Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych tripeptydów, zawierajacych N-karbo- ksyaJkilopioline. Nowe zwiazki maja strukture lancucha tripeptydowego z dwoma koncowymi jednostkami profilowymi oddzielonymi jednostka¬ mi przestrzennymi. Jedna z jednostek prolilowych zawiera zasadniczy N-)-p0d- stawnik.Aktywnosc biologicana zwiazków wytworzonych sposobem wedlug wynalazku polega na zwieksza¬ niu przeplywu krwi nerkowej i indukowaniu atotywnoscd moczopednej* Zwiazki te sa wiec uzy¬ teczne do leczenia nadcisnienia lub poprawy dzia¬ lania nerek.K. T. Poroshin i wspólpracownicy w Chemical Abstracts, 53, 21693h opisaM uiycie karbobenzoksy- -L-proliloglicylo-L-pnliny jako substratu do wy¬ twarzania L-proliloglicylo-L-praliny. Jednakze w literaturze tej nie przedstawiono zasadniczego pod- stawnika N^karboksyalkilowego, jak równiez oby- bu4owy nowych zwiazków. Poroshin nie wskazal równiez aktywnosci biologicznej tych zwiazków.Europejski opis patentowy nr 12 401 przedsta¬ wia karlbotesya,1lkii,lodip€gtydy, które stanowia enzy¬ matyczne inhibitory przeksztalcania angiotensin.Zwiazki przedstawione w wymienionym europej¬ skim opisie róznia sde od nowych zwiazków me¬ chanizmem dzialania, jak równiez budowa che¬ miczna. Prolilowa jednostka dipeptydu, wedlug 10 15 20 30 wymienionego patentu europejskiego, nie zawiera podstawników N-karooksyalkilowych.Jak stwierdzono powyzej, jwwe zwiazki wytwa¬ rzane sposobem wedlug wynalazku maja charak¬ terystyczna budowe tripeptydów, które stanowia prolilo-czesc parzestrzenna-prolina z podstawnikiem kwasowoalkilowym przy wolnym N-cztome piers¬ cienia profilowego. Zwiazki te zawieraja wiec tflwiie grupy kwasowe, z których jedna jest antfoie- ryczna.Sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie zwiaz¬ ki o wzorze 1, w którym R oznacza 'grupe kwa¬ sowa, taka jak karboksylowa o wzorze —COsH, sulfonowa o wzorze —-SO^OH lub fosfomowa o wzo¬ rze —P(0) o lancuchu prostym lub rozgalezionym, zawiera¬ jaca 1—©" atomów wegla, za wyjatkiem etylidene- wej («=OH— atomy H, H, Y -oznacza atom H Mb jezeH X ^ozna¬ cza atom H, H, wówczas Y oznacza grupe —OH, linia przerywana oznacza ewentualnie wiazanie wegiel—wegiel tylko gdy X i Y oznaczaja atomy H, H, lub atom H, n oznacza liczbe mieaaczaca sie w zakresie 0—3 wlacznie, a A. oznacza prze¬ strzenna reszte aminokwasowa w polaczonym peptydzie, taka jak iub L-Phe o wzorze 6, D- lufo L-^metyio*p-Ala o wzorze 7, D- lub L-0-fenylo-P-Ala o wzorze 8, D- lub L-fJ-tienylo-Gly o wzorze 9, D- lub L-fe- nylo-Gly o wzorze 10, D- lufo L-0-Ala o wzorze 136 098136 3 9, D- lub L-fenylo-0-Gly o wzorze 10, D- lub L-0- -Ala o wzorze —NH—CH*—CH2—CO—, kwas y-aminomaslówy o wzorze —NH—CH2—CH2— —CH2—CO— kwas D- lub L-2-aminomaslowy o wzorze 11, D- lub L-nor-Val o wzorze 12, D- lub L-norlLeu o wzorzo 13, kwas 3-amino-3-metylo- maslowy o wzorze 14, 2-metylo-Ala o wzorze 15 albo ich N-metylowe pochodne wymienionych reszt przestrzennych.Sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie no¬ we zwiazki na drodze reakcji zwiazku o wzorze 2 ze zwiazkiem o wzorze 3, w których to wzorach A, 3^;piania przerywana oraz n maja wyzej po¬ dane znaczenie, R1 oznacza ochroniona grupe kar¬ boksylowa, sulfonowa lub fosfbnowa, R2 oznacza grupe ochronna funkcji karboksylowej, taka jak '< benzylowa lub q|zfza alkilowa, a Rf oznacza gru¬ pe amiriowa o waorze —NHi lub N^metyloamino- wa o wzorze 16.Subgeneryczna grupe zwiazków stanowia zwiaz¬ ki o wzorze 1, w którym A oznacza podstawiona lub niepodstawiona reszte 0-Ala. Szczególnie uzy¬ teczne sa zwiazki o wzorze 1, w których R ozna¬ cza grupe karboksylowa, alk oznacza grupe me¬ tylenowa, X oznacza atomy H, H, Y oznacza atom H, n oznacza liczbe 0, a A oznacza reszte P-Ala. Korzystna konfiguracja reszt aminokwaso- wych kazdej z wymienionych grup jest konfigu¬ racja L. Szczególnie korzystnym zwiazkiem wy¬ twarzanym sposobem wg wynalazku jest siarczan N-karboksymetylo-L-prolilo-P-alanylo-L-proliny.W definicji zwiazków o wzorze 1, reszty, w któ¬ rych X oznacza atom O stanowia pierscien piro- glutamylowy, reszty, w których Y oznacza grupe OH stanowia pierscien hydroksyprolilowy, a resz¬ ty, w których jest obecne podwójne wiazanie sta¬ nowia pierscien dehydroprolilowy. Wszystkie te zwiazki sa zasadniczo pochodnymi prolilowymi W nerkach psów uspionych w zapisie przeswie¬ tlenia radiologicznego N^karboksymetylo-L^prolilo- -L-lizylo-L-prolina, N^carboksymetyloproliloglicylo- -LHprolina