FI75175B - Process foer framstaellning av n-karboxialkylprolin innehaollande tripeptider. - Google Patents

Description

751 75

Prosessi N-karboksialkyyliproliinia sisältävien tripepti-dien valmistamiseksi Tämä keksintö käsittää valmistustavan uusien kemiallisten yhdisteiden ryhmän valmistamiseksi, joilla on biologista vaikutusta, ja joiden rakenteissa on tripeptidiketju, jossa kahta prolyylipääteryhmää erotaa kytkentäyksikkö. Toisessa prolyyliyksikössä on varsinainen N-(happofunktionaalinen alkyyli)-substituentti. Tällä valmistustavalla valmistettujen yhdisteiden biologisena vaikutuksena on lisätä munuaisten verenkiertoa ja saada aikaan diureettista vaikutusta. Sellaisenaan yhdisteet ovat käyttökelpoisia verenpaineen hoitamisessa tai munuaistoiminnan parantamisessa.

K.T. Poroshin et ai,. Chemical Abstracts, 53^ 21693h kuvaili karbobentsoksi-L-propyyliglysyyli-L-proliinin käyttöä välituotteena L-prolyyliglysyyli-L-proliinin valmistamiseksi; kuitenkaan tämä referenssi ei kuvaillut varsinaista N-karboksialkyyli-substituenttia eikä kriittistä keskiryhmää, jotka molemmat ovat luonteenomaisia näiden uusien yhdisteiden rakenteille. Poroshin ei myöskään kuvaillut minkään valmistamansa yhdisteen biologista vaikutusta.

Tämän keksinnön yhdisteet sen sijaan poikkeavat aikaisemman kaltaisista yhdisteistä kahdella rakenteellisella parametrillä.

EPO-hakemus 12 401 kuvailee tiettyjä karboksialkyylidipep-tidejä, jotka ovat verisuonia muuttavia entsyymi-inhi-biittoreita. EPO-yhdisteet poikkeavat tämän keksinnön yhdisteistä toimintamekanismiltaan samoin kuin kemialliselta rakenteeltaan. N-karboksialkyylisubstituentit eivät ole substituoituneet EPO-dipeptidien prolyyliyksikköön.

Kuten yllä esitettiin, tällä valmistustavalla valmistettuja uusia kemiallisia yhdisteitä luonnehditaan siten, että 2 75175 niissä on tripeptidirakenteita, jotka ovat prolyyli-kytkentä-ryhmä-proliineja, joissa on happofunktionaalinen alkyylisubs-tituentti prolyylirenkaan vapaassa N-atomissa. Rakenteet sisältävät siksi kaksi happoryhmää, joista toinen on amfoteeri-nen.

Esimerkkinä tämän keksinnön tuotteista ovat kaavassa I esitetyt tuotteet: I I 8 /n xn yJ i ai k

R CO H

2 jossa: R on happoryhmä, kuten karboksyyli (-C0 H); alk on 1-5 hiilen suora tai haarautunut aikyleeniketju, joka ei ole etylideeni (=CH-CH ); A on kytkevä aminohappoyksikkö yhdistyneessä peptidimuodossa, kuten CH I 3 D- tai L-Ala (-NH-CH-C0-); CH-> I 3 D- tai L-3-metyyl i-B-Ala (-NH-CH-CH^CO-); C H 16 5 D- tai L- g-fe nyyli — 3—AI a (-NH-CH-CH^-CO-); D- tai L-3-Ala (-NH-CH -CH -C0-).

2 2 Tämän keksinnön alaryhmä käsittää ne kaavan I yhdisteet, joissa A on substituoitunut tai substituoimaton 3-Ala. Kaavan I eräs käyttökelpoinen muoto on se, jossa R on karboksyyli, alk on metyleeni ja A on 3-Ala. Mieluummin jokaisen yllä mainitun yhdisteryhmän aminohappoyksikön konfiguraatio on L. N-karboksimetyyli-L-prolyyli- 3-aianyyli-L-proli i ni sulfaatti on hyödyllinen yhdistemuoto tässä keksinnössä.

li 3 75175 Jäljempänä kuvattavien nukutettujen koirien munuaisten tar-kastusmuistiinpanoissa N-karboksimetyy1i-L-prolyyli-L-lysyy1i-L-proliini, N-karboksi metyy1i-prolyyli-glysyy1i-L-proli i ni ja N-(1-karboksietyyli)-L-prolyyli- 3-aianyyli-L-proli i ni oii vat epäaktiivisi a munuaisverisuoni en laajentajina tarkastusmuis-tiinpanojen alkutestien aikana. Tämä kuvaa kytkentäryhmän samoin kuin prolyylipääteyksikön N-alkyylisubstituentin kriittistä luonnetta.

Nämä yhdisteet sisältävät erilaisia farmaseuttisesti hyväksyttäviä keksinnön suolamuotoja, kuten niitä, jotka on muodostettu ei-toksisten happojen kanssa, jotka ovat N-karboksiai -kyyliprolyylifragment!n emäksisessä N-atomissa, tai niitä, jotka on muodostettu siten, että niissä on farmaseuttisesti hyväksyttäviä kationeja yhdistyneenä anionisten happoryhmien kanssa. Edelliset käsittävät sulfaatin, hydroklori di n , fosfaatin, hydrobromidi n, etaanidisulfonaatin tai metaanisulfo-naatin. Jälkimmäset käsittävät natriumin, kaliumin, kalsiumin ja näiden kaltaisia suoloja vahvojen emästen kanssa. Alka-1imetal1isuolat ovat käyttökelpoisimpia välituotteina mieluummin kuin lopputuotteina, vaikka niitä voidaan käyttää jommalla kummalla tavalla.

