FI66842B - Foerfarande foer framstaellning av som analgetiska medel anvaendbara enkelfalinanaloger - Google Patents

Description

I55F1 [B] (^KUULUTUSJULKAISU £ £ Q Λ O

JX§Ka lJ ' ') UTLACCN INCSSKRIFT ooo4z +¾¾¾ c (45) Patentti cyönneUy 10 12 1904 ^ T ^ (51) Kv.ik?/IM.CL3 C 07 C 103/52 SUOMI —FINLAND (21) IWtUhdwmw-PMwwweknln* 782971 (22) HikamtapUvt —AnaOkninfKUf 29.09.78 (23) AHctipahrl—GIHtflMtsdag 29.09.78 (41) Tullut JulklMlal — Blhrlt affamNf η<^

Patentti· ja rakistarihallitu· (44) Nthtftvtksipanon kuuLJvrikfttsun pvm. — ,, no ΟΛ

Patent- och registarstyralMd Anrtkan Utkgd odi utl-skrtftM pabHcarad i 1 ·Uö ·04 (32)(33)(31) ΡχΤ«··«Τ •taelkeu·—β^«ηΙ prior** 03.10.77 USA(US) 838516 (71) Eli Lilly and Company, 307 East McCarty Street, Indianapolis,

Indiana A6206, USA(US) (72) Edward Lee Smithwick, Jr., Indianapolis, Indiana,

Robert Curtis Arthur Frederickson, Indianapolis, Indiana,

Robert Theodore Shuman, Greenwood, Indiana, USA(US) (7^) Oy Kolster Ab (5*0 Menetelmä ana 1geettisina aineina käyttökelpoisten enkelfaliini-analogien valmistamiseksi ~ Förfarande för framstä11 ning av som analgetiska medel användbara enkelfalinanaloger Tämä keksintö koskee menetelmää analgeettisina aineina käyttökelpoisten enkelfaliinianalogien valmistamiseksi, joilla on kaava I, (L)

OO O R.R.O

Hv (L) Il (D) K K [4|5|| '>N-CH-C-NH-CH-C-NH-CH_-C-N-C-C-NH„ (I) 1 I 2 I 2 CH0 CH- CH~ Φ 0

OH

jossa L ja D, soveltuvassa tapauksessa, määrittelevät kiertosuunnan; ja jossa R4 on -C^-alkyyli; ja R& on vety tai -C-^-alkyyli; _____ - Γ“ 2 66842 ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien, myrkyttömien happo-additiosuolojen valmistamiseksi. Tämän uuden yhdisteluokan yhdisteillä on parenteraalisesti annettaessa merkittävä ja osoitettavissa oleva analgeettinen vaikutus.

Nisäkkäiden aivo- tai aivo-selkäydinnesteestä (csf) on hiljattain uutettu sisäsyntyisiä aineita, joilla on morfiilin kaltaisia ominaisuuksia. Nämä aineet, joista käytetään nimitystä enkefa-liini, Hughes ym. (Nature 258 (1975) 577) ovat identifioineet pentapeptideiksi, joiden kaavat ovat seuraavat:

K-Tvr-GIy-Gly-Phe-Met-OH

H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Lcu-OH.

Näistä yhdisteistä käytetään nimitystä metioniini-enkefalii-ni ja vastaavasti leusiini-enkefaliini.

Vaikkakin näillä yhdisteillä on osoitettu olevan analgeet-tista vaikutusta aivokammionsisäisesti hiirelle annettuna /Buscher ym., Narute 261 (1976) 423j, niillä ei ole käytännöllisesti katsoen lainkaan käyttökelpoista analgeettista vaikutusta parenteraalisesti annettuna.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle uusien, kaavan I mukaisten enkelfaliinianalogien valmistamiseksi on tunnusomaista, että vastaavasti suojatusta yhdisteestä, jolla on kaava II

(L)

0 0 0 R LO

R2 il) li (D) li il |V|| "-ÖrN-CH-C-NH-CH-C-NH-CH _-C-N-C-C-NH0 (II)

Rf^" ! » 2 I 2 f2 CH3 f 2 O f) 'k'/

OH

jossa ja toisistaan riippumatta merkitsevät vetyä tai cx-aminosuojaryhmää, kuten tert.-butyy1ioksikarbonyyliä, ja R^ ja R merkitsevät samaa kuin edellä, lohkaistaan suojaryhmät happo-väliaineella, kuten trifluorietikkahapolla, jääetikkahapolla, jossa on HCl-kaasua tai muurahaishapolla.

Farmaseuttisesti hyväksyttäviä myrkyttömiä happoadditiosuo-loja ovat orgaaniset ja epäorgaaniset happoadditiosuolat, esimerkiksi suolat, jotka on valmistettu selliaisista hapoista kuin suo- 66842 lahappo, rikkihappo, sulfonihappo, viinihappo, fumaarihappo, bromi-vetyhappo, glykolihappo, sitruunahappo, maleiinihappo, fosfori-happo, meripihkahappo, etikkahappo, typpihappo, betnsoehappo, as-korbiinihappo, p-tolueenisulfonihappo, bentseenisulfonihappo, naf-taleenisulfonihappo, ja propionihappo. Happoadditiosuolat ovat edullisesti suoloja, jotka on valmistettu suolahaposta, etikkahapos-ta tai meripihkahaposta. Kaikkia edellä mainittuja suoloja valmistetaan tavanomaisin menetelmin.

Kaavan (I) mukaisten yhdisteiden oleellinen ominaisuus on niiden stereokonfiguraatio. Mukavuussyistä modifioitujen kaavan (I) mukaisten tetrapeptidien aminohappotähteet on numeroitu pääteami-noryhmätähteestä alkaen. Aminohappotähteiden kierto asemasta 1 asemaan 3 on L, D, ei kiertoa. Asemassa 3 oleva tähde on glysiini-osa, ja näin ollen tämän tähteen osalta ei esiinny kiertoa. Aseman 4 osalta (C-pääteasema), jossa on primäärinen amidi, sen kierto määrittyy siksi, joka on vastaavalla oletetulla L-aminohappotähteel-lä.

Kaavan (I) mukaisten modifioitujen tetrapeptidien kussakin asemassa olevien määrättyjen tähteiden osalta pätevät seuraavat tärkeät seikat: (A) . Asema 1.

Tämä asema edustaa peptidin amino-pääteosaa. Tähde on peräisin L-tyrosiinista tai L-(O-asetyyli)tyrosiinista; edullisesti tähteenä on tyrosyyli.

(B) . Asema 2.

Kaavan (I) mukaisen peptidin toisessa asemassa olevan aminohappotähteen on oltava D-stereoisomeeri ja edullisesti se on D-alaniinin (Ala) johdannainen.

(C) . Asema 3.

Tässä asemassa oleva aminohappotähde on glysiinin (Gly) johdannainen .

(D) . Asema 4.

C-pääteasemassa oleva tähde on L-fenyylialaniinin (Phe) johdannainen. Tähde on primäärinen amidi (Phe-NH^).

Tähteen aminotyppi on substituoitu (R^). Tähteessä oleva N-substituentti, on N-metyyli, N-etyyli tai N-n-propyyli, edullisesti N-metyyli. Lisäksi tähteen c*.-hiilessä voi olla substituentti 4 Γ7 66842 (Rg); tällöin R,- voi olla metyyli, etyyli tai n-propyyli, edullisesti metyyli.

Tässä julkaisussa käytetään seuraavia lyhenteitä, joista useimmat ovat alalla hyvin tunnettuja ja yleisesti käytettyjä:

Avu- «--aminovoihappo

Ala - alaniini

Gys - kysteiini

Gly - glysiini

Hse - homoseriini

Ile - isoleusiini

Leu - leusiini

Met - metioniini

Nle - norleusiini

Nva - norvaliini

Phe - fenyylialaniini

Phe-Nf^ - fenyylialaniini-amidi

Ser - seriini

Tyr - tyrosiini

Vai - väliini

Ac - asetyyli

Me - metyyli

Et - etyyli BOC - t.-butyylioksikarbonyyli Bzl - bentsyyli DCC - N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidi HBT - 1-hydroksibentsotriatsoli DMF - N,N-dimetyyliformamidi TFA - trifluorietikkahappo THF - tetrahydrofuraani DEAE - dietyyliaminoetyyli DCHA - disykloheksyyliamiini

Kaavan (I) mukaisia yhdisteitä valmistetaan totunnaisin menetelmin, joita käytetään peptidejä syntesoitaessa. On mahdollista, että eräiden kaavan (I) mukaisten yhdisteiden syntesoinnin aikana voi tapahtua osittaista rasemoitumista. Mikäli tällaista ra-semoitumista tapahtuu, sitä ei kuitenkaan tapahdu sellaisessa määrässä, että se muuttaisi arveluttavasti kaavan (I) mukaisen yhdisteiden analgeettista vaikutusta.

5 66842

Kaavan (I) raukaisten yhdisteiden valmistusmenetelmiin sisältyy aminohappojen tai peptidiosien kytkeminen toisiinsa antamalla toisen karboksyyliryhmän reagoida toisen aminoryhmän kanssa, jolloin syntyy amidisidos. Jotta kytkeytyminen saadaan tehokkaaksi, on toivottavaa, ensiksi, että kaikki reaktiokykyiset ryhmät, jotka eivät suoraan osallistu reaktioon, inaktivoidaan käyttämällä sopivia suojaryhmiä, ja toiseksi, että kytkettävä karboksyyliryhmä aktivoidaan sopivalla tavalla kytkentäreaktion edistämiseksi. Tämä kaikki edellyttää sekä reaktiosarjän että reaktio-olosuhteiden huolellista valintaa samoin kuin spesifisten suojaryhmien käyttämistä siten, että halutun peptidituotteen valmistus voidaan toteuttaa. Kutakin aminohappoa, jota käytetään kaavan (I) mukaisten yhdisteiden valmistamiseen ja jossa on erityisesti valitut suojaryhmät ja/tai aktivoivat ryhmät, valmistetaan käyttämällä peptidialalla hyvin tunnettuja menetelmiä.

Kussakin kaavan (I) mukaisten yhdisteiden kokonaissynteesin kohdassa käytetään valittuja suojaryhmäydhistelmiä. Näiden erikois-yhdistelmien on todettu toimivan erittäin luontevasti. Muutkin yhdistelmät voivat olla käyttökelpoisia kaavan (I) mukaisia yhdisteitä syntesoitaessa, joskin, ehkä, heikommalla menestyksellä.