oraz N- mylo-L-prolina byly nieskuteczne jako czynniki rozszerzajace naczynia nerkowe podczas badania radiologicznego. Stanowi to ilustracje krytycznego charakteru reszt przestrzennych oraz podstawnika N-alkilowego przy kolcowej reszcie prolilowej.Nowe zwiazki obejmuja rózne farmakologicznie dopuszczalne sole wytworzone z nietoksycznych kwasów przy zasadowym N-czlonie reszty N^kar- boksyalkiloprolitowej lub z farmakologicznie do¬ puszczalnych kationów przy anionowej grupie kwasowej.Przykladem ich sa siarczany, chlorowodorki, fosforany, bromowodorki, etanodisulfoniany lub metasiosulfoniany, a takze sole sodowe, potasowe, wapniowe i podobne sole mocnych zasad. Sole metali alkalicznych sa szczególnie uzyteczne ra¬ czej jako pólprodukty niz produkty koncowe, cho¬ ciaz moga byc równiez stosowane w tej postaci.Sole wytwarza sie w reakcji zwiazków o wzo¬ rze 1 w odpowiednim rozpuszczalniku z odpo¬ wiednim kwasem lub zasada w znanych warun¬ kach stosowanych w tej dziedzinie. Zazwyczaj nadmiar kwasu nieorganicznego lub zasady pod- 008 4 daje sie reakcji ze zwiazkiem wytwarzanym spo¬ sobem wedlug wynalazku, rozpuszczanym w wo¬ dzie lub w odpowiednim rozpuszczalniku orga¬ nicznym, takim jak wodny roztwór etanolu. 5 Nowe zwiazki czesto tworza solwaty, takie jak wodziany lub nizsze alkoholany.Sole addycyjne z kwasami, takie jak siarczany, sa najbardziej uzyteczna postacia macierzystych tripeptydów. 10 Ponadto dikwasy mozna stosowac do wytwa¬ rzania proleków, w postaci amidów, pochodnych nizszych estrów alkilowych o 1—5 atomach wegla w kazdej z grup alkilowych lub estru benzylowego.Sposób wedlug wynalazku ilustruje schemat 15 reakcji. We wzorach zwiazków wystepujacych w tym schemacie wszystkie symbole maja wyzej po¬ dane znaczenie.Wedlug wynalazku N- proline o wzorze 2 w postaci, w której lancuch 20 boczny grupy kwasowej jest ochroniony, poddaje sie reakcji z dipeptydem zawierajacym proline z ochronionymi koncowymi grupami kwasowymi o wzorze 3. W reakcji tej otrzymuje sie produkt w postaci ochronionego kwasu dikarboksylowego o 25 wzorze 4.Podczas wytwarzania wiazania aminowego w reakcji aminokwasu oraz wyjsciowego dipeptydu stosuje sie warunki uzywane w reakcji sprzega¬ nia peptydów. Korzystnie, reakcje aminokwasu o 30 wzorze 2 z dipeptydem o wzorze 3 prowadzi sie w obecnosci promotora acylowania, takiego jak karbodiimid, np. dicykloheksylokarbodiimid. Re¬ akcje prowadzi sie w rozpuszczalniku organicz¬ nym, np. tetrahydrofuranie, dimetyloacetamidzie 35 lub dimetyloformamidzie, stosujac az do zakon¬ czenia reakcji temperatury umiarkowane. W wie¬ lu przypadkach stosuje sie temperature pokojowa w czasie 1—18 godzin.Inne metody sprzegania obejmuja zastosowanie 40 pochodnych dzoksazolinowych, 1-etoksykarbonylo- -2-etoksy-l,2-dihydrochinoliny, pochodnych fosfo- niowych, pochodnych wodorku N-karboksylowego lub pochodnych estru N-hydroksysukcynimidu.Metody sprzegania opisano bardziej szczególowo 45 w „Peptide Synthesis" przez Bodanszky, Willsy (1976 wydanie piate).Nastepnie, ochronne grupy estrowe wydziela sie na drodze znanych reakcji, które nie maja wply¬ wu na wiazanie amidowe. Odpowiednimi przy- 50 kladami tych metod sa katalityczne uwodornianie dla grup benzylowych albo alkaliczna hydroliza z uzyciem wodorotlenku baru.Alternatywnie, reagent dipeptydowy mozna wy¬ tworzyc z N-alkilokwasowej pochodnej proliny o 55 wzorz e 2 skondensowanej z resztami przestrzen¬ nymi A. Nastepnie dipeptyd poddaje sie reakcji z prolina, której grupa karboksylowa jest ochro¬ niona w postaci estru benzylowego lub nizszego alkilowego. Grupy ochronne wydziela sie nastep- 60 nie i ewentualnie wytwarza sole.Zwiazki te sa równiez wytwarzane z uzyciem zwyklych technologii stosowanych do wytwarza* mia peptydów.Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wyna- 65 lazku wykazuja dzialanie farmakodynamiczne oraz136 098 5 6 dzialanie na nerki i sa uzyteczne w farmacji. Sto¬ suje sie je szczególnie do zwiekszenia przeplywu krwi w nerkach i obnizania odpornosci naczyn nerkowych. Ich dzialanie poprawia prace nerek i czesto kumuluje sie. Nowe zwiazki wykazuja równiez dzialanie moczopedne. Z tego wzgledu, zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku wykazuja stosunkowo dlugie dzialanie przeciw- nadcisnieniowe lub poprawiajace funkcjonowanie nerek. Nieoczekiwanie, nowe zwiazki sa skutecz¬ ne przy podawaniu doustnym i pozajelitowym.Aktywnosc biologiczna zwiazków o wzorze 