Suolat ovat muodostuneet kaavan I yhdisteiden reagoidessa sopivassa liuottimessa sopivan hapon tai emäksen kanssa käyttäen reaktio-olosuhteita, jotka ovat alalle harjaantuneelle hyvin todennäköisiä. Tavallisesti ylimäärä epäorgaanista happoa tai emästä reagoi tämän keksinnön yhdisteen kanssa, joka on liuotettu veteen tai sopivaan orgaaniseen liuottimeen, kuten vesipitoiseen etanoliin. Tämän keksinnön yhdisteet muodostavat usein solvaatteja, kuten hydraatteja tai alempia alkoholaat-te ja.

Hapon additiosuolat, kuten sulfaatti, ovat tämän keksinnön yhdisteiden käyttökelpoisimpia muotoja, kuten ovat perustri-pepti di t.

75175

Edelleen kaavan I dihappoja voidaan käyttää esi 1ääkeaineen muodossa sellaisena kuin amidina, alemman aikyyliesteri n johdannaisena koostuen 1-5 hiilestä, joista jokaisessa on mainitut aikyyliryhmät, tai bentsyyliesterinä.

Näitä yhdisteitä valmistetaan tämän keksinnön valmistusmenetelmällä seuraavasti: A.

I—I + I ! 2 —> kN/-cv i i

ai k A

il 13

R R

II III

O-*-·-G-* ai k i 1 2

R C02R

IV

A^on kuten edellä määriteltiin.

R on karboksyylin suojattu muoto, kuten bentsyyliesteri 2 tai alemman alkyylin esteri, R on karboksyyliä suojaava 3 ryhmä, kuten bentsyyli tai alempi alkyyli, ja R on kytkevän aminohappoyksikön amino- (-NH ) tai N-metyy1iaminoryhmä (-NH).

4h 3 N-(happofunktTonaalinen aikyyli)-proliini (II) siinä muodossa, joka suojaa sivuketjun happoryhmää, reagoi proliinia

II

5 75175 sisältävän dipeptidin kanssa, jonka päätehapporyhmä on suojattu (III) , antaen tämän keksinnön valmistustavalla tuotteita suojattujen dikarboksyylihappojen muodossa (IV). Amidisidoksen muodostamisessa reaktion kuluessa aminohappoja dipeptidi-lähtöaineiden välille käytetään mitä tahansa peptidejä kytkevän reaktion reaktio-olosuhteita. Erityisen käyttökelpoinen on aminohappoyksikön (II) reaktio dipeptidin (III) kanssa asyloinnin edistäjän läsnäollessa, sellaisen kuin karbodi-imidi,, esimerkiksi disykloheksyyli-karbodi-imidi. Reaktio tehdään orgaanisessa liuottimessa, esimerkiksi tetrahydrofuraanissa, dimetyyliasetamidissa tai dimetyyliformamidissa, käyttäen kohtuullisia lämpötiloja, kunnes reaktio on täydellinen. Huoneen lämpötilaa 1-18 h käytetään monissa tapauksissa.

Muut käytetyt kytkentämenetelmät sisältävät isoksatsolium-johdannaiset, l-etoksikarbonyyli-2-etoksi-l,2-dihydrokino-liinin, fosfoniumjohdannaisen, N-karboksianhydridijohdannaiset tai N-hydroksisukkinimidiesterijohdannaiset. Lisää erityisiä yksityiskohtia erilaisista kytkentämenetelmistä on kuvailtu teoksessa "Peptide Synthesis", Bodanszky,

Wiley (1976) kappaleessa viisi.

Suojaavat esteriryhmät siirretään sitten tavanomaisilla reaktioilla, jotka eivät vaikuta amidisidoksiin, kuten käyttämällä katalyyttista hydrausta O-bentsyyliryhmiin tai käyttämällä hallittua alkalihydrolyysia, kuten käyttämällä bariumhydroksidia.

Vaihtoehtoisesti dipeptidilähtöaine voidaan muodostaa N-(happofunktionaalinen alkyyli)-proliinista (II), joka on kondensoitunut kytkentäyksikön (A) kanssa. Tämä dipeptidi reagoi sitten, kuten yllä kuvattiin, proliinin kanssa, jonka karboksyyliryhmä on suojattu, kuten bentsyylin tai alemman esterin muodossa. Sen jälkeen suojaavat ryhmät siirretään pois ja valmistetaan haluttuja suoloja.

6 751 75

Yhdisteitä valmistetaan myös käyttämällä kiinteän faasin tekniikkaa, mitä yleensä käytetään peptidejä valmistettaessa .

Tämän keksinnön yhdisteillä on farmakodynaamista vaikutusta, ja vaikuttaessaan munuaisiin ne ovat käyttökelpoisia farmaseuttisia yhdisteitä. Erityisemmin ne lisäävät munuais-verenkiertoa tai vähentävät munuaisverisuonien resistanssia. Niiden vaikutus munuaistoiminnan parantamisessa osoittautuu usein olevan kumulatiivinen. Niillä on myös diureet-tista vaikutusta. Nämä yhdisteet ovat siksi suhteellisen pitkävaikutteisia verenpainetta alentavia tai munuaistoimintaa parantavia aineita. Yllättäen tämän keksinnön yhdisteillä on vaikutusta joko suun kautta tai parenteraali-sesti antamisen jälkeen.

Kaavan I yhdisteiden biologinen vaikutus osoitettiin antamalla yhdisteitä infuusiona nukutetuille koirille ja mitaten keskimääräinen valtimoverenpaine, munuaisverenkierto, munuaisverisuonien resistanssi ja sydämen lyöntinopeus koejärjestelyllä, jota selvitetään yksityiskohtaisesti US-patentissa n:o 4 197 297. Yleisesti mainiten yhdisteet antoivat alentunutta munuaisverisuonien resistanssia ja lisääntynyttä munuaisten verenkiertoa annoksissa, jotka vaihtelivat 1/3 - 1/100 dopamiinin annoksista tässä koejärjestelyssä. Edustavia, erityisiä lopputuloksia on sisällytetty esimerkkeihin.