Täten kaavan (I) mukaisten yhdisteiden synteesissä aminosuojaryh-minä voidaan käyttää eri tavoin, esimerkiksi, bentsyylioksikarbo-nyyliä (CBz), t-butyylioksikarbonyyliä (BOC), t-amyylioksikarbonyy-liä (AOC), p-metoksibentsyylioksikarbonyyliä (MBOC), adamantyyli-oksikarbonyyliä (AdOC), ja isobornyylioksikarbonyyliä. Lisäksi tyrosyyli-tähteen hydroksi-suojaryhmänä käytetään tavallisesti bentsyyliä (Bzl) siitäkin huolimatta, että voidaan hyvin käyttää muitakin ryhmiä, kuten p-nitrobentsyyliä (PNB) , p-metoksibentsyyliä (PMB).

Kaavan (I) mukaisten yhdisteiden valmistuksessa käytettävät karboksyyli-suojaryhmät voivat olla mitä tahansa tyypillisiä esterin muodostavia ryhmiä, mukaan luettuina, esimerkiksi, metyyli, etyyli, bentsyyli, p-nitrobentsyyli, p-metoksibentsyyli, ja 2,2,2-trikloorietyyli.

Sopivasti suojatun N-blokeeratun aminohapon tai peptidiosan kytkemiseen sopivasti suojatun karboksi-blokeeratun aminohapon tai peptidiosan kanssa kaavan (I) mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi ___ - Γ 6 66842 sisältyy aminohapon tai peptidiosan vapaan karboksyyliryhmän aktivointi kytkentäreaktiota varten. Tämä voidaan suorittaa käyttämällä mitä tahansa monista hyvin tunnetuista menetelmistä. Erääseen tällaiseen aktivointimenetelmään sisältyy karboksyyliryhmän muuttaminen seka-anhydridiksi. Vapaa karboksyyliryhmä aktivoidaan antamalla sen reagoida toisen hapon, tavallisesti karboksyylihappojohdannaisen, kuten happokloridijohdannaisen kanssa. Esimerkkejä seka-anhyd-ridien muodostamiseen käytetyistä happoklorideista ovat etyylikloo-riformiaatti, tenyyliklooriformiaatti, sek .-butyyliklooriformiaat-ti, isobutyyliklooriformiaatti ja pivaloyylikloridi. Edullisesti käytetään isobutyyliklooriformiaattia.

Toisena menetelmänä karboksyyliryhmän aktivoimiseksi kytken-täreaktion suorittamista varten on sen muuttaminen aktiiviseksi esterijohdannaiseksi. Sellaisia aktiivisia estereitä ovat esimerkiksi, 2,4,5-trikloorifenyyliesteri, pentakloorifenyyliesteri, ja p-nitrofenyyliesteri. Toinen käytettävissä oleva kytkentäreaktio on hyvin tunnettu atsidi-kytkentäreaktio.

Ensisijaiseen kytkentämenetelmään kaavan (I) mukaisten yhdisteiden valmistamiskesi sisältyy N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidin (DCC) käyttö vapaan karboksyyliryhmän aktiovimiseen, mikä mahdollistaa kytkeytymisen. Tämä aktivointi - ja kytkentämenetelmä suoritetaan käyttämällä DCC:tä aminohappoon tai peptidiosaan nähden ekvimoolimäärän ja suoritetaan ekvimolaarisen 1-hydroksibensto-triatsoli (HBT)-määrän lsänäollessa. HBT:n läsnäolo ehkäisee ei-toivotut sivureaktiot, rasemioitumismahdollisuus mukaan luettuna.

Kaavan (I) mukaisia yhdisteitä valmistettaessa käytettävän synteesisarjän tietyissä kohdissa on lohkaistava valittuja blokee-raavia ryhmiä. Peptidisynteesialan tuntevan kemistin on helppo valita edustavista suojaryhmistä ryhmät, jotka ovat sopivia siinä mielessä, että tuotteen selektiivinen lohkaiseminen voidaan suorittaa poistamalla yksi tai useampia, mutta ei kaikkia läsnäolevia aminohapon tai peptidiosan suojaryhmiä. Nämä mentelmät ovat hyvin tunnettuja peptidialalla. Täydellisempi selostus menetelmistä, jotka ovat käytettävissä selektiivisen lohkaisun suorittamiseksi, on saatavissa kirjallisuudesta, Schröder and Lubke, The Peptides, Volume I, Academic Press, New York, (1965), ja erityisesti siinä sivuilla 72-75 esitetystä taulukosta.

7 66842

Karboksyylisuojaryhmien lohkaiseminen voidaan suorittaa alkalisen saippuoinnin avulla. Suojatun karboksyylin esterin lohkaiseminen suoritetaan yleensä suhteellisen ankarissa aikalisissä olosuhteissa, tyyppillisesti käyttämällä alkalimetallihydroksidia, kuten natriumhydroksidia, kaliumhydroksidia tai litiumhydroksidia. Alan asiantuntijat tuntevat hyvin reaktio-olosuhteet, joissa saip-puointi suoritetaan. Karboksyylin suojaryhmät voidaan poistaa myös hydraamalla katalyyttisesti, mukaan luettuna, esimerkiksi, hydraaminen katalyytin, kuten palladiumhiilen läsnäollessa. Lisäksi tapauksissa, joissa karboksyylin suojaryhmänä on p-nitrobentsyy-li tai 2,2,2-trikloorietyyli, suojauksen poistaminen voidaan suorittaa pelkistämällä sinkin ja suolahapon läsnäollessa.

Aminosuojaryhmät lohkaistaan käsittelemällä suojattua aminohappoa tai peptidiä hapon, kuten muurahaishapon, trifluorietikka-hapon (TFA), p-tolueenisulfonihapon (TSA), bentseenisulfonihapon (BSA) tai naftaleenisulfonihapon kanssa vastaavan happoadditiosuo-latuotteen muodostamiseksi. Aminosuojaryhmän lohkaiseminen voidaan suorittaa myös käsittelemällä suojattua aminohappoa tai peptidiä HBr:n tai HCl:n ja etikkahapon seoksella vastaavan hydrobromidi-tai hydrokloridi-happoadditiosuolan muodostamiseksi. Käytettävä erikosmentelmä tai reagenssi riippuu spesifisessä suojauksen pois-tamisreaktiossa käytettävien aineiden kemiallisista tai fysikaalisista omianisuuksista.

On todettu, että kun suojaus on poistettava peptidistä, jossa on ainakin kolme amonohappotähdettä, on erittäin suotavaa, että peptidin suojaryhmän lohkaiseminen suoritetaan trifluorietikkaha-polla tai muurahaishapolla, jolloin saadaan vastaavaa happoadditio-suolaa. Suola voidaan muuttaa farmaseuttisesti hyväksyttävämpään muotoon käsittelemällä sopivalla ioninvaihtohartsilla, kuten tuotteilla DEAE Sephadex® A25 tai Amberlyst® A27.

Tyrosyyli-tähteessä oleva hydroksi-suojaryhmä voidaan säilyttää peptidissä koko valmistussarjan ajan, jolloin se poistetaan viimeisen synteesivaiheen aikana samassa yhteydessä kuin aminosuo-jaryhmäkin lohkaistaan. Karboksyylisuojaryhmän poistamiseen käytettävistä olosuhteista riippuen se voidaan kuitenkin poistaa aikaisemmassa valmistusvaiheessa. Kun karboksyyliryhmä lohkaistaan alkalilla saippuoimalla, hydroksi-suojaryhmä säilyy; kuitenkin käy- _ _ - T“ 8 66842 tettäessä katalyyttistä hydrausta karboksyylisuojaryhmän poistamiseksi, hydroksi-suojaryhmäksin voi lohjeta. Viimeksi mainittu tilanne ei edusta vakavaa huolen aihetta sillä kaavan (I) mukaisten yhdisteiden valmistaminen voidaan suorittaa tyrosyylitähteen läsnäollessa, jossa on vapaa hydroksyyliryhmä.

Ensisijaiseen spesifiseen kaavan (I) mukaisten yhdisteiden valmistusmenetelmään sisältyy erikseen valmistetun N-päätteisen tripeptidin kytkeminen erikseen valmistettuun V-päätteiseen fenyy-lialanyyliamidiin, minkä jälkeen lohkaistaan sopivalla tavalla kaikki jäljellä olevat suojaryhmät.

Vaihtoehtoisesti erikseen valmistettu C-päätteinen fenyyli-alanyyli-yhdiste, jonka annetaan reagoida N-päätteisen tripeptidin kanssa, voi olla siten konstruoitu, että siinä on ryhmä, joka vastaa amidiosan edeltävää ryhmää. Yleinen reaktiosarja, joka kuvaa kaavan (I) mukaisen tetrapeptidin valmistusta, voidaan esittää seu-raavan piirroksen avulla. Reaktiosarjassa symboli AA vastaa aminohappotähdettä, ja alanumero vastaa aminohapon asemaa lopullisessa peptidituoteketjussa.

9 66842 A. Tripeptidi-osan valmistus.

OOC-L-Tyr-OH + H-D-(AA)a-OBzI

°Bzl DCC

HBT

\ /

BOC-L-Tyi—D-(AA)2~0DzI I

OBz I

0H_ \ /

BOC-L-Ty I—D-(AA)2-OH I

OBz I

H—G ty-OBzI DCC HBT

\ /

BOC-L-Ty I—D-(AA)2-GIy-OBzI I

OBz I

Hz NaOH

Pd/C THF/HzO

\ / \ /

BOC-L-Tyi D-(AA)a-GIy-OH BOC-L-Tyr-D-(AA)2~GIy-OH

I I

OH OBzI

- - r: 10 66842 B. Tripeptidin ja fenyylialanyyli-pääteosan kytkentä.

R.R-

II

BOC-L-Tyr-D-(AA)~-Gly-OH + HN-C-Q

I I

OY CH

DCC I

Ph

HBT

r.r- I 4 I5

BOC-L-Tyr-D-(AA) -Gly-N-C-Q

I ! OY CH- I 2

Ph

Edellä esitetyssä reaktiossa Ph vastaa fenyyliä ja Q on

O O

Il il -C-NH2, -C-OCH2Ph, ja muu näiden kaltainen ryhmä.

