ml), pestiin ensin 2 x 100 ml:11a 10-% sitruunahappoa; sitten 100 ml:11a 50-% NaCl:a; 3 x 100 ml:lla 10-% NaHCO^ta ja lopuksi 100 ml:lla 50-% kyllästettyä NaCl:a, kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja väke-vöitiin tyhjössä. Kiteytettiin EtOAc/kevytbensiinistä, jolloin saatiin neulamaisia kiteitä, joiden sp. oli 141 - 142°C (27,8 g, 88 %).

Rf 0,641^ ; 0,756) .

C21H32N2°5 laskettu: c 64,29 H 8,16 N 7,14 löydetty: C 64,10 H 8,44 N 7,29.

Vaihe 6

Phe.D. Leu.OMe.HCl BOC.Phe.D.Leu.OMe:tä sekoitettiin tunnin ajan 1-n HCl:n kanssa jääetikassa. Väkevöitiin tyhjössä ja trituroitiin kevytben-siinillä, jolloin saatiin kiinteä amorfinen aine (22,57 g, 97 %), joka kuivattiin tyhjössä, ja jota ei enää puhdistettu lisää.

Rf 0,65?); 0,778); 0,552) .

12 „ ,h 7 70228

Vaihe 7

Bzl BOC.Tyr.D.Ala.Gly.Phe.D. Leu.OMe

Bzl

Liuotettiin 30,1 g BOC.Tyr.D.Ala.Gly.OH DMF:iin (125 ml), joka oli jäähdytetty -5°C:seen, ja lisättiin HOBT:a (16,29 g) ja DCI:ä (12,43 g). Yhden tunnin sekoittamisen jälkeen lisättiin Phe.D.Leu.OMe.HCl (19,82 g) ja NEt (8,35 ml) ja pidettiin +4°C:ssa 24 tunnin ajan. DCU suodatettiin ja suodos väkevöitiin tyhjössä. Jäännös liuotettiin EtOAc:iin (900 ml) ja happo/emäs-pestiin tavalliseen tapaan. Magnesiusulfaatilla kuivaamisen ja tyhjössä tapahtuneen väkevöimisen jälkeen jäännös kiteytettiin EtOAc/eetter.istä; jolloin saatiin prismamaisia kiteitä, sp. 164 - 166°C (40,36 g, 87 %) .

Rf 0,927); 0,908); 0,872); 0,531).

C.~H NcO- laskettu: C 65,20 H 7,12 N 9,06 42 55 5 9 löydetty: C 65,08 H 7,09 N 9,51.

Vaihe 9

BOC.Tyr.D.Ala.Gly.Phe.D-Leu.OH

Bzl i

Liuotettiin 34,7 g BOC. Tyr. D. Ala. Gly. Phe .D-Leu. OH MeOH:.iin (300 ml) ja hydrattiin 10-% palladium/hiilen läsnäollessa, kunnes teoreettinen määrä vetyä oli kulunut. Katalysaattori suodatettiin eroon, ja pestiin metanolilla; suodos väkevöitiin tyhjössä. Jäännös trituroitiin eetterillä ja amorfinen kiinteä aine suodatettiin eroon ja kiteytettiin EtOAc/DIPE:stä; saatiin neulamaisia kiteitä, sp.

138 - 140°C (haj.) (39,28 g, 99 %).

Rf 0,657) ; 0,608) .

C34H47N5°7 laskettu: C 60,62 H 7,58 N 10,40 löydetty: C 60,70 H 7,35 N 9,98.

Il 70228 1 3

Vaihe 10 H.Tyr.D.Ala.Gly.Phe.D-Leu.OH.HCl

Vaiheessa 9 saatu aine (30,28 g) sekoitettiin 90 minuutin ajan an.isolin (75 ml) ja 1-n HCl/HOAc:n (225 ml) seoksessa. Liuos väkevöitiin tyhjössä ja jäännös trituroitiin kuivassa eetterissä; muodostunut aine suodatettiin eroon ja kuivattiin tyhjössä. Tuote liuotettiin veteen (500 ml), suodatettiin ja uutettiin 2 x 150 ml :11a eetteriä, ja vesifaasi erotettiin ja lyofiloitiin, jolloin saatiin väritön amorfinen jauhe (25,12 g, 92 %).

Rf 0,93?); 0,808) ; 0,572) .

I'oij25 +31,5° (c = 0,53, metanolissa).

C29H39N50?.1,5 H20 laskettu: C 54,93 H 6,79 N 11,00 löydetty: C 54,96 H 6,80 N 10,95.

Peptidi voidaan puhdistaa pienistä epäpuhtauksista joko kromatografoimalla CM52:lla käyttäen gradientti-eluointia 0,005 -0,1-m NH^OAc (pH 5,1) tai HPLCrlla käyttäen Zorbax C8, joka on iso-kraattisesti eluoitu 0,1-m NH^OAc (pH 4,0) 30-% asetonitri.ili-seok-sella, molemmissa tuote lyofiloitiin ja eristettiin vapaana emäksenä.