Yhdisteet osoittavat vaihtoehtoisesti biologista vaikutusta itsesyntyisesti liiallista verenpainetta omaavissa rotissa (SHR). Tässä kokeessa koiraspuoliset Okimato-Aoki-suvun itsesyntyisesti liiallista verenpainetta omaavat rotat, joiden ikä on 16-19 viikkoa, kiinnitetään, ja sitten seu-raavana iltapäivänä annetaan ensimmäinen testiyhdisteen annos yhdessä 25 ml/kg p.o. normaalin saliinikuormituksen kanssa. Eläimet asetetaan sitten metaboliahäkkeihin, ja virtsaa kerätään kolme tuntia analyysia varten. Epäsuora

II

7 751 75 systolinen verenpaine ja sydämen lyöntinopeus mitataan häntäkalvosimella. Annetaan samanlainen toinen testiyhdis-teen annos. Kahden tunnin kuluttua mitataan jälleen verenpaine ja sydämen lyöntinopeus. Näytevhdiste annetaan tavallisesti p.o. tai i.p. saliinissa, jossa on 0,02 % asorbii-nihappoa. Tässä kokeessa tämän keksinnön edustamat lääkeaineet osoittivat diureettista vaikutusta.

Esimerkiksi (N-karboksimetyyli)-L-prolyyli-B-alanyyli-L-proliinihemisulfaatti i.p. osoitti merkittävää lisääntymistä Na®:n tai I^:n tai virtsan erittymisessä 25:ssä ja 50:ssä mg/kg i.p. Sillä oli RVR-ED^^ 12 ^ug/kg nukutettujen koirien munuaisten tarkastuspöytäkirjoissa (dopamiinilla oli 3,5 ^ug/kg). Sillä ei ollut suonia muuttavaa, entsyymejä inhiboivaa vaikutusta 10-kertaisena munuaisiin vaikuttavasta annoksesta. Tämä yhdiste ei myöskään kiihdyttänyt tai vastustanut dopamiinille herkkää adenylaattisyklaasisys-teemiä in vitro, eikä se ollut aktiivinen sammakon rakon anti-ADH-näytteessä. Yhdiste osoitti heikkoa sydämen harva-lyöntisyysvaikutusta.

Yllä kuvatut uudet kemialliset yhdisteet liitetään annos-yksikön muotoon, kuten kapseleiksi, tableteiksi tai injektoitaviksi valmisteiksi, mitkä ovat käyttökelpoisia munuaistoiminnan parantamiseksi, korkean verenpaineen hoitamiseksi tai diureesin voimistamiseksi. Farmaseuttinen kantaja-aines, jota käytetään annosyksikköä varten, voi olla esimerkiksi joko kiinteä tai liuos. Esimerkkejä kiinteistä kantaja-aineista ovat laktoosi, terra alba, sakkaroosi, talkki, gelatiini, agar, pektiini, akaasia, magnesiumstearaatti tai steariinihappo. Esimerkkejä nestemäisistä kantaja-aineista ovat siirappi, maapähkinäöljy, oliiviöljy tai vesi. Samoin kantaja-aines tai laimennin voi sisältää mitä tahansa viivytysainetta, jotka alalla hyvin tunnetaan, kuten glyseryylidistearaatin glyseryylimonostearaattia yksin tai vahan kanssa. Sellaisia pitkitetyn vaikutuksen tuotteita samoin kuin johdannaisia, jotka voivat asteittain meta- 8 751 75 boloitua aktiivisiksi perusmuodoiksi, voidaan käyttää pidentämään tämän keksinnön yhdisteiden ainutlaatuista biologista vaikutusta, mikäli se nähdään tarpeelliseksi.

Voidaan käyttää farmaseuttisten muotojen laajaa valikoimaa. Siten, jos käytetään kiinteää kantaja-ainesta suun kautta annettavaksi, valmiste voi olla tabletoitu, asetettu jauheena kovan gelatiinikapselin sisään, peräpuikot tavanomaisen tai pitkitetyn vaikutuksen pellettien muodossa, lääke-napin tai tabletin muodossa. Kiinteän kantaja-aineen määrä vaihtelee laajasti, mutta mieluummin se on noin 25 mg:sta 1 g:aan. Jos käytetään nestemäistä kantaja-ainesta, on valmiste siirapin, emulsion, pehmeän gelatiinikapselin, steriilin injektoitavan liuoksen, kuten ampullin, tai vesipitoisen tai vedettömän nestemäisen suspension muodossa.

Farmaseuttiset valmisteet tehdään farmaseuttisen kemian tavnaomaisen tekniikan mukaisesti käsittäen sekoituksen, rakeistamisen ja puristamisen, kun se on tarpeen tablettimuotoja varten, tai sekoittamisen, täyttämisen ja ainesten liuottamisen, kun se on tarkoituksenmukaista toivotun tai parenteraalisen lopputuotteen saamiseksi.

Näiden yhdisteiden annokset farmaseuttisena annosyksikkönä ovat tehokkaita, ei-toksisia määriä valittuna alueelta 10-350 mg aktiivista tripeptidiä, mieluummin 50-200 mg. Valittu annostus annetaan hoidon tarpeessa olevalle potilaalle määrätyissä kliinisissä olosuhteissa 1-5 kertaa päivässä suun kautta, injektiona tai infuusiona. Parenteraa-lista lääkkeen antamista, missä käytetään alempaa annos-telualueelta valittua annosta sinällään tai yhdistettynä, pidetään parempana; silti antamista suun kautta 1-5 kertaa päivässä suurempina annoksina käytetään myös, kun se on potilaalle miellyttävämpää.

Alalla harjaantunut havaitsee, että tämän keksinnön yhdisteet voivat olla eri konfiguraatioissa, kuten optisina

II

9 751 75 isomeereinä tai niiden seoksina. Isomeerisiä yhdisteitä valmistetaan helposti käyttämällä valitun konfiguraation omaavaa aminohappoa esimerkkien kemiallisiin reaktioihin, jotka kuvaavat tätä keksintöä, tai isomeerisen seoksen kromatograafisella erottamisella korkean paineen nestekroma-tografiällä.