1 wykazano przez podawanie na drodze infuzji uspionym psom, którym mierzono obwodowe ci¬ snienie krwi, przeplyw krwi w nerkach, odpor¬ nosc naczyn nerkowych oraz czestotliwosc ude¬ rzen serca wedlug metod opisanych szczególowo w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ame¬ ryki nr 4197 297. Ogólnie, nowe zwiazki obnizaly odpornosc naczyn nerkowych i zwiekszaly prze¬ plyw krwi w nerkach w dawkach mieszczacych sie w zakresie 1/3—1/100 dawki dopaminy stoso¬ wanej w tym badaniu. Reprezentatywne wyniki tych badan podano w przykladach.Alternatywnie, nowe zwiazki wykazuja biolo¬ giczna aktywnosc w samoistnym nadcisnieniu u szczurów (SHR). W bodaniu tym szczury w wie¬ ku 16^19 tygodni, rodzaju Okamato-Aoki po po¬ poludniowym podaniu pierwszej dawki doustnie w ilosci 25 ml/kg wykazaly samoistne nadcisnie¬ nie. Nastepnie, zwierzeta umieszczano w klatkach metabolicznych iw czasie 3 godzin analizowano zbierany mocz.Za pomoca obejmy ogonowej mierzono posred¬ nie, skurczowe cisnienie krwi oraz czestotliwosc bicia serca. Podawano taka sama druga dawke badanego zwiazku. Po 2 godzinach powtórnie ba¬ dano cisnienie krwi oraz czestotliwosc bicia ser¬ ca. Badane zwiazki podawano doustnie i pozaje- lijtowo w solance z dodatkiem 0,02*/© kwasu askor¬ binowego. W tescie tym wykazano aktywnosc mo¬ czopedna reprezentatywnych zwiazków wytwa¬ rzanych sposobem wedlug wynalazku.Na przyklad, pólsiarczan (N-karboksymetylo)-L- -prolilo-^-alanylo-L-proliny w dawce pozajelito¬ wej wykazal wzrost wydzielania Na+, K+ w daw¬ ce 25 i 50 mg/kg. U uspionych psów RVR—EDi5 wynosilo 12 \ilkg dla porównania wielkosci dawki dopaminy wynosila 3,5 \ifkg. Nie stwierdzono aktywnosci enzymatycznej inhibitujacej konwersje angiotensyny przy lO^krotnej dawce efektywnej nerkowo. Ta wlasciwosc równiez nie stymuluje lub antagonizuje in vitro cyklazowego ukladu do- pamina—adenylan jak równiez nie wykazuje aktywnosci w anty-próbie ADH pecherza moczo¬ wego. Nowe zwiazki wykazuja slabe dzialanie zwalniajace czynnosci serca.Nowe zwiazki podaje sie w jednostkach dawko- wych, takich jak kapsulki, tabletki, preparaty injekcyjne stosowane do poprawienia dzialania nerek, leczenia wysokiego cisnienia krwi oraz in¬ dukowania diurezy. Farmakologiczne nosniki do wytwarzania dawek jednostkowych stosuje sie w postaci stalej i cieklej. Przykladem nosników sta¬ lych jest laktoza, guma arabska, sacharoza, talk, zelatyna, agar, pektyna, siarczan wapnia, steary¬ nian magnezu lub kwas stearynowy. Przykladem nosników cieklych jest syrop, olej z orzeszków ziemnych, olej z oliwek lub woda. Nosniki lub 5 rozcienczalniki moga obejmowac znane substancje opózniajace dzialanie, takie jak monostearynian glicerolu lub distearynian glicerolu sam lub z wo¬ skiem.Powstrzymanie wydzielania produktu koncowe¬ go jak równiez pochodnych, które moga byc stop¬ niowo wchlaniane, powoduje to, ze substancja aktywna moze dzialac w sposób przedluzony na¬ dajac nowym zwiazkom unikalna aktywnosc bio¬ logiczna.Mozna stosowac nowe zwiazki w postaci róz¬ norodnych form farmaceutycznych. Do podawania doustnego, przy uzyciu stalych nosników, stosu¬ je sie preparaty w postaci tabletek, proszku umieszczonego w zelatynowych kapsulkach, dra¬ zetek uwalniajacych regularnie skladnik czynny lub uwalniajacych skladnik czynny stopniowo, ko- laczyków, pastylek romboidalnego ksztaltu. Staly nosnik stosuje sie w ilosci mieszczacej sie w sze¬ rokim zakresie, korzystnie od okolo 25 mg do 1 g.W przypadku stosowania nosników cieklych, wy¬ twarza sie preparaty w postaci syropu, emulsji, miekkich kapsulek zelatynowych, sterylnych ply¬ nów do injekcji umieszczonych w ampulkach, albo wodnych lub bezwodnych zawiesin.Preparaty farmaceutyczne wytwarza sie znany¬ mi w dziedzinie farmacji technologiami, obejmu¬ jacymi mieszanie, granulowanie i sprasowywane podczas wytwarzania tabletek, albo mieszanie, na¬ pelnienie i rozpuszczanie skladników z wytworze¬ niem zadanego pozajelitowego produktu konco¬ wego.Dawki nowego zwiazku w srodku farmaceutycz¬ nym stanowia skuteczne, nietoksyczne ilosci ak¬ tywnego tripeptydu mieszczace sie w zakresie 10—350 mg, korzystnie 50—200 mg. Dobrana daw¬ ke podaje sie pacjentowi poddawanemu leczeniu w zaleznosci od potrzeb 1—5 razy dziennie do¬ ustnie, przez injekcje lub infuzje. Stosowanie po¬ zajelitowe wymaga doboru mniejszej dawki z wy¬ mienionego zakresu, 'indywidualnie lub w kombi¬ nacji. Jednakze korzystnie stosuje sie doustnie 1—5 