C29H39N507·4 H20 laskettu: C 54,29 H 7,33 N 10,92 löydetty: C 54,47 H 6,92 N 11,13.

70228 14

Esimerkki 2

H. Tyr- D.Ala - Gly - Phe - D-Leu.OCP

BOC.D-Leu 0 DCI/HOBT/ p-kloorifenoni BOC.D-Leu.OCP 01-11 HCl/HOAc

Bzl w

BOC.Tyr -- D.Ala - Gly - Phe HC1 .D-Leu.OCP

f3)DCI/H0BT (90,5 %)

Bzl

BOC.Tyr - D.Ala Gly Phe - D-Leu.OCP

@H2/PdC (90-%)

BOC.Tyr - D.Ala Gly Phe - D-Leu.OCP

01-n HC1/ HOAc/anisoli (87-%)

HC1 H.Tyr - D.Ala Gly Phe - D-Leu-OCP

H.Tyr.D.Ala.Gly.Phe.D-Leu.OCP

Valmistettiin kaavion mukaisesti ja kiteytettiin eetteristä; prismamaisia kiteitä, sp. 182°C.

Rf 0,752); 0,695); /TaJ0 = +38,9° (c = 0,5).

C35H42N5°7C1 !askettu: C 61,81 H 6,18 N 10,3 löydetty: C 62,00 H 6,45 N 10,51.

li 15 70228

Esimerkki 3 H-Tyr - D-Ala -Gly--Phe-----D-Leu.OMe BOC.Gly Phe.CMe Θ H0BT/DC1 BOC.Gly - Phe.CMe © N.HCl/HOAc Z.D-Ala HCl.Gly--Phe.CMe © H0BT/DC1 (77-%) Z-D-Ala - Gly---_ Pne.OMe (T) H?/PdC (92-%)

Bzl BOC.Tyr HCl.D-Ala Gly - Phe.CMe

Bzl ©) DC 1 (53-%) BOC.Tyr - D-Ala Gly - Pne.OMe © H0/PdC (90-%)

' <L

BOC.Tyr - D-Ala Gly -- Phe.CMe (7) MaOH/MeOH (93-%) BOC.Tyr - D-Ala Gly _ Phe.CM D-Leu.OMe @ HOBT/DCl (82-%) BOC.Tyr - D-Ala Gly - Phe - D-Leu.OMe © 1-n HCl/HOAc (86-%) H.Tyr---D-Ala--Gly - Phe--D-Leu.OMe H.Tyr.D-Ala.Gly.Phe.D-Leu.OMe.HC1

Valmistettiin ylläolevan kaavion mukaisesti ja eristettiin amorfisena jauheena lyofiloimalla.

Rf O,928); 0,632).

/ +39,6° (c = 0,51, metanolissa).

C30H41N5O7'HCl,H2O laskettu: c 56,47 H 6,90 N 10,98 löydetty: C 56,17 H 6,97 N 10,72.

16 70228

Esimerkki 4

Liuotettiin 50 mg H.Tyr.D-Ala.Gly.Phe.D.Leu.OH 1-n HCl:.iin metanolissa (4 ml) ja annettiin seistä huoneen lämpötilassa 48 tunnin ajan. Väkevöitiin tyhjössä ja trituroitiin eetterissä, jolloin saatiin amorfinen metyyliesterihydrokloridi (kvantitatiivinen saanto) , jonka oli sama kuin tunnetulla näytteellä.

Esimerkki 5 H.Tyr - D.Ala- Gly - Phe - D.Leu.NHEt BZ1 BOC.Tyr - D.Ala - Gly - Phe - D.Leu.OMe B-r 1 /-\ (ONH~Et BOC.Tyr --- D.Ala — Gly —--Phe . . D.Leu.NHEt

nft„ (2)H2/PdC

BOC.Tyr D.Ala —- Gly —--Phe - D.Leu.NHEt (l) 1-n.HCl/HQAc/anisoli (87-%) H· 'ΥΓ--D.Ala--- Gly -- Phe _ D.Leu.NHEt

Vaihe 1 Bzl - 1

Liuotettiin 2,68 g BOC.Tyr.D.Ala.Gly.Phe.D-Leu.OMera meta-nolin (25 ml) ja etyyliamiinin (100 ml) seokseen ja sekoitettiin suljetussa putkessa huoneen lämpötilassa 24 tuntia. Liuos väkevöitiin tyhjössä ja jäännös kiteytettiin isopropanolista, jolloin saatiin prismamaisia kiteitä, sp. 218 - 220°C (2,06 g).

Rf 0,501).

Ο,οΗγοΝ,Ο. laskettu: C 65,65 H 7,38 N 10,69 4 J Do O ö löydetty: C 65,93 H 7,63 N 10,58.

Vaihe 2

Vaiheessa 1 saatu aine hydrattiin metanolissa (100 ml) 10-% palladiumin (1 g) läsnäollessa. Suodatettiin, haihdutettiin kuiviin ja kiteytettiin uudelleen isopropanolista; saatiin prismamaisia kiteitä, sp. 212 - 213°C (haj.) (1,9 g).