Seuraavien esimerkkien tarkoituksena on opettaa tämän keksinnön uusien yhdisteiden valmistusta ja käyttöä, mutta tarkoituksena ei ole rajata sen puitteita. Kaikki lämpötilat ilmoitetaan Celsiusasteina.

Esimerkki 1

Seosta, jossa oli 6,0 g (0,025 moolia) L-proliinin bentsyy-liesteriä, 4,7 g (0,025 moolia) N-tert.-butoksikarbonyyli-L-alaniinia, 6,75 g (0-05 moolia) 1-hydroksibentsotriatso-lia, 3,2 ml (2,82 g, 0,025 moolia) N-etyylimorfoliinia ja 65 ml kuivaa tetrahydrofuraania, jäähdytettiin, suodatettiin ja lisättiin seokseen, jossa oli 5,15 g (0,025 moolia) disykloheksyylikarbodi-imidiä ja 10 ml tetrahydrofuraania. Seosta sekoitettiin 0°:ssa 30 min ja sitten 25°:ssa 18 h. Reaktioseos suodatettiin, suodos haihdutettiin, mikä antoi jäännöksen, joka liuotettiin etyyliasetaattiin. Liuos pestiin 1-10 %:sella etikkahapolla, vedellä, 5 %:sella nat-riumbikarbonaattiliuoksella ja suolavedellä, sitten kuivattiin vedettömällä magnesiumsulfaatilla ja konsentroitiin, mikä antoi 9,8 g N-tert.-butoksikarbonyyli-L-alanyyli-L-proliinin bentsyyliesterin raakatuotetta (t-boc).

Seoksen, jossa oli 2 g t-boc:ia, 3,0 g trifluorietikka-happoa ja 15 ml kuivaa metyleenikloridia, annettiin reagoida huoneenlämmössä 2 tuntia, sitten se haihdutettiin alipaineessa, mikä antoi trifluoriasetaattisuolan raakatuotteen. Suola liuotettiin eetteriin ja tehtiin happamaksi eetteri-pitoisella suolahapolla, mikä antoi 1,15 g valkeaa, kiinteää L-alanyyli-L-proliinin bentsyyliesterihydrokloridia, sp. 162-164°.

75175 10

Noin 500 mg 10 %:sta palladioitua hiiltä, mikä oli kostutettu vedellä, lisättiin liuokseen, jossa oli 16,5 g (0,06 moolia) N-karboksimetyyli-L-proliinibentsyyliesteriä /R. Adams, J. Am. Chem. Soc. £1, 5803 (1959]_/ ja 50 ml etanolia. Alhaisen paineen hydrauslaitteessa vetyatmosfäärissä ravistelun jälkeen seos suodatettiin. Suodos haihdutettiin. Sen jälkeen kun etanolia oli lisätty ja haihdutettu, liuotettiin siirappimainen jäännös 1:1 tolueeni-eetteriin ja tehtiin happamaksi kylmällä eetteripitoisella suolahapolla. Valkea kiinteä tuote erotettiin ja pestiin eetterillä, mikä antoi 13,8 g N-karbometoksimetyyli-L-pro-liinihydrokloridin raakatuotetta, sp. 191-193°.

Seos, jossa oli 2,23 g (0,01 moolia) N-karbometoksimetyyli-L-proliinihydrokloridia, 3,13 g (0,01 moolia) L-alanyvli-L-proliinin bentsyyliesterihydrokloridia, 2,70 g (0,02 moolia) 1-hydroksibentsotriatsolia, 2,3 g (0,02 moolia) N-etyyli-morfoliinia ja 40 ml kuivaa tetrahydrofuraania, jäähdytettiin jää/vesihauteessa ja sitten annettiin reagoida 2,06 g (0,01 moolia) disykloheksyylikarbodi-imidin kanssa huoneenlämpötilassa 17 h. Kiinteät aineet erotettiin suodattamalla. Suodos laimennettiin etyyliasetaatilla ja pestiin 3 kertaa 50 mlrlla 1,5 %:sta etikkahappoa, vedellä, 5 %:sella nat-riumbikarbonaattiliuoksella ja suolavedellä. Kuivattu orgaaninen kerros haihdutettiin, mikä antoi 4,3 g keltaista siirappia. Siirappi laskettiin silikageelipylvään läpi ja eluoitiin metyleenikloridilla, 1 %:sella metanoli/metylee-nikloridilla ja 1-1/2 %:sella metanoli/metyleenikloridilla, mikä antoi 2,1 g (47 %) N-karbometoksimetyyli-L-prolyyli-L-alanyyliproliinin bentsyyliesteriä, halutun lopputuotteen esilääkeainetta.

Tämä aine, 2,1 g, 30 ml:ssa metanolia lisättiin seokseen, jossa oli 5,0 g batriumhydroksidihydraattia 40 ml:ssa vettä. 4 tunnin sekoittamisen jälkeen laskettiin hiilidioksidi-kaasua seoksen läpi bariumkarbonaatin saostamiseksi. Väritön suodos haihdutettiin, mikä antoi valkeaa, kiinteää

II

11 751 75 ainetta 1,25 g (78 %) haluttuna tripeptidituotteena.

Yksi näyte (300 mg) uudelleenkiteytettiin metanoli/etyyli-asetaatilla, mikä antoi valkean, kiinteän aineen, sp.

270° (hajoaa), joka on bariumsuola.

Puhdistamaton kiinteä aine (0,9 g) liuotettiin vedessä.

Seos suodatettiin. Suodoksen pH asetettiin 3,5:een laimealla rikkihapolla. Bariumsulfaatti erotettiin suodattamalla. Suodos haihdutettiin, mikä antoi N-karboksimetyvli-L-pro-lyyli-L-alanyyli-L-proliinisulfaattia, 190-196° (hajoaa).

Analyysi laskettu yhdisteelle C^H^N^Og* 1/4 Η230^·1/2 H20: C 48,06; H 6,59; N 11,20. Havaitut: C 48,48, 48,21; H 6,69, 6,78; N 10,80, 10,74 /~q_7p5= (C,l, 1:1 CH30H-H20) -132,2°.