Kun Q vastaa bentsyyliesteriä tai muuta esteriä, jossa hyd-raamalla helposti poistettavissa oleva ryhmä, se voidaan muuttaa vapaaksi hapoksi hydraamalla palladium-hiilen läsnäollessa. Vapaa happo on muutettavissa amidiksi käsittelemällä ammoniakin kanssa DCC:n ja HBT:n läsnäollessa.

Valmistettaessa edellä selostetun menetelmäsarjän avulla kaavan (I) mukaisia yhdisteitä on erittäin suositeltavaa käyttää, 0

II

C-pääte-reagenssina, yhdistettä, jossa Q on -C-NH2.

Kun on saatu valmistetuksi haluttua modifioitua tetrapepti-diä, jossa on C-pääteryhmä, tyrosyylin O-suojaryhmä (mikäli sellainen on läsnä) voidaan poistaa hydraamalla ja N-BOC-suojaryhmä käsittelemällä trifluorietikkahapolla.

Kaavan (I) mukaisten yhdisteiden valmistukseen voidaan käyttää myös monia muita menetelmiä.

Erääseen sisältyy vaihettainen, sarjana tapahtuva yksittäisten aminohappojen tai niiden johdannaisten lisääminen peptidiket-jun runkoon alkaen karboksiamidi-pääteosasta. Tässä, samoin kuin missä tahansa muussa vamistusmenetelmässä, voidaan käyttää esimerkiksi edellä selostetun kaltaisia reaktiomenetelmiä.

66842

Koska on C^-C^-alkyyli, voidaan valmistusarjassa käyttää sopivaa N-substituoitua aminohappoa. Mitä tahansa N-substituoi-duista aminohapoista voidaan valmistaa samalla mentelmällä, joka on esitetty seuraavalla tavalla käyttämällä lähtöaineena N-suojat-tua aminohappoa: H KH K+ I v I- _ +

BOC-N- (AA) -COOH --------------τ> BOC-N - (AA)-COO K

18-kruunu-6-eetteri THF C^-C^ primäärinen DMF ψ alkyylijodidi

R

la

BOC-N-(AA)-COOH

Kuten edellä oleva reaktiovaihe osoittaa, N »-suojattua aminohappoa käsitellään ensin kaliumhydridillä sopivan kruunu-eetterin läsnäollessa dianionin muodostamiseksi. Väliyhdistettä käsitellään sitten sopivalla alkyylijodidilla, jolloin saadaan haluttua N-substituoitua aminohappoa.

Peptidisynteesi-alan asiantuntijoille on selvää, että «.-hiilen rasemoituminen voi tapahtua vahvasti aikalisissä olosuhteissa, jollaisia käytetään edellä esitetyssä alkylointimenetelmässä. Ra-semoitumisaste voi vaihdella kyseisestä aminoyhdisteestä riippuen. Rasemoituminen saadaan mahdollisimman vähäiseksi käyttämällä alky-lointiainetta ylimäärin ja pitämällä reaktioaika mahdollisimman lyhyenä. Siitä huolimatta silloinkin'kun tapahtuu liiallista rase-moitumista, tuote voidaan puhdistaa kiteyttämällä uudelleen sopivan kierron omaavan amiinin suolana, esimerkiksi d(+) «-fenyylietyyli-amiinin suolana.

Muodostunut aminohappo, jossa R^ on C^-C^-alkyyli, voidaan muuttaa vastaavaksi amidikseen millä tahansa edellä selostetulla menetelmällä.

Eräissä kaavan (I) mukaisissa yhdisteissä ryhmä on C^-C^-alkyyli. Tällöin valmistusvaiheessa käytetään sopivaa «-hiili-subs-tituoitua aminohappoa tai sen vastaavaa esteri- tai amidijohdannais-ta. Tiettyä «-hiili-substituoitua fenyylialaniinia voidaan valmistaa käyttämällä mentelmää, joka on esitetty artikkelissa Stein ym., 12 66842

Journal of the American Chemical Society 77 (1955) 700-703. Ra-seemisen seoksen hajoittaminen suoritetaan artikkelin Turk ym., J. Org. Chem. 40 (1975) 953-955 mukaisesti. Muodostunut ot-substi-tuoitu fenyylialaniini voidaan muuttaa vastaavaksi amidiksi edellä selostettujen menetelmien mukaisesti. Tämä voidaan suorittaa joko ennen sen käyttämistä tetrapeptidiketjun valmistuksessa tai sen jälkeen; erityisen suositeltavaa on kuitenkin, että se suoritetaan ennen tetrapeptidin valmistusta.

Kaavan (I) mukaiset yhdisteet ovat käyttökelpoisia analgeet-tisina aineina. Kaavan (I) mukaisten yhdisteiden analgeettinen vaikutus osoitetaan hiirellä kuumalla levyllä suoritettavassa kokeessa. Tässä kokeessa hiiri pannaan pystyasennossa olevaan akryy-lisylinteriin, jonka pohjana on kuuma levypinta, joka pidetään 52°C:ssa. Tässä kokeessa hiirelle annetaan, ihonalaisena ruiskeena, edeltä käsin määrätty määrä kokeiltavaa yhdistettä liuotettuna tai suspendoituna sopivaan kantajaan. Koeyhdisteen annon jälkeen annetaan kulua edeltäkäsin määrätty aika, ja sen jälkeen hiiri sijoitetaan kuumalle levypinnalle. Sitten tallennetaan viipymisajat sekunneissa kummankin kahden erillisen ilmiön ilmaantumiseen. Ensiksi mitataan viipymisaika kunnes hiiri nuolaisee takakäpäläänsä, ja toiseksi mitataan viipumisaika kunnes hiiri hypähtää kuumalta levypinnalta. Analgeettista vaikutusta omaava aine pidentää näitä viipymisaikoja verrattuna kontrollihiirillä, jotka ovat saaneet ruiskeena vain kantajaa, mitattuihin viipymisaikoihin. Tämän on tapahduttava annosalueessa, joka ei aiheuta liikehermon yhteistoi-mintahäiriötä tai toimintakyvyttömyyttä. Seuraavissa taulukoissa ovat tulokset, jotka on saatu tässä kokeessa, verrattuna suola-liuoskontrollikokeen antamiin arvoihin. Taulukossa I ovat takakä-pälän nuolemiseen kuluneet ajat, ja taulukossa II ovat hypähtämi-seen kuluneet ajat. Vakuttavan analgeettisen vaikutuksen kriteerio-na ovat seuraavat seikat: ajan, joka kuluu käsitellyltä eläimeltä takakäpälän nuolemiseen tai hypähdykseen on oltava yhtä pitkä tai pitempi kuin kontrollieläimillä keskimäärin kuluneen ajan ja kahden standardikeskiarvopoikkeaman summa. Kukin seuraavissa taulukoissa I ja II esiintyvä tulos vastaa keskiarvoa plus tai miinus standardivirhe.

Il 66842

Koeyhdisteet: A. L-tyrosyyli-D-alanyyli-glysyyli-N- ot-metyyli-L-fenyyliala-nyyli-amidi, asetaattisuola.

B. L-tyrosyyli-D-alanyyli-glysyyli-L- <*—metyyli-fenyylialanyy-li-amidi, asetaattisuola.

C. L-tyrosyyli-D-alanyyli-glysyyli-N- cst-n-propyyli-L-fenyyliala-nyyli-amidi, asetaattisuola.

D. L-tyrosyyli-D-alanyyli-glysyyli-N ct-etyyli-L-fenyylialanyy-li-amidi, asetaattisuola.

14

I 1 I I I I I 1 I

66842 o

CO

04 rH

<T» H 04 • · rH ro m σ\ xr uo · · · · O 04 rH r- CO 04 h +1 i +1 +1 +1 +1 I I +1

cn cm o OJ

• · · « · · Ν' H H va cn o rH o r- n· cn cn

(C 1-1 rH

m <U n m +J cn <o G · H cn n-

Λί ci + I + I l I I I I I I

1) (N I—I

03 G · • cn 00 ,. O' ΙΊ <f

G

Ö5 M N

3 -H

+-> co ε 3 cn H X +>

•H 3 03 H CN

G G 0 I + I I I I I I I I

0 > 3 G cn

Μ Ή G

G G ^ G O) X rn

Ή G

G -H G

G 4-) <33

Eh 4-) (1) rH

<U tn r- m a) ή ·

Di E cn ι-t -πω <n I I I I I I + I + I i

G iH . T O

GO O · <C G σ\ -3· G cn cn

G

:G Hr^iHCNr'-cj'icrirHcrir^ rH rH ····«·· ·

:03 rHrHCOfNtNOOCOHrH

a 0 +| +1+1 +1+1 +1+1 +1+1 :G Girin’TrocNCNcjioo X 44.........

G CiDrHcnCNOOOOiDLnoO

OcNcncncncNcNCNCNCN G 4-) «

Eh G

G -G G

G

G-H-h ιηιηιηοοοιηιηο

WG E iHi—IrHcniOiTirHrHCN

rH

<13 +) 03 <

*H

Ό X!

X

15

I I I I I I I I I II II

66842 o rn rn ro

<D O rH

• · rH 00 σ> <£) <D rH

CM O · · rH

o rH i—i ro rn m r-π un o ή +| I +1+1 I +I+I+I+I I +1 I +1 ^ ο Ή CO rH o m crv m h ο ld co o ό ld «ζτ mrocN(N un cm

n (N CM rH

m c- r- cm fO * * .

•r—> CM CM cm c- 0) ro+1+Ιιιιιιιι I +1 I +1

-P 03 Γ- in CM CM

C .

3 σ' LO O m A! a: m -r mm 3 0) P cn u>

* E

-*-* to mm rä 3 fö w in tr en •f-1 +j λ; o .

3 Ή C>-i<n <Nm

,, AI (0 C l+llllllll -Hl + | I

M -H <C 00 rr (N

I Π3 -P . .

O > 3 •'T (N (N

a; G m m n*

Ai G 3 3 m ή •H C 3

3 -A M (V) fO

fO -P σ, m E-i 4-1 . .

- Ή (N CM

2i3 ro 1 I I I + I I I I I -Hl + I I

3 S o *

JS ΐ H (N (N

< g ” mm

<D

^ Γ^Γ^-σ'σ'σ'ΌΌ'^'Γ^οοΓ^Γ'^Η H ···♦····...·.