Rf 0,451) .

C ,HC „N 0o laskettu: C 62,07 H 7,47 N 12,07 36 bz 6 o löydetty: C 61,88 H 7,78 N 11,74.

1] 70228

Vaihe 3

Suojaryhmä poistettiin kohdassa 2 saadusta aineesta sekoittamalla 1 tunnin ajan 1-n HCl/HOAc:n (100 ml) kanssa anisolin (10 ml) läsnäollessa. Väkevöitiin, trituroitiin eetterissä, ja lyofiloi- ti.in, jolloin saatiin amorfinen kiinteä aine (1,56 g, 87 %).

21 5) 4)

Rf 0,60^ ; 0,613' ; 0,93*' / +46,5° (c = 0,5, metanolissa) C.,H. ,Nr0r.HC1.1 ,5 Ho0 laskettu: C 56,40 H 7,30 N 12,70 I 3 4 4 6 6 2 löydetty: C 55,97 H 7,29 N 12,31.

Claims (3)

70228 18

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen enkefaliini-analogi-peptidin, jolla on kaava H- Tyr-D-Ala-Gly-Phe-D-Leu-R^ I 2 3 4 3 jossa R on NHR tai OR , jolloin R on 1 - 4 hiiliatomia sisältävä 4 alkyyliryhmä, ja R on vety, 1-4 hiiliatomia sisältävä alkyyliryh-mä tai halogeenifenyyli, tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan (peptidi karb-oksylaattianionina ja farmaseuttisesti hyväksyttävä kationi) valmistamiseksi, tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän happoadditiosuo-lan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) reagenssi, jonka kaava on Η-Υ1-OH II jossa Y on -Tyr- tai osittainen radikaalisekvenssi, jonka N-loppu-päässä on -Tyr- ja joka siitä eteenpäin on identtinen mainitun peptidin kanssa, saatetaan reagoimaan kaavan 2 2 H-Y -R III 2 mukaisen reagenssin kanssa, jossa kaavassa R merkitsee samaa kuin 2 edellä ja Y on osittainen radikaalisekvenssi, joka on identtinen edellä määritellyn tuotepeptidin loppuosan kanssa, jolloin reagens-sit II ja III ovat mahdollisesti suojattuja ja/tai aktivoituja, missä ja kun se on tarkoituksenmukaista, ja jolloin, mikäli se on tarkoituksenmukaista, poistetaan suojaryhmät, tai b) kun halutaan valmistaa sellainen kaavan I mukainen pep-2 3 tid.i, jossa R on NHR , vastaava kaavan I mukainen peptidi, jossa 2 4 4 R on OR , jossa R on 1 - 4 hiiliatomia sisältävä alkyyliryhmä, saatetaan reagoimaan 1 - 4 hiiliatomia sisältävän monoalkyyliamiinin kanssa, tai II ,9 70228 c) kun halutaan valmistaa sellainen kaavan I mukainen pep-2 4 4 tidi, jossa R on OR , jossa R on 1-4 hiiliatomia sisältävä alk- yyliryhmä tai halogeenifenyyli, vastaava kaavan I mukainen peptidi, 2 4 4 jossa R on OR , jossa R on vety, esteröidään, jonka jälkeen saatu tuote haluttaessa tai tarvittaessa muutetaan vapaaksi emäkseksi tai farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi tai happoadditiosuolaksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä peptidin valmistamiseksi, jonka kaava on H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-D-Leu-OH tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan tai happoadditiosuolan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että reagenssi, jonka kaava on H-Y1-OH II jossa Y on -Tyr- tai osittainen radikaalisekvenssi, jonka N-loppu-päässä on -Tyr- ja joka siitä eteenpäin on identtinen mainitun peptidin kanssa, saatetaan reagoimaan kaavan H-Y2-OH III 2 mukaisen reagenssin kanssa, jossa Y on osittainen radikaalisekvens-si, joka on identtinen edellä mainitun peptidin loppuosan kanssa, jolloin reagenssit II ja III ovat mahdollisesti suojattuja ja/ta.i aktivoituja, missä ja kun se on tarkoituksenmukaista, ja jolloin tarvittaessa poistetaan suojaryhmät, jonka jälkeen saatu tuote tarvittaessa muutetaan vapaaksi emäkseksi tai farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi tai happoadditiosuolaksi -

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä peptidin valmistamiseksi, jonka kaava on H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-D-Leu-NHC2H5 20 7 0 2 2 8 tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän happoadditiosuolan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että peptidi, jonka kaava on H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-D-Leu-OR4 4 jossa R on 1 - 4 hiiliatomia sisältävä alkyyliryhmä, saatetaan reagoimaan etyyliamiinin kanssa, jonka jälkeen saatu tuote tarvittaessa muutetaan vapaaksi emäkseksi tai farmaseuttisesti hyväksyttäväksi happoadditiosuolaksi. 70228 21