Munuaisverisuonien laajentamisen aktiivisuuskokeessa 3 nukutetulla koiralla bariumsuola antoi 21,7 %:n lisäyksen munuaisverenkiertoon ja 15 %:n vähentymisen munuaisverisuonien resistanssiin 30:ssa ^ug/kg/min.

Esimerkki 2

Seosta, jossa oli 6,0 g (0,025 moolia) L-proliinihydroklo-ridin bentsyyliesteriä, 6,75 g (0,05 moolia) 1-hydroksi-bentsotriatsolia, 3,2 ml (0,025 moolia) N-etyylimorfoliinia, 6,63 g (0,025 moolia) L-tert.-butoksikarbonyylifenyyliala-niinia, 5,15 g (0,025 moolia) disykloheksyylikarbodi-imidiä ja 35 ml kuivaa tetrahydrofuraania, sekoitettiin 0°:ssa vähän aikaa ja sitten 25°:ssa 4 h. Kantaliuos erotettiin ja haihdutettiin. Jäännös liuotettiin etyyliasetaatissa ja laimeassa suolahapossa. Kerrokset erotettiin. Vesikerros ekstrahoitiin etyyliasetaatilla. Yhdistetyt orgaaniset kerrokset pestiin laimealla suolahapolla, vedellä, 5 %:sella natriumbikarbonaattiliuoksella ja suolavedellä. Orgaaninen kerros kuivattiin ja haihdutettiin, mikä antoi 10,3 g (91 %) N-tert.-butoksikarbonyyli-L-fenyylialanyyli-L-pro-liinin bentsyyliesteriä.

12 75175 Tämän aineen (7,0 g) annettiin reagoida liuoksen kanssa, jossa oli 10 ml trifluorietikkahappoa, 40 ml kuivaa metylee-nikloridia ja 4 ml 1,3-dimetoksibentseeniä, 25°:ssa 2 h. Toimittaessa kuten yllä kuvattiin saatiin 5,57 g L-fenyyli-alanyyli-L-proliinin bentsyyliesterin hydrokloridia.

Bentsyyliesteri (2,23 g, 0,01 moolia) reagoi 3,89 g N-karbometoksimetyyli-L-proliinihydrokloridin, 2,70 g (0,02 moolia) 1-hydroksibentsotriatsolin, 4,0 ml N-etyylimorfo-liinin, 2,06 g (0,01 moolia) disykloheksyylikarbodi-imidin ja 40 ml kuivan tetrahydrofuraanin kanssa 25°:ssa 17 h, kuten yllä kuvattiin, mikä antoi silikageelillä puhdistettua N-karbometoksimetyyli-L-prolyyli-L-fenyylialanyyli-L-pro-liinin bentsyyliesteriä.

Tämä diesterin esilääkeaine (1,1 g, 2,1 mm) liuotettiin 30 ml:aan metanolia ja annettiin reagoida lämpimän liuoksen kanssa, missä oli 5,0 g batriumhydroksidia 40 ml:ssa vettä. Seosta sekoitettiin 25°:ssa 4 h, ja sitten lisättiin ylimäärin hiilidioksidia. Bariumkarbonaatti poistettiin suodattamalla käyttäen suodatusapuainetta. Suodos haihdutettiin, ja jäännös tehtiin atseotroopiksi etanolilla, mikä antoi kuten yllä kuvattiin, 0,72 g (82 %) N-karboksi-metyyli-L-prolyyli-L-fenyylialanyyli-L-proliinin barium-suolaa ja sitten 0,89 g sen hemisulfaattisuolaa, sp. 145-148°.

Analyysi laskettu yhdisteelle *1/2-Ba·Η20: C 51,15; H 5,31; N 8,52; Ba 13,92. Havaitut: C 51,47, 51,64; H 5,27, 5,50 ; N 5,28, 5,28; Ba 12,60 /V7q5 = (C,l, H20) -43,9°.

Analyysi laskettu yhdisteelle ' 1/2 : C 54,07; H 6,04; N 9,01. Havaitut: C 53,71, 53,64; H 5,90, 5,94; N 8,82, 8,91.

Tämä sulfaatti lisäsi munuaisverenkiertoa 30 ja 300 ^ug/kg/ min:ssa. Bariumsuola ei ollut aktiivinen nukutettujen koirien tarkastustestien parametrien sisällä.

li 75175 13

Esimerkki 3 Käyttäen yllä mainittuja menetelmiä valmistettiin kuvatulla asyloinnilla 7,6 g N-tert.-butoksikarbonyyli-8-alanyyli-L-proliinin bentsyyliesteriä käyttäen disykloheksyylikarbodi-imidiä. Suojaryhmä siirrettiin käyttäen trifluorietikka-happoa, mikä antoi β-alanyyli-L-proliinin bentsyyliesteri-hydrokloridia. Tämä yhdiste (6,39 g, 0,02 moolia) konden-soitiin 2,23 g (0,01 moolia) N-karbometoksimetyylipro-liinihydrokloridin kanssa reagoimalla 2,7 g (0,02 moolia) 1-hydroksibentsotriatsolin, 12 ml N-etyylimorfoliinin, 2,06 g (0,01 moolia) disykloheksyylikarbodi-imidin läsnäollessa 50 mlrssa kuivaa tetrahydrofuraania huoneenlämpö-tilassa 17 h. Tuote oli 1,9 g siirappimaista N-karbometoksi-metyyli-L-prolyyli-β-alanyyli-L-proliinin bentsyyliesteriä. toivotun dihapon esilääkeaineen esimolekyyli.

Diesteri (1,75 g, 3,9 mmoolia) hydrolysoitiin käyttäen bariumhydroksidia ja metanolia, ja sitten sitä käsiteltiin rikkihapolla, mikä antoi 1,2 g valkoista, kiinteää N-karboksimetyyli-L-prclyyli-β-alanyyli-L-proliinisulfaattia.