Z> rHrHU^UDrHCMCNi—I *H »H <—I Csl^H

+ 1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 £ CMH'COCOOOOr^O CM Γ"' Ιίζ, *

,» <TlrHa>0>LnOO<H00 ν£> ο 1C

:ίβ CMPOCMCMCMiHrnCMCM CM CM Cl (N

On +) (C 3 jO 3 (Ö c ^ mmoouioooo mm mm /3 'dg "-(^Hmmi-imcrNrsim γΗγη «h .-h W 10 Ή t—i 0)

w « U Q

H

Ό

G

iH

__ ” r ............

16 66842

° I I I I I I I I I I I I I

m

rH

r—I rH *3* Γ-* rH I—( CO N Π rH Γ" .

I—I Γ’*- * * 00 o · • · (N TT · . ^ r-H Γ—( cr> cm i—ι Ή cn r- + | I + | + | o fli + I + I -f t t- I I I + | γμ m^· i~l CM fO <N Ο <Ν Γ' · .

• · · · . vo co o

CM Τ' m lil Ο «J· CM rM CO

cm ro as o r-t o cm cm

i’N ("N rH rH ·—{ rH

^ iH rH

-r7 -H in in cm 00 O .

o-i g cn I—i (—i

3 ^ ή +1 +1 l I

·* m+l+llllllll mt ro *; fT3 —I 'vf .

ω ... CM «3* CT· ΡΊ Ο ιΛ

rn " X ΓΟ *T H rH

3 M σ ^ M m

H 3 « E

X 05 , 0 -H +J O lt, ^

y 5 5 5 -H I Μ I I I I I l I I I + | I I

3 > d «j ^ s s s s d S .5 * - -

-M C

4J 0) «, 0) <D ™ _ ω en

Cn M ' M

3 * h «;

rr ooilllll+l+ll I I I I

3 4 o "· ° >i ^

Xi ™ O

O —i —·

^ o·") vO VO

(p Γ~- i—l-vf-rHOOCOO'ii—I CM U0 ...

pj . o m· rr

vrcnr^cooocovocri··^ ιτ> .h i iH

+ 1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 'Tr-irMCMininr—r^oo οοσνοοοο cocNOOOororoo'i ro cm n ro *3>νΟΟΟνΟΟΟΟΟΓ'νΟνΟ 'Ο'νΟΓ'Γ^ 4J ' d e d ra · r-H ^ C uo m o o p .,-1 h uo un in o o o uo m o i .-i ro vo

'—li—I*—I CO CD CTi i—li—I (N

rH

V

+J

Ui

•H

rQ << PQ

Jd 1 I I i t i I ii 66842 17 ro ΓΟ r-i <N Γ\! <N f- ,-m • m oo ·

m . . rH · '—I

Η Γ" 1/) H CJ O

I i I -i-1 +1 ϊ- I I -hl I +1

o ro rH *s£> O

•—i · · · * ♦ ♦ ’]' O) Τ'" o -- co cd o cm m vr

.p—j f—\ rH C -i C'J

CD

4J r-l rH

c ^ l'J

^ Z· KD

^ fl) '—* r~^ cn lllll I 4- I I 4- i -X Ό o vr ® 3 ij · m oo ~ 4j O1 in 3 ·Η -4 1 I nj Η Λ! 3 ^

Η -H fT* rH rH

G +J £ <N o 0 > 3 · 44 C w M- in

44 C D O rH rH

3 δ h c -· 1 1 1 I I +1 I +1 I

rH G 3 G VD rH

3 -H .* < · rj 4 o in B 4 C fM oo

0) (U rH rH

dJ (D

en tn 1—I CN CN

h a; oo m r- 3 >i · · G T3 m mm

,G rH (—I f—I

:¾ +1 +1 I +1 i

Qj '’I t— I I I I CTH <N

>1 · ·

,G o n oo rH

O m rH cn

44 rH rH rH

3

d, -H

rH ,-, oo oo r~ in m r- r- I—1 . . . · . · . · .

O oi m in in i.r 4' in r~ r- G l· I 4 I 4-1 4- I -r I 4 I 4- 1 4 I 4- i

4J r~- f-J rs| -T co r~ ID 00 rH

G.........

O o tn m oi O'. m m mcr\ io m m p> id o γ- ιοι-'

-U

3 G ' 3 3· ή 44 (.: 3 -H ..h m o o o o m m m m

£4 3 £ Ή ID OH (N CN i—l i—I rHrH

Ή i—1

<D

4J

tfl

-H

'S m o a

Sl

>H

18 66842

Taulukoiden I ja II viite a:

Yläviitteinä esiintyvät numerot "1", "2" ja "3'' osoittavat, että tulos on merkitsevä arvoon PL 0,001, PL 0,01 ja vastaavasti arvoon PL 0,05.

Kaavan (I) mukaiset yhdisteet ovat siis arvokkaita farmaseuttisia aineita. Niillä on analgeettista vaikutusta, ja erityisesti ne ovat hyödyllisiä annettuna parenteraalisesti nisäkkäille, ihmiset mukaan luettuna.

Kaavan (I) mukaisia yhdisteitä voidaan antaa sellaisinaan, tai niitä voidaan sekoittaa ja formuloida farmaseuttiksiksi, annos-yksikkömuodossa oleviksi parenteraalisesti annettaviksi valmisteiksi. Seoksia tehtäessä ja formuloinnissa voidaan käyttää orgaanisia tai epäorgaanisia kiinteitä aineita ja/tai nesteitä, jotka ovat farmaseuttisesti hyväksyttäviä kantajia. Alan asiantuntijat tuntevat hyvin sellaisiksi sopivat kantajat. Seokset voivat olla tablettien, jauheiden, rakeiden, kapselien, suspensioiden, liuosten ja näiden kaltaisten valmisteiden muodossa.

Tehoavin määrin annettuna kaavan (I) mukaiset yhdisteet aiheuttavat analgeettisen vaikutuksen. Annosmäärät voivat yleensä olla välillä noin 0,1 milligrammaa - noin 100 milligrammaa saajan kehon painon kiloa kohden. Ensisijainen annosalue on tavallisesti välillä noin 1,0 milligrammaa - noin 20 milligrammaa saajan kehon painon kiloa kohden.

Seuraavat esimerkit kuvaavat kaavan (I) mukaisten yhdisteiden valmistusta.

Esimerkki 1 L-tyrosyyli-D-alanyyli-glysyyli-N ^-metyyli-L-fenyylialanyy-li-amidin asetaattisuolan valmistus.

A. Bentsyyli-D-alinaatti p-tolueenisulfonaatti.

Seokseen, jossa oli 100 ml bentsyylialkoholia ja 200 ml bentseeniä ja jossa oli 55,1 g (0,29 moolia) p-tolueenisulfoni-happo-monohydraattia, lisättiin 25 g (0,281 moolia) D-alaniinia. Seos lämmitettiin kiehuvaksi, ja vettä poistettiin atseotrooppises-ti Dean-Stark-laitteella. Seosta lämmitettiin viisitoista tuntia ja sen jälkeen se jäähdytettiin huoneen lämpötilaan ja laimennettiin eetterillä. Muodostunut sakka koottiin talteen ja kiteytettiin uudelleen metanoli/eetteri-seoksesta, jolloin saatiin 55,3 g 19 66842 (56 %) otsikon yhdistettä, sp. 112-115°C.

Analyysi, laskettu yhdisteelle ci7H21N05S (351,42): C, 58,10; H, 6,02; N, 3,99; saatu: C, 58,19; H, 6,06; N, 3,82.

B. Bentsyyli-N ^-t-butyylioksikarbonyyli-O-bentsyyli-L-tyrosyyli-D-alinaatti.

200 ml:aan kuivaa Ν,Ν-dimetyyliformamidia (DMF) lisättiin 35,1 g (0,1 moolia) osan A tuotetta. Saatua seosta sekoitettiin ja jäähdytettiin 0°C:een, ja lisättiin 11,2 g (0,1 moolia) diatsa-bisyklo-oktaania (DABCO). Seosta sekoitettiin kymmenen minuuttia 0°C:ssa, ja lisättiin 37,1 g (0,1 moolia N°^-t-butyylioksikarbonyy-li-O-bentsyyli-L-tyrosiinia ja sen jälkeen 13,5 g (0,1 moolia) 1-hydroksi-bentsotriatsolia (HBT) ja 20,6 g (0,1 moolia) Ν,Ν'-di-sykloheksyylikarbodi-imidiä (DCC). Muodostunutta seosta sekoitettiin 0°C:ssa kolme tuntia ja sitten huoneen lämpötilassa kaksikymmentäneljä tuntia. Sitten seos jäähdytettiin 0°C:een, muodostunut suspensio suodatettiin ja suodos konsentroitiin vakuumissa. Saatu jäännös liuotettiin sitten uudelleen etyyliasetaattiin ja pestiin peräkkäin 1-n NaHC03:11a, vedellä, 0,75-n kylmällä sitruunahapolla, ja vedellä. Sen jälkeen orgaaninen kerros kuivattiin magnesiumsulfaatilla, suodatettiin ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa. Saatu jäännös liuotettiin sitten kuumaan etanoliin. Jäähtymisen seurauksena tapahtui kiteytyminen. Kerran etanolista suoritetun uusintakiteytyksen jälkeen saatiin 41,5 g (80 %) puhdasta otsikon yhdistettä, sp. 121-123°C.

Analyysi, laskettu yhdisteelle Cor.H_,~N„0, (520,63):

jU jb L· O

C, 69,21; H, 6,97; N, 5,38; saatu: C, 68,99; H, 6,75; N, 5,17.

C. N ^-t-butyylioksikarbonyyli-O-bentsyyli-L-tyrosyyli-D-alaniini.

Seokseen, jossa oli 200 ml tetrahydrofuraania (THF) ja 20 ml vettä, lisättiin 31,2 g (0,06 moolia) osan B tuotetta. Saatu liuos jäähdytettiin 0°C:een, ja lisättiin hitaasti 13,2 ml (1,1 ekvivalenttia) 5-norm. natriumhydroksidia. Saatua seosta sekoitettiin ja sen annettiin lämmetä hitaasti huoneen lämpötilaan. Viiden tunnin _____— — T— ' ' ' 20 66842 kuluttua seos jaettiin veteen ja eetteriin liukeneviin osiin.

Vesikerros eroitettiin ja jäähdytettiin, pH säädettiin arvoon 2 lisäämällä sitruunahappoa, ja seos uutettiin etyyliasetaatilla. Etyyliasetaattiuute pestiin vedellä, kuivattiin magesiumsulfaatil-la, suodatettiin, ja laimennettiin eetterillä. Muodostunut sakka koottiin talteen, jolloin saatiin 17,7 g (67 %) otsikon yhdistettä, sp. 160-162°C.