krotne podawanie wiekszych dawek w ciagu dnia w zaleznosci od pacjenta.Jak stwierdzono wyzej zwiazki wytwarzane spo¬ sobem wedlug wynalazku moga wystepowac w róznych konfiguracjach, takich jak izomery op¬ tycznie czynne lub ich mieszaniny. Zwiazki izo¬ meryczne wytwarza sie latwo przez podstawienie aminokwasu o wybranej konfiguracji do reakcji chemicznych albo przez rozdzial chromatograficz¬ ny mieszaniny izomerów na drodze wysokocisnie¬ niowej chromatografii cieczowej.Ponizsze przyklady ilustruja przedmiot wyna¬ lazku, nie ograniczajac, jego zakresu. Wszystkie wartosci temperatury wyrazano w °C.Przyklad I. Mieszanine 6,0 g (0,025 m) estru benzylowego Lnproliny, 4,7 g (0,025 m) N-tert-buto- ksykarbonylo-L-alaniny, 6,75 g (0,05 m) 1-hydro- ksybenzotriazolu, 3,2 ml (2,82 g, 0,025 m) N-etylo- morfoliny oraz 85 ml suchego tetrahydrofuranu 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60136 7 chlodzi sie, sajszy i dodaje do, mieszaniny 5,15 g (0,025. m); dicykloheksylokarbodiimidu oraz 10 ml tetadaydrofuranu. Mieszanine miesza sie w tem¬ peraturze 0°C w czasie 30 minut, po czym: w temperaturze 25°C w czasie 18 h. Mieszanine re- aflficyjpa saczy sie. Przesacz odparowuje sie, otrzy¬ mujac pozostalosc, która rozpuszcza sie w octanie etylu. Roztwór przemywa sie 1—10% kwasem octowym, woda, 5% roztworem wodoroweglanu sodu* oraz solanka, po czym suszy nad bezwodnym siarczanem magnezu i aateza. Otrzymuje sie 9,8 g surowego estru benzylowego N-tert«but©ksykarbo- nylo-L-alanylo-L^prodiny.Mieszanine 2 g wytworzonego estru benzylowe¬ go^ 3|0 g kwasu trifluorooctowego oraz 15 ml su¬ chego chlorku metylenu pozostawia sie do prze- reagowania w temperaturze pokojowej w czasie 2 godzin, po czym odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac surowa sól trifluorooctowa.S& rozpuszcza sie w eterze i zakwasza eterowym roztworem chlorowodoru. O^ymuje sie. 1,15 g chlorowodorku estru benzylowego Lralanyk-L-pro^ liny w postaci stalej barwy bialej o temperaturze topnienia 162—164°C.Okolo 500 g 10*/» palladu na weglu drzewnym zwilza sie woda i dodaje do roztworu 16.5 g (0,00 m) estru benzylowego N^carbometoksymety- lo-L-4)roliny [R. Adarus, J. Am. Chem. Soc. 81 5803 (1959)] i 50 ml etanolu. Po wstrzasaniu w atmosferze wodoru pod obnizonym cisnieniem w czasie 2 godzin*, mieszanine saczy sie. Przesacz odparowuje sie. Po dodaniu etanolu i odparowa- nia pozostalosc w postaci syropu rozpuszcza sie w taluenie-eterze (1:1) L zakwasza zimnymi etero¬ wym roztworem chlorowodoru. Wytworzona sub¬ stancje stala barwy bialej oddziela sie i przemy¬ wa eterem. Otrzymuje sie 13,8 g surowego chloro¬ wodorku N4LaitK)metofesyinetylo-I^pix]iny o tem¬ peraturze topnienia 191—193°C.Mieszanine 2,23 gi (0,01 m) chlorowodorku N-kar- bometDksymetylD^Lirprjoliny, 3,13 g (0,01 mola) chlo¬ rowodorku estru benzylowego L-alanylo-L-proliny, 2,70f g (0,02 m) 1-bydroksybenzotriazolu^ 2,3: g (0,02- m)i N-etylomorloliny oraz 40 ml suchego teteahydrofuranu chlodzi sie w wodzie z lodem, po czym poddaje reakcji z 2,06 g (0,01 m) dicyklo- heksylokarbodwiuimidu w temperaturze pokojowej w czasie 17 godzin. Substancje stala oddziela sie przez, saczenie. Przesacz rozciencza sie octanem etylu i przemywa 3 krotnie 50 ml l,5*/« kwasu octowego, woda* 5% roztworem wodoroweglanu sodu; oraz solanka. Osuszona warstwa organiczna odparowuje sie z uzyskaniem 4,3 g syropu barwy zóltej* Wytworzony syrop wprowadza sie na ko¬ lumna z zelem krzemionkowym i eluuje chlorkiem, metylenu, l9/t metanolem/chlorkiem metylenu oraz 1—lWt metanolem/chlorkiem metylenu. Otrzymu¬ je sie 2,1 g (47t/# estru benzylowego N-karbome- toksymetylo-L-proiilo-L-alanyloproliny jako pro- -leku zadanego produktu koncowego.Do 30 ml dodaje sie. 2,1 g otrzymanej substan¬ cji* po czym calosc dodaje sie do mieszaniny 5,0 g wodoianu wodorotlenku baru w 40 ml wody. Po mieszaniu w czasie 4 godzin, przez mieszanine przepuszcza sie gazowy dwutlenek weg^La. Wytra- 8 eony bezbarwny weglanu baru odsacza sie, otrzy- muiac 1,25 g (78Ve zadanego tripeptydu w posta¬ ci stalej barwy bialej.Po rekrystalizacji z mieszaniny metanol/octan 5 etylu próbka 300 g dala substancje stala barwy bialej o temperaturze topnienia 270°C (rozklad), kt6ra stanowi sól barowa.W wodzie rozpuszcza sie 0,9 g naeoczyszczonej substancji stalej. Mieszanine przesacza sie. Prze^ i* sacz zakwasza rozcienczonym kwasem siarkowym do wartosci pH 3,5. Siarczan baru wydziela sie przez saczenie. Przesacz