Analyysi laskettu yhdisteelle ^^23^0^. . 1/2 I^SO^: C 46,15; H 6,20; N 10,76, Havaitut: C 45,81, 46,14; H 6,50 , 6,52; N 9,94, 10,22; 7^5 = (0,8, H20) -70,4°.

Itsesyntyisesti verenpainetta omaavien rottien kokeissa (n = 3) 25 mg/kg:ssa i.p. yhdiste antoi seuraavat tulokset diureettisena luontaispitoisuutena: Na® 676,04 (vertailu 126,76); 1^242,53 (85,12); virtsaa, ml/rotta, 16(3). Se myös lisäsi munuaisverenkiertoa ja vähensi munuaisverisuo-nien resistanssia kahdella nukutetulla koiralla 3, 30 ja 300 yug/kg/min:ssa. Sekundaarisessa testissä kolmella koiralla tällä yhdisteellä oli ED.^ 12 ^ug/kg verrattuna dopamiinin 3,5 ^,ug/kg:aan (i.v.).

Esimerkki 4 Käyttäen samoja edellä kuvattuja reaktioita 7,23 g (0,03 moolia) etyyli-β -bromipropionaattia ja 7,33 g (0,04 moolia) _____ - 14 751 75 proliinibentsyyliesterihydrokloridia antoi N-(2-karbetok-si)-etyyli-L-proliinin bentsyyliesteriä (4,6 g, 50,2 %).

Tämä yhdiste (4,6 g, 0,015 moolia) hydrattiin palladoidul-la hiilellä, joka antoi 2,96 g (78 %) N-(2-karbetoksi)-etyyli-L-proliinin hydrokloridia, sp. 169-171°. Tämä yhdiste (2,42 g, 0,0096 moolia) kondensoitiin 2,25 g (0,0072 moolia) L-alanyyli-L-proliinin bentsyyliesterihydroklori-din kanssa disykloheksyylidi-imidi-menettelyllä, joka antoi 0,8 g N-(2-karbetoksi)-etyyli-L-prolyyli-L-alanyyli-L-proliinin bentsyyliesteriä. Esilääkeaineen esimolekyyli hydrolysoitiin bariumhydroksidilla vesipitoisessa metano-lissa, joka antoi 0,498 g (64 %) N-(2-karboksietyyli)-L-prclyyli-L-alanyyli-L-proliinia, sp. 133-136°.

Analyysi laskettu yhdisteelle ci6H25N3°6 · C2H5OH · 1H20; C 51,54; H 7,93; N 10,02, Havaitut: C 51,95, 51,72; H 7,12, 7,32; N 10,19, 10,04, /~q_7*5 = (1, H20) -147,3°.

Tämä yhdiste osoitti 2 nukutetussa koirassa akkumulatirvistä vaikutusta annoksella 300 ^,ug/kg/min 34 % munuaisveren-kierron lisääntymisessä ja 25 % munuaisverisuonien resistanssin vähentymisessä.

Esimerkki 5 D,L-8-metyyli-β-alanyyli-L-proliinin bentsyyliesterihydro-kloridi (5,95 g, 0,017 moolia), valmistettu kuten esimerkissä 1) kuvattiin, reagoi 4,41 g (0,015 moolia) L-N-/5-(karbo-metoksi)pentyyli/-proliinin hydrokloridin kanssa, joka oli valmistettu reaktiolla etyyli-6-bromikaproaatti proliinin bentsyyliesterihydrokloridin kanssa, jota seurasi katalyyttinen hydraus bentsyyliesterin jakamiseksi. Kondensointi-aine oli disykloheksyylikarbodi-imidi 1-hydroksibentso-triatsolin ja N-etyylimorfoliinin läsnäollessa tetrahydro-furaanissa. Tuotteena oli 1,5 g siirappimaista N-5-karbo-etoksipentametyleeni-L-prolyyli-D,L-β-metyyli-β-alanyyli-L-proliinin bentsyyliesteriä, m/e 530:ssa on M+l. 0,5 g esterin hydrol/ysi bariumhydroksidilla antoi 0,2 g haluttua L-(N-5-karboksipentametylenyyli)propyyli-D,L^-metyyli-8- 75175 15 alanyyli-L-proliinia, sp. 80-84°; /"α_7ρ5 = (C,l, 1:1 metanoli/vesi) -90,1°.

Analyysi laskettu yhdisteelle C20H33N3°6*1>25 H20: C 55,35; H 8,36; N 9,68. Havaitut: C 55,49; H 8,78; N 9,05.

Esimerkki 6 Käyttäen samoja edellä kuvattuja menetelmiä 12,5 g (0,76 moolia) D,L-amino-3-fenyylipropionihappoa reagoi 9,6 g (0,095 moolia) triecyyliamiinin ja 20,7 g (0,095 moolia) di-tert.-butyylidikarbonaatin kanssa 250 ml:ssa dimetyyli-formamidia 25°:ssa 17 h, joka antoi 19,9 g (79 %) valkoista, kiinteää t-boc-johdannaista, sp. 115-117°. Tätä materiaalia, 7,95 g (0,03 m), kondensoitiin 7,23 g (0,05 moolia) L-proliinin bentsyyliesteri-hydrokloridin kanssa, joka antoi 13,6 g dipeptidiä. Suojaryhmä siirretiin käsittelemällä trifluorietikkahapolla metyleenikloridissa ja 1,3-dimetoksibentseenissä, joka antoi vedettömän suolahappokä-sittelyn jälkeen D,L-6-fenyyli-8-alanyyli-L-proliinin bentsyy-liesterin hydrokloridia valkeana kiinteänä aineena. Tämä aine (10,1 g, 0,026 moolia) kondensoitiin 5,81 g (0,026 moolia) L-N-karbometoksimetyylipropyylihydrokloridin kanssa, joka antoi kromatograafisesti silikageelillä erottamisen jälkeen, jossa käytettiin gradienttia metanoli metyleenikloridissa, 1,8 g N-karbometoksimetyyli-L-prolyyli-D,L-8-fenyyli-B-alanyyli-L-proliinin bentsyyliesteriä. Diesterin hydrolyysi bariumhydroksidilla, jota seurasi happamaksi tekeminen laimealla rikkihapolla, antoi 0,99 g N-karboksi-metyyli-L-prolyyli-D,L-8-fenyyli-8-alanyyli-L-proliinin

A P

sulfaattia, sp. 256-260°. / a_7p ~ 1:1 metanoli/vesi) -43,2°.