Analyysi, laskettu yhdisteelle C24H30N2^6 (442'51): C, 65,14; H, 6,83; N, 6,63.

saatu: C, 64,73; H, 6,70; N, 6,20.

D. Bentsyyli-N -t-butyylioksikarbonyyli-O-bentsyyli-L-tyro-syyli-D-alanyyli-glysinaatti.

70 ml:aan kuivaa DMF:a lisättiin 6,74 g (0,02 moolia) bent-syyliglysinaatin p-tolueenisulfonihapposuolaa. Saatu seos jäähdytettiin 0°C:een ja lisättiin 2,24 g (0,020 moolia) DABCOrta. Seosta sekoitettiin muutama minuutti, ja lisättiin 8,84 g (0,020 moolia) osan C tuotetta ja sen jälkeen 2,7 g (0,020 moolia) HBT:tä ja 4,12 g (0,020 moolia) DCC:tä. Reaktioseosta sekoitettiin kaksi tuntia 0°C:ssa ja sitten kaksikymmentäneljä tuntia huoneen lämpötilassa. Muodostunut suspensio jäähdytettiin 0°C:een, suodatettiin, ja suodos haihdutettiin kuiviin vakuumissa. Saatu jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin ja pestiin peräkkäin 1-norm. natriumvety-karbonaatilla, vedellä, kylmällä 0,75-norm. sitruunahapolla ja vedellä. Orgaaninen faasi kuivattiin magnesiumsulfaatilla, suodatettiin ja konsentroitiin vakuumissa. Saatu jäännös kiteytettiin etanolista, jolloin saatiin 10,8 g (92 %) puhdasta otsikon yhdistettä, sp. 145-147°C.

Analyysi, laskettu yhdisteelle C^H^gN^O^ (589,69): C, 67,22; H, 6,67; N, 7,13.

saatu: C, 67,32; H, 6,83; N, 6,91.

E. N ^ -t-butyylioksikarbonyyli-O-bentsyyli-L-tyrosyyli-D-alanyyliglysiini.

150 ml:aan seosta, jossa oli suhteessa 9:1 tetrahydrofuraa-nia ja vettä, lisättiin 15,95 g (27 mmoolia) osan D tuotetta. Seos jäähdytettiin 0°C:een sekoittaen ja saatuun seokseen lisättiin 21 66842 tiputtamalla 30 ml 1-n natriumhydroksidia. Seosta sekoitettiin tiputtamalla tapahtuneen lisäyksen päätyttyä 2 tuntia ja sitten uutettiin kahdesti eetterillä. Eroitettu vesikerros tehtiin happa-meksi (pH 2,5) lisäämällä 30 ml 1-n suolahappoa. Otsikon yhdiste kiteytyi, koottiin talteen suodattamalla ja kiteytettiin uudelleen kerran metanolin ja veden seoksesta ja kahdesti etyyliasetaatista, jolloin saatiin 11,43 g tuotetta (85 % teoreettisesta), sp. 104-107°C, + 31,4° (C = 0,5, MeOH) .

Analyysi, laskettu yhdisteelle C26H33N3^7 (499,54): C, 62,51; H, 6,66; N, 8,41; saatu: C, 62,31; H, 6,83; N, 8,12.

F. N°^-t-butyylioksikarbonyyli-N°^-metyyli-L-fenyylialaniinin d-(+) 00 -metyylibentsyylialamiini-suola.

75 ml:aan tetrahydrofuraania lisättiin 13,26 g (0,05 moolia) Nö^-t-butyylioksikarbonyyli-L-fenyylialaniinia. Saatu seos lisättiin tiputtamalla 30 minuutin aikana mekaanisesti sekoitettuun suspensioon, jossa oli 0,15 moolia kaliumhydridiä ja 0,5 grammaa 18-kruumi-6-eetteriä 0°C:ssa typen suojaamana. Seosta sekoitettiin vielä tunnin ajan 0öC:ssa 15 minuutin kuluessa lisättiin tiputtamalla liuos, jossa oli 6,23 ml (0,1 moolia) metyylijodidia 15 ml:ssa tetrahydrofuraania. Seosta pidettiin näin 2 tuntia, ja lisättiin tiputtamalla seos, jossa oli 10 ml etikkahappoa ja 10 ml tetrahydrof uraania, ja sen jälkeen 20 ml etanolia. Seos kaadettiin sitten 400 ml:aan jäitä. Saadun vesifaasin pH kohotettiin sitten arvoon 12-13 lisäämällä 2-n natriumhydroksidia. Vesiseos uutettiin kahdesti eetterillä ja tehtiin sitten happameksi (pH 3,0) lisäämällä kiinteätä sitruunahappoa. Sen jälkeen vesiseos uutettiin kolme kertaa 200 ml:lla eetteriä. Eetteriuutteet yhdistettiin, uutettiin vedellä, kuivattiin magnesiumsulfaatilla, ja haihdutettiin vakuu-missa siirapiksi. Siirappi liuotettiin 50 ml:aan eetteriä ja lisättiin 6,44 ml (0,05 moolia) d(+)-06-metyylibentsyyliamiinia. Saatu liuos laimennettiin 350 ml:11a heksaania ja raaputettiin. Tuote koottiin talteen suodattamalla, jolloin saatiin 15,83 g (79 % teoreettisesta) otsikon yhdistettä. Kiteytettäessä uudelleen etyyliasetaatista saatiin 13,70 g (68 % teor.) otsikon yhdistettä, sp. 136-139°C. /o^5 - 28,2° (C = 1, EtOH) .

--- - Γ 22 66842

Analyysi, laskettu yhdisteelle C23H32N204 (400'5°)? C, 68,97; H, 8,05; N, 6,99; saatu: C, 68,75; H, 7,81; n, 6,74.

G. N^-t-butyylioksikarbonyyli-N ^metyyli-L-fenyylialanyy-liamidi.

N oC-t-butyylioksikarbonyyli-No<- -metyyli-L-f enyylialaniinia (4,0 g; 0,01 moolia; valmistettu tekemällä d(+)-06-metyylibentsyy-liamiinisuola happameksi ja uuttamalla eetteriin) liuotettiin 20 ml:aan N,N-dimetyyliformamidia (DMF). Seos jäähdytettiin -15°C:een ja lisättiin 1,56 ml (0,012 moolia) isobutyyliklooriformiaattia ja sen jälkeen 1,32 ml (0,012 moolia) N-metyylimorfoliinia. Reak-tioseosta sekoitettiin 10 minuuttia -15°C:ssa, ja reaktioseokseen johdettiin 1,5 tunnin ajan kuplina kuivaa ammoniakkia. Saatua seosta sekoitettiin tunnin ajan -15°C:ssa ja sen jälkeen seos kaadettiin astiaan, jossa oli 200 ml jäitä. Vesiliuos uutettiin etyyliasetaatilla. Orgaaninen kerros eroitettiin ja pestiin peräkkäin 1,5-norm. sitruunahapolla, vedellä, 1-norm. natriumvetykarbonaatil-la ja vedellä. Sen jälkeen etyyliasetaattiliuos kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin vakuumissa siirapiksi, joka kiteytettiin eetterin ja petrolieetterin seoksesta, jolloin saatiin 2,12 g (76 % teor.) otsikon yhdistettä, sp. 91-92°C, £bC7^5 -111,2° (C = 0,5 CHC13).

Analyysi, laskettu yhdisteelle C15H22N2°3 (278'33): C, 64,73; H, 7,97; N, 10,06; saatu: C, 64,95; H, 7,81; N, 9,79.

H. N<^-t-butyylioksikarbonyyli-0-bentsyyli-L-tyrosyyli-D-alanyyliglysyyli-N -metyyli-L-fenyylialanyyliamidi.

20 ml:aan vastavalmistettua jääetikkahappoa, jossa oli kuivaa kloorivetyä (1-n) ja 2 ml anisolia, lisättiin 1,95 g (0,007 moolia) N °6-t-butyylioksikarbonyyli-N^-metyyli-L-fenyylialanyy-liamidia. Saatua seosta sekoitettiin huoneen länpötilassa 30 minuuttia. Sitten seos kaadettiin eetteriin, ja muodostunut sakka koottiin talteen ja kuivattiin (1,5 g). Sitten hydrokloridisuola liuotettiin 30 ml:aan DMF:a. Liuos jäähdytettiin 0°C:een, ja lisättiin 1,4 ml (0,007 moolia) disykloheksyyliamiinia. Seosta sekoitet- 23 66842 tiin muutaman minuutin ajan, ja lisättiin 3,5 g (0,007 moolia N Oz-t-butyylioksikarbonyyli-O-bentsyyli-L-tyrosyyli-D-alanyyli-glysiiniä, 950 mg (0,007 moolia) HBT:tä ja 1,4 g (0,007 moolia) DCC:tä. Reaktioseosta sekoitettiin sitten 0°C:ssa 2 tuntia ja sen jälkeen 4°C:ssa 24 tuntia. Seos jäähdytettiin 0°C:een ja suodatettiin. Suodos konsentroitiin vakuumissa öljyksi, joka liuotettiin uudelleen etyyliasetaattiin. Etyyliasetaattiliuos uutettiin peräkkäin 1-n natriumvetykarbonaatilla, vedellä, kylmällä 0,75-n sitruunahapolla ja vedellä. Orgaaninen faasi kuivattiin magnesium-sulfaatilla ja konsentroitiin vakuumissa öljyksi. Öljy kromatogra-fioitiin 40 cm x 3 cm:n pylväässä, jossa oli piigeeliä (Crace and Davison Grade 62 silica gel) kloroformissa. Tuote eluoitiin astettaisesti kloroformin määrää lisäten seoksella, jossa oli lopuksi 10 % metanolia kloroformissa.

Tuote eristettiin otetuista fraktioista ohutkerros-kromato-graafisten arvojen perusteella, jolloin saatiin 3,55 g (77 % teor.) otsikon yhdistettä. £<*.7q~ -9,2° (C = 0,5 MeOH) .

Analyysi, laskettu yhdisteelle C^gH^^N^O^ (659,8); C, 65,54; H, 6,57; N, 10,61; saatu: C, 65,46; H, 6,58; N, 10,36.