odparowuje sie, otrzy¬ mujac siarczan N4carboksymetylo-L-nprolilo-L-alar- nyLo-L-proliny w temperaturze topnienia 190— 15 -^196QC z rozkladem.Amaliza elementarna: Obliczono dla Ct{H^z0^m^^SO^mK^O: 48,06C; 6,59H; 11,20N Znaleziono: 48,48 i 48,2IC; 6;69 i 6,78H; 10,80 20 i 10,79N. [o]*d (C, 1,1:1 CHaOH-H80) — 132,2°.W badaniach 3 uspionych psów sól barowa w dawce 30 pg/kg/minute dala 21,7Vl wzrost prze¬ plywu krwi nerkowej oraz 15*/o zmniejszenie od- 25 pormosci naczyn nerkowych.Przyklad II. Mieszanine 6,0 g (0,025 m) chlo¬ rowodorku estru benzylowego L-proriny, (T,7& g (0,05 m) 1-hydroksybenzotriazolu, 3,2 ml (0,025 m) N-etylomorfoliny, &,63 g (0,025 m) L-tert-butoksy- 30 karbonylofenyloalaniny, 5,15 g (0,025 m) dicyklo- hefcsylokarbodiimidu oraz 35 ml suchego tetrahy- drofuranu miesza sie krótko w temperaturze 0°C, po czym 4 godziny w temperaturze 25°C. Lug ma¬ cierzysty oddziela sie i odparowuje. Pozostalosc 3* rozpuszcza sie w octanie etylu i rozcienczonym kwasie solnym. Warstwy rozdziela sie. Warstwe wodna ekstrahuje sie octanem etylu.Polaczone warstwy organiczne przemywa sie rozcienczonym kwasem solnym, woda, 5°/a roztwo- 40 rem wodoroweglanu sodu oraz solanka. Warstwy organiczne rozdziela sie i odparowuje. Dtrzymuje sie 10,3 g (91%) estru benzylowego N-tert-butoksy- karbonylo-L-fenyloalanylo-L^proliny.Nastepnie 7,0 g otrzymanego estru poddaje sie 45 reakcji z 10 ml kwasu trifluorooctowego, 40 ml suchego chlorku metylenu oraz 4 ml 1,3-dimeto^ ksybenzenu w temperaturze 25(,C w czasie 2 go¬ dzin i postepujac w sposób opisany powyzej wy¬ twarza sie 5,57 g chlorowodorku estru benzylo- 50 wego L-fenytoalanylo-Lnpnufliiy.Ester benzylowy w ilosci 2?,23 g (0,01 m pod¬ daje sie reakcji z 3*89 g chlorowodorku N-karbo- metoksymetylo-L-proliny, 2,70 g (0,02 m) 1-hydro¬ ksybenzotriazolu, 4^0 ml N-etylomorfoliny, 2,06 g 55 (0,01 m) dicyfldoheksylokarbodiimadu oraz 40 ml suchego tetrahydrofuranu w temperaturze 25°C w czasie 17 godzin w sposób opisany powyzej.Otrzymuje sie 2,9 g estru benzylowego N-karb0- metoksymetylo-L-prolilo-L-fenyloalanylo-Iji-pffoliny 60 oczyszczonego na zelu krzemionkowym.W 30 ml metanolu rozpuszcza sie 1,1 g (2,1 mm) pro-leku diestru i poddaje* reakcji w cieplym rozi- tworze 5,0 g wodorotlenku baru w 40 ml wody.Mieszanine miesza siej w temperaturze 25°C w 65 czasie 4 godzin, po czym dodaje nadmiar dwu-13#W& 9 10 tlenki* wegla. Weglom baru* wydziela sie przez sa¬ czenie z uzyciem filtra pomocniczego. Przesacz odparowuje sie, a pozostalosc azeotropuje z eta¬ nolem, jaik opisano powyzej. Otrzymuje sie 0,72 g (8&fa) soli barowej, a nastepnie 0,8& g pólsiarezamu' N-karbeksyimetylo-LiprolilG^Li-jfe-nyloalamylo-L-pro- liny o temperaturze topnienia 145—I48°C Analiza elementarna.Obliczono dla CiiILsNsOe-l^-Ba-HjO: 51,15 C; 5;31 H; 8;52 N"; 13,92 ,Ba.Znaleziono: 51,47, 51,64 C; 5,27, 5,50 H; 5,28, 5,28N; 12,60 Ba [aP»D = (C 1, H,0)- 43,9*.Analiza elementarna.Obliczono dla C2iHt7NsO«rl/2HtS04: 54,07 C\ 6,04 H; 9,61 N.Znaleziono: 53,71, 5^64 C; 590 5,94 H; 8,82; 8,91 N.Otrzymany siarczan w dawce 30- i 300 pg/kgftnin wykazal dzialanie zwiekszajace przeplyw krwi ner¬ kowej. Sól barowa okaoftla sie nieaktywna w ba¬ daniach prowadzonych: na uspionych psach.Przyklad UL. Postepujac w sposób analo¬ giczny do opisanego powyzej na drodze acyluwra- nia z uzyciem dicykloheksylokacbodiiniidu; wy¬ twarza sie 7,6' g estru benzylowego. tN^terWautt^- ksykarbonylo^-aianylo*Ii-43nli2iy; Gnape ochron¬ na wydziela sie z uzyciem kwasu tiiflaoroocto^ wego. Otrzymuje sie chlorowoóferek estru benzy¬ lowego fJ-alanylo-L-proliny. Zwiazek ten w ilosci 6,39 g (0,02 m) kandensuje sie z 2,23; g (0,01 rn) chlorowodorku N^arbometaksymetyloproliny pro¬ wadzac reakcje w obecnosci 2,7 g (0,02 m) 1-hy- dnoksybenzotriazolu, 12 ml N-etylomorfoliny, 2,06 g (0,01 m) dicykloheksylokarbodiimidu w 50 ml suchego tetrahydrofurami- w temperaturze poko¬ jowej w czasie 17 godzin. Otrzymuje sie 1,9 g estru benzylowego NHkai?bometok&ymetyLo-L»-proli- lo-(3^alanylo-LHproliny w postaci syropu, stanowia¬ cego prekursor pro-leku zadanego dikwasu.Diester w ilosci 1,75 g (3*9 m hydrolizuje sie z uzyciem wodorotlenku baru i metanolu; po czym zadaje kwasem siarkowym. Otrzymuje sie 1,2 g siarczanur N^karboksymetylo-L-proliJo-^-ala- nylo-L^pro4iny w postaci stalej barwy bialej.Analiza elementarna.Obliczono dla CwHWtyD,,- l/2r H2SO»: 46,15 C; 6,20 H 10,76. N, Znaleziono: 45,81 C; 46,14 C; 6,50, 