Analyysi laskettu yhdisteelle C21H27N3°6 " 0,25 H2SO^ Η20: C 54,83; H 6,46; N 9,13. Havaitut: C 54,86; H 6,43; N 8,24.

Esimerkki 7 Käyttäen samoja yllä kuvattuja reaktioita 12,5 g (0,12 moolia) D,L-6-metyyli-8-alaniini-(D,L-3-aminobutyyrihappo) reagoi 12,2 g (0,15 moolia) trietyyliamiinin ja 32,7 g 16 751 75 (0,15 moolia) di-tert.-butyylidikarbonaatin kanssa 300 ml:ssa dimetyyliformamidia, mikä antoi 18,5 g (76 %) valkoista, kiinteää t-boc:ia, sp. 90-92°. Tätä ainetta (4,06 g, 0,02 moolia) kondensoitiin 4,82 g (0,02 moolia) proliinin bentsyyliesterihydrokloridin kanssa käyttäen yllä kuvattua disykloheksyylikarbodi-imidireaktiota 25°:ssa 17 h, joka antoi trifluorietikkahapolla ja vedettömällä suolahapolla käsittelyn jälkeen D,L-3-metyyli-3-alanyyli-L-proliinin bentsyyliesterin hydrokloridia. Tätä ainetta (3,5 g, 0,01 moolia) kondensoitiin 1,12 g (0,005 moolia) N-karbometoksi-metyyliproliinihydrokloridin kanssa niin kuin yllä kerrottiin, mikä antoi N-karbometoksimetyyli-L-prolyyli-D,L-8-metyyli-B-alanyyli-L-proliinin bentsyyliesteriä. Barium-hydroksidihydrolyysi ja sitten rikkihapon suolan muodostaminen antoivat N-karboksimetyyli-L-prolyyli-D,L-β-metyyli- 2 5 β-alanyyli-L-proliinihemisulfaattia, sp. 135° j_ = 63,3° (C,l 50 % vesipitoinen metanoli).

Diastereoisomeerinen seos (S, S, S ja S, R, S) erotettiin laittamalla seos 9:1 vesi-metanoli-liuoksessa korkean paineen nestekromatografia C-18 käänteisfaasikolonniin käyttäen 90:10:0,1 vesi-metanoli-trifluorietikkahapposeosta eluentti-na. Base line-erottelutekniikalla (a = 1,29) saatiin S, S, S ja S, R, S-isomeerien erottuminen, ja niiden optinen kierto-kyky vastaavassa järjestyksessä oli / a7^5 = -59,9° (C,l, 1:1 CH3OH‘H20) ja /_o_7q5 = -44,8° (C,l, 1:1 CH30H-H20).

Asettamalla N-(2-karbetoksi)etyyli-L-proliinin hydrokloridi alemman homologinsa sijaan tässä menettelyssä antaa N-(2-karboksi)etyyli-L-prolyyli-D,L-β-metyyli-β-alanyyli-L-proliinia. Korvaamalla N-(3-karbometoksi)prolyyli-D,L-pro-liinin hydrokloridi (valmistettu kuten esimerkissä 4 kuvattiin) esimerkin 4 menettelyssä N-(2-karbetoksi)etyyli-L-proliini-hydrokloridin tilalle antaa N-karboksipropyyli-D,L-prolyyli-L-alanyyli-L-proliinia emäsmuodossa.

Esimerkki 8

Seoksen, jossa oli 10,0 g (0,0529 moolia) N-tert.-butoksi- il 17 75175 karbonyyli-D-alaniinia, 12,75 g (0,0529 moolia) L-proliinin bentsyyliesterihydrokloridia, 14,28 g (0,0106 moolia) 1-hydroksibentsotriatsolia, 15 ml N-metyylimofoliinia ja 125 ml kuivaa tetrahydrofuraania yhdessä 10,9 g (0,0529 moolia) disykloheksyylikarbodi-imidin ja 15 ml kuivan dimetyyliform-amidin kanssa, annettiin reagoida, ja työskennellen niin kuin yllä kuvattiin, saatiin 20,4 g N-tert.-butoksikarbo-nyyli-D-alanyyli-L-proliinibentsyyliesterin raakatuotetta. t-boc-suojaryhmän siirtäminen kuten kuvattiin, antoi D-ala-nyyli-L-proliinin bentsyyliesterihydrokloridia, sp. 140-142°. Tätä ainetta (8,3 g, 0,0625 moolia) kondensoitiin 5,92 g (0,0265 moolia) N-karbometoksimetyyli-L-proliini-hydrokloridin kanssa, kuten kerrottiin, mikä antoi 3,1 g siirappimaista N-karbometoksietyyli-L-prolyyli-D-alanyyli-L-proliinin bentsyyliesteriä. 3,0 g (6,7 mmoolia) em. di-esterin bariumhydroksidikäsittely antoi 2,1 g N-karboksi-metyyli-L-prolyyli-D-alanyyli-L-proliinia; sp. 145-148° /“a7^5 = -39,9° (C,l, 1:1 CH30H-H20).

Samalla tavoin valmistettiin N-2-karboksietyyli-L-prolyyli-D-alanyyli-L-proliinia; sp . 170° hajoaa (pehmenemispiste 142-145°) L~vJq5 = -67,9° (C,l, 1:1 CH30H*H20).