I. N -t-butyylioksikarbonyyli-L-tyrosyyli-D-alanyyli-gly-syyli-N °^-metyyli-L-fenyylialanyyliamidi.

Osan J tuote (3,2 g; 0,0485 moolia) liuotettiin 60 ml:aan etanolia, ja seokseen lisättiin vesilietteenä 1,5 grammaa 5 % palladiumhiiltä. Reaktioseokseen johdettiin kaasundispergoin-tiputken läpi kuplina noin 5 minuutin ajan typpeä ja sen jälkeen vetykaasua 6 tunnin ajan. Sen jälkeen reaktioseos huuhdeltiin typellä, ja palladium-katalyytti poistettiin suodattamalla. Seos konsentroitiin vakuumissa siirapiksi. Siirappi liuotettiin kloroformiin ja absorboitiin silikageelille 40 cm x 3 cm:n kromatogra-fiointipylvääseen, jossa oli Grace and Davison Grade 62 silicagel-valmistetta. Tuote eluoitiin lisäämällä asteettain kloroformin määrää seoksella, jossa oli lopuksi 10 % metanolia kloroformissa, ja eristettiin otetuista fraktioista ohutkerros-kromatograafisten arvojen perusteella, jolloin saatiin 2,0 g (74 % teor.) tuotetta.

“9'9° (c = 0,5 MeOH).

___ - r 24 6 6 8 4 2

Aminohappoanalyysi, saatu: Gly, 1,01; Ala, 0,99; Tyr, 0,99; NH3, 1,14.

J. L-tyrosyyli-D-alanyyli-glysyyli-N -metyyli-L-fenyyli-alanyyliamidi, asetaattisuola.

Osan I tuotetta (1,6 g; 0,00281 moolia) liuotettiin 10 ml jaan trifluorietikkahappoa, jossa oli 0,5 ml anisolia. Seosta sekoitettiin 0°C:ssa 30 minuuttia. Seos kaadettiin sitten eetteriin, ja muodostunut sakka koottiin talteen ja kuivattiin (1,1 g). Kiinteä aine liuotettiin niin riittävään määrään puskurin vesiliuosta (1 % pyridiiniä ja 0,05 % etikkahappoa), että tilavuudeksi tuli 15 ml, ja liuos kaadettiin 2,5 cm x 99 cm:n pylvääseen, jossa oli valmistetta DEAE-Sephadex A-25 (asetaattia), joka oli tasapainoi-tettu samalla puskurilla. Eluaattia tarkkailtiin kohdalla 280 nm, ja sopivat fraktiot yhdistettiin ja pakkaskuivattiin. Lyofilisoimalla uudelleen 10-prosenttisesta etikkahaposta, ja lyofilisoimalla sen jälkeen veden ja asetonitriilin seoksesta (75:25) saatiin 0,84 g 2 5 o otsikon yhdistettä. /οί_7^ + 27,8 (C = 1, 1-n HC1) . Aminohappo- analyysi, saatu: Tyr, 0,98; Ala, 1,03; Gly, 1,00; NH^, 1,05.

Esimerkki 2 L-tyrosyyli-D-alanyyli-glysyyli-L-oC-metyyli-fenyylialanyy-li-amidin, asetaattisuolan valmistus.

A. L-oC-metyylifenyylialaniinin bentsyyliesterin tosylaatti- suola.

100 ml:aan bentseeniä lisättiin 3,0 grammaa (0,0168 moolia) L- o6-metyylifenyylialaniinia. Saatuun suspensioon lisättiin 3,5 grammaa (1,1 ekvivalenttia) p-tolueenisulfonihappo-hydraattia ja 10 ml bentsyylialkoholia. Seosta kiehutettiin Dean-Stark-loukkua käyttäen neljä päivää. Sitten seos jäähdytettiin huoneen lämpötilaan, ja tosylaattisuolan saostamiseksi lisättiin eetteriä. Muodostunut sakka koottiin talteen ja kuivattiin, jolloin saatiin 7,0 grammaa (94 %) otsikon yhdistettä, sp. 129-131°C. 10,7° (C = 0,5 1-nMeOH) .

Analyysi, laskettu yhdisteelle C24H27N05S (441,5): N, 3,17; saatu: N, 2,87.

25 66842 B. N^-t-butyylioksikarbonyyli-O-bentsyyli-L-tyrosyyli-D-alanyyliglysyyli-L-ö6-metyylifenyylialaniinin bentsyyliesteri.

80 ml:aan DMF:a lisättiin 5,74 grammaa (0,013 moolia) osan A tuotetta. Saatua seosta jäähdytettiin 0°C:ssa 5 minuuttia, ja lisättiin 6,5 grammaa (13 mmoolia) N^-t-butyylioksikarbonyyli-O-bentsyyli-L-tyrosyyli-D-alanyyli-glysiiniä (valmistettu kuten esimerkissä 1), 1,8 grammaa (13 mmoolia) HBT:tä, ja 2,7 grammaa (13 mmoolia) DCC:tä. Seosta sekoitettiin 0°C:ssa kaksi tuntia ja sitten huoneen lämpötilassa 24 tuntia. Sitten seos jäähdytettiin o 0 C:een, ja muodostunut sakka poistettiin suodattamalla. Suodos haihdutettiin vakuumissa kuiviin. Saatu jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin, ja etyyliasetaattiliuos uutettiin peräkkäin 1-n natriumvetykarbonaatilla, vedellä, 0,75-norm. sitruunahapolla ja vedellä. Orgaaninen faasi kuivattiin sitten magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin vakuumissa öljyksi, öljy kiteytettiin eetteristä ja kiteytettiin uudelleen etyyliasetaatin ja eetterin seoksesta, 25 o jolloin saatiin 7,0 grammaa (72 %) otsikon yhdistettä. £oOJD +7,9 (C = 0,5 MeOH).

Analyysi, laskettu yhdisteelle C43H5oN4®8 (750,86): C, 68,78; H, 6,71; N, 7,46.

saatu: C, 68,75; H, 6,46; N, 7,21.

C. N°C-t-butyylioksikarbonyyli-L-tyrosyyli-D-alanyyli-gly-syyli-L- oC-metyylifenyylialaniinin disykloheksyyliamiini-suola.

50 ml:aan etanolia lisättiin 4,0 grammaa (0,0053 moolia) osan B tuotetta. Sitten lisättiin liete, jossa oli 2,0 grammaa 5-prosenttista palladium-hiiltä DMF:ssa. Seokseen johdettiin kuplina 5 minuutin ajan kaasun dispergointiputken kautta typpeä ja sen jälkeen vetykaasua 4 tunnin ajan. Sitten seos huuhdellaan typellä, ja palladium-katalyytti poistettiin suodattamalla. Suodos konsentroitiin vakuumissa siirapiksi. Siirappi kaadettiin klorofomissa 1o cm x 2 cm:n pylvääseen, jossa oli valmistetta Grade and Davison Grade 62 silica gel. Pylväs eluoitiin lisäämällä asteettain kloroformin määrää kunnes kloroformi-metanolisuhde , oli 9,5:0,5. Pääfraktiot yhdistettiin ja liuotin haihdutettiin pois. Saatu öljy liuotettiin etyyliasetaattiin ja lisättiin 1 ml disykloheksyyliamiinia. Muodostunut sakka koottiin talteen ja kuivattiin, jolloin saatiin 2,6 grammaa (65 %) otsikon yhdistettä, sp. 142-146°C, +46,3° ____ - Γ 26 66842 (C = 0,5 MeOH).

D. N*^ -t-butyylioksikarbonyyli-L-tyrosyyli-D-alanyyli-gly-syyli-L- OC -metyylif enyylialanyyli-amidi.

Esimerkin C tuote (2,0 grammaa; 0,0027 moolia) neutraloitiin etyyliasetaatin ja 0,75-norm. sitruunahapon seoksella. Saatu orgaaninen kerros erotettiin, uutettiin vedellä, kuivattiin magnesiumsulfaatilla, ja haihdutettiin vakuumissa öljyksi (1,5 grammaa). Saatu vapaa happo liuotettiin 30 ml:aan DMF:a, ja liuos jäähdytettiin 0°C:een painepullossa. Lisättiin DCC:tä (560 mg; 0,0027 moolia), ja seosta sekoitettiin 4 tuntia 0°C:ssa ja sitten 3 tuntia huoneen lämpötilassa. Sitten pullo jäähdytettiin -78°C:een ja lisättiin 30 ml kuivaa ammoniakkia. Pullo suljettiin uudelleen, ja seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 48 tuntia. Seos jäähdytettiin -78°C:een, pullo avattiin ja ammoniakin annettiin haihtua huoneen lämpötilassa. Sitten liuotin haihdutettiin pois vakuumissa. Saatu jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin, ja etyyliasetaatti-liuos uutettiin ensin 0,75-norm. sitruunahapolla ja sitten vedellä. Liuos kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja liuotin haihdutettiin pois vakuumissa. Jäännös liuotettiin kloroformiin ja kaadettiin 3 cm x 45 cm:n pylvääseen, jossa oli valmistetta Grace and Davison Grade 62 silica gel. Pylväs eluoitiin lisäämällä asteettain kloroformin määrää kunnes suhde kloroformi:metanoli oli 9:1. Fraktiot yhdistettiin ohutkerros-kromatograafisten arvojen perusteella.

Liuottimen haihduttamisen jälkeen saatiin 1,1 grammaa (72 %) 25 o otsikon yhdistettä </o6_7d “26 (C = 0,4 MeOH). Aminohappoanalyysi; saatu: Gly, 0,99; Ala, 1,00; Tyr, 0,99; NH3, 1,12.

E. L-tyrosyyli-D-alanyyli-glysyyli-L-pj,-metyyli-fenyyli-alanyyli-amidin asetaattisuola.

20 ml:aan seosta, jossa oli 1-norm. kaasumaisen kloorivedyn jääetikkahappoliuosta, jossa oli 0,3 ml anisolia, lisättiin 900 mg (0,0016 moolia) osan D tuotetta. Seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 30 minuuttia ja sen jälkeen se kaadettiin eetteriin. Muodostunut sakka koottiin talteen ja kuivattiin (720 mg). Kiinteä aine liuotettiin niin riittävään määrään puskurin vesiliuosta (1 % pyridiiniä ja 0,05 % etikkahappoa), että tilavuudeksi saatiin 5 ml, ja liuos kaadettiin 2,5 x 99 cm:n pylvääseen, jossa oli DEAE-Sephadex®A-25 (asetaattia), joka oli aikaisemmin tasapainoitettu 27 66842 samalla puskurilla. Eluaattia tarkkailtiin kohdalla 280 nm, ja sopivat fraktiot yhdistettiin ja pakkaskuivattiin. 10-prosenttises-ta etikkahaposta suoritetun uusinta-lyofilisoinnin jälkeen lyofili-soitiin veden ja asetonitriilin seoksesta (75:25), jolloin saatiin 400 mg otsikon yhdistettä, + 23,9° (C = 0,5 1-n HC1) .