6,52: Hr 9,94, 1%22 N; [ol«D = (0,8, HfO) - 70;4°.Test samoistnego nadcisnienia u 3 badanych szcbutów pozajelitowo wykazal dzialanie przy dawce 25 mg/kg. Próba moczopedna wykazala: Na+ 676,04 (kontrolna 126,76); K+ 242,53: (kontrol¬ na 85,12), ilosc moczu 16 ml/szczura- (kontrolna 3^.Stwierdzono równoczesnie wzrost przeplywu krwi nerkowej^ i obnazenie odpornosci naczyn nerko¬ wych w badaniach u Z uspionych psów w daw¬ kach 3,30 i 30ff ngflfcgtain. W drugorzedowych te¬ scie u 3 p6Ów zwiazek ten przy podaniu dozylnym wykazal wartosc ED*« wynoszaca 12 \iglkg dla porównania dopamina —3,5 ng/kg.Przyklad IV. Postepujac w sposób analo¬ giczny do opisanego powyzej z %2d (0,03 m) ffc- -bromopropiomanu etylu i 7,3& g (0,04 m) chloro¬ wodorku estru benzylowego prolniy otrzymano 4,6 g (50;2V#) estru benzylowego N-(2^kartooeto- ksy)etyIo-L-piroliny. Otrzymany zwiazek 4,6 g (0,015* m) poddano uwodornieniu nad palladem na weglu. Otrzymano 2,9fr g (78?/o) chlorowodorku:. N- -(2Hkarbbetoksy)etyló-LHproliny o temperaturze to* i pmienia 169—171°. Zwiazek ten w ilosci 2,42 g (0,0096 m) poddano kondensacji z 2,25 g (0,0072 m) chlorowodorku estru benzylowego L^alanylo-L- -proliny w dicyklctoeiksylokarbodiimidzie. Otrzy¬ muje sie 0,8 g estru benzylowego N-(2-karboeto- io ksy)etyIo-L-prolilo-L-alanylo-L^proliny. Prekursor proleku hydrolizowano wodorotlenkiem baru w wodnym roztworze metanolu. Otrzymano- 0,498 g (64°/o) N-(2^karboksyetyto)-L-prolilo-L-alanylo-L- -iproliny o temperatunize topnienia 133—1369. 15 Analiza elementarna dla CieHtsNsO^CsHsOH lHtO; 51,54 C; 7,93 H; 10,02 N. Obliczono: 51,9$, 51,72 C; 7,12, 7,3* H; 10,1* 10,04 N. [«}»D = (HfcOH —147,3°.Zwiazek ten u 2- uspionych psów wykazal ku- 20 mulacyjny efekt dzialania przy dawce 300' [ig/kgA /min z 34*/# wzrostem przeplywu krwi nerkowej i 23^/r obnizeniem odpornosci naczyn nerkowych.Przyklad V. Wytworzony w sposób opisany w pttytoladzie 1, chlorowodorek estru benzylowe- 2? go D,L-§Hmetylo-0-alsnylo-L-prolihy w ilosci 5,95 g (0j6*7 m poddaje sie reakcji z 4,41 g (0,015 m) ehlocowodoffeu L-N-[5^karbornetoksy)pentylo]pr©- liny, otrzymanego w reakcji 6-bromokapronianu etylu z prolina, Nastepnie chlowodorek estru ben- 30 zylowego podctewajao katalitycznemu uwodornia¬ niu dla wydzielenia grupy benzylowej.Jako srodek kondensujacy stosowane dicyklo- heksylokarbodiimid w obecnosci 1-hydroksybenzo- triazolu i N-etyiomorfoliny w tetrahydrofuranie. 35 Otrzymano 1,5 g estru benzylowego N-Snkarboeto- ksypentametylenylo)-L-prolilo^D,L-P-metylo^P'-ala^ nylo-L-proliny w postaci syropu o wartosci m/e przy 530 wynoszacym MH-1. Po hydrolizie wodorotlenkiem baru z 0,5 g estru otrzymano 0*2, 40 g zadanej N-54cai^etoksypenteonetylenylo(]firo- lilo-D,L-p-metyIo-p-aJ:anylo-Ii-proliny o tempera¬ turze topnienia 80—34°; ifdPD- (C,l, 1:1 meta¬ nol/woda) -90,1°.Analiza elementarna. 45 Obliczono dla CwHfcNiOfr-1,25 HjOc: 55,35 C; S,3ff H;9;68'N.Znaleziono: 55,49 C; 8,78 H; 9,05^ N.Przyklad VI. Postepujac w sposób analo¬ giczny do opisanego powyzej 12,5 g (0;76 my 50 kwasu D,L-3-aniino-3-fenyIopropionowego podda¬ je sie reakcji z 9,6 g (6,695 m) trietylbaminy i 20,7 g (0,095 m) di^tert-butylodiweglarra w 250 ml di¬ metyloformamidu w temperaturze 25° w czasie 17 godzin. Otrzymuje sie 19,9 g (79,/t) pochodnej 55 w postaci stalej barwy bialej o temperaturze top¬ nienia 115r—117°. Otrzymane 7,95 g (6-03 m) sub¬ stancji poddiaje sie: kondensacji z: 723 g (0,05 m) chlorowodorku estrubenzylowego L^woiiny z uzy¬ skaniem 13,6 g dipeptydu. Grupe ochronna wy- 60 dziela' sie przez poddanie dzialania kwasu triffijo- rooctowego w dicMorku metylenu i 1,3-drmeto^ ksybenzeme.Po dzialaniu bezwodnym chlorowodorem otrzy¬ muje sie* chlorowoctaarek estru benzylowego B,L- 65 p-fenylo-P-alanyloriu-paroliny w postaci starej bar-186 098 ii 12 wy bialej. Uzyskana substancje w ilosci 10,1 g (0,026 m) kondensuje sie z 5,81 g (0,026 m) chlo¬ rowodorku L-N^kai^ometoksymetyloproliny, a po chromatografowaniu na zelu krzemionkowym z uzyciem metanolu w chlorku metylenu, otrzymuje sie 1,8 g estru benzylowego N-karbometoksymety- lo-L-prolilo-D,L-^-fenylo-P-alanylo-L-proliny. Po hydrolizie tego dwuestru wodorotlenkiem baru i nastepnym zakwaszeniu rozcienczonym kwasem siarkowym otrzymuje sie 0,99 g siarczanu N^carbo- ksymetylo-L-prolilo-D,Lnp-fenylo-(3-alanylo-L-pro- liny o temperaturze topnienia 266—260°, [a] 25D = C, 1, 1 :1-metanol/woda) ^13,2°.Analiza elementarna.Obliczono