Esimerkki 9

Seosta, jossa oli 6,28 g (0,0332 moolia) N-tert.-butoksi-karbonyyli-6-alaniinia, 5,0 g (0,0332 m) L-proliiniamidi-hydrokloridia, 8,96 g (0,0664 moolia) 1-hydroksibentsotriat-solia, 12 ml N-metyylimorfoliinia, 75 ml tetrahydrofuraania, 40 ml dimetyyliformamidia ja 6,84 g (0,0332 moolia) disykloheksyylikarbodi-imidiä, sekoitettiin 25°:ssa 17 h. Liuottimet haihdutettiin tyhjössä ja jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin ja veteen. Erotetut orgaaniset kerrokset pestiin pienillä määrillä laimeaa suolahappoa, suolavedellä, 5 %:sella bikarbonaatilla ja suolavedellä. Kuivattu uute konsentroitiin, mikä antoi 3,2 g siirappimaista N-tert.-butoksikarbonyyli-6-alanyyli-L-proliiniamidia. Kemiallisen ionisaation massaspektri metaania käyttäen oli yhtäpitävä dipeptidirakenteen kanssa.

751 75 18 Tämä tuote liuotettiin 35 ml:aan kuivaa metyleenidiklori-dia, joka oli jäähdytetty jäävedessä, ja lisättiin 15 ml trifluorietikkahappoa. Liuosta sekoitettiin 0°C:ssa 15 min ja 25°:ssa 3 h. Liuottimet haihdutettiin tyhjössä 40°:ssa, mikä antoi siirappimaisen β-alanyyli-L-proliiniamidin tri-fluorietikkahapon suolan. Tätä yhdistettä (-v 0,01 moolia) kondensoitiin N-karbometoksimetyyli-L-proliinihydroklori-din kanssa niin kuin kerrottiin, mikä antoi N-karbometoksi-metyyli-L-prolyyli-β-alanyyli-L-proliiniamidia. Bariumhydrok-sidikäsittely antoi N-karboksimetyyli-L-prolyyli-β-alanyyli-L-proliiniamidia .

Esimerkki 10

Korvaamalla N-karbometoksimetyyli-L-dehydroproliinin bent-syyliesteri, joka on valmistettu Adamsin alkylointimenetel-mällä, N-karbometoksimetyyli-L-proliiniesterillä esimerkissä 1 antaa N-karboksimetyyli-L-dehydroprolyyli-L-alanyyli-L-proliinia sulfaattisuolana. Substituoimalla esimerkissä 1 N-karbometoksimetyyli-pyroglutaamihapon bentsyyliesteri, joka on valmistettu Adamsin alkylointimenetelmällä, antaa N-karboksimetyylipyroglutamyyli-L-alanyyli-L-proliinia. Korvaamalla esimerkissä 1 2-pyrrolidinyylietikkahapon bentsyyliesteri L-proliinin bentsyyliesterillä antaa N-karboksimetyyli-L-prolyyli-L-alanyyli-2-pyrrolidinyyli-etikkahappoa. Korvaamalla β-(2-tienyyli)alaniinin t-boc-johdannainen (The Chemistry of Heterocyclic Compound, volyymi III, Hartough, sivu 262) esimerkin 1 alaniinijohdannaisella antaa N-karboksimetyyli-L-prolyyli-D,L-B-(2-tienyyli) -alanyyli-L-proliinia. Substituoimalla N-metyylisulfometyyli-proliinibentsyyliesteri, joka on valmistettu käyttäen tunnettua kloorimetaanisulfonihapon metyyliesteriä Adamsin alky-lointiprosessissa, esimerkissä 1, antaa N-sulfometyyli-L-prolyyli-L-alanyyli-L-proliinia. Käyttäen tunnettua kloori-metyylifosfonihapon dimetyyliesteriä Adamsin alkyloinnissa, jci sitten substituoimalla N-dimetyylifosfonometyylipyrrolii-nibentsyyliesteri esimerkissä 1 antaa N-fosfonometyyli-L-prolyyli-L-alanyyli-L-proliinia.

Il

Claims (6)

1. 751 75 Patentti vaatimukset
2. 1. Menetelmä lääkeaineena käytettävän tripeptidin val mistamiseksi, jonka rakennekaava on I JJ /y x/ y I ai k R CO H 2 jossa: R on karboksyyli; alk on 1-5 hiilen suora tai haaroittunut aikyleeniketju, joka ei ole etylideeni; A on aminohappojäännös, joka on johdettu seuraavista: D- tai L-Ala, D- tai L-β-metyyl i - 3-A1 a, D- tai L-6-fenyyl i-β-Ala, D- tai L-g-Ala; tai mainitun yhdisteen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola tai esi 1ääkeaineen johdannainen, tunnettu siitä, että yhdisteen, jonka rakennekaava on: ai k i1 annetaan reagoida yhdisteen kanssa, jonka rakennekaava on: " 1-CO R2 2 i A R3 joissa molemmissa: 751 75 A tai ai k on kuten yllä määriteltiin; R on suojattu karboksiryhmä; 2 R on karboksia suojaava ryhmä; j‘a R on amino- tai N-metyyliaminoryhmä, joka on osa A:sta, kuten yllä määriteltiin; poistetaan mikä tahansa läsnäoleva suojaryhmä tavanomaisilla kemiallisilla reaktioilla, ja vaihtoehtoisesti muodostetaan tripeptidin farmaseuttisesti hyväksyttävä suola.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktio suoritetaan karbodi-imi di n läsnäollessa.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktio suoritetaan di sykioheksyy1ikarbodi-imi di n 1ä snäol1essa.
5. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 3-alanyyli-L-proliinin bentsyyliesterihydroklori-din annetaan reagoida N-karbometoksimetyyli-L-proliinihydrokl ori di n kanssa N-karboksimetyyli-L-prolyyli-3-alanyylΐ-L-prol iinin tuottamiseksi.
6. 1. Förfarande för framstä11ning av en tripeptid, som an- vänds som ett läkemedel, och har strukturformeln I—I « Ή yJ älk R CO H 2 dä ri R är en karboxyl; alk är en rak eller grenad alkylenkedja med 1-5 kolatomer, som inte är en etyliden; II