Analyysi, laskettu yhdisteelle C26H35N5^7 (529,60): C, 58,97; H, 6,66; N, 13,22; O, 21,15; saatu: C, 59,02; H, 6,36; N, 12,99; O, 21,41.

Aminohappoanalyysi: saatu Tyr, 0,96; Ala, 1,01; Gly, 1,00; NH3, 1,03.

Esimerkki 3 L-tyrosyyli-D-alanyyli-glysyyli-N^-propyyli-L-fenyyliala-nyyliamidin asetaattisuolan valmistus.

A. N-t-butyylioksikarbonyyli-N^-n-propyyli-L-fenyyliala- niini.

70 ml:aan tetrahydrofuraania lisättiin 10,6 g (0,04 moolia) N°^-t-butyylioksikarbonyyli-L-fenyylialaniinia. Saatu seos lisättiin tiputtamalla 30 minuutin aikana mekaanisesti sekoitettuun suspensioon, jossa oli 0,12 moolia kaliumhydridiä 220 ml:ssa tetrahydrofuraania ja 0,5 g 18-kruunu-6-eetteriä 0°C:ssa typpiatmosfäärin suojaamana. Seosta sekoitettiin vielä 10 minuuttia 0°C:ssa.

20 minuutin kuluessa lisättiin tiputtamalla liuos, jossa oli 23,3 ml (0,24 moolia) 1-jodipropaania 40 ml:ssa tetrahydrofuraania.

Seosta pidettiin 2,5 tuntia 0°C:ssa, ja seokseen lisättiin tiputtamalla vielä 11,5 ml (0,12 moolia) 1-jodipropaania. Seosta sekoitettiin vielä 2 tuntia 0°C:ssa, lisättiin 10 ml jääetikkahappoa ja seosta sekoitettiin 10 minuuttia. Seos kaadettiin sitten murskattuihin jäihin. Saadun vesifaasin pH kohotettiin sitten arvoon 8,0 2-n natriumhydroksidilla. Vesiseos uutettiin kahdesti eetterillä, ja sen jälkeen se tehtiin happameksi pH-arvoon 2,5 lisäämällä kylmää 2-nHCl:a. Sen jälkeen vesiseos uutettiin etyyliasetaatilla. Etyyli-asetaattiuute uutettiin kerran vedellä, kuivattiin (MgSO^:lla), ja haihdutettiin vakuumissa siirapiksi. Siirappi liuotettiin 200 ml:aan eetteriä, ja lisättiin 8 ml (0,04 moolia) DCHA:ta. Sakka suodatettiin erilleen ja suodos uutettiin kerran 1,5-norm. sitruunahapolla, ja vedellä. Eetterikerros kuivattiin (MgSO^:lla) ja haihdutettiin 28 66842 vakuumissa öljyksi. Öljy kromatografioitiin 40 cm x 3 cm:n pylväässä, jossa oli valmistetta Grace and Davison Grade 62 silica gel kloroformissa. Tuote eluoitiin lisäämällä asteettain kloroformin määrää seokseksi, jossa oli 5 % metanolia kloroformissa. Tuote eristettiin koottujen fraktioiden ohutkerros-kromatograafisten arvojen perusteella. Saatiin 3,6 g (31 % teor.) otsikon yhdistettä. C^_7q5 - 153,3 (C = 1, MeOH) . NMR ά (-C02H) = 10,47; S (Me3C-) = 1,50.

Analyysi, laskettu yhdisteelle ci7H25N04 (307,4): C, 66,43; H, 8,20; N, 4,56; saatu: C, 66,16; H, 7,99; N, 4,45.

B. N-t-butyylioksikarbonyyli-N^-n-propyyli-L-fenyyliala-nyyliamidi.

N <26-t-butyylioksikarbonyyli-N c£-n-propyyli-L-f enyylialaniini (valmistettu osassa A) liuotettiin N,N-dimetyyliformamidiin (DMF). Seos jäähdytettiin -15°C:een ja lisättiin yksi ekvivalentti iso-butyyliklooriformiaattia ja sen jälkeen yksi ekvivalentti N-metyyli-morfoliinia. Seosta sekoitettiin 10 minuuttia -15°C:ssa, ja seokseen johdettiin kuplina kuivaa ammoniakkia 30 minuutin ajan. Saatua seosta sekoitettiin tunnin ajan -15°C:ssa, ja sitten seos kaadettiin astiaan, jossa oli 200 ml jäitä. Vesiliuos uutettiin etyyliasetaatilla. Orgaaninen kerros eroitettiin ja pestiin peräkkäin 1,5-norm. sitruunahapolla, vedellä, 1-n natriumvetykarbonaatilla ja vedellä. Sitten etyyliasetaattiliuos kuivattiin (MgSO^:llä) ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa, jolloin saatiin otsikon yhdistettä.

C. N^-t-butyylioksikarbonyyli-L-tyrosyyli-D-alanyyli-glysyyli-NO^-n-propyyli-L-fenyylialanyyli-amidi.

20 ml:aan vasta valmistettua jääetikkahappoa, jossa oli kuivaa kloorivetyä (1-norm.) ja 2 ml anisolia, lisättiin yksi ekvivalentti N <3^-t-butyylioksikarbonyyli-N ^-n-propyyli-L-f enyyliala-nyyli-amidia. Saatua seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 30 minuuttia. Sitten seos kaadettiin eetteriin, ja muodostunut sakka koottiin talteen ja kuivattiin. Sen jälkeen hydrokloridisuola liuotettiin 30 ml:aan DMF:a. Liuos jäähdytettiin 0°C:een, ja lisättiin yksi ekvivalentti disykloheksyyliamiinia. Seosta sekoitettiin muutama minuutti, ja lisättiin yksi ekvivalentti N #-t-butyylioksi- 29 6 6 8 4 2 karbonyyli-O-bentsyyli-tyrosyyli-D-alanyyliglysiiniä (valmistettu kuten esimerkissä IE), yksi ekvivalentti HBT:tä, ja yksi ekvivalentti DCC:tä. Sen jälkeen reaktioseosta sekoitettiin 0°C:ssa 2 tuntia ja sitten 4°C:ssa 24 tuntia. Seos jäähdytettiin 0°C:een ja suodatettiin. Suodos konsentroitiin vakuumissa öljyksi, joka liuotettiin uudelleen etyyliasetaattiin. Etyyliasetaattiliuos uutettiin peräkkäin 1-n natriumvetykarbonaatilla, vedellä, kylmällä 0,75-norm. sitruunahapolla, ja vedellä. Orgaaninen faasi kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja konsentroitiin vakuumissa öljyksi, öljy kromatografioitiin 40 cm x 3 cm:n pylväässä, jossa oli valmistetta Grace and Davison Grade 62 silica gel kloroformissa. Tuote eluoitiin lisäämällä asteettain kloroformia seokseksi, jossa oli 10 % metanolia kloroformissa. Tuote eristettiin koottujen fraktioiden ohutkerros-kromatograafisten arvojen perusteella. Saatiin N 01 -t-butyylioksikarbonyyli-O-bentsyyli-L-tyrosyyli-D-alanyyli-glysyyli-N <*· -n-propyyli-L-fenyylialanyyli-amidia.

Edellisessä kappaleessa saatu tuote liuotettiin 60 ml:aan etanolia, ja seokseen lisättiin vesilietteenä 1,5 g 5-prosenttista palladiumhiiltä. Reaktioseokseen johdettiin kuplina noin 5 minuutin ajan kaasun dispergointiputken läpi noin 5 minuutin ajan typpeä ja sen jälkeen vetykaasua 6 tunnin ajan. Sen jälkeen reaktio-seos huuhdeltiin typellä, ja palladiumkatalyytti poistettiin suodattamalla. Seos konsentroitiin vakuumissa siirapiksi. Siirappi liuotettiin kloroformiin ja absorboitiin 40 cm x 3 cm:n kromatograf ointipylvääseen, jossa oli valmistetta Grade and Davison Grade 62 silica gel. Tuote eluoitiin lisäämällä asteettain kloroformin määrää kunnes seoksessa oli 10 % metanolia kloroformissa ja eristettiin koottujen fraktioiden ohutkerros-kromatograafisten arvo-jen perusteella. Saatiin otsikon yhdistettä, D -34,8 (C = 0,5, MeOH).

Analyysi, laskettu yhdisteelle (597,7): C, 62,29; H, 7,25; N, 11,72; saatu: C, 62,13; H, 7,24; N, 11,70.

D. L-tyrosyyli-D-alanyyli-glysyyli-N4* -n-propyyli-L-fenyyli-alanyyliamidin asetaattisuola.

Osan C tuote (800 mg; 1,34 mmoolia) liuotettiin 10 ml:aan _ ” τ~.

30 66842 trifluorietikkahappoa, jossa oli 0,5 ml anisolia. Seosta sekoitettiin 0°C:ssa 30 minuuttia. Reaktioseos pakkaskuivattiin. Kiinteä aine liuotettiin niin riittävään määrään puskurin vesiliuosta (1 % pyridiiniä ja 0,05 % etikkahappoa), että tilavuudeksi saatiin 10 ml, ja liuos pantiin 2,5 cm x 99 cm:n kolonniin, jossa oli valmistetta DEAE-Sephadex^A-25 (asetaatti), joka oli tasapainoitettu samalla puskurilla. Eluaattia tarkkailtiin kohdalla 280 nm, ja sopivat fraktiot yhdistettiin ja pakkaskuivattiin. Lyofiilisoimalla uudelleen 1-molaarisesta etikkahaposta saatiin 655 mg otsikon yhdistettä. ~ 11,0° (C = 0,5, 1-n HC1) .

Analyysi, laskettu yhdisteelle ^gH^gN^O^ (557,6): C, 60,31; H, 7,05; N, 12,56; saatu: C, 60,23; H, 6,98; N, 12,49.