dla C8iH27N8CV0,25 H,S04 HO: 54,83 C; 6,46 H; 9,13 N.Znaleziono: 54,86 C; 6,43 H; 8,24 N.Przyklad VII. Postepujac w sposób analo¬ giczny do opisanego powyzejl2,5 g (0,12 m) D,L- -fl-metylo-p-alaniny (kwasu D,I-3-aminomaslowe- go) poddaje sie reakcji z 12,12 g (0,15 m) triety- loamdny i 32,7 g (0,15 m) di-tert-butylodiweglanu w 300 ml dimetyloformamidu, uzyskujac 18,5 g (76^/t) substancji stalej barwy bialej o tempera¬ turze topnienia 90—92°. Substancje te w ilosci 4,06 g (0,02 m) poddaje sie reakcji kondensacji z 4,82 g (0,02 m) chlorowodorku estru benzylowego proldny, z zastosowaniem dicykloheksylokarbodi- imidu, prowadzac reakcje w temperaturze 25° w czasie 17 godzin. Po dzialaniu kwasem trifluoro- octowym i bezwodnym chlorowodorem, otrzymuje sie chlorowodorek estru benzylowego D,L-|3-mety- lo-P-alanylo-LHproliny, który w ilosci 3,5 g (0,1 m) poddaje sie reakcji kondensacji z 1,12 g (0,005 m) chlowodorku N^karbometoksymetyloproliny w sposób opasany powyzej.Otrzymany ester benzylowy N-karbomotoksyme- tylo-L-parolilo-D,L-P-metylo-p-alanylo-L-(proliny po hydrolizie wodorotlenkiem baru, a nastepnie po dzialaniu sola kwasu siarkowego daje p61siarczan N-karboksymetylo-L-prolilo-D,L-ip-metylo-p-alanylo- -L-proliny o temperaturze topnienia 135°, [a] f5D = 63,3° (C, 1, 50% wodny roztwór metanolu).Mieszanine diastereoizomerów (S, S, S i S, R, S) rozdziela sie przez zastosowanie mieszaniny 9:1 woda—metanol dla C-18 kolumny wysokocisnie¬ niowej chromatografii cieczowej z uzyciem wo¬ dy—metanolu—kwasu trifluorooctowego w stosun¬ ku 90: 10 : 0,1 jako eluentu.Zasadnicza linia rozdzialu (a = 1,29) pozwala na rozdzial S,S,S i S,R,S^izotmerów o skrecalnosci op¬ tycznej odpowiednio [a]»D = —59,9° (C, 1, 1:1 CH,OH-H20) oraz [a]«D = —44,8° (C, 1, 1:1 CH,OH-H£0).Zastapienie w tym procesie chlorowodorku N- ^24carboetoksy)-etylo-L-piroliny jego nizszym ho- mologiem powoduje wytworzenie N-(24carboksy) e^ylo-L-proUlo^D,L^nmetylo-p-alanylo-LHproliny.Zastapienie, w sposobie opisanym w przykladzie IV chlorowodorkiem N-(3^karbometoksy)propylo-D, L-proliny chlorowodorku N-<2nkarboetoksy)etylo- -Liproliny wytwarza sie N-karboksypropylo-D,Li- iprolilo-Lf-alanylo-Lipiroliny w postaci zasady.Przyklad VIII. Mieszanine 10,0 g (0,0529 m) N^tert-*butoksykarbonylo-D-alaniny, 12,75 g (0,0529 m) chlorowodorku estru benzylowego L-proliny, 14,29 g (0,0106 m) 1-hydroksybenzotriazolu, 15 ml N^metylomorfoMny oraz 125 ml suchego tetrahy¬ drofuranu* poddaje sie reakcji z 10,9 g (0,0529 m) 5 dicykloheksylokarbodiimidu oraz 15 ml suchego tetrahydrofuranu i postepuje w sposób opisany powyzej. Otrzymuje sie 20,4 g surowego estru ben¬ zylowego N^tert^butoksykarbonylo-D-alanylo-L- ^proliny. io Po wydzieleniu grup ochronnych otrzymuje sie chlorowodorek estru benzylowego D-alanylo-L- ^proliny o temperaturze topnienia 140—142°C.Substancje ta w ilosci 8,3 g (0,0265 m) poddaje sie reakcji kondensacji z 5,92 g (0,0265 m) chloro- 15 wodorku N^kanbometoksymetylo L-proliny z wy¬ tworzeniem 3,1 g estru benzylowego N-karbometo- ksyetylo-L-pirolilo-D-alanylo-L-proliny w postaci syropu.Po dzialaniu wodorotlenkiem baru z 3,0 g (6,7 20 mm otrzymanego diestru uzyskuje sie 2,1 g N- ^aitooksymetylo-Liprolilo-D-alanylo-L-proliny o temperaturze topnienia 145—148°, [ciPd = 39,5° C,l, 1 :1 CHfOH-HiO).W sposób analogiczny wytwarza sie N-2-karbo- 25 ksyetylo-LHprolilo-D-alanylo-L-proline o tempera¬ turze topnienia 170° z rozkladem (temperatura mieknienia 142—145°) [a]»D = 67,9° (C, 1, 1:1 CHiOH-H*0).Przyklad IX. Mieszanine 6,28 g (0,0332 m) 30 N^tertHbutoksykarbonylo-p-alanmy, 5,0 g (0,0332 m) chlorowodorku LHprolino-amidu, 8,96 g (0,0664 m) 1-hydroksybenizotriazolu, 12 ml N-metylomorfoli- ny, 75 ml tetrahydrofuranu, 40 ml dimetyloforma¬ midu i 6,84 g (0,0332 m) dicykloheksylokarbodiiimi- 35 du miesza sie w temperaturze 25°w czasie 17 go¬ dzin. Rozpuszczalniki odparowuje sie pod zmniej¬ szonym cisnieniem, a pozostalosc rozpuszcza sie w octanie etylu i wodzie.Rozdzielona faze organiczna przemywa sie mala 40 objetoscia rozcienczonego kwasu solnego, solanka, 5*/o wodoroweglanem oraz solanka. Osuszony eks¬ trakt zateza sie. Otrzymuje sie 3,2 g N-tert-buto- ksykarbonylo-P-alanylo-L^prolinoamidu w postaci syropu. Widmo masowe metanowej jonizacji che- 45 imdcznej jest zgodne z budowa dipeptydu.Produkt rozpuszcza sie w 35 ml suchego chlorku metylenu, chlodzi w wodzie lodowej i dodaje 15 ml kwasu trifluorooctowego. Roztwór miesza