Aminohappoanalyysi, saatu: Tyr, 0,99; Ala, 1,00; Gly, 1,01; NH3, 0,96.

Esimerkki 4 L-tyrosyyli-D-alanyyli-glysyyli-N0^ -etyyli-L-fenyylialanyy-li-amidin asetaattisuolan valmistus.

A. N-butyylioksikarbonyyli-N ^C-etyyli-L-fenyylialaniini.

70 ml:aan tetrahydrofuraania lisättiin 10,6 g (0,04 moolia) No^-butyylioksikarbonyyli-L-fenyylialaniinia. Saatu seos lisättiin tiputtamalla 30 minuutin aikana mekaanisesti sekoitettuun suspensioon, jossa oli 0,12 moolia kaliumhydridiä 220 ml:ssa tetrahydro-furaania ja 0,5 g 18-'kruunu-6-eetteriä 0°C:ssa typpiatmosfäärin suojaamana. Seosta sekoitettiin vielä 10 minuuttia 0°C:ssa. 20 minuutin kuluessa lisättiin tiputtamalla liuos, jossa oli 19,4 ml (0,24 moolia) etyylijodidia 40 ml:ssa tetrahydrofuraania. Seosta pidettiin neljä tuntia 0°C:ssa. Seokseen lisättiin kahtena yhtä suurena eränä vielä toiset 19,4 ml (0,24 moolia) etyylijodidia. Seosta sekoitettiin vielä kaksi tuntia 0°C:ssa, ja sitten lisättiin 10 ml jääetikkahappoa. Kun seosta oli sekoitettu 10 minuuttia, se kaadettiin 400 ml:aan murskattuja jäitä. Saadun vesifaasin pH kohotettiin arvoon 8,0 lisäämällä 2-n natriumhydroksidia. Vesiseos uutettiin kahdesti eetterillä ja tehtiin sitten happameksi pH-arvoon 2,5 lisäämällä kylmää 2-nsuolahappoa. Sitten vesiseos uutettiin etyyliasetaatilla. Uute pestiin vedellä, kuivattiin (MgSO^), ja 66842 haihdutettiin vakuumissa siirapiksi. Siirappi liuotettiin 200 ml:aan eetteriä, ja lisättiin 8 ml (0,04 moolia) DCHAita. Sakka suodatettiin erilleen ja suodos uutettiin 1,5-norm. sitruunahapolla, ja vedellä. Eetterikerros kuivattiin (MgS04:llä) ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa, jolloin saatiin 4,6 g (39 % teoreettisesta) otsikon yhdistettä. 0 NMR <$ (fenyyli) = 7,2; <i(Me3COC-) = 1,4.

B. N°k-t-butyylioksikarbonyyli-N ^-etyyli-L-fenyylialanyyli- amidi.

N Oi -t-butyylioksikarbonyyli-N -etyyli-L-f enyylialaniinia (4,3 g, 0,0146 moolia; valmistettu osassa A) liuotettiin 60 ml:aan Ν,Ν-dimetyyliformamidia (DMF). Seos jäähdytettiin 0°C:een, ja lisättiin 3,0 g (0,0146 moolia) N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidiä (DCC). Reaktioseosta sekoitettiin kaksi tuntia 0°C:ssa ja sitten 72 tuntia huoneen lämpötilassa. Sitten seos jäähdytettiin 0°C:een ja suodatettiin. Suodos konsentroitiin vakuumissa öljyksi, joka liuotettiin uudelleen etyyliasetaattiin. Liuos uutettiin 1-n natrium-vetykarbonaatilla, vedellä, kylmällä 1,5-norm. sitruunahapolla ja vedellä. Orgaaninen faasi kuivattiin (MgS04:llä) ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin 3,93 g (91 % teor.) otsikon yhdistettä. £Ö0J^ -101,51° (C = 1, MeOH) .

Analyysi, laskettu yhdisteelle ci6H24N2^3 ^292,4): C, 65,73; H, 8,27; N, 9,58; saatu: C, 66,03; H, 8,13; N, 9,85.

C. N o~ -etyyli-L-fenyylialanyyli-amidi hydrokloridisuola.

N ^-t-butyylioksikarbonyyli-N °^-etyyli-L-fenyylialanyyli- amidia (3,5 g; 11,95 mmoolia; valmistettu osassa B) liuotettiin 40 ml:aan vasta valmistettua jääetikkahappoa, jossa oli kuivaa kloorivetyä (1-norm.) ja 1,5 ml anisolia, sekä 1,5 ml yhdistettä (C2H3)3SiH. Saatua seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 30 minuuttia. Sitten seos kaadettiin eetteriin, ja muodostunut sakka koottiin talteen ja kuivattiin, jolloin saatiin 2,6 g (96 % teor.) otskon yhdistettä, sp. 276-277°C.

Analyysi, laskettu yhdisteelle ciiHi6N2OC1 (227,7): C, 58,02; H, 7,08; N, 12,30; saatu: C, 57,97; H, 7,26; N, 12,54.

_______ ΤΓ 32 66842 D. N^-t-butyylioksikarbonyyli-L-tyrosyyli-D-alanyyli-gly-syyli-N0^-etyyli-L-fenyylialanyyli-amidi.

50 ml:aan DMF:a lisättiin 1,14 g (0,005 moolia) N00-etyyli-L-f enyylialanyyli-amidin hydrokloridisuolaa (valmistettu osassa C). Seos jäähdytettiin 0°C:een ja sitten lisättiin 2,95 g (0,005 moolia) N-t-butyylioksikarbonyyli-L-tyrosyyli-D-alanyyli-gly-siinin DCHA-suolaa. Seosta sekoitettiin 0°C:ssa 5 minuuttia, ja sitten lisättiin 675 mg (0,005 moolia) HBT:tä ja 1,03 g (0,005 moolia) DCC:tä. Reaktioseosta sekoitettiin 0°C:ssa 6,5 tuntia ja sitten huoneen lämpötilassa 20 tuntia. Seos jäähdytettiin 0°C:een ja suodatettiin. Suodos konsentroitiin vakuumissa öljyksi, joka liuotettiin uudelleen etyyliasetaattiin, uutettiin 1-n natriumvety-karbonaatilla, vedellä, kylmällä 1,5-norm. sitruunahapolla ja vedellä. Orgaaninen faasi kuivattiin (MgSO^rllä) ja konsentroitiin vakuumissa öljyksi, öljy kromatografioitiin 40 cm x 3 cm:n pylväässä, jossa oli valmistetta Grace and Davison Grade 62 silica gel. Tuote eluoitiin asteettain kloroformin määrää kunnes seoksessa oli 15 % metanolia kloroformissa. Tuote eristettiin koottujen fraktioiden ohutkerros-kromatograafisten arvojen perusteella. Saatiin 1,13 g (39 % teor.) otsikon yhdistettä, -21,0° (C = 0/5,

MeOH).

Analyysi, laskettu yhdisteelle C3(jH4iN507 (583,7): C, 61,73* H, 7,08* N, 12,00* saatu: C, 60,35* H, 7,26* N, 11,25.

E. L-tyrosyyli-D-alanyyli-glysyyli-N -etyyli-L-fenyylialanyyli-amidin asetaattisuola.

Osan D tuote (1 g; 1,71 mmoolia) liuotettiin 20 ml:aan tri-fluorietikkahappoa, jossa oli 3 ml anisolia ja 3 ml yhdistettä (C2H^)2SiH. Seosta sekoitettiin 0°C:ssa 30 minuuttia. Sitten seos kaadettiin eetteriin, ja muodostunut sakka koottiin talteen ja kuivattiin (660 mg). Kiinteä aine liuotettiin niin riittävään määrään puskurin vesiliuosta (1 % pyridiiniä ja 0,05 % etikkahappoa), että tilavuudeksi tuli 10 ml, ja liuos pantiin 2,5 x 90 cm:n kolonniin, jossa oli valmistetta DEAE-Sephadex®A-25 (asetaatti), joka oli tasapainotettu samalla puskurilla. Eluaattia tarkkailtiin kohdalla 280 nm, ja sopivat fraktiot yhdistettiin ja pakkaskuivattiin. Kiinteä aine liuotettiin 0,2-mol. etikkahappoon (10 ml) ja liuos kro- 33 66842 matografioitiin 2,5 cm x 99 cm:n pylväässä, jossa oli G-10 Sephadej^®'ia, joka oli tasapainoitettu samalla liuottimena. Elu-aattia tarkkailtiin kohdalta 280 nm, ja sopivat fraktiot yhdistettiin ja pakkaskuivattiin, jolloin saatiin 448 mg (48 % teor) otsikon yhdistettä, -10,fe° (C = 0,5, 1-n HC1) .

Analyysi, laskettu yhdisteelle ^γΗ^Ν,-Ο^ (543,6): C, 59,65; H, 6,86; N, 12,88; saatu: C, 59,41; H, 7,26; N, 13,18.

Aminohappoanalyysi: saatu: Tyr, 1,03; Ala, 0,99; Gly, 0,97; NH3, 0,98.

Claims (2)

1. 000 R,RK0 (L) |l (D) || || I 413II J>N-CH-C-NH-CH-C-NH-CH--C-N-C-C-NH0 (II) Ri I I
2. 2 I 2 CH0 CH., CH0 Φ 0 OH jossa R^ ja R^ toisistaan riippumatta merkitsevät vetyä tai ot-aminosuojaryhmää, kuten tert.-butyylioksikarbonyyliä, ja R^ ja R^ merkitsevät samaa kuin edellä, lohkaistaan suojaryhmät happo-väliaineella, kuten trifluoroietikkahapolla, jääetikkahapolla, jossa on HCl-kaasua tai muurahaishapolla. Il

   34 66842 Patenttivaatimus Menetelmä analgeettisina aineina käyttökelpoisten enke-faliinianalogien valmistamiseksi, joilla on kaava I, (L)

   000 R,RcO H (L) Il (D) Il II |4|b|| J1N-CH-C-NH-CH-C-NH-CH.-C-N-C-C-NH0 (I) I | 2 I 2 CH_ Ch CH„ JL i Φ o OH jossa L ja D, soveltuvassa tapauksessa, määrittelevät kiertosuunnan; ja jossa on -C^-alkyyli; ja R^ on vety tai -C^-alkyyli; ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien, myrkyttömien happoaddi-tiosuolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että vastaavasti suojatusta yhdisteestä, jolla on kaava II (L)