sie w temperaturze 0° w czasie 15 minut i w czasie 50 3 godzin w temperaturze 25°. Rozpuszczalniki od¬ parowuje sie pod zmniejszonym cisnieniemw tem¬ peraturze 40°. Otrzymuje sie sól trifluorooctowa P-alanyk)-LHprolinoamidu w postaci syropu. Zwia¬ zek ten (0,01 m) poddaje sie kondensacji z chlo- 55 rowodorkiem N-karbometoksymetylo-L^proliny, jak opasano powyzej z wytworzeniem N^karbometo- ksymelylo-LHprolalo-P-alanylo-Liprolinoamidu, z którego po dzialaniu wodorotlenkiem baru, otrzy¬ muje sie N-karboksymetylo-L^prolilo-fl-alanylo-L- 60 -prolinoamiid.Przyklad X. Zastepujac estrem N-karbome- toksymetylo-L^dehydiropiroliny wytworzonym me¬ toda alkilowania Adamka ester N^karbometoksy- metylo-Liproliny w przykladzie I, wytwarza sie 85 N^aiboksymetylo-L-dehydroprolilo-L-alanylo-L-IM 008 13 •iproline w postaci siarczanu. Stosujac w przykla¬ dzie I ester benzylowy kwasu N-karbometoksyme- tylopiroglutaminowy wytworzony sposobem alkilo¬ wania Adams^, otrzymuje sie N^karboksymetylo- piroglutamylo-L-alanylo-L-proline. Stosujac w 5 przykladzie I ester benzylowy kwasu 2-pirolidy- nylooctowy zamiast estru benzylowego L-proli- ny, otrzymuje sie kwas N^karboksymetylo-L-proli- lo-L-alanylo-2ipirolidynylooctowy. Stosujac po¬ chodna fM2-tienylo)alaniny (The Chemistry of He- io terocyclic Compound czesc III, Hartough, strona 262) zamiast pochpdnej alaniny wedlug przykladu I wytwarza sie NHkarboksymetylo-L-prolilo-D,L-(3- -(2-tienylo)-alanylo-L^proline.Stosujac w przykladzie I ester benzylowy N- 15 -metylosulfometyloproliny, wytworzony wedlug re¬ akcji alkilowania Adams'a ze znanego estru me¬ tylowego kwasu chlorometanosulfonowego, otrzy¬ muje sie Nnsulfometylo-L^prolilo-L-alanylo-L-pro- line. Stosujac w przykladzie I w miejscu estru 20 benzylowego N^dimetylofosfonometyloproliny znany ester dimetylowy kwasu chlorometylofosfonowego w alkilowaniu Adams'a, wytwarza sie N-fosfono- metylo-L^prolilo-L-alanylo-L-iproline. 25 Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych tripeptydów o wzorze 1, w którym R oznacza grupe karboksylo¬ wa, sulfonowa lub fosfonowa, alk oznacza grupe 30 alkilenowa o lancuchu prostym lub rozgalezionym, zawierajaca 1—5 atomów wegla za wyjatkiem gru¬ py etylidenowej, X oznacza atom O lub atomy H, H, Y oznacza atom H lub jezeli X oznacza atomy H, H wówczas Y oznacza grupe OH, linia prze- 35 14 rywana oznacza ewentualne wiazanie wegiel—we¬ giel w przypadku gdy X oznacza atomy H, H a Y oznacza atom H, n oznacza liczbe 0—3 wlacznie, a A oznacza reszte aminokwasu pochodzaca z D- lub L-Ala, D- lub L-Phe, D- lub L-0-metylo 0-Ala, D- lub L-fenylo-Gly, D- lub L-p-fenylo-0-Ala, D- lub L-P-tienyl-Gly, D- lub L-0-Ala, kwasu y-aim- nomaslowego, kwasu D- lub L-2-amino-maslowe- go, D- lub Iwior-Val, D- lub L-Leu, kwasu 3-ami- no-3-metylomaslowego, 2-metylo-Ala albo N-mety- lowa pochodna wymienionych reszt, albo ich far¬ makologicznie dopuszczalnych soli nizszych estrów alkilowych, o 1—5 atomach wegla w grupie alki¬ lowej lub estru benzylowego, znamienny tym, ze izwdazek o wzorze 2, w którym X i Y maja wy¬ zej podane znaczenie, a R1 oznacza ochroniona grupe karboksylowa, sulfonowa lub fosfonowa, poddaje sie reakcji ze zwiazkiem o wzorze 3, w którym A ma wyzej podane znaczenie, R2 ozna¬ cza grupe ochronna funkcji karboksylowej, a Rl oznacza grupe anionowa lub N-metyloaminowa, wydziela kazda z grup ochronnych i ewentualnie przeprowadza w farmakologicznie dopuszczalne sole tripeplydu lub ich estry. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze reakcje prowadzi sie w obecnosci karbodiimidu. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze reakcje prowadzi sie w obecnosci dicykloheksylo- karbodiimidu. 4. Sposób wedlug izastrz. 1, znamienny tym, ze fl-alanylo-L^pirodine w postaci chlorowodorku estru benzylowego, poddaje sie reakcji z chlorowodor¬ kiem N^karbometoksymetylo-L^proliny z wytwo¬ rzeniem N-karboksymetylo-Lnprolilo-P-alanylo-L- -proliny.im m Y O XCNJ-C-A-N/~] Tk ' H2;n R ^H WZOR 1 X^.rX-C02H + CL(CH,)n- fk A R r3 l2)n—CO2R2 WZOR 2 WZ0R 3 X 0 Y 9"< lru-1 Ali, V-1 R1 WZOR 'CH2)n C02R2 SCH EMA 1 alk I R WZOR I" I C02H 1i3*%fe CHo ' NH-CH-CO- WZÓR 5 CH2-C6H5 -NH-CH-CO — WZCfR 6 CH-: -NH~CH-CH2~C0- WZtfR 7 ^5 -NH-CH-CH2-C0- WZOR 8 P -NH-CH-CO- WZtfR 9 CeH5 -NH—CH-CO- WZCCR 10 C2H5 NH-CH-CO — WZÓR 11 C3H7 -NH—CH—CO WZÓR 12 C4Hg I ¦NH-CH—CO— WZdR 13 CH3 I — NH-C-CH2~C0- CH3 WZCfR U CH3 ¦NH-C—CO— I CH3 WZ^R- :%&:*f CHo I 3 — NH WZtf&v